COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA QUE COMPRENDE UNA CÉLULA BACTERIANA QUE EXHIBE UN COMPUESTO PROTEINÁCEO HETERÓLOGO Antecedentes de la Invención En años recientes, la vacunación por la mucosa ha recibido atención incrementada debido a i) nuevos discernimientos en los mecanismos del sistema inmune, ii) la exposición razonada de imitar la ruta de infección para una mayoría de patógenos, pero también debido a iii) la necesidad por vacunas fácilmente administradas y efectivas contra enfermedades nuevas y emergentes. Además, la amenaza global del bio-terrorismo requiere vacunas efectivas, que se puedan producir fácilmente y administrar rápidamente sin personal entrenado . El sistema inmune de la mucosa se presenta que es ideal para obtener respuestas inmunes efectivas, puesto que la inducción en un sitio de la mucosa da por resultado una respuesta específica por todo el sistema inmune de la mucosa. La inducción en los sitios de la mucosa más frecuentemente da por resultado una respuesta inmune sistémica (Huang J. y colaboradores, 2004 Vaccine 6:794-801; Verdonck F. y colaboradores, 2004 Vaccine 31_-3_2: 4291-9) . La mayoría de los patógenos infectan a sus hospederos por la vía de las superficies de la mucosa. Este hecho lo hace ventajoso para crear vacunas que ejercen su efecto en una etapa temprana de esta ruta de infección. Consecuentemente, el esfuerzo se ha
enfocado sobre el desarrollo de microorganismos no patogénicos o patogénicos adecuados que son capaces de suministrar componentes de vacuna específicos hacia los patógenos . Progreso significante, durante décadas recientes, se ha hecho en desarrollar métodos para la exhibición en la superficie de proteínas heterólogas utilizando microorganismos recombinantes. La exhibición en la superficie de proteínas heterólogas se ha mostrado en tanto bacterias patogénicas atenuadas tal como Salmonella (Arnold H. y colaboradores, 2004 Infect Immun. 1_1: 6546-53) como en bacterias no patogénicas tales como Staphylococcus (Wernerus H. y colaboradores, 2002 Biotechnol J. 3^:67-78) o Lactobacillus utilizando la tecnología de DNA recombinante (Grangette C. y colaboradores, 2004 Infect Immun. _5:2731-7). Las proteínas heterólogas se producen mediante la célula recombinante, que a su vez dirige la proteína a la superficie de la célula. Varios métodos se han descrito para anclar a la superficie a la proteína secretada en microorganismos. Un procedimiento, mostrado en Staphylococcus, es introducir un estiramiento de aminoácidos que se fijan a la pared celular en la proteína secretada. La proteína quimérica se integra a la pared celular durante su secreción, donde enlaza a la pared celular a través del estiramiento de aminoácidos de fijación (Wernerus H. y colaboradores. 2002 Biotechnol J.
1_: 67-78). En un procedimiento alternativo, fantasmas bacterianos producidos por la lisis celular, se han empleado como un portador o vehículo de dirección para sustancias activas tales como anticuerpos o polipéptidos terapéuticamente efectivos (CA 2,370,714). Las cepas bacterianas adecuadas que comprenden un gen lítico, por ejemplo gen E de bacteriófago, se inducen para someterse a la lisis celular para formar un fantasma vacío. La sustancia activa deseada luego se transporta en el fantasma vacío, donde puede ser inmovilizada en la superficie de la membrana de célula interna. En este caso la sustancia activa es encapsulada en el interior del fantasma celular, antes que expuesta sobre la superficie de la célula. Varias publicaciones describen el potencial biológico significante de utilizar las propiedades de exhibición de superficie de bacterias vivas para la tecnología de suministro de vacuna (Wernerus H. y colaboradores, 2004 Biotechnol Appl Biochem. 40 (3) : 209-28). Sin embargo, estos procedimientos dependen de microorganismos recombinantes, donde el riesgo de, y la oposición general a utilizar ' o liberar organismos genéticamente modificados ha sido una barrera para aplicar esta tecnología de suministro de vacuna viva en humanos y animales. Las bacterias exterminadas que contienen DNA recombinante también son consideradas un riesgo, puesto que ellas llevan DNA
recombinante que eventualmente puede ser difundido en el medio ambiente. Bajo ciertas circunstancias, como por ejemplo bajo un ataque bio-terrorista, el uso de la tecnología basada en GMO se puede considerar como un riesgo aceptable. Muy pocos intentos se han hecho para proporcionar un vehículo que exhibe antígeno que no es dependiente sobre las cepas bacterianas genéticamente modificadas. La solicitud de patente norteamericana US 2003/0180816 Al divulga un método para obtener un material de pared celular de bacterias Gram positivas no de GM con capacidad mejorada para enlazar proteínas que son fusionadas a un dominio de enlace de pared celular AcmA (W099/25836) . De acuerdo con el método divulgado, las bacterias Gram positivas se tratan con una solución acídica para remover los componentes de la pared celular que incluyen proteinas, ácido lipoteicoico y carbohidratos. El material de pared celular resultante de esta manera es grandemente separado de las proteínas nativas, pero permanece una barrera contra el medio ambiente exterior, y se designa un fantasma. Las proteínas quiméricas, que comprenden la proteína de dominio AcmA, se pueden enlazar de una manera no covalente a estos fantasmas. Modos mejorados de presentación de antígeno y alérgeno se requieren con el fin de cumplir las necesidades de los procedimientos de vacunación diseñados para proporcionar tratamiento para tanto pacientes que sufren de
alergia así como aquellos que sufren de una enfermedad infecciosa. El concepto de vacunación se basa en dos características fundamentales del sistema inmune, específicamente la especificidad y la memoria. La vacunación cebará el sistema inmune del recipiente, y la exposición repetida a las proteínas similares del sistema inmune estará en una posición para responder más rigurosamente a la estimulación de por ejemplo una infección microbiana. Las vacunas son mezclas de proteínas propuestas para ser utilizadas en la vacunación para el propósito de generar tal respuesta inmune protectora en el recipiente. La protección comprenderá solamente componentes presentes en la vacuna y los antígenos homólogos . Comparada con otros tipos de vacunación, la vacunación para alergia es complicada por la existencia de una respuesta inmune en curso en pacientes alérgicos. Esta respuesta inmune se caracteriza por la presencia de IgE específico de alérgeno que media la liberación de síntomas alérgicos en la exposición a alérgenos. Así, la vacunación para alergia utilizando alérgenos de fuentes naturales tiene un riesgo inherente de efectos secundarios que son en la consecuencia más extrema amenazantes de la vida para el paciente . Los procedimientos para evitar este problema se pueden dividir en tres categorías. En la práctica las medidas
de más de una categoría son frecuentemente combinadas. La primera categoría de medidas incluye la administración de varias dosis pequeñas durante un tiempo prolongado para ' alcanzar una dosis acumulada sustancial. La segunda categoría de medidas incluye la modificación física de los alérgenos mediante la incorporación de los alérgenos en sustancias de gel tal como hidróxido de aluminio. La formulación de hidróxido de aluminio tiene un efecto adyuvante y un efecto de depósito de liberación de alérgeno lenta que reduce la concentración de un tejido de los componentes de alérgeno activos. La tercera categoría de medidas incluye la modificación química de los alérgenos para el propósito de reducir la alergenicidad, es decir, el enlace de IgE. La vacunación de alergia específica convencional es un tratamiento causal para la enfermedad alérgica. Esta interfiere con los mecanismos inmunológicos básicos dando por resultado la mejora persistente del estado inmune del paciente. Así, el efecto protector de la vacunación de alergia específica se extiende más allá del período de tratamiento en contraste al tratamiento con fármaco sintomático. Algunos pacientes que reciben el tratamiento son curados, y además, la variedad de los pacientes experimentan un alivio en la severidad de la enfermedad y los síntomas experimentados, o por lo menos una detención en la agravación de la enfermedad. Así, la vacunación de alergia específica
tiene efectos preventivos que reducen el riesgo de desarrollar la fiebre del heno en asma, y reducir el riesgo de desarrollar nuevas sensibilidades. El mecanismo inmunológico que implica la vacunación de alergia exitosa no se conoce en detalle. En una respuesta inmune específica, tal como la producción de anticuerpos contra un patógeno particular, es conocida como una respuesta inmune adaptiva. Esta respuesta puede ser distinguida de la respuesta inmune innata, que es una reacción no específica hacia los patógenos. Una vacuna para alergia se enlaza para dirigir la respuesta inmune adaptiva, que incluye células y moléculas con especificidad de antígeno, tales como células T y las células B que producen anticuerpo. Las células B no pueden madurar en las células que producen anticuerpo sin la ayuda de las células T de la especificidad correspondiente. Las células T que participan en la estimulación de las respuestas inmunes alérgicas son principalmente del tipo Th2. El establecimiento de un nuevo balance entre las células Thl y Th2 se ha propuesto que es benéfica y central para el mecanismo inmunológico de la vacunación para alergia específica. Si esto se origina por una reducción en las células Th2, un desplazamiento de las células Th2 a Thl o una regulación hacia arriba de las células Thl es controversial. Recientemente, las células T regulatorias se han propuesto que son importantes para el mecanismo de la vacunación para
alergia. De acuerdo con este modelo las células T regulatorias, es decir, células Th3 o Trl, regulan hacia abajo ambas de las células Thl y Th2 de la especificidad de antígeno correspondiente. A pesar de estar ambigüedades generalmente se cree que una vacuna activa debe tener la capacidad para estimular las células T específicas de alérgeno, de preferencia células THl. La vacunación para alergia específica es, a pesar de sus virtudes, no en uso difundido, principalmente por dos razones. Una razón es inconveniencias asociadas con el programa de vacunación tradicional que comprende vacunaciones repetidas, es decir, inyecciones durante varios meses. La otra razón es, más importantemente el riesgo de reacciones secundarias alérgicas. Las vacunaciones ordinarias contra agentes infecciosos se realizan eficientemente utilizando una sola o unas cuantas inmunizaciones de alta dosis. Esta estrategia, sin embargo, no puede ser utilizada para la vacunación para alergia puesto que una respuesta inmune patológica ya está en curso. La vacunación para alergia específica convencional por lo tanto se lleva a cabo utilizando múltiples inmunizaciones subcutáneas aplicadas durante un período de tiempo prolongado. El curso se divide en dos fases, la dosificación hacia arriba y la fase de mantenimiento. En la fase de dosificación hacia arriba dosis incrementadas se
aplican, típicamente durante un período de 16 semanas, iniciando con dosis pequeñísimas. Cuando la dosis de mantenimiento recomendada es alcanzada, esta dosis se aplica para la fase de mantenimiento, típicamente con inyecciones cada seis semanas. Después de cada inyección el paciente debe permanecer bajo atención médica durante 30 minutos debido al riesgo de reacciones secundarias anafilácticas, que en principio aunque extremadamente raras podrían ser amenazantes de la vida. Además, la clínica debe ser equipada para soportar el tratamiento de emergencia. No hay duda de que una vacuna basada en una ruta diferente de administración eliminaría o reduciría el riesgo por reacciones secundarias alérgicas inherentes en la vacuna de base subcutánea actual así como facilitarían un uso más difundido, posiblemente aún habilitando la autovacunación en casa. Los intentos para mejorar las vacunas para la vacunación para alergia específica se han realizado por arriba de 30 años e incluyen procedimientos multivariados. Varios procedimientos se han dirigido al alérgeno mismo a través de la modificación de la reactividad de IgE. Otros se han dirigido a la ruta de administración. El sistema inmune es accesible a través de la cavidad oral y la administración sublingual de alérgenos es una ruta conocida de administración. La administración se puede llevar a cabo al colocar la formulación de vacuna bajo
la lengua y al permitirla que permanezca ahí durante un período corto de tiempo, por ejemplo 30 a 60 segundos. Convencionalmente la vacuna para alergia que utiliza la ruta oromucosal consiste de la dosificación diaria de una solución del alérgeno. En comparación, las dosis de mantenimiento terapéuticas (acumuladas) dadas excedieron el mantenimiento de la dosis subcutánea comparable por un factor 5-500. Aun existe una necesidad por un vehículo biológico mejorado capaz de presentar los compuestos proteináceos seleccionados (por ejemplo, alérgenos o antígenos) para la manufactura de vacunas. Breve Descripción de la Invención La presente invención se dirige a una composición farmacéutica para el uso como un medicamento que comprende un vehículo biológico que exhibe en la superficie uno o más compuestos proteináceos heterólogos que comprenden: a) células de una o más cepas bacterianas no patogénicas, y b) uno o más compuestos proteináceos covalentemente enlazados por medio de un reticulador bifuncional a una entidad química accesible sobre la superficie de las células. en donde las células no comprenden una molécula de ácido nucleico transgénica que codifica el uno o más compuestos
proteináceos, y el enlazador bifuncional se enlaza a un grupo de amino de las células por la vía de una base de Schiff, y el compuesto proteináceo y el reticulador son heterólogos en origen a las células. De preferencia, el medicamento es para el tratamiento o tratamiento profiláctico de un paciente animal o humano. En una modalidad preferida, el reticulador bifuncional se selecciona del grupo que consiste de glutaraldehído, poliazetidina y paraformaldehído. Además el vehículo biológico de la composición puede comprender células de ya sea una cepa bacteriana no genéticamente modificada, o una cepa bacteriana genéticamente modificada o una combinación de las mismas. En una modalidad preferida la cepa bacteriana de la composición es un miembro de un género bacteriano seleccionado del grupo que consiste de Lactococcus , Lactobacillus , Leuconostoc, Streptococcus del Grupo N, Enterococcus, Bifidobacterium, Staphylococcus no patogénico y Bacillus no patogénico. En una modalidad el uno o más compuestos proteináceos es un antígeno de un patógeno animal o humano, o variante del mismo. Alternativamente, el uno o más compuestos proteináceos es ya sea un alérgeno, un antígeno de cáncer animal o humano, o un auto-antígeno de origen animal o humano, o variante de los mismos. La composición de acuerdo con la invención además
puede comprender un enlazador bifuncional y/o un compuesto espaciador. El número de moléculas del compuesto proteináceo enlazado por célula en la composición, que comprende un enlazador bifuncional o espaciador, puede variar de 1 a aproximadamente 100,000. En la ausencia de un espaciador, el número de moléculas del compuesto proteináceo enlazado por células está en el intervalo de 1 a aproximadamente 10,000. La composición puede además estar comprendida en una formulación encapsulada. La composición se puede utilizar como un medicamento. En particular, la composición se puede utilizar para la manufactura de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de: enfermedad infecciosa, cáncer, alergia, y enfermedad autoinmune en un paciente animal o humano. Así, la composición de la invención se puede utilizar en la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o alergia de un paciente animal o humano, mediante lo cual al paciente se le administra una dosis efectiva de la composición. La invención además proporciona un método para la preparación de la composición farmacéutica de la invención, que comprende un vehículo Biológico que exhibe la superficie uno o más compuestos proteináceos heterólogos, que comprende las etapas: preparar una mezcla que comprende: i) células de una o más cepas bacterianas, y ii) uno o más compuestos
proteináceos heterólogos, y iii) un reticulador bifuncional heterólogo, e incubar la mezcla para formar el vehículo biológico en el cual el enlazador bifuncional se enlaza a un grupo amino de las células por la vía de una base de Schiff, y separar el vehículo biológico de la mezcla, en donde la célula no comprende una molécula de ácido nucleico transgénica que codifica el uno o más compuestos proteináceos. En una modalidad preferida, la mezcla se incuba a una temperatura de por debajo de 0°C, de preferencia a una temperatura de entre -1°C y -30°C, mucho más de preferencia a -20°C. De acuerdo con el método de la invención, el vehículo biológico puede comprender células de ya sea una cepa bacteriana no genéticamente modificada o una cepa bacteriana genéticamente modificada. Además la invención de preferencia se practica con una cepa bacteriana que es un miembro de un género bacteriano seleccionado del grupo que consiste de Lactococcus , La ctobacill us , Leuconostoc, Streptococcus del Grupo N, En terococcus , Bifidobacteri um, Staphylococcus no patogénico y Bacill us no patogénico. De acuerdo con el método de la invención, el uno o más compuestos proteináceos puede ser un antígeno, o variante de los mismos, de un patógeno animal o humano. En una modalidad alternativa, el uno o más compuestos proteináceos puede ser un alérgeno o variante de los mismos; o el uno o
más compuestos puede ser un antígeno de cáncer animal o humano y variante de los mismos o auto-antígeno y variante del mismo. En una modalidad adicional del método de la invención, la mezcla puede además comprender un enlazador bifuncional y/o un compuesto espaciador. El método además puede comprender la etapa de encapsular la composición que comprendé el vehículo biológico. Descripción de la Invención I. Breve descripción de los dibujos Figura 1. Reticulación química a Lactobacill us utilizando 1 µg/ml o 2 µg/ml de ß-galactosidasa. La cantidad de actividad de ß-galactosidasa detectada en la fracción de células o fracción del sobrenadante de la mezcla de reacción de reticulación que comprende 1010 células. Figura 2. Reticulación química de arabinosa isomerasa a La ctobacillus . La cantidad de actividad de arabinosa isomerasa detectada en la fracción de células o fracción de sobrenadante de una mezcla de reacción de reticulación que comprende 1010 células. La enzima reticulada en la superficie se representa con símbolos triangulares y la cantidad total de enzima con símbolos cuadrados. Figura 3. Reticulación química de ß-galactosidasa a Lactobacillus, utilizando quitosán como molécula mejoradora. Figura 4. Reticulación química de la proteína Be tvl
a las células de Lactobacill us utilizando glutaraldehído como es descrito en el Ejemplo 11. El panel A muestra los cuadros de contraste de fase del material de pelotilla que se ha reticulado utilizando glutaraldehído. El panel B muestra células de una mezcla de proteína Betvl y células de Lactoba cill us, donde no se adicionó glutaraldehído. La ilustración de la mano derecha de cada panel muestra células seleccionadas del material analizado en la ilustración de la mano izquierda, visualizada en un aumento más alto. Figura 5. Distribución en la superficie de Betvl reticulado a células de Lactobacill us utilizando glutaraldehído . El panel A y el panel B muestran fotografías de células en el material de pelotilla preparado como es descrito en el Ejemplo 12. El panel A muestra células derivadas de una reacción de reticulación en la cual la proteína Betvl estuvo presente; mientras que B muestra células derivadas de una reacción de control negativo en el cual se omitió la proteína Betvl . La detección de la proteína Betvl se realizó utilizando un ' anti-Betvl primario de conejo y un anticuerpo anti-conejo marcado con Cy-3 secundario como es descrito en el Ejemplo 12. Las fotografías de la izquierda son imágenes de contraste de fase, y las fotografías a la derecha son imágenes fluorescentes (los límites del filtro
para la luz de excitación y emisión fueron 545-575 nm y 610-680 nm respectivamente) de las mismas células utilizando ajustes idénticos de tanto el microscopio como la cámara. Figura 6. Proliferación de célula del bazo después del tratamiento con SLIT, inmunización y la re-estimulación in vi tro subsecuente. Cuatro grupos de ratones recibieron una vez al día durante tres semanas lo siguiente: BetV-LB: conjugados de vacuna que contienen BetVl acoplado a X37 a L . acidophilus; Lb: X37 L a cidophilus no tratado; BetVl 2.5 µg : proteína BetVl purificada a 2.5 µg por día; BetVl 5 µg : proteína BetVl purificada a 5µg por día, solución reguladora: grupo de control negativo que recibe la solución reguladora. Figura 7. Estimulación de células dendítricas in vi tro utilizando lactobacillus no tratado, - lactobacillus conjugado con Lacs o proteína LacS sola. LX37: X37 . acidophil us no tratado; LX37+lacS+glut : B-galactosidasa acoplada a la superficie a lactobacillus utilizando glutaraldehído; LacS: Proteína LacS sola. II. Definición de los términos Alérgeno: Son antígenos que inducen una reacción de hipersensibilidad o alérgica. Antígeno: Cualquier sustancia proteinácea capaz de inducir una respuesta inmune. Variante de antígeno: Cualquier antígeno, donde la composición de aminoácido se ha cambiado del antígeno
natural . API: Ingrediente (s) farmacéutico (s) activo (s) del reticulador: un reactivo químico que contiene dos grupos reactivos para de esta manera proporcionar los medios para enlazar covalentemente dos grupos objetivo. En los reticuladores homo-bifuncionales, los grupos reactivos son idénticos formando un enlace covalente entre grupos similares. En los reticuladores hetero-bifuncionales, los grupos reactivos tienen química distinta permitiendo la formación de reticulación entre grupos funcionales distintos. El reticulador bifuncional heterólogo se define como un reactivo químico que tiene un origen diferente de (es decir, no es nativo) a la célula a la cual es enlazado. DC: Célula dendrítica FDA: Administración de alimentos y fármacos GM: genéticamente modificado GMO: organismo genéticamente modificado GLA: glutaraldehído Compuesto proteináceo heterólogo se define como un compuesto que contiene proteína que tiene un origen diferente de (es decir, no es nativo a) la célula a la cual se enlaza la superficie o reticulada por un enlace covalente o no covalente . Solución reguladora M9: Solución acuosa que comprende Na2HP04 0.6%, KH2P04 0.3%, NaCl 0.5%, MgS04 0.025%.
