MX2007010265A - Infeccion por helicobacter porcina. - Google Patents

Abstract

Se divulgan composiciones y metodos para tratar, prevenir y diagnosticar la infeccion por Helicobacter. Los metodos utilizan proteinas y/o acido nucleicos derivados de Helicobacter cerdo, un nuevo patogeno aislado de cerdos. Ademas, se describen modelos porcinos para estudiar la gastritis bacteriana y la enfermedad de ulcera gastrica y duodenal causada por patogenos de Helicobacter, tal como H. pylori y H. cerdo, asi como metodos de identificacion de vacunas y compuestos para tratar y/o prevenir la infeccion por Helicobacter utilizando los modelos animales. Tambien se describen metodos de prevencion de la infeccion por Helicobacter en cerdos, tal como la infeccion causada por H. cerdo, utilizando proteinas inmunogenicas y acidos nucleicos derivados de patogenos de Helicobacter, tal como H. pylori.

Description

INFECCIÓN POR HELICOBACTER PORCINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente a patógenos bacterianos. En particular, la invención pertenece a modelos de animales para estudiar la gastritis bacteriana y la enfermedad de ulcera gástrica y duodenal, tal como la causada por Helicoba cter pylori y Helicoba cter cerdo, asi como métodos para tratar y prevenir la infección por Heli coba cter en cerdos, tal como la infección causada por H. cerdo, utilizando proteínas inmunogénicas y ácidos nucleicos derivados de patógenos de Heli coba cte r tal como H. pylori . ANTECEDENTES La enfermedad gástrica es una causa importante de morbidez y pérdida económica en las operaciones de cria de cerdos (O'Brien, J. (1992) "Gastric ulcers" p.680. En A. D. Leman, B. E. Straw, W. L. Mengeling, y S. D. D'Allaire (ed) , Diseases of swine . Wolfe, Londres, Remo Unido) . Aunque la causa de la enfermedad gástrica porcina no se ha establecido previamente, esta es más frecuentemente atribuida a la dieta y/o estrés (O'Brien, J. (1992) "Gastric ulcers" p. 680. En A. D. Leman, B. E. Straw, W. L. Mengeling, and S. D. D'Allaire (ed) , Diseases of swine, Wolfe, Londres, Reino Unido) . En 1984, Helicobacter pylori (Hp) emergió como un agente etiológico en enfermedad de gas ri is/úlcera humana después de la documentación de este agente en pacientes con gastritis (Marshall and Warren (1984) Lancet 1:1311-1314). Hp es una bacteria de forma de bastón curvo pequeño positivo de ureasa microaerofilica Gram-negativa que posee varias características inusuales relacionadas con su nicho ecológico gástrico. La marca de referencia para los miembros del género Helicobacter es la expresión de la enzima ureasa. La presencia de esta enzima y su actividad en la hidrólisis de urea forma la base de pruebas presuntivas (prueba de respiración de urea y otras) para la colonización gástrica. El organismo coloniza la capa mucosa de la cardia y antrum gástrico y la infección se presume que es de larga vida. Hp es ahora universalmente reconocida como uno de los patógenos gástricos primarios, y el estudio de esta especie bacteriana y el espectro de enfermedades asociadas con ésta ha llegado a ser un mayor foco en la gastroenterologia humana (Suerbaum and Michetti (2002) N. Eng. J. Med. 347:1175-1186) . Hp es causalmente asociada con la gastritis tipo B superficial (activa) crónica (Buck (1990) Clin . Mi cro . Rev. 3:1-12; Blaser (1992) Gas teroen terol . 102: 720-727; Consensus Statement, 1994, ?SAID) , ulceración gástrica independiente (Peterson (1991) N. Eng. J. Med. 324:1043-1047; Moss and Calam (1992) Gut 33:289- 292; Leung y colaboradores, (1992) Am . J. Clin . Pa thol . 98:569 574; Forbes y colaboradores, (1994) Lancet 343:258-260) , gastritis atrófica (?omura y colaboradores, (1991) N. Engl . J. Med. 325:1132-1136; Parsonnet y colaboradores, (1991) JNCI 83:640-643; Sipponen (1992) Drugs 52:799-804, 1996), y linfoma MALT gástrico (Rodríguez y colaboradores, (1993) Gas ro-En terol . Belg. 5_6 (suppl) :47; Eidt y colaboradores, (1994) J. Clin . Pa thol . 4_7: 436-439) . Adicionalmente, la gastritis atrófica y alcoridria resultante ahora se cree que representa la etapa última en la progresión de la colonización de larga vida persistente por Hp (Leung y colaboradores, (1992) Am . J. Clin . Pa thol . 98:569 574). . Intentos tempranos para reproducir la enfermedad con Hp fueron frustrados debido a que las especies de animales de laboratorio comúnmente utilizados se encontraron que son altamente resistentes a la colonización gástrica de Hp . Los modelos de animales experimentales de la infección de gastritis por Hp desde entonces se han desarrollado. Prominente entre estos está el modelo de cerdito gnotobiótico para la gastritis bacteriana aguda (Krakowka y colaboradores, (1987) Infect . Immun . 55:2789-2796). Los cerdos gnotobióticos, como omnívoros monogás trieos cuya anatomía y fisiología gástrica más estrechamente se asemeja a los humanos (Bertram y colaboradores, (1991) Rev. Infect . Dis . j3_: S714-S722) , son susceptibles a la colonización oral con muchas diferentes cepas de Hp (Krakowka y colaboradores, (1987) Infect . Immun . 5_5 : 2789-2796; Bertram y colaboradores, (1991) Rev. Infect . Dis . 13 : S714-S722 ) . Los arreglos antigénicos de Lewis expresados sobre mucoproteinas humanas y glicoproteinas de superficie celular se cree que son receptores de enlace para lipopolisacárido bacteriano de Hp y otras glicoproteinas de superficie (Vandenbroucke-Grauls y colaboradores, (1998) Ital . J. Gastroen terol . Hepa tol . 3_0: 259-260 ) . Los tejidos gástricos de ceros, distintos a otras especies de animales de laboratorio excepto a los primates también son positivos de antigeno de Lewis (Appelmelk y colaboradores, (1998) "Molecular Mimicry between Helicobacter pylori and the host" in Helicobacter pylori : Basis Mechanisms to Clinical Cure (1998) R.H. Hunt, Tytgat GNT, eds. ) . De las especies de animales domésticos, los cerditos son los más comúnmente afectados con úlceras gástricas clínicamente significantes (O'Brien JJ. Gastric Ulcers. Diseases of Swine, 6th ed. Editors AD Leman AD, y colaboradores, (1986), 680-691; Embaye y colaboradores, (1990) J. Comp. Pa th . 103: 253-264 ) . En los sistemas de producción intensiva de cerdos modernos, el desarrollo de úlceras y erosiones del revestimiento gástrico esofágico no glandular (cardiaco) y la mucosa gástrica antral es un problema de enfermedad común y serio (O'Brien JJ. Gastric Ulcers. Diseases of Swine, 6th ed . Editors AD Leman AD, y colaboradores, (1986), 680-691). Una prevalencia de 5-100% para ulceraciones gastroesofágicas (GEU) es reportada, pérdidas por muerte de hemorragias fatales de 3% o más son reportadas (O'Brien JJ. Gastric Ulcers. Diseases of Swine, 6th ed. Editors AD Leman AD, y colaboradores, (1986), 680-691; Embaye y colaboradores, (1990) J. Comp. Pa th . 103:253-264) y pérdidas económicas subletales son sustanciales. La ulceración mucosal gástrica porcina y GEU se atribuyen al reflujo de los contenidos gástricos acidicos sobre los esófagos de pars no protegidos (Argenzio y colaboradores, (1975) Am . J. Physiol . 228:454-462; Argenzio y colaboradores, (1996) Am . J. Vet . Res . 57_: 564-573) . En particular, el epitelio escamoso estratificado de los esófagos de pars están libres de glándulas que producen moco y carece del sistema de regulación de bicarbonato de sodio característico de la mucosa glandular gástrica y, como una consecuencia, el pars es frecuentemente dañado por los contenidos acidicos del estómago. El contenido de ácido gástrico elevado es multifactorial y se cree que es grandemente debido a una combinación de la producción de ácido clorhídrico de la célula parietal en exceso, hidrólisis luminal del carbohidrato luminal, ambos acoplados con una pérdida de gradiente de pH en los estómagos de los cerdos alimentados con una dieta alta en carbohidra os, bajo en forraje indigestible, finamente molida. Las dietas de cerdos alimentadores contienen ácidos grasos insaturados, ácidos grasos libres de cadena corta (acetato, propionato, butirato y lactato) o grasas peroxidadas, todas las cuales elevan la concentración de ácido luminal (Argenzio y colaboradores, (1975) Am . J. Physiol . 228 : 454-462 ) . Las dietas de terminación altas en carbohidrato tal como maiz y almidón de maiz también son una fuente dietética primaria de metabolitos acidicos en los cerdos. La glicólisis incompleta del almidón de maiz mediante los iones de hidrógeno de origen de célula parietal y/o acciones enzimáticas de microbios fermentativos comensales tales como el Lactobacillus y Bacillus spp. dá por resultado la generación de ácido láctico, acético y propiónico dentro del compartimiento gástrico. En realidad se ha demostrado que la colonización gástrica con especies bacterianas fermentativas dio por resultado GEU si una fuente dietética de carbohidrato (jarabe de maiz) se proporcionó a los gnotobiótos colonizados (Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . 3b : 274-282 ) . Finalmente, en credos alimentadores, la forma fisica de la dieta también influencia el desarrollo de GEU (O'Brien JJ. Gastric Ulcers. Diseases of Swine, 6th ed . Editors AD Leman AD, y colaboradores, (1986), 680-691). En general, una dieta finamente molida (<malla 3.5), aun en forma de pelotillas es un factor de riesgo importante para la ulcerogénesis presumiblemente debido a la incapacidad general de estas dietas para "confinar" los ácidos liberados al compartimiento de fermentación del estómago glandular. La pérdida de un gradiente de pH asociado con las dietas finamente molidas permite el reflujo de ácido craneal en los esófagos de pars. Como en los humanos con "acidez" recurrente, esofagitis de reflujo y el esófago de Barrett, se cree que los iones de hidrógeno de origen gástrico y los metabolitos acidicos de la glicólisis intragástrica parcial entran y acidifican el citoplasma a la célula epitelial escamosa. La Na-K-ATPasa enlazada a la membrana celular es interrumpida lo cual da por resultado la acumulación de iones de sodio intracelulares y la acumulación de agua intracelular, his ológicamente reconocido como hinchamiento celular agudo, degeneración hidrópica, paraqueratosis epitelial y finalmente necrosis. Para lesiones erosivas, la membrana de basamento implícita permanece intacta y la re-epitelización de la porción dañada del pars es rápida. Presumiblemente el pivote a la progresión de erosiones epiteliales a la ulceración es la penetración de la membrana de basamento y el daño mediado por ácido continuo a la lámina propia implícita. Este tejido desvitalizado puede ser secundariamente colonizado por microbios comensales que incluyen anaerobios fermentativos. En humanos asi como cerdos, hay un consenso fuerte de que un incremento relativo absoluto en los iones de hidrógeno gástrico (ácido) es la causa próxima del daño del pars y el esófago. Asi, un objetivo terapéutico en los humanos es elevar el pH gástrico hacia la neutralidad a través del uso de medicaciones de regulación de bicarbonato y e inhibir la producción de ion de hidrógeno gástrico nueva mediante las células parietales del fondo gástrico con inhibidores de la bomba de protones. Estos medicamentos sin prescripción proporcionan alivio sintomático inmediato para pacientes afectados con acidez y esofagitis de reflujo y directamente implican hiperacidez gástrica en la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, tales medicamentos no curan la causa implícita de la enfermedad. Los intentos para tratar la infección de Hp en humanos utilizando la inmunoterapia antes que la quimioterapia ha sido grandemente sin éxito. En particular, la inducción de la inmunidad que imita la respuesta inmune "natural" de los humanos infectados convalecientes no ha sido exitosa, puesto que la infección de Hp humana puede persistir indefinidamente a pesar de una fuerte respuesta inmune a Hp (Lee (1996) Gastroen terol . 110:2003-2006). En ratones, la protección se ha logrado con sonicados o proteínas recombinantes tal como ureA y ureB, vacA y GroEL, dados oralmente con toxina de cólera (CT) y toxina inestable al calor (LT) como adyuvantes. El enfoque ha sido principalmente en el uso de proteínas bacterianas purificadas y/o recombinantes, inmunógenos objetivos en programas de desarrollo de vacuna. En general, la protección inconsistente y solamente parcial se ha logrado. En sistemas de roedores, la vacunación por la mucosa asistida por CT o LT ha emergido como la ruta favorecida, no importando el hecho de que estas especies son altamente resistentes a los efectos tóxicos de CT/LT y los datos de roedores resultantes no directamente se traducen en experiencia en humanos o en cerdos. En particular, en cerditos inmunizados y luego estimulados con Hp, el indicador de preestimulación más fuerte de eficacia es el nivel y la presencia de IgG de suero especifico de Hp/salival, no IgA (Eaton and Krakowka (1992) Gastroen terol . 103 : 1580-1586) . La vacunación parenteral estimula una fuerte respuesta de IgG; pero no la vacunación oral. La inmunización parenteral fue completamente protectora en 50% de los cerditos inmunizados subcutáneamente en 60% de cerditos inmunizados intraperitonealmente (Eaton y colaboradores, (1998) J. In fecí: . Dis . 178:1399-1405) . En contraste, la vacunación oral con: 1) bacterias vivas (clarificadas con antimicrobianos antes de la estimulación) , 2) bacterias exterminadas intactas completas, 3) sonicados bacterianos completos y 4) sonicados bacterianos completos con adyuvante LT mucosal no logró proporcionar un solo caso (0 de 27 cerditos o 0%) de protección. El cfu bacteriano se redujo comparado con los controles pero los niveles de reducción no alcanzaron significado estadístico. Asi, en el modelo porcino de colonización por Hp y la gastritis aguda, la ruta parenteral de vacunación se presenta que es superior a la ruta oral en ambas de las medidas absolutas (infectado contra no infectado después de la estimulación) y relativa (cfu bacteriano en vacunados contra controles no vacunados) de eficacia antimicrobiana. Múltiples terapias con agente antimicrobiano han sido disponibles para el Hp humano por más de una década. Estas terapias pueden ser costosas, difíciles de administrar y frecuentemente no curan completamente la enfermedad. Tales terapias serán imprácticas en el ganado doméstico. Por otra parte, el uso imprudente de antimicrobianos promueve la emergencia de cepas resistentes a antibióticos de Hp y resistencia de Hp a metronidazol y claridrotromicina se ha incrementado (Michetti, (1997) Gut 41:728-730). Adicionalmente, como el uso de antibióticos en animales alimenticios es indeseable. Asi, hay una necesidad continua por descubrir nuevos modos para prevenir o tratar la infección con Helicobacter en tanto humanos como en animales. Los modelos animales que imitan la infección de Helicoba cter son de gran uso en estudiar las opciones de tratamiento y de prevención. Recientemente, un nuevo patógeno de Helicoba cter se recuperó de cerdos que exhiben gastritis/enfermedad de úlcera. Este patógeno llamado H. cerdo, se ha mostrado que causa enfermedad gástrica en cerditos jóvenes que es similar II a la gastritis activa asociada con Hp en humanos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está basada en el descubrimiento de un patógeno de Heli cobacter novedoso aislado de cerdos que exhiben gastritis/enfermedad de úlcera. Este organismo se ha llamado Helicobacter cerdo (He) por los inventores en la presente. Este organismo se ha mostrado por los inventores que causa enfermedad gástrica en cerditos jóvenes que es similar a la gastritis activa asociada con Hp en humanos. Las vacunas subunitarias, incluyendo antigenos y mezclas de antigenos derivadas de H. cerdo, proporcionan protección contra la infección subsecuente con la especie de Heli cobacter, tal como H. pylori y H. cerdo . La presente invención proporciona un método seguro eficaz y económico para tratar y/o prevenir la infección con He en cerdos. Por consiguiente, en una modalidad, la invención se dirige a una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como por lo menos un inmunógeno de H. cerdo . En ciertas modalidades, el por lo me?os un inmunógeno de H. cerdo se proporciona con un lisado de H. cerdo, tal como el lisado producido por la digestión proteolítica de las bacterias de H. cerdo . En modalidades adicionales, la composición además comprende un adyuvante. En otra modalidad, la invención se dirige a métodos para tratar o prevenir una infección con Helicobacter en un sujeto vertebrado, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición como es descrito en lo anterior. En ciertas modalidades, el sujeto vertebrado es un sujeto porcino. En modalidades adicionales, la infección con Helicobacter es una infección con H. cerdo . En t todavía modalidades adicionales, la composición se administra parenteralmente. En todavía otra modalidad, la invención se dirige a métodos para tratar o prevenir una infección con H. cerdo en un sujeto porcino que comprende administrar parenteralmente al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición como es descrito en lo anterior. En otra modalidad, la invención se dirige a un método para producir una composición que comprende proporcionar por lo menos un inmunógeno de H. cerdo; y combinar el inmunógeno de H. cerdo con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, el por lo menos un inmunógeno de H. cerdo se proporciona en un lisado de H. cerdo, tal como un lisado de H. cerdo producido mediante la digestión proteolítica de bacterias de H. cerdo. En modalidades adicionales, también se proporciona un adyuvante. En todavía otra modalidad, la invención se dirige a un método para detectar la infección con Heli coba cter en un sujeto que comprende proporcionar una muestra biológica del sujeto; y hacer reaccionar una muestra biológica con por lo menos un inmunógeno de H. cerdo, bajo condiciones que permiten a los anticuerpos de Helicobacter, cuando están presentes en la muestra biológica, enlazarse con el (los) inmunógeno (s) , para de esta manera detectar la presencia o ausencia de la infección por Helicobacter en el sujeto. En ciertas modalidades, el método además comprende remover los anticuerpos no enlazados; proporcionar una o más porciones capaces de asociarse con los anticuerpos enlazados; y detectar la presencia o ausencia de las una o más porciones, para de esta manera detectar la presencia o ausencia de la infección por H. cerdo . En ciertas modalidades, la marca detectable es un fluorescente o una enzima. En modalidades adicionales, en por lo menos un inmunógeno se proporciona en un lisado de H. cerdo . En todavía modalidades adicionales, la muestra biológica es una muestra de suero porcina. En modalidades adicionales, la invención se dirige a un método para detectar la infección con H. cerdo en un sujeto porcino que comprende proporcionar una muestra biológica del sujeto; y hacer reaccionar la muestra biológica con por lo menos un inmunógeno de H. cerdo, bajo condiciones que permiten a los anticuerpos de H. cerdo, cuando están presentes en la muestra biológica, enlazarse con el (los) inmunógeno (s ) ; remover los anticuerpos no enlazados; proporcionar una o más porciones capaces de asociarse con los anticuerpos enlazados y detectar la presencia o ausencia de las una o más porciones, para de esta manera detectar la presencia o ausencia de la infección con H. cerdo . En todavía en modalidades adicionales, la invención se dirige a un anticuerpo específico para un inmunógeno de H. cerdo . En ciertas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra modalidad, la invención se dirige a un lisado de H. ce rdo que comprende por lo menos un inmunógeno de H. cerdo . En ciertas modalidades, el lisado de H. cerdo se produce mediante la digestión proteolítica de bacterias de H. cerdo. La presente invención también está basada en el descubrimiento de modelos de animales que imitan la infección de H. pylori humana así como la infección con Heli coba cter porcina. Los modelos animales consisten de cerditos gnotobióticos que son inmunizados con candidatos de vacuna y luego estimulados con bacterias de 11. cerdo-similares a H. cerdo . En algunas modalidades, los cerditos se inoculan con H. ce rdo y opcionalmente se alimentan con una dieta de reemplazo de leche que contiene una fuente dietética de carbohidrato fermentable con el fin de estimular la ulceración gastroesofágica porcina (GEU) . Los modelos animales son útiles para identificar compuestos y composiciones, tales como candidatos de vacuna de H. pylori y H. cerdo, que tienen habilidad para prevenir o tratar la infección con Helicobacter en humanos y animales, tales como cerdos . Por consiguiente, en una modalidad, la invención proporciona un método para infectar un cerdito gnotobiótico con un aislado porcino de H. cerdo, el método que comprende aislar H. cerdo de un sujeto porcino para producir un aislado de H. cerdo y administrar el aislado de H. cerdo al cerdito en una cantidad suficiente para causar la infección con H. cerdo en el cerdito. En otra modalidad, la invención proporciona un método para evaluar la habilidad de una vacuna para prevenir la infección con H. cerdo en un cerdo que comprende administrar una vacuna candidata a un cerdito gtobiótico; administrar un aislado de H. cerdo al cerdito en una cantidad suficiente para causar la infección con H. cerdo en un sujeto no vacunado; y evaluar la presencia de infección de H. cerdo en el cerdito, para de esta manera evaluar la habilidad de la vacuna candidata para prevenir la infección de H. cerdo . En una modalidad preferida, la vacuna candidata es una vacuna de H. pylori que comprende por lo menos un inmunógeno de H. pylori . En otra modalidad preferida, la vacuna candidata es una vacuna de H. cerdo que comprende por lo menos un inmunógeno de H. cerdo . Una modalidad adicional proporciona un método para producir un modelo animal porcino de ulceración gastroesofágico (GEU) de los esófagos pars, el método que comprende aislar H. cerdo de un sujeto porcino para producir un aislado de H. cerdo; administrar el aislado de H. cerdo a un cerdito gnotobiótico en una cantidad suficiente para causar la infección por H. cerdo en el cerdito; y alimentar al cerdito infectado con una dieta de reemplazo de leche que contiene una fuente dietética del carbohidrato fermentable bajo condiciones suficientes para producir GEU del esófago pars . En una modalidad preferida, la fuente dietética de carbohidrato fermentable es jarabe de maíz. Una modalidad adicional proporciona un método para identificar un compuesto capaz de tratar la infección con Helicobacter, el método que comprende administrar un aislado de H. cerdo en un cerdito gnotobiótico en una cantidad suficiente para causar una infección de H. cerdo en el cerdito; suministrar un compuesto o series de compuestos al cerdito infectado; y evaluar la infección por H. cerdo en el cerdito con relación al cerdito gnotobiótico infectado con H. cerdo no tratado, en donde la infección con H. cerdo reducida en el cerdito con relación al cerdito no tratado identifica un compuesto capaz de tratar la infección por Heli coba cter. Otro método para identificar un compuesto capaz del tratamiento de la infección con H. cerdo comprende proporcionar un modelo animal o porcino de GEU producido por los métodos de la invención; suministrar un compuesto o series de compuesto al cerdito infectado; y evaluar la infección con H. cerdo en el cerdito con relación a un cerdito gnotobiótico infectado con H. cerdo no tratado en donde la infección por H. ce rdo reducida en el cerdito con relación al cerdito no tratado identifica un compuesto capaz de tratar la infección por Helicoba cter . En una modalidad preferida, el H. cerdo de los métodos divulgados se administra oralmente al cerdito, de preferencia en una cantidad de 107-109 unidades de formación de colonia. También se contempla por la invención un método para prevenir la infección por H. cerdo en un sujeto porcino que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende por lo menos un inmunógeno de Helícobacter . En una modalidad preferida, la composición comprende por lo menos un inmunógeno de H. pylori . En una modalidad especialmente preferida, la composición comprende un lisado de H. pilory. De preferencia, el lisado de H. pylori se produce mediante la digestión proteolitica de la bacteria de H. pylori . La composición ventajosamente además . comprende un adyuvante. De preferencia, la composición se administra parenteralmente. Esta y otras modalidades de la presente invención fácilmente se les ocurrirán a aquellos expertos en la técnica en vista de la descripción en la presente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Varias características preferidas y modalidades de la presente invención ahora serán descritas en más detalle por medio de ejemplos no limitativos y con referencia a las Figuras acompañantes, en las cuales: La Figura 1 muestra perfiles de SDS-PAGE de preparaciones de lisado de H. pylori y H. cerdo intactas y enzimáticamente digeridas, producidas como es descrito en los ejemplos. El ">" en la figura ilustra las bandas presentes en H. pylori y ausentes de H. cerdo . El "]" indica productos de digestión de proteasa de bajo peso molecular. Una cantidad incrementada de material de bajo peso molecular se observa en las preparaciones digeridas. Ambas digestiones estimularon respuestas de anticuerpos similares en cerdos cuando se prueban utilizando un ELISA. Las Figuras 2A y 2B muestran las separaciones de SDS-PAGE de H. cerdo intacto (2A) y una digestión de H. cerdo (2B) . Una cantidad incrementada de material de bajo peso molecular (>) se observa en la preparación digerida. Las Figuras 3A y 3B muestran un análisis de manchado de Western de H. cerdo intacto (3A) y una digestión de H. cerdo (3B) separado sobre un gel no reductor, nativo. Las Figuras 4A y 4B muestran el análisis de manchado de Western del perfil de reactividad de anticuerpo contra H. cerdo intacto (4A) y una digestión de H. cerdo (4B). Una cantidad incrementada de material de bajo, peso molecular se observa en la digestión (indicada por ]) . La intensidad de manchado incrementada también se observa (*), así como bandas inmunorreactivas adicionales (<) . Las Figuras 5A y 5B muestran los geles manchados con azul de Coomassie (5A) y manchados con plata (5B) del aislado de H. pylori 26695 contra los aislados de H. cerdo (2662 y 1268) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, bacteriología, tecnología de DNA recombinante e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Labora tory Manual , Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Syn thesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridi za tion (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Cul ture (R.K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); y Handbook Of Experimen tal Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and CC . Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications). Definiciones En la descripción de la presente invención, los siguientes términos serán empleados, y se proponen para ser definidos como es indicado enseguida. Se debe observar que, como se utiliza en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "un inmunógeno de H. cerdo" incluye una mezcla de dos o más de tales inmunógenos, y los similares . Por "infección por Helicoba cter" se propone cualquier desorden causado por una bacteria de Helicobacter, incluyendo sin limitación, H. cerdo ("infección por H. cerdo" ) , H. pylori ("infección, por H. pylori ") y H. heilmannii ("infección por H. heilmannii" ) , tal como, pero no limitado a, la gastritis tipo B superficial crónica (activa), ulceración gástrica independiente, úlceras pépticas, gástricas y duodenales, como ulceración gastroesofágica (GEU), ulceras proventriculares, hemorragia gástrica ulcerativa, gastritis atrófica, y carcinoma incluyendo linfoma MALT gástrico. El término también propone la enfermedad subclínica, por ejemplo, donde la infección por Heli cobacter está presente pero los síntomas clínicos de la enfermedad todavía no se han manifestado por sí mismos. Los sujetos con la enfermedad subclínica pueden ser asintomáticos pero no obstante están en un riesgo considerable de desarrollar úlceras pépticas y/o adenocarcinomas gástricos. Para una revisión de úlceras enfermedades asociadas con Heli coba cter, ver, Telford y colaboradores, Trends ín Biotech . (1994) 12:420-426 and Blaser, MJ. , Scien tifíc American (February 1996) : 104-107. "Evaluación de la infección por H. cerdo" o "medición de la infección por H. cerdo" incluyen examinar un cerdito para la presencia o pérdida de la bacteria de H. cerdo y/o el desarrollo, por inhibición o aminoración de la úlcera o formación de tumor con relación a un cerdito gnotobiótico infectado con H. cerdo no tratado. Los métodos para evaluar o medir la infección por H. cerdo se enseñan en la presente e incluyen las observaciones anatómicas gruesas, observación de cambios histopatológicos en los sistemas gástricos y extragástricos, . estudio microbiológico (incluyendo el manchado Gram, la observación de morfología de colonia, actividad de la enzima ureasa y catalasa, etc.), inmunorreactividad con antisueros específicos de especie y la detección de anticuerpos de suero con especies de Heli cobacter y otros métodos conocidos en la técnica. Por "i?. cerdo" ' se comprende un patógeno de Helicobacter aislado de cerdos, que tiene sustancialmente las mismas propiedades como el aislado 2662 de H. cerdo como es descrito en los ejemplos enseguida. Así, el término H. cerdo como se utiliza en la presente comprende aislados de Heli coba cter porcinos además del aislado 2662. Como se explica en los ejemplos, el aislado 2662 es similar, pero no idéntico, a los patógenos H. pylori aislados de humanos. En particular, H. pylori y H. cerdo poseen los aspectos característicos comunes del género Helicoba cter. Así, un patógeno de H. cerdo como se define en la presente tiene las siguientes características: bastones curvos cortos, Gram negativos, patrón de crecimiento microaerofílico, actividad de enzima de ureasa, actividad de enzima de catalasa y posesión de la agrupación de genes referidos como es la "isla de patogenicidad cagA" . El perfil de proteína de dos aislados de H. cerdo, 2662 y 1268, se muestran en la Figura 5. Por otra parte, el nicho gástrico preferido de H. cerdo es la curvatura menor de la cardia gástrica y el antrum. El primero está inmediatamente adyacente al esófago pars. Como se explica en los ejemplos en la presente, el aislado 2662 de H. cerdo es significativamente más patogénico y ulcerogénico en cerdos gnotobióticos que el arquetipo de especies de Helicoba cter humano ( H. pylori , cepa 26695). Los cerditos inoculados con el aislado 2662 de H. cerdo exhiben una incidencia más alta de erosiones y úlceras de los pars gástricos (GEU) mientras que los cerditos infectados con H. pylori , aislado 1268 o H. heilmannii . Adicionalmente, la incidencia de la ulceración en la mucosa glandular causada por el aislado 2662 de H. cerdo es mucho más grande que la observada con H. pylori . Por "un aislado de H. pylori " se propone un extracto o lisado derivado de una bacteria completa de H. pylori que incluye uno o más polipéptidos inmunogénicos de H. pylori , como es definido enseguida. El término por lo tanto se propone para comprender extractos crudos que contienen varios inmunógenos de H. pylori así como composiciones relativamente purificadas derivadas de los lisados crudos que incluyen solamente unos o pocos de tales inmunógenos. Tales lisados se preparan utilizando técnicas bien conocidos en el arte, descritas adicionalmente enseguida. Los inmunógenos representativos que se pueden presentar en tales lisados, ya sea solos o en combinación, incluyen inmunógenos con uno o más epítopes derivados de adesinas de H. pylori tales como, pero no limitados a, inmunógenos de H. pylori que incluyen una hemaglutinina fibrilar que enlaza N-acetil-neuraminilactosa de 20 kDa (hpaA) , una proteína 63 kDa que enlaza fosfatidiletanolamina y gangliotetraosil ceramida, y una estructura similar a pilus fimbrial conservado. Ver, por ejemplo, Telford y colaboradores, Trends in Biotech . (1994) 1^2:420-426 para una descripción de estos antígenos. Otros inmunógenos que pueden estar presentes en el lisado incluyen inmunógenos con uno o más epítopes derivados de cualquiera de las diversas flageíinas de H. pylo ri conocidas como la flagelina mayor, FlaA y la flagelina menor, FlaB. Los flagelos de H. pylori están compuestos de FlaA y FlaB, cada uno con peso molecular de aproximadamente 55 kDa. Cualquiera o ambos de FlaA y/o FlaB se pueden utilizar en los lisados de la presente invención. Otro inmunógeno de 11. pylori representativo es una ureasa de H. pylori que está asociada con la membrana externa y el espacio periplásmico de la bacteria. La holoenzima de H. pylori es un complejo grande constituido de dos subunidades de 26.5 kDa (UreaA) y 61 kDa (UreB) , respectivamente. Los inmunógenos de H. pylori con epítopes derivados de la holoenzima, ya sea de las subunidades, como una combinación de 'los tres, pueden estar presentes en las composiciones. Otro inmunógeno representativo que puede estar presente en el lisado o utilizada en forma purificada adicional incluye la proteína de choque térmico de H. pylori conocida como "hsp60". Ver, por ejemplo, la publicación internacional No. WO 93/18150. Adicionalmente, la citotoxina de H. pylori también puede estar presente. Esta citotoxina es una ATPasa de transporte de iones que incluye formas de 87kDa (monómero) y 972 kDa (decámero) . Una citotoxina es comúnmente llamada "CagA". CagA está asociada con el antígeno inmunodominante y es expresada sobre la superficie bacteriana. El DNA y las secuencias de aminoácidos correspondientes de CagA de H. pylori son conocidos. Ver, por ejemplo, la publicación internacional No. WO 93/18150, publicada el 16 de Septiembre de 1993. La proteína nativa muestra variabilidad de tamaño de intercepa debido a la presencia de un número variable de repeticiones de un segmento de DNA 102 bp que codifica repeticiones de la secuencia de aminoácido rica en prolina. Ver, Covacci y colaboradores, Proc . Na ti . Acad. Sci USA (1993) _90: 5791-5795. Por consiguiente, el peso molecular reportado de CagA varia en aproximadamente 120-135 kDa. Por otra parte, si CagA está presente en el lisado, este puede estar presente como cualquiera de las varias variantes de CagA, fragmentos de los mismos y muteínas de los mismos, que retienen actividad. Todavía otro inmunógeno que puede estar presente en el lisado incluye la proteina VacA de H. pylori . El DNA y las secuencias de aminoácidos correspondientes para VacA de H. pylori son conocidas y reportadas en, por ejemplo, la publicación internacional No. WO 93/18150, publicada el 16 de Septiembre de 1993. El gen para el polipéptido VacA codifica un precursor de aproximadamente 140 kDa que es procesado a una molécula activa de aproximadamente 90-100 kDa. Esta molécula, a su vez, es segmentada de manera lenta proteoli ticamente para generar dos fragmentos que copurifican con la molécula 90 kDa intacta. Ver, Telford y colaboradores, Trends in Biotech . (1994) 12:420-426. Así, el lisado puede incluir la proteína precursora, así como la molécula activa procesada, fragmentos proteolíticos activos de la misma o porciones o proteínas de la misma, que retiene la actividad biológica . Se va a entender que el lisado también puede incluir otros inmunógenos no específicamente descritos en la presente. Por "un lisado de H. cerdo" se propone un extracto o lisado derivado de una bacteria completa de H. cerdo que incluye uno o más polipéptidos inmunogénicos de H. cerdo. Así, un lisado de H. cerdo puede incluir uno o más polipéptidos inmunogénicos correspondientes a los inmunógenos de H. pylori descritos inmediatamente en lo anterior. El término "polipéptido" cuando se utiliza con referencia a un inmunógeno de Helicobacter, tal como BacA, CagA o cualquiera de otros inmunógenos descritos en lo anterior, se refiere a VacA, CagA, etc., ya sea nativos, recombinados o sintéticos, el cual es derivado de cualquier cepa de Heli cobacter. El polipéptido no necesita incluir la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la molécula de referencia pero puede incluir solamente tanto la molécula como sea necesario con el fin de que el polipéptido retenga la inmunogenicidad y/o la habilidad para tratar o prevenir la infección por H. ce rdo, como es descrito enseguida. Así, solamente uno o pocos epítopes de la molécula de referencia necesita estar presente. Además, el polipéptido puede comprender una proteina de fusión entre la molécula de referencia de longitud completa o un fragmento de la molécula de referencia, y otra proteína que no interrumpe la reactividad del polipéptido de Helicoba cter. Es fácilmente evidente que el polipéptido por lo tanto puede comprender la secuencia de longitud completa, fragmentos, secuencias truncadas y parciales, asi como análogos y formas precursoras de la molécula de referencia. El término también propone supresiones, adiciones y sustituciones a la secuencia de referencia, mientras que el polipéptido retenga la inmunogenicidad. Así, la proteínas de longitud completa y fragmentos de la misma, asi como proteínas con modificaciones, tales como supresiones, adiciones y sustituciones (ya sea de naturaleza conservativa o no conservativas), a la secuencia nativa, como se propone para uso en la presente, mientras que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de la mutagénesis dirigida al sitio, pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de los hospederos que producen las proteínas o errores debido a la amplificación de PCR. Por consiguiente, las proteínas activas sustancialmente homologas a la secuencia parental, por ejemplo, proteínas con 70, 80, 85, 90, 95, 98, 99% etc., de identidad que retienen la actividad biológica, son contemplados para el uso en la presente. El término "análogo" se refiere a derivados biológicamente activos de la molécula de referencia, como fragmentos de tales derivados, que retienen la actividad, como es descrito en lo anterior. En general, el término "análogo" se refiere a compuestos que tienen una secuencia de polipéptido nativa y estructura con una o más adiciones de aminoácidos, como sustituciones y/o supresiones, con relación a la molécula nativa. Los análogos particularmente preferidos incluyen sustituciones que son de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que toman lugar dentro de una familia de aminoácidos que son relacionados en sus cadenas laterales. Específicamente, los aminoácidos generalmente se dividen en cuatro familias: (1) acídica - aspartato glutamato; (2) básica - lisina, arginina, histidina; (3) no polar - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polar no cargada -glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina treonina, tirosina. Fenilalanina, triptofano y tirosina son algunas veces clasificados como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que un reemplazo aislado de leucina con isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo conservativo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto mayor sobre la actividad biológica. Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta aproximadamente 5-10 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, o aun hasta aproximadamente 15-25 o 50 sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, como cualquier número entre 5-50, mientras que la función deseada de la molécula permanece intacta. Una proteina o polipéptido "purificada" es una proteína que es recombinantemente o sintéticamente producida, o aislada de su hospedero natural, tal que la cantidad de proteina presente en una composición es sustancialmente más alta que aquella presente en una preparación cruda. En general, una proteina purificada será por lo menos aproximadamente 50% homogénea y más de preferencia por lo menos aproximadamente 80% a 90% homogénea. Por "biológicamente activa" se propone una proteína de Helicobacter que induce una respuesta inmunológica, como es definido enseguida . Por "epítope" se propone un sitio de un antígeno al cual las células B específicas y las células T responden. Al término también se utiliza intercambiablemente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Un epítope puede comprender 3 o más aminoácidos en una conformación especial única al epitope. Generalmente, un epítope consiste de por lo menos 5 de tales aminoácidos y, más usualmente, consiste de poi lo menos 8-10 de tales aminoácidos. Los métodos para determinar la conformación especial de aminoácidos son conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, la cristalografía por rayos X y la resonancia magnética nuclear bidimensional. Además, como la identificación de epítopes en una proteína dada es fácilmente realizado utilizando técnicas bien conocidas en el arte, tal como mediante el uso de estudios de hidrofobicidad y mediante la . serología dirigida al sitio. Ver, también, Geysen y colaboradores, Proc . Na ti . Acad . Scí USA (1984), 8J_: 3998-4002 (método general para sintetizar rápidamente péptidos para determinar la localización de epítopes inmunogénicos en un antígeno dado), patente norteamericana No. 4,708,871 (procedimiento para identificar y sintetizar químicamente epítopes de antígenos); y Geysen y colaboradores, Molecular Immunology (1986) 23:709-715 (técnica para identificar péptidos con alta afinidad para un anticuerpo dado) . Los anticuerpos que reconocen el mismo epítope pueden ser identificados en un inmunoensayo simple que muestra la habilidad de un anticuerpo para bloquear el enlace de otro anticuerpo a un antígeno objetivo. Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el hospedero de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpo a la composición o vacuna de interés. Usualmente, una "respuesta inmunológica" incluye pero no está limitada a uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T ayudantes, células T supresoras, y/o células T citotóxicas y/o células T ?d, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. De preferencia, el hospedero exhibirá una respuesta inmunológica protectora a el (los) inmunógeno (s) de Helicoba cter en cuestión, por ejemplo, el hospedero será protegido de la infección subsecuente por H. cerdo y tal protección será demostrada por ya sea una reducción o falta de síntomas normalmente exhibidas por un hospedero infectado con tiempo de recuperación más rápido. Los términos proteína o polipéptido "inmunogénicos" se refiere a una secuencia de aminoácidos que induce una respuesta inmunológica como es descrito en lo anterior. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", como se utiliza en la presente, incluye la secuencia de longitud completa del inmunógeno de Helicobacter particular en cuestión, incluyendo cualquier precursor y formas maduras, análogos de los mismos, o fragmentos inmunogénicos de los mismos. Por "fragmento inmunogénico" se propone un fragmento del inmunógeno Helicobacter en cuestión que incluye uno o más epitopes y así induce la respuesta inmunológica descrita en lo anterior. Los fragmentos inmunogénicos, para propósitos de la presente invención, usualmente serán por lo menos de aproximadamente 2 aminoácidos en longitud, más de potencia aproximadamente 5 aminoácidos en longitud, y más de potencia por lo menos aproximadamente 10 a 15 aminoácidos en longitud. No hay límite superior crítico en la longitud del fragmento, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia de proteína, o aun una proteína de fusión que comprende dos o más epítopes del ínmunógeno de Heli coba cter en cuestión. "Homología" se refiere al por ciento de identidad entre dos polinucleótidos o dos porciones de polipéptido. Dos DNA, o dos secuencias de polipéptido son "sustancialmente homologas" entre si cuando las secuencias exhiben por lo menos aproximadamente 50%, de preferencia por lo menos aproximadamente 75%, más de preferencia por lo menos aproximadamente 80%-85%, de preferencia por lo menos aproximadamente 90%, y mucho más de preferencia por lo menos aproximadamente 95%-98% de identidad de secuencia sobre una longitud definida de las moléculas. Como se utiliza en la presente, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran identidad completa al DNA especificado o secuencia de polipéptido. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia de nucleótido-a-nucleótido o aminoácido-a-aminoácido exacta de dos polinucleótídos o secuencias de polipéptido respectivamente. El por ciento de identidad se puede determinar mediante una comparación directa de información de secuencia entre dos moléculas al alinear las secuencias, al contar el número exacto de igualaciones entre las dos secuencias alineadas, al dividir entre la longitud de la secuencia más corta y multiplicar el resultado por 100-Los programas de computadora fácilmente disponibles se pueden utilizar para ayudar en el análisis, tal como ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Seqúense and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta al algoritmo de homología local de Smith y Waterman Advances in Appl Ma th . 