MX2007006807A - Expresion regulada de transgenes en el sistema nervioso central de mamiferos. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) para el suministro de transgenes regulables al sistema nervioso central (SNC) de un mamifero. Se proporcionan tambien metodos para el tratamiento de sujetos con trastornos neurodegenerativos mediante el uso de los vectores, y "kits" para construir o usar los vectores o realizar los metodos de la invencion. Se expresan las secuencias transgenicas procedentes de una region promotora/potenciadora que comprende uno o mas sitios de enlace para un factor de transcripcion que responde a un inductor molecular pequeno. Tanto la construccion transgenica y como una construccion para el factor de transcripcion se suministran a las celulas diana. Se puede suministrar el transgen regulable en el mismo vector rAAV que el factor de transcripcion, o en un vector diferente. El factor de transcripcion puede comprender dos cadenas de polipeptidos, v.g., un dominio de enlace de ADN y un dominio de activacion de transcripcion, que forman un dimero activo en la presencia de un dimerizador tal como rapamicina o un analogo no inmunogenico del mismo. Se puede utilizar los vectores, metodos y "kits" de la invencion para suministra genes como AADC o GNDF al cerebro de un sujeto con un trastorno neurodegenerativo tal como la enfermedad de Parkinson, donde la expresion de AADC o GNDF en el cerebro puede regularse subsecuentemente mediante el tratamiento del sujeto con rapamicina o un analogo de rapamicina.

Description

EXPRESIÓN REGULADA DE TRANSGENES EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE MAMÍFEROS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la regulación de genes introducidos por terapia génica, específicamente la regulación de la expresión de transgenes introducidos por transducción en el sistema nervioso central (SNC) de mamíferos . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchas enfermedades humanas están causadas por la expresión anormal de genes. Cuando los genes se expresan por debajo de lo normal, o cuando el producto génico en sí mismo es deficiente, la ausencia del producto génico funcional correspondiente puede tratarse por suministro del producto génico perdido al sujeto. El suministro de proteínas, sin embargo, a menudo es difícil y confiere beneficio solamente durante un tiempo limitado, lo que significa que la proteína debe re-administrarse repetidamente en una base regular, quizá indefinidamente, como es el caso de las enfermedades crónicas. La administración repetida puede ser cara, inconveniente, y puede sufrir de mal cumplimiento por parte del paciente. Además, el nivel de producto génico puede variar drásticamente entre el tiempo justo después de la administración de una dosis y el tiempo justo antes de la administración de la siguiente dosis. Esta variabilidad en el nivel es particularmente problemática para agentes terapéuticos con mala farmacocinética (por ejemplo, vida media corta) o un bajo índice terapéutico. La terapia génica puede usarse para suministrar un gen, en lugar del producto génico, a una célula que muestra expresión subóptima de ese gen. Además de suplementar los genes expresados endógenos por debajo de lo normal o deficientes, la terapia génica también puede usarse para suministrar otros genes que pueden tener un efecto beneficioso cuando se expresan en una célula diana, tal como citoquinas, hormonas, anticuerpos o proteínas modificadas genéticamente. El gen suministrado por terapia génica se menciona en este documento como transgén. Cuando un transgén se expresa de forma estable en la célula diana, la terapia génica tiene el potencial de suministrar el nivel estacionario de un producto génico indefinidamente. La terapia génica solamente tiene que realizarse una vez, o al menos infrecuentemente, en comparación con el suministro repetido de los propios productos génicos. La terapia génica es particularmente preferida como un medio para suministrar proteínas terapéuticas al cerebro, ya que las proteínas administradas sistémicamente probablemente no entrarían en el cerebro debido a la barrera hematoencefálica, y la inyección estereotáxica directa en el cerebro es impracticable para la administración repetida. Terapia Génica Mediada por Virus Adeno -Asociados Se han desarrollado vectores virales para ayudar al suministro eficaz de transgenes a células diana, un proceso mencionado en este documento como transducción. Un sistema viral que se ha usado para el suministro de genes es el virus adeno-asociado (AAV) . El AAV es un parvovirus que pertenece al género Dependovirus . El AAV tiene varias características atractivas no encontradas en otros virus. Primero, el AAV puede infectar un amplio rango de células hospedadoras, incluyendo células guiescentes . La capacidad de infectar células quiescentes hace de AAV una elección particularmente buena para la transducción de tejido del SNC, por ejemplo, cerebro. Segundo, el AAV puede infectar células de diferentes especies. Tercero, el AAV no se ha asociado con ninguna enfermedad humana o animal y no parece alterar las propiedades biológicas de la célula hospedadora después de la integración. De hecho, se estima que el 80-85% de la población humana se ha expuesto al virus. Finalmente, el AAV es estable en un amplio intervalo de condiciones físicas y químicas, que facilitan la producción, almacenamiento y transporte. El genoma de AAV es una molécula de ADN lineal, bicatenaria de aproximadamente 4681 nucleótidos (nt) de longitud. El genoma de AAV generalmente comprende un genoma no repetido no repetido interno flanqueado en cada extremo por repeticiones terminales invertidas (ITR) . Las ITR son de aproximadamente 145 nt de longitud. Las ITR funcionan como orígenes de replicación de ADN y como señales de empaquetamiento para el genoma viral. La parte no repetida interna del genoma incluye dos fases de lectura abierta principales, para los genes de replicación (rep) y cápsida (cap) de AAV. Los genes rep y cap codifican proteínas que permiten al virus replicar y empaquetar el genoma viral en un virión. En particular, se expresa una familia de al menos cuatro proteínas virales a partir de la región rep de AAV; Rep 78, Rep 68, Rep 52, y Rep 40, llamadas de acuerdo con su peso molecular aparente. La región cap de AAV codifica al menos tres proteínas; VP1 , VP2 y VP3. El AAV es un virus dependiente de auxiliar; es decir, generalmente requiere co-infección con un virus auxiliar (por ejemplo, adenovirus, herpesvirus o vaccinia) para formar viriones AAV. En ausencia de co-infección con un virus auxiliar, AAV estabiliza un estado latente en el que el genoma viral persiste como un episoma o se inserta en un cromosoma de la célula hospedadora, pero no se producen viriones infecciosos. La infección posterior por un virus auxiliar "rescata" el genoma integrado, permitiendo que se replique y empaquete su genoma en viriones AAV infecciosos. Aunque AAV puede infectar células de diferentes especies, el virus auxiliar debe ser de la misma especie que la célula hospedadora. Por tanto, por ejemplo, un AAV humano se replicará en células caninas co-infectadas con un adenovirus canino. Los vectores AAV se han diseñado genéticamente para suministrar genes de interés eliminando la parte no repetida interna del genoma de AAV (es decir, rep y cap) e insertando un gen heterólogo (un "transgén") entre las ITR. El transgén puede unirse a un promotor heterólogo. También pueden incluirse señales de terminación, tales como sitios de poliadenilación. Para producir una reserva de AAV recombinante infeccioso (rAAV) que contenga el transgén, se transfecta una línea celular productora adecuada con un vector de expresión AAV que contenga un transgén en sandwich entre ITR de AAV. Las funciones auxiliares y las funciones accesorias de AAV también se expresan en la célula productora. Las funciones auxiliares son aquellas funciones normalmente proporcionadas por genes codificados en AAV (por ejemplo, rep y cap) , y las funciones accesorias son aquellas funciones normalmente proporcionadas por el virus auxiliar cuando el AAV de tipo silvestre (wtAAV) se replica en células co-infectadas con virus auxiliar (por ejemplo, adenovirus) . Los genes que codifican funciones auxiliares en wtAAV deben suministrarse por separado porque se retiran en la construcción de los vectores rAAV para hacer un hueco para las secuencias transgénicas. En presencia de funciones auxiliares y accesorias la construcción del vector que comprende el transgén y las ITR de AAV se replica y empaqueta para formar un virión AAV recombinante (rAAV) . La producción de reservas de rAAV se describe adicionalmente en las Patentes de Estados Unidos N° 5.622.856; 6.001.650; 6.027.931; 6.365.403; 6.376.237; 5.945.335; 6.004.797; y 6.482.633, cuyas descripciones se incorporan por la presente como referencia en su totalidad. La reserva de rAAV preparada de este modo puede después usarse para introducir el transgén en células diana in vi tro, o en un sujeto in vivo, infectando las células diana con rAAV en ausencia de virus auxiliar. A causa de que las células del sujeto carecen de los genes rep y cap y los genes de funciones accesorias, los vectores rAAV son deficientes en la replicación en la célula diana; es decir, no pueden replicarse ni empaquetar adicionalmente sus genomas. De forma similar, sin una fuente de genes rep y cap, wtAAV no puede formarse en las células del sujeto. Regulación de la expresión de transgenes Una desventaja potencial de la terapia génica mediada por AAV, y la terapia génica en general, es la incapacidad de invertir el tratamiento, o modular sus efectos, una vez se ha administrado. A diferencia del suministro de medicaciones tradicionales, que puede interrumpirse en cualquier momento según sea necesario, la terapia génica exitosa proporciona una expresión génica a largo plazo persistente después de la administración del vector. La capacidad de apagar la expresión del transgén es una consideración de seguridad importante en el tratamiento de sujetos humanos. Además, la capacidad de regular negativamente la expresión del transgén sería útil para asegurar el control farmacológico apropiado (dosificación) del producto transgénico en el sujeto. Se han desarrollado diversos sistemas para modular la expresión de transgenes usando pequeños inductores moleculares. Rivera et al. (1996) Nat. Med . 2: 1028-32; No et al. (1996) Proc . Na ti . Acad . Sci . USA, 93: 3346-51; Gossen y Bujard (1992) Proc . Nati . Acad . Sci . USA 89: 5547-51; el sistema GeneSwitch® (Valentis, Inc., Burlingame, California) . Estos sistemas se basan en el uso de factores de transcripción modificados genéticamente cuya actividad está controlada por un pequeño fármaco molecular, y un transgén cuya expresión está dirigida por el factor de transcripción regulado. En dicho sistema, basado en la inducción por rapamicina (mencionada en este documento como "sistema dimerizador" ) , implica la formación de un factor de transcripción funcional del que dependen dos proteínas de fusión sintéticas después de la adición de rapamicina. Rivera et al. (1996) Nat. Med . 2: 1028-32. La rapamicina es un pequeño fármaco molecular biodisponible por vía oral, estrechamente relacionado con el producto natural inmunosupresor FK506, que se une con alta afinidad (200 pM) a la proteína celular FKBP12, cuyo complejo después se une a FRAP. Aunque la rapamicina tiene actividad inmunosupresora intrínseca, se han desarrollado análogos no inmunosupresores que pueden usarse con una secuencia génica de FRAP modificada para promover la transcripción en el sistema dimerizador sin inmunosupresión indeseable. Pollock et al (2000) Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 97: 13221-26. El sistema basado en dimerizador para la regulación genética in vi vo se describe con más detalle en Rivera et al. (1996) Na t . Med . 2 : 1028-32 y en Pollock et al. (2000) Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 97: 13221-26. El sistema dimerizador se ha adaptado para su uso con vectores virales para suministrar genes al músculo (Ye et al. (1999) Science 283: 88-91; Rivera et al. (1999) Proc. Nati . Acad. Sci . USA 96: 8657-62; Johnston et al. (2003) Mol . Ther. 7: 493-7), el hígado (Auricchio et al. (2002) Gene Ther. 9: 963-71), y el ojo (Auricchio et al. (2002) Mol . Ther. 6: 238-42). El sistema dimerizador también es un componente de la plataforma de Tecnología de Transcripción ARGENT de ARIAD Pharmaceuticals, Inc. (Cambridge, Massachusetts). Esta tecnología se describe adicionalmente en la Patente de Estados Unidos N° 6.043.082 de Crabtree et al., que describe el sistema basado en dimerizador ARGENT en líneas generales, y la Patente de Estados Unidos N° 6.649.595 de Clackson et al . , que describe sistemas basados en dimerizador usando rapamicina o un análogo de rapamicina, que incluye dominios de unión a ADN compuestos, el dominio de activación de la transcripción p65 y análogos de rapamicina con inmunosupresión reducida. Las descripciones de las Patentes de Estados Unidos N° 6.043.082 y 6.649.595 se incorporan por la presente como referencia en su totalidad. El sistema dimerizador tiene la ventaja de estar completamente humanizado, ya que las secuencias de los componentes funcionales de las proteínas de fusión de activación transcripcional derivan todas de proteínas humanas, reduciendo de este modo la probabilidad de una respuesta inmune adversa en seres humanos. Rivera et al. (1999) Proc . Na ti . Acad . Sci . USA 96: 8657-62. Enfermedad de Parkinson La. enfermedad de Parkinson (PD) es un ejemplo de una enfermedad que puede ser susceptible a terapia génica, particularmente terapia génica con AAV. PD es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común en los Estados Unidos, que afecta a más de un millón de personas. PD se caracteriza por una disminución a los movimientos espontáneos, dificultad al caminar, inestabilidad postural, rigidez y temblores. Estos signos clínicos son un resultado directo de la degeneración de las neuronas pigmentadas (es decir, neuronas dopaminérgicas) en la sustancia negra de la región de los ganglios básales del cerebro. La degeneración progresiva de la sustancia negra conduce a una disponibilidad disminuida de dopamina, ya que las neuronas pigmentadas de la sustancia negra son los sitios de síntesis de este importante neurotransmisor de catecolamina. La dopamina se sintetiza en las terminaciones nerviosas terminales de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra, específicamente la parte compacta de la sustancia negra. Los nervios dopaminérgicos se proyectan en el cuerpo estriado, específicamente inervando el putamen y el núcleo caudado. Tres enzimas son necesarias para la biosíntesis eficaz de dopamina: tirosina hidroxilasa (TH) , guanosina trifosfato ciclohidrolasa I (GCH) , y L-aminoácido aromático descarboxilasa (AADC) . La tirosina hidroxilasa añade un grupo hidroxilo al aminoácido tirosina creando L-dihidroxifenilalanina (L-dopa) . GCH cataliza la primera etapa y limitante de la velocidad de la biosíntesis de BH4, que es un cofactor necesario para la actividad TH. Finalmente, AADC retira el grupo carboxilo terminal de L-dopa para producir dopamina. El tratamiento de PD implica actualmente la administración oral de L-dopa, a menudo en combinación con un inhibidor periférico de AADC. Según progresa PD, la mayoría de los pacientes experimenta una reducción en el contenido de AADC en regiones afectadas del cerebro (es decir, la sustancia negra) . Como AADC es necesaria para la conversión de L-dopa en dopamina, se necesitan dosis en escala de L-dopa para la eficacia terapéutica, pero esto a menudo provoca efectos secundarios aumentados. Además, como la sustancia negra se deteriora progresivamente, el agotamiento de AADC continúa sin disminución, alcanzando a menudo un nivel en el que el beneficio terapéutico derivado de la administración de L-dopa ya no se consigue. AADC Un enfoque basado en terapia génica para el tratamiento de PD es suministrar genes que codifican una o más enzimas implicadas en la biosíntesis de dopamina, tal como AADC. La AADC suplementaria restaura la eficacia del tratamiento de L-dopa. Los vectores derivados de AAV y métodos de tratamiento de PD por suministro y expresión de AADC en el cerebro de sujetos mamíferos se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2002/0172664, cuya descripción se incorpora por la presente como referencia en su totalidad. La enfermedad de Parkinson (PD) se caracteriza por la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra y una disminución grave de dopamina en el estriado. Hornykiewicz (1975) Nati . Inst . Drug Abuse Res . Monogr . Ser. 13-21. El modelo de 6-OHDA se produce lesionando químicamente el haz del prosencéfalo medio que se proyecta desde la sustancia negra al estriado y se parece histopatológicamente a PD. Ungerstedt (1971) Acta Physiol . Scand . Suppl . 367: 69-93. Las ratas que tienen una lesión unilateral por 6-OHDA en un hemisferio producen una actividad de giro contralateral rápido en respuesta a dosis terapéuticas de L-dopa o agonistas del receptor de dopamina. Ungerstedt (1971) . Estudios previos han demostrado que la transferencia de un gen que codifica AADC humana (hAADC) al estriado de ratas o primates no humanos y que suministra L-dopa de forma exógena puede restaurar la dopamina a niveles eficaces y disminuir los requisitos de L-dopa en modelos animales de Enfermedad de Parkinson (PD) . Bankiewicz et al. (2000) Exp . Neurol . 164: 2-14; Sanchez-Pernaute et al. (2001) Mol . Ther. 4: 324-30. GDNF Otro enfoque basado en terapia génica para el tratamiento de PD es suministrar genes que bloqueen o ralenticen la aparición del proceso degenerativo. El factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) es un factor neurotrófico potente que ha demostrado potenciar la supervivencia de neuronas DA tanto in vi tro como en modelos animales de PD in vivo (Bjorklund et al., Brain Res . (2000) 886: 82-98, Bohn, M. C, Mol . Ther. (2000) 1: 494-496; et al., J. Neural Transm . Suppl . (2000) 58: 181-191) , cuyas descripciones se incorporan por la presente como referencia en su totalidad. Los vectores derivados de AAV y métodos para el tratamiento de PD por suministro y expresión de GDNF en el cerebro de sujetos mamíferos se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/0050273, cuya descripción se incorpora por la presente como referencia en su totalidad.

