MX2007006099A - Metodo para disenar polipeptidos para la nanofabricacion de peliculas delgadas, recubrimientos y microcapsulas mediante el autoensamble de capa por capa electrostatico. - Google Patents

Abstract

Un metodo para disenar polipeptidos para la nanofabricacion de peliculas delgadas, recubrimientos y microcapsulas mediante ELBL para aplicaciones en biomedicina y otros campos.

Description

MÉTODO PARA DISE AR POLIPEPTIDOS PARA LA NANOFABRICACION DE PELÍCULAS DELGADAS, RECUBRIMIENTOS Y MICROCÁPSULAS MEDIANTE EL AUTOENSAMBLE DE CAPA POR CAPA ELECTROSTÁTICO Antecedentes de la Invención A. Campo de la Invención La presente invención se relaciona a la fabricación de películas multicapa ultradelgadas sobre superficies adecuadas mediante el autoensamble de capa por capa electrostático ("ELBL") . Más específicamente, la presente invención se relaciona a un método para diseñar polipéptidos para la nanofabricación de películas delgadas, recubrimientos y microcápsulas mediante ELBL para aplicaciones en biomedicina y otros campos. B. Descripción de la Técnica Relacionada ELBL es una técnica establecida en la cual las películas ultradelgadas son ensambladas al alternar la adsorción de polielectrolitos opuestamente cargados. El proceso está basado en la reversión de la carga superficie de la película después de la deposición de cada capa. La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del proceso ELBL general: películas de poliiones opuestamente cargados (poliiones catiónicos 10 y poliiones aniónicos .11) se ensamblan en capas sucesivas sobre una superficie plana negativamente cargada 12; la carga de superficie es revertida después de la deposición de cada capa. Este proceso se repite hasta que se V forma una película de espesor deseado. La base física de asociación es la electrostática - las fuerzas de gravitación y nucleares no desempeñan efectivamente la función. Debido a la generalidad y simplicidad relativa del proceso, ELBL 5 permite la deposición de muchos tipos diferentes de materiales sobre muchos tipos diferentes de superficie. Por lo tanto, hay un basto número de combinaciones útiles posibles de materiales y superficies. Para una discusión general de ELBL, incluyendo su historia, ver Yuri Lvov, 10 "Electrostatic Layer-by-Layer Assembly of Proteins and ' Polyions" en Protein Archí tecture: Interf acial Molecular Assembly and Immobilization Biotechnology, Y. Lvov & H. Móh ald eds. (Nueva York: Marcel Dekker, 1999), páginas 125- 167, que es incorporada en la presente por referencia en su 15 totalidad. ELBL ha llegado a ser recientemente un área enfocada en el campo de la nanotecnología debido a que se puede utilizar para fabricar películas sustancialmente de menos de 1 miera en espesor. Además, ELBL permite el control 20 excepcional sobre el proceso de fabricación de película, permitiendo el uso de materiales de nanoescala y permitiendo modificaciones estructurales de nanoescala. Debido a que cada capa tiene un espesor en el orden de unos cuantos nanómetros o menos, dependiendo del tipo de material utilizado y el 25 proceso de adsorción específico, se pueden formar ensambles de multicapa de espesor precisamente repetible. Un número de polielectrolitos sintéticos se han empleado en aplicaciones de ELBL, que incluyen poli (estiren sulfonato) de sodio ("PSS") , poli (clorhidrato de alilamina) ("PAH"), poli (cloruro de dialildimetilamonio) ("PDDA") poli (acrilamida-co-cloruro de dialildimetilamonio) poli (etilenimina) ("PEÍ"), poli (ácido acrílico) ("PAA") poli (ácido anetolsulfónico) , poli (sulfato de vinilo) ("PVS") y poli (ácido vinilsulfónico) . Tales materiales, sin embargo no son generalmente útiles para aplicaciones biomédicas debido a que son antigénicos o tóxicos. Las proteínas, que son polímeros con cadenas laterales que tienen grupos ionizables, se pueden utilizar en ELBL para varias aplicaciones, incluyendo aquellas biomédicas. Ejemplos de proteínas que se han utilizado en ELBL incluyen citocromo c, lisozima de clara de huevo de gallina, inmunoglobulina G, mioglobina, hemoglobina y albúmina de suero (ibid. ) . Hay, sin embargo, dificultades con la utilización de proteínas para