2 : 482-489, 1981 para el análisis de péptido. Los programas para determinar la identidad de secuencia de nucleótidos están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas VESTFIT, FASTA y GAP, que también dependen del algoritmo Smith and Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros de error recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Secuence Analysis Package referido en lo anterior. Por ejemplo, con el por ciento de identidad de una secuencia de nucleótido particular a una secuencia de referencia se puede determinar utilizando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de registro de error y una sanción de espacio de seis porciones de nucleótido. Otro método para establecer el por ciento de identidad en el contexto de la presente invención es el uso del paquete de programas MPSRCH protegido por la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) . De este sitio de paquetes el algoritmo S ith-Waterman puede ser empleado donde los parámetros de error se utilizan para la tabla de registro (por ejemplo, sanción abierta de espacio 12, sanción de extensión de espacio de uno, y un espacio de seis) . De los datos generados el valor "Match" refleja "identidad de secuencia". Otros programas adecuados para calcular el por ciento de identidad o similitud entre secuencias son generalmente conocidas en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineación es BLAST, utilizados con parámetros de error. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden utilizar utilizando los siguientes parámetros de error: código genético= estándar; filtro= ninguno; hebra= ambas; corte= 60; esperado= 10; Matriz= BLOSUM62; Descripciones= 50 secuencias; clasificado por= HIGH SCQRE; Databases= no redundante, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS traducciones+proteína Suiza-?-Subdato-?-PIR. Los detalles de estos programas son bien conocidos en la técnica. Alternativamente, la homología se puede determinar para la hibridación de polinucleótidos bajo condiciones que forman duplexos estables entre regiones homologas, seguido por la digestión con nucleasa (s) específica (s) de una sola hebra, y la determinación de tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de DNA que son sustancialmente homologas pueden ser identificadas en un experimento de hibridación de Southern bajo, por ejemplo, condiciones severas, como es definido para este sistema particular. La definición de condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la habilidad de la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra ; DNA Cloning, supra ; Nuclei c Acid Hybridi za tion , supra . Una "secuencia de codificación" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que es transcrita (en el caso de DNA) y traducidas (en el caso de mRNA) en un polipéptido ín vi tro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación son determinadas por el codón de inicio en el 5' (amino) terminal y el codón de detención de traducción en el 3' (carboxi) terminal. Una secuencia de terminación de transcripción puede ser localizada 3' a la secuencia de codificación . Por "vector" se propone cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, virus, virión, etc., que es capaz de la replicación cuando se asocia con los elementos de control apropiado y que puede transferir las secuencias del gen de transferencia en las células. Así, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales . Por "vector recombinante" se propone un vector que incluye una secuencia de ácido nucleico heterólogo que es capaz de la expresión in vi tro o in vivo . El término "transfección" se utiliza para referirse a la captación de DNA foráneo por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el DNA exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección son generalmente conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Graham y colaboradores, (1973) Virology, 52:456, Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning, a labora tory manual , Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis y colaboradores, (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu y colaboradores, (1981) Gene 13:197. Tales técnicas se pueden utilizar para introducir una o más porciones de DNA exógenas en células hospederas adecuadas. El término "heterólogo" como se relaciona a secuencias de ácido nucleico tales como secuencias de codificación y secuencias de control, denota secuencias que normalmente no son unidas conjuntamente, y/o no son normalmente asociadas con una célula particular. Asi, una región "heteróloga" y una construcción de ácido nucleico o un vector es un segmento de ácido nucleico dentro o unido a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de una construcción de ácido nucleico podría incluir una secuencia de codificación flanqueada por secuencias no encontradas en asociación con la secuencia de codificación en la naturaleza. Otro ejemplo de secuencia de codificación heteróloga es una construcción donde la secuencia de codificación misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo) . De manera similar, una célula transformada con una construcción que no está normalmente presente en la célula será considerada para los propósitos de esta invención. La variación alélica o eventos mutacionales que ocurren naturalmente no dan origen a DNA heterólogo, como se utiliza en la presente. Una secuencia de "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de DNA o RNA. El término captura secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de DNA y RNA tales como, pero no limitados a 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5- (carboxihidroxil-metil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina . 1-metiladenina, 1-metilpseudo-uracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metil-citosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxi-amino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5' -metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibu toxosina, pseudouraciio, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2 , 6-diaminopurina . El término "secuencias de control" DNA se refiere colectivamente a secuencias de promotor, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de transcripción, dominios reguladores corriente arriba, orígenes de replicación, sitios de entrada de ribosoma interno ("IRES"), mejoradores y los similares, que colectivamente proporcionan la replicación, transcripción y traducción de una secuencia de codificación en una célula recibidora. No todas estas secuencias de control necesitan siempre estar presentes mientras que la secuencia de codificación seleccionada sea capaz de ser replicada, transcrita y traducida en una célula hospedera apropiada. El término "promotor" se utiliza en la presente en su sentido ordinario para referirse a una región de nucleótido que comprende una secuencia reguladora de DNA, en donde la secuencia reguladora se deriva de un gen que es capaz de enlazar RNA polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (3' -dirección) . Los promotores de transcripción pueden incluir "promotores inducibles" (donde la expresión de una secuencia de polinucleótido operablemente enlazada al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteina reguladora, etc.), "promotores reprimibles" (donde la expresión de una secuencia de polinucleótido operablemente enlazada al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteina reguladora, etc.) y "promotores constitutivos". "Operablemente enlazado" se refiere a un arreglo de elementos en donde los elementos así descritos se configuran para realizar su función usual. Así, como las secuencias de control operablemente enlazadas a una secuencia de codificación son capaces de efectuar la expresión de la secuencia de codificación. Las secuencias de control no necesitan ser contiguas con la secuencia de codificación, mientras que ellas funcionan para elegir la expresión de las mismas. Asi, por ejemplo, la intervención de las secuencias no traducidas todavía transcritas pueden estar presentes entre una secuencia de un promotor de las secuencias de codificación y la secuencia de promotor puede todavía ser considerada "operativamente enlazada" a la secuencia de codificación. Para el propósito de describir la posición relativa de las secuencias de nucleótido en una molécula de ácido nucleico particular por toda la presente solicitud, tal como cuando una secuencia de nucleótido particular es descrita como que esta situada "corriente arriba", "corriente abajo", "3 prima (3')" o "5 prima (5')" relativa a otra secuencia, se va a entender que esta es la posición de las secuencias en la hebra de "sentido" o "de codificación" de una molécula de DNA que está siendo referida como es convencional en la técnica. Por "sujeto vertebrado" se propone cualquier miembro del subphylum chordata, incluyendo, sin limitación, mamíferos tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, caballos y humanos; animales domésticos tales como perros y gatos; y aves, incluyendo aves domésticas, silvestres y de juego tales como gallos y gallinas incluyendo pollos, pavos y otras aves gallináceas; y peces.' El término no denota una edad particular. Así, tanto animales adultos como recién nacidos, así como fetos, se proponen para ser incluidos. Los términos "cantidad efectiva" o "cantidad terapéuticamente efectiva" de una composición o agente, como se proporciona en la presente, se refiere a una cantidad no tóxica pero suficiente de la composición o agente para proporcionar el "efecto terapéutico" deseado, tal como para inducir una respuesta inmune como es descrito en la presente, de preferencia prevenir, reducir o revertir los síntomas asociados con la infección de Heli cobacter . Este efecto puede ser para alterar un componente de una enfermedad (o desorden) hacia un efecto deseado o punto final, tal que una enfermedad o desorden en el sujeto muestra mejora, frecuentemente reflejada por amelioración de un signo o síntoma relacionado a la enfermedad o desorden. Por ejemplo, un efecto terapéutico representativo puede transformar al sujeto negativo para la infección por Helicobacter cuando la mucosa gástrica es cultivada para un patógeno de Helicoba cter. De manera similar, las biopsias que indican producción de anticuerpo IgG, IgM e IgA disminuida dirigida contra el patógeno de Helicobacter son indicación de un efecto terapéutico. De manera similar, los anticuerpos de suero disminuidos contra el patógeno de Heli cobacter son un indicativo de un efecto terapéutico. La inflamación gástrica reducida también es indicativa de un efecto terapéutico. La cantidad exacta requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, edad y condición general del sujeto, la severidad de la condición que es tratada, y los componentes particulares de la composición administrada, modo de administración y los similares. Una cantidad "efectiva" apropiada en cualquier caso particular puede ser determinada por uno de habilidad ordinaria en la técnica utilizando la experimentación de rutina. "Tratamiento" o "que trata" la infección por Helicobacter incluye: (1) prevenir la enfermedad de Helicobacter, o (2) causar que los desórdenes relacionados con la infección por Helicobacter se desarrollan u ocurren en proporciones mínimas en un sujeto que puede ser expuesto a Helicobacter , tal como H. cerdo, (3) reducir la cantidad de Helicobacter presente en un sujeto, y/o reducir los síntomas asociados con la infección por Heli coba cter. Como se utiliza en la presente, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislado de un individuo, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea, bilis, fluido espinal, fluido linfático, muestras de la piel, secreciones externas de la piel, tractos respiratorios, intestinal y genitourinario, muestras derivadas del epitelio gástrico y la mucosa gástrica, lágrimas saliva, leche, células sanguíneas, órganos, biopsias y también muestras de constituyentes de cultivo en células in vi tro que incluyen pero no limitados a medios condicionados que resultan del crecimiento de células y tejidos en el medio de cultivo, por ejemplo, células recombinantes y componentes celulares. Como se utiliza en la presente, los términos "marca" y "marca detectable" se refiere a una molécula capaz de la detección, incluyendo, pero no limitado a, isótopos radioactivos, fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimas, sustratos de enzima, cofactores de enzima, inhibidores de enzima, cromóforos, tintes, iones de metal, soles de metal, ligandos (por ejemplo, biotina o haptenos) y los similares. El término "fluorescente" se refiere a una sustancia o una porción de la misma que es capaz de exhibir fluorescencia en el intervalo detectable. Ejemplos particulares de marcas que pueden ser utilizadas bajo la invención incluyen fluoresceína, rodamina, dansilo, umbeliferona, rojo Texas, luminol, éteres de acradimo, NADPH y a-ß-galactosidasa . Modos para Llevar a Cabo la Invención Antes de describir la presente invención en detalle, se va a entender que esta invención no está limitada a las formulaciones o parámetros de proceso particulares detectables ya que, por supuesto, pueden variar. También se va a entender que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares de la invención solamente, y no se propone para ser limitativa. Aunque un número de métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica de la presente invención, los materiales y métodos son descritos en la presente. Central para la presente invención es el descubrimiento de una nueva especie de Helicoba cter aislada de cerdos con gastritis/enfermedad de úlcera. Este organismo, llamado H. cerdo (He) por lo inventores en la presente, produce enfermedad gástrico en cerditos jóvenes es similar a la gastritis activa asociada con Hp en humanos. Por otra parte, los inmunógenos de H. cerdo proporcionan protección contra la estimulación subsecuente con las especies de Helicoba cter que proporciona reactivos de diagnóstico para detectar infección de Helicoba cter, tal como la infección de H. cerdo, en sujetos vertebrados tales como cerdos. Las vacunas de H. cerdo se puede utilizar mediante una amplia gama de aislados con Heli coba cter. Por otra parte, las vacunas son seguras, económicas, tienen una vida en anaquel indefinida que pueden ser eficientemente administradas de manera parenteral. También central a la presente invención es el desarrollo de un nuevo modelo de animal útil para estudiar la patogénesis, tratamiento y la prevención de la infección por Helicobacter, tal como la infección por H. pylori y H. cerdo . Los cerditos gnotobióticos se pueden utilizar para estudiar la habilidad de varias vacunas de Heli coba cter, tal como las vacunas de H. pylori y H. cerdo discutidas en lo anterior, para prevenir la infección con I-I. cerdo . Adicionalmente, los cerditos gnotobióticos infectados con H. cerdo se pueden utilizar para investigar varios compuestos para su habilidad para tratar la infección con Helicobacter causada por, por ejemplo, H. pylori o H. cerdo . Con el fin de dar adicionalmente un entendimiento de la invención, una discusión más detallada se proporciona enseguida que considera los modelos de animal de Helicobacter, vacunas de H. pylori , inmunógenos de Helicoba c ter, así como varios usos de los mismos. Modelos Animales de Helicobact&r Como se explicó en lo anterior, los cerditos gnotobióticos especialmente adecuados para estudiar la gastritis bacteriana/enfermedad ulcerativa causada por H. pylori . Ver , por ejemplo, Krakowka y colaboradores, (1987) Infect . Immun . b b : 2789-2796. Los cerdos gnotobióticos son onmívoros monogástricos son uría anatomía y fisiología gástrica que se asemeja estrechamente a los humanos. Bertram y colaboradores, (1991) Rev. Infect . Dis . 13. : S 714-S722. Estos credos son susceptibles a la colonización oral con muchas diferentes cepas de H. pylori . Krakowka y colaboradores, (1987) Infect . Immun . 5_5: 2789-2796; Bertram y colaboradores, (1991) Rev. Infect . Dis . 13 : S714-S722. Los inventores en la presente han descubierto que este modelo de animal también es adecuado para estudiar el patógeno de Helicoba cter porcino recientemente identificado, H. cerdo, y por lo tanto para identificar candidatos de vacuna, tales como vacunas de H. pylori (es decir, vacunas que incluyen uno o más inmunógenos derivados de H. pylori ) y vacunas de H. cerdo (es decir, vacunas que incluyen uno o más inmunógenos derivados de H. cerdo) , útiles para prevenir la infección de Heli cobacter en cerdos. Así, un uso preferido para los modelos de animal de la invención es el desarrollo de vacunas para el uso en la prevención y/o tratamiento de la infección de Helicoba cter en cerdos y enfermedades asociadas con los mismos. En este contexto, los cerdos se administran con el candidato de vacuna por lo menos una vez, y de preferencia se refuerzan con por lo menos una inmunización adicional. Por ejemplo, los cerditos gnotobióticos pueden ser administrados con una composición de vacuna para ser probadas en 1-5 días de edad, seguido por un refuerzo subsecuente 5-10 días después y opcionalmente una tercera inmunización 5-10 días después de la segunda administración. Los cerditos pueden ser vacunados tantas veces como sea necesario. Los cerditos vacunados luego se exponen a H. cerdo aproximadamente 3-20 dias después, tal como 4-10 días después de la última inmunización. Típicamente, los cerditos vacunados se administran oralmente de aproximadamente 106-1010, más particularmente aproximadamente 107-109, tal como aproximadamente 108-109 unidades de formación de colonias (cfu) de H. cerdo, y los indicios de la infección con Helicobacter son monitoreados, tal como es descrito en los ejemplos en la presente. Por ejemplo, el establecimiento de la infección de H. cerdo se puede confirmar al examinar muestras de tejido para bacterias y/o signos de inflamación, ulceración o carcinoma. Alternativamente, los cerditos gnotobióticos pueden ser primero infectados con bacteria de H. cerdo con el fin de establecer la infección con Heli coba cter. Por ejemplo, los cerditos pueden ser oralmente inoculado a 1-5 dias de edad con H. cerdo, en una cantidad suficiente para causar infección, tal como con aproximadamente 106-1010, más particularmente de manera aproximada de 107-109, tal como aproximadamente 108, cfu de H. cerdo . La presencia de la infección por H. cerdo se puede confirmar al examinar muestras de tejido para bacterias y/o signos de inflamación, ulceración o carcinoma. En modalidades alternativas, cerditos inoculados con H. cerdo se pueden alimentar con una dieta de reemplazo de leche que contiene una fuente de dieta de carbohidrato fermentable con el fin de causar ulceración gastroesofálica (GEU) del esófago pars. En esta modalidad, los cerdos típicamente se alimentan con una fórmula de reemplazo bien conocida en la técnica, tal como pero no limitadas a SIMILAC o ESBILAC, suplementado con una fuente de carbohidrato fermentable, tal como pero no limitado a jarabe de maíz, almidón de maíz, inulina, lactulosa, almidón de trigo, pulpa de remolacha, rafinosa, estaquiosa, cualquiera de varios oligasacáridos tales como fructooligosacáridos, transgalactooligosacáridos, glucooligosacáridos, mananoligosacáridos, xilooligosacáridos, o combinaciones de los anteriores. La suplementación de carbohidrato es típicamente introducida gradualmente, por ejemplo, aproximadamente 2-7% (v/v) , de preferencia aproximadamente 3-6% (v/v) , tal como aproximadamente 5% (v/v) , comenzando 1-10 días después de la inoculación de H. cerdo, tal como comenzando en 3-8 dias, de preferencia 2-4 dias después de la inoculación con H. cerdo . La cantidad de carbohidrato puede ser. incrementada a, por ejemplo, aproximadamente 8-15% (v/v) , de manera típica aproximadamente 9-12% (v/v) , tal como aproximadamente 10% (v/v) , cuando los cerditos se adaptan al aditivo, típicamente después de 3-14 días después de la suplementación inicial, generalmente 5-10 días después de la suplementación inicial. Una vez que la infección bacteriana se ha establecido y, si es deseado, la dieta de reemplazo de leche descrita en lo anterior es administrada, como un compuesto o una serie de compuestos puede suministrar al cerdito infectado en varios tiempos y en varias dosificaciones, dependiendo de los objetivos particulares de la clasificación. En una variedad de este procedimiento, puede ser deseable administrar la bacteria con un compuesto para determinar si, con relación a animales de control, el compuesto puede efectivamente prevenir in vivo la adhesión bacteriana inicial y/o el establecimiento subsecuente de la infección o patogénesis. Así, los cerditos infectados se pueden utilizar para clasificar compuestos y condiciones que previenen la infección con Heli coba cter, tales como compuestos y condiciones que bloquean el enlace de los patógenos con Helicoba cter al epitelio del intestino y/o que aminoran la patogénesis asociada con Heli coba cter de gastritis y adenocarcinoma gástrico. La eficacia del compuesto o compuestos se puede estimar al examinar los tiempos seleccionados de células de un tejido epitelial del intestino de los animales infectados para la presencia o pérdida de la bacteria de Helicoba cter y/o el desarrollo, inhibición o amielioración de la úlcera o formación del tumor con relación a los animales de control apropiados, por ejemplo, los animales infectados con H. cerdo no tratados. Los modelos de animales descritos en la presente por lo tanto proporcionan la habilidad para fácilmente estimar la eficacia de varios fármacos o compuestos basados en modos diferentes de administración y formación de compuestos. Además de utilizar los animales infectados con H. cerdo para clasificar compuestos terapéuticos, estos animales también se pueden utilizar para clasificar condiciones o estímulos que efectúan un bloqueo en o aminoran la infección por Heli coba cter y/o enfermedades del intestino asociadas. Tales estímulos o condiciones incluyen cambios ambientales o dietéticos, cambiando el pH gastrointestinal, o combinaciones de varios estímulos o condiciones que dan por resultado el estrés sobre el animal o en las bacterias de Hel icoba cter en el intestino. Así, como los animales infectados con H. cerdo pueden ser expuestos hacia un estímulo o condiciones seleccionada como una combinación de estímulos y condiciones, a ser probadas. El tejido epitelial del intestino de los animales expuesto luego se examina periódicamente para un cambio en el número de bacterias de Helicoba cter y/o estado de enfermedad del tejido epitelial con relación a los animales de control no expuestos. Otro tipo de condición que puede ser probada por los animales inoculados con H. cerdo descritos en la presente es la inducción de una respuesta inflamatoria, por ejemplo al administrar un agente químico tal como sulfato de dextrano, en varios tiempos antes de, durante o después de la administración de H. cerdo al cerdito gnotobiótico. El agente inflamatorio puede ser administrado oralmente o por cualquier otro método que da por resultado una respuesta inflamatoria gastrointestinal. La severidad de la respuesta inflamatoria puede ser controlada al variar la dosis y la duración del tratamiento del agente químico. Vacunas de Helicobacter Como se explicó en lo anterior, los modelos de animales descritos en la presente se pueden utilizar para identificar vacunas de Helicoba cter, tal como vacunas de H. pylori , útiles para prevenir la infección de Helicobacter en cerdos tal como la causada por H. cerdo . Las vacunas por Helicobacter útiles para tratar infección con H. cerdo pueden tomar varias formas, tal como las vacunas de Helicobacter inactivadas o atenuadas, incluyendo vacunas con bacterias antigénicamente aumentadas, tal como la vacuna de H. pylori descrita en por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,897,475, incorporada en la presente por referencia en su totalidad, así como vacunas subunitarias que contienen uno o más inmunógenos de Helicobacter, tales como vacunas que incluyen ureasa o subunidades de ureasa y/o epítopes, tal como las vacunas de H. pylori descritas en las patentes norteamericanas Nos. 5,972,336 y 6,290,962 incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades. Otras vacunas de Helicobacter útiles incluyen aquellas que comprenden la enzima catalasa o fragmentos inmunogénicos de la misma, tal como las vacunas de H. pylori descritas en las patentes norteamericanas Nos. 6,005,090 y '6,468,545, incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades; así como los inmunógenos de célula descritos en por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,841,155, incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Como se explicó en lo anterior, varios de otros inmunógenos de Heli cobacter existen y encontrarán uso en vacunas de Heli cobacter, tal como las vacunas de H. pylori para prevenir la infección por H. cerdo . Tales inmunógenos incluyen VacA e incluye la proteína precursora, así como la molécula activa procesada, fragmentos proteolíticos activos de la misma o porciones o muteínas de la misma, que retienen la actividad inmunogénica; cualquiera o ambas de FlaA y FlaB; las subunidades UreA y UreB de la haloenzima de ureasa, así como la haloenzima ureasa y epítopes de la misma; CagA en cualquiera de sus varias formas como es descrito en lo anterior; cualquiera de las adhesinas de Helicoba cter tales como, pero no limitadas a, la hemaglutinina fibrilar que enlaza N-acetil-neuraminilactosa (HpaA) 20 kDa y la proteína 63 kDa que enlaza fosfatidiletanolamina y gangliotetraosil ceramida, y una estructura similar al pilus imbrial conservado; hspdO; proteina de activación de neutrófilo (NAP) , ver, por ejemplo, Evans y colaboradores, (1995) Gene 153:123-127; y PCT Publication Nos. WO 96/01272 y WO 96/01273; los antígenos conocidos como antígenos HopX, HopY, 36 kDa, 42 kDa, y 17 kDa (ver la publicación de PCT No. WO 98/04702) y el antígeno 50 kDa (ver la publicación Europea No.. EP 0793676) . Los inmunógenos para el uso en composiciones de vacuna se pueden producir utilizando una variedad de técnicas. Por ejemplo, los inmunógenos se pueden obtener directamente de las bacterias de Helicoba cter, comercialmente disponibles de, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivo Tipo (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, VA. Los inmunógenos de Helicobacter de las bacterias se pueden proporcionar en un lisado, obtenido utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Generalmente, tales métodos comprenden la extracción de proteínas de las bacterias de Helicobacter utilizando tales técnicas como sonicación o ultrasonicación; agitación; extrusión líquida o sólida; tratamiento con calor; técnicas de congelación-descongelación; descompresión explosiva; choque osmótico; digestión proteolítica tal como el tratamiento con enzimas líticas que incluyen proteasas tales como pepsina, tripsina, neuraminidasa y lisozima; tratamiento con álcali; desintegración de presión; el uso1 de detergentes y solventes tales como sales biliares, dodecilsulfato de sodio, TRITÓN, NP40 y CHAPS; fraccionamiento y los similares. La técnica particular utilizada para interrumpir las células es grandemente una materia de elección y dependerá de las condiciones del cultivo y cualquier pretratamiento utilizado. Después de la interrupción de las células, los desechos celulares pueden ser removidos generalmente por centrifugación y/o diálisis. Una técnica particular para obtener una composición de 'vacuna de lisado de H. pylori se describe en los ejemplos en la presente y utiliza la digestión proteolítica, de acuerdo con un método similar al protocolo de digestión descrito en Waters y colaboradores, (2000) Va ccine 18:711-719. En esta técnica, las bacterias de H. pylori se recuperan por centrifugación y la pelotilla bacteriana se resuspende, se congela y se liofiliza. Para la digestión bacteriana, la pepsina se incuba con las bacterias liofilizadas durante 24-30 horas a 37 grados C. Los inmunógenos presentes en tales lisados pueden ser además purificados si es deseado, utilizando técnicas de purificación estándares tales como pero no limitado a, cromatografía de columna, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, electroforesis, HPLC, técnicas inmunoabsorbentes, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, y los similares. Ver, por ejemplo, la publicación de PCT No. WO 96/12965, publicada el 2 de Mayo de 1996, para una descripción de la purificación de varios antígenos de H. pylori . Los inmunógenos de Helicobacter también se pueden generar utilizando métodos recombinantes, bien conocidos en la técnica. A este respecto, las sondas de oligonucleótido se pueden desviar basado en la secuencia del genoma de Heli coba cter particular y utilizadas para el sondeo de librerías genómicas o de cDNA de genes de Heli cobacter que codifican para los antígenos útiles en la presente invención. Lo genes además pueden ser aislados utilizando técnicas estándares y, si se desea, enzimas de restricción empleadas para mutar el gen en porciones deseadas de la secuencia de longitud completa. De manera similar, los genes de Helicobacter pueden ser aislados directamente de células bacterianas utilizando técnicas conocidas, tal como la extracción de fenol y la secuencia puede ser además manipulada para producir cualquiera de las alteraciones deseadas. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra , para una descripción de técnicas utilizadas para obtener y aislar DNA. Finalmente, los genes que codifican los i?munógenos de Helicobacter pueden ser producidos sintéticamente, basados en las secuencias conocidas. La secuencia de nucleótidos puede ser diseñada con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos particular deseada. En general, se seleccionarán codones preferidos para el hospedero propuesto en el cual la secuencia será expresada. La secuencia completa es generalmente ensamblada de oligonucleótidos sobrepuestos preparados por métodos estándares y ensamblada en una secuencia de codificación completa. Ver, por ejemplo, Edge, Na ture (1981) 292 : 756; Nambair y colaboradores, Science (1984) 223:1299; Jay y colaboradores, J. Biol . Chem . (1984) 259:6311. Una vez que las secuencias de codificación de los polipéptidos deseados se han aislado o sintetizado, ellas se pueden clonar en cualquier vector o replicón adecuado para la expresión en una variedad de sistemas, incluyendo los sistemas de expresión de insecto, mamíferos, bacterianos, virales y de levadura, todos bien conocidos en la técnica. En particular, las células hospederas se transforman con vectores de expresión que incluyen secuencias de control operablemente enlazadas a la secuencia de codificación deseada. Las secuencias de control serán compatibles con la célula hospedera particular utilizada. Frecuentemente es deseable que los polipéptidos preparados utilizando los sistemas anteriores en polipéptidos de fusión. Como con las proteínas de no fusión, estas proteínas se pueden expresar intracelularmente o se pueden secretar de la célula en el medio de crecimiento. Además, se pueden construir plásmidos que incluyen una secuencia de gen quimérico, que codifica, por ejemplo, múltiples antígenos de Helicoba cter. Las secuencias de gen pueden ser presentes en una configuración de gen dicistrónico . Los elementos de control adicionales pueden ser situados entre los diversos genes para la producción eficiente de RNA desde la región de codificación distal. Alternativamente, una unidad de transcripción quimérica que tiene una sola estructura de lectura abierta que codifica los múltiples antígenos también puede . ser construida. Ya sea una fusión se puede hacer para permitir la síntesis de una proteína quimérica o alternativamente, las señales de procesamiento de proteína se puede diseñar para proporcionar segmentación mediante una proteasa tal como una peptidasa de señal, permitiendo de esta manera la liberación de las dos o más proteínas derivadas de la traducción del RNA de plantilla. La proteasa de procesamiento también puede ser expresada en este sistema ya sea independientemente o como parte de una quimera con el antígeno y/o región (es) de codificación de citoquina. La proteasa misma puede ser tanto una enzima de procesamiento como un antígeno de vacuna. Dependiendo del sistema de expresión y el hospedero seleccionado, los inmunógenos de la presente invención se producen al cultivar células hospederas transformadas por un vector de expresión bajo condiciones mediante las cuales el inmunógeno de interés es expresado. El inmunógeno luego es aislado de las células hospederas y purificado. Si el sistema de expresión proporciona secreción del inmunógeno, el inmunógeno puede ser secretado directamente del medio. Si el inmunógeno no es secretado, este es aislado de los lisados de célula. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas y los métodos de recuperación están dentro de la habilidad de la técnica. Los inmunógenos de Heli coba cter también se pueden producir mediante síntesis químicas tal como mediante la síntesis de péptido en fase sólida o solución, utilizando métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica. La síntesis química de péptidos puede ser preferible si el antígeno en cuestión es relativamente pequeño. Ver, por ejemplo, J. M. Stewart y J. D. Young, Solid Phase Peptide Syn thesis, 2nd Ed. , Pierce Chemical Co . , Rockford, IL (1984) y G. Barany y R. B. Merrifield, The Peptides : Analysis , Syn thesis , Biology, editors E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pp . 3-254, para las técnicas de síntesis de péptido en fase sólida y M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesís, Springer- Verlag, Berlin (1984) y E. Gross y J. Meienhofer, Eds., The Peptides : Analysis , Syn thesis , Biology, supra , Vol. 1, para la sintesis en solución clásica. Formulaciones y Administración Los inmunógenos de Helicobacter, tal como los lisados de H. pylori , se pueden formular en composiciones, tales como, composiciones de vacuna, ya sea solos o en combinación con otros antigenos, para el uso en la inmunización de sujetos porcinos como es descrito enseguida. Los métodos para preparar tales formulaciones se describen en, por ejemplo Remíngton ' s Pharma ceuti cal Sciences , Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18 Edition, 1990. Típicamente, las vacunas de la presente invención se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para la solución en o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección también se pueden preparar. La preparación también puede ser emulsificada o un ingrediente activo encapsulado en vehículos de liposoma. El ingrediente inmunogénico activo generalmente se mezcla con un vehículo farmacéutico compatible, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o los similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes y agentes reguladores del pH . Los adyuvantes que aumentan la efectividad de la vacuna también se pueden adicionar a la formulación. Los adyuvantes pueden incluir por ejemplo, dipéptidos de muramilo, avridina, hidróxido de aluminio, alumbre, adyuvante de Freund, adyuvante de Freund incompleto (ICFA), bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDA), aceites, emulsiones de aceite en agua, saponinas, citoquinas y otras sustancias conocidas en la técnica. Tales adyuvantes son bien conocidos y comercialmente disponibles de un número de fuentes, por ejemplo, Difco, Pfizer Animal Health, Newport Laboratories, etc. Los inmunógenos también pueden ser enlazados a un portador con el fin de incrementar la inmunogenicidad de los mismos. Los portadores adecuados incluyen macromoléculas lentamente metabolizadas grandes, tales como proteínas, incluyendo albúminas de suero, hemocianina de lapa de punta, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina y otras proteínas bien conocidas para aquellos expertos en la técnica; polisacárídos, tales como sefarosa, agarosa, celulosa, fuentes de celulosa y los similares; aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina y los similares; copolímeros de aminoácido y partículas de virus inactivo . Los inmunógenos se pueden utilizar en su forma nativa o su contenido de grupo funcional puede ser modificado mediante, por ejemplo, succinilación de los residuos de lisina o reacción con Cys-tiolactona . Un grupo sulfidrilo también puede ser incorporado en el portador (o antígeno) , mediante, por ejemplo, reacción de funciones de amino con 2-iminotiolano o el éster de N-hidroxisuccinimida de 3- (4- ditiopiridil propionato) . Los portadores adecuados también pueden ser modificados para incorporar brazos espaciadores (tal como hexametilen diamina u otras moléculas bifuncinales de tamaño similar) para la unión de péptidos. Además, los inmunógenos se pueden formular en composiciones de vacuna en forma ya sea neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos de amino libre de los polipéptidos activos) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o tales ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y los similares. Las sales formadas de los grupos carboxilo libre también pueden ser derivadas de ácido orgánico tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y tales bases orgánicos tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamina etanol, histidina, procaina y los similares . Las formulaciones de vacuna contendrán una "cantidad terapéuticamente efectiva" del ingrediente activo, esto es, una cantidad capaz de inducir una respuesta inmune en un sujeto al cual la composición se administra. En el tratamiento y la prevención de la infección con Heli cobacter en cerdos, una "cantidad terapéuticamente efectiva" fácilmente es determinada por un experto en la técnica utilizando pruebas estándares. Los inmunógenos de Heli coba cter típicamente variarán de aproximadamente 1% a aproximadamente 95% (p/v) de la composición, o aun más alta o más baja si es apropiada. Con las formulaciones de vacuna presentes, aproximadamente 0.1 a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo por ml, de preferencia aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg/ml, más de preferencia aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/ml, tal como aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, etc., o cualquier número dentro de estos intervalos establecidos, de solución inyectada serán adecuados para lograr una respuesta inmunológica cuando se administra una dosis de aproximadamente 0.25 a 3 ml por animal . Para inmunizar un sujeto, la vacuna generalmente se administra parenteralmente, usualmente mediante inyección intramuscular. Otros modos de administración, sin embargo, tal como la inyección subcutánea, intraperitoneal e intravenosa, también son aceptables. La cantidad a ser administrada depende del animal que es tratado, la capacidad del sistema inmune del animal para sintetizar anticuerpos, y el grado de protección deseada. La dosificación se efectúa y se puede establecer fácilmente con uno de habilidad ordinaria en la técnica a través de experimentos de rutina que establecen curvas de dosis respuesta. El sujeto se inmuniza mediante la administración de la vacuna y por lo menos una dosis, y más de preferencia dos o más dosis. Por otra parte, el animal puede ser administrado con tantas dosis como sea requerido para mantener un estado de inmunidad a la invención. Las formulaciones de vacuna adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones en aerosol, intranasales, orales y formulaciones de liberación sostenida. Para supositorios, la composición de vehículo incluirá aglutinantes tradicionales y portadores, tales como, glicoles polialcalinos o triglicéridos. Tales supositorios pueden ser formados de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 10% (p/v) , de preferencia aproximadamente 1% a aproximadamente 2%. Los vehículos orales incluyen tales excipientes normalmente empleados como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, magnesio, estearato, celulosa de sacarina sódica, carbonato de magnesio y los similares. Estas composiciones de vacuna oral se pueden tomar en la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulación de liberación sostenida o polvos, y contienen aproximadamente 10% a aproximadamente 95% del ingrediente activo, de preferencia aproximadamente 25% a aproximadamente 70%. Las formulaciones intranasales usualmente incluirán vehículos que no causan irritación a la mucosa nasal ni alteran significativamente la función ciliar. Los diluyentes tales como agua, solución salina' acuosa u otras sustancias conocidas se pueden emplear dentro de la presente invención. Las formulaciones nasales también pueden contener conservadores tales como, pero no limitados a, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Un surfactante puede estar presente para aumentar la absorción de las presentes proteínas por la mucosa nasal. Las formulaciones de liberación controlada obtenidas se hacen al incorporar la proteína en portadores o vehículos tales como liposomas, polímeros impermeables no resorbibles tales como copolimeros de etileno acetato de vinilo y copolímeros Hytrel, copolímeros hinchables tales como hidrogeles o polímeros resolbibles tales como colágenos y otros poliácidos o poliésteres tales como aquellos utilizados para hacer suturas resorbibles. Los inmunógenos de Heli cobacter también pueden ser suministrados utilizando mini gomas implantadas, bien conocidas en la técnica. Los inmunógenos de Helicoba cter también se pueden administrar por la vía de un virus portador que expresa el mismo. Los virus portadores encontrarán uso con la presente invención que incluye pero no están limitados a la vaccinia u otros virus pox, adenoviris, y virus de herpes. A manera de ejemplo, los recombinantes de virus de vaccinia que expresan las proteínas novedosas pueden ser construidos como sigue. El DNA que codifica la proteína particular primero se inserta en un vector apropiado de modo que está adyacente un promotor de vaccinia y que plantea las secuencias de DNA de vaccinia, tal como la secuencia que codifica timidina quinasa (TK) . Este vector luego se utiliza para transfectar células que son simultáneamente infectadas con vaccinia. La recombinación homologa sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica la presente proteína en el genoma viral. El TK recombinante resultante puede ser seleccionado al cultivar las células en la presencia de 5-bromodeoxiuridina y la recolección de las placas virales resistentes a la misma. Una ruta alternativa de administración involucra terapia génica o inmunización de ácido nucleico. Así, las secuencias de nucleótidos (y elementos reguladores se acompañan) que codifican los inmunógenos de Helicobacter puede ser administrados directamente a un sujeto para la traducción in vivo del mismo. Alternativamente, la transferencia génica puede ser realizada al trasnfectar las células o tejidos del sujeto ex vivo y al reintroducir el material transformado en el hospedero. El DNA puede ser directamente introducido en el organismo hospedero, es decir, mediante inyección (ver la publicación internacional No. WO/90/11092; y Wolff y colaboradores, (1990) Science 247 : 1465-1468) . La transferencia génica mediada por liposoma también puede ser realizada al utilizar los métodos conocidos. Ver, por ejemplo, Hazinski y colaboradores, (1991) Am . J. Respir . Cell Mol . Biol . 4 : 206-209; Brigham y colaboradores, (1989) Am . J. Med. Sci . 298:278-281; Canónico y colaboradores, (1991) Clin . Res . 39:219A; y Nabel y colaboradores, (1990) Science 1990) 249:1285-1288. Los agentes de la inyección, tales como anticuerpos dirigidos contra los antígenos de superficie expresados sobre tipos de células específicos, pueden ser covalentemente conjugados a la superficie liposomal de modo que el ácido nucleico puede ser suministrado a tejidos y células específicas susceptibles a infección. Las composiciones de la presente invención se pueden administrar antes de, subsecuente a o concurrentemente con los agentes antimicrobianos tradicionales utilizados para tratar la enfermedad por Helicobacter, tal como pero no limitados a salicilato de bismuto,, metronidazol, amoxicilina, omeprazol, claritromicina, ciprofloxacina, eritromicina, tetraciclina, nitrofurantoína, ranitidina, omeprazol y los similares. Un método particularmente preferido del tratamiento es primero administrar antibióticos convencionales como es descrito en lo anterior seguido por la vacunación con las composiciones de la presente invención una vez que la infección con Helicobacter se ha puesto en claro.