Aunque la expresión de AADC o GDNF en el cerebro de pacientes con Parkinson puede ser beneficiosa, la sobreexpresión de los genes puede conducir a efectos secundarios dañinos. Los vectores típicos usados en terapia génica se diseñan para incorporar fuertes promotores constitutivos que pretenden maximizar la expresión global del transgén en el sujeto para asegurar un efecto terapéutico. Muchos estudios previos han intentado maximizar la expresión de esas pocas células que se transducen, que puede ser un objetivo razonable cuando se espera que la eficacia de transducción sea relativamente baja, y cuando se pretende que el producto transgénico se secrete de las células transducidas en la circulación general. Varios estudios anteriores de expresión transgénica regulada por dimerizador han implicado dichas proteínas secretadas. Rivera et al. (1996) Nat . Med . 2 : 1028-32; Rivera et al. (1999) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 96: 8657-62; Ye et al. (1999) Science 283: 88-91; Pollock et al. (2000) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 97: 13221-26; Auricchio et al. (2002) Gene Ther. 9: 963-71; Johnston et al. (2003) Mol . Ther . 7: 493-7; Auricchio et al. (2002) Mol . Ther . 6: 238-42. En contraste con las proteínas secretadas cuya producción está combinada en el sistema circulatorio, el beneficio terapéutico no puede conseguirse si se sobreexpresan productos transgénicos no secretados en algunas células pero de los que otras carecen completamente. La terapia génica usando proteínas no secretadas puede requerir que la expresión del transgén esté regulada a niveles deseables en cada célula transfectada, haciendo particularmente importante que la expresión de dichas proteínas sea regulable después de la transducción. La terapia génica de enfermedades neurodegenerativas y otros trastornos del SNC es un campo en expansión (Tinsley y Eriksson (2004) Acta Neurol . Scand . 109: 1-8) y la regulación de los transgenes es probable que sea una necesidad para los propósitos tanto del control como de la seguridad de la dosificación. Aunque la expresión regulada de genes puede que no sea necesaria en el caso de terapia con AADC a causa de gue la producción de dopamina en principio puede controlarse por el suministro exógeno de su precursor L-dopa, la regulación puede ser beneficiosa para controlar de forma exacta la dosis de enzima suministrada, o para realizar la terminación de la terapia si se requiere. La regulación probablemente será un requisito para el suministro génico de factores neurotróficos (tales como GDNF) donde la sobreexpresión tendría efectos nocivos, estando determinado el grado requerido de control por la aplicación específica. Existe la necesidad de un método para regular la expresión de genes introducidos en el SNC (por ejemplo, el cerebro) de un sujeto por terapia génica, y vectores que posibiliten dicha regulación. Específicamente, existe la necesidad de métodos para regular la expresión de transgenes en el cerebro de un sujeto con una enfermedad neurodegenerativa, tal como PD. Preferiblemente, el sistema regulador tendría un nivel de fondo bajo de expresión transgénica en condiciones de represión, pero también mostraría una proporción de inducción elevada. El sistema óptimo también comprendería componentes funcionales derivados exclusivamente de proteínas humanas para minimizar las oportunidades de reacciones inmunes adversas durante la terapia génica humana. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Estas y otras necesidades en la técnica se cumplen por la presente invención, que proporciona vectores, métodos y kits para la terapia génica mediada por AAV en la que la expresión del transgén en las células diana del sistema nervioso puede regularse usando un inductor. En un aspecto, la invención se refiere a vectores AAV recombinantes (rAAV) en los que la expresión de transgenes puede regularse después de que el transgén se haya introducido por transducción en el SNC (por ejemplo el cerebro) de un sujeto. En una realización, la regulación se realiza usando un factor de transcripción que comprende dos componentes polipeptídicos, siendo dicho factor de transcripción activo solamente cuando los dos componentes están unidos entre sí, y donde los componentes se unen entre sí solamente en presencia de un inductor. En una realización, los dos polipéptidos comprenden una fusión de dominio de unión a ADN y una fusión de dominio de activación. Una fusión de dominio de unión a ADN ejemplar comprende dos dominios de unión a ADN del factor de transcripción humano Zif268, un homeodominio derivado de Oct-1, y tres dominios de unión a fármaco del receptor citosólico para FK506. Una fusión de dominio de activación ejemplar comprende el dominio de unión a rapamicina de FRAP humana fusionado con el dominio de activación transcripcional derivado de la subunidad p65 de NFKB. En una realización, el primer vector rAAV comprende el transgén y un segundo vector rAAV comprende la secuencia de los componentes del factor de transcripción. En otra realización un único vector rAAV comprende las secuencias de los componentes del factor de transcripción y el transgén. En una realización, la regulación se consigue por administración de un inductor. En otra realización el inductor es un dimerizador, tal como rapamicina o un análogo no inmunosupresor de la misma, por ejemplo, AP21967. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos de tratamiento de sujetos con vectores rAAV en los que la expresión transgénica puede regularse después de que se haya introducido por transducción el transgén en el SNC (por ejemplo, el cerebro) de un sujeto. En una realización, el método de tratamiento implica la administración de un inductor, por ejemplo un dimerizador, tal como rapamicina o un análogo no inmunosupresor de la misma, por ejemplo, AP21967. En otro aspecto más, la invención se refiere a kits para construir los vectores, o realizar los métodos de la invención. En una realización, el kit comprende un primer vector rAAV que tiene una región polienlazadora para clonar un transgén de interés para un usuario. En otra realización, el kit comprende adicionalmente un segundo vector rAAV que codifica un factor de transcripción que puede regular la expresión del transgén clonado en el primer vector rAAV. En otra realización más, el kit comprende un inductor, por ejemplo un dimerizador tal como rapamicina o un análogo no inmunosupresor de la misma, por ejemplo, AP21967. En una realización, la invención implica el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa humana, por ejemplo, enfermedad de Parkinson (PD) . En algunas realizaciones, el transgén regulado es AADC o GDNF, aunque en general el transgén regulado puede ser cualquier gen cuya expresión en el tejido diana se desee. Estas y otras realizaciones de la presente invención se les ocurrirán fácilmente a los especialistas en la técnica en vista de la descripción de este documento. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIG. ÍA es un diagrama de un vector rAAV que codifica los dominios de activación y unión a ADN de un factor de transcripción para la regulación de la expresión transgénica (AAV-CMV-TF) . Dichos vectores se mencionan en este documento como vectores del factor de transcripción. La FIG. IB es un diagrama de un vector AAV recombinante que codifica hAADC (AAV-Zl2 -hAADC) , cuya expresión puede regularse por adición de rapamicina o derivados de la misma. Dichos vectores se mencionan en este documento como vectores de expresión.

La FIG. ÍC es un diagrama de un vector AAV recombinante que codifica hAADC (AAV-CMV-hAADC2) , cuya expresión está dirigida por el promotor CMV constitutivo. La FIG. 2 muestra los resultados de experimentos en los que se transducen células D7-4 con diversas construcciones rAAV y posteriormente se tratan con el análogo de rapamicina AP21967 a 0, 5 ó 25 nM. También se muestra un control no transducido. Los valores "OD" se refieren a la expresión relativa de AADC (medida por OD05 en un ELISA de expresión de AADC) calculada usando una curva patrón obtenida con células transducidas con lotes de referencia de AAV-CMV-hAADC2. La FIG. 3 es una programación para los experimentos en los que se mide la respuesta rotatoria a L-dopa en ratas lesionadas con 6-OHDA como función del tratamiento con rapamicina . La FIG. 4 muestra la respuesta rotatoria a 5 mg/kg de L-dopa en ratas lesionadas con 6-OHDA, expresada en giros contralaterales por hora, como función del tiempo a lo largo de la programación mostrada en la FIG. 3. Las ratas se infundieron con excipiente solo (control) o con vectores que codifican hAADC regulable y los factores de transcripción correspondientes. Los datos no se presentan para la primera y segunda semanas. La infusión tuvo lugar en el día O, como se ilustra en la FIG. 3, que es la fecha a partir de la que se mide la cantidad de semanas (por ejemplo, "3 semanas" se refiere al día 21 después de la infusión) . Por simplicidad, los grupos de cuatro inyecciones de rapamicina al día ("rap") mostrados en la FIG. 3 se representan como una única flecha en la FIG. 4. La FIG. 5A muestra los resultados de inmunohistoquímica para AADC en el estriado de una rata tratada con rapamicina 7 semanas después de la infusión con vectores AAV que llevan las secuencias necesarias para la expresión regulada por rapamicina de hAADC. La barra a escala representa 75 µm. La FIG. 5B muestra los resultados de un experimento similar al mostrado en la FIG. 5A pero en el que la rata no está tratada con rapamicina. La FIG. 6 muestra los resultados de inmunohistoquímica para AADC en secciones de cerebro montadas completas de ratas representativas en tres grupos de tratamiento obtenidas 7 semanas después de la infusión: A: vector infundido (+) rap; B: vector infundido (-) rap; C: excipiente infundido (+) rap. Como en la FIG. 4, las ratas se infundieron con excipiente solo (FIG. 6C) , o con vectores que codifican hAADC regulable y los correspondientes factores de transcripción (FIGS. 6A y 6B) .