este 'propósito. Estos incluyen el control limitado sobre la estructura de multicapa (debido a que la superficie de la proteína es altamente irregular y las proteínas no se absorberán ordinariamente sobre una superficie en un patrón regular) , restricciones sobre el pH debido a la dependencia de pH de la solubilidad de la proteína y estabilidad estructural, falta de biocompatibilidad cuando se utilizan proteínas exógenas, y el costo de escalar la producción si el gen no se ha clonado; a menos que la proteína fuera idéntica en una fuente fácilmente disponible, por ejemplo una vaca, la proteína tendría que ser obtenida del organismo en el cual se propuso para utilizarse, haciendo el costo de la producción a gran escala de la proteína prohibitivo. En contraste los polipéptidos, que son generalmente más pequeños y menos complejos que las proteínas, constituyen una clase excelente de material para el ensamble de ELBL, y las estructuras de película de polipéptido formadas' por ELBL serán útiles en una amplia gama de aplicaciones. La presente invención proporciona un método para diseñar polipéptidos para la nanofabricación de películas delgadas, recubrimientos y microcápsulas mediante ELBL. Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención deben exhibir varias propiedades útiles, incluyendo, sin limitación, estructura primaria completamente determinada, estructura secundaria mínima en solución acuosa, monodispersividad, carga neta completamente controlada por longitud unitaria, habilidad para formar reticulaciones sobre la demanda, habilidad pare revertir la formación de reticulación, habilidad para formar películas delgadas más organizadas que lo que es posible con proteínas, y el costo de producción a gran escala relativamente barato (asumiendo el diseño del gen, síntesis, clonación y la expresión del hospedero en E. coli o levadura, o síntesis de péptido) . Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención se han mostrado útiles para ELBL de estructuras de película delgada con aplicaciones dirigidas o posibles en la tecnología biomédica, tecnología de alimentos y la tecnología ambiental. Tales polipéptidos podrían ser utilizados, por ejemplo, para fabricar glóbulos rojos artificiales, dispositivos de suministro de fármaco y películas antimicrobianas. V. Breve Resumen de la Invención La presente invención proporciona un método novedoso para identificar "porciones de secuencia" de una longitud definida y carga neta en pH neutro en la información de secuencia de aminoácidos para el uso en ELBL, y el registró de un número deseado de las porciones. El método comprende las etapas de: (a) Obtener una secuencia de aminoácidos para un péptido o una proteína de un organismo particular; (b) Localizar un aminoácido iniciador en la secuencia de aminoácidos; (c) Examinar el aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos para determinar el número de aminoácidos cargados que tienen una polaridad opuesta a la cierta polaridad; (d) Si el número de los aminoácidos cargados que tienen una polaridad opuesta a la cierta polaridad es uno o más, continuar el método de la etapa g; (e) Examinar el aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos para determinar el número de aminoácidos cargados que tienen la cierta polaridad; (f) Si el número de aminoácidos cargados que tienen la cierta polaridad es igual o mayor que x, registrar la porción de secuencia de aminoácidos que consiste del aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos; (g) Localizar otro aminoácido iniciador en la secuencia de aminoácidos; y (h) Repetir el método comenzando en la etapa c hasta que el número deseado de porciones de secuencia de aminoácidos se han identificado o todos los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos se han utilizado como el aminoácido iniciador en la etapa c; en donde x es mayor que o igual a aproximadamente la mitad de n . La presente invención también proporciona un método novedoso para diseñar un polipéptido para el uso en ELBL, que comprende las etapas de: (a) Identificar y registrar una o más porciones de secuencia de aminoácidos que tienen una carga neta de una cierta