Diagnósticos Los inmunógenos de H. cerdo, incluyendo lisados de H. cerdo, también se pueden utilizar como diagnósticos para detectar la presencia de anticuerpos reactivos dirigidos contra la bacteria en una muestra biológica. Además, los inmunógenos pueden ser utilizados para monitorear el curso de la terapia con antibiótico al comparar resultados obtenidos al inicio de la terapia a aquellos obtenidos durante y después del curso del tratamiento. Por ejemplo, la presencia de anticuerpos reactivos con los antígenos de H. cerdo se pueden detectar utilizando técnicas electroforáticas y de inmunodiagnóstico estándares, incluyendo inmunoensayos tal como los ensayos de competición, reacción directa, o de tipo de intercalación. Tales ensayos incluyen, pero no están limitados a, manchado de Western; pruebas de aglutinación; inmunoensayos marcados y mediados por enzima, tal como ELISAs; ensayos de tipo biotina/avidina; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación, etc. Las reacciones generalmente incluyen marcas de revelación tales como fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas, marcas enzimáticas o moléculas de tinte, u otros métodos para detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el anticuerpo o los anticuerpos reaccionados con el mismo. Los ensayos mencionados en lo anterior generalmente involucran la separación del anticuerpo no enlazado a una fase líquida de un soporte en fase sólida a la cual se enlazan los complejos de antígeno-anticuerpo . Los soportes sólidos que pueden ser utilizados en la práctica de la invención incluyen sustratos tales como nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de cavidad de membrana o de microtítulo); polivinilcloruro (por ejemplo, hojas o cavidades de microtítulos) ; látex de poliestireno (por ejemplo, cuentas o placas de microtítulo) ; fluoruro de polivinilidina; papel diazotizado; membranas de nylon; cuentas activadas, cuentas magnéticamente responsivas y los similares. Típicamente, un soporte sólido primero se hace reaccionar con un componente de fase sólida (por ejemplo, uno o más de antígenos de H. cerdo, tal como un lisado de H. cerdo producido mediante la digestión proteolítica de bacteria de H. cerdo) bajo condiciones de enlace adecuadas tal que el componente es suficientemente inmovilizado al soporte. Algunas veces, la inmovilización del antígeno al soporte puede ser aumentado al primero acoplar el antígeno a una proteína con mejores propiedades de enlace. Las proteínas de acoplamiento adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, macromoléculas tales como albúminas de suero que incluyen albúminas de suero bovino (BASA) , hemocianina de lapa de punta, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina y otras proteínas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Otras moléculas que pueden ser utilizadas para enlazar los antígenos al soporte incluyen polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido y los similares. Tales moléculas y métodos para acoplar estas moléculas a los antígenos, son bien conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Ver, por ejemplo, Brinkley, M.A., Bioconj uga te Chem . (1992) 3:2-13; Hashida y colaboradores, J. Appl . Biochem . (1984) 6 : 56-63; y Anjaneyulu y Staros, Interna tional J. of Peptide y Pro tein Res . (1987) 30:117-124. Después de la reacción del soporte sólido con el componente de fase sólida, cualquiera de los componentes de fase sólida no inmovilizados se remueven del soporte mediante lavado, y el componente enlazado al soporte luego se pone en contacto con la muestra biológica que se sospecha de contener por'ciones de ligandos (por ejemplo, anticuerpos hacia los antígenos inmovilizados) bajo condiciones de enlace adecuadas. Después del lavado para remover cualquier ligando no enlazado, una porción enlazadora secundaria- se adiciona bajo condiciones de enlace adecuadas, donde el enlazador secundario es capaz de asociarse selectivamente con el ligando enlazado. La presencia del enlazador secundario luego puede ser detectada utilizando técnicas bien conocidas en el arte . Más particularmente, se puede utilizar un método de ELISA, donde las cavidades de una placa de microtítulo se recubren con el (los) antígeno (s) de H. cerdo . Una muestra biológica que contiene o se sospecha de contener moléculas de inmunoglobulina de anti-ff. cerdo luego se adicionan a las cavidades recubiertas. En los ensayos donde se desea utilizar una placa de microtitulo, un número seleccionado de cavidades pueden ser recubiertas con, por ejemplo, una primera porción de antígeno, un diferente producto de cavidad recubiertas con una segunda porción de antígeno y así sucesivamente. En lo alternativo, unas series de ELISAs pueden ser corridas en tándem. Después de un período de incubación suficiente para permitir el enlace de anticuerpo en los antígenos inmovilizados, la(s) placa (s) luego se puede lavar para remover las porciones no enlazadas y una molécula de enlace secundaria detectablemente marcada adicionada. La molécula de enlace secundarias se deja reaccionar con cualquiera de los anticuerpos de muestra capturados, la placa se lava y la presencia de la molécula de enlace secundaria detectada utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Así, en una modalidad particular, la presencia de ligandos de antígeno de anti-H. cerdo enlazado de una muestra biológica se pueden detectar fácilmente utilizando un enlazador secundario que comprende un anticuerpo dirigido contra los ligandos de anticuerpo. Un número útil de moléculas de inmunoglobulina (Ig) bien conocidas en las técnicas comercialmente disponibles. Las moléculas Ig para uso en la presente de preferencia serán del tipo IgG o IgA, sin embargo, IgM también puede ser apropiado en algunos casos. Las moléculas Ig pueden ser fácilmente conjugadas en una marca de enzima detectable, tal como peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, Beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y ureasa, entre otros, utilizando métodos conocidos por aquellos de habilidad en la técnica. Un sustrato de enzima apropiado luego se utiliza para generar una señal detectable. En otras modalidades relacionadas, las técnicas de ELISA de tipo competitivo pueden ser practicadas utilizando métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica . Los ensayos también se pueden conducir en solución, tal que las proteínas bacterianas y anticuerpos específicos para esas proteínas bacterianas forman complejos bajo condiciones de precipitación. En una modalidad particular, el (los) antígeno (s) de H. cerdo pueden ser unidos a una partícula de fase sólida (por ejemplo, una cuenta de agarosa o los similares) utilizando técnicas de acoplamiento conocidas en el arte, tal como mediante el acoplamiento químico directo o indirecto. La partícula recubierta de antígeno luego se pone en contacto bajo condiciones de enlace adecuadas con una muestra biológica que es hecha del contenido de anticuerpos para H. cerdo . La reticulación entre los anticuerpos enlazados causa la formación de los agregados de complejo de partícula-antígeno-anticuerpo que pueden ser precipitados o separados de la muestra utilizando lavado y/o centrifugación. La mezcla de reacción puede ser analizada para determinar la presencia o ausencia de complejos de anticuerpo-antígeno utilizando cualquiera de un número de métodos estándares, tales como aquellos métodos de inmunodiagnóstico descritos en lo anterior. En todavía una modalidad adicional, se puede proporcionar una matriz de inmunoafinidad, en donde una población policlonal de anticuerpos de una muestra biológica que se sospecha de contenido de anticuerpos anti-fí. cerdo se inmovilizan en sustrato. A este respecto, una purificación de afinidad inicial de la muestra se puede llevar a cabo utilizando antígenos inmovilizados. La preparación de muestra resultante así solamente contendrá porciones anti-H. cerdo, que evitan las propiedades de enlace no específicos potenciales en el soporte de afinidad. Un número de métodos de inmovilización de inmunoglobulinas (ya sea intactas o en fragmentos específicos) en alto rendimiento y que tienen buena retención de la actividad de enlace de antigeno, son conocidos en la técnica. No se han delimitado por cualquier método particular, la proteína A o proteína G inmovilizada se puede utilizar para inmovilizar inmunoglobulinas. Por consiguiente, una 'vez que las moléculas de inmunoglobulina se han inmovilizado para proporcionar una matriz de inmunoafinidad, los antígenos de H. cerdo, que tienen marcas separadas y distintas, se ponen en contacto con los anticuerpos enlazados bajo condiciones de enlace adecuadas. Después de que cualquier antígeno no enlazado específicamente se ha lavado del soporte de inmunoafinidad, la presencia de antígeno enlazado puede ser determinado o al analizar para cada marca específica utilizando métodos conocidos en la técnica. Los reactivos de ensayos descritos en lo anterior, incluyendo los inmunógenos de H. cerdo (tal como un lisado de H. cerdo) , opcionalmente inmovilizados sobre un soporte sólido, pueden ser proporcionados en equipos, con instrucciones adecuadas y oros reactivos necesarios, con el fin de conducir los inmunoensayos como es descrito en lo anterior. El equipo también puede contener, dependiendo del inmunoensayo particular utilizado, marcas adecuadas y otros reactivos empacados y materiales (es decir, soluciones reguladoras de lavado y los ' similares) . Inmunoensayos estándares, tales como aquellos descritos en lo anterior, se pueden conducir utilizando estos equipos. EJEMPLOS Enseguida están ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no se proponen para limitar el alcance la presente invención de ninguna manera. Ejemplo 1. Aislamiento de H. cerdo de la Mucosa Gástrica Porcina Las bacterias se recuperaron de la mucosa gástrica porcina bajo condiciones microaerofílicas como sigue. Los estómagos se removieron de cerdos jóvenes y se abrieron mediante la incisión a lo largo de las curvaturas más grandes y menores. Los contenidos se removieron y la mucosa se enjuagó con lavados de solución salina estéril. Tiras mucosales de la cardia glandular de la curvatura menor y el antrum mucosal, 5x20 mm (menos el muscularis), se removieron mediante disección estéril y se suspendieron en 5 ml de caldo Brucella (Difco) suplementado con suero de bovino fetal al 10% (B-FBS) y la tira se colocó en moledores de tejido Broeck de vidrio de 7.0 ml estériles. Los tejidos se molieron 10 veces y diluciones (10"° a 10~4) se hicieron en B-FBS. 1/10 ml de cada dilución se colocó sobre placas de agar que contienen ya sea el medio de Skirrow o TSAII (agar de soya de tripticasa con 5% de sangre de oveja) . Las placas se incubaron en un ambiente microaeróbico durante 3-4 días. Las colonias de especie de Helicobactér sospechosas (translúcidas de punto de perno pequeño y no hemolíticas) se identificado y se sobrepasaron sobre placas de agar fresco como en lo anterior.