MRS: Medio adecuado para el cultivo de Lactobacillus ONPG: Orto-Nitrofeni1-ß-D-Galactopiranósido PCR: reacción en cadena de polimerasa Espaciador: Una molécula con múltiples grupos reactivos que aumentan la reacción de reticulación. Utilizado como un puente entre la superficie de las células y la proteína objetivo. Proteína objetivo: El compuesto proteináceo (que es) exhibido sobre la superficie de la célula bacteriana Molécula de ácido nucleico transgénico: una molécula de ácido nucleico que se introduce y se integra establemente en el genoma (que comprende tanto plásmido, DNA episomal y cromosomal) de un organismo hospedero, en donde el DNA comprende una secuencia de codificación de proteína, y en donde la molécula de ácido nucleico transgénica no se encuentra en el organismo hospedero en la naturaleza, pero se introduce en la célula hospedera por medio de técnicas de modificación genéticas Temperatura ambiente: Entre 15-25°C de preferencia
18°C. III Descripción Detallada La presente invención proporciona un vehículo biológico caracterizado por la exhibición en la superficie de uno o más compuestos proteináceos, cuyas propiedades tienen
aplicación particular en las áreas de suministro de vacuna, bioabsorbentes de célula completa, biofiltros, microbiocatalizadores y herramientas de diagnóstico. La invención se dirige en el reconocimiento de que una vacuna terapéuticamente efectiva, segura y públicamente aceptable debe comprender los siguientes componentes y propiedades: a) un vehículo no patogénico biológico, de preferencia capaz de localizar y unir temporalmente a las células inmunocompetentes en la mucosa de un animal o humano (paciente) , b) en donde el vehículo proporciona exhibición en la superficie de uno o más antígenos heterólogos, capaz de la presentación a las células inmunocompetentes que conducen a una respuesta inmune específica y c) es capaz de estimular - como un adyuvante o modulador inmune - las células inmunes y de esta manera el sistema inmune completo y de preferencia inducir las células hospederas del paciente para secretar las citoquinas deseadas y d) en donde la vacuna, que comprende un vehículo con uno o más antígenos heterólogos exhibidos en la superficie, es barata y simple de producir, y evita la necesidad de sintetizar
enlazadores complejos, por ejemplo, precursores de mureína de la pared bacteriana. Una bacteria no patogénica proporciona las propiedades de a) y e), mediante lo cual las proteínas específicas localizadas sobre la superficie de estas bacterias le permiten localizar y unir a las células objetivo en la mucosa, y mediante el llamado cruzado de bacteria-célula iniciar varias respuestas por ejemplo producción de citoquina y mucina (Christensen H. R. y colaboradores. 2002, J Immunology 168 : 171-8, Mack D.R. y colaboradores. 2003 Gut 52 : 827-33) . La localización de células bacterianas a la mucosa se puede mediar mediante el enlace sensible a mañosa a las células mamíferas como es descrito por Adlerberth I. y colaboradores, 1996 Appl Environ Microbiol 1_: 2244-51. Por consiguiente, la presente invención emplea cepas bacterianas no patogénicas cuyos componentes en la superficie están todavía presentes, y pueden de esta manera soportar la presentación efectiva de antígenos localizados en la superficie. La presente invención satisface los requerimientos de b) al proporcionar una célula bacteriana no patogénica a la cual uno o más compuestos proteináceos heterólogos son enlazados en la superficie. El compuesto heterólogo puede ser enlazado por afinidad o adsorbido a la superficie de la célula bacteriana o covalentemente enlazado empleado o un agente de acoplamiento. Los compuestos
proteináceos aislados de fuentes naturales o sintetizados químicamente o producidos utilizando la tecnología de DNA recombinante se pueden acoplar a la superficie de la bacteria de la invención. El compuesto proteináceo heterólogo que es enlazado y exhibido sobre la superficie de la bacteria de la invención no es limitado a un compuesto que puede ser sintetizado y secretado por la célula bacteriana misma. El compuesto proteináceo heterólogo puede comprender una modificación post-traduccional cuya síntesis depende de etapas catalíticas no encontradas en la bacteria de la invención. En la presente se dirige a una de las ventajas significantes de la invención, en que el compuesto proteináceo heterólogo exhibido sobre la superficie bacteriana puede ser un compuesto cuya composición y estructura puede ser ajustada para un uso específico, sin ser limitado a un compuesto que se dirige dentro de la capacidad biosintética de la célula bacteriana sobre la cual es exhibido. El método de la invención puede proporcionar una exhibición de superficie densamente empacada de un compuesto(s) proteináceo (s) , que sirve para aumentar sus propiedades inmunogénicas durante la presentación de antígeno. Puesto que la cantidad del compuesto proteináceo enlazado a la superficie en una muestra bacteriana dada de la invención puede ser determinada con precisión, este facilita el control preciso de la dosis de antígeno como una
preparación terapéutica, que es otra ventaja significante de la invención. En contraste a las tecnologías conocidas, basada en la exhibición de la superficie de proteínas antigénicas heterólogas por las bacterias GM, la cepa bacteriana no patogénica en una modalidad de la presente invención es no clasificada como genéticamente modificada puesto que los compuestos proteináceos exhibidos en la superficie heterólogos no son recombinantemente expresados por las células mismas. En una modalidad alternativa la cepa bacteriana no patogénica, a la cual uno o más compuestos proteináceos heterólogos son enlazados es por sí misma genéticamente modificada. Una cepa bacteriana no patogénica adecuada para practicar la presente invención incluye una cepa bacteriana Gram-positiva, de preferencia seleccionada de una especie del grupo de géneros bacterianos que consiste de Lactococcus , Lactobacillus , Leuconostoc, Streptococcus de Grupo N, En terococcus , Bifidobacteri um, Staphylococcus no patogénico, Bacill us no patogénico. Más de preferencia la cepa bacteriana no patogénica se selecciona de una especie seleccionada del grupo de género bacterianos que consiste de Lactococcus , Lactobacill us , Leuconostoc, Streptococcus del Grupo N, Enterococcus , Bifidobacteri um , Staphylococcus no patogénico. Aun más de preferencia las cepas bacterianas no patogénicas
se seleccionan de una especie seleccionada del grupo de géneros bacterianos que consiste de Lactobacillus y Bifidobacteri um . Más específicamente la cepa bacteriana no patogénica preferida se selecciona de una especie seleccionada del grupo de especies bacterianas que consiste de: Lactobacillus acetotolerans , Lactobacillus acidipiscis , Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus agilis,
Lactobacillus algidus , Lactobacillus alimentarius ,
Lactobacillus amylolyticus , Lactobacillus amylophilus , Lactobacillus amylovorus , Lactobacillus animalis ,
Lactobacillus arizonensis , Lactobacillus aviarius ,
Lactobacillus bi fermentans , Lactobacillus brevis,
Lactobacillus buchneri , Lactobacillus casei , Lactobacillus coelohominis , Lactobacillus collinoides , Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis , Lactobacillus coryniformis subsp. torquens , Lactobacillus crispa tus, Lactobacillus c?rva tus , Lactobacillus cypricasei , Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus , Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii , Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus durianus , Lactobacillus equi , Lactobacillus farciminis , Lactobacillus ferintoshensis , Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis , Lactobacillus fructivorans , Lactobacillus frumenti , Lactobacillus fuchuensis , Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri , Lactobacillus graminis, Lactobacillus hamsteri , Lactobacillus
helveticus , Lactobacillus helveticus subsp . j ugurti ,
Lactobacillus heterohiochii , Lactobacillus hilgardii ,
Lactobacillus homohiochii , Lactobacillus intestinalis ,
Lactobacillus japonicus , Lactobacillus jensenii , Lactobacillus johnsonii , Lactobacillus kefiri , Lactobacillus kímchií , Lactobacillus kunkeei , Lactobacillus leichmannii , Lactobacillus letivazi , Lactobacillus lindneri , Lactobacillus malefermentans , Lactobacillus mail , Lactobacillus mal taromicus , Lactobacillus manihotivorans , Lactobacillus mindensis , Lactobacillus mucosae , Lactobacillus murinus , Lactobacillus nagelii , Lactobacillus oris , Lactobacillus pañis , Lactobacillus pantheri , Lactobacillus parabuchneri , Lactobacillus paracasei subsp . paracasei , Lactobacillus paracasei subsp . pseudoplantarum, Lactobacillus paracasei subsp. tolerans , Lactobacillus parakefiri , Lactobacillus paralimentarius , Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus , Lactobacillus perolens , Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis , Lactobacillus psi ttaci , Lactobacillus reuteri , Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus ruminís, Lactobacillus sakei , Lactobacillus salivarius , Lactobacillus salivarius subsp . salicinius , Lactobacillus salivarius subsp. salivarius , Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus suebicus , Lactobacillus thermophilus , Lactobacillus thermotolerans , Lactobacillus vaccinostercus , Lactobacillus vaginalis , Lactobacillus versmoldensis ,
Lactobacillus vitulínus , Lactobacillus vermiforme, Lactobacillus zeae, Bifidobacterium adolescentis , Bif i doba cterium aerophilum, Bifidobacterium angulatum, Bif i doba cterium animalis , Bifidobacterium asteroides , Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium boum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium coryneforme, Bifidobacterium cuniculi , Bifidobacterium dentium, Bifidobacterium gal.licum, Bifidobacterium gallinarum, Bifidobacterium indicum, Bifidobacterium longum,
Bifidobacterium longum subsp. longum, Bifidobacterium longum subsp. infantis, Bifidobacterium longum subsp. suis, Bifidobacterium magnum, Bifidobacterium merycicum,
Bifidobacterium mínimum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum, Bifidobacterium pseudolongum subsp. pseudolongum, Bifidobacterium psychroaerophilum,
Bifidobacterium pullorum, Bifidobacterium ruminantium,
Bifidobacterium saeculare, Bifidobacterium scardovii, Bifidobacterium subtile, Bifidobacterium thermoacidophilum, Bifidobacterium thermoacidophilum subsp. suis,
Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium urinalis . El uno o más compuestos proteináceos enlazados y exhibidos sobre la superficie de la bacteria no patogénica se pueden seleccionar de una amplia variedad de compuestos,
donde la proteína puede además comprender un carbohidrato, lípido u otras modificaciones post-traduccionalmente adicionadas. De preferencia el compuesto es una proteína o péptido sustituido, que significa modificar post-traduccionalmente como es sustituido, en donde el compuesto es capaz de inducir el desarrollo de una respuesta humoral o celular en animales o humanos por ejemplo, antígeno, alérgeno, alergoide, péptido, proteína, hapteno, glicoproteína, ácido nucleico de péptido (PNAs, una clase de imitación genética sintética) y material viral o bacteriano así como análogos o derivados de los mismos. Tal modificación se puede hacer mediante la modificación química o la modificación sintética, por ejemplo mediante la PEGilación
(PEG = polietilenglicol) biotinilación, desaminación, maleinación, sustitución de uno o más aminoácidos, mediante reticulación, mediante glicosilación o mediante otra tecnología recombinante o sintética. El término también se propone para incluir mutaciones que ocurren naturalmente, isoformas y análogos retroinversos . Más de preferencia el compuesto es capaz de inducir el desarrollo de anticuerpos específicos y/o una respuesta de célula T específica en animales o humanos. Alternativamente el compuesto es capaz de inducir el desarrollo de una respuesta de célula T citotóxica en animales o humanos, o el compuesto es capaz de inducir el desarrollo de una respuesta alérgica. Además el compuesto
puede ser capaz de reaccionar con anticuerpos pre-existentes
0 células T, o es un compuesto al enlazar al anticuerpo IgE sobre células cebadas o mediar una respuesta alérgica al tipo
1 en un mamífero previamente sensibilizado. En una modalidad preferida el compuesto proteináceo es capaz de inducir el desarrollo de inmunidad contra uno o más agentes infecciosos o alérgenos en un animal o un humano. Alternativamente, el compuesto proteináceo es capaz de inducir el desarrollo de inmunidad contra enfermedades autoinmunes en animales o humanos. En una modalidad adicional el compuesto proteináceo o variantes del mismo es uno que opera como antígenos de cáncer en animales o humanos. El compuesto proteináceo que induce el desarrollo de inmunidad en un animal o humano puede originarse de, o ser una variante del mismo, de una o más de las siguientes fuentes: bacterias, virus, hongos, protozoarios y priones por ejemplo seleccionado del siguiente grupo: Fuentes de antígeno Poxviridae, Herpesvirídae , Adenoviridae, Parvoviridae , Papovaviridae , Hepadnaviridae , Picornaviridae , Caliciviridae, Reoviridae, Togaviridae, Flaviviridae,
Arenaviridae , Retroviridae, Bunyaviridae , Orthomyxoviridae , Paramyxoviridae , Rhabdoviridae , Arboviruses , Oncoviruses , virus no clasificado por ejemplo virus de Hepa ti tis seleccionados, Astrovirus y Torovirus , Bacill us ,
Mycoba cteri um , Plasmodi um, Priones (por ejemplo, que causan la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob o variantes) , Cholera , Shigella , Escherichia , Salmonella , Corynebacterium, Borrelia , Haemophilus , Onchocerca , Bordetella , Pneumococcus , Schistosoma , Clostridium, Chlamydia , Streptococcus,
Staphylococcus , Campylobacter, Legionella , Toxoplasmose , Listeria , Vibrio, Nocardia , Clostridium , Neisseria , Candida , Trichomonas , Gardnerella , Treponema , Haemophilus , Klebsiella , Enterobacter, Proteus, Pseudomonas , Serra tia , Leptospira , Epidermophyton , Microsporum, Trichophyton , Acremonium,
Aspergillus , Candida , Fusarium, Scopulariopsís , Onychocola , Scytalidium, Histoplasma , Cryptococcus, Blastomyces ,
Coccidioides , Paracoccidioides Zygomycetes , Sporothrix, Bordetella , Brucella , Pasteurella , Rickettsia , Bartonella , Yersinia , Giardia , Rhodococcus , Yersinia y Toxoplasma . El compuesto proteináceo para el tratamiento o alivio de alergia o la vacunación para alergia terapéutica o profiláctica puede originarse de una o más de las siguientes fuentes : Fuentes de alérgeno El término "alérgeno" se refiere a cualquier proteína que ocurre naturalmente o mezclas de proteínas que se han reportado que inducen reacciones alérgicas, es decir mediadas por IgE en su exposición repetida a un individuo. Los alérgenos, para el propósito de la presente invención se
pueden derivar de plantas, mascotas, animales de granja, insectos, arácnidos y alimentos, incluyendo polen de abedul y árboles taxonómicamente relacionados, árboles de cedro Japonés, árboles de olivo, ambrosia, malas hierbas o hierbas, insectos picadores, mosquitos/jejenes, cucarachas, ácaros de polvo, hongos de interiores, moho de exteriores, ganado vacuno, gatos, perros, caballos, roedores, cacahuates, nueces, frutas, leche, soya, trigo, huevo, pescado y molusco. En particular, los alérgenos adecuadamente pueden ser un alérgeno de inhalación que se origina, es decir, de árboles, prados, hierbas, hongos, ácaros de polvo casero, ácaros de almacenamiento, cucarachas y pelo de animal y caspa. Los alérgenos de polen importantes de árboles, prados y hierbas son tales que se originan de los órdenes taxonómicos de Fágales , Oléales y Piñales que incluyen es decir abedul (Betula) , aliso (Alnus) , avellano (Corylus) , carpe (Carpinus) y olivo (Olea) , el orden de Poales incluye, es decir, pastos de los géneros Lolium , Phieum , Poa , Cynodon , Dactylis y Sécale, los órdenes de Asterales y Rosales, Urticales que incluyen es decir hierbas de los géneros Ambrosia , Artemisia y Parietaria . Los alérgenos de inhalación importante de hongo son es decir tales que se originan de los géneros Al ternaria y Cladosporium . Otros alérgenos de inhalación importantes son aquellos de ácaros de polvo casero del género Derma tophagoides y ácaros de almacenamiento del género
Blonia , Euroglyphus y Lepidoglyphus, aquellos de cucarachas y aquellos de mamíferos tales como gato, perro, caballo y roedores tales como ratones, ratas, conejillos de indias y conejos. Además, los alérgenos recombinantes de acuerdo con la invención pueden ser alérgenos de veneno que incluyen tales que se originan de insectos picadores o chupadores tales como aquellos del orden de Hymenoptera que incluyen abejas (superfamilia Apidae) , avispas (superfamilia Vespidea) , y hormigas (superfamilia Formicoidae) . Los componentes de alérgenos específicos incluyen, por ejemplo, Bet v 1 ( B . verrucosa , abedul), Aln g 1 (Alnus gl utinosa , aliso), Cor a 1 ( Corylus avelana , avellano) y Car b 1 ( Carpinus betul us , carpe) y el orden de Fágales. Otros son Cry j 1 ( Piñales) , Amb a 1 y 2, Art v 1 ( Asterales) , Par j 1 ( Urticales) , Ole e 1 ( Oléales) , Ave e 1 , Cyn d 1 , Dac g
1 , Fes p 1, Hol I 1, Lol p 1 y 5, Pas n 1 , Phl p 1 y 5, Poa p 1, 2 y 5, Sec c 1 y 5, y Sor h 1 (varios polens de pastos),
Alt a 1 y Cía h 1 (hongo), Der f 1 y 2, Der p 1 y 2, Der m 1
(ácaros de polvo casero, D. farinae, D. pteronyssinus y D. microceras, respectivamente), Lep d 1 y 2 y Bio t 1 y 2, Eur m 1 y 2, Gly d 1 y 2 (Lepidoglyphus destructor; Blomia Tropicalis y Glyphagus domesticus ácaros de almacenamiento y Euroglyphus maynei), Bla g 1 y 2, Per a 1 (cucarachas, Blatella germánica y Periplaneta americana, respectivamente) , Fel d 1 (gato), Can f 1 (perro), Equ c 1, 2 y 3 (caballo),
Apis m 1 y 2 (abeja de miel), Ves v 1, 2 y 5, Pol a l, 2 y 5 (todo de avispas) y Sol i 1, 2, 3 y 4 (hormiga roja) . El alérgeno puede estar en una forma de extracto de alérgeno, como un alérgeno purificado aislado y variante o fragmentos del mismo. El alérgeno también se puede obtener en virtud de la tecnología de expresión génica recombinante es decir un alérgeno recombinante y variantes o fragmentos del mismo, o un mutante y fragmentos del mismo. Por ejemplo, el alérgeno recombinante puede ser Betvl , Fel d 1, Phl p 1 o 5, Lol p 1 o 5, Sor h 1, Cyn d 1, Dag g 1 y 5, Der f o p 1 o 2, Amb a 1 y 2, Cry j 1 y 2, Ves v 1, 2 y 5 o Dol ml, 2 y 5, Api í o Bla g 1 y 2 de cucaracha, Per al recombinantes. El mutante de Bet v 1 cuya composición va a ser modificada, y los aminoácidos en Betvl son potencialmente adecuados para la sustitución comprenden aminoácidos que son descritos en por ejemplo, WO99/47680, WO02040676, WO03/096869. La expresión "extracto de alérgeno" como se utiliza en la misma se refiere a un extracto obtenido mediante la extracción de un material de fuente alérgeno biológico como es generalmente descrito en "Allergenic extracts", H. Ipsen y colaboradores, capítulo 20 in Allergy, principie y practise
(Ed. S. Manning) 1993, Mosby-Year Book, St. Louis. Tal extracto se puede obtener mediante la extracción acuosa del material soluble en agua seguido por etapas de purificación similares a filtración para obtener la solución, es decir el