polaridad utilizando las etapas mencionados en el párrafo precedente y (b) unir una pluralidad de las porciones de secuencia de aminoácidos registrada para formar un polipéptido. La presente invención también proporciona un método novedoso para diseñar un polipéptido para el uso en ELBL que comprende las siguientes etapas: (a) Diseñar de novo una pluralidad de porciones de secuencia de aminoácidos, en donde las porciones de secuencia de aminoácidos consisten de n aminoácidos, por lo menos x de los cuales son positivamente cargados y ninguno es negativamente cargado, o por lo menos x de los cuales son negativamente cargados y ninguno es positivamente cargado, en donde x es mayor que o igual a aproximadamente la mitad de n ; y (b) unir la pluralidad de las porciones de secuencia de aminoácidos. Las porciones de secuencias de aminoácidos pueden comprender los 20 aminoácidos usuales o aminoácidos no naturales, y los aminoácidos pueden ser ya sea de la mano izquierda (L-aminoácidos) o de la mano derecha (D-aminoácidos) . La presente invención también proporciona una película delgada, la película que comprende una pluralidad de capas de polipéptidos, las capas de polipéptidos que tienen cargas alternantes, en donde los polipéptidos comprenden por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos que consiste de n aminoácidos, por lo menos x de los cuales son positivamente cargados y ninguno es negativamente cargado, o por lo menos x son negativamente cargados y ninguno es positivamente cargado, en donde x es mayor que o igual a aproximadamente la mitad de n . Las porciones en estos polipéptidos pueden ser seleccionadas utilizando cualquiera de los métodos descritos en lo anterior. La presente invención también proporciona un proceso novedoso para utilizar cisteína u otros tipos de aminoácidos que contienen sulfhidrilo para "fijar" y "desfijar" las capas de películas de ELBL de polipéptido. Este proceso permite a las películas permanecer estables en extremos de pH, dando más grande control sobre la estabilidad mecánica y propiedades difusivas de las películas nanofabricadas de los polipéptidos diseñados y el incremento de su utilidad en una amplia gama de aplicaciones. VI. Breve Descripción de las Diversas Vistas de los Dibujos La Figura 1 es un diagrama esquemático del proceso ELBL general . La Figura 2 es una gráfica de las propensiones de estructuras secundarias acumulativas de las porciones de secuencia de aminoácidos identificadas en la información de secuencia de aminoácidos humana utilizando el método de la presente invención, comparada con la distribución de propensiones de estructura de 105 secuencias de aminoácidos aleatorias . La Figura 3 (a) muestra los datos de adsorción como son monitoreados mediante la técnica de microbalance de cristal de cuarzo ("QCM") para una combinación de secuencias de aminoácidos diseñadas de acuerdo con la presente invención. La Figura 3(b) muestra una comparación de los datos de adsorción como son monitoreados por QCM para diferentes combinaciones de secuencias de aminoácidos diseñadas de acuerdo con la presente invención. La Figura 3 (c) muestra una gráfica de la masa adsorbida en nanogramos contra el número de capas para secuencias de aminoácidos diseñadas y fabricadas de acuerdo con la presente invención. La Figura 4 (a) ilustra los enlaces de disulfuro intra-capa de acuerdo con el método de fijación de cisteína de la presente invención. La Figura 4 (b) ilustra los enlaces de disulfuro de intercala de acuerdo con el método de fijación de cisteína de la presente invención. La Figura 4 (c) ilustra la oxidación y reducción de los enlaces de disulfuro en microcápsulas fabricadas de polipéptidos diseñados de acuerdo con el método de la presente invención. La Figura 5 es una ilustración esquemática del proceso de selección de la presente invención utilizado para identificar en la información de secuencia de aminoácidos existente porciones de secuencias de aminoácidos que tienen propiedades electrostáticas adecuadas para ELBL. La Figura 6 muestra el número de porciones de secuencias no redundantes identificadas en datos de secuencia de aminoácidos humanas disponibles.