Las alícuotas de cada aislado sospechosas se mancharon mediante el método de manchado de Gram y se probaron con la actividad de ureasa (colocación de una torunda de algodón que contiene los organismos en urea que contiene B-FBS e indicador de pH) en una solución de peróxido de hidrógeno al 1% (v/v) en agua destilada estéril. Los microbios que fueron bastones curvos cortos Gram negativos que fueron positivos a ureasa y catalasa se consideraron que son especies de Heli cobacter. En la base de la localización (estómago) , morfología (bastones "similares a ala de gaviota", curvos, cortos, Gram negativos), actividad de ureasa y la reactividad cruzada con un reactivo anti-Hp, la bacteria aislada se asignó al género Helicoba cter y se llamó H. cerdo (Español para "puerco") . H. cerdo es distinto de, pero antigénicamente relacionado a Hp, y el organismo espiral más grande, Candida tus Helicobacter suís (Degroote y colaboradores, (2000) J. Clin . Mi crobiol . 38:1131-1135), otra especie de Helicobacter que se encuentra en los cerdos normales y cerdos con gastritis y por lo tanto se cree que es un organismo comenzal no patogénico. Ejemplo 2. Infección y Recuperación de H. cerdo de Cerdos Experimentalmente Infectados Tres cerditos gnotobióticos se infectaron oralmente con H. cerdo de tres días de edad y se terminaron en 35 días de edad. Un procedimiento similar a aquel detallado en lo anterior se utilizó para recuperar bacterias gástricas de los cerdos experimentalmente infectados. Para esto, la mitad del estómago se removió estérilmente y se colocó en cajas petri de 100 mm3 prepresadas, estériles. 5 ml de B-FBS se adicionó y la mucosa se separó de muscularis gástrico mediante la disección de punta y el raspado con instrumentos estériles. El muscularis se removió y las placas petri que contienen la mucosa recuperada se pesaron nuevamente. La mucosa y B-FBS se removieron y se colocaron en moledoras de tejido Broeck de vidrio de 7.0 ml estéril y se molieron como el anterior. Diluciones en serie de 10 veces del homogenado se hicieron en B-FBS y 1/10 ml de cada dilución se colocaron por duplicado sobre placas TSAII o de agar de sangre. Las placas se incubaron en un ambiente microaeróbico húmedo durante 3-4 días . Las colonias de especie de Helicoba cter sospechosas (traslúcidas de punto de perno pequeño y no emolíticas) se identificaron sobre cada dilución de placa. Colonias discretas se contaron sobre la placa/dilución que contiene entre 30 y 300 colonias bacterianas. Para determinar las unidades de formación de colonias (cfU) bacteriana por gramo de mucosa gástrica, el número de colonias contadas entre las dos diluciones se promedió (colonias totales contadas divididas entre 2) y se multiplicaron por el factor de dilución (10~° a 10~4) , por 5 (para la dilución inicial en B- FBS) , tiempos 10 (para la dilución inicial) para llegar al sitio cfu total recuperado. El cfu total se dividió entre el peso de la mucosa gástrica y el número resultante fue el cfu/gramo bacterial de mucosa gástrica. Las Tablas 1-4 resumen las observaciones gruesas (Tabla 1), cambios histopatológicos (Tabla 2), descubrimientos histopatológicos extra-gástricos (Tabla 3) y los descubrimientos microbiológicos (Tabla 4) en los cerdos infectados. Todos de los cerdos probados (3/3) fueron en cultivo y positivos en W/S en el estómago. 3/3 cerdos exhibieron ulceración gastroesofágica (GEU) en la cardia no glandular; 2/3 mostraron microúlceras antrales lesionadas; y 3/3 exhibieron gastritis antral lipofolicular . Así, H. cerdo colonizó la mucosa gástrica de los cerdos. Adicionalmente, la infección con H. cerdo estuvo fuertemente asociada con la enfermedad gástrica y úlcera duodenal y produjo una infección bacteriana gástrica persistente de cerdos análogos a H. pylori en los humanos. Tabla 1 . Un resumen de las observaciones gruesas en los cerdi tos gnotobióticos infectados con H. cerdo y terminados en 35 días de edad. aAntígeno de la prueba de la piel consistió de la preparación de Heli cobacter pylori (10.0 ug de sonicado clarificado 26695 en 0.1 ml de PBS) . bVisualmente registrado como 0=sin cambio de lo normal; 1= cambio mínimo; 2= cambio moderado; y 3= cambio severo cRespuestas de la prueba de la piel registradas como negativas (-) o positivas (+) con descripción adicional. Tabla 2. Un resumen de cambios histopa tológicos en los estómagos de cerdi tos gnotobióticos infectados con H. cerdo y terminados en 35 días de edad. aH/E= manchado de hematoxilina y eosina; W/S= manchado de Warthin-Starry bSubjetivamente registrado como 0= sin cambio de lo normal (sin inflamación); 1= cambio mínimo de lo normal; 2= cambio moderado de lo normal; y 3= cambio, severo de lo normal. cRegistrado como (+) para microorganismos extracelulares curvos pequeños presentes sobre la superficie luminal gástrica de las secciones o (-) : no se observan microbios. dX - Las manchas de W/S son de pobre calidad y deben ser repetidas antes de una determinación de la presencia de organismos que pueden ser determinados. eGEU: ulceración gastroesofágica en la cardia no glandular y la mucosa glandular adyacente de una curvatura menor del estómago . Tabla 3. Un resumen de descubrimientos histopa tológicos extra gástricos en cerdi tos gnotobióticos infectados con H. cerdo y terminados en 35 dias de edad.