Los animales de las FIGS . 6A y 6C se trataron posteriormente con rapamicina (como se muestra en la FIG. 3) pero el animal de la FIG. 6B no. El hemisferio izquierdo es el lado de la lesión con 6-OHDA y las infusiones intraestriadas de vector (o excipiente) , y el hemisferio derecho muestra la tinción endógena de fibras positivas a AADC en una rata intacta. La FIG. 7 muestra la expresión de AADC 7 semanas después de la infusión, medida por análisis de transferencia de western, en los tres grupos de tratamiento analizados con referencia a la FIG. 6. Los paneles superiores son imágenes de las bandas de AADC y ß-actina observadas en electroforesis en gel de proteínas de los cerebros de animales representativos de cada uno de los tres grupos de tratamiento. La ß-actina se incluye como control. El gráfico de barras muestra las intensidades de imagen integradas medias, y desviaciones típicas, de las bandas de proteína para las bandas AADC para tres animales en cada grupo de tratamiento. La FIG. 8A es un diagrama de un vector rAAV (AAV-TF-Z8-hGDNF) que comprende un transcrito que codifica la fusión del dominio de activación y la fusión del dominio de unión a ADN del factor de transcripción, y un transcrito regulable que codifica el transgén hGDNF, en el que la expresión de hGDNF puede regularse por adición de rapamicina o derivados de la misma. La FIG. 8B es un diagrama de un vector similar al mostrado en la FIG. 8A, excepto que la expresión del dominio de unión a ADN de factor de transcripción está dirigido por un promotor SV40 en un transcrito diferente al de la expresión del dominio de activación, y el dominio de activación se expresa a partir de la cadena opuesta (es decir, en la dirección opuesta) . La FIG. 8C es un diagrama de un vector AAV recombinante que codifica hGDNF, cuya expresión está dirigida por el promotor CMV constitutivo (AAV-CMV-hGDNF) . La FIG. 9 muestra la expresión de GDNF, en picogramos (pg) , para células HeLa D7-4 transfectadas de forma transitoria con un plásmido TF-GDNF regulado (AAV-TF-Z8-hGDNF) o un plásmido CMV-GDNF constitutivo (AAV-CMV-hGDNF) , como función del tratamiento con rapamicina 0, 5 ó 25 n . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique de otro modo, métodos convencionales de química proteica, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, pertenecientes a la especialidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties ( . H. Freeman and Company, 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry ( orth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edición, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990). I . DEFINICIONES Todos los términos científicos y técnicos usados en esta solicitud tienen los significados usados habitualmente en la técnica salvo que se especifique de otro modo. Como se usa en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados. Debe observarse que, como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referencias plurales salvo que el contenido indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, una referencia a "un vector" incluye una mezcla de dos o más de dichos vectores, y similares . El término "transgén", como se usa en este documento, se refiere a cualquier gen a suministrar a una célula diana independientemente del origen del transgén, incluyendo, en algunas realizaciones, copias adicionales de, o variantes de secuencia de genes endógenos ya presentes en la célula diana. Los transgenes pueden ser secuencias génicas o secuencias génicas parciales obtenidas de cualquier organismo, variantes de secuencia modificadas genéticamente de dichos genes, o secuencias de ADN sintético (de origen no natural) . Los transgenes pueden dirigir la producción de ARN mensajeros que codifican proteínas, o pueden codificar moléculas de ARN biológicamente activas, tales como secuencias de ARN antisentido, ribozima, de formación de triple hélice, ARNi y otras secuencias de ARN. Un "transgén regulable", como se usa en este documento, es un gen cuya expresión puede alterarse por la administración de un inductor después de que el genoma se haya introducido por transducción en una célula diana. La regulación de la expresión del transgén terapéutico proporciona un control farmacológico del nivel de producto transgénico. "Cásete de expresión" se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de la secuencia o secuencias o el gen o genes de interés . El cásete de expresión incluye un promotor o promotor/potenciador gue está unido de forma operativa a (para dirigir la transcripción de) la secuencia o secuencias o gen o genes de interés, y a menudo también incluye una secuencia de poliadenilación. En ciertas realizaciones de la invención, el cásete de expresión descrito en este documento puede estar contenido en una construcción de virus adeno-asociado. "Recombinante" como se usa en este documento para describir una molécula de ácido nucleico significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc, viral, semi-sintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación, no está asociado con todo o parte del polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante. En general, el gen de interés se clona y después se expresa en organismos transformados, como se describe a continuación adicionalmente. El organismo hospedador expresa el gen extraño para producir la proteína en condiciones de expresión. Una "secuencia codificante" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas (o "elementos de control") . Los límites de la secuencia codificante pueden determinarse por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxi) . Una secuencia codificante puede incluir, aunque sin limitación, ADNc de ARNm viral, procariota o eucariota, ADN genómico de ADN viral o procariota, e incluso secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción puede estar localizada 3' de la secuencia codificante. Los "elementos de control" típicos incluyen, aunque sin limitación, promotores de la transcripción, elementos potenciadores de la transcripción, señales de terminación de la transcripción, secuencias de poliadenilación (localizadas 3' del codón de parada de la traducción), secuencias para la optimización del inicio de la traducción (localizadas 5' de la secuencia codificante), y secuencias de terminación de la traducción. La expresión "ácido nucleico" incluye ADN y ARN, y también sus análogos, tales como los que contienen estructuras modificadas (por ejemplo, fosforotioatos, etc.), y también ácidos péptido nucleicos (PNA), etc. La invención incluye ácidos nucleicos que comprenden secuencias complementarias a las descritas anteriormente (por ejemplo, para propósitos antisentido o de sondeo) .

El término "transfección" se usa para hacer referencia a la captación de ADN extraño por una célula. Una célula se ha "transfectado" cuando se ha introducido ADN exógeno en el interior de la membrana celular. Se conocen en líneas generales varias técnicas de transfección en la técnica. Véase, por ejemplo, Graham et al. (1973) Virology, 52: 456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu et al. Gene 13: 197, 1981. Dichas técnicas pueden usarse para introducir uno o más restos de ADN exógeno, tal como un vector plasmídico u otras moléculas de ácido nucleico, en células hospedadoras adecuadas. El término se refiere tanto a la captación estable como transitoria del material genético. El término "transducción" indica el suministro de una molécula de ADN a una célula receptora in vivo o in vi tro, mediante un vector, tal como un vector de virus adeno-asociado recombinante. El término "heterólogo" que se refiere a secuencias de ácido nucleico tales como secuencias génicas y secuencias de control, indica secuencias que no están normalmente unidas juntas, y/o no están normalmente asociadas con una célula particular. Por tanto, una región "heteróloga" de una construcción de ácido nucleico o un vector es un segmento de ácido nucleico en o unido a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de una construcción de ácido nucleico podría incluir una secuencia codificante flanqueada por secuencias no encontradas en asociación con la secuencia codificante en la naturaleza. Otro ejemplo de una secuencia codificante heteróloga es una construcción en la que la propia secuencia codificante no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo) . De forma similar, una célula transformada con una construcción que no está presente normalmente en la célula se consideraría heteróloga para propósitos de esta invención. La variación alélica o acontecimientos de mutación de origen natural no da lugar a ADN heterólogo, como se usa en este documento. La expresión "elementos de control" se refiere colectivamente a regiones promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores cadena arriba, orígenes de replicación, sitios de entrada internos de ribosomas ("IRES"), potenciadores, y similares, que proporcionan colectivamente la replicación, transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula receptora. No todos estos elementos de control tienen que estar siempre presentes siempre que la secuencia codificante seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una célula hospedadora apropiada. La expresión "región promotora" se usa en este documento en su sentido ordinario para hacer referencia a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, en la que la secuencia reguladora deriva de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3'). "Unido de forma operativa" se refiere a una disposición de elementos en la que los componentes descritos están configurados para realizar su función habitual. Por tanto, los elementos de control unidos de forma operativa a una secuencia codificante son capaces de realizar la expresión de la secuencia codificante. Los elementos de control no tienen que estar contiguos con la secuencia codificante, siempre que funcionen dirigiendo la expresión de la misma. Por tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias transcritos aún no traducidas intercaladas entre una secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia promotora aún puede considerarse "unida de forma operativa" a la secuencia codificante. Por "aislado" cuando se hace referencia a una secuencia de nucleótidos, se entiende que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. Por tanto, una "molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido particular" se refiere a una molécula de ácido nucleico que está sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican el polipéptido sujétesin embargo, la molécula puede incluir algunas bases adicionales o restos que no afectan de forma nociva a las características básicas de la composición. Un "vector" es capaz de transferir secuencias de ácido nucleico a células diana (por ejemplo, vectores virales, vectores no virales, vehículos particulados, y liposomas) . Típicamente, "construcción de vector", "vector de expresión", y "vector de transferencia génica", significan cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un ácido nucleico de interés y que puede transferir secuencias de ácido nucleico a células diana. Por tanto, la expresión incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales. Por "sujeto" se entiende cualquier miembro del subfilo cordados, incluyendo, sin limitación, seres humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpancés y otros simios y especies de monos; animales de granja tales como vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos; animales domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cobayas; aves, incluyendo aves domésticas, salvajes y de caza tales como pollos, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos, y similares. El término no indica una edad particular. Por tanto, pretenden cubrirse individuos tanto adultos como recién nacidos. Por "dosis o cantidad terapéuticamente eficaz" de un vector AAV que codifica un factor de transcripción regulable y/o transgén se entiende una cantidad que cuando el vector AAV se administra como se describe en este documento, consigue una respuesta terapéutica positiva, por ejemplo, mejora los síntomas o evita la progresión de un trastorno neurológico. Por ejemplo, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector AAV, que provoca la expresión de un agente terapéutico (por ejemplo, AADC, GDNF) en un sujeto que se está tratando para la enfermedad de Parkinson, puede mejorar los síntomas, por ejemplo, mejorar la función motora o reducir los temblores en reposo. La cantidad exacta del vector AAV necesaria variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, edad, y estado general del sujeto, la gravedad de la afección a tratar, y la composición particular usada, modo de administración, y similares. II . MODOS DE REALIZAR LA INVENCIÓN Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a moléculas o parámetros de proceso particularmente ejemplificados ya que estos pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en este documento es para el propósito de describir realizaciones particulares de la invención solamente, y no se pretende que sea limitante. Además, la práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique de otro modo, métodos convencionales de virología, microbiología, biología molecular, técnicas de ADN recombinante e inmunología todas las cuales pertenecen a la especialidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) ; y Fundamental Virology, 2a Edición, vol. I y II (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds.) . Aungue pueden usarse varios métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en este documento . La presente invención proporciona construcciones de vector, métodos y kits para la regulación de la expresión de transgenes en una célula diana. En una realización, las secuencias necesarias para la introducción por transducción de un transgén regulable en una célula diana se proporcionan en una pluralidad de moléculas de vector AAV recombinantes diferentes. Los Ejemplos 1 y 2 demuestran la construcción y uso de una realización de doble vector de la presente invención. En otra realización, un único vector AAV recombinante lleva todas las secuencias necesarias para la introducción por transducción de un transgén regulable en una célula diana. El Ejemplo 3 demuestra la construcción y uso de una de dichas realizaciones de vector único de la presente invención. En una realización, se suministra una forma regulable del gen AADC a células diana. Los Ejemplos 1 y 2 demuestran el suministro de una forma regulable del gen AADC. En otra realización, se suministra una forma regulable del gen GDNF a células diana. El Ejemplo 3 demuestra el suministro de una forma regulable del gen GDNF.

El término transgén, como se usa en este documento, se refiere a cualquier gen a suministrar a una célula diana independientemente del origen del transgén, incluyendo, en algunas realizaciones, copias adicionales de, o variantes de secuencia de, genes endógenos ya presentes en la célula diana. Los transgenes pueden ser secuencias génicas o secuencias génicas parciales obtenidas de cualquier organismo, variantes de secuencia modificadas genéticamente de dichos genes, o secuencias de ADN sintético (de origen no natural) . Los transgenes pueden dirigir la producción de ARN mensajeros que codifican proteínas, o pueden codificar moléculas de ARN biológicamente activas, tales como secuencias de ARN antisentido, ribozima, de formación de triple hélice, ARNi u otras secuencias de ARN. Un transgén regulable, como se usa en este documento, es un gen cuya expresión puede alterarse por administración de un inductor después de que el gen se haya introducido por transducción en una célula diana. La regulación de la expresión del transgén terapéutico proporciona un control farmacológico del nivel de producto transgénico. En realizaciones preferidas, el inductor es un fármaco molecular pequeño. Uno de dichos pequeños fármacos moleculares es rapamicina. En una realización, el sistema de expresión génica regulable de la presente invención hace uso de la dimerización específica de la inmunofilina FKBP y el homólogo lipídico de quinasa FRAP en presencia de rapamicina o AP21967, un análogo inmunosupresor de rapamicina, para producir un complejo de factor de transcripción activo que activa específicamente un promotor inducible. Rivera et al. (1996) Nat . Med . , 2: 1028-32. La estructura de AP21967 se proporciona a continuación.