extracto. El extracto luego se puede someter a la purificación adicional y/o procesamiento similar al secado por congelación que remueve sustancialmente toda el agua. Generalmente, un extracto de alérgeno comprende una mezcla de proteínas y otras moléculas. Las proteínas de alérgeno son frecuentemente clasificadas, un alérgeno mayor, un alérgeno intermediario, un alérgeno menor o ninguna clasificación. Un extracto de alérgeno generalmente comprende alérgenos tanto mayores y menores. Los alérgenos mayores generalmente constituyen aproximadamente 5-15% de un extracto de alérgeno promedio, de manera más frecuente aproximadamente 10%. Las cantidades de extracto de alérgeno referidas en la presente se refieren al contenido de materia seca de tales extractos de alérgeno. De preferencia el contenido de agua de la materia seca no excede 10%, más de preferencia 5% en peso. Los materiales de fuente de alérgeno biológico pueden comprender materiales contaminantes, tal como polen extraño y planta y restos celulares de flores para un material de fuente de polen de alérgeno. El grado de contaminación debe ser minimizado. De preferencia, el contenido de contaminantes no debe exceder 10% (P/P) del material de fuente biológica. Normalmente un extracto de alérgeno contiene por lo menos 10% de proteína del contenido de materia seca del
extracto de alérgeno como es determinado en un ensayo de proteína estándar tal como BCA o Lowry y el resto consiste de otro "material no de proteína", que pueden ser componentes tales como lípidos, carbohidratos o agua enlazada que se origina de la fuente de alérgeno biológica. Un extracto de alérgeno se puede formular y almacenar en la forma de un material secado por congelación obtenido al secar por congelación un extracto de alérgeno líquido a una presión de por abajo de 800 micro bar y durante un período de hasta 100 horas que remueve el agua. En el campo de extractos de alergia, no hay método de estandarización aceptado internacional. Un número de diferentes unidades de concentración de extracto, es decir bio-potencia existen. Los métodos empleados y las unidades utilizadas normalmente miden el contenido de alérgeno y la actividad biológica. Ejemplos de los mismos son Unidades SQ
(unidades de Calidad Estandarizadas) , BAU (Unidades de
Alérgeno Biológico) , BU (unidades biológicas) , UM (Unidades de Masa), IU (Unidades Internacionales) e IR (índice de Reactividad) . Por consiguiente si los extractos de orígenes diferentes de aquellos divulgados en la presente son utilizados, ellos necesitan ser estandarizados contra el extracto divulgado en la presente con el fin de determinar su potencia en unidades SQ o cualquiera de las unidades mencionadas en lo anterior. La materia sujeto se relaciona
con. "Allergenic extracts", H. Ipsen y colaboradores, chapter 20 in Allergy, principie y practise (Ed. S. Manning) 1993, Mosby- Year Book, St. Louis y L wenstein H. (1980) Arb Paul Ehrlich Inst 75:122. La bio-potencia, es decir, la actividad alergénica in vivo, del extracto dado depende de un número de factores el más importante que es el contenido de alérgeno mayor en el extracto, que varía con la composición del material de fuente biológico. La cantidad de extracto de alérgeno en gramos a ser utilizada para obtener una bio-potencia deseada varía con el tipo de extracto en cuestión, y para un tipo dado de extracto la cantidad de extracto alérgeno varía de un lote a otro con la bio-potencia actual del extracto. Para un lote dado del extracto, la cantidad del extracto de alérgeno en gramos a ser utilizada para obtener una bio-potencia deseada se puede determinar utilizando el siguiente procedimiento: a) La bio-potencia de varias cantidades de un extracto de referencia se determina utilizando una o más pruebas in vivo inmunológicas para establecer una relación entre la bio-potencia y la cantidad del extracto de referencia. Ejemplos de las pruebas . in vivo inmunológicas son la Prueba de Pinchazo de la Piel (SPT) , Prueba de Provocación Conjuntival (CPT) , Estimulación Bronquial con Alérgeno (BCA) y varios experimentos clínicos en los cuales uno o más síntomas de
alergia son monitoreados, ver por ejemplo Haugaard y colaboradores., J Allergy Clin Immunol, Vol. 91, No. 3, pp 709-722, Marzo 1993. b) En la base de la relación establecida entre la bio-potencia y el extracto de referencia, la bio-potencia de una o más dosis relevantes para el uso en las formas de dosificación de la invención se selecciona con consideración de vida a un balance de los factores de i) el efecto de tratar o aliviar los síntomas de la alergia, ii) efectos secundarios registrados en las pruebas in vivo inmunológicas y iii) la variabilidad de i) y ii) de un individuo a otro. El balance se hace para obtener un efecto terapéutico adecuado máximo sin experimentar un nivel inaceptable de efecto secundario. La manera de balancear los factores son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. La bio-potencia de las una o más dosis relevantes encontradas se puede expresar en cualquier unidad de bio-potencia disponible, tales como unidades SQ, BAU, unidades IR, IU, ver lo anterior. c) A partir del extracto de referencia uno o más extractos estándares de referencia de bio-potencia se prepara y, si se utiliza, los valores de unidad de bio-potencia de los extractos estándares de referencia se calculan en la base del valor de unidad de bio-potencia asignado a la una o más dosis relevantes, por ejemplo, tal estándar para BAU se puede
obtener a partir de FDA como se ilustra enseguida. d) Para los extractos estándares de referencia de cada tipo de extracto, un número de parámetros para evaluar la bio-potencia de extractos son seleccionados. Ejemplos de tales parámetros de evaluación son actividad alergénica total, la cantidad de alérgenos mayores definidos y la composición molecular total del extracto. La actividad alergénica total se puede medir utilizando un inmunoensayo competitivo in vitro, tal como ELISA y el inmunoensayo de luminiscencia MagicLite® (LIA) , utilizando una mezcla de anticuerpo estandarizada resaltada contra el extracto obtenido utilizando métodos estándares, por ejemplo anticuerpos resaltados en ratón o conejo, o una acumulación de sueros de pacientes alérgicos. El contenido de alérgenos mayores puede ser, por ejemplo, cuantificado mediante la inmuno-electroforesis de rocket (RÍE) y comparado con los estándares de referencia. La composición molecular total se puede examinar utilizando, por ejemplo la inmuelectroforesis cruzada (CIÉ) y la electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) . e) Para un lote dado de extracto de bio-potencia desconocida (extracto de prueba) , la cantidad de extracto a ser utilizada para obtener un nivel de bio-potencia deseado (dosis efectiva para el uso en la forma de dosificación sólida de acuerdo con la presente invención) se puede determinar como sigue: Para
cada parámetro de evaluación seleccionado, el extracto de prueba se compara con los extractos estándares de referencia utilizando los métodos de medición relevantes como son descritos en lo anterior, y la base de los resultados de medición de la cantidad de extracto que tiene la bio-potencia deseada es calculada. Una dosis efectiva de un alérgeno para el tratamiento de alergia o vacunación para alergia terapéutica o profiláctica significará una dosis que cuando se toma una vez repetidamente en una monodosis o en dosis incrementadas da por resultado, por ejemplo una respuesta inmune adaptiva y de esta manera sirve como el medio para desensibilizar pacientes alérgicos. De preferencia, el término significará la cantidad de alérgeno en cada forma de dosificación necesaria para inducir una respuesta inmune adaptiva después de la administración repetida de las formas de dosificación sólidas de acuerdo con un régimen de tratamiento (durante un período que varía de unas cuantas aplicaciones a por lo menos una aplicación al día durante varios meses) . De preferencia, la desensibilización incluye el alivio de síntomas alérgicos en la administración de la dosis. Los síntomas de alergia clínicos incluyen rinitis, conjuntivitis, asma, urticaria, eczema, que incluye reacciones en la piel, ojos, nariz, vías aéreas superiores e inferiores con síntomas comunes tal como enrojecimiento y picazón de los ojos y nariz, nauseas, dolor
de mandíbula, deficiencia de respiración, picazón e hinchamiento del tejido. En una modalidad a la dosis de un alérgeno puede ser un contenido de extracto de alérgeno de aproximadamente 0.15 µg - 10 mg/dosis, más preferido un contenido de extracto de alérgeno de aproximadamente 0.5 µg - 5 mg/dosis, más de preferencia un contenido de extracto de alérgeno de aproximadamente 0.5 µg - 3.75 mg/dosis, más de preferencia un contenido de extracto de alérgeno de aproximadamente 2.5 µg -3.75 mg/dosis, más de preferencia un contenido de extracto de alérgeno de aproximadamente 2.5 µg - 2.5 mg/dosis, más de preferencia un contenido de extracto de alérgeno de aproximadamente 25 µg - 2.5 mg/dosis, más preferido aproximadamente 25 µg - 1.25 mg/dosis, aun más preferido aproximadamente 25 µg - 1 mg/dosis, mucho más preferida de aproximadamente 25 µg - 0.75 mg/dosis. En una modalidad adicional una dosis de alérgeno tiene un solo contenido de alérgeno de aproximadamente 0.015 µg - 1 mg/dosis, más preferido de aproximadamente 0.05 µg -500 µg/dosis, más de preferencia de aproximadamente 0.05 µg -375 µg/dosis, más de preferencia de aproximadamente 0.25 µg -375 µg/dosis, más de preferencia de aproximadamente 0.25 µg -250 µg/dosificación, más de preferencia de aproximadamente 2.5 µg - 250 µg/dosis, más preferido aproximadamente 2.5 µg -125 µg/dosis, aun más preferido aproximadamente 2.5 µg - 100
µg/dosis, mucho más preferible aproximadamente 2.5 µg - 75 µg/dosis . En una modalidad adicional, la dosis de alérgeno tiene un solo contenido de alérgeno de aproximadamente 0.015 µg - 1 mg/forma de dosificación, más preferido de aproximadamente 0.05 µg - 500 µg/forma de dosificación, más de preferencia de aproximadamente 0.05 µg - 375 µg/forma de dosificación, más de preferencia de aproximadamente 0.25 µg -375 µg/forma de dosificación, más de preferencia de aproximadamente 0.25 µg - 250 µg/forma de dosificación, más de preferencia de aproximadamente 2.5 µg - 250 µg/forma de dosificación, más preferido aproximadamente 2.5 µg - 125 µg/forma de dosificación, aun más preferida aproximadamente 2.5 µg - 100 µg/forma de dosificación, mucho más preferible aproximadamente 2.5 µg - 75 µg/forma de dosificación. Acoplamiento de superficie de proteína al vehículo biológico de la invención El uno o más compuestos proteináceos se enlazan a la superficie de la bacteria no patogénica ya sea por enlaces no covalentes o covalentes. La invención además divulga un método para enlazar el uno o más compuestos proteináceos a una célula bacteriana no patogénica empleando un agente de reticulación químico, capaz de unir dos o más moléculas conjuntamente mediante un enlace covalente. En general, los reactivos de reticulación químicos contienen extremos
reactivos a grupos funcionales específicos más frecuentemente aminas o sulfhidrilos sobre proteínas u otras moléculas. Ejemplos de un agente de reticulación adecuado para realizar la presente invención incluyen glutaraldehído, poliazetidina y paraformaldehído. El uso del reticulador bifuncional glutaraldehído para la reticulación química de la proteína ß-galactosidasa a la superficie de célula de Lactobacillus plan tarum se describe en los Ejemplos 1, 2, 6 y 7. Alternativamente un enlace covalente entre el uno o más compuestos proteináceos y la superficie de la bacteria no patogénica es enzimáticamente catalizado empleando un agente catalítico seleccionado de transferasas por ejemplo transglutaminasa, (las enzimas que son clasificadas bajo el número de Clasificación de Enzima E.C.2 de acuerdo con las recomendaciones (1992) de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular), oxidoreductasas por ejemplo lacasa o peroxidasa de rábano picante (las enzimas que son clasificadas bajo el número de Clasificación de Enzima E.C.l), ligasas de péptido (las enzimas que son clasificadas bajo el número de Clasificación de Enzima E.C.6) o hidrolasas por ejemplo transpeptidasa, carboxipeptidasa o endopeptidasa
(las enzimas que son clasificadas bajo el número de
Clasificación de Enzima E.C.3). El uso de la transglutaminasa para el enlace covalente de la proteína ß-galactosidasa a la superficie de la célula de Lactobacillus plan tarum se
describe en el Ejemplo 5. Alternativamente, el uno o más compuestos proteináceos pueden ser enlazados no covalentemente a la superficie de la bacteria no patogénica mediante enlaces no específicos más débiles, como se ejemplifica en el Ejemplo 4. Las condiciones de reacción para la reticulación química o catalítica, o el enlace de uno o más compuestos proteináceos a la superficie de la bacteria no patogénica se pueden modular con el fin de variar el número de moléculas de compuesto proteináceo enlazado por célula, por ejemplo al variar la relación de célula y proteína que es acoplada, el pH, la concentración iónica de la solución reguladora, y la temperatura de la mezcla de reacción. Así, en una modalidad de la presente invención, la reacción de reticulación se realiza a baja temperatura, de preferencia a una temperatura por debajo de 0°C, más de preferencia entre -1°C y -20°C, por ejemplo -20°C, donde una baja temperatura se ha mostrado sorprendentemente que da por resultado un número más alto de moléculas proteináceas que son covalentemente enlazadas a la superficie de una célula bacteriana (ver los Ejemplos 9-12) . El número de moléculas del compuesto proteináceo enlazado también puede ser aumentado al incluir una molécula espaciadora en la mezcla de reacción, como se divulga en el Ejemplo 3 y 8. Una de las ventajas particulares de la presente invención se relaciona al número y densidad de
moléculas de compuesto proteináceo que se pueden enlazar y exhibir sobre la superficie ' de la célula bacteriana de la invención. Como se ilustra en los Ejemplos 1 y 3, las moléculas de compuesto proteináceo pueden ser reticuladas directamente a una entidad química sobre la superficie bacteriana o indirectamente a través de un espaciador multivalente, mediante lo cual el número de moléculas enlazadas no es limitado al número de moléculas de proteína nativa que una célula bacteriana puede tener unida a su superficie de la célula in vivo . El enlace mediante el cual el compuesto proteináceo heterólogo se reticula a la superficie de la célula bacteriana no patogénica de la invención, es un enlace covalente entre una entidad química accesible en la superficie de la célula bacteriana por una parte, un sustituyente terminal o interno del compuesto proteináceo por la otra parte. La reticulación entre el compuesto proteináceo heterólogo y la entidad accesible puede además comprender un enlazador bifuncional heterólogo, mediante lo cual el reticulador es un componente integrado del producto reticulado. La célula bacteriana de la invención tiene una superficie externa, que comprende una pared, que es químicamente accesible y a la cual el compuesto proteináceo heterólogo puede ser reticulado. Más específicamente, una entidad químicamente accesible en la superficie sobre la
célula bacteriana de la invención es un componente de la envoltura de célula bacteriana que comprende una pared celular o membrana de célula externa, en donde la entidad es directamente expuesta a los compuestos presentes en el medio ambiente externo de la célula. En una modalidad de la presente invención, en donde un compuesto proteináceo heterólogo es enlazado no covalentemente a la superficie de una célula bacteriana, el número de moléculas del compuesto enlazado por célula bacteriana es por lo menos 100. Preparación y prueba de una vacuna de la invenció : La presente invención proporciona un método para preparar una bacteria no patogénica con uno o más compuestos proteináceos enlazados a la superficie, que se puede emplear en la manufactura de una vacuna y además probar y terapéuticamente utilizar en un animal o un humano, como es ejemplificado en el Ejemplo 17. En la primera etapa, las bacterias no patogénicas con un compuesto proteináceo (por ejemplo antígeno) covalentemente enlazado a la superficie de la célula son manufacturadas por la tecnología de reticulación química como es descrito en los ejemplos, por ejemplo, Ejemplo 1 o 9. Alternativamente, los conjugados de bacterias y antigenos se manufacturan utilizando enzimas de reticulación como es descrito en el Ejemplo 5 o utilizando el enlace no específico como es descrito en el Ejemplo 4. Así, a
manera de ejemplo, las células bacterianas se producen con compuestos proteináceos enlazados a la superficie, donde los compuestos enlazados son antígenos específicos de la Micobacteri um tuberculosis patogénica humana o virus de influenza, o los antígenos de superficie del patógeno de animal E . coli . Las células bacterianas que tienen antígenos de E . coli enlazados a la superficie se utilizan en la manufactura de una vacuna veterinaria para el uso en el ganado porcino, en particular para prevenir o tratar la diarrea en cerditos . Las etapas en la manufactura de una vacuna que comprende células bacterianas con antígenos enlazados a la superficie específicos para uso en el tratamiento de afecciones causadas por Mycojbac eriu-n tuberculosis, influenza virus o E . coli veterinario son similares y se describen enseguida. 1. Selección de la cepa bacteriana no patogénica para la presentación del antígeno enlazado a la superficie Un número de cepas bacterianas, que se han descrito que colonizan transientemente el hospedero recipiente, son seleccionadas para el análisis adicional. Las cepas se analizan en el modelo de célula dendítrica in vitro como es descrito por Christensen H. R. y colaboradores. 2002, J Immunology 168 : 171-8, y en el Ejemplo 18. La cepa preferida es una que es caracterizada por la inducción de citoquinas inflamatorias que incluyen IL1, IL2, IL6, IL12, TNFa, y/o
TGFß. 2. Producción de antígeno de' la presentación enlazada a la superficie sobre bacterias no patogénicas. Un antígeno de M. Tuberculosis , por ejemplo ESAT6 (S0rensen A.L. y colaboradores. 1999 Infect Immun. 63 : 1710-17), se produce recombinantemente en La ctococcus lactis utilizando un sistema de expresión, por ejemplo el sistema de Expresión P170 (Madsen S. y colaboradores. 1999 Mol Microbiol. 3_2:75-87). El gen que codifica al antigeno se inserta en un vector de expresión, por ejemplo, pAMJ297, y se transforma en una cepa de L . la ctis, que subsecuentemente se cultiva en el medio de crecimiento de un fermentador como es descrito previamente (Madsen S. y colaboradores. 1999 supra ) . El antígeno se sintetiza y se secreta por las células de L . lactis transformadas durante la fermentación. El sobrenadante luego se separa del cultivo de células de L . lactis utilizando por ejemplo la filtración de flujo cruzado. El antígeno de M. Tuberculosis presente en el sobrenadante se purifica utilizando un método' de purificación de proteínas tradicionales, que incluyen por ejemplo la filtración en gel. El antígeno purificado se disuelve en una solución reguladora apropiada por ejemplo M9, como es descrito en el Ejemplo 1. Un antígeno de virus de influenza se produce ya sea por la expresión génica recombinante, o por la purificación de un antígeno del virus intacto que se ha cultivado en huevos como