Subjetivamente registrado como 0= sin cambio de lo normal (sin inflamación) ; 1= cambio mínimo de lo normal; 2= cambio moderado de lo normal; y 3- cambio severo de lo normal sobre secciones manchadas con H/E. bSitios de prueba de la piel (oreja) registrado como 0 (célula infilrado no inflamatoria) o 1 (infiltrados de célula inflamatoria moderado) cnd: no hecho Tabla 4. Un resumen de descubrimientos microbiológicos en cerdi tos gnotobióticos infectados con H. cerdo y terminados en .35 días de edad.

Ejemplo 3. Prevención de la Infección por H. cerdo utilizando el Lisado de H. cerdo Una vacuna de H. cerdo se preparó utilizando la digestión proteolítica para producir un lisado de H. cerdo, de acuerdo con un método similar al protocolo de digestión descrito en Waters y colaboradores (2000) Va ccine 18 : 711-719. En particular, suspensiones de bacteria de H. cerdo propagadas en cultivos líquidos de B-FBS bajo condiciones microaerofílicas se dejaron alcanzar aproximadamente 109 bacterias por ml . Las bacterias se recuperaron por centrifugación (2000-3000 x g) ' durante 10 minutos. El sobrenadante agotado se desechó y la pelotilla bacteriana se suspendió en una cantidad mínima de solución salina regulada de fosfato de Dulbecco, se transfirió a un crio frasquito de plástico y se congeló a -70 grados C. Mientras se congela, la pelotilla bacteriana se liofilizó en un aparato evaporador centrífugo (vacío de velocidad) . Las pelotillas bacteriales liofilizadas se acumularon y se pesaron. Para la digestión bacteriana, pepsina (Sigma, St . Louis, MO) en una concentración de 1.0 µg/ml se preparó mediante dilución con HCl' 10 mM, pH 1.9-2.2. 1 µg de pepsina se incubó con 1 mg de bacteria liofilizada durante 24-25 horas a 37 grados C sobre un agitador magnético. Después de la terminación de la digestión, la digestión se enjuagó en alícuotas, se etiquetó y se congeló a -70 grados C hasta el uso. El lisado de H. cerdo se formuló a una composición de vacuna y se utilizó para vacunar cerditos gnotobióticos conocidos. El lisado se diluyó a 24-25 mg/ml en solución salina regulado con fosfato de Dulbecco y se mezcló con 1 ml de adyuvante. La vacuna se emulsificó en adyuvante y .5 ml de la mezcla se inyectó en las axilas dorsales y caderas de cada cerdito. Cada cerdito recibió 3 inyecciones en 3, 10 y 17 días de dad. (Ver la Tabla 5) . Los resultados indicaron reducción significante en las pérdidas de patógeno y escasez de enfermedad de los cerditos vacunados, demostraron eficacia del procedimientos inmunoprofiláctico. En particular, como se observa en las tablas en la presente, H. cerdo infecta cerditos y persistentemente coloniza la mucosa gástrica a los sedimentos del intestino delgado próximo. H. cerdo está asociado con la enfermedad de úlcera gástrica. La vacuna parenteralmente administrada homologa protegió contra la estimulación oral subsecuente con infección de H. cerdo . (Ver la Tabla 6) . Tabla 5. Diseño Experimen tal y Eval uación 1. Los cerditos se terminaron aproximadamente 2 semanas después de la estimulación con H. cerdo (35 días de edad). 2. La mitad del estómago se removió, se pesó, se raspó la mucosa libre de muscularis y se pesó nuevamente. Un homogenado al 10% (p/v) se hizo y el reaislamiento cuantitativo de los organismos se determinó mediante titulación sobre placas de microtítulos . Los organismos se confirmaron que son Helicobacter sp por ensayos de ureas, catalasa, manchado de Gram y morfología de colonia. 3. La mitad del estómago restante se examinó para la evidencia histológica de enfermedad por métodos estándares. 4. Para los dos cerditos del grupo C, muestras estériles de esófago, duodedo, yeyuno, ileum, colon espiral, colon descendente y colon terminal también se cultivó para la presencia de organismos (positivo o negativo, no cuantitativo) para determinar si H. suis es un patógeno específico del estómago de los cerdos como H. pylori es en los cerdos gnotobióticos experimentalmente infectados y también en humanos . Tabla 6. Un resumen de observaciones gruesas en cerdi tos gnotobióticos vacunados con digestiones de proteasa , infectados con H. cerdo y terminados en 35 dias de edad. aVisualmente registrado como 0= sin cambio de lo normal; +/= posible cambio de lo normal; 1= cambio mínimo; 2= cambio moderado y 3= cambio severo Las ELISAs específicas de isotipo se realizaron con el fin de detectar los anticuerpos de suero dirigidos contra el antígeno de la especie de Hel icoba cter en sueros de cerdos infectados con H. cerdo y H. pylori como es descrito en Krakowka y colaboradores, (1987) Infect . Immun . 55 : 2789-2796; Krakowka y colaboradores, (1996) Vet . Immunol . Immunopa thol . 55:2789-2796; y Eaton y colaboradores, (1992) Gastroen terol . 103:1580-1586. La vacuna en solución salina sola sin adyuvante o combinada con los adyuvantes descritos adicionalmente enseguida estimularon los anticuerpos específicos del isotipo IgG. Por otra parte, los sueros de los cerdos infectados con H. cerdo e infectados con H. pylori reaccionaron cruzadamente en el ELISA cuando se utilizó el antígeno bacteriano. Ver las tablas 7-9. Tabla 7. Respuesta del anticuerpo de suero de ELISA (IgG) a lisados de especies de Helicobacter en cerdi tos gnotobióticos vacunados tres veces con digestión proteolí tica de H. pylori , oralmen te infectados con una cantidad subóptima de H. pylori y terminados en 24 días de edad.

Interpretación (es) 1. Los valores OD de ELISA se corrigieron para el antecedente de aproximadamente 0.1-0.2 unidades OD; no hubo diferencia significante entre los antígenos de Helicoba cter sp en los ensayos de ELISA. 2. La dosis de estimulación del inoculo de H. pylori fueron por debajo del umbral de colonización para los cerditos gnotobióticos, aun a través de todos los vacunados (digestión proteolítica en escualeno o solución salina, Grupos A y Grupos C) seroconvertidos después de las vacunaciones (suero de Pre-estimulación) y títulos de ELISA se han incrementado ligeramente por la terminación. 3. ,Un efecto de "cebado" de vacunación pueden ser evidente si las respuestas a las digestiones de vacuna en ya sea el adyuvante de escualeno o en solución salina (Grupos A y C) se comparan a falta de respuesta, aun después de la estimulación subinfecciosa, en el grupo de control de estimulación (Grupo B) . Tabla 8. Respues ta de anticuerpo de suero de ELISA (IgG) a lisados de especies de Helicobacter en cerditos gnotobióticos oralmente infectados con H. cerdo y terminados en 34 días de edad.

Interpretación (es) 1. Los valores OD de ELISA se corrigieron para el antecedente de 'aproximadamente 0.1-0.2 unidades OD; no hubo diferencia significante entre los antígenos de Helicoba cter sp en los ensayos de ELISA. 2. Cerditos 02-2663 fueron ligeramente colonizados; los organismos fueron solamente recuperados en re-rayas; los otros dos cerditos tuvieron nivel de colonización de aproximadamente un décimo que (por ejemplo. 105 cfu/gramo) esperado para H. pylori . Tabla 9. Respuesta de anticuerpo de suero de ELISA (IgG) a lisados de especies de Helicobacter en cerdi tos gnotobióticos vacunados tres veces con digestiones de proteasa de ya sea H. pylori o H. cerdo, estimulados con H. cerdo después de la vacunación y terminados en 35 días de edad.

Interpretación (es) 1. Los valores OD de ELISA se corrigieron para el antecedente de aproximadamente 0.1-0.2 unidades de OD; no hubo diferencia significante entre los antígenos de Heli cobacter sp en los ensayos de ELISA. 2. Ambas digestiones se estimularon tanto la producción de anticuerpo homologa y heteróloga a los antígenos de Heli coba cter sp específicos; no hubo diferencia en los títulos entre el antígeno homólogo (mismo antígeno para la vacunación y combinación de anticuerpos) y heterólogos (diferente antígeno y combinación del anticuerpo) de los sistemas de ELISA. 3. La respuesta moderada para el antígeno en los cerditos de control de estimulación (Grupo C) es probablemente atribuido al hecho de que la infección de estimulación fue por solo 18 días (después de la vacunación) . Ejemplo 4. E icacia de Varios Adyuvantes Un número de experimentos se condujeron para prevenir la eficacia de varios adyuvantes con las composiciones de vacuna, incluyendo el adyuvante de Freund incompleto (ICFA) (Difco), TRIGEN (Newport Laboratories, Worthington, MN) , IM-CREST 21 (Newport Laboratories, Worthington, MN) y RESPISURE (Pfizer Animal Health) . Los cerditos administrados con la vacuna con adyuvante con TRIGEN mostraron una reacción de granulomatosos severa a los sitios de inyección pero mostró respuestas positivas en pruebas de piel en 24 horas. Las pruebas de seroconversión en cerdos administrados con la vacuna que contiene TRIGEN mostraron promesa. Dos de cada tres de los cerdos administrados con la vacuna con adyuvante con IM-CREST 21 murieron 48 horas después de la primera inyección, probablemente debido al LPS incluido en el adyuvante. La vacunación parenteral utilizando ICFA y RESPISURE previene la colonización bacteriana y gastritis. Sin embargo, las vacunaciones parenterales de cerditos activamente infectados no fueron efectivas para incrementar la severidad histológica de la gastritis. Por lo tanto, la terapia con antibiótico podría ser administrada antes de la inmunización de los animales activamente infectados. Los inmunógenos en Escualeno, RESPISURE e ICFA estimularon las respuestas de anticuerpo específico del isotipo IgG antes de la estimulación. Los inmunógenos en solución salina también estimularon la producción de anticuerpo pero los valores de OD fueron menos que aquellos que se les dio inmunógeno en adyuvantes. La infección de estimulación con Hp/HC incrementó los valores de OD en los sueros terminales. Resultados adicionales se muestran en las Tablas 10-16. Tabla 10. Un resumen para observaciones histopa tológicas en cerdi tos gnotobióticos vacunados con digestiones de proteasa en adyuvante de Freund incompleto, infectados con H. cerdo y terminados en 35 días . aErosiones (pérdida de epiteliales restringida al epitelio superficial a la membrana de basamento) notadas en la cardia no glandular del estómago. Lesiones ulcerativas de la cardia no glandular penetran en la membrana de basamento, se entienden dentro de muscularis. El lecho de úlcera consiste de tejido de granulación inmaduro., bInfiltrados linfocíticos multifocales y foliculares en la mucosa gástrica subjetivamente registrados como 0= sin cambio de lo normal (sin inflamación); 1= cambio mínimo de lo normal; 2= cambio moderado de lo normal; 3= cambio severo de lo normal y 4= cambio muy severo de lo normal. cUna microúlcera se detectó en la mucosa duodenal de una sección del duodeno que presenta en este bloque. Los tejidos del resto del tracto gastrointestinal se guardaron en formalina y serán examinados. Organismos detectados en la sección manchada de hematoxilina del antrum adyacente a la gastritis folicular gástrica (secciones desmanchadas con Wathin Starry dependientes). Tabla 11 . Un resumen de cul tivo microbiano y resul tados de reaislamiento en cerdi tos gnotobióticos vacunados con digestivos de proteasa en adyuvante de Freund incompleto, infectados con H. cerdo y terminados en 35 dias . aAbreviaciones utilizadas: gi= tracto gastrointestinal, Eso=esófago, Duo= Duodeno, Jej= Yeyuno, Sp Col Colon espiral, Dis Col= Colon distal, Ter Col= Colon terminal "reportado como nd= no hecho, += organismos presentes, -= organismos no presentes, (-)= sin crecimiento, aun en rerayas de las placas. Tabla 12. Un resumen de observaciones gruesas en cerdi tos gnotobióticos vacunados3 con H. cerdo (He) digestión proeolí tica emulsificada en ICFA y estimulado con He 5 días después déla úl tima vacunación . aInmunizado de 7, 10 y 17 días de edad con digestión de He proteolítica en un adyuvante de Freunds incompleto. bAntígeno de prueba de la piel consistió de la preparación de H. cerdo (10.0 ug, sonificado clarificado en 0.1 ml de PBS) cVisualmente registrado como 0= sin cambio de lo normal; l=cambio mínimo; 2= cambio moderado y 3= cambio severo Respuesta de la prueba de la piel registrada como negativa (-), positiva ( + ) o + /- (enrojecimiento en el subcutis sin hinchamiento previo. Tabla 13. Un resumen de cambios histopa tológicos en cerdi tos gnotobióticos vacunados3 con H. cerdo (He) digestión proeoli tica emulsifi cada en ICFA y estimulada con He 5 días después de la úl tima vacunación . aInmunizado a 7, 10 y 17 días de edad con digestión de He proteolítica en un adyuvante de Freunds incompleto. bSubjetivamente registrado como 0= sin cambio a lo normal (sin inflamación); 1= cambio mínimo de lo normal; 2= cambio moderado de lo normal; y 3= cambio severo de lo normal. Tabla 14. Un resumen de descubrimientos microbiológicos en cerdi tos gnotobióticos vacunados con H. cerdo (He) digestión proteolí tíca emulsificada en ICFA y estimulada con He 5 días después de la úl tima vacunación .