AP21967 AP21967 (masa molecular 1017,4 Da) es el análogo de 7-metilindolilo del Compuesto 69 de la Patente de Estados Unidos ?° 6.649.595 (la patente '595), y puede prepararse como se describe en el Ejemplo 5 del mismo sustituyendo 7-metilindol por dimetoxibenceno . AP21967 es idéntico al Compuesto 71 de la patente '595 excepto en que AP21967 tiene un grupo 7-metilo en el anillo de indol.

También pueden usarse otros análogos de rapamicina sin desviarse del alcance de la presente invención. Los análogos de rapamicina que no interaccionan con la FRAP endógena en el sujeto no tendrán los efectos inmunosupresores e inhibidores del ciclo celular potencialmente indeseables de la rapamicina. Pollock et al. (2000) Proc . Nati . Acad . Sci . USA 97: 13221-26. Pueden crearse formas mutantes de FRAP que retienen la capacidad de unirse a estos análogos de rapamicina no inmunosupresores para su uso en la parte FRB de la proteína de fusión del dominio de activación del sistema dimerizador. Véase, por ejemplo, Pollock et al. (2000). Expresión regulada de AADC Se realizan experimentos usando la regulación dependiente de rapamicina, mediada por el vector AAV de la expresión de un transgén AADC en células HeLa D7-4 in vi tro, y en un modelo de roedor de enfermedad de Parkinson (PD) in vivo . La expresión del transgén AADC humano (hAADC) se hace dependiente de la reconstitución de un factor de transcripción funcional (TF) por la rapamicina dimerizadora usando vectores descritos adicionalmente en el Ejemplo 1 y las FIGS. ÍA y IB. Se usa un vector AAV de factor de transcripción para suministrar el dominio de unión a ADN y el dominio de activación del factor de transcripción, y se usa un vector AAV de expresión para suministrar el transgén hAADC bajo el control de un promotor regulable. Regulación de AADC in vi tro Se describen experimentos que demuestran la expresión de AADC dependiente de dimerizador en células humanas in vi tro en el Ejemplo 1. El dimerizador usado en el Ejemplo 1, AP21967, es un análogo de rapamicina no inmunosupresor que es aproximadamente 3 veces menos potente que la rapamicina. Los resultados se muestran en la FIG. 2, en la que los datos de más a la derecha muestran la expresión de hAADC dependiente de la dosis de rapamicina (de AAV-Z12-hAADC) en células co-transducidas con un vector que codifica el factor de transcripción dependiente de dimerizador (AAV-CMV-TF) . Los datos de ELISA muestran que la expresión de AADC es 9 veces mayor en presencia de AP21967 25 nM que en ausencia de dimerizador. La concentración eficaz máxima de AP21967 es 25 nM, que da niveles estacionarios de expresión transgénica in vi tro . La expresión de hAADC a partir del promotor regulable en AP21967 25 nM es casi la mitad del nivel de hAADC bajo el control del promotor CMV constitutivo (AAV-CMV-hAADC2) (FIG. ÍC, y descrito en Sanftner et al. (2004) Mol . Ther . 9: 403-9) . Las células que tienen ambos vectores (AAV-Z12 -hAADC y AAV-CMV-TF) muestran solamente un nivel bajo de producción de AADC en ausencia de AP21967, es decir, el sistema no es "permeable" . La ausencia de permeabilidad puede ser crítica en terapia génica para asegurar que los transgenes pueden apagarse totalmente si es necesario, y para proporcionar un alto intervalo de regulación farmacológica. .Regulación de AADC in vivo Los mismos vectores usados para demostrar la transducción mediada por AAV de hAADC regulada por dimerizador in vi tro (FIGS. ÍA y IB) se ensayan in vivo en el modelo de rata de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) de la enfermedad de Parkinson, un modelo quirúrgico de desnervación del estriado, como se describe en el Ejemplo 2. El programa de tratamiento se presenta esquemáticamente en la FIG. 3. Se introduce por transducción a las ratas con Parkinson tanto AAV-CMV-TF y AAV-Z12 -hAADC y después se mide su comportamiento rotacional después de una serie de tratamientos con rapamicina, como se muestra en la FIG. 4.

Se usa rapamicina en los experimentos in vivo, en lugar de AP21967 que se usó in vi tro, simplemente porque la dosificación apropiada de rapamicina se ha determinado previamente. La rapamicina dimerizadora tiene muchas propiedades favorables para su uso como inductor en terapia génica humana, pero sus propiedades inmunosupresoras inherentes pueden limitar su utilidad. Los análogos no inmunosupresores de rapamicina, tales como AP21967, pueden ser inductores superiores de la expresión transgénica, particularmente en el tratamiento de sujetos humanos. La dosificación apropiada de AP21967 en animales y sujetos humanos in vivo puede determinarse por métodos experimentales convencionales, incluyendo ensayos clínicos. La transducción del vector de hAADC regulado en combinación con la administración de L-dopa y rapamicina provoca efectos de comportamiento en ratas lesionadas con 6-OHDA coherentes con la producción de niveles significativos de dopamina. Como se ilustra en la FIG. 4, el tratamiento con rapamicina aumenta reversiblemente la expresión de hAADC en el estriado lesionado, como es evidente por una respuesta rotacional alterada a 5 mg/kg de L-dopa que es reversible después de la retirada de rapamicina en el grupo y de vector infundido (+) rap. La respuesta rotacional del grupo de vector infundido (+) rapamicina a L-dopa está significativamente aumentada por encima tanto del grupo de vector infundido (-) rapamicina como el grupo de control de excipiente infundido a las 3, 5, y 7 semanas ( P <0,001) inmediatamente después del tratamiento con rapamicina, pero vuelve a niveles casi de control en las semanas 4 y 6. Estos datos demuestran que la expresión de hAADC transgénica puede regularse reversiblemente in vivo en un cerebro de mamífero para afectar al fenotipo de comportamiento. La PCR cuantitativa a tiempo real confirma que las ratas en el grupo de vector infundido (+) rapamicina y el grupo de vector infundido (-) rapamicina se traducen con cantidades iguales de copias del gen hAADC, eliminando la eficacia de transducción diferencial como una posible explicación para los diferentes resultados observados con los dos grupos. Los ensayos de inmunohistoquímica y de expresión de proteínas realizados en el criterio de valoración del estudio (Tabla 1 y FIGS. 5, 6 y 7) confirman los resultados de comportamiento, como se analiza a continuación con detalle. La FIG. 5A demuestra la fuerte tinción inmunohistoquímica para AADC, y por tanto la expresión tansgénica eficaz, en neuronas espinosas medianas en el estriado de una rata del grupo de vector infundido (+) rapamicina, mientras que la FIG. 5B muestra un nivel solamente muy bajo de expresión de AADC en una rata del grupo de vector infundido (-) rapamicina. Las FIGS. 6A-6B presentan imágenes de baja resolución de secciones de cerebro montadas completas teñidas inmunohistoquímicamente para AADC. Los resultados dan una confirmación visual simple del nivel de expresión significativamente mayor de AADC en el hemisferio izquierdo (tratado) de una rata del grupo de vector infundido (+) rapamicina (FIG. 6A) en comparación con el hemisferio izquierdo (tratado) de una rata del grupo de vector infundido (-) rapamicina (FIG. 6B) . Los resultados para el animal del grupo de vector infundido (-) rapamicina son similares a los resultados para el animal de control de excipiente infundido (FIG. 6C) . Análisis serológicos inmunohistoquímicos confirman que los niveles de expresión medidos por recuentos de células positivas están significativamente aumentados cuando el vector se administra en combinación con rapamicina. La Tabla 1 presenta los resultados de recuentos celulares positivos por inmunotinción y estimados derivados de transgenes por estereología cuantitativa de animales inducidos y no inducidos con rapamicina. Los animales inducidos con rapamicina muestran aproximadamente dos veces la propagación anterior a posterior de inmunotinción de AADC, el volumen de propagación de inmunotinción de AADC, y la cantidad de células positivas a AADC en comparación con animales no inducidos. El análisis de proteínas totales muestra una disparidad incluso mayor en los niveles de proteínas. Como se muestra en la FIG. 7, el análisis de transferencia de Western de los niveles enzimáticos de hAADC después de electroforesis en gel de las muestras de proteínas del estriado muestra una expresión significativamente mayor de hAADC en el grupo (+) rapamicina en comparación con el grupo (-) rapamicina. Cuando se resta la expresión de AADC endógena de los datos representados en la FIG. 7, el nivel de hAADC es un 88% inferior en el grupo de (-) rapamicina en comparación con el grupo (+) rapamicina. Los resultados de los experimentos descritos en el Ejemplo 2 indican que la expresión del gen de hAADC está inducida por la rapamicina dimerizadora, aunque el bajo nivel de expresión observado en los animales no inducidos sugiere alguna "permeabilidad" en el sistema regulador in vivo . La razón para la permeabilidad del sistema no está clara, y sin pretender limitarse por la teoría, puede estar causada por la expresión no regulada del promotor mínimo de IL-2 en ausencia de factor de transcripción unido. Sin embargo, el bajo nivel de hAADC observado en ausencia de inducción no es suficiente para provocar una respuesta de comportamiento a la dosis subterapéutica de L-dopa, que sugiere que una pequeña cantidad de expresión génica producida por el promotor inducible en ausencia de agente de inducción puede ser tolerable para esta aplicación particular. La dosificación apropiada de rapamicina (o análogo) para producir el nivel deseado de inducción transgénica in vivo puede determinarse por experimentación en una base caso por caso, como es habitual con protocolos terapéuticos. La dosificación puede ajustarse por ensayo y error en base a mediciones fenotípicas o a marcadores sucedáneos. Las dosificaciones también pueden ajustarse para conseguir una concentración diana predeterminada de rapamicina en el tejido diana o en la sangre del sujeto. Cuando se introducen por inyección intravenosa, las dosificaciones ejemplares pueden variar de 0,01 a 50 mg/kg, preferiblemente de 0,1 a 10 mg/kg, por ejemplo 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mg/kg. En el caso de tratamiento de sujetos humanos, la dosificación puede determinarse por referencia a los resultados de ensayos clínicos o extrapolarse de datos con animales . Los vectores AAV recombinantes pueden introducirse quirúrgicamente en diversas localizaciones en el cerebro, dependiendo del transgén que se está suministrado, su mecanismo de acción, y las células diana deseadas. Por ejemplo, los ganglios básales son grupos de neuronas colocados bajo la corteza. Incluyen el núcleo caudado, el putamen, y el globo pálido. El núcleo caudado y el putamen juntos forman el cuerpo estriado (o simplemente estriado) . El caudado y el putamen están recíprocamente interconectados con la sustancia negra, que consta de la parte compacta de la sustancia negra (SNpc) y la parte reticulada de la sustancia negra. La SNpc es el sitio normal de la biosíntesis de dopamina; la degeneración de SNpc es una evidencia de PD. Transduciendo neuronas del putamen y núcleo caudado del cuerpo estriado con genes que codifican enzimas de la vía biosintética de la dopamina, tales como AADC, puede restaurarse la síntesis de dopamina, superando de este modo una red de SNpc funcionalmente disminuida . Las células del cuerpo estriado pueden transducirse usando una diversidad de técnica conocidas en la técnica. Por ejemplo, una inyección estereotáxica es una técnica quirúrgica común usada por los neurocirujanos para administrar diversos compuestos al SNC. También puede emplearse inyección directa; si se usa esta técnica, pueden usarse mapas anatómicos derivados de exploraciones CT, PET, o MRI por el cirujano para ayudar a la selección del sitio o sitios de inyección. Otras técnicas, incluyendo suministro potenciado por convección (descrito con detalle en la Patente de Estados Unidos N° 6.309.634, incorporada por la presente como referencia en su totalidad) , puede emplearse en los métodos de la presente invención para suministrar viriones rAAV al SNC. Los experimentos descritos en los Ejemplos 1 y 2 implican una realización de doble vector de la presente invención, en la que se usan vectores diferentes para suministrar las proteínas de fusión del factor de transcripción y el transgén. En otras realizaciones, se usan diferentes genes en lugar de hAADC en el vector de expresión. Puede empaquetarse un máximo de aproximadamente 5000-5200 nucleótidos (nt) en un virión AAV, siendo óptimo aproximadamente 4500 nt . Dong et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 2101-12. Dados los otros elementos de secuencia necesarios de los vectores de expresión de rAAV como el ilustrado en la FIG. IB (por ejemplo, regiones ITR, promotor, secuencias de unión al factor de transcripción, etc.), las secuencias transgénicas en el vector de expresión no pueden ser mayores de aproximadamente 2500 nucleótidos (nt) . En esta restricción de tamaño, puede suministrarse cualquier transgén deseado usando las construcciones de vector de expresión de rAAV de una realización de doble vector de la presente invención. Pueden construirse variantes del vector de expresión optimizado con ITR, promotores y regiones de unión al factor de transcripción más cortos para posibilitar el suministro de secuencias transgénicas más largas. Los resultados de los Ejemplos 1 y 2 demuestran que la expresión de un transgén de hAADC dependiente de dimerizador puede regularse en células humanas en cultivo, y en neuronas de rata in vivo, usando una realización mediada por rAAV de vector doble de la presente invención. Regulación de GDNF en un Sistema de Vector Único Como se describe en el Ejemplo 3, se realizan experimentos usando una realización de vector único de la presente invención, en la que se diseña un único vector rAAV para que exprese todas las proteínas necesarias para la regulación dependiente de dimerizador de la expresión de un transgén GDNF. Se proporciona un diagrama de un vector de expresión de hGDNF rAAV regulado en la FIG. 8A, y se proporciona un diagrama de un vector de control con expresión de hGDNF constitutiva (no regulada) como la FIG. 8C. (La FIG. 8B muestra un diseño alternativo para un vector de expresión de GDNF regulado que no se usa en el Ejemplo 3.) Los vectores plasmídicos se introducen por transfección transitoria en células HEK-293 in vi tro. Después las células se tratan con medios que contienen rapamicina 0, 5 ó 25 nM.