es descrito en Tree J.A. y colaboradores. 2001 Vaccine 19 (25-26]_: 3444-50. 3. Producción de células bacterianas no patogénicas para el uso en la presentación de antígeno enlazado a la superficie sobre bacterias. La cepa seleccionada de la etapa 1, se cultiva en un medio de crecimiento, que es un medio complejo, por ejemplo MRS (Oxoid) en el caso de la preparación de una vacuna para la experimentación animal y el uso veterinario. Un medio de crecimiento, solamente basado sobre componentes sintéticos, se utilizan para el cultivo de la cepa cuando se prepara una vacuna para el uso humano, debido al riesgo de agentes infecciosos tales como virus y priones que pueden estar presentes en el medio de crecimiento de los componentes del medio de crecimiento de origen animal. Además, el medio de crecimiento de la cepa seleccionada es uno que cumple con las guías de seguridad para el uso humano terapéutico expedido por ejemplo por la FDA. Después del cultivo de un fermentador, las células bacterianas se separan del medio de crecimiento mediante, por ejemplo, la centrifugación en la filtración de flujo cruzado. Las células bacterianas se resuspenden en medio de crecimiento fresco o una solución reguladora apropiada tal como la solución reguladora M9. Estas células se pueden almacenar a -80°C por al menos un año, después de la adición de un volumen igual de glicerol en
autoclave al 50%. 4. Reacción de reticulación y Formulación Las bacterias producidas en la etapa 3, y el antígeno producido en la etapa 2, se enlazan en la superficie utilizando uno o más de los métodos descritos en los Ejemplos 1, 3-12. Las bacterias no patogénicas resultantes con antígenos enlazados en la superficie se evalúan en las siguientes pruebas: La cantidad de antígeno acoplada a la superficie a la(s) célula (s) bacteriana (s) se determina utilizando las técnicas de inmuno-detección, por ejemplo la prueba de ELISA que emplea anticuerpos marcados fluorescentemente específicos para el antígeno enlazado, o el análisis de manchado de Western de extractos de las células bacterianas que emplean anticuerpos específicos al antígeno enlazado. Además, la distribución de antígenos sobre la superficie bacteriana se analiza, utilizando algunos anticuerpos en un análisis basado en microscopio. Las células que contienen antígenos acoplados en la superficie se suspenden en una solución reguladora apropiada, por ejemplo, solución reguladora M9 y se almacenan en glicerol a -80°C como es descrito en la etapa 3. Las células se pueden utilizar per se . Sin embargo, la vacuna también puede ser encapsulada utilizando métodos novedosos bien conocidos. La encapsulación debe asegurar que la vacuna conserve las propiedades originales durante el almacenamiento
y durante el tránsito en ambientes hostiles tal como el jugo gástrico. Además, la encapsulación debe asegurar que la vacuna sea liberada en la localización de la mucosa deseada. Varios métodos de encapsulación son descritos y comercialmente disponibles tanto para preservar microorganismos vivos o muertos, ver, por ejemplo http://www.encapdrugdelivery.com (Encap Drug Delivery, UK) . 5. Prueba del Producto en un modelo animal La vacuna de prueba, que comprende bacterias con antígenos acoplados en la superficie preparadas y formuladas de acuerdo con la etapa 4, se dividen alícuotas que comprenden de aproximadamente 108 a aproximadamente 1011 células. Cuatro grupos de animales, cada uno que comprende 10 ratones, son vacunados con ya sea la vacuna de prueba o la vacuna de control, como sigue: dos grupos reciben la vacuna de prueba en diferentes dosis; un grupo recibe una vacuna de control que comprende las células bacterianas sin el antígeno acoplado a la superficie; y un grupo recibe el antígeno purificado. La vacuna se administra oralmente o nasalmente o mediante el tubo nasoyeyunal. El programa de vacuna es como sigue. La dosis se da en los días No.: 1, 2, 3, 14, 15, 16, 42, 43 y 44. Muestras de sangre y de mucosa se toman cada semana iniciando en el día No. 0, donde las primeras muestras de sangre y de mucosa constituyen los sueros pre-inmunes. Las muestras de sangre y de mucosa finales se toman en el día No.
63, y los ratones se sacrifican antes de la remoción del bazo y opcionalmente los nodos linfáticos. La sangre y la mucosa se analizan para los anticuerpos específicos de antígenos utilizando técnicas estándares, por ejemplo la técnica de ELISA. El bazo se analiza para la presencia de células T citotóxicas específicas de antígeno utilizando por ejemplo un ensayo de liberación de cromo. La vacuna de prueba útil de acuerdo con el experimento de vacunación animal anterior exhibe las siguientes propiedades. nada de anticuerpos específicos de antígeno detectables o respuesta de célula T citotóxica específica de antígeno en ratones tratados de una vacuna de control que comprende las células bacterianas de la invención sin antígeno acoplado a la superficie, y los niveles de anticuerpos específicos de antígeno y/o respuesta de célula T citotóxica específicas de antígeno en ratones tratados con la vacuna de prueba, en por lo menos en la dosis más alta, es más grande que los niveles detectados en los ratones tratados con antígeno purificado, donde la diferencia es estadísticamente significante . Aproximadamente una molécula de antígeno puede ser acoplada por célula al ajustar la concentración de antigeno. Una dosis que comprende una sola célula con una molécula de
antígeno acoplado a la superficie define el límite de dosis inferior. La optimización de las condiciones de reticulación (Ejemplo 13) se espera que de por resultado por lo menos 10,000 moléculas acopladas a la superficie por célula. Si la reacción de reticulación retícula una molécula de proteína objetivo por célula, entonces una dosis de 1012 células contendrá 83 ng de proteína objetivo reticulada. Por consiguiente, una reticulación química eficiente de acuerdo con la presente invención reticulará 10,000 moléculas de proteína objetivo por célula que proporciona aproximadamente 1 mg de proteína reticulada por dosis de 1012 células. El uso de un enlazador bifuncional o espaciador, más de preferencia una combinación de los mismos, permite un incremento adicional en el número de moléculas de la proteína objetivo que pueden ser enlazadas a una sola célula, a aproximadamente 100,000. El número de células en una sola dosis podría ser optimizado, para de esta manera incrementar la cantidad total de antígeno en una sola dosis. El número de células y el número de moléculas acopladas a la superficie define el límite de dosis superior. Formulación y administración de una vacuna de la invención: Una modalidad de la invención proporciona una composición farmacéutica para la manufactura de un medicamento que comprende un vehículo biológico que exhibe en la superficie una o más compuestos proteináceos heterólogos
que incluyen: a) células de una o más cepas bacterianas no patogénicas, y b) uno o más compuestos proteináceos enlazados por medio de un reticulador bifuncional a una entidad química accesible sobre la superficie de las células, en donde la célula no comprende una molécula de ácido nucleico transgénica que codifica el uno o más compuestos proteináceos, y el enlazador bifuncional es enlazado covalentemente a un grupo amino de la célula por la vía de una base de Schiff, y el compuesto proteináceo enlazador son heterólogos en origen a las células. Donde los compuestos proteináceos exhibidos en la superficie son antígenos y el vehículo biológico son bacterias que están vivas o muertas, la composición se puede utilizar per se como una vacuna para cualquier administración por la mucosa incluyendo la administración oromucosal, oral, nasal, sublingual, vaginal o anal . El término "administración oromucosal" se refiere a una ruta de administración donde la composición farmacéutica de la invención se coloca bajo la lengua o en cualquier otra parte en la cavidad oral para permitir que el ingrediente activo entre en contacto con la mucosa en la cavidad oral o la faringe del paciente con el fin de obtener un efecto local o sistémico del ingrediente activo. Un ejemplo de una ruta de administración oromucosal es la administración sublingual. El término "administración sublingual" se refiere a
una ruta de administración, donde una forma de dosificación se coloca por debajo de la lengua con el fin de obtener un efecto local o sistémico del ingrediente activo. Para este uso, la vacuna se formula ya sea como una solución o una sustancia cristalizada, secada o secada por congelación junto con materiales apropiados que conservan las propiedades originales de la vacuna y proporciona una vida en anaquel óptima. Sin embargo, la vacuna también puede ser encapsulada utilizando métodos novedosos bien conocidos. La encapsulación debe asegurar que la vacuna conserve las propiedades originales durante el almacenamiento durante el tránsito en medios ambientes hostiles tal como los jugos gástricos. Además, la encapsulación debe asegurar que la vacuna sea liberada en la localización de la mucosa deseada. Varios métodos de encapsulación son descritos y comercialmente disponibles tanto para conservar microorganismos vivos o muertos de por ejemplo, http: //www. encapdrugdelivery . com. La cantidad promedio de antígenos acoplados a la superficie de cada célula microbiana y el número de bacterias no patogénicas en cada dosis de vacunación se puede calcular de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 13. Además de la administración por la mucosa, la administración dérmica o subcutánea puede ser ventajosa para vacunar contra o tratar enfermedades seleccionadas. También la administración parenteral puede ser útil para la
vacunación contra o el tratamiento de enfermedades seleccionadas tales como cánceres. La presentación de la bacteria no patogénica que contiene antígenos acoplados a la superficie al tumor, células dendítricas u otras células mamíferas ex vivo puede ser útil antes del transplante o el re-transplante . La vacuna formulada se puede administrar en numerosas formas tales como fluidos, aerosoles, polvos, cristales y tabletas. La vacuna formulada también puede contener sustancias activas que ajustan la actividad de la vacuna o proporciona propiedades adicionales. Las sustancias activas podrían ser complejas o compuestos inmunomoduladores simples tales como interleucinas u otros ingredientes farmacéuticos activos (API). Los API's pueden ser uno o más fármacos novedosos o bien conocidos que ya sea que aumentan el efecto terapéutico de la vacuna o derivan propiedades útiles de la vacuna cuando se administran simultáneamente. Identificación de la cepa apropiada para ser un componente de cada vacuna específica y preanálisis de la vacuna de la invención : Una vacuna usualmente consiste de un adyuvante y los componentes de vacuna específicos. La función del adyuvante es estimular el sistema inmune y de esta manera aumentar los efectos del patógeno específico o antígenos. Una propiedad importante de las células microbianas en la vacuna
es que sirve como un adyuvante de la mucosa y/o como un componente complejo que dirige el sistema inmune a responder en una manera deseada además de responder al (los) antígeno (s) específico (s) . En algunos aspectos la respuesta inmune apropiada a una vacuna puede ser humoral mientras que en otros aspectos puede ser celular o una combinación de ambas. Además, la respuesta puede ser polarizada en la llamada respuesta Thl o Th2 o polarizadas hacia una respuesta inflamatoria o respuesta antiinflamatoria o inducir tolerancia. Al emplear la cepa apropiada la polarización inmune hacia la proteína enlazada puede ser controlada. El sistema inmune de la mucosa es parte del sistema inmune completo y, consecuentemente, respuestas inmunes a la mucosa son reflejadas en el cuerpo completo. Este consiste de una red integrada de tejidos, células linfoides y no linfoides y moléculas efectoras tales como anticuerpos y citoquinas. La interacción entre las células que presentan antígeno, linfocitos T y citoquinas es la clave para proporcionar la respuesta inmune específica correcta. El encuentro entre las células de los sistemas inmunes, y un agente de infección o antígeno, da por resultado la producción de interleucinas. Las interleucinas son moléculas mediadoras que instruyen al sistema inmune permanente en como comportarse hacia los agentes infecciosos o antígenos. Esencialmente, las interleucinas se dividen en dos clases que
dirigen ya sea una respuesta inmune proinflamatoria o antiinflamatoria. Sin embargo, un número de subclases debe estar presente puesto que más de 20 interleucinas son conocidas y cada respuesta a diferentes infecciones da por resultado niveles diferentes de cada interleucina. Métodos se han establecido ex vivo para analizar la respuesta inmune a varias bacterias (Christensen H. R. y colaboradores. 2002, J Immunology 168 : 171-8 ) . Los métodos están basados en células dendítricas (DCs) que son reconocidas como los moduladores claves del sistema inmune. Las DCs se desarrollan en células inmunocompetentes maduras cuando encuentran células foráneas o antígenos. Durante el encuentro, las DCs secretan citoquinas tanto para realizar una autoestimulación y para estimular otras células del sistema inmune. En los métodos ex vivo las citoquinas de las DCs se miden tanto cualitativamente y cuantitativamente después de la exposición a los microorganismos inactivados o vivos. Diferentes microorganismo se han probado utilizando tales métodos y los resultados muestran variación significante entre diferentes bacterias que incluyen la variación entre miembros del mismo género y aun de la misma especie. Por lo tanto, los métodos de DC son útiles para identificar candidatos bacterianos para una vacuna dada puesto que cantidades adecuadas son aquellas que dirigen la respuesta inmune deseada como es indicado por el perfil de
liberación de citoquina. Los candidatos también deben dirigir la respuesta inmune deseada mientras que presentan simultáneamente los antígenos específicos. Por consiguiente, los candidatos bacterianos con antígenos foráneos acoplados a la superficie de la célula también se pueden probar utilizando el método de DC, como se ilustra en el Ejemplo 18. En el futuro, métodos más sofisticados se esperan que sean desarrollados con el fin de mejorar la distinción entre las diferentes respuestas inmunes y para estrechamente imitar la situación in vivo. Tales métodos serán útiles para identificar más precisamente los candidatos correctos para vacunas específicas. Experimentos animales y aplicación de la vacuna de la invención para propósitos veterinarios : Una vacuna se puede diseñar y manufacturar al utilizar, por ejemplo, los métodos descritos en los ejemplos divulgados. La vacuna puede contener componentes que son útiles como una vacuna contra un patógeno por ejemplo seleccionado del grupo de agentes infecciosos y alérgenos listados bajo fuentes de Antígeno y fuente de Alérgeno respectivamente. Este también puede contener componentes que son útiles como una vacuna contra otras enfermedades por ejemplo seleccionadas del grupo de enfermedad infecciosa, cáncer, alergia y enfermedad autoinmune. La vacuna puede ser probada en animales
experimentales utilizando un método de formulación seleccionado de los ejemplos. Los animales de prueba pueden ser de cualquier especie de animal. La vacuna puede ser alimentada a los animales o mezclada con el agua de beber. La vacuna también se puede administrar vaginalmente o analmente o la vacuna se puede administrar directamente al intestino delgado a través de dispositivos que se desvían del estómago y el jugo gástrico por ejemplo al utilizar un tubo nasoyeyunal. La vacuna se puede administrar al rociar al animal directamente en la boca-nariz o la región de las branquias o simplemente rociar la vacuna en los establos de animales. La vacuna también puede ser adicionada al agua donde los peces y otros animales que están en el agua viven. La administración se puede realizar una vez o seguido hacia arriba regularmente para asegurar un refuerzo de vacunación y el mantenimiento de la memoria inmune. El experimento se puede realizar con la vacunación o el tratamiento con placebo antes y/o después de la estimulación con patógenos o inducción de una enfermedad que se asemeja a la enfermedad en cuestión. Los puntos de extremo del experimento pueden incluir, pero no están limitados al análisis del número de animales supervivientes y los animales sanos contra los animales muertos o enfermos. La severidad de la enfermedad entre los animales supervivientes también puede ser un parámetro importante. Las biopsias de los animales tratados y
los títulos de anticuerpo específicos también pueden indicar el efecto de la vacunación. Las células de las Biopsias también pueden ser probadas en inmunoensayos que incluyen respuestas específicas al (los) antígeno (s) en cuestión. Los experimentos de animales se pueden diseñar para identificar : la bacteria no patogénica correcta de un número de candidatos para el uso en la vacuna particular, - la dosis ideal de bacteria no patogénica con el número de promedio ideal de antígenos acoplados a la superficie, - la ruta óptima de administración, - sustancias que aumentan el efecto de la vacuna, y - la frecuencia de vacunación y el período de vacunación. Los resultados en experimentos en animales serán útiles para ajustar el régimen para vacunación de animales domésticos, mascotas, animales de granja, manadas, ganado vacuno o animales salvajes. Después en la presente, la vacuna será útil para propósitos veterinarios. En algunos aspectos, los resultados en animales pueden ser útiles para el diseño de experimentos de vacuna en humano. También, los experimentos en animales deben ser útiles para probar la vacuna humana en experimentos preclínicos . Experimentos en humanos y aplicación de la vacuna para propósitos humanos
Como se mencionó en el ejemplo previo, una vacuna se puede diseñar y manufacturar al utilizar, por ejemplo, los métodos descritos en lo anterior. La vacuna puede comprender componentes útiles como una vacuna contra un patógeno o cualquier alergia alistada bajo las fuentes de Alérgeno anterior. También puede contener componentes que son útiles como una vacuna contra cánceres o enfermedades autoinmunes u otra enfermedad seleccionada, por ejemplo del grupo listado bajo fuentes de antígeno interior. La vacuna puede ser probada en experimentos clínicos después de la terminación del experimento pre-clínicos como es descrito para una vacuna veterinaria. El método de la formulación puede ser seleccionado de cualquiera descrito en los ejemplos. Las personas sanas y/o enfermas pueden ser incluidas en el experimento clínico. La vacuna puede ser tomada como tableta (s), parte del alimento o como una bebida. La vacuna puede ser administrada sublingualmente o rociada en la región de la boca y la nariz. La vacuna también puede ser administrada vaginalmente o analmente o la vacuna puede ser administrada lentamente al intestino delgado a través de dispositivos que evitan el estómago y el jugo gástrico, por ejemplo al utilizar un tubo nasoyeyunal. La administración se puede realizar una vez o seguido regularmente para asegurar un refuerzo de vacunación y mantenimiento de la memoria inmune. La vacunación se puede realizar por la vacuna y/o