Tabla 15. Respuesta del anticuerpo de suero de ELISA (IgG) a lisados de especies de Helicobacter en cerdi tos gnotobióticos vacunados tres veces con digestión proteolí tica de H. pylori en ya sea RespisureR o adyuvante de Freund incompleto (ICFA) , oralmente infectado con I-I. pylori y terminados en 35 días de edad.

Interpretación (es) 1. Los valores OD de ELISA se corrigieron para el antecedente de 0.1-0.2 unidades OD; hubo diferencia significante entre los antígenos de Heli cobacter sp en los ensayos de ELISA. 2. Tanto los adyuvantes RespisureR e ICFA estimularon títulos de ELISA significantes a los antígenos de Helicobacter sp antes que la estimulación con H. pylori . 3 . .Uno de los dos cerdos de control no vacunados estimulados con H. pylori serpconvirtió; esta respuesta serológica "lenta" se ha observado en experimentos de estimulación previos en que toma varias semanas a detectar los anticuerpos IgG y la estimulación para el intervalo de terminación fue de solamente 15 días. Tabla 16. Respuesta de anticuerpo de suero de ELISA (IgG) a lisados de especies de Helicobacter en cerdi tos gnotobióticos vacunados tres veces con digestión proteolí tica de H. pylori , oralmente infectados con una cantidad subóptima de H. pylori y terminados sobre 24 días de edad. aNewport Laboratories, Worthington, MN Interpretación (es) 1. Los valores OD de ELISA se corrigieron para el antecedente de aproximadamente 0.1-0.2 unidades OD; no hubo diferencia significante entre los antígenos de Helicobacter sp en los ensayos de ELISA. Ejemplo 5. Caracterización del H. cerdo y H. pylori Con el fin de demostrar que H. cerdo fue hecho en un organismo distinto de H. pylori , los geles de SDS-PAGE se corrieron bajo condiciones de reducción para examinar los perfiles de proteína de los dos organismos. El gel afilado para la separación consistió de acrilamida al 3.9%, gel de reparación que contiene acrilamida al 12%. Cada uno se hizo utilizando procedimientos estándares como es resumido en Current Protocols in Molecular Biology, suplement 47, section 10. 2A . 6. En algunos casos los geles PAGE nativos se utilizaron los cuales se adquirieron de BioRad Corporation. La solución reguladora de tabla de gel consistió de Tris-Cl (50 mM) , pH 6.8, SDS al 2% (grado de electroforesis), azul de bromofenol al 0.1% y glicerol al 10%. Las muestras se corrieron en una solución reguladora de Tris-glicina que contiene Tris 25 mM, glicina 250 mM (grado de electroforesis, pH 8.3) y SDS al 0.1%. Las muestras consistieron de H. pylori (Hp) y H. cerdo (He) intactos y digeridos. Las digestiones proteolíticas se hicieron como es descrito en lo anterior. Un µl de cada muestra (2.4-3.0 µg) se diluyó en agua destilada a un volumen final de 15 µl y se diluyó a 1:2 con solución reguladora de carga. Las muestras se hirvieron durante 3 minutos, y 20 µl de cada muestra se cargaron en el gel. Las muestras (junto con un estándar) luego se sometieron a electroforesis en 100 V durante 60-75 minutos o hasta que los frentes de tinte son precisamente salidos de los geles. Los geles luego se mancharon con Azul de Coomassie o manchas de plata para revelar las bandas separadas y luego se fotografiaron. Después de la clarificación en solución de ácido acético diluido durante la noche, los geles se deshidrataron y luego se fotografiaron. Como se muestra en la Figura 1, los perfiles de SDS-PAGE de tanto H. pylori como H. cerdo intactos y digeridos fueron diferentes. El ">" en la figura ilustra bandas presentes en Hp y ausentes de He. El "]" indica productos de digestión de proteasa de bajo peso molecular. Los geles de SDS-PAGE de H. cerdo intacto y digerido también se corrieron y se compararon. Como se puede observar en la Figura 2A (intacto) y 2B (digerido), como una cantidad incrementada de material de bajo peso molecular estuvo presente en el producto de digestión proteolítico (indicado por "<" en la Figura 2B. El análisis de manchado de Western de H. cerdo intacto y H. cerdo digerido también se realizó. Las muestras se separaron sobre geles PAGE (geles de reducción y nativos, como son descritos en lo anterior) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante la metodología electroforética estándar utilizando un aparato BioRad. Las membranas de nitrocelulosa se incubaron durante la noche (4°C) en solución salina regulada de fosfato que contiene leche seca sin grasa al 10% que contiene TWEEN 20 (PBS-NFM) para bloquear los sitios reactivos sobre las membranas. Después del lavado, una dilución 1:250 de suero porcino (diluido en PBS-NFM) se hizo y se incubó durante 2 hr a 22°C. Después de lavar 3 veces (5 minutos cada uno) en PBS-NFM, las membranas se incubaron con IgG anti-porcino de cabra, durante una hr a 22 °C. Las membranas se lavaron nuevamente como el anterior y se revelaron con sustrato de peroxidasa de rábano picante de membrana de TMB calentada (37 °C) durante varios minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de agua destilada en exceso. Las membranas luego se secaron y se fotografiaron. Como se observa en las Figuras 3A y 3B, el material de bajo peso molecular presente en la Figura 2B entre el gel nativo y es inmunoreactivo con los sueros de prueba de los cerdos. Como se muestra en las Figura 4A y 4B, el análisis de manchado de Western del perfil de reactividad de anticuerpo contra H. cerdo intacto (4A) y una digestión de H. cerdo (4B) mostró una cantidad incrementada de material de bajo peso molecular en la digestión (indicado por ]) . La intensidad de manchado incrementada también se observó (*), así como bandas inmunoreactivas adicionales (<). Como es evidente, el lisado de H. cerdo contiene material inmunoreactivo que reacciona cruzadamente con el organismo intacto, indicando que esto es probable la base para la protección. Por otra parte, los sueros de prevacunación fueron negativos y los sueros de post-vacunación/post-estimulación fueron fuertemente positivos. Ejemplo 6. Patogenicidad de los Aislados de H. cerdo en Cerdos como es comparado a H. heilma.nnii Con el fin de estudiar la patogenicidad de H. cerdo en cerdos y comparar esto con aquel observado con H. heilmannii , el siguiente experimento se condujo. Materiales y Métodos A. Cerditos Gnotobióticos Un total de 36 cerditos gnotobióticos de las porciones de 7 carnadas se utilizaron en este estudio (Krakowka y Eaton "Helicoba cter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedical Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N. Y., 779-810). En breve, los cerditos se derivaron de marranas apareadas hasta la fecha adquiridas de un productor de puercos local. Después de la anestesia epidural, una sección Caesaria se realizó y el útero grávido se exteriorizó, se segmentó de sus uniones abdominales y se introdujo en un tanque de transferencia lleno con 'desinfectante de cloro. Los cerdos inmediatamente se eutanizaron mediante electrocución y exanguinación. Los cerditos se removieron del útero, se estimularon para respirar y después de la reacción de los umbilicales se transfirieron en unidades de aislamiento de tubo de corral estériles que contienen 6 particiones separadas. Los cerditos se alimentaron con dieta de reemplazo de leche de cerda y SIMILAC con hierro 3-4 veces al día hasta la terminación de 35 días de edad.

B. Aislamiento de H. cerdo H. cerdo se aisló de la mucosa gástrica porcina como es descrito en el Ejemplo 1. Dos aislados se obtuvieron y se llamaron "1268" y "2662" en la presente. C. H. heilmannii Cultivos puros de H. heilmannii (Hh) se obtuvieron de suspensiones de célula parietal inicialmente recuperado de ratones desnudos infectados con Hh como es descrito en Eaton y colaboradores, "Isolation of Puré Populations of Helicobacter heilmannii-like bacteria" in Campyloba cters , Helicobacters y Rela ted Organisms, Newell y colaboradores, eds. (1996) Plenum Press, New York, N. Y., 25-31. En breve, Hh se separó de otras especies bacterianas y contaminantes microbianos, al explotar la afinidad de Hh para el sistema canalicular de células apriétales. Las células apriétales aisladas se congelaron alícuotas del material de partida. El aislado de Hh se pasó dos veces en ratones gnotobióticos utilizando homogenados gástricos cargados con Hh que se confirmó mediante manchas de Warthin-Starry (WS) de preparaciones de citospina de los homogenados. Un solo pasaje de Hh se realizó en los cerdos gnotobióticos y el inoculo infeccioso se mantuvo mediante pasajes adicionales de homogenados gástricos porcinos infectados (10%, p/v) en cerdos gnotobióticos. El homogenado infeccioso se formó en alícuota en volúmenes de dos ml y se congeló (-70°C) hasta que se utilizó para estudios in vivo . D. Administración Para inoculaciones in vivo, los aislados se expandieron en caldo de Brucella. Cada cerdito recibió 2 ml de organismos (109 total) recuperados de la fase de crecimiento log oralmente 3 días de edad. Como controles de infección para algunos experimentos, grupos de cerdos gnotobióticos recibieron 2 ml de caldo de Brucella oralmente conteniendo H. pylori , cepa 26695 adaptada para el crecimiento óptimo en cerdos (Akopyants y colaboradores, (1994) Infect. Immun . 63:116-121) y de manera similar se preparó. Los cerditos de control no infectados recibieron ya sea caldo de Brucella solo o no se inocularon. Para excluir la contaminación inadvertida entre los grupos infecciosos, cada grupo de infección fue separadamente alojado en unidades de aislamiento gnotobióticas . La distribución de los cerdos mediante el grupo de inoculación bacteriana fue: 13 cerditos de 4 carnadas diferentes oralmente infectados con el aislado 2662 en 3 días de edad, 5 cerditos de una carnada oralmente infectada con aislado 1268 en 3 días de edad y 6 cerditos de una carnada oralmente inoculada con homogenados gástricos contiene Hh en 5 (n=3) y 21 días de edad (n=3), 9 cerditos de 4 carnadas oralmente infectados con Hp, cepa 26695 en 3 días de edad de cerditos de 2 carnadas se utilizaron como controles no infectados.

E. Patología 28 a 35 días después de la inoculación, se utilizó un procedimiento estandarizado para la evaluación de recolección de muestra de tejidos gástricos. Los cerditos, en ayunas durante 12 hrs, se sedaron pesadamente con HCl de cetamina y se removieron de las unidades de aislamiento. Después de la recolección de una muestra de sangre no coagulada terminal para el suero, los cerditos se eutanizaron con solución de EUTHOL intravenosa. Los estómagos se exteriorizaron, se ligaron al esófago y el duodeno próximo y se removieron. Los estómagos se abrieron asépticamente mediante disección a lo largo de las curvaturas más grandes y menores y la mitad del estómago se extirpó para el cultivo microbiano cuantitativo (ver enseguida). Descubrimientos gruesos pertinentes en el medio estómago restante (edema submucosal, cantidad de moco lumenal, presencia y grado de folículo linfoides, y erosiones o úlceras si esta presente) se registraron y fotografías de lesiones ulcerativas, si están presentes, se tomaron. En la ausencia de úlceras, secciones de cardia gástrica incluyendo el esófago pars, fundus, antrum y duodeno próximo al píloro se recolectaron para la evaluación microscópica. Las lesiones ulcerativas y erosivas sospechosas en el esófago pars y la mucosa gástrica se . cortaron transversalmente tal que la superficie que contiene las úlceras/erosiones estuvo disponible para el seccionamiento con microtomo desde el frente de los bloques de parafina. Las muestras gástricas se sumergieron en diez volúmenes de formalina regulada con fosfato a 10% por al menos 24 horas antes del procesamiento adicional. Las muestras de mucosa gástrica fijadas en formalina se deshidrataron en alcoholes graduados y se procesaron para la histopatología y se incrustaron en bloques de parafina mediante métodos estándares. Replicados de secciones de cinco micrómetros se mancharon con hematoxilina y eosina para la evaluación morfológica, las manchas Warthin-Starry para organismos y con antisueros específicos de anti-Hp-de conejo o comerciales mediante la inmunohistoquímica indirecta esencialmente como es descrito en otra parte (Krakowa y Eaton (2002) Vet . Immun . and Immunopa thol . 88:173-182). Para estimar las relaciones antigénicas reconocidas por las células T inmunes inducidas por infección, pruebas de piel intradérmica tanto de 24 y 48 horas se realizaron en cerdos mediante la inoculación de diez microgramos de cualquiera o ambos sonicados de Hp y 2662 en 100 microlitros de solución salina en el pabellón de la oreja externa de algunos cerdos. F. Microbiología Unidades de aislamiento se clasificaron para los contaminantes microbianos extraños después de la derivación y en intervalos después hasta la terminación mediante el cultivo aeróbico y anaeróbico de torundas de frotación de las charolas de alimentación, heces y las unidades de aislamiento. Los contaminantes bacterianos no se identificaron. Para la preparación de inóculos en vivo, caldo Brúcela, BACTO 2.8% p/v (Difco 'Laboratories, Detroit, MI 48232) con cultivos de suero de ternero fetal al 10% v/v en fase de crecimiento log se utilizaron. La enumeración bacteriana se realizó con hemocitómetro y las cuentas se ajustaron a 108 microbios por 2 ml por cerdito. Los ensayos para la ureasa bacteriana, catalasa, oxidasa y motilidad se ha descrita en otra parte (Krakowka y colaboradores, (1987) Infect . Immun . 5_5: 2789-2796; Krakowka y Eaton "Helicobacter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swi ne in Biomedica l Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810). Para la determinación cuantitativa de las unidades de formación de colonias (cfu) bacteriana por gramo de mucosa gástrica recuperada de cerditos infectados, la mucosa se separó de la túnica muscularis implícita, se peso, se ho ogenizó en caldo de Brúcela al 10% (p/v) y diluciones de de 10-veces se colocaron por duplicado, sobre agar de sangre o placas de agar TVAP (Remel, Lenexa, KS 66315) y se leyeron después de 4 días de incubación a 37°C, 10% C02 , 5% oxígeno y 85% nitrógeno en humedad de 95%. Los re-aislados porcinos se identificaron como especies de Helicoba cter mediante el manchado Gram, la morfología de colonia, la actividad de la enzima ureasa y catalasa y la inmunoreactividad con tanto antisueros de Hp monoespecíficos recolectado de cerdos gnotobióticos infectados como antisueros de conejo específicos de Hp comercialmente disponibles (Novacastra: Vision Biosystems, 700 Longwater Dr.,, Norwell, MA 02061 and DAKO: Dakocy omation CA, Inc, 6392 Carpinterra, CA 93013) . Resulta.dos Un episodio transiente ocasional (24 hr) de anorexia se observó en una porción de cerdos gnotobióticos infectados con I-Ip (Krakowka y colaboradores, (1987) Infec t . Immun . 5_5: 2789-2796; Krakowka y Eaton "Helicobacter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Bíomedical Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810). En los experimentos descritos aquí, la infección de cerdos gnotobióticos con la especie de Helicobacter porcina fue clínicamente asintomática y nada de diferencias evidentes en el tamaño, peso o comportamientos se notó entre estos animales, los controles no infectados y los otros animales en varios experimentos. Lesiones gruesas de enfermedad gástrica en cerdos infectados (GEU, úlceras mucosales glandulares, folículos linfoides, particularmente a lo largo de la curvatura, menor, exceso de mucus luminar y edema mucosal) típico de las infecciones de la especie de Helicobacter en cerdos gnotobióticos (Krakowka y colaboradores, (1987) Infect . Immun . 5_5_: 2789-2796; Krakowka y Eaton "Heli coba cter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances m Swine in Biomedi cal Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810; Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . 35:274-282; Krakowka y colaboradores, (1995) Infect . Immun . _63: 2352-2355) se observaron en la mayoría de los gnotobiotes infectados con 2662 e infectados con Hp (Tabla 17). Ulceración (es) del esófago pars (GEU) se observaron en 9 de 13 cerditos infectados con 2662, 5 de 9 cerditos infectados con Hp y 1 de 5 cerditos infectados con el aislado 1268. Ni los infectados con Hh ni los controles no infectados desarrollaron GEU. Además, úlceras pequeñas de la mucosa gástrica glandular se observaron en 4 de 13 infectados con 2662 y uno de cinco cerdos infectados con 1268 pero no en el control y los grupos con infección de Hh . El agrandamiento de los nodos linfáticos gástricos se observaron en muchos de los cerdos infectados con el Heli coba cter spp también. Los descubrimientos histológicos confirmaron que el GEU observado en los cerditos infectados con 2662 y con Hp fueron erosivos y ulcerativos en naturaleza. Las úlceras penetrantes de la mucoso glandular gástrica, excepto para un cerdito infectado con 1268 se encontraron solamente cerditos oralmente inoculados con el aislado 2662. Además de las úlceras mucosales gástricas, la micro-ulceración de duodeno próximo se observó en un cerdito de este grupo de infección. Las manifestaciones de inflamación gástrica (infiltrados de células inflamatorias linfocí ticas y plasmad ticas y formación de folículo linfoide mucosal) fue más prominente en los cerditos infectados con el aislado 2662. Estas lesiones inflamatorias fueron más prominentes en la curva menor del estómago cerca de la cardia non glandular y en la mucosa antral, anterior al píloro gástrico y distal al fundus. Los cerditos infectados con el aislado 1268 y con Hh tuvieron evidencia mínima de inflamación en la mucosa gástrica entre solamente 2 de 5 cerditos infectados con 1268 tuvieron mucho infiltrados de células inflamatorias y ninguno de estos demostraron folículos linfoides. Los nodos linfáticos gástricos de muchos de los cerditos infectados con aislado 2662 y con Hp fueron altamente celulares y tuvieron folículos linfoides en desarrollos sugestivos y una respuesta inmune/inflamatoria local inducida en los estómagos de estos animales. Los tejidos restantes fueron no remarcables. Todos los 13 cerditos 'infectados con el asilado 2662 y tres de nueve cerditos infectados con Hp se utilizaron para recuperación cuantitativa de bacterias. En los cerditos infectados con 2662, el nivel de infección varió de la recuperación después el re-rayado (aproximadamente equivalente a 103 cfu bacteriana/gramo a mayor que 6 x 106 cfu bacteriano/gramo. Las bacterias similares a Heli coba cte r se recuperaron de uno de cinco cerditos inoculados con el aislado 1268 y de ninguno de los controles. No se hizo intento para recuperar Hh de los cerdos inoculados con Hh . La mancha de WS confirmó la infección gástrica con Helicoba cter. Los organismos extracelulares consistentes en morfología con Hp (bastones curvos pequeños con forma replicativas de "ala de gaviota" ocasional) se identificaron en 12 de 13 cerditos inoculados con el aislado de 2662 pero no en tejidos de cerdos infectados con 1268. En el primero, las bacterias fueron más abundantes en la cardia gástrica, adyacente al esófago pars, la curvatura menor y el antrum gástrico. Los organismos fueron en caso o no existentes en el fundus. Todos los 6 cerditos inoculados con Hh fueron positivos de WS . Distinto a Hp o al aislado 2662, el Hh fue fácilmente distinguido por el tamaño (3 veces más largos) y la morfología únicamente en espiral. Mientras que algunos microbios Hh se encontraron en la cardia, la vasta mayoría de estos estuvieron en las hendiduras gástricas del fundus. El inmunomanchado positivo para el Heli coba cter se obtuvo cuando secciones replicadas de tejidos gástricos infectados con 2662 se mancharon con el ensayo de imunohistoquímica (IHC) de antisuero anti-hp de conejo. Las bacterias que reaccionan con este agente se identificaron en 12 o 13 cerditos inoculados con el aislado 2662, dos de cinco cerditos colonizados por el aislado 1268 y todos los seis cerditos infectados con Hh . El manchado de bacterias con estos reactivos reaccionaron débilmente por el aislado en 1268. Cuando se compara con el cultivo y el aislamiento, ambos de los métodos WS y ICH para la demostración de bacterias o técnicas insensibles y frecuentemente se registraron como "negativa" en los estómagos que contienen menos de 106 cfu bacteriano recuperable por gramo. En cinco de los gnotobiotes infectados con 2662, el cultivo y el reaislamiento de los organismos 2662 también se realizó en muestras por todo (esófago a recto) el tracto gastrointestinal. Niveles pequeñísimos de 2662 se recuperaron del duodeno próximo de dos de estos cincos y en el ileum y yeyuno de uno de los cinco cerditos respectivamente; no hubo lesiones histológicas en estos tejidos. En niveles pequeñísimos de organismos similares a Helicobacter se recuperaron mediante el cultivo de solamente uno de cinco cerditos infectados con 1268. Este cerdito positivo en el cultivo tuvo GEU, pero nada de úlceras mucosales gástricas. Puesto que Hh no es cultivable sobre medios artificiales, las manchas de WS fueron dependientes de confirmar la colonización gástrica con este agente. Los sueros terminales de todos los cerditos se probaron para los anticuerpos homólogos y heterólogos a los Helicobacter mediante de ensayos de ELISA. De todos los 13 sueros de cerdos infectados con aislado 2662 reaccionaron a ambos de los antígenos Hp y 2662 mientras que ninguno de los sueros terminales de los cerdos infectados con Hh y con el aislado 1268, reaccionaron con estos mismos antígenos de ELISA. Los sueros convalecientes de los sueros infectados con 1268 reaccionaron solamente con el antígeno de ELISA de origen de 1268. Un subconjunto de cerdos de cada grupo de infección se probó en la piel con cualquiera o ambos de 10 microgramos de sonicado de Hp o sonicado de 2662, 48 horas antes de la terminación. La evaluación histológica de los sitios de la prueba de piel 'reveló las respuestas de hipersensibilidad del tipo retardado dérmico a los antígenos de la prueba de piel de cuatro o cinco cerditos inoculados con 2662, cuatro de cinco cerditos inoculados con el aislado 1268 y siete de nueve cerditos infectados con Hp cuando se utilizó el sonicado de Hp . La dermis y los tejidos subcutáneos contuvieron en infiltrados celulares mononucleares con una dispersión de neutrófilos y eosinófilos de .respuesta de DTH a la(s) proteína (s) . Los mismos cuatro inoculados con 2662 respondieron a sonicados de 2662 como le hicieron cinco de seis cerditos infectados con Hh . Los descubrimientos inmunológicos y bacteriológicos se resumen en la en la Tabla 17. De los dos aislados, fue evidente que el aislado 2662 fue el más patogénico. El aislado 2662 se ha mostrado que es similar al Hp de origen humano (ver Ejemplo 1) . Cuando se comparó a los otros grupos de inoculación, los cerditos inoculados con 2662 tuvieron una incidencia más alta (70%) de erosiones y úlceras de el pars gástrico (GEU) que aquellos cerditos infectados con Hp (55%), 'aislado de 1268 (20%) o Hh (0%) . Más importantemente sin embargo fue de incidencia de ulceración en la mucosa glandular. Mientras que Hp, en la ocasión, producirá úlceras mucosales (Krakowka y colaboradores, (1995) Infect . Immun . 6_3: 2352-2355) , las úlceras mucosales se observaron en 5 de 13 (38%) colonizados por el aislado 2662. Además, una úlcera en el duodeno próximo se observó en uno de los cerditos en este grupo de inoculación. Esta incidencia de la ulceración mucosal gástrica real fue inesperada y excede aquella observada con Hp, un ulcerógeno gástrico humano y porcino probado. Es notable Hh, un microbio asociado con GEU y la enfermedad de úlcera por otros (Barbosa y colaboradores, (1995) Vet . Pa thol . 32:134-139; Queiroz y colaboradores, (1996) Gas t.roen te.rol . 111:19-27 ; Melnichouk y colaboradores, (1999) Swine Heal th Prod. 1_ : 201-205; Roosendaal y colaboradores, (2000) J. Clin . Micorbiol . 38:2661-2664) produjo nada de GEU o ulceración mucosal gástrica en cerdos infectados con este agente . Similar a ia infección con Hp en tanto humanos como en cerdos gnotobióticos, la respuesta inflamatoria en desarrollo en la mucosa gástrica a la coloración bacteriana gástrica fue predominantemente de naturaleza linfocítica. Los folículos linfoide bien desarrollado en el antrum y cardia, distinto de los parche de Peyer cardiales fueron características regulares de la gastritis. La infiltración significante con neutrófilos, ya sea en la mucosa o acumulaciones en las hendiduras gástricas, no se observó. Mientras que no es cuantificado, la intensidad de la inflamación cardial y antral gástrica fue más evidente en cerditos inoculados con 2662 y menos evidentes los cerditos infectados con el aislado de 1268. Como se reportó previamente (Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . 3_5 : 274 -282 ) , la inflamación no supurativa asociada con Hh es moderada en gnotobiotos mono-infectado. También similar a la infección de Hp en tanto humanos como en cerdos gnotobióticos subsecuentemente convencionalizados (Bertram y colaboradores, (1991) Rev. Infecí: . Dis . 13 : S714-S722 ; Krakowka y Eaton "Helicoba cter pylo ri infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedical Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810), la infección gástrica por el Heli coba cter se presentó que es persistente a presar de la respuestas mediadas por anticuerpo y por célula T vigorosas y los antígenos bacterianos.