Los resultados de ELISA de GDNF realizados tres días después de la transfección se presentan en la FIG. 9. Los datos muestran la expresión sensible a la dosis de rapamicina de GDNF en células transfectadas con la construcción regulada ("plásmido TF-GDNF" , que se refiere a pAAV-TF-Z8-hGDNF) , con una expresión observada máxima aproximadamente una cuarta parte el nivel de expresión de GDNF expresado constitutivamente ("plásmido CNV-GDNF" , que se refiere a pAAV-CMV-hGDNF) . La expresión de GDNF a partir de pCMV-GDNF no aumenta por adición de rapamicina. El experimento descrito en el Ejemplo 3 demuestra que puede construirse una construcción AAV-GDNF regulable de vector único de modo que pueda regularse la expresión de GDNF en células humanas en cultivo simplemente por adición del pequeño inductor molecular rapamicina. Los resultados sugieren que la expresión de GDNF también puede regularse en sujetos in vivo usando un vector AAV-GDNF regulable. El vector único del Ejemplo 3 cumple los papeles tanto del vector de factor de transcripción como del vector de expresión en la realización de vector doble analizada anteriormente. El tratamiento con un único vector tiene la ventaja de requerir solamente un acontecimiento de transducción para introducir un GDNF regulable, en comparación con el enfoque de dos vectores, que requiere la co-transfección de las células diana con dos vectores. Esta ventaja de la realización de vector único es particularmente significativa para protocolos que dan una eficacia de transducción solamente baja, tal como métodos de terapia génica en los que solamente se esperaría una pequeña proporción de células diana transducidas simultáneamente por ambos vectores. Por ejemplo, suponiendo eficacias de transducción independientes, solamente se transduciría un 0,25% de las células con ambos vectores si la eficacia de transducción global fuera del 5% para cada vector individualmente. Como el vector a empaquetar en un virión AAV no puede ser más largo de aproximadamente 5000-5200 nucleótidos (nt) , las construcciones regulables de vector único solamente serán prácticas para el suministro de transgenes relativamente cortos. Por ejemplo, con la elección particular de las proteínas de fusión de factor de transcripción y los elementos reguladores usados en el vector rAAV ilustrado en la FIG. 8A (como se usa en el Ejemplo 3) , la secuencia transgénica (GDNF) es aproximadamente de 600 nt de longitud. Es posible que puedan suministrarse secuencias transgénicas más largas, por ejemplo hasta 850 o incluso 1000 nt usando construcciones AAV regulables de vector único optimizadas con una colocación más eficaz de los elementos de secuencia, y en los que se eliminen nucleótidos innecesarios de las proteínas de fusión y elementos reguladores. Dentro de las limitaciones de tamaño para el empaquetamiento de AAV, puede suministrarse cualquier transgén deseado usando las construcciones de vector único de la presente invención. Los transgenes pueden comprender sub-fragmentos activos de genes deseables, en lugar de genes de longitud completa, para facilitar el suministro de vector único. La dosis de viriones rAAV necesaria para conseguir un efecto terapéutico particular, por ejemplo, las unidades de dosis en genomas de vector/kilogramo de peso corporal (vg/kg) , puede depender de varios factores incluyendo, aunque sin limitación: la vía de administración del virión rAAV, el nivel de expresión del transgén necesario para conseguir un efecto terapéutico, y la estabilidad del producto génico heterólogo. Un especialista en la técnica puede determinar el intervalo de dosis de virión rAAV para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno particular en base a los factores mencionados anteriormente, así como otros factores que son bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones de la presente invención, la dosis apropiada de rAAV usada para realizar la transducción en un animal puede variar de 1 X 108 vg/kg a 1 X 1015 vg/kg, preferiblemente de 4 x 109 vg/kg a 4 X 1012, aunque pueden emplearse dosis mayores o menores determinadas por experimentación. Aunque AADC y GDNF están presentes como transgenes ejemplares en los ejemplos de este documento, el transgén específico a suministrar no es un aspecto limitante de la presente invención. Otros genes o partes de genes que podría esperarse que proporcionen un efecto beneficioso (por ejemplo, terapéutico) pueden introducirse en el cerebro usando los vectores, métodos y kits de la presente invención, con la condición de que la secuencia sea suficientemente corta para adaptarse en la construcción del vector AAV que puede empaquetarse en viriones AAV. Como se ha analizado anteriormente, AADC (OMIM 107930, EC 4.1.1.28, N° de Acceso a Genbank M76180) es un transgén implicado en la biosíntesis de dopamina. Otros transgenes potenciales implicados en la biosíntesis de dopamina son tirosina hidroxilasa (TH) (OMIM 1912290, EC 1.14.16.2, N° de Acceso a Genbank X05290) y guanosina trifosfato ciclohidrolasa I (GCH) (OMIM 600225, EC 3.5.4.16, N° de Acceso a Genbank NM_000161) . Otros transgenes potenciales más incluyen neurotrofinas, incluyendo GDNF (OMIM 600837, N° de Acceso a Genbank AX713049, L19063) y otros miembros de la familia de la proteína GDNF, tales como artemina (OMIM 603886, N° de Acceso a Genbank AF109401) , neurturina (OMIM 602018, N° de Acceso a Genbank HSU78110) , y persefina (OMIM 602921, N° de Acceso a Genbank AF040962) . Saarma et al. (1999) Microscopy Res . Tech . 45: 292-302. Otros transgenes más incluyen IL-10 (OMIM 124092, N° de Acceso a Genbank M57627) . Los números OMIM se refieren a la base de datos de Herencia Mendeliana en Seres Humanos Online mantenida por la Johns Hopkins University, disponible en internet a través del sitio web de la National Library of Medicine www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez. Los contenidos de todas las entradas OMIM citadas en este documento, y las secuencias citadas por números de acceso, se incorporan por la presente como referencia en su totalidad. Los números de acceso a Genbank se proporcionan para las secuencias de ADNc completas representativas solamente y no pretenden limitar el alcance de la invención. En particular, los transgenes potenciales incluyen otras secuencias presentadas para el gen en Genbank, longitud completa y sus fragmentos de los genes naturales, genes homólogos de otras especies, variantes alélicas de estas secuencias, y formas mutantes de origen natural o creadas artificialmente de los genes.