placebo y puede ser utilizando un procedimiento doble ciego aleatorizado. Los puntos de extremo del experimento pueden incluir pero no está limitado al análisis del número de supervivientes y las personas sanas contra las personas muertas o enfermas. La severidad de la enfermedad entre los supervivientes también puede ser un parámetro importante. Las biopsias de los sobrevivientes tratados, las personas sanas tratadas y enfermas se puede utilizar para analizar los resultados de los experimentos clínicos. También, los títulos de anticuerpos específicos pueden indicar el efecto de la vacunación. Las células de las biopsias también se pueden probar en inmuno-ensayos que incluyen respuestas específicas al (los) antígeno (s) en cuestión. Los experimentos clínicos se pueden diseñar para identificar y seleccionar: - una bacteria no patogénica de un número de candidatos para el uso en la vacuna particular, - la dosis óptima de bacteria no patogénica con el número promedio óptimo de antígenos acoplados a la superficie, - la ruta óptima de administración, - sustancias que aumentan el efecto de la vacuna, y - la frecuencia de vacunación y el período de vacunación. Los resultados de los experimentos clínicos son útiles para ajustar el régimen para la vacunación de humanos, punto en el cual la vacuna será útil para propósitos de
vacunación humana. Las DCs expuestas ex vivo a una vacuna que contiene antígenos acoplados a la superficie relacionados con las enfermedades tales como cánceres también pueden ser útiles para el tratamiento de las enfermedades. La exposición ex vivo se puede realizar antes del re-transplante de DCs al paciente. Además, una vacuna en la cual el mismo tipo de antígenos se han acoplado a la superficie a bacterias no patogénicas vivas o muertas puede ser utilizada parenteralmente para proporcionar el efecto adyuvante apropiado a vacunas tales como vacunas de cáncer. El método de la invención también puede ser útil para producir una vacuna eficiente 'y fácil de administrar contra un patógeno en un ataque bio-terrorista . Es conocido que, por ejemplo las vacunas de ántrax licenciadas existentes deben ser administradas parenteralmente y requiere múltiples dosis para inducir inmunidad protectora (Flick-Smith H.C. y colaboradores. 2002, Infection and Immunity, 7_0:2022). Esto requiere personal entrenado y no es la ruta óptima para estimular o respuesta inmune de la mucosa. También, la administración no es ideal para la vacunación de un número grande de personas dentro de un tiempo muy corto. III Ejemplos Ejemplo 1. Reticulación química de la ß-galactosidasa a Lactobacillus mediante glutaraldehído
Este ejemplo demuestra la reticulación química de la proteína ß-galactosidasa de Sulfolobus solfa taricus (Pisani F. M. y colaboradores. 1990 Eur J Biochem., 187 : 321-8) a la superficie de la célula de Lactobacill us plantarum UP1 utilizando el reactivo de reticulación bifuncional, glutaraldehído (GLA) , que es un dihaldehído de cinco carbones. GLA actúa como un reticulador al formar una base de Schiff (-H=N-) con los grupos amino de las proteínas. Así, la reticulación mediada por GLA de ß-galactosidasa a la superficie bacteriana se espera que ocurra entre los residuos de lisina o arginina presentes en la proteína ß-galactosidasa y los residuos de lisina o arginina accesibles en, o cerca de, la superficie de la célula de la bacteria. La ß-galactosidasa para estudios de reticulación se obtuvo mediante la expresión recombinante de Escherichia coli , utilizando el sistema de vector pET-3a (Invitrogen, CA) . Brevemente, el gen lacS, qe codifica ß-gala ctosidasa , se amplificó mediante técnicas de PCR estándares del DNA genómico de S . solfa taricus clonado en el vector pGET-3a y se transformó en E . coli . La ß-Galactosidasa se expresó extracelularmente, y las células de E . coli luego se lizaron. La ß-galactosidasa , liberada en el lisado se purificó parcialmente mediante termoprecipitación, al calentar el lizado a 80°C durante 30 minutos. L . plan tarum UP1 se cultivó en MRS (Oxoid, Hampshire UK) durante 24 h a 30°C sin
aleación. Las células se recolectaron por centrifugación y se resuspendieron en solución reguladora M9 (Na2HP04 0.6%, KH2P04 0.3%, NaCl 0.5%, MgS04 0.025%) y ajustaron a una densidad de células de 1010 células por mL. Una cantidad fija de células de plan tarum (1010) se incubó con diferentes cantidades de ß-galactosidasa y GLA al 0.2% (Sigma-Aldrich, St . Lois MO) durante 50 min a temperatura ambiente. La viabilidad de las células tratadas con GLA se probó al dispersar la mezcla de células sobre agar MRS. Nada de colonias viables se produjeron indicando que el tratamiento con GLA ha exterminado a la mayoría de las células. Subsecuente al tratamiento con GLA, la mezcla de célula se sometió a centrifugación para dar una fracción de célula y un sobrenadante. Las células aisladas se lavaron completamente dos veces en solución reguladora M9. Con el fin de monitorear la reticulación de GLA de ß-galactosidasa a las células de L . plan tarum la disolución de ß-gala ctosidasa entre las fracciones de sobrenadante y las fracciones de célula se determinó al analizar la actividad de la enzima de ß-galactosidasa empleando el procedimiento ONPG descrito por Sambrook J y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY) . Debido al lavado con M9 repetido de las células, la cantidad de ß-galactosidasea no enlazada a la fracción de célula fue insignificante. Por lo tanto, la actividad de la enzima
medida en la fracción de la célula se toma que corresponde a la cantidad de enzima, que es enlazada a la superficie de las células de L . plan tarum . La reticulación utilizando 1 µg/mL y 2 µg/mL de ß-galactosidasa y 1010 células por mL dio por resultado el enlace de 33% y 40%, respectivamente, de la cantidad total de enzimas (basado en unidades detectables de la actividad de enzima) a la superficie de la célula (Figura 1), mientras que menos de 5% fue enlazado a la superficie en la reacción de control sin GLA (datos no mostrados) . Las fracciones de células obtenidas después de la reticulación con GLA con ya sea 1 µg/mL o 2 µg/mL de ß-galactosidasa , tuvo actividad de enzima a 480 U y 610 U, que corresponde a 600 y 800 moléculas de ß-galactosidasa por célula, respectivamente. En conclusión el ejemplo demuestra que GLA es capaz de reticular una proteina enzimáticamente activa a la superficie de una célula de Lactobacill us . La enzima reticulada a la superficie de la célula retiene su actividad enzimática, indicando que la reticulación de proteína mediada por GLA a la superficie de la célula no compromete la funcionalidad de la proteína. Ejemplo 2. Reticulación química de Arabinosa isomerasa a Lactobacillus mediante glutaraldehído Para demostrar que la reticulación química de las proteínas a la superficie de la célula de una bacteria no es limitada a ß-galactosidasa, los inventores muestran la
reticulación de la enzima arabinosa isomerasa, del Thermoanaerobacter ma thrani termofílico, a una célula bacteriana. La arabinosa isomerasa convierte D-galactosa a D-tagatosa y se obtuvo mediante la expresión intracelular recombinante en E . coli como es descrito por J0rgensen y colaboradores, (J0rgensen F y colaboradores, 2004, Appl Microbiol Biotechnol 64:816-22). Después del crecimiento y la expresión en E . coli recombinante, las células se Usaron utilizando una prensa French. Esta mezcla lisada se centrifugó y el sobrenadante que comprende arabinosa isomerasa se utilizó para el siguiente experimento de reticulación. UP1 de Lactobacillus plan tarum se cultivó y se lavó como es descrito en Ejemplo 1. Las células lavadas (1010 células) se incubaron con diferentes cantidades de lisado que contiene la arabinosa isomerasa y con GLA a una concentración final de 0.1 %. La reacción de reticulación se realizó a 37°C durante 60 minutos. Después, las células se recolectaron y se lavaron como es descrito en el Ejemplo 1. Las actividades de enzimas en tanto la fracción de células como es el sobrenadante se analizaron como es descrito previamente (J0rgensen F y colaboradores, 2004, Appl Microbiol Biotechnol 64:816-22). La figura 2 muestra que la arabinosa isomerasa es reticulada a la superficie de la célula de Lactobacillus en una concentración dependiente de la materia. Puesto que la enzima arabinosa isomerasa no fue
inhibida por el tratamiento de GLA (datos no mostrados), la actividad catalítica detectable total en la célula y las fracciones de sobrenadante (Figura 2) corresponde a la cantidad de enzima adicionada a la células de L. plantarum lavadas antes del tratamiento con GLA. La Figura 2 muestra que más de 50% de arabinosa isomerasa se enlazó a la superficie de las células de L. plan tarum bajo todas las tres condiciones de reticulación, basado en la comparación de la actividad de arabinosa isomerasa en las fracciones de células con la cantidad total de actividad de enzima en la célula y las fracciones de sobrenadante combinadas. En conclusión, este ejemplo muestra que GLA puede enlazar eficientemente la arabinosa isomerasa activa a la superficie de una célula de Lactobacillus . Ejemplo 3. Quitosán, como molécula espaciadora, aumenta los niveles de ß-galactosidasa reticulada a Lactobacillus mediante glutaraldehído El quitosán es una molécula que ocurre naturalmente, que contiene múltiples grupos reactivos, que se puede utilizar como molécula espaciadora para aumentar la cantidad de proteína unida a la superficie de la célula bacteriana mediante la reticulación química. Las células de L. plan tarum se cultivaron y se lavaron como es descrito en el Ejemplo 1, y se suspendieron en solución reguladora M9 a una concentración de 1010 células por ml, a la cual quitosán
al 0.5% p/v 500 kDA (Cognis Deutschland GmbH, Alemania), y GLA al 0.2% se adicionaron, junto con ya sea 1 µg/mL o 2 µg/mL de ß-galactosidasa. El efecto del quitosán sobre la reticulación de ß-galactosidasa a las células se comparó con una reacción de reticulación de control sin quitosán. Las células de L . plantarum se recolectaron y se lavaron como es descrito en el Ejemplo 1 y la actividad catalítica de ß-galactosidasa de la fracción de célula lavada y un sobrenadante de la mezcla de reacción de reticulación se midieron. La Figura 3 demuestra que el quitosán aumenta la reacción de reticulación, puesto que más de 90% de la actividad de ß-galactosidasa total se enlazó a la fracción de células, con solamente 35% de la actividad de ß-galactosidasa que se enlazó a la fracción de células en la ausencia de quitosán. Este ejemplo muestra que la utilización de quitosán como espaciador molecular aumenta la reacciona de reticulación e incrementa la cantidad de ß-galactosidasa enlazada de 800 moléculas por célula a aproximadamente 2000 moléculas por célula. Ejemplo 4. Enlace no covalente de proteínas a la superficie de Lactobacillus El tratamiento químico de Lactobacillus con el agente de reticulación da por resultado células no vivas. Este ejemplo muestra que las bacterias no tratadas y vivas pueden enlazar ß-galactosidasa de una manera no covalente.
Mientras que no es relacionado por la teoría, la interacción entre superficie de la célula y la proteína es ya sea iónica, hidrofóbica o entre ß-galactosidasa y las porciones de azúcar sobre la superficie de la célula. UP1 de Lactobacillus plan tarum se cultivó y se lavó como es descrito en el Ejemplo 1. Células (1010) se incubaron durante 60 minutos a 37°C con 2 µg/ml de ß-galactosidasa. Las células se centrifugaron y se lavaron dos veces en 500 µl de solución reguladora M9. La actividad catalítica de ß-Galactosidasa en la fracción de células lavada y el sobrenadante de la mezcla de reacción de reticulación se analizaron. En la fracción de células 538 U fueron detectados, mientras que 5455 U se midieron en el sobrenadante correspondiente un enlace de 9% de la ß-galactosidasa total de la superficie de la célula. Este Ejemplo muestra que Lactobacill us puede enlazar ß-galactosidasa a la superficie de las células sin el uso de mediadores de reticulación. Sin embargo, solo 9% de la ß-galactosidasa adicionada se enlaza por la reticulación no covalente, mientras que la utilización de reactivo de GLA, como es descrito en el Ejemplo 1, en cantidades similares de ß-galactosidasa, dio por resultado 40% de la ß-galactosidasa adicionada que es enlazada. El método de enlace no covalente por lo tanto es cuatro veces menos eficiente como es comparado con el método de enlace covalente utilizando al
método de GLA. La disminución en la ß-gal enlazada (40% a 9%) corresponde una disminución de 800 a 180 moléculas de ß-galactosidasa por célula. La reacción se puede optimizar para obtener cantidades más altas de proteína enlazada. La optimización se puede lograr al controlar el pH, la concentración iónica de la solución reguladora, la temperatura u otros parámetros. Ejemplo 5. Reticulación catalizada enzimática de ß-galactosidasa a Lactobacillus La enzima transglutaminasa (TG) es capaz de formar reticulaciones inter- e intra-moleculares dentro y entre de las proteínas. Por lo tanto, TG puede catalizar la reticulación mientras las proteínas externamente adicionadas y los residuos de aminoácidos en componentes de la pared celular de la bacteria. A través de una reacción de transferencia de acilo, TG cataliza la reticulaciones entre los grupos ?-carboxiamida de los residuos de glutamina enlazados a péptido o a la proteína como donador de acilo y varias aminas primarias, aceptores de acilo, que incluye los grupos e-amino de los residuos de lisina en lazados a péptido o a la proteína. Esta reacción conduce a la formación de reticulaciones en la forma de isopéptidos de e- (?-glutamil) lisina, cuando los residuos de lisina enlazados a la proteína actúan como aceptores de acilo. La reacción se realiza al mezclar células bacterias con la proteína objetivo
(por ejemplo, antígenos o alérgenos) y TG, donde la reticulación gradualmente se incrementa con el tiempo. Las condiciones de reacción de preferencia son reguladas en pH entre aproximadamente 6.5 y aproximadamente 8.0, y comprenden > CaCl2 10 mM, para optimizar la reacción de reticulación. Además, el tratamiento con calor a < 90 °C de la proteína objetivo y la adición de ditiotreitol 20 mM puede aumentar la reticulación. Puesto que las sustancias inhibidoras de TG en las proteínas de leche se ha reportado (Bóenisch y colaboradores, 2004, Jour Food Science 69(8)) el tratamiento con calor de las células bacterianas derivadas de leche se puede realizar antes de la reacción de reticulación. Además, la proteína objetivo que es reticulada puede ser N- o C-terminalmente extendida con aminoácidos que contienen múltiples residuos reactivos, que pueden funcionar como sustrato de TG y aumentar la reacción de reticulación. La reticulación mediada por TG de una proteína objetivo a la superficie a las células bacterianas se detecta al analizar la fracción de células lavada y un sobrenadante para la proteína objetivo, ya sea al medir su actividad funcional (por ejemplo, actividad catalítica) o mediante técnicas inmunoquímicas utilizando anticuerpos específicos para la proteína objetivo tal como una enzima, antígeno o alérgeno. Ejemplo 6. Reticulación de beta-lactoglobulina a Lactobacillus mediante
el uso de glutaraldehído La beta-lactoglobulina (BLG) es una proteína de leche de la fracción del suero que causa alergia, la preparación de composiciones que comprenden BLG, capaz de inducir una respuesta inmune por la mucosa después de la administración oral, se puede emplear en el tratamiento de alergia de BLG en pacientes que sufren de tal alergia. Los siguientes componentes se incluyeron en ensayos realizados para demostrar la reticulación de BLG a células de Lactobacillus : Células de Lactoba cillus : Un cultivó de Lactobacillus plantarum (299v) se cultivó durante la noche en caldo MRS (Flukka 69966) a 30°C. Alícuotas de 1 ml de la noche (o/n) de cultivo se centrifugaron y las pelotillas resultantes se lavaron con 1 ml de solución reguladora M9 antes de que se congelaran a -20°C para el uso posterior. Antes del uso las pelotillas congeladas se descongelaron y se resuspendieron en solución reguladora M9 (pelotilla de 1 ml o/n de cultivo resuspendidas en 500 ml en solución reguladora M9) . BLG: Una solución al 1% de BLG (L 6879, Sigma-Aldrich) preparada en agua destilada estéril. Glutaraldehido (GLA) : Solución al 25% en agua de glutaraldehído (1.04239, Merck). El glutaraldehído es un dialdehído, de cinco carbonos, que actúa como un reticulador al formar una base de chip (>C=N-)
con grupos amino primario (principalmente lisina en caso de proteínas) . Muestras que comprenden células de Lactobacill us, proteína
BGL y glutaraldehído, en los volúmenes indicados en la
Tabla 1, se mezclaron y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente con mezclado periódico. Tabla 1 Tubo nr . Células BLG H20 GLA 1 250 µl 25 µl 225 µl 5 µl 2 250 µl 0 µl 250 µl 5 µl 3 250 µl 25 µl 225 µl 0 µl 4 250 µl 0 µl 250 µl 0 µl Después de 60 minutos de incubación, las muestran se centrifugaron, y las pelotillas de células se lavaron 2 veces con 500 µl en solución reguladora M9 (solución reguladora M9: 7.3 gramos de Na2HP04, 2.9 gramos KH2P04 y 2.0 gramos de NH4C1 disueltos en agua a un volumen total de 1 litro) . La cantidad de BLG reticulado en la pelotilla se determinó utilizando el equipo cuantificación de ELISA de Beta-Lactoglobulina Bovina (Catálogo nr. E10-125, Bethyl Laboratorio) con algunas modificaciones, empleando soluciones descritas por el fabricante del equipo. Debido a que la proteína BLG que es detectada se ha reticulado a la superficie de las células de Lactoba cill us, el procedimiento
del equipo del ELISA se modificó, permitiendo el uso de células completas en suspensión para la medición basada en anticuerpo. Brevemente, la detención se realizó utilizando un anticuerpo anti-BGL de conejo conjugado a HRP (peroxidasa de rábano picante) . La pelotilla se resuspendió en 100 µl de solución de bloqueo, se mezcló con 100 µl de solución de detención (1 ml de solución reguladora de disolución + 0.1 µl de anticuerpo HRP) , y se incubó durante 60 min a temperatura ambiente con mezclado regular. La célula luego se centrifugó y se lavaron 3 veces con 200 µl de solución de lavado antes ser resuspendidas en 100 µl de solución reguladora de disolución. Finalmente una reacción de color de TMB (Tetrametilbenzidina) se realizó al adicionar 100 µl de reactivo TMB (T 0440, Sigma Aldrich) a volúmenes de 50 µl del material diluido en serie en una placa microtítulo. La placa microtítulo se incubó durante 5-30 min a temperatura ambiente antes de que la reacción se detuviera mediante la adición de 100 µl 2M H2S04 y la absorbencia se determinó en 450 nm en un lector de placa. Una curva estándar de los valores de OD450 de enlace y las concentraciones de BGL se incluyó en la instalación de placa microtítulo como es descrito por el manual del equipo. Tabla 2 Tubo nr. OD420 para una OD420 para una Calculada dilución 4x dilución 8x BLG
1 0 . 974 0.526 65 ng/ml 2 0 . 386 0.217 19 ng/ml 3 0 . 621 0.353 38 ng/ml 4 0.298 0.157 11 ng/ml La BLG calculada en Tabla 2 es la concentración de proteína derivada de los valores OD420 medidos mediante el uso de la curva estándar. Un valor de fondo de absorbencia 450 nm se detecta en la ausencia de la adición de BGL al tubo de reacción, que probablemente refleja el enlace no específico del anticuerpo HRP. La adhesión no específica de la proteína BLG a las células de Lactobacillus probablemente explica los niveles de BLG en la muestra 3, donde se omite el glutaraldehído . Ejemplo 7. Reticulación de nucleasa de S . aureus a Lactobacillus mediante el uso de glutaraldehído El Staphylococcus a ureus es un patógeno bacterial importante, donde el tratamiento es especialmente difícil debido a la emergencia de cepas bacterianas multi-resistentes. Un componente de vacuna candidato es la nucleasa secretada (Nuc) Staphylococcus a ureus, que se ha producido mediante la expresión de proteína heteróloga en Lactococcus lactis (Poquet I. y colaboradores, 1998 J Bact., 180: 1904-1912). Los siguientes componentes se incluyeron en ensayos