Los datos anteriores ponen en evidencia que la colonización gástrica con H. cerdo y microbios gástricos similares a H. cerdo pueden ser factores críticos en la iniciación de la enfermedad de úlcera gástrica porcina. A partir de esto se sigue que GEU porcino puede ser finalmente una enfermedad bacteriana infecciosa, antes que una enfermedad producida por dietas de alto carbohidrato y/o métodos de producción de cerdos modernos . Un estudio serológico de ELISA de arriba de 1,000 muestras de suero de cerdos convencionales de animales destetado adulto ha mostrado que los créditos comienzan el proceso de seroconversión al (los) antígeno (s) del aislado de 2662 en 5-6 semanas de edad; por adultos, arriba de 80% de los cerdos son cero positivos de ELISA del isótopo IgG a Hp y el aislado 2662. Mientras que es posible que esta alta incidencia de infección podría ser, en parte debido a la colonización reactividad cruzada subsecuente con Hh, es notable que ninguno de los cerdos gnotobióticos infectados con Hh aquí reaccionaron en los ensayos de ELISA Hp y el antígeno aislado 2662, aun cuando estos sueros se probaron para la actividad utilizando reactivos secundarios específicos de isotipo IgM. En un estudio de compañía, 2 bandas fueron discernidas por los inmunoensayos de manchado de Western cuando los sueros convalecientes de Hh pueden ser probados contra Hp y el aislado 2662.