Los transgenes también incluyen genes para el tratamiento de otras enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , esclerosis múltiple, enfermedad de Canavan, isquemia cerebral, parálisis supranuclear progresiva, demencia del cuerpo de Lewy, síndrome de Shy-Drager, síndrome de demencia por SIDA, temblores esenciales, distonía, degeneración corticobasal, atrofia sistémica múltiple y degeneración de la retina (por ejemplo, degeneración macular, retinopatía diabética, retinitis pigmentosa, glaucoma) . El inductor se selecciona preferiblemente entre compuestos que pueden suministrarse a un sujeto humano sin toxicidad significativa o efectos secundarios. En realizaciones preferidas para el tratamiento de enfermedades neurológicas u otras enfermedades del SNC, el inductor es capaz de cruzar la barrera hemato-encefálica . En realizaciones más preferidas, el inductor es un dimerizador, por ejemplo rapamicina o un análogo no inmunosupresor de la misma. En algunas realizaciones el inductor se suministra por vía parenteral, por ejemplo por inyección subcutánea, intramuscular, intraocular o intravenosa. En realizaciones preferidas, el inductor es uno que puede suministrarse de forma relativamente conveniente, tal como por vía oral, tópica, por suministro nasal (pulverizador nasal) , por suministro en aerosol/pulmonar (inhalador) , por suministro ocular (gotas oculares) o por cualquier otro modo conveniente de suministro. El inductor también puede suministrarse de forma continua o semi-continua usando un parche transdérmico, un implante subcutáneo, una minibomba osmótica implantable, una bomba de infusión mecánica o una composición farmacéutica de liberación controlada. Las reservas de vectores rAAV de acuerdo con la presente invención pueden prepararse usando cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica para la producción de viriones AAV. El AAV de tipo silvestre y los virus auxiliares pueden usarse para proporcionar las funciones de replicación necesarias para producir viriones rAAV, o puede usarse un plásmido para suministrar los genes de funciones auxiliares (por ejemplo, pHLP 19) , los genes de funciones accesorias (por ejemplo, pladeno 5) , o ambos en el caso del método de transducción triple. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.139.941; 5.622.856; 6.001.650 y 6.004.797, cuyas descripciones se incorporan por la presente como referencia en su totalidad. Para el suministro in vivo, se formulan viriones rAAV en composiciones farmacéuticas que comprenden una dosis apropiada de uno o más viriones rAAV y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichos excipientes incluyen cualquier agente farmacéutico que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición, y que puede administrarse sin toxicidad excesiva. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden incluir en las mismas, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, y similares; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. Además, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento del pH, y similares, en dichos vehículos. Está disponible un análisis minucioso de los excipientes farmacéuticamente aceptables en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co . , N.J. 1991). En algunas realizaciones, los viriones rAAV de la presente invención se suministran como composiciones farmacéuticas que comprenden excipientes que potencian la estabilidad viral durante almacenamiento prolongado y exposición a ciclos de congelación-descongelación repetidos, y que reducen la adherencia del vector al dispositivo de infusión. En realizaciones preferidas, los excipientes muestran baja toxicidad en el tejido diana, por ejemplo, el SNC. Por ejemplo, los viriones pueden almacenarse y suministrarse en tampón que comprende pluronic F-68 (BASF Corp., Mount Olive, NJ) del 0,01% al 0,0001%, preferiblemente al 0,001%. Se describen composiciones y excipientes adicionales en las Patentes de Estados Unidos N° 6.759.050 y 6.764.845, cuyas descripciones se incorporan por la presente como referencia en su totalidad. En otro aspecto la presente invención se refiere a kits para la construcción de vectores AAV para la expresión regulada de transgenes. En algunas realizaciones, se incluyen uno o más vectores sustancialmente idénticos a los mostrados en las FIGS. ÍA y IB, o las FIGS. 8A u 8B, en dichos kits . En otras realizaciones, se incluyen vectores similares a los mostrados en las FIGS. IB, 8A u 8B en dichos kits excepto en que las secuencias codificantes de AADC y GDNF están reemplazadas por secuencias de clonación convenientes, tales como un polienlazador . Vectores de expresión similares a los mostrados en la FIG. IB son útiles en métodos de vector doble, mientras que vectores similares a los mostrados en las FIGS. 8A y 8B son útiles en métodos de un único vector de la presente invención. Un usuario de un kit de la presente invención puede clonar un gen o fragmento génico de interés en un vector de expresión, y después preparar viriones rAAV para la transducción . Los kits que incluyen vectores de expresión para su uso en métodos de vector doble también pueden incluir un vector de factor de transcripción sustancialmente similar al mostrado en la FIG. ÍA. Los kits pueden incluir opcionalmente rapamicina o un análogo de la misma. Los kits también pueden incluir opcionalmente plásmidos para su uso en la preparación de reservas de virión rAAV, tal como los plásmidos pHLP 19 y pladeno 5, como se describe más completamente en las Patentes de Estados Unidos N° 6.001.650 y 6.004.797. Los kits también pueden contener instrucciones para su uso . En algunas realizaciones, se administran vectores de terapia génica, métodos y kits de la presente invención a un sujeto que padece una enfermedad, tal como enfermedad de Parkinson, para proporcionar un efecto terapéutico. Hablando en líneas generales, "efecto terapéutico" se refiere a un nivel de expresión de uno o más transgenes suficiente para alterar un componente de una enfermedad (o trastorno) hacia un resultado deseado o criterio de valoración clínico, de modo que una enfermedad o trastorno del sujeto muestre mejora clínica, a menudo reflejada por la mejora de un signo o síntoma clínico relacionado con la enfermedad o trastorno. En el caso de la enfermedad de Parkinson, un efecto terapéutico puede ser una mejora en la función motora (por ejemplo, tareas motoras finas) manifestada, por ejemplo, por mejora en la destreza manual. Como alternativa, una reducción en los temblores en reposo también puede ser un signo de mejora de PD. Hay varios criterios de valoración observables y medibles reconocidos en la técnica para determinar la eficacia terapéutica (es decir, un efecto terapéutico) para un tratamiento particular de PD. En pacientes humanos que presentan signos y síntomas clínicos de PD, los médicos a menudo dependen de la Escala de Valoración de la Enfermedad de Parkinson Unificada (UPDRS) bien conocida para evaluar la gravedad de la enfermedad y también para medir la eficacia terapéutica de una modalidad de tratamiento particular. Análogo al sistema UPDRS, los científicos evalúan las características de PD en modelos de primate de PD usando la Escala de Valoración de Parkinson en Primates (PPRS, también conocida como Valor de Clasificación Clínica - CRS) , que mide, entre otras características, la tarea motora fina, temblores en reposo, bradiquinesia, hipoquinesia, y rigidez muscular. El sistema PPRS se describe en Langston et al. (2000) Ann . Neurol . 47: S79-89. III. EXPERIMENTAL A continuación hay ejemplos de realizaciones específicas para realizar la presente invención. Los ejemplos se ofrecen solamente para propósitos ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ningún modo. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero debe permitirse algún error experimental y desviación, por supuesto. EJEMPLO 1 EXPRESIÓN REGULADA DE AADC IN VITRO La regulación de un transgén AADC in vi tro se consigue del siguiente modo. Vectores AAV Se construyen dos vectores para conseguir una expresión dependiente de dimerizador de hAADC: AAV-CMV-TF y AAV-Z12-hAADC. La FIG. ÍA es un diagrama de AAV-CMV-TF, en el que el potenciador/promotor de citomegalovirus (CMV) dirige la expresión de un mensaje bicistrónico que codifica las proteínas de fusión del dominio de activación y del dominio de unión a ADN. La proteína de fusión del dominio de activación contiene el dominio de unión a rapamicina (FRB*) de FRAP humana fusionado con el dominio de activación transcripcional derivado de la subunidad p65 de NFKB (p65) . El dominio FRP particular usado en esta realización (FRBT2098L) , e ilustrado en la FIG. ÍA (FRB*) , lleva una mutación T a L en la posición 2098 cuando se compara con la secuencia de FRB de tipo silvestre. Pollock et al. (2000) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 97: 13221-26. FRBT2098L puede dimerizarse en la fusión del dominio de unión a ADN usando AP21967 o rapamicina. La secuencia de entrada interna del ribosoma (IRES) se obtiene del virus de la encefalomiocarditis . La proteína de fusión del dominio de unión a ADN contiene dos dominios de unión a ADN del factor de transcripción humano Zif268, un homeodominio derivado de Oct-1 (ZFHD1) , y tres dominios de unión a fármaco del receptor citosólico para FK506 (3xFKBP) . La FIG. IB es un diagrama de AAV-Z12 -hAADC, en el que la expresión de AADC humana (hAADC) se controla por 12 sitios de unión para el factor de transcripción fusionado a un promotor de IL-2 mínimo. La repetición terminal invertida (ITR) de AAV2 , la secuencia codificante de hAADC (hAADC) y la poliadenilación de la hormona del crecimiento humana (pA) están indicados. Análisis de expresión in vi tro La capacidad de regular la expresión del gen hAADC se ensaya in vi tro co-transduciendo células HeLa D7-4 con una proporción 1:1 de AAV-CMV-TF y AAV-Z12 -hAADC, y posteriormente tratando las células con el análogo de rapamicina AP21967 (ARIAD Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, Massachusetts) a 0, 5 ó 25 nM. Los resultados se presentan en la FIG. 2, que incluye los resultados de diversos experimentos de control, incluyendo células no transducidas, células transducidas con el vector del factor de transcripción solo (AAV-CMV-TF) , células transducidas con un vector hAADC expresado constitutivamente (AAV-CMV-hAADC2) , y células transducidas con el vector hAADC regulado (AAV-Z12 -hAADC) pero que carecen del vector de factor de transcripción. Los detalles experimentales con respecto a los métodos experimentales usados en el Ejemplo 1 son los siguientes. Construcción del Vector AAV-CMV-TF se ha descrito previamente (AAV-CMV-TFINc, Auricchio et al. (2002) Mol . Ther . 6: 238-42). AAV-Z12-hAADC se crea reemplazando el potenciador y promotor CMV de pAAV-hAADC (Sanftner et al (2004) Mol . Ther. 9: 403-9) con una región de Z12-IL2-SEAP (Rivera et al. (1996) Nat . Med. 2 : 1028-32) que contiene 12 sitios de unión para el dominio de unión a AD? ZFHD1 cadena arriba del promotor de IL-2 mínimo . Producción del vector recombinante Se generan vectores AAV recombinantes (serotipo 2) por transfección triple de células HEK-293 (?° de Acceso ATCC CRL1573) y se purifican por centrifugación en gradiente de densidad de CsCl. Grimm et al. (2003) Blood 102: 2412-9. En resumen, se microfluidizan las recolecciones celulares que contienen rAAV y se filtran a través de filtros de 0,2 µm. El vector se purifica de los lisados celulares aclarados por centrifugación en gradiente de densidad de CsCl, se concentran por ultrafiltración, y diafiltración en solución salina tamponada con fosfato que contiene sorbitol al 5%, pH 7,4 (PBS-sorbitol) con pluronic F-68 al 0,001% (BASF Corp., Mount Olive, ?J) añadido para evitar la pérdida del vector en catéteres de suministro. La pureza del vector se evalúa por SDS-PAGE. El vector rAAV purificado usado en este estudio muestra esencialmente sólo VPl, VP2 , y VP3 por tinción con plata de geles SDS-PAGE. El título se determina por análisis de Q-PCR de genomas del vector. Análisis de AADC in vi tro por ELISA de expresión El ELISA de expresión mide la expresión de la proteína hAADC en células HeLa D7-4 permeabilizadas usando un anticuerpo contra hAADC. Las células HeLa D7-4 se transducen con vectores rAAV y se tratan con tres dosis diferentes de AP21967 (0, 5, 25 nM) . Para cada grupo n = 3. Las células se siembran en una placa de 96 pocilios 24 h antes de la transducción. Las células se transducen con un valor de MOI de 104 vg/célula (de cada vector cuando se usan múltiples vectores) en 100 µl de medio completo. Se realiza el ELISA en células transducidas 48 h después de la transducción. En resumen, se aspiran los medios y se lavan las células con PBS. Las células se fijan con paraformaldehído al 4% y se incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavan con PBS, con agitación, y se bloquean con tampón de bloqueo (suero de cabra al 3%, Tritón X-100 al 0,5% en PBS), después se incuban durante 60 min a temperatura ambiente con agitación. El anticuerpo primario (AB136 de conejo anti-hAADC, Chemicon, 1:1000) se diluye en tampón de lavado (suero de cabra al 1%, Tritón X-100 en 0,5% en PBS) y se incuba en un agitador durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavan con tampón de lavado y el anticuerpo secundario (de cabra anti-IgG-AP de conejo (Vector Labs, Burlingame, California), 1:1000 en tampón de lavado) se incuba en un agitador durante 30 min a temperatura ambiente. Las placas se lavan con tampón de lavado. Se añade solución de sustrato [p-nitrofenil fosfato IX, levamisol IX (reactivo de inactivación) , en tampón de sustrato (NaHC03 100 mM, pH 10,0) (Vector Labs, Burlingame, California) ] y se incuba la placa a temperatura ambiente durante 30-60 minutos, después se lee en un lector de placa a OD405. Los datos de este ELISA de expresión de hAADC se presentan como densidad óptica relativa medida en células transducidas con vector en comparación con una curva de respuesta a dosis para la transducción con lotes de referencia de AAV-CMV-hAADC2. EJEMPLO 2 EXPRESIÓN REGULADA DE AADC IN VIVO Los mismos vectores usados para demostrar la transducción mediada por AAV de hAADC regulada por dimerizador in vitro (Ejemplo 1, FIGS. ÍA y IB) también se ensayan in vivo en el modelo de rata con 6-hidroxidopamina (6-0HDA) de enfermedad de Parkinson, del siguiente modo. Se usa rapamicina en lugar de AP21667 como dimerizador en el Ejemplo 2 a causa de su mayor potencia y farmacocinética conocida. La rapamicina tiene una vida media de aproximadamente 10 h in vivo con una eliminación rápida. Gallant-Haidner et al. (2000) Ther. Drug Moni t . 22: 31-5. Todas las ratas usadas en este ejemplo están lesionadas unilateralmente con 6-0HDA en el lado izquierdo. Hay tres grupos experimentales: un grupo de control con excipiente infundido (excipiente infundido (+) tratamiento con rapamicina), un grupo de control de vector infundido (-) tratamiento con rapamicina, y un grupo de vector infundido (+) tratamiento con rapamicina. El grupo de vector infundido (-) rapamicina sirve como control para la expresión génica de hAADC en ausencia de rapamicina, es decir, para determinar si el sistema es permeable. Se infunde una mezcla 1:1 de AAV-CMV-TF y AAV-Z12-hAADC (3xl010 genomas virales (vg) de cada uno) y de forma ipsilateral en ratas lesionadas unilateralmente con 6-hidroxidopamina (6-OHDA) . El excipiente solo se infunde en el grupo de control de excipiente infundido. La inducción de la expresión del transgén se consigue por inyección intraperitoneal de rapamicina en los momentos puntuales indicados, como se analiza a continuación. La FIG. 3 muestra la programación experimental para los experimentos descritos en este ejemplo. Antes del tratamiento con rAAV, se da a todos los grupos un ensayo rotacional inicial después de la administración de L-dopa (5 mg/kg) . El vector o excipiente se infunde de forma intraestriada en el día 0. En el día 17 las ratas se inducen con rapamicina o se tratan con diluyente. La inducción consta de cuatro días consecutivos de inyección IP de 10 mg/kg/día de rapamicina. (Se administra rapamicina durante 4 días consecutivos para asegurar niveles en circulación máximos en el cerebro.) Las flechas en la FIG. 4 indican el inicio de la inducción de rapamicina de cuatro días. En el día 21 las ratas se ensayan de nuevo para una respuesta rotacional a 5 mg/kg de L-dopa. Las ratas se dejan recuperar de la rapamicina durante 1 semana y después se ensayan para una respuesta en el día 28. Las ratas se inducen una segunda vez en el día 31 y se ensayan para una respuesta rotacional en el día 35. Después de recuperarse de la rapamicina durante una semana, se repite el ensayo rotacional en el día 42. En el día 45 las ratas reciben el tercer y final transcurso de inducción seguido por un ensayo rotacional final en el día 49. Los animales se sacrifican por eutanasia en este momento en su estado inducido (+ rapamicina) y se procesan para inmunohistoquímica . .Respuesta rotacional del comportamiento a L-dopa Se realiza un análisis de comportamiento usando la respuesta rotacional clásica a agonistas de dopamina. En este caso el agonista es dopamina sintetizada a partir de L-dopa exógena, en el modelo de rata de 6-OHDA unilateral de PD. Ungerstedt (1971) Acta Physiol . Scand . Suppl . 367: 69-93. Como se muestra en la FIG. 4, tres semanas después de la transducción, los animales en el grupo de vector infundido (+) rapamicina muestran una respuesta de giro contralateral robusta a L-dopa (5 mg/kg) que es significativamente mayor que la del grupo de vector infundido (-) rapamicina (215,13 ± 73,86 frente a 16,33 ± 21,92 giros en la dirección de las agujas del reloj en 60 min, P <0,001). Las diferencias estadísticas se comparan usando un análisis ANOVA de una vía para múltiples grupos. En el grupo de vector infundido (+) rapamicina, la respuesta de giro contralateral a la estimulación con L-dopa en las semanas 3, 5, y 7 aumenta significativamente con respecto a los valores antes de la infusión o los controles de tiempo coincidente (grupo de vector infundido (-) rapamicina y grupo de excipiente infundido (+) rapamicina) ( P <0,001). En contraste, el grupo de vector infundido (+) rapamicina no es significativamente diferente de los dos grupos de control (P >0,05) en el momento puntual antes de la infusión y en momentos puntuales después de la retirada de rapamicina (semanas 4 y 6) . Los grupos de vector infundido (-) rapamicina y de control de excipiente infundido no son significativamente diferentes en ningún momento puntual (P >0,05) . Sin pretender limitarse por la teoría, el aumento gradual en la respuesta rotacional sobre el transcurso de las siete semanas en ambos grupos de control puede deberse a la sensibilización al tratamiento repetido con L-dopa. La respuesta rotacional en el grupo de vector infundido (+) rapamicina en los momentos puntuales "sin" rapamicina, semanas 4 y 6, no es significativamente diferente del grupo de vector infundido (-) rapamicina o el grupo de excipiente infundido (+) rapamicina en esos momentos puntuales, lo que demuestra la reversibilidad de la respuesta inducida. El hecho de que la inducción de la expresión de hAADC, y la posterior expresión disminuida en las semanas sin tratamiento, que se observa sobre tres ciclos de tratamiento con rapamicina sucesivos refuerza la conclusión de que está sucediendo la inducción inducida por rapamicina de la expresión génica in vivo . Cuantificación de las copias del transgén hAADC en el estriado infundido Se realiza una PCR cuantitativa a tiempo real en todas las ratas para confirmar que ambos grupos de vector infundido se transducen con cantidades equivalentes de copias del gen de hAADC. La cantidad de copias del gen de hAADC en el grupo de vector infundido (+) rapamicina (222 ± 92 copias del genoma/20 ng de ADN) (± SD) no es diferente del grupo infundido con vector (-) rapamicina (229 ± 48 copias del genoma/20 ng de ADN) . Jnmunohistoguí-Tiica y cuantificación de la expresión . Los niveles de expresión de hAADC se evalúan por análisis inmunohistoquímico a las siete semanas después de la infusión. Se muestra una imagen de elevado aumento en el sitio de infusión del estriado de un animal representativo del grupo de vector infundido (+) rapamicina en la FIG. 5A, y se muestra una del grupo de vector infundido (-) rapamicina en la FIG. 5B. Como se ilustra en la FIG. 5A, la expresión del transgén hAADC se localiza en las neuronas espinosas medianas del estriado de la rata. En contraste, las ratas a las que se infunde el vector pero nunca se inducen (grupo de vector infundido (-) rapamicina) muestran un nivel muy bajo de expresión de transgén hAADC (FIG. 5B) .