realizados para demostrar la reticulación de la proteína Nuc a las células de Lactobacillus : Células de Lactobacillus: Un cultivó de Lactoba cillus acidophil us (X37) cultivado y preparado como es descrito en el Ejemplo 6. Proteína Nuc (A): proteína Nuc purificada (1 mg/ml,
Calbiochem) Proteína Nuc (B) : proteína Nuc recombinante (187 µg/ml) producida en Lactococcus lactis . La solución reguladora M9 y glutaraldehído (GLA) son como es descrito en el Ejemplo 6. Las muestras que contienen células de Lactobacillus solución reguladora M9, proteína Nuc y glutaraldehído, en los volúmenes indicados en la Tabla 3, se mezclaron y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente con mezclado periódico. Tabla 3 Tubo nr. células X37 Nuc solución GLA reguladora M9 1 100 µl 20 µl 0 µl 2 µl 2 50 µl 10 µl 60 µl 2 µl 3 25 µl 5 µl 90 µl 2 µl 4 100 µl 20 µl 0 µl 2 µl 5 50 µl 10 µl 60 µl 2 µl 6 25 µl 5 µl 90 µl 2 µl Después de 60 minutos de incubación, las muestras
se centrifugaron, y las pelotillas se lavaron 2 veces con 1 ml de solución reguladora M9. Las concentraciones de proteína Nuc en el material de pelotilla se determinó utilizando un ensayo basado en anticuerpo con un anticuerpo Nuc primario (anticuerpos anti-Nuc de conejo) y un anticuerpo anti-conejo AP-enlazado secundario (anticuerpo purificado por afinidad, marcado con fosfatasa a la IgG de conejo producido en cabra, Catálogo nr. 075-1506, KPL), empleando soluciones descritas en el Ejemplo 1. Brevemente, la pelotilla se resuspendió en 100 µl de solución reguladora de bloqueo, se mezcló con 100 µl de solución de detención (1 ml de solución reguladora de dilución + 1 µl de anticuerpo Nuc) , y se incubó durante 60 min a temperatura ambiente con mezclado regular. Luego las células se centrifugaron y se lavaron 2 veces con 500 µl solución de lavado antes de ser resuspendidas en 100 µl de solución reguladora de dilución. Enseguida 100 µl de solución de detención (4 ml de solución reguladora dilución + 1 µl de anticuerpo AP) se adicionó, y la muestra se incubó durante 60 min a temperatura ambiente con mezclado regular. La muestra luego se centrifugó, se lavó 3 veces con 500 µl de solución de lavado y resuspendió en 100 µl solución reguladora de dilución. Finalmente una reacción de color de AP (fosfatasa alcalina) se realizó al adicionar 100 µl del sistema de sustrato de fosfatasa de Microcavidad Blue Phos (50-88-02, KPL) a volúmenes de 50 µl del material serialmente
diluido de una placa de microtítulo. La placa de microtítulo se incubó durante 10-30 min a temperatura ambiente antes de que la reacción se detuviera mediante la adición de 100 µl de EDTA al 2.5% y la absorbencia se determinó en 595 nm en un lector de placa. Una curva estándar de los valores de ODsgs de enlace y las concentraciones de Nuc se generó por separado utilizando el mismo equipo experimental. Tabla 4 Tubo nr. OD595 para una OC para una Nuc dilución 4x c ución 8x Calculado 1 0 . 08 9 0.074 13 µg/ml 2 0 . 074 0.061 8 µg/ml 3 0 . 061 0.054 5 µg/ml 4 0 . 131 0.091 22 µg/ml 5 0 . 112 0.079 18 µg/ml 6 0.091 0.070 13 µg/ml Los valores de Nuc calculados dados en la Tabla 4 es la concentración de proteína derivada de los valores OD595 medidos mediante el uso de la curva estándar después de la sustracción de valor de fondo. La reticulación de la proteína Nuc a las células de Lactobacillus acidophilus se demuestra y la cantidad de Nuc reticulado es proporcionar la cantidad de proteína Nuc y las células presentes en el ensayo. Ejemplo 8. Reticulación de beta-galactosidasa de lacS a Lactobacillus
mediante el uso de glutaraldehído y quitosán El quitosán es una molécula que ocurre naturalmente que contiene múltiples grupos amino, que puede participar en reacciones de reticulación de glutaraldehído. Las llamadas moléculas espaciadoras frecuentemente se adicionan a las muestras de reacción de reticulación con el fin de mejorar el efecto. Los siguientes componentes se emplearon en ensayos realizados para demostrar la reticulación de beta-galactosidasa a células de Lactoba cill us por la vía de quitosán: Beta-galactosidasa se obtuvo mediante la expresión recombinante del gen lacS de Sulfolobus solfa taricus (Pisani F.M. y colaboradores, 1990 Eur J Biochem., 187:321-8) en Escherichia coli utilizando el sistema de vector pET-3a (Invitrogen, CA) . Brevemente, un fragmento de PCR que codifica la beta-galactosidasa se purificó utilizando técnicas de PCR estándares, se clonó en el vector pET-3a y se trasformó en E. coli para la expresión intracelular de la beta-galactosidasa. Una preparación de la proteína lacS expresada se obtuvo mediante lisis de las células de E . coli seguido por la purificación (termo-precipitación) , donde el lisado se calentó a 80°C durante 30 min y se centrifugó para remover la mayor parte de las otras proteínas en el lisado (la beta-galactosidasa lacS es una enzima termoestables). La
concentración de beta-galactosidasa lacS se estima que es cercana a 400 µg/ml basado en la proteína detectable en un gel manchado de Coomassie. Células de Lactobacill us : Un cultivó de Lactobacill us plan tarum (299v) cultivado y preparado como es descrito en el Ejemplo 6. Una solución de quitosán de 1 % se preparó al mezclar 7.3 mg de quitosán (500 kDa) (Cognis Deutchland GmbH, Alemania), 730 µl de H20 y 20 µl de HCl 2N. La solución reguladora de M9 y glutaraldehído (GLA) son como es descrito en el Ejemplo 6. Las muestras, que comprende células de Lactoba cill us, solución reguladora M9 y quitosán en los volúmenes indicados en la Tabla 5, como se mezclaron y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente. La beta-galactosidasa lacS y glutaraldehído luego se dispararon en los volúmenes indicados en la Tabla 5, y las muestras se mezclaron durante 15 min a temperatura ambiente. Tabla 5 Tubo nr. Células Solución Quitosán lacS GLA reguladora M9 1 50 µl 50 µl 2.5 µl 20 µl 2 µl
2 50 µl 50 µl 5 µl 20 µl 2 µl
3 50 µl 50 µl 10 µl 20 µi 2 µl
4 50 µl 50 µl 20 µl 20 µl 2 µl Después de la incubación de 15 minutos, las
muestras se centrifugaron y las pelotillas se resuspendieron en 100 µl de solución reguladora M9. Un ensayo estándar para la actividad de la enzima de beta-galactosidasa empleando el del procedimiento ONPG (Sambrook J y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY) se realizó sobre la pelotilla y la soluciones del sobrenadante a 65°C con el fin de determinar la distribución de la proteína lacS . Las cantidades relativas resultantes de la enzima beta-galactosidasa se muestra en la Tabla 6, donde los valores tabulados se calculan como la actividad de enzimas (unidades por ml) contra el volumen de la solución (ml) . Tabla 6 Tubo nr . Pelotillas Sobrenadante Reticulado 1 1 15511 2427 6% 2 371 2172 14% 3 653 1790 25% 4 1305 1347 50% Reticulado es la relación entre la pelotilla y las actividades de beta-galactosidasa lacS total medidas. Este ejemplo muestra que la inclusión de quitosán, un espaciador, significativamente el rendimiento del material reticulado. Ejemplo 9. Reticulación en frío de azocaseína a Lactobacillus mediante
glutaraldehído Los inventores han descubierto de manera sorprendente, que la reticulación mediante glutaraldehído se puede realizar utilizando un protocolo de congelación (reticulación en frío) , y que altos rendimientos de proteína reticulada se pueden obtener utilizando este protocolo. Los siguientes componentes incluyeron los ensayos realizados para demostrar la reticulación de azocaseína a las células de Lactobacillus : Azocaseína: es bien conocida como un sustrato de proteasa general. Esta consiste se caseína conjugada a un tinte azo, que se puede utilizar para las mediciones espectroscópicas cuantitativas. Para el experimento de reticulación una solución al 1% (10 mg/ml) de azocaseína (A 2765, Sigma-Aldrich) disuelta en agua destilada estéril se preparó. Células de La ctobacillus : Un cultivó de Lactobacill us plantarum (299v) cultivado y preparado como es descrito en el Ejemplo 6. Solución reguladora M9 y glutaraldehído (GLA) son como es descrito en el Ejemplo 6. Las muestras, que comprende células de La ctobacillus, azocaseína, solución reguladora M9 y glutaraldehido en los volúmenes indicados en la Tabla 7, se mezclaron y se congelaron inmediatamente utilizando nitrógeno líquido, antes de ser colocadas en un congelador a -20°C, donde las muestras se conservaron durante 3 días.
Tabla 7 Células 299v Azocaseína Solución GLA Recuperación Reguladora M9 100 µl 50 µl 50 µl 0 µl 90 % 100 µl 50 µl 50 µl 2 µl 5% 0 µl 50 µl 150 µl 2 µl 10 %
Células 299v Azocaseína solución GLA Recuperación Reguladora M9 100 µl 100 µl 0 µl 0 µl 78%
100 µl 100 µl 0 µl 2 µl 6% 0 µl 100 µl 100 µl 2 µl 5% Para evaluar la reticulación, las muestras se descongelaron, se centrifugaron y el contenido de azo-caseína de los sobrenadante se midió al detectar la absorbencia del grupo azo en 420 nm. Los valores de recuperación, dados en la
Tabla 7, se calculan como el porcentaje de manchado de azo que permanece en el sobrenadante con relación a un control
(azocaseína pura en agua similar a la concentración inicial). Ambas de las soluciones de 2.5 mg/ml y 5.0 mg/ml de azocaseína se encontraron que son eficientemente reticuladas utilizando glutaraldehído al 0.25% de acuerdo con el protocolo en frió anterior. La centrifugación produjo una pelotilla firme, que fue imposible de resuspender. Este indica, que un alto grado de reticulación ha ocurrido. Los
resultados de reticulación con o sin adiciones de células de Lactobacillus son muy similares. Debido al protocolo de congelación, donde la posición de las células es fijada durante la incubación, la reticulación en frió da por resultado células y azo-caseína uniformemente enlazadas en un aglomerado . Ejemplo 10. Reticulación en frío de beta-galactosidasa a Lactobacillus mediante glutaraldehído El protocolo de congelación (reticulación en frío) para la reticulación mediada por glutaraldehído de las proteínas a la superficie de las Lactobacill us también da rendimiento más altos de beta-galactosidasa reticulada ( lacS) a Lactobacillus. Los siguientes componentes incluyeron ensayos realizados para demostrar la reticulación de lacS a células de Lactobacill us utilizando el protocolo de congelación : Células de Lactoba cillus : Un cultivó de La ctobacill us a cidophilus (X37) se cultivó y se preparó como es descrito en el Ejemplo 6. lacS se preparó como es descrito en el Ejemplo 8. Solución reguladora M9 y glutaraldehído (GLA) se prepararon como es descrito en el Ejemplo 6. Las muestras que comprenden células de Lactobacillus, solución de proteína de beta-galactosidasa
lacS, solución reguladora, M9 y glutaraldehído se mezclaron en volúmenes indicados en la Tabla 8 e inmediatamente se congelaron utilizando nitrógeno líquido, antes de ser colocadas en un congelador a -20°C, en donde las muestras" se conservaron durante 3 días. Tabla 8 Tubo nr. Células X37 lacS solución GLA eguladora M9 1 100 µl 0 µl 50 µl 2 µl 2 100 µl 10 µl 40 µl 2 µl 3 100 µl 20 µl 30 µl 2 µl 4 100 µl 50 µl 0 µl 2 µl 5 100 µl 50 µl 0 µl 0 µl 6 0 µl 10 µl 140 µl 2 µl 7 0 µl 20 µl 130 µl 2 µl 8 0 µl 50 µl 100 µl 2 µl Para evaluar la reticulación las muestras se congelaron, se centrifugaron y la pelotilla se lavó una vez con 200 µl solución reguladora M9. Finalmente la pelotilla se resuspendió en 100 µl solución reguladora M9. La actividad de la beta-galactosidasa se determinó como es descrito en el Ejemplo 7 utilizando un ensayo de ONPG a 65°C. Las cantidades relativas resultantes de la actividad de beta-galactosidasa se muestran en la Tabla 9. Los valores tabulados se calculan como actividad de la enzima (contra el
volumen de la solución) (ml). Tabla 9 Tubo nr . Pelotillas Sobrenadante Lavado Recuperación Reticulado
1 18 22 13 - —
2 583 139 8 73% 80%
3 1331 77 4 70% 94%
4 3708 10 46 75% 99%
5 3 5016 4 100% - 6 317 188 4 51% 62%
7 1321 14 4 67% 99%
8 2711 18 27 55% 98% La recuperación es la fracción de la actividad de lacS adicionada detectadas después de la reticulación en la soluciones de pelotilla + sobrenadante + lavado, combinadas. El tratamiento con glutaraldehído conduce a la inactivación de la enzima, que más probablemente explica la pérdida observada en la actividad recuperable total. La adición de células X37 mejoran la recuperación, probablemente adherido a más objetivos que están presentes para la reacción del glutaraldehído . Los valores reticulados son la actividad beta-galactosidasa de la pelotilla expresada como un porcentaje de la actividad de beta-galactosidasa lacS total. En general, la mayoría de la proteína de beta-galactosidasa lacS adicionadas es reticulada, y mucho más actividad de la enzima se
encuentra la fracción de pelotilla, sin considerar si las células 299v son incluidas o no son incluidas. Para las concentraciones de proteína más altas la recuperación es cercana a 100%. La microscopía de las fracciones de pelotilla mostró células individuales X37 normales para la muestra sin GLA (Tubo nr. 5). Para la reticulación se realizó sin adición de células (Tubos 6-8) se observaron agregados pequeños, que fueron similares en tamaño a las células bacterianas. Los agregados mezclados, que aparecieron que consisten de tanto células como el material de proteína, se observaron para los experimentos donde tanto las células como la proteína de beta-galactosidasa lacS se adicionó (Tubos 2-4). Las células incubadas sin la cS adicionado también exhibieron grumos pequeños de células reticuladas (Tubo nr. 1). Ejemplo 11. Reticulación en frío de Betvl a Lactobacillus mediante glutaraldehído comparado con la reticulación a temperatura ambiente Betvl, el antígeno de polen mayor de abedul ( Betula verrucosa ) , es una proteína de 17 kd (Breiteneder H. y colaboradores, 1989 EMBO J. , 8:1935-1938), y es una de las causas principales de las reacciones alérgicas de Tipo I (asma bronquial alérgico) . Los siguientes componentes incluyeron los ensayos realizados para determinar la
eficiencia de la reticulación en frío de Betvl a las células de Lactobacillus : Proteína Betvl recombinante purificada se obtuvo de acuerdo con el procedimiento descrito por Spangfort y colaboradores, (1996) Prot. Exp. Purification, 8, 365-373. La proteína Betvl radiactivamente marcada se produjo utilizando un sistema de síntesis de proteína in ví tro (RTS 100 E . coli HY Kit, Roche Applied Science) . Brevemente, un fragmento de PCR que contiene el cuadro de lectura de Betvl se clonó en el vector pIVEX2.3d (Roche) por medio de los sitios de restricción Ndel y Sal í adicionados a los cebadores de PCR utilizados para su amplificación. El DNA de plásmido purificado de un clon resultante, que mediante el análisis de secuencias se encontró que contiene una secuencia de codificación Betvl libre de error, se utilizó como la plantilla del DNA para la síntesis de proteína in vi tro . La marcación radioactiva se realizó utilizando L- [35S]metionina (SJ235, Amersham Biosciences) como es descrito por el fabricante. Un filtro de 30K centrifugo (Ultrafree, Amicon Bioseparations, Millipore) capaz de retener la proteína Betvl se utilizó para lavar los productos de bajo peso molecular lejos de la pequeña sintetizada in vi tro . La proteína Betvl 35S-marcada se purificó mediante esta etapa, dando una banda radioactiva dominante individual sobre SDS PAGE. Finalmente la proteína Betvl 35S-marcada se mezcló con solución reguladora M9 y el
portador no radioactivo Betvl (40 µg/ml) para producir la mezcla utilizada en los experimentos de marcación radioactiva (10 µl de proteína Betvl 35S-marcada, 490 µl de solución reguladora M9, con 550 µl de portador Betvl) . Células de La ctoba cillus : Un cultivó de La ctobacillus acidophilus (X37) se cultivó y se preparó como es descrito en el Ejemplo 6. Betvl : 1.32 mg/ml en solución reguladora de fosfato de sodio que contiene glicerol 50%. Solución reguladora M9 glutaraldehído (GLA) se preparó como es descrito en el Ejemplo 6. Células de La ctobacill us, soluciones de proteína Betvl , y glutaraldehído se mezclaron en los volúmenes indicados en la Tabla 10 e inmediatamente se congelaron utilizando nitrógeno líquido, antes de ser colocado en un congelador a -20°C. Tabla 10 Tubo nr . Células X37 Betvl 35S-Betvl GLA 1 100 µl 5 µl 10 µl 2 µl 2 100 µl 5 µl 10 µl 2 µl 3 3 1 10000 µµll 5 µl 10 µl 2 µl 4 100 µl 5 µl 10 µl 2 µl 5 100 µl 5 µl 10 µl 0 µl 6 100 µl 5 µl 10 µl 0 µl Después de 3 días a -20°C, las muestras se descongelaron y se centrifugaron. Las pelotillas se lavaron
con 200 µl en solución reguladora M9 y se resuspendieron en 100 µl de solución reguladora M9. La medición de 35S-radioactividad en la pelotilla, el sobrenadante y las soluciones de lavado se realizaron al colocarse gotas de 5 µl sobre una superficie de papel no absorbente, al secar las gotas de 50°C y al colocar una Criba Phosphor Storage súper sensible (Pachard Instrument Company) sobre las gotas secas en un cásete de película. La Criba Phosphor expuesta se exploró (Cyclone, Pachard Instrument Company) y las señales de unidad de luz detectadas (DLU) se integraron para áreas circulares que tienen diámetros idénticos para todas las manchas analizadas. Los resultados se muestran en la Tabla 11. (Unidades relativas) donde los valores tabulados se calculan como el resultado de la exploración (DLU por ml) contra el volumen de solución (ml) . Tabla 11 Tubo nr. Pelotillas Sobrenadante Lavado Recuperación Reticulado
1 713 5362 431 79% 9%
2 916 7829 355 110% 11%
3 1339 6873 542 106% 16%
4 508 4215 371 62% 6%
5 - 6282 - 76% - 6 _ 7146 _ 87% _
La recuperación es la fracción de la actividad
35 S-Betvl adicionada detectada después de la reticulación en
la soluciones de pelotilla + sobrenadante + lavado. Reticulado es el porcentaje de la actividad de 35S-Betvl total detectado en la pelotilla. Las disoluciones de la solución de 35S-Betvi se utilizaron para determinar la radioactividad total adicionada, y las áreas del papel no absorbente a las cuales las muestras no se han localizado se utilizaron para la sustracciones de fondo de los valores de DLL determinados. La microscopía de las fracciones de pelotilla mostró células individuales X37 normales para las muestras en GLA, mientras que la reticulación de GLA produjo células en agregados pequeños decorados con el material de proteína Betvl (Figura 4). La mayoría de la proteína Betvl observada en la fracción de pelotilla se encontró que es asociada con la célula, mientras que los agregados de proteinas grandes separadas, y los agregados pequeños tendrían que haber sido removidos durante las etapas repetidas de lavado de células. El glutaraldehído es un agente de reticulación de proteína ampliamente utilizado (Migneault I. y colaboradores, 2004 BioTechniques, 37_:790-802). En el experimento comparativo el glutaraldehído a temperatura ambiente se utilizó para reticular Betvl a 2 diferentes tipos de células de Lactobacillus . Los siguientes componentes incluyeron lo ensayos realizados para determinar la eficiencia de la reticulación a temperatura ambiente de Betvl a células de Lactobacillus .