Las contribuciones de la dieta a la patogénesis de GEU porcino son indisputables (ver el Ejemplo 7 enseguida y O'Brien JJ. Gastric Ulcers. Disea ses of Swine, 6th ed. Editors AD Leman AD, y colaboradores, (1986), 680-691; Argenzio y colaboradores, (1996) Am . J. Vet . Res . 5_7: 564-573) . La evidencia para el daño mediado del ácido luminal gástrico al pars es fuerte y el hecho de que la dieta puede ser específicamente manipulada para reducir la incidencia de GEU argumenta solamente la función que la dieta desempeña en promover los ulcerogenesis gástrica. La estrategia general para el manejo de GEU y la ulceración mucosal gástrica se centra al rededor de la prevención de reflujo acídico en el pars al proporcionar dietas que son gruesamente molidas en limitar los carbohidratos fermentables (O'Brien JJ. Gastric Ulcers. Disea ses of Swine , 6th ed. Editors AD Leman AD, y colaboradores, (1986), 680-691). Este procedimiento representa un compromiso entre proporcionar una dieta que promueve el crecimiento óptimo y la ganancia de peso durante el período de engordamiento de producción y la prevención de GEU. Las interacciones de la formulación de dieta, el contenido de carbohidrato dietético (principalmente, maíz, almidón de maíz y subproductos de maíz) y la asociación de ciertas especies de microbios gástricos, tanto como el Helicoba cte r como los comensales de fermentación de carbohidratos tales como Ba cillus y La ctobacill us spp. (Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . 3_5:274-282) con el desarrollo de GEU bajo condiciones de manejo convencionales permanecen para ser delineados. Si los componentes infecciosos de la enfermedad de úlcera porcina son establecidos, entonces medidas específicas tales como terapias antimicrobianas, probióticos y vacunaciones se puede diseñar para prevenir y controlar a la gastritis bacteriana. A su vez, esto proporcionará a los productores con otro método para el control de GEU porcino y la enfermedad de úlcera mucosal. Tabla 1 7. Un resumen de descubrimien tos pa tológicos y microbíológicos en cerdi tos gno tobióti cos inoculados con aislados gás tri cos de Helicoba cter porcino 2662 y 1268 , Hh y Hp 1 Número positivo (numerador) contra el número examinado (denominador) 2 Infiltrados de célula celda inflamatoria linfocit ca focales observados en la cardia de un cerdito. Ejemplo 7. Producción de un Modelo Animal de GEU Porcino Con el fin de producir un modelo animal para GEU porcino y comparar este modelo para otros modelos potenciales, se condujo el siguiente experimento. Materiales y Métodos A. Cerditos Gnotobióticos Un total de 22 cerditos gnotobióticos de porción de 4 carnadas se utilizaron en estos experimentos. Estos se derivaron mediante la sección Caesarian y se criaron como es descrito en otra parte (Krakowka y Eaton "Helicobacter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedical Research II, Tumbles'on y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810). La dieta básica para estos cerditos consistió de una fórmula de reemplazo de leche de cerdo líquida estéril (SIMILAC) individualmente alimentar a cada cerdito en charolas de alimentación tres veces al día, 200-300 ml/alimentación . El volumen de la dieta se ajustó a través del tiempo para a acomodar los requerimientos nutricionales incrementados de los cerditos en crecimientos. La suplementación dietética con carbohidrato líquido se realizó al adicionar jarabe de maíz estéril (KARO) en 5% (v/v) en 5-7 días de edad (Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . 3_5:274-282) . Estos se incrementó a 10% (v/v) en 10-12 días de edad y se continúa la terminación en los días 30-35 de edad o cuando están moribundos (31 días de edad en un caso) . B. Inóculos Bacterianos H. Heilmannii : Un total de 9 cerditos en el Grupo A se pusieron en ayunas durante 12 horas y luego se inocularon oralmente en 3 días de edad en un homogenado gástrico de murino (Eaton y colaboradores, "Isolation of Puré Populations of Heli cobacter heilmannii-like bacteria" in Campylobacters, Helycobacters and Rela ted Organisms, Newell y colaboradores, eds'. (1996) Plenum Press, New York, N.Y., 25-31) que contiene H. heilmannii (Hh) como es descrito en lo anterior y en Krakowka y colaboradores, (1998) Ve t . Pa thol . 35:274-282. No se hizo intento para cuantificar el número de bacterias infecciosas en esto inóculos puesto que este agente no es cultivable sobre medios convencionales. I-I. cerdo : Un total de 11 cerditos en el (Grupo B) , separablemente alojado de los cerdos del Grupo A anteriores y los controles (Grupo C) , se inocularon de manera similar con H. cerdo porcino (108 cfu bacteriana contenido en 2.0 ml de caldo de Brúcela) en 3 días de edad, obtenido como es descrito en lo anterior. Dos cerditos de Grupo C recibieron caldo de Brúcela solo como controles no infectados. C . Diseño Experimental y Evaluación Patológica El diseño básico utilizado en este estudio fue similar aquel descrito en el Ejemplo 6 y en Krakowka y colaboradores, (1998) Ve t . Pa thol . 35:274-282. Grupos de cerditos separadamente alojados se pusieron en ayunas durante 12 horas y se inocularon oralmente con bacterias en 3 días de edad. La suplementación con carbohidrato en la dieta se introdujo gradualmente (5%) iniciando en 5 a 7 días de edad y se incrementó en 10% (v/v) cuando se presentó que los cerditos se han adaptado a este aditivo, usualmente por 10-14 días de edad. Tres cerditos infectados con Hh recibieron suplementación de carbohidrato como lo hicieron 6 de los cerditos infectados con Helicoba cter porcino. En la terminación planeada en 30-35 días de edad (post-infección días 27, 32), los cerditos se pusieron en ayunas durante la noche, se sedaron y se removieron de las unidades de aislamiento. Después de la recolección de una muestra de sangre coagulada terminal para el suero, los cerditos se eutanizaron con una sobre dosis intravenosa de pentotal sódico (EUTHOL) . El estómago se aisló, se ligó en el esófago distal y el duodeno próximo se removió. Utilizando métodos estériles, el estómago se abrió a lo largo de las curvaturas más grandes y menor. Cuando el cultivo y el re-aislamiento se realizó, la mitad del estómago se utilizó para la microbiología como es descrito en el Ejemplo 6 y en Krakowka y Eaton "Helicobacter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedi cal Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810; Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . 3J5: 274-282 ; PCT Publication No. WO 2004/069184. Para esto, la mucosa se eliminó libre del muscularis, se peso y luego de homogenizó en el caldo Brúcela como una suspensión al 10% (p/v) . Diluciones de diez veces homogenado gástrico luego se colocaron por duplicado sobre placas de medio de Skirrow y estas se incubaron durante 4 días, a 37°C, 5% (v/v) oxígeno. Los re-aislados se confirmaron que son especies de Helicobacter mediante la morfología de colonias, mancha de Gram y la morfología y por pruebas bioquímicas para la actividad de ureasa y catalasa como es descrito (Krakowka y Eaton "Helicoba cter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedi cal Research II, • Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810). En un caso, el trato de la úlcera GEU se cortó transversalmente libre del tejido gástrico circundarte y se cultivó por separado para el Helicobacter. Como se indicó en lo anterior, no se hizo intento para recuperar Hh de los cerditos del Grupo A y la mancha de Warthin Starry se utilizó para confirmar la infección gástrica con este organismo como es descrito en el Ejemplo 6 y en Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . 35:274-282. Para la evaluación patológica, todas las úlceras mucosales de GEU se fotografiaron como muestras frescas antes de la fijación por inmersión de los estómagos abiertos en solución de formalina regulada con fosfato al 10% (v/v) durante 24 horas. Secciones representativas de la cardia no glandular (esofágica), la cardia glandular, el fundus, el antrum, poilorus y duodeno próximo se recolectaron, y se procesaron en botes de parafina mediante métodos de rutina. Secciones de tejido de 5 mieras replicadas se des-parafinizaron a través de .alcoholes graduados, se rehidrataron y se mancharon con hematoxilina y eosina y manchas de plato de Warthin Starry como es descrito en el Ejemplo 6 y en Krakowka y Eaton "Heli coba cter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Bíomedi cal Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810 and Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . 3J5: 274-282. Resultados Como se explicó en lo anterior, los cerditos infectados por cualquiera de estas especies bacterianas gástricas y mantenidas con la dieta de reemplazo de la leche de control fueron clínicamente asintomáticos a través del curso de los experimentos. Los cerditos que se alimentaron con la dieta de reemplazo de leche y carbohidrato líquido adicionado fueron inicialmente resistentes a la dieta pero dentro de varios días que consumieron completamente entre las alimentaciones como lo hicieron sus contrapartes de dietas normales. Durante la noche (PID 30-31) uno de los cerditos infectados con el Helicobacter en la dieta de alto carbohidrato murió. Este se le hizo la necropsia 6-8 horas después . En la necropsia, la única lesión extra-gastrointestinal ocurrió en los hígados de lo cerditos implementados con carbohidrato. Los hígados fueron pálidos o amarillos con la generación grasosa o la infiltración de glicógeno. La Tabla 18 resumen los descubrimientos gruesos en los estómagos de los cerditos en este experimento. Como es reportado el Ejemplo 6 y en Krakowka y Eaton " Helicobacter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedical Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810; Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . 35:274-282; PCT Publication No. WO 2004/069184; y Krakowka y colaboradores, (1987) Infecí . Immun . 55:2789-2796, los cerditos gnotobióticos persistentemente infectados con Helicobacter gástricos desarrollaron una inflamación gástrica gruesamente evidente como el desarrollo de folículo linfoide, predominantemente en la curvatura menor del estómago y el antrum. Acompañantes a esto está el edema submucosal leve y variable de la lámina propia gástrica (Krakowka y Eaton " Helicoba cter pylo ri infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedi cal Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810). Estas manifestaciones de gastritis no estuvieron presentes en los cerdos de control no infectados pero se detectaron en todos excepto uno de los cerdos infectados, sin considerar la especie del Helicoba cter presente. Úlceras pequeñas en la mucosa gástricas glandular se detectaron en 3 de 11 cerditos infectados con H. cerdo porcino y en ninguno de los cerditos (0 de 9) infectados con Hh . Estas úlceras mucosales fueron similares a aquellas descritas en el Ejemplo 6. Las lesiones erosivas en el esófago pars no glandular se observaron ocasionalmente en los sueros infectados con H. pylori (Krakowka y Eaton "Helicobacter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedi cal Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810); estas lesiones también se detectaron en 2 de 9 cerditos infectados con Hh . La ulceración extensiva y profunda del esófago pars, indistinguible morfológicamente del GEU porcino que ocurre naturalmente en cerdos convencionales (O'Brien JJ. Gastric Ulcers. Diseases of Swine, 6th ed. Editors AD Leman AD, y colaboradores, (1986), 680-691; Embaye y colaboradores, (1990) J. Comp . Pa th . 103:253-264 ) , se presentó en todos los seis cerditos infectados con especie de Heli cobacter porcina y alimentados con una dieta suplementada con carbohidrato fermentable. En estos cerdos, la ulceración fue profunda, extensiva e incluyó el cuerpo completo del esófago pars gástrico en cuatro de estos cerditos y fuero de 1.5 a 2.0 en diámetro. En dos cerditos, el edema serosal gástrico estuvo presente en el exterior de la serosa al GEU. El hecho de úlcera en 4 de 6 cerditos contuvo restos celulares necróticos, mucus gástricos y sangre parcialmente digerida, indicando que el proceso ulcerativo ha progresado más allá de la lámina propia para involucrar la mucosa muscular implícita. La causa de muerte de los cerditos encontrados muertos fue la exsanguinacion en el estómago. En ese cerdito, del estómago fue tres veces más grande que el esperado y rellenado con sangre coagulada y parcialmente digerida y mucus. El bazo fue severamente contraído y el exterior del estómago fue delgado, acuoso y no coagulado. Este proceso ulcerativo ha sido presente por al menos varios días antes de la terminación en el grupo de cerditos fue sugerido por la presencia de melena en el intestino delgado y grueso en 4 de 6 cerditos. Los descubrimientos histológicos en el estómago confirmaron en la presencia de folículos linfoides incrustados en la mucosa gástrica. También, un infiltrado inflamatorio predominantemente linfocítico, moderado en la mucosa acompaño el desarrollo de folículo. Ambas de estas características son descubrimientos regulares de los cerdos infectados con He 1 i coba c ter gástrico (Krakowka y Eaton "Helicoba cter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedi cal Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810). Las lesiones ulcerativas en el pars fueron histológicamente comparables a aquellos descritos en los cerdos convencionales por otros (O'Brien JJ. Gastric Ulcers. Diseases of Swine, 6th ed. Editors AD Leman AD, y colaboradores., (1986), 680-691; Embaye y colaboradores, (1990) J. Comp . Pa th . 103:253-264) . Los hechos de úlceras estuvieron libres de células epiteliales y consistieron de tejido de granulación, hemorragia y restos celulares necróticos. Las células inflamatorias que comprenden estas lesiones fueron predominantemente neutrófilos muertos y teñidos. Los bordes de la úlcera contuvieron remanentes y hiperplásticos de epitelio no glandular, infiltrados de célula inflamatoria y fueron distendidos por acumulaciones de fluido seroso. Ninguno de los cerdos infectados con Hh fueron cultivados para la recuperación de Heli coba cter ya que este agente fue no cultivable. Cuatro de seis cerditos infectados con H. cerdo, alimentados con carbohidrato suplemental se cultivaron para la recuperación cuantitativa de Helicoba cter. Las unidades de formación de colonias (cfu) bacteriano por gramo de mucosa gástrica varió de 0.14 a 8.16 x 106, valores típicos para gnotobiotes persistentemente infectados con H. pylori (Krakowka y Eaton "Helicoba cter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedical Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810) o especie de H. cerdo porcino (ver el Ejemplo 6) . En uno de estos cerditos, el cráter de úlcera se cortó transversalmente libre de la mucosa gástrica circundante y se cultivó por separado. La úlcera contuvo 0.2 x 10d cfu bacteriano mientras que la mucosa glandular restante en ese cerdito produjo diez veces más organismos (2.94 x 106 cfu/gramos) . La mancha de plata de Warthin-Starry se utilizó para conformar la colonización gástrica en todos los cerdos. Son los nueve cerdos infectados con Hh contuvieron microbios fácilmente detectables de morfología herméticamente en espiral características (ver en el Ejemplo 6 Krakowka y colaboradores, (1998) Vet. Pa thol . 35:274-282) . En estos cerdos el volumen de los organismos se detectaron en el fundos gástricos y el antrum y localizaciones extracelulares asociadas con el epitelio de superficie luminar o dentro de los volúmenes de las hendiduras gástricas. Como es descrito en lo anterior, el cardia mucosal gástrico y el antrum, particularmente a lo largo de la curvatura menor, fue regularmente colonizado por microbios en forma bastón curvos cortos de morfología Heli coba cter. Los organismos fueron abundantes en la capa mucus superficial y adherentes a la mucosa glandular gástrica adyacente a las lesiones ulcerativas en pars. Sin embargo, loso organismos no fueron detectados en los cráteres de úlce'ra en el pars. Para resumir, úlceras severas y amenazantes de la vida del esófago pars de porcino se produjeron en todos los cerdos gnotobióticos resistentemente colonizados con H. cerdo porcino cuando una fuente fácilmente fermentable de carbohidrato dietético se adicionó a la dieta de leche estéril. Estos GEU experimentalmente producidos son indistinguibles de los GEU que ocurre naturalmente en cerdos convencionales. Mientras que las lesiones erosivas leves en el pars son ocasionalmente detectadas en cerditos gnotobióticos colonizados con H . pylori (Krakowka y Eaton "Helicobacter pylon infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedi cal Research II, Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810), Lactoba cill us sp. and Bacillus sp. fed sow milk replacement diet (Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . 35:274-282), estas lesiones son leve, no progresan a ulceración y que nunca se han asociado con muertes en las unidades de aislamiento. De manera importante, la colonización de los gnotobióticos suplementados con carbohidrato líquido con Hh en ambos del presente estudio y en el estudio previamente reportado (Krakowka y colaboradores (1998) Vet . Pa thol . 35:274-282), no produjeron GEU. Estos datos fuertemente implican la especie de H . cerdo porcino y no Hh en la génesis de la enfermedad de GEU significante en cerdos. En realidad, los datos aquí y en otra parte (Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . 35:274-282) sugieren que la asociación entre la colonización de Hh gástrico y GEU es coincidental, no causal. Esto no se presenta que sea el caso con la especie de H. cerdo gástrico porcino recientemente identificado descrito en lo anterior. Distinta la mono-colonización con Hh como es descrito en la presente y Krakowka y colaboradores, (1998) Vet . Pa thol . _35: 274-282, and even H. pylop (Krakowka y colaboradores, (1995) Infect. Immun. 63:2352-2355; Krakowka y Eaton "Helicoba cter pylori infection in gnotobiotic piglets: A model of human gastric bacterial disease" in Advances in Swine in Biomedical Research II, 'Tumbleson y colaboradores, eds., Plenum Press, New York, N.Y., 779-810), la colonización gástrica con esta especie bacteriana está asociada con alta incidencia de GEU (70%) y la ulceración mucosal glandular duodenal y gástrica (40%) cuando los cerditos se mantienen en una dieta de reemplazo de leche de control. En los presentes experimentos, las úlceras en la mucosa glandular gástrica fueron identificadas en 2 de 5 cerdos infectados sobre dieta de •control. Más importantemente sin embargo fue la influencia culminar de la colonización gástrica persistente con esta especie bacteriana y una fuente fácilmente disponible de carbohidrato dietético en la incidencia y severidad de GEU. Todos los seis cerditos infectados con H. cerdo que recibieron suplementación de carbohidrato desarrollaron enfermedad de GEU severa y amenazante de la vida. De hecho, un cerdito murió durante la noche sobre PID 30-31 sin demostrar signos clínicos definitivos de ulceración gástrica antes de la muerte. La muerte repentina es un descubrimiento clínico típico en cerdos alimentadores GEU (O'Brien JJ. Gastric Ulcers. Diseases of Swine, 6th ed . Editors AD Leman AD, y colaboradores, (1986), 680-691). Por otra parte, tres de otros cerditos en este grupo tuvieron evidencia obvia de sangrado intra-gástrico (sangre parcialmente digerida en el injerto de úlcera y adherida a la capa de lupus luminal gástricos) que ha estado ocurriendo por al menos un día como es expuesto en evidencia por la melena presente en el intestino delgado y grueso. Como es descrito en lo anterior, el nicho gástrico preferido para este agente bacteriano es la curvatura menor de la cardia gástrica y el antrum. El primero está inmediatamente adyacente al esófago pars, así como descrito con Hh, de esta proximidad anatómica proporciona fuerte evidencia circunstancial para intima causalidad. En este respecto, es importante acentuar que estas especies de Helicobacter, similar H. pylori , no se adhiriere al epitelio escamoso estratificado del pars ni coloniza en las regiones esofágica pars directamente. Más bien, el patrón de colonización gástrico en gnotobiotes es idéntico aquel observado con H. pylori . Para H. pylori , los útiles de colonización aparecen que son dictados por la expresión de superficie de los residuos de glicoproteína que interactúan con residuos de carbohidrato recíprocos (antígenos de Lewis) en el mucus gástrico y en la epitelial gástricas. Los arreglos antigénicos de Lewis en humanos también se expresan en cerdos, y sin que sean relacionado por una teoría en particular, la facilidad mediante la cual las especies de Helicobacter gástricas inician y perpetúan la colonización gástrica en cerdos puede ser debido a este fenómeno de mimetismo molecular. Como se muestra en lo anterior, ni el carbohidrato dietético en exceso ni en infección bacteriana sola produjo GEU. Más bien, se presenta que la combinación de la dieta rica en carbohidrato junto con la colonización por H. cerdo actúan sinergísticamente para promover tanto la incidencia como la severidad de GEU. La demostración de que la especie de Helicobacter gástrica dirige un porcino tal como H. cerdo está íntimamente involucrado en el desarrollo GEU como es mostrado en lo anterior tiene varias implicaciones para el manejo de esta enfermedad y esta infección bacteriana en cerdos convencionales. Las procesamientos antimicrobianos innovativos al control o prevención de la infección gástrica por estos Helicoba cter puede ser mencionado en el control y manejo de GEU porcino y composiciones de vacuna para prevenir la infección por H. cerdo, tal como las vacunas de H. cerdo y H. pylori , también serán útiles. Tabla 18. Un resumen de descubrimien tos gruesos en los estómagos de cerdos gnotobióticos infectados con el Helicobacter gás trico con suplementación dietética con carbohidra to líquido . * incidencia = número positivo (numerador) cuenta de numero total (denominador) Ejemplo 8. Efectividad y Capacidad Protectora de la Especie de Helicobacter Con el fin de determinar la efectividad y capacidad protectora de I-I . ce rdo, H. pylori y I-I. heilmannii se condujeron los siguientes experimentos. Ma.teria.les y Métodos A. Preparación de lisados de H. cerdo y H. pylori Lisados de H. cerdo y H. pylori se prepararon utilizando la digestión proteolítica, de acuerdo con un método similar al protocolo de digestión directo en Waters y colaboradores, (2000) Vaccine 1_8: 711-719. En particular, suspensiones de bacterias de H. cerdo o H. pylori preparadas en cultivos líquidos de caldo de Brúcela (Difco) suplementado con suero bovino fetal 10% (B-FBS) bajo condiciones microaerofílicas se dejaron alcanzar aproximadamente 109 bacteria por ml . Las bacteria se recuperaron mediante centrifugación (2000-3000 x g) durante 10 minutos. El sobrenadante agotado se desechó y la pelotita bacteriana se .resuspendió en una cantidad mínima de solución salina regulada con un fosfato de Dulbecco, se transfirió a un crio frasquito de plástico y se congeló a -70 grados C. Mientras que se congela, la pelotita bacteriana se liofilizó en un aparato de evaporador centrifugó (speed vac). Las pelotillas bacterianas liofilizadas se acumularon y se pesaron. Para la digestión bacteriana, pepsina (Sigma, St . Louis, MO) en una concentración de 1.0 µg/ml se preparó mediante la dilución con HCl 10 mM, pH 1.9-2.2. 1 µg de pepsina se incubó con 1 mg de bacterias, liofilizado durante 24-25 horas a 37 grados C. sobre un agitador magnético. Después de la terminación de la digestión, la digestión se formó en alícuotas en dosis de 1 ml, se marcó y se congeló a -70 grados C hasta el uso. La Figura 1 muestra los perfiles, de digestión de enzima proteolítica de H. cerdo y H. pylo ri . B. Vacunación y Protocolo de Estimulación Los lisados se formularon en composiciones de vacunas y se utilizaron para vacunar cerdos gnotobióticos como sigue. Los lisados se diluyeron a 24-25 mg/ml en solución salina regulada con fosfato de Dulbecco y se mezclaron con 1 ml de adyuvante de forma incompleto. La vacuna se emulsificó en adyuvante y la mezcla se inyectó en las axilas dorsales y las caderas de cada cerdito. Cada cerdito recibió 3 inyecciones en 3, 10 y 17 días de edad. Los cerdos vacunados y los controles no vacunados fueron oralmente inoculados con organismos de I-I. cerdo (aproximadamente 108 a 109 unidades de información de colonia (cfu) en 2.0 ml de inoculo) 7 a 10 días después de la última vacunación. Los cerdos se terminaron 10-14 días después de la estimulación y la eficacia de vacunación se determinó mediante una combinación del examen grueso e histológico de los estómagos y mediante re-cultivo cuantitativo del inoculo de estimulación de la mucosa gástrica como es descrito en el Ejemplo 6. C. Respuestas de la Prueba de la Piel de Tipo Retardado Cutáneo (48 hr) Cerdos gnotobióticos mono-infectados con ya sea H. pylori o H. cerdo se probaron en la piel mediante la inyección intradérmica de 100 microlitros de un reactivo de pruebas de piel que contiene 10 microgramos de lisado bacteriano ( H. cerdo o H. pylori ) . Los sitios de prueba de la piel se les hizo una biopsia y se 'examinaron en 24 y 48 horas después de la prueba de la piel en la histología de los sitios de la prueba de la piel' se determinó mediante el examen microscópico de las secciones de tejido. D. índices de Eficacia La eficacia de la digestión de proteolítica se estimó mediante la separación electroforética de SDS-PAGE y el análisis de las bandas de proteína producidas por digestión (en comparación a los perfiles SDS-PAGE de bacterias no digeridas) . Una digestión exitosa dio por resultado la aparición de proteínas de bajo peso molecular en la digestión que estuvieron ausentes en el organismo intacto no digerido. En la seguridad in vivo de las preparaciones de vacunas se determinó en cerdos gnotobióticos no infectados. Para esto, las digestiones de vacunas se administraron como en lo anterior y la evidencia clínica para el daño mediado por endotoxinas (diarrea, choque hipovolémico, angustia respiratoria y muerte repentina) se monitorearon. Todas las preparaciones se estimaron como "seguras" mediante este proceso. La eficacia de las preparación de vacuna en inducir las respuestas inmunes tanto humoral como celular en los vacunados se determinó mediante un ensayo de ELISA para los anticuerpos IgG y/o IgM a los lisados de célula de H. cerdo no digerida en sueros post-vacunales y mediante las respuestas de las prueba de la piel cutánea intradérmica 48 horas a lisado de H. cerdo . La hipersensibilidad dérmica de tipo retardado se confirmó mediante lo examen histológico de los sitios de la prueba de la piel y la demostración de los infiltrados linfocíticos-plasmacíticos y monocíticos celulares en los sitios de la prueba de la piel. La digestión de vacuna se consideró que es efectiva si el proceso de vacunación eliminó las vacunas recuperables de los homogenizados gástricos o redujo el cfu bacteriano en un promedio de 2 logs por debajo de los cerdos de control de estimulación. Los parámetros adicionales de éxito incluyendo la inflamación gástricas reducidas o ausentes (gastritis) y la 'ausencia de ya sea úlceras mucosales gástricas o úlceras del esófago pars. Resultados Las Tablas 19-22 resumen los resultados de los experimentos. Los análisis de manchado de Western de sueros convalecientes acumulados de cerdos infectados con H. pylori e infectados con H. cerdo exhibieron reactividad cruzadas basadas en IgG extensivas a proteínas múltiples. La Mono-infección con ya sea bacteria indujo una infiltración linfocítica y monocítica modesta en los sitios por 30-35 días después de la infección cuando se probaron con ya sea preparaciones de prueba de La piel de H. pylori o H. cerdo . Las vacunaciones parenterales con digestiones bacterianas de H. pylori y H. cerdo indujeron la misma respuesta. Cuando los cerditos fueron vacunados parenteralmente y luego probados en la piel con estos antígenos en la terminación, el aumento y el grado y la cantidad de infiltrados de células inflamatorias se observaron. No hubo diferencias detectables entre los sitios de la prueba de la piel inducida por el lisado de H. pylori y los sitios de la prueba de la piel inducidos por lisado de H. cerdo . Un experimento de protección heterólogo pequeño (n = 2 cerditos) en cerdos se intentó. En ese experimento, dos cerditos se vacunaron con una digestión proteolítica de H. pylori recientemente preparada y luego se estimularon mediante la inoculación oral con H. cerdo . De manera sorprendente, no se observó una reducción en el cfu bacteriano recuperable del estómago. Hay varias explicaciones para este resultado. Primero u'n número insuficiente de cerditos se utilizaron en este experimento. La protección puede haber sido observada en alguna fracción con los cerditos estimulados tuvieron un número más grandes de animales de estimulación que son involucrados. Segundo, la digestión de H. pylo ri puede haber sido inmunológicamente defectuosa en este experimento. Esto es, un experimento homólogo paralelo (por ejemplo, vacunación con esa digestión de t H. pylori y la estimulación con I-I. pylori ) no se condujo para determinar si el producto de vacuna de prueba fue efectivo. Otros estudios presentados en las tablas acompañantes, y otros Ejemplos, han documentado el hecho de que las preparaciones de digestión de vacuna de H. pylori si se preparan apropiadamente, proporcionaron protección a cerditos cuando se estimularon con bacterias de H. pylori . Finalmente, el inoculo de estimulación de H. cerdo utilizado en este experimento utilizó aproximadamente diez veces más bacterias (109 cfu) para estimular los dos vacunados que ordinariamente utilizaron (aproximadamente 108 cfu) en los estudios de protección y estimulación. En este caso, cualquiera de los análisis protectores de la vacunación serán obscurecidos en el frente de una estimulación bacteriana notable . Los datos presentados en los Ejemplos anteriores, muestran que I-I. pylori y H. cerdo poseen los aspectos comunes característicois del género Helicoba cter . Estos incluyen las siguientes características mantenidas en común: bastones curvos cortos, gram negativos, patrón de crecimiento microaerofílico, actividad de enzima de ureasa, actividad de urea de catalasa y posesión de la agrupación de genes referida como la "isla de patogenicidad cagA" . Adicionalmente, hay una fuerte homología entre los perfiles de proteína (número similar de proteínas con movilidades electroforéticas similares) de H. pylori y H. cerdo como es evidenciado por el análisis de SDS-PAGE (ver, Figures 5A y 5B) y un grado significante de la reactividad cruzada inmunológica entre las dos especies de Heli cobacter. Así, las condiciones adecuadas dadas y las digestiones efectivas, serán esperadas que las digestiones de H. pylori y fracciones de las mismas proporcionarían una medición de inmunoprotección en las especies (cerdos y otras) que son susceptibles a la infección con sus propias especies de Helicobacte r homologas ( H. cerdo en cerdos, por ejemplo). Tabla 19. Resumen de los estudios de infección en un solo agen te .

Tabla 20. Resumen de va cuna ciones con diges tión de H. cerdo en la protección homologa y heteróloga .

Tabla 21 . Resumen de vacunaciones con digestión de H. pylori en la protección homologa y heteróloga .

Tabla 22. Resumen de reacciones cruzadas serológicas en tre las especies de Heli coba cter porcino como es determinado con los sueros convalecien tes a cumulados probados en los inmunoensayos de ELISA y manchado de Western en las reacciones de prueba de la piel (48 horas de inyecciones in tradérmica s en el pabellón de la oreja an tes de la terminación) .

Así, los modelos animales para el estudio de infección con Helicobacter y los métodos para tratar, prevenir y diagnosticar la infección por Heli cobacter son descritas, así como composiciones para el uso con los métodos. Aunque las modalidades preferidas de la presente invención se han descrito en algún detalle, se entiende que varias modificaciones y variaciones se pueden hacer sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como es definido por las reivindicaciones. Tales modificaciones y variaciones serán evidentes para aquellos expertos en la técnica .

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para infectar un cerdito gnotobiótico con un aislado porcino de Helicobacter cerdo, el método caracterizado que comprende: (a) aislar I-I. cerdo de un sujeto porcino para producir un aislado de I-I. cerdo; y (b) administrar el aislado de H. cerdo al cerdito en una cantidad suficiente para causar infección por H. cerdo en el cerdito. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aislado de H. ce rdo se administra oralmente al cerdito. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el aislado de H. cerdo se administra en una cantidad de aproximadamente 107-109 unidades de formación de colonia. 4. Un método para evaluar la habilidad de una vacuna para prevenir la infección por Heli cobacter cerdo, caracterizado porque comprende: (a) administrar una vacuna candidata a un cerdito gnotobiótico; (b) administrar un aislado de H. cerdo al cerdito en una cantidad suficiente para causar infección en un sujeto no vacunado; y (c) avaluar la presencia de la infección por H. cerdo en el cerdito, para de esta manera evaluar la habilidad de la vacuna candidata para prevenir la infección por H. cerdo . 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la vacuna candidata es una vacuna de H. pylori que comprende por lo menos un inmunógeno de H. pylori . 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la vacuna candidata es una vacuna de H. cerdo que comprende por lo menos un inmunógeno de H. cerdo . 1 . Un método para producir un modelo de animal porcino de ulceración gastroesofágica (GEU) del esófago pars, el método caracterizado porque comprende: (a) aislar H. cerdo de un sujeto porcino para producir un aislado de H. cerdo ; (b) administrar el aislado de I-I. cerdo a un cerdito gnotobiótico en una cantidad suficiente para causar infección por H. cerdo en el cerdito; y (c) alimentar al cerdito con una dieta de reemplazo leche que contiene una fuente dietética de carbohidrato fermentable bajo condiciones suficientes para producir GEU del esófago pars. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el aislado de H. ce rdo se administra oralmente al cerdito. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el aislado de H. cerdo se administra en una cantidad de aproximadamente 107-109 unidades de formación de colonia . 10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la fuente dietética de carbohidrato fermentable es jarabe de maíz. 11. Un método para producir un modelo de animal porcino de ulceración gastroesofágica (GEU) del esófago pars, el método caracterizado que comprende: (a) aislar H. cerdo de un sujeto porcino para producir un aislado de II. cerdo; (b) administrar oralmente aproximadamente 107-109 unidades de formación de colonia del aislado de H. cerdo al cerdito gnotobiótico para causar infección con H. cerdo ; (c) alimentar al cerdito con una dieta de reemplazo de leche que contiene jarabe de maíz, como una fuente fermentable de carbohidrato bajo condiciones suficientes para producir GEU del esófago pars. 12. Un método para identificar un compuesto capaz de tratar la infección por Heli coba c ter, el método caracterizado porque comprende: (a) administrar un aislado de H. cerdo a un cerdito gnotobiótico en una cantidad suficiente para causar infección por H. cerdo en el cerdito; (b) suministrar un compuesto o una serie de compuestos al cerdito; y (c) evaluar la infección por H. cerdo en el cerdito con relación al cerdito gnotobiótico infectado con H. cerdo no tratado, en donde la infección por H. cerdo reducida en el cerdito con relación al cerdito no tratado identifica un compuesto capaz de tratar la infección por Hel i coba cter . 13. Un método para identificar un compuesto capaz de 'tratar la infección por H. cerdo, el método caracterizado porque comprende: (a) proporciona un modelo de animal porcino de GEU producido por el método de la reivindicación 7, en donde el modelo de animal porcino es un cerdito; (b) suministrar un compuesto o una serie de compuestos al cerdito; (c) evaluar la infección por H. cerdo en el cerdito con relación al cerdito gnotobiótico infectado con H. cerdo no tratado, en donde la infección por H. cerdo reducida en el cerdito con relación al cerdito no tratado identifica un compuesto capaz de tratar la infección por Hel i coba cter . 14. Un método para prevenir la infección por Hel i coba cte r cerdo en un sujeto porcino, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende por lo menos un inmunógeno de Helicoba cter. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la composición comprende por lo menos un inmunógeno de H. pylori . 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la composición comprende un lisado de H. pylori . 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el lisado de H. pylo ri se produce mediante la digestión proteolítica de bacterias de H. pylori . 18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la composición además comprende un adyuvante. 19. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la composición se administra parenteralmente .