La Figura 7 muestra la adsorción de ELBL de poli-L-glutamato y poli-L-lisina de un medio acuoso como una función de la intensidad iónica. La Figura 8 muestra la adsorción de polipéptidos diseñados de acuerdo con el método de la presente invención para experimentos para sondear el efecto de la formación de enlace de disulfuro. La Figura 9 muestra el porcentaje de material restante durante el desensamble de película delgada en pH acídico como se discute con referencia a la Figura 8. La Figura 10 muestra el porcentaje de material perdido durante la etapa de desensamble de pH acídico de un experimento que involucra polipéptidos diseñados de novo que' contienen cisteína. La Figura 11 (a) ilustra la función de la estructura de solución de péptidos sobre el ensamble de película, que muestra como el comportamiento del ensamble de poli-L-glutamato y poli-L-lisina depende del pH. La frecuencia resonante de QCM es clasificada contra la capa de adsorción. La masa molecular promedia de poli-L-glutamato fue de 84,600 Da, mientras que aquella de poli-L-lisina fue de 84,000 Da.

Los números se refieren a valores de pH. E = GIu, K = Lys. La concentración de péptido utilizada para el ensamble fue de 2 mg/mL. La Figura 11 (b) ilustra la función de la estructura de solución de péptidos sobre el ensamble de película, que muestra como la estructura de solución de poli-L-glutamato y poli-L-lisina depende del pH. La elipticidad de residuo molar media se gráfica como una función del pH. La concentración de péptido fue de 0.05 mg/mL. La Figura 12 muestra los datos de adsorción para polielectrolitos de diferentes longitudes, que ilustran que los polielectrolitos largos adsorben mejor que los cortos. VII. Descripción Detallada de la Invención A. Explicación de los Términos Por conveniencia en la descripción consecuente, las siguientes explicaciones de términos son adoptadas. Sin embargo, estas explicaciones se proponen para ser ejemplares solamente. Ellas no se proponen para limitar los términos como se describen o se refieren por toda la especificación. Más bien, estas explicaciones se proponen para incluir cualquiera de los aspectos adicionales y/o ejemplos de los términos como son descritos y reclamados en la presente. Como se utiliza en la presente, "biocompatibilidad" significa que no causa efecto a la salud adverso de la ingestión, contacto con la piel, o introducción a la corriente sanguínea. Como se utiliza en la presente, "respuesta inmune" significa la respuesta del sistema inmune humano a la presencia de una sustancia en la corriente sanguínea. Una respuesta inmune se puede caracterizar en un número de maneras, por ejemplo, mediante un incremento en la corriente sanguínea del número de anticuerpos que reconocen un cierto antígeno. "Los anticuerpos son proteínas hechos por el sistema inmune, y un antígeno es una entidad que genera una respuesta inmune) . El cuerpo humano pelea con la infección e inhibe la reinfección al incrementar el número de anticuerpos en la corriente sanguínea. La respuesta inmune específica depende un poco sobre el individuo, aunque patrones generales de respuesta son la norma. Como se utiliza en la presente, "epítope" significa la estructura de una proteína que es reconocida por un anticuerpo. Ordinariamente un epítope estará sobre la superficie de- una proteína. Un "epítope continuo" es uno que involucra varios aminoácidos en una hilera, no uno que involucra residuos de aminoácidos que se encuentran por casualidad en contacto con una proteína plegada. Como se utiliza en la presente, "porción de secuencia" y "porción" significa una secuencia de aminoácidos de un número dado de residuos identificados utilizando el método de la invención actual. En una modalidad preferida, el número de residuos es 7. Como se utiliza en la presente, "secuencia de aminoácidos" y "secuencia" significa cualquier longitud de cadena de polipéptido que es por lo menos dos residuos de amino de largo. Como se utiliza en la presente, "residuo" significa un aminoácido en un polímero; esté es el residuo del monómero de aminoácido del cual se formó el polímero. La síntesis de ppolipéptido involucra la deshidratación - una molécula de agua individual se "pierde" en la adición del aminoácido a una cadena de pólipéptido. Como se utiliza en la presente, "polipéptido diseñado" significa un polipéptido diseñado utilizando el método de la presente invención, y los términos "péptido" y "polipéptido" se utilizan intercambiablemente. Como se utiliza en la presente, "estructura primaria" significa la secuencia lineal de aminoácidos en una cadena de polipéptido, y "estructura secundaria" significa los tipos más o menos regulares de estructura estabilizados por interacciones no covalentes, usualmente enlaces de hidrógeno - ejemplos incluyen a-hélice, ?