Células de La ctobacill us (A) : Un cultivo de Lactobacillus acidophil us (X37) cultivado y preparado como es descrito en el Ejemplo 6. Células de La ctobacillus (B) : Un cultivó de La ctobacill us rhamnosus (616) cultivado y preparado como es descrito en el
Ejemplo 6. Betvl : 1.32 mg/ml en solución reguladora de fosfato de sodio que contiene glicerol al 50%. 35S-Betvl se preparó como es descrito en lo anterior. Solución reguladora M9 y glutaraldehído (GLA) se prepararon como es descrito en el Ejemplo 6. Las células de Lactobacillus, soluciones de proteínas Betvl , y glutaraldehído se mezclaron de acuerdo con los volúmenes indicados en la Tabla 12 y se incubaron a temperatura durante 60 min con mezclado periódico. Tabla 12 Tubo nr . Células Solución Betvl 35S-Betvl GLA reguladora M9 1 100 µl (A) 0 µi 3 µl 10 µl 1 µl
2 100 µl (A) 0 µl 3 µl 10 µl 2 µl
3 100 µl (A) 0 µl 6 µl 10 µl 1 µl
4 100 µl (A) 0 µl 6 µl 10 µl 2 µl
5 100 µl (B) 0 µl 3 µl 10 µl 1 µl
6 100 µl (B) 0 µl 3 µi 10 µi 2 µl
7 100 µl (B) 0 µl 6 µl 10 µl 1 µl
8 100 µl (B) 0 µl 6 µl 10 µl 2 µl
9 0 µl 100 µl 3 µl 10 µl 1 µl 10 0 µl 100 µl 6 µl 10 µl 1 µl
Después de la incubación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron, y las pelotillas se lavaron 3 veces con 100 µl solución reguladora M9 y resuspendieron en 50 µl de solución reguladora M9. La medición de la 35S-actividad en la pelotilla, sobrenadante y las soluciones de lavado se realizó al colocar gotas de 5 µl de la muestra sobre una superficie de papel no absorbente y se procesaron como es descrito en lo anterior. Los resultados se muestran en la Tabla 13 (unidades relativas), y los valores tabulados se calculan como el resultado de exploración (DLU por ml) contra el volumen de solución (ml) . Tabla 13 Tubo Pelotillas Sobrenadante Lavado-1 Lavado-2 Recuperación Reticulado nr . 1 342 16278 712 74 78% 1.5%
2 478 16837 1278 74 84% 2.1%
3 258 15134 642 58 72% 1.2%
4 367 13520 615 79 65% 1.6%
5 316 21299 816 79 101% 1.4%
6 604 11829 958 33 60% 3.6%
7 312 15682 803 59 76% 1.6%
8 . 154 10072 1347 77 52% 0.7%
9 38 15011 529 45 70% 0.2% 10 28 12613 787 56 61% 0.1% Los valores tabulados para la recuperación y la reticulación se calcularon como es descrito en lo anterior. El material de pelotillas examinó en el microscopio, y las células de ambas de las cepas de Lactobacillus se encontraron que producen agregados de células un poco más grandes como un resultado de reticulación, aunque la agregación de las células se redujo, cuando la solución reguladora M9 se utilizó para diluir la concentración de células en un experimento similar (dato no mostrado) . El rendimiento de agregados pequeños de la proteína Betvl reticulada con células de Lactoba cill us se encontró que está en el intervalo de 1-3% cuando se realiza a temperatura ambiente. Mientras que esto incremento a una reticulación promedio de 11% utilizando el procedimiento de reticulación en Frió, que es una mejora significante inesperada en el nivel de reticulación. Un conjugado de Lactobacillus con Betvl acoplado a la superficie de preparado de acuerdo con los dos procedimientos de reticulación anteriores se puede concentrar 100 veces. Un alícuota de 5 µl de cada concentrado, cuando se administra a ratones en un experimento de tipo S.L.I.T. de acuerdo con el Ejemplo 15, daría una dosis que comprende 0.330 mg o 0.075 mg de proteína Betvl unida a las células de
Lactoba cill us preparadas de acuerdo con la reticulación de temperatura fría o ambiental al respectivamente. Ejemplo 12. Distribución de superficie de Betvl reticulado a Lactobacillus mediante glutaraldehído La distribución de superficie de Betvl reticulado a Lactoba cill us mediante glutaraldehído se examinó empleando métodos de detención basados en anticuerpo. Los siguientes volúmenes se mezclaron e inmediatamente se congelaron utilizando nitrógeno líquido, antes de ser colocados en un congelador a -20°C: 100 µl de células de Lactobacillus acidophil us (X37), 5 µl de proteína de Betvl y 2 µl GLA. Todas las soluciones son como es descrito en el Ejemplo 8. Un control negativo, donde Betvl se omitió de la mezcla de reticulación, se trató de una manera idéntica a las otras muestras del experimento. Después de 3 días a -20°C, la mezcla se descongeló, se centrifugó y la pelotilla se lavó con solución reguladora M9. Con el fin de evitar la auto-fluorescencia de glutaraldehído residual, la pelotilla primero se suspendió en 500 µl de etanolamina 40 mM y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Cada muestra luego se centrifugó y la pelotilla luego se resuspendió en 2 ml de solución NaBH4 (1 mg/ml en solución reguladora PBS, pH 8.0) durante 10 min a temperatura ambiente. Finalmente, el material de pelotillas
se lavó 3 veces con 500 µl de solución reguladora M9. La presencia de Betvl se visualizó al utilizar un anticuerpo anti-Betvl de conejo (ALK-Abelló A/S) en combinación con un anticuerpo anti-conejo marcado con Cy-3 secundario (PA43004, Amersham Biosciences) . Brevemente, la pelotilla se resuspendió en 500 µl TBS (Tris 50 mM, NaCl 0.9%, pH 7.6) junto con 1 µl de anticuerpo primario (anti-Betvl de conejo) y se incubó 60 minutos a temperatura ambiente. La muestra luego se centrifugó y se lavó 3 veces en 500 µl de solución reguladora de TBS, y la pelotilla se resuspendió en 500 µl de TBS junto con 1 µl de anticuerpos secundarios (anti-conejo Cy-3) y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, la pelotilla se lavó 3 veces con 500 µl de PBS, se resuspendió en 500 µl de PBS y se analizó mediante la microscopia de fluorescencia (Axioskop 2, Zeiss) con una cámara CCD (Princeton Instruments), donde las imágenes se produjeron durante el uso del software MetaMorph (Universal Imaging Company) . Una señal fluorescente clara se localizó a la superficie de las células de Lactobacillus cuando las muestras se visualizaron en el microscopio y la cámara empleando instalaciones idénticas. Esto demuestra que la proteína Betvl puede ser reticulada a la superficie de las células de La ctoba cill us (Figura 5) , y que la proteína unida reticulada (jetvi) retiene sus propiedades de reconocimiento
de anticuerpo. Ejemplo 13. Optimización y control de reticulación química de un compuesto proteináceo a la superficie de bacterias no patogénicas La proporción de formación de reticulaciones químicas entre un compuesto proteináceo objetivo y la superficie celular de la célula bacteriana, y la cantidad de proteína objetivo enlazada por célula, se puede modular mediante las condiciones de la reacción de reticulación. Por ejemplo, el tiempo de incubación y la temperatura se ajustan para obtener el grado requerido de reticulación. La concentración del reticulador químico y la relación de proteína objetivo a célula se ajusta en la relación de reticulación para producir una densidad de reticulación de aproximadamente 1 ng a por lo menos aproximadamente 1 mg de proteína objetivo reticulada por 1012 células. Además, el mezclado de los reactivos durante el proceso de reacción se define para asegurar tanto el contacto eficiente entre los reactivos, una distribución uniforme de la proteína sobre la superficie externa de las células bacterianas, y para prevenir la formación de agregados de células. Las condiciones de las reacciones de reticulación que modulan la abundancia, densidad y distribución del compuesto proteináceo objetivo enlazado a una(s) célula (s) bacteriana (s) se analiza mediante métodos inmunoquímicos y microscopia. Los reactivos
químicos bi-funcionales alternativos y espaciadores alternativos para la reticulación se pueden probar. El método divulgado de la invención permite la producción de uno o más células bacterianas que comprende una cantidad controlada de proteína reticulada sobre su superficie externa. Ejemplo 14. Estimado de dosificación del compuesto proteináceo objetivo reticulado a las bacterias no patogénicas La dosificación del compuesto proteináceo objetivo (por ejemplo enzima, antígeno o alérgeno) reticulado a células bacterianas, o formulado como una vacuna, se calcula como sigue: Proteína reticulada de dosificación = N x M x CFU/A Donde N es el número de moléculas de proteína reticuladas por célula, M es el peso molecular, CFU es el número de unidades de formación de colonia en una dosis y A es el número de Avogadro 6.02 x 1023 mol"1. En el Ejemplo 1, de número de moléculas de ß-galactosidasa acopladas a la superficie se estimó a aproximadamente 600-800 moléculas por célula, basada en la actividad de enzima de ß-galactosidasa sobre la superficie bacteriana. La estimación asume que la actividad de la enzima se conserva después de la terminación del acoplamiento de las moléculas de antígeno a la superficie bacteriana. Sin embargo, la actividad de la enzima se puede reducir
significativamente por ejemplo debido al tratamiento con GLA y/o el acceso incompleto de las moléculas de sustrato a toda la ß-galactosidasa reticulada. Por consiguiente, el número de moléculas aplicadas acopladas a la superficie puede ser más alto que el estimado de 600-800. El número de moléculas por célula puede estar entre 1,200 a 2,400 si la actividad de la enzima se reduce dos-tres veces mediante el tratamiento de GLA. El número correcto de moléculas acopladas a la superficie se puede terminar precisamente, utilizado por ejemplo el antígeno marcado con isótopo o técnicas inmuno-basadas . En los Ejemplos 1 y 2, el protocolo para acoplar las moléculas de antígeno a la superficie bacteriana no fue saturante, puesto que la adición de cantidades incrementadas de antígeno en la reacción de acoplamiento se mostró que incrementa la cantidad de antígeno acoplado a la superficie (Figura 1 y 2) . La cantidad de antígeno acoplado a la superficie se puede ser además incrementado al modular las condiciones de reacción de reticulación (incluyendo la concentración de GLA, temperatura y/o el tiempo de incubación), como es detallada en el Ejemplo 7. En el Ejemplo 6, la cantidad de proteína BLG reticulada fue de aproximadamente 46 ng/ml. La proteína BGL tiene un peso molecular de alrededor de 18,300. Asumiendo 2xl09 células/ml para un cultivo de Lactobacill us cultivado
durante la noche, esto cuantifica a 4.6 ng de proteína BLG por IxlO9 células para los volúmenes de reacción utilizados o 151 moléculas reticuladas por célula. En el Ejemplo 7, la cantidad de proteína Nuc reticulada fue de aproximadamente 22 µg/ml para la concentración de Nuc más alta utilizada. El peso molecular de la proteína Nuc es de aproximadamente 18 kd. Asumiendo 2xl09 células/ml para un cultivo de Lactoba cillus cultivado durante la noche, esto cuantifica a 2.2 µg de proteína Nuc por 4xl08 células para los volúmenes de reacción utilizados o aproximadamente 184xl03 reticuladas por célula. En el Ejemplo 8, el número de moléculas lacS reticuladas se encontró que está entre 6 y 50% dependiendo de la cantidad de quitosán utilizada. La beta-galactosidasa lacS es una proteína de 57 kd. Asumiendo 2xl09 células/ml para un cultivo de Lactoba cill us cultivado durante la noche, esto cuantifica de 0.48 a 4.0 µg de proteína lacS por 2xl08 células o de 25xl03 a 211xl03 moléculas reticuladas por célula . En el Ejemplo 9, el número de moléculas de azocaseína reticuladas se encontró que es de alrededor de 90% del material adicional adicionado, que cuantifica 450 µg por 100 µl de solución de células utilizadas. La caseína se encuentra en varias formas diferentes con pesos moleculares en el intervalo de 20-25 kd. Asumiendo 2xl09 células/ml para
un cultivo de La ctobacillus cultivado durante la noche, esto cuantifica a 450 µg de caseína por 4xl08 células o aproximadamente 27xl06 moléculas reticuladas por célula. En el Ejemplo 10, el número de moléculas lacS reticuladas se encontró que está en el intervalo 80 a 90%, que cuantifica a aproximadamente 18 µg por 100 µl de solución de células para el volumen lacS más alto utilizado. Asumiendo 2xl09 células/ml para un cultivo de Lactoba cill us cultivado durante la noche, esto cuantifica a 18 µg de proteína de la cS por 4xl08 células o aproximadamente 475xl03 moléculas reticuladas por célula. En el Ejemplo 11, el número de moléculas Betvl reticuladas utilizando el procedimiento en frío se encontró que es de alrededor de 10% del material adicionado, que cuantifica 0.66 µg por 100 µl de solución de células utilizada. Betvl es una proteína de 17 kd. Asumiendo 2xl09 células/ml para un cultivo de Lactobacill us cultivado durante la noche, esto cuantifica 0.66 µg Betvl por 4xl08 células o aproximadamente 58xl03 moléculas reticuladas por célula. También en el Ejemplo 11, el número de moléculas
Betvl reticuladas utilizando el procedimiento de temperatura ambiente se encontró que está en el intervalo de 1 a 2%, que cuantifica a alrededor de 0.2 µg por 100 µl de solución de células para el volumen de Betvl más alto utilizado. Asumiendo 2xl09 células/ml para un cultivo de La ctobacill us
cultivado durante la noche, esto cuantifica a 0.2 µg de proteína Betvl por 4xl08 células o aproximadamente 18xl03 moléculas reticuladas por célula. En el Ejemplo 1, la proteína objetivo (ß-galactosidasa) reticulada a la superficie de la célula bacteriana tiene una masa de aproximadamente 50 kDa. Así, la cantidad de proteína objetivo en una dosis que contiene 1012 células y con aproximadamente 1,000 moléculas de proteína objetivo reticuladas por célula es: Proteína objetivo reticulada de dosificación = 1,000x50,000 gxmol^xlO^/d.OSxlO^mol"1 = 83 µg . Ejemplo 15 Uso de conjugados de Lactobacillus que contienen alérgeno Betvl de polen de abedul acoplado a la superficie como un medicamento para el tratamiento de alergia en un modelo de animal mediante la administración sublingual 15.1 Métodos : Animales: Ratones Balb/cJ de 6-10 semanas de edad, hembras se crearon en la instalación y se alojaron en un medio ambiente libre de patógenos específico bajo un ciclo de luz de 12 h, oscuridad de 12 h. Todos los experimentos descritos aqui se condujeron de acuerdo con legislación Danesa . 15.2 Manufactura de los conjugados de BetVl/X31 de L. acidophilus :
Los conjugados de X37 de L. acidophilus/alergeno BetVl covalentemente acoplados se prepararon mediante una reacción de glutaraldehído repetida como lo es descrito en lo siguiente : X37 de L . acidophil us obtenido de la colección de cepas internas de Bioneer A/S se cultivaron durante dos días en 250 ml de medio MRS a 30°C sin aireación. Las ondas se recolectaron y se lavaron en 100 ml en solución reguladora M9 y la pelotilla de célula resultante se conservó a -20°C hasta que se utilizó. La pelotilla de célula se disolvió 125 ml de solución reguladora M9 y se dividió en porciones como 10 ml en doce tubos Nunc de 50 ml. A esta suspensión de células y cada tubo de 10 ml de solución reguladora M9, 150 µl de glutaraldehído al 25% (1.04239, Merck), y 150 µl de BetVl (una concentración de 2.56 mg/ml) se mezcló y se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos y se mezcló frecuentemente. La mezcla se centrifugó a 4000 RPM y el sobrenadante se conservó y se almacenó a -20°C para el uso posterior. La pelotilla de células resultantes se lavó con 10 ml de solución reguladora M9, se resuspendió en 5 ml de M9, se acumuló y luego se centrifugó (4000 RPM) y la pelotilla de célula resultante se disolvió en volúmenes mínimos de solución reguladora M9. El resultado fue 2.5 ml de suspensión de células, que se conservó durante la noche a -80°C. Esta suspensión de células se sometió a una reacción