La FIG. 6 muestra imágenes de bajo aumento de inmunohistoquímica de AADC en secciones de cerebro montadas completas de animales representativos de cada grupo a las siete semanas después de la infusión intraestriada . Los animales a los que se infundió AAV-CMV-TF + AAV-Z12 -hAADC (3 x 1010 vg de cada vector) con inducción con rapamicina (A) o sin rapamicina (B) se muestran en comparación con el control de excipiente con rapamicina (C) . El hemisferio izquierdo es el sitio tanto de la lesión con 6-OHDA como de las infusiones intraestriadas del vector (o excipiente) . El hemisferio derecho no está lesionado ni está infundido, y por tanto la tinción de los hemisferios derechos refleja la tinción endógena de fibras positivas a AADC de una rata intacta. La lesión con 6-OHDA causa el agotamiento de la AADC endógena, provocando una tinción histoquímica baja de la enzima en el hemisferio izquierdo, como se ilustra mejor en el grupo de control de excipiente infundido mostrado en la Figura 6C. Las ratas en el grupo de vector infundido (+) rapamicina muestran todas una tinción del transgén de hAADC en el lado izquierdo infundido (véase, por ejemplo, FIG. 6A) . Las ratas en el grupo de vector infundido (-) rapamicina muestran niveles bajos de expresión del transgén de hAADC (véase, por ejemplo, la FIG. 6B) . Esta expresión de hAADC se observa en cinco de seis animales de vector infundido (-) rap. Hay menos células positivas, y menos intensidad de tinción por célula, en el grupo de vector infundido (-) rapamicina en comparación con el grupo de vector infundido (+) rapamicina, que demuestra solamente un bajo nivel de expresión de hAADC a partir del promotor inducible en ausencia de rapamicina. También se realizó estereología cuantitativa en secciones de cerebro en serie obtenidas de ratas sacrificadas por eutanasia siete semanas después de la infusión intraestriada, inmediatamente después de la dosificación de rapamicma. Se evalúa la mmunotmción de AADC y se cuantifica por estereología en secciones en serie de tejido cerebral fijado Se usa un protocolo de estereología en fraccionador óptico, un método de recuento de objetos imparcial eficaz que es una combinación de un protocolo de diseccionador óptico con procedimientos de muestreo espacial optimizados estadísticamente. Gundersen et al. (1988) Apmis 96:857-81; Gundersen (1986) J". Microsc. 143 (Pt 1) : 3-45. Los resultados se presentan en la Tabla 1, que revela que el grupo de vector mfundido (+) rapamicma tiene la mayor distancia anterior a posterior de tinción (3.72011.276 µm) (±SD), mientras que hay un nivel mucho menor de propagación (1 920+1 577 µm) en el grupo de vector mfundido (-) rapamicina TABLA 1 Expresión de AADC en cerebro de rata Inducido por Sin inducción Proporción rapamicma (n=5) de (n = 8) inducción Distancia anterior a 3 720 ± 1 276 1 920±1 577 1, 94 X posterior de propagación (µm) Cantidad de células 75.825 ± 30.506 31.000 ± 2,45 X positivas a AADC 25.812 Volumen de propagación 15,75 ± 8, 16 7, 09 ± 5,69 2,22 X (mm3) "n" es la cantidad de hemisferios examinados. Los valores de los datos se presentan + una desviación típica La propagación anterior a posterior media, los volúmenes de propagación, y las cantidades de células positivas para el grupo inducido con rapamicina son estadísticamente diferentes de los valores para el grupo "sin inducción" (P <0,02) por ensayos t de Student.