-lámina y /j-vuelta. Como se utiliza en la presente, "aminoácido" no está limitado a los 20 aminoácidos que ocurren naturalmente; el término también se refiere a D-aminoácidos, L-aminoácidos y aminoácidos no naturales, como el contexto lo permita. Como se utiliza en la presente, "aminoácidos no naturales" significan aminoácidos diferentes de los 20 que ocurren naturalmente. Las siguientes abreviaciones de tres letras se utilizan en la presente para los 20 aminoácidos usuales: Ala = alanina Cys = cisteína ASP = ácido aspártico GIu = ácido glutámico Phe = fenilalanina Gly = glicina His = histidina He = isoleucina Lys = lisina Leu = leucina Met = metionina Asn = asparagina Pro = prolina GIn = glutamina Arg = arginina Ser = serina Thr = treonina Val = valina Trp = triptofano Tyr = tirosina B. Descripción de la Invención La presente invención proporciona un método para diseñar polipéptidos para la nanof bricación mediante ELBL de películas delgadas, recubrimientos y microcápsulas para aplicaciones en biomedicina y otros campos. El método involucra 5 incumbencias de diseño primarias: (1) las propiedades electrostáticas de los polipéptidos; (2) la estructura física de los polipéptidos; (3) la estabilidad física de las películas formadas de los polipéptidos; (4) la biocompatibilidad de los polipéptidos y películas; y (5) la bioactividad de los polipéptidos y películas. La primera incumbencia de diseño, la electrostática, es quizás la más importante debido a que es la base de ELBL. Sin propiedades de carga adecuadas, un polipéptido no será soluble en solución acuosa y no puede ser utilizado para la nanofabricación de películas mediante ELBL. Los inventores han ideado un proceso para identificar en la información de secuencia de aminoácidos porciones de secuencias de aminoácidos que tienen propiedades electrostáticas adecuadas para el ELBL. La estructura secundaria de los polípéptidos utilizados para ELBL también es importante, debido a que las propiedades físicas de la película, incluyendo su estabilidad, dependerán de como la estructura en solución del péptido se traduce en su estructura en la película. La Figura 11 ilustra como la estructura en solución de ciertos polipéptidos se correlacionan con el ensamble de película. El panel (a) muestra como el comportamiento de ensamble de poli-L-glutamato y poli-L-lisina depende sobre el pH. Es claro que la conformación dea-hélice se correlaciona con un grado más grande del material depositado que la conformación de a-lámina. La interpretación molecular precisa de este comportamiento queda para ser puesto en claro. El panel (b) muestra como la estructura de solución de estos péptidos depende del pH. En pH 4.2 poli-L-glutamato es grandemente a-helicoidal, como es poli-L-lisina en pH 10.5. Ambos polipéptidos están en una conformación similar a espiral grandemente no estructurada en pH 7.3. Las incumbencias restantes se relacionan a las aplicaciones de las películas de polipéptido. En la práctica de la invención, más o menos peso será colocado sobre otras incumbencias dependiendo de los requerimientos de diseño de una aplicación particular. Al utilizar el proceso de selección de la presente invención para identificar en la información de secuencia de aminoácidos porciones de secuencia de aminoácidos que tienen características de carga adecuadas, y al utilizar las otras incumbencias de diseño para seleccionar porciones particulares, se puede diseñar polipéptidos adecuados para la fabricación de ELBL de películas nano-organizadas para las aplicaciones en biomedicina y otros campos. Alternativamente, se puede utilizar el método de la presente invención para diseñar polipéptidos de novo para el uso en ELBL. El procedimiento de diseño de novo es esencialmente el mismo como la identificación de porciones en la información de secuencia de aminoácidos existente, excepto que cada residuo en una porción de secuencia de aminoácidos se selecciona por el profesional antes que una porción completa sea identificada en la información genómica o proteómica de un organismo específico. Se debe enfatizar que los principios de diseño de polipéptido fundamentales