de reticulación repetida utilizando el sobrenadante conservado de la reacción de reticulación inicial. La suspensión de células se dividió en porciones como 500 µl en cuatro tubos Nunc de 50 ml y a cada tubo 25 ml de BetVl (sobrenadante conservado) , 10 ml de acetona y 50 µl de glutaraldehído al 25% se adicionaron. La reacción se hizo a temperatura ambiente durante 60 minutos y frecuentemente se mezcló. Las células se recolectaron mediante centrifugación, se lavaron en 10 ml de solución reguladora M9 y se disolvieron en cantidades mínimas de M9. El resultado fue 1.5 ml de suspensión de células que se conservó a -80°C hasta que se utilizó como un tratamiento de terapia inmune. 15.3 Tratamiento de terapia inmune sublingual (SLIT) : Los ratones se trataron 5 días en una semana durante un período de 3 semanas con ya sea un medicamento que comprende Betvl enlazado en la superficie de X-37 de La ctoba cill us Acidophil us manufacturado mediante el método de reticulación a temperatura ambiente descrito en el ejemplo 15.2 (2.5 µg Betvl y 2.5 x 109 bacterias por dosis); o composiciones de control que comprenden a) X-37 de Lactoba cill us Acidophil us no tratado (2.5 x 109 bacterias por dosis), b) Betvl que tiene dos concentraciones diferentes (2.5 y 5.0 µg por dosis), o c) solución reguladora. Después de dos semanas de tratamiento de SLIT, los ratones se inmunizaron con 10 µg de Betvl adsorbido a Alumbre y
nuevamente tres semanas de tratamiento. 11 días después de la última inmunización los ratones se sacrificaron, el bazo se aisló, y la célula del bazo se re-estimularon in vi tro como es descrito en seguida. 15.4 Proliferación de células T y producción de citoquina: El tejido del bazo, derivado de los ratones tratados se desmenuzó en suspensiones de células individuales y se lavó en RPMI-1640 (BioWhittaker, Bélgica) . Las células se contaron y se ajustaron a 1.67 x 106 células/mL en RPMI-1640 que contiene 50 µg/mL de gentamicina (Gibco, UK) , Nutridoma al 1% (Roche, Alemania) y monotioglicerol 1.5 mM (Sigma, USA) . 3 x 105 células se adicionaron a cada cavidad de una placa de cultivo de fondo plano de 96 cavidades (Nunc, Dinamarca) y las células se estimularon mediante Betvl (0,5 y 40 µg/mL) . Las células se cultivaron durante 6 días a 37°C y en una atmósfera de C02 al 5%. La proliferación se midió al adicionar 0.5 µCi de 3H-timidina a cada cavidad durante las últimas 18 horas del período de cultivo, seguido por la recolección de las células sobre un recolector de placa de 96 cavidades Tomtec (Tomtec, • USA) y al contar la radiomarca incorporada utilizando un contador de centelleo líquido Wallac Microbeta 1450 (Wallac, Finlandia) . 15.5 Resultados : La respuesta de la célula T se evaluó al medir la proliferación de las células del bazo, aisladas de ratones
sometidos a tratamiento con ya sea conjugados de Lactoba cill us que contienen alérgeno BetVl de polen de abedul covalentemente acoplado o composiciones de control, en la re-estimulación in vi tro con Betvl . La Figura 6 muestra que el pre-tratamiento con los conjugados de Betvl/X-37 de Lactobacill us Acidophilus dio por resultado una proliferación de células del bazo significativamente reducida, que es indicativa de la supresión de las células T reactivas al alérgeno y de esta manera una supresión de la respuesta alérgica. Este no fue el caso, cuando los ratones se pre-trataron con ya sea X-37 de Lactobacillus Acidophilus o Betvl solamente. Ejemplo 16. Uso de una vacuna de Staphylococcus aureus basada en el conjugado de Lactobacillus que comprende nucleasa de S. aureus acoplada a la superficie como un medicamento para el tratamiento de una infección bacteriana en un modelo de animal La nucleasa de antigeno de S . a ureus para el uso en la presente invención se puede producir utilizando el sistema de expresión de L . lactis (Madsen y colaboradores, 1999 Mol Microbiol. 3_2:75-87) y el método descrito en el ejemplo 7. Un conjugado de vacunas se prepara como es descrito en el ejemplo 7 o al utilizar el control optimizado como lo es descrito en el ejemplo 11. La cepa de La ctobacill us utilizada
es la X37 de L . acidophilus , pero otras que muestran un efecto adyuvante alto también son probadas. El efecto adyuvante de las diferentes cepas se prueba en el modelo de célula dendrítica descrita en el ejemplo 18. El conjugado de vacuna que contiene nucleasa acoplada a la superficie a una cepa de Lactobacillus seleccionada se prueba como una vacuna oral en experimentos en ratones. Ratones naive son divididos en cuatro grupos. El Grupo 1 recibe oralmente 300 µL de 108-1012 bacterias por ml; el grupo 2 recibe bacterias no tratadas en la misma concentración; el grupo 3 recibe la proteína de nucleasa sola en una concentración correspondiente aquella de los conjugados; y el grupo 4 recibe solución reguladora de fosfato sola. Los diversos tratamientos se administran oralmente a los ratones una vez al día por tres semanas. Muestras de sangre son tomadas y los anticuerpos específicos para la nucleasa se analizan utilizando los métodos de ELISA. Además otros programas y estrategias de vacunas son probados, por ejemplo una inmunización una semana por cinco semanas o la administración nasal se utiliza en lugar de la administración oral. Ejemplo 17. La manufactura de una vacuna de alergia de acuerdo con el método de la invención, y la administración de la vacuna en un modelo de animal
La tecnología de reticulación química optimizada escrita en el Ejemplo 11 se utiliza para manufacturar una bacteria no patogénica con alérgeno covalentemente enlazado en la superficie de la célula. Este ejemplo se enfoca en la producción de una vacuna con alérgenos de cacahuates o del alérgeno de leche B-lactoglobulina. La manufactura de la vacuna de alergia emplea las siguientes etapas . 17.1. Selección de la cepa Un número de cepas bacterianas se analizan en el modelo de célula dendrítica in vi tro como es descrita es descrito en el ejemplo 18 y por Christensen H.R. y colaboradores, 2002, J Immunology 168 : 171-8. La cepa preferida es una cascara caracterizada por la inducción significante de ya sea una respuesta inmune polarizada de Thl o la inducción de tolerancia hacia el alérgeno exhibido. 17.2. Producción de alérgeno El alérgeno de cacahuate Ara H2 se produce en E . coli utilizando un sistema de expresión génica. El gen que codifica el alérgeno se inserta en un vector de expresión compatible pAMJ297, y se introduce en una cepa de L . lactis, que subsecuentemente se cultiva en el medio de crecimiento en un fermentador como es descrito por Madsen S. y colaboradores, 1999 Mol Microbiol. 3_2: 75-87. El alérgeno se sintetiza y se secreta por las células de L. lactis
recombinantes durante el crecimiento fermentativo. El sobrenadante luego se separa del cultivo de células utilizando por ejemplo la filtración de flujo cruzado. El alérgeno recombinante en el sobrenadante se purifica utilizando los métodos de purificación de proteínas tradicionales, por ejemplo la filtración en gel. El alérgeno resultante se disuelve en una solución reguladora apropiada, por ejemplo M9. El alérgeno de B-lactoglobulina se obtiene como es descrito en el ejemplo 1. 17.3. Producción de biomasa de células bacterianas no patogénicas La cepa seleccionada en la etapa 1, se cultiva en un medio de crecimiento apropiado, empleando un medio complejo, por ejemplo MRS (Oxoid) para la preparación de una vacuna para experimentos en animales y el uso veterinario. Un medio de crecimiento solamente basado en componentes sintéticos se emplea para el cultivo de la cepa para la preparación de una vacuna para el uso humano debido al riesgo de agentes infecciosos, por ejemplo virus y priones, en los componentes del medio de crecimiento de origen de animal. El medio de crecimiento utilizado en la preparación de vacunas para el uso humano también debe cumplir las guías de seguridad expedidas mediante, por ejemplo, la FDA. Después del cultivo en un fermentador, las células bacterianas se separan del medio de crecimiento utilizando por ejemplo la
filtración de flujo cruzado. La células bacterianas se resuspenden en el medio de crecimiento fresco a una solución reguladora apropiada, por ejemplo solución reguladora M9. Mediante la adición de un volumen igual de glicerol colocado en autoclave al 50% las células se pueden almacenar a -80°C por al menos un año. 17.4. Reacción de reticulación y formulación Las bacterias producidas en la etapa 3, y el alérgeno producido en la etapa 2, se reticulan utilizando el método descrito en el ejemplo 6. Las bacterias resultantes con el alérgeno enlazado en la superficie se evalúan en las siguientes pruebas: La cantidad de alérgeno acoplado a la superficie se determina , utilizando inmuno-técnicas por ejemplo al aplicar los anticuerpos específicos de alérgeno, marcados con fluorescencia en una prueba de ELISA. Alternativamente, la cantidad de alérgeno enlazado en la superficie presente en un extracto de las células de la reacción de reticulación se determina como el método en el ejemplo 6 utilizando el alérgeno radioactivamente marcado. Además, la distribución de alérgenos sobre la superficie bacteriana se analiza utilizando los mismos anticuerpos en un análisis microscópico. Las células que contienen alérgeno acoplado a la superficie se suspenden en solución reguladora, por ejemplo, solución reguladora M9 y se almacenan en glicerol a
-80°C como es descrito en la etapa 3. 17.5. Prueba de bacterias con antígeno acoplado a la superficie en un modelo de alergia de animal Las células que contienen el alérgeno acoplado en la superficie de la etapa 4 comprenden una vacuna de prueba que es dividida en alícuotas que contiene 108 a 1011 células. Cuatro grupos, cada uno que contiene 10 ratones se vacunan con la vacuna de prueba o una vacuna de control de acuerdo con el siguiente protocolo: dos grupos reciben cantidades diferentes de vacuna de prueba; un grupo recibe vacuna de control que comprende las células bacterianas sin alérgeno acoplado en la superficie, y el grupo restante recibe vacuna de control que comprende alérgeno purificado. La vacuna se administra oralmente o nasalmente utilizando un modelo de animal como es descrito en Repa y colaboradores, 2004 Clin Exp Immunol. _l:12-8. Alternativamente, un modelo de alergia se utiliza donde los ratones inmunizan inicialmente con 5 µg/mL de alérgeno combinado con adyuvante de toxina de cólera para sensibilizar los animales al alérgeno. Después los ratones se tratan oralmente con los conjugados de vacuna para desensibilizar la respuesta. Esto se evalúa mediante el ensayo de activación esplenocito como es descrito en el ejemplo 15 y la evaluación de los anticuerpos IgE. Un modelo de alergia para la alergia al cacahuate se describe en Xiu-Min Li y colaboradores, J allergy Clin Immunol 2000 106:1
lll
y para B-lactoglobulina en Xiu-Min Li y colaboradores J allergy Clin Immunol 2001 107:4. Estos protocolos se utilizan en la prueba de la presente invención. Ejemplo 18 Efecto Inmuno-estimulador de las bacterias no tratadas y los conjugados Las células dendríticas (DC) desempeñan una función inmunoreguladora de pivote en el balance de células Thl, Th2, y Th3 y están presentes por todas las superficies de la mucosa de un animal o humano. Así, DC pueden se objetivos para la modulación mediante los conjugados de vacuna. En el presente ejemplo los inventores han analizado el efecto inmuno-estimulador de los conjugados de vacuna de la invención sobre DC in vi tro . El modelo de DC se utiliza para seleccionar la cepa bacteriana que estimula la respuesta inmune deseada. Así en el caso de vacunas de patógeno tradicionales, una cepa bacteriana con un efecto adyuvante alto es preferida. Sin embargo, las cepas bacterianas que polarizan el sistema inmune hacia una respuesta de tipo Thl se puede desear para vacunas de alergia, mientras que las cepas bacterianas que favorecen una respuesta de célula T citotóxica CD8+ fuerte pueden ser preferidas en el desarrollo de una vacuna para cáncer. De manera similar, las cepas bacterianas que inducen tolerancia o anti-inflamación pueden ser preferidas en el diseño de conjugados de vacuna para el
tratamiento de enfermedades auto-inmunes. 18.1 Conjugados de vacuna Conjugados de vacuna que contienen beta-galactosidasa acoplada a la superficie a X37 de L . acidophil us se prepararon como es escrito en el ejemplo 10. Células de médula ósea se aislaron y se cultivaron como es descrito por Lutz y colaboradores, J. Immunol . Métodos 1999 223:77, con modificaciones menores. Brevemente, fémures y tibias de dos ratones C57BL/6 hembras, 8-12 semanas (Charles River Breeding Laboratorios, Portage, MI), se removieron y se separaron de los músculos y tendones. Después del empapamiento de los huesos en etanol al 70% durante 2 minutos y el enjuague en PBS, ambos extremos se cortaron con tijeras y la médula se limpió a chorro con PBS utilizando una aguja de calibre 27. Agrupaciones de células se disociaron mediante el pipeteo repetido. La suspensión de células resultantes se centrifugó durante 10 min a 300 x g y se lavó una vez en PBS. Las células se resuspendieron en RPMl 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suplementado con L-glutamina 4 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 2-ME 50 µM, FBS inactivado con calor al 10% (v/v) (Atlanta Biologicals, Norcross, GA) , y 15 ng/ml de GM-CSF de murino. GM-CSF se adicionó como sobrenadante de cultivo al 5-10% (v/v) recolectado de una línea de células que produce GM-CSF (línea de células de mieloma Ag.8.653 transfectadas con GM-CSF) Zal
y colaboradores, 1994 J. Immunol. Methods 223:77. El GM-CSF producido se cuantificó utilizando un equipo de ELISA específico (BD PharMingen, San Diego, CA) . Para enriquecer DC, 10 ml de suspensión de células que contiene 3xl06 leucocitos se sembró por caja petri bacteriológica de 100 mm (día 0) y se incubó durante 8 días a 37°C en una atmósfera de C02 al 5%. 10 ml adicionales de medio recientemente preparados se adicionaron a cada placa del día 3. En el día 6, 9 ml de cada placa se centrifugaron durante 5 min a 300 x g, y la pelotilla de células resultantes se resuspendió en 10 ml de medio fresco, y la suspensión se regresó a la caja. En el día 8, las células se utilizaron para evaluar los efectos de lactobacilli sobre la liberación de citoquina y la expresión de marcadores de superficie como es descrito en seguida. 18.2 Inducción de liberación de citoquina Células no adherentes se pipetearon levemente de las cajas petri que contienen cultivos enriquecidos con DC de 8 días de edad. Las células recolectadas y centrifugadas durante 5 min a 300 x y se resuspendieron en medio suplementado con solamente 10 ng/ml de GM-CSF. Las células se sembraron en placas de cultivo de tejido de 48 cavidades en 1.4 x 106/500 µl/cavidad, y luego a cada cavidad se adicionó (100 µl/cavidad) una de las siguientes soluciones a) solución de X37 de L . a cidophil us conjugado (1-1000 µg/ml) con
LacS, acoplado en la superficie, b) solución de X37 de L . acidophil us (1-1000 µg/ml) no tratado, c) B-galactosidasa de LacS purificada (preparada como es descrito en el ejemplo 3, en una concentración de LacS similar como el conjugado LacS), d) LPS (026:B6 de Escheri chia coli ; Sigma-Aldrinch) a 1 µg/ml se adicionó algunos cultivos como un control positivo. El medio solo o el medio que contiene cuentas de látex de 2-µm ( Polysciences, Warrington, ' PA) se utilizaron como controles no estimulados y negativos, respectivamente. Después de un período de estimulación de 15 h a 37°C en C02 al 5%, el sobrenadante de cultivo se recolectó y se almacenó a -80°C hasta el análisis de citoquina. 18.3 Cuantificación de Citoquina en los sobrenadantes de cultivo IL-12(p70) y TNF-a se analizaron utilizando los equipos de ELISA comercialmente disponibles (BD PharMingen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. IL-10 y IL-6 se analizaron de manera similar utilizando los pares de Ab igualados adquiridos de BD PharMingen. 18.4 Resultados Las células dendríticas estimuladas con conjugados de vacuna mostraron inducción de IL-12 (Figura 7) . Además, la inducción de IL-12 se incrementó con la concentración de conjugado incrementada. Los conjugados de vacuna mostraron inducción de IL-12 similar a aquella de L . acidophil us no
tratado indicando que el componente de adyuvante de la bacteria se conserva en los conjugados de vacuna. La proteína (LacS) utilizada para la conjugación no mostró inducción inmune sola.