La Tabla 1 también presenta la población media de células positivas al transgén y el volumen de propagación en el estriado. El grupo de vector infundido (+) rapamicina tiene la mayor cantidad de células positivas AADC (75.825 +/- 30.506), seguido por una cantidad inferior de células positivas (31.000 +/- 25.812 células) en el grupo de vector infundido (-) rapamicina (P <0,01), y sin expresión detectable en el grupo de control de excipiente infundido (datos no mostrados) . De forma similar, el grupo de vector infundido (+) rapamicina presenta un gran volumen de propagación en el estriado de hAADC (15,75 ± 8,16 mm3) , mientras que el grupo de vector infundido (-) rapamicina muestra un volumen inferior del 55% de propagación en el estriado (7,09 ± 5,69 mm3) . El análisis estereológico es una medida precisa de la cantidad de neuronas del estriado transducidas y la distribución de las partículas de vector vial. Sin embargo, el análisis de proteínas totales es una determinación más exacta de la cantidad de enzima hAADC producida porque la cantidad de hAADC creada por la célula puede diferir entre grupos. Para confirmar gue la intensidad inferior de la expresión de hAADC en el grupo no inducido observada por inmunotinción se correlaciona con un nivel total inferior de expresión de hAADC, se extraen las proteínas totales de las varias secciones tisulares y se examinan por análisis de transferencia de Western. Se confirma una concentración de proteína hAADC inferior en el grupo no inducido. La FIG. 7 muestra imágenes de las bandas relevantes del gel, y una representación de las intensidades de banda integradas, de ratas lesionadas unilateralmente con 6-OHDA de vector infundido (+/-) rapamicina y excipiente infundido (+) rapamicina que muestra los cambios en los niveles de proteínas de hAADC (50 kDa) en el estriado. La ß-actina se incluye como control de carga. La densidad de la banda de AADC es significativamente mayor en el grupo de vector infundido (+) rapamicina en comparación con ambos grupos de control, P <0,001. Las intensidades de banda en las transferencias de Western de las ratas de vector infundido (+) rapamicina y (-) rapamicina son 102,04 ± 7,02 megapíxeles (MP) y 30,63 ± 3,47 MP, respectivamente, a las siete semanas después de la infusión. El nivel de proteína AADC total medio está reducido en un 88%, después de la corrección para la presencia de niveles de AADC endógena de rata, en el grupo de vector infundido (-) rapamicina en comparación con el grupo de vector de infundido (+) rapamicina. Estos datos demuestran una mayor diferencia en el nivel de enzima hAADC entre los dos grupos que lo que se sugiere por el análisis estereológico. A continuación hay detalles experimentales con respecto a los métodos experimentales usados en el Ejemplo 2. Procedimientos Quirúrgicos Se obtienen ratas Sprague Dawley adultas lesionadas con 6-OHDA (n = 6 ratas para los grupos de excipiente infundido y vector infundido (-) rapamicina y n = 8 ratas para el grupo de vector infundido (+) rapamicina) de Taconic Farms (Germantown, NY) . Las ratas se alojan una por jaula en condiciones estándar: temperatura y humedad controladas, ciclo de 12 horas de luz, y acceso libre a comida y agua. El vector de infunde por suministro potenciado por convección (CED) para conseguir una distribución óptima en todo el estriado. Bankiewicz et al. (2000) Exp . Neurol . 164:2-14; Liebarman et al. (1995) J. Neurosurg. 82:1021-9. En resumen, los vectores se cargan en un tubo de polímero (DE, 1,59 mm (1/16"), DI, 0,76 mm (0,030"), Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA) conectado a línea cargada con aceite de oliva bombeada desde una jeringa Hamilton precintada al vacío de 1 ml . El vector se suministra con una bomba programable (Bioanalytical Systems, Ine, West Lafayette, IN) . La cánula, compuesta por un capilar de sílice fusionado (DE, 164 µm; DI, 100 µm; Polymicro Technologies, Phoenix, AZ) equipado con una aguja de calibre 27, está conectada al extremo distal del tubo de polímero. Se induce anestesia con isoflurano al 3% en flujo de 02 (2 l/min) y se colocan los animales en un tramo estereotáxico (Kopf, Tujunga, CA) . Después se mantiene la anestesia con isoflurano al 1% en 02 a través de una máscara fijada al tramo estereotáxico. Se perforan orificios tipo erizo sobre los sitios diana y se insertan las cánulas verticalmente en el caudado-putamen en las siguientes coordenadas con relación a la bregma y la dura: AP 0,0 mm, ML -3,5 mm, DV - 5,0 mm, con una barra de incisión establecida a -3,3 mm. A los animales se les infunde de forma unilateral 10 µl de una proporción 1:1 de los dos vectores a una velocidad de 0,5 µl/min. Al final del periodo de infusión de 20 minutos, la velocidad se disminuye a 0 µl/min durante 5 minutos de reposo y se retira lentamente la cánula. Análisis de comportamiento Se evalúa la respuesta a apomorfina (0,05 mg/kg, Sigma, St . Louis, MO) y L-dopa (éster metílico, Sigma) con rotómetros automáticos conectados a un ordenador que ejecuta el software de análisis rotacional RotoMax (AccuScan Instruments, Inc. Columbus, OH) . Se computan los giros contralaterales e ipsilaterales totales en 30 minutos (para apomorfina) y en 60 minutos (para L-dopa) . Sólo las ratas con una rotación media >6 giros contralaterales/minuto durante 30 minutos en respuesta a apomorfina (0,05 mg/kg) tres semanas después de la lesión se consideran bien lesionadas (Ungerstedt (1971) Acta Physiol . Scand . Suppl . 367:69-93) y se ensayan para la respuesta a L-dopa. Estos animales se ensayan para la respuesta a L-dopa usando un intervalo terapéutico por debajo de la dosis, 5 mg/kg de éster metílico de L-dopa coadministrado con 2,5 mg/kg de benserazida (Sigma, St . Louis, Missouri) . Más del 95% de las ratas ensayadas no rotan en respuesta a 5 mg/kg de L-dopa. Los animales que muestran una rotación contralateral neta a esta dosis se excluyen del experimento. La respuesta a L-dopa se evalúa antes de la cirugía y en diferentes momentos puntuales (3, 4, 5, 6 y 7 semanas) después de la infusión intraestriada. Jnmurío is toguí i ca Para los estudios histológicos, se perfunde a los animales a través de la aorta solución salina, seguido por paraformaldehído al 4% (n = 6 ratas para los grupos de excipiente infundido y de vector infundido (-) rapamicina y n = 8 para el grupo de vector infundido (+) rapamicina) . Los cerebros se postfijan durante una noche en paraformaldehído al 4%, se equilibran en soluciones de sacarosa graduada, y se congelan en isopentano. Los cerebros se cortan en serie en secciones de corona de 40 µm de grosor en un criostato. Se realiza inmunohistoquímica para AADC (Chemicon, Temecula, CA, 1:1500) en secciones de flotación libre. Las secciones se incuban en peróxido de hidrógeno al 3% durante 30 minutos para inactivar las peroxidasas endógenas. Después del bloqueo para la unión no específica con suero de cabra normal al 5%, se incuban las secciones en anticuerpo primario durante una noche a temperatura ambiente. Las incubaciones con un anticuerpo anti-IgG de conejo biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, CA, 1:300) seguido por peroxidasa de rábano rusticano conjugada con estreptavidina (Vector Laboratories, 1:300) se realizan a temperatura ambiente, ambas durante 1 hora, y se visualiza el complejo con 3-3 ' diaminobenzidina (DAB, Vector Laboratories) y peróxido de hidrógeno. Las secciones se montan en portaobjetos recubiertos con gelatina, se secan, se deshidratan en series de etanol ascendentes, se aclaran en xileno, y se montan usando Cytoseal-60 (Richard-Alien Scientific, Kalamazoo, MI) . Se determina la distribución anterior a posterior de inmunotinción de hAADC por la fórmula (n x 12 x 40 µm) donde n es la cantidad de secciones con células positivas a hAADC, 40 µm es el grosor de la sección, y se examina cada duodécima sección. El volumen de distribución y el recuento de células positivas se estimaron en secciones en serie (cada duodécimo) , se tiñó para AADC usando el método de estereología basado en el diseño Optical Fractionator-Optical Disector a un aumento 63X en un microscopia Zeiss equipado con una videocámara y el software de estereología Stereoinvestigator (Microbrightfield, Willston, VT) . CEE <5% para cada grupo. Los resultados se presentan como la media ± SD. Se usa el ensayo t de Student para medir el significado estadístico. PCR cuanti tativa a tiempo real El vector AAV-Z12-hAADC usado en este estudio contiene el gen diana AADC humano. Los cebadores de Q-PCR y la sonda hibridan con los exones 2 y 3 del gen AADC, abarcando de este modo un intrón presente en la secuencia del vector y minimizando de este modo la amplificación del ADN genómico. La Q-PCR a tiempo real (Heid et al. (1996) Genome Res . 6:986-94) se normaliza con ADN plasmídico que contiene el inserto del vector. El plásmido se linealiza con una enzima de restricción, se purifica, se cuantifica por absorbancia UV, y se diluye en tampón de dilución Q-PCR (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, 10 µg/ml de ARNt de levaduras, y Tween 80 al 0,1%) para dar 10 patrones que varían de tres a 106 copias por reacción. Cada patrón se procesa en tres reacciones de 50 µl duplicadas en una placa óptica de 96 pocilios. Se añaden 10 µl de muestra, conteniendo cada una 20 ng de ADN a tres pocilios de Q-PCR duplicados que contenían 40 µl de mezcla de reacción. La PCR se realiza en un Sistema de Detección de Secuencia Applied Biosystems 7700. La cantidad de copias del gen de hAADC se calcula por comparación con la curva patrón, y multiplicando las copias resultantes por pocilio por dos, suponiendo que una copia de ADN plasmídico bicatenario es equivalente a dos genomas de vector monocatenario. Análisis de Transferencia de Western Se homogenizan diez secciones en serie (de 40 µm cada una) de cerebros completos por separado con un homogeneizador manual en un tampón de lisis que contiene una mezcla de inhibidores de fosfatasa e inhibidores de proteinasa. La proteína se cuantifica usando el método de Bradford. Se preparan muestras proteicas (15 µg) en gel SDS-PAGE (gel de gradiente 4-15%; Bio-Rad, Hercules, California) y se transfiere a filtros de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Bedford, Massachussets) . Los filtros se bloquean con leche al 3% y se incuban durante 1 hora con un anticuerpo primario de conejo policlonal anti -AADC (1:500 Chemicon, Temecula, California) . Después se incuban las transferencias durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) con un anticuerpo secundario conjugado con HRP correspondiente (1:3000; Amersham Biosciences, Arlington Heights, Illinois), se visualizan en solución ECL (PerkinElmer Life Sciences, Emeryville, California) durante 1 minuto, y se exponen en una película X-Omat de Kodak (Rochester, New York) durante 1-30 minutos. Finalmente, las transferencias se incuban en tampón de separación (Tris 67,5 mM, pH 6,8, SDS al 2% y ß-mercaptoetanol al 0,7%), durante 30 minutos a 50°C y se vuelven a sondear con un anticuerpo policlonal de conejo anti-ß-actina (1:1000; Alpha Diagnostics, San Antonio, Texas) como controles de carga. El anticuerpo primario anti-AADC se ha usado extensivamente en estudios previos, y las bandas de transferencia de Western observadas en este estudio muestran el mismo tamaño de banda (-50 kDa) indicado en la hoja de información de anticuerpos. La densidad de cada banda se mide con un sistema de análisis de imágenes asistido por ordenador (Alphalmager®, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, California) . No hay diferencia significativa en la densidad de las bandas de control carga de ß-actina entre los grupos. Para comparar las diferencias entre los grupos de control de excipiente infundido (+) rapamicina y vector infundido, primero se normaliza la densidad de cada banda específica frente a la densidad de la banda de carga interna correspondiente (n = 3 para cada grupo) . Se determina el porcentaje de reducción en proteínas totales después de restar el nivel de hAADC endógena encontrado en las ratas de excipiente infundido de los dos grupos de vector infundido. Las diferencias se comparan usando un ANOVA de una vía para múltiples grupos. EJEMPLO 3 EXPRESIÓN REGULADA DE GDNF JN VITRO Se transducen células de mamífero con una construcción de transgén GD?F regulable por dimerizador del siguiente modo. Vectores AAV-GDNF Las FIGS. 8A y 8B son diagramas de construcciones plasmídicas del vector AAV recombinante para el suministro de un transgén GD?F humano (hGD?F) regulable. Se muestra un vector de control para el suministro de hGD?F expresado constitutivamente (pAAV-CMV-hGD?F) en la FIG. 8C. Las construcciones regulables (FIGS: 8A y 8B) implican un vector rAAV único que lleva los genes que codifican hGD?F y la proteína de fusión del dominio de activación y los componentes de la proteína de fusión del dominio de unión a AD? del factor de transcripción. En ambas construcciones la expresión de hGD?F está dirigida por un promotor de IL-2 mínimo adyacente a ocho sitios de unión para el factor de transcripción dimerizable descrito con mayor detalle a continuación. En la construcción ilustrada en la FIG. 8A (pAAV-TF- Z8-hGDNF) , un potenciador/promotor de CMV dirige la expresión de un único transcrito que codifica tanto los dominios de activación como de unión a ADN del factor de transcripción, con un sitio de entrada interna al ribosoma (IRES) entre los dos. En la construcción ilustrada en la FIG. 8B, en cambio, un promotor SV40 dirige la expresión del dominio de unión a ADN y un potenciador/promotor CMV dirige la expresión del dominio de activación, en un transcrito diferente, de la cadena opuesta (es decir en la dirección opuesta) . La proteína de fusión del dominio de unión a ADN contiene dos dominios de unión a ADN del factor de transcripción humano Zif268, un homeodominio derivado de Oct-1 (ZFHD1) , y tres dominios de unión a fármaco del receptor citosólico para FK506 (3xFKBP) . La proteína de fusión del dominio de activación contiene el dominio de unión a rapamicina de FRAP humana (FRB*) fusionado con el dominio de activación transcripcional derivado de la subunidad p65 de NFKB (p65) . El dominio FRB* ilustrado en las FIGS. 8A y 8B se describe en el Ejemplo 1. Se indican las secuencias de la repetición terminal invertida (ITR) de AAV2 , la poliadenilación mínima de SV40 (SV40 pA Min.), la poliadenilación de ß-globina de conejo mínima (RBG pA Min.) y la poliadenilación de la hormona de crecimiento humana mínima (hGH pA Min.) . En el vector de control pAAV-CMV-hGDNF (FIG. 8C) el promotor/potenciador CMV dirige la expresión de hGDNF. Se indican las secuencias de la repetición terminal invertida (ITR) de AAV2 y la poliadenilación de la hormona del crecimiento humana (pA) . Los resultados del experimento de inducción con rapamicina se presentan en la FIG. 9, en la que se presenta la expresión de GDNF como una función de la concentración de la construcción del vector y rapamicina. pAAV-TF-Z8-hGDNF dirige la producción de GDNF de un modo sensible a dosis cuando se tratan las células con rapamicina, mientras que pAAV-CMV-hGDNF dirige la expresión de GDNF a nivel constitutivo (elevado) independientemente del tratamiento con rapamicina. Los detalles experimentales con respecto a los métodos de ensayo ELISA experimentales usados en el Ejemplo 3 son los siguientes. ELISA DE GDNF Los ensayos ELISA para cuantificar la expresión de GDNF se realizan del siguiente modo. Se cultivan células HEK-293 (5xl05 células/pocilio) durante una noche en dos placas de 6 pocilios para alcanzar un confluencia del 60-70%. Las placas se transfectan con 10 µg de pAAV-TF-Z8-hGDNF o pAAV-CMV-hGDNF usando CaCl2 300 µM. Seis horas después se intercambian los medios con medios recientes que contienen rapamicina (0 nM, 5 nM o 25 nM, cada uno por duplicado) y se cultivan durante tres días . Se recogen por separado tanto los medios como las células, se congelan y se almacenan a -80°C hasta que se realiza el ELISA. Todas las muestras se tratan con ácido HCl 1 N hasta por debajo de pH 3,0 durante 15 minutos, y después se vuelven a neutralizar hasta aproximadamente pH 7 , 6 con NaOH 1 N . Las muestras de medio se ensayan para la presencia de GDNF usando el sistema de Inmuno Ensayo Promega Emax® (Promega, Inc., Madison, Wisconsin) . Se añade tampón de recubrimiento a la placa de 96 pocilios, que se incuba durante una noche a 4°C. El tampón de recubrimiento se retira y se drena la placa. Se añade tampón de bloqueo (200 µl ) a la placa y se incuba durante una hora a temperatura ambiente sin agitación. Se retira el tampón de bloqueo y se drena la placa. Se diseñan dos columnas de 8 pocilios de la placa de 96 pocilios para los patrones de GDNF. Se añade Tampón de Bloqueo y Muestra IX (100 µl/pocillo) a las filas B-H de las columnas de patrón. Se añade patrón de GDNF diluido (200 µl de 1000 pg/ml) a la fila A de las columnas de patrón y se realiza una dilución en serie doble de 100 µl/pocillo a la fila G. La fila H es un control solamente de tampón sin GDNF: Las muestras experimentales se diluyen a 1:300 para pAAV-TF-Z8-hGDNF y 1:1000 para los experimentos de pAAV-CMV-hGDNF, y se añaden 100 µl de cada una a pocilios duplicados y se incuban durante seis horas a temperatura ambiente con agitación (500 rpm) . Se lavan los pocilios cinco veces, cada vez con aproximadamente 400 µl del tampón de lavado recomendado del kit. Se añaden 100 µl de una dilución 1:500 de anticuerpo policlonal anti-hGDNF (en Tampón de Bloqueo y Muestra IX) a cada pocilio y se incuban durante una noche a 4°C sin agitación. La placa se lava de nuevo como se ha descrito anteriormente. Se añaden 100 µl de una dilución 1:250 de un conjugado con HRP de anti-IgY de pollo (en Tampón de Bloqueo y Muestra IX) a cada pocilio y se incuban durante dos horas a temperatura ambiente con agitación (500 rpm) . La placa se lava de nuevo como se ha descrito anteriormente. Se añaden 100 µl de una solución de TMB a temperatura ambiente (que contiene el sustrato de HRP 3 , 3 ', 5 , 5 ' -tetrametilbenzidina) a cada pocilio y se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos sin agitación. El desarrollo de color se detiene añadiendo 100 µl de ácido clorhídrico 1 N a cada pocilio. Se registra la absorbancia a 450 nm en un lector de placa en 30 minutos de adición de TMB. Se determinan los niveles de GDNF en pg/ml por comparación de señales obtenidas de muestras experimentales con los patrones de GDNF en la misma placa. La desviación típica se obtiene de un total de cuatro determinaciones para cada muestra (muestras duplicadas en cada una de las dos placas) . Aunque se describen las realizaciones ilustrativas preferidas de la presente invención, será evidente para los especialistas en la técnica que pueden hacerse diversos cambios y modificaciones sin alejarse de la invención, y se pretende que las reivindicaciones adjuntas cubran todos estos cambios y modificaciones que pertenecen al verdadero espíritu y alcance de la invención. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, secuencias y entradas de bases de datos mencionadas en este documento se incorporan por la presente como referencia en su totalidad.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un sujeto con un trastorno neurológico, que comprende: un vector de virus adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un factor de transcripción regulable que tiene actividad potenciadora de la transcripción; y un vector AAV recombinante que codifica un transgén. en la que la expresión del transgén está afectada por la actividad del factor de transcripción.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el factor de transcripción regulable y el transgén están codificados en vectores rAAV diferentes.

3. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 1-2, en la que la actividad del factor de transcripción regulable está aumentada en presencia de rapamicina o un análogo de rapamicina.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, en la que el análogo de rapamicina es AP21967.

5. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el trastorno neurológico es enfermedad de Parkinson.

6. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el transgén es la L-aminoácido aromático descarboxilasa (AADC) .

7. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el transgén es el factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) .

8. Un método para tratar un sujeto con un trastorno neurológico, que comprende administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un kit para realizar el método de la reivindicación 8, que comprende : un vector AAV recombinante que codifica un vector de transcripción regulable; un vector AAV recombinante que codifica un transgén; y rapamicina o un análogo de rapamicina.

10. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en un método para tratar a un sujeto con un trastorno neurológico.

11. Uso de un vector AAV recombinante que codifica un transgén y un vector AAV recombinante que codifica un factor de transcripción regulable que tiene actividad potenciadora de la transcripción, en el que la expresión del transgén está afectada por la actividad del factor de transcripción, en la fabricación de una composición para el tratamiento de un sujeto con un trastorno neurológico. RESUMEN Se proporcionan vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) para el suministro de transgenes regulables al sistema nervioso central (SNC) de un mamífero. Se proporcionan también métodos para el tratamiento de sujetos con trastornos neurodegenerativos mediante el uso de los vectores, y "kits" para construir o usar los vectores o realizar los métodos de la invención. Se expresan las secuencias transgénicas procedentes de una región promotora/potenciadora que comprende uno o más sitios de enlace para un factor de transcripción que responde a un inductor molecular pequeño. Tanto la construcción transgénica y como una construcción para el factor de transcripción se suministran a las células diana. Se puede suministrar el transgén regulable en el mismo vector rAAV que el factor de transcripción, o en un vector diferente. El factor de transcripción puede comprender dos cadenas de polipéptidos, v.g., un dominio de enlace de ADN y un dominio de activación de transcripción, que forman un dímero activo en la presencia de un dimerizador tal como rapamicina o un análogo no inmunogénico del mismo. Se puede utilizar los vectores, métodos y "kits" de la invención para suministrar genes como AADC o GDNF al cerebro de un sujeto con un trastorno neurodegenerativo tal como la enfermedad de Parkinson, donde la expresión de AADC o GDNF en el cerebro puede regularse subsecuentemente mediante el tratamiento del sujeto con rapamicina o un análogo de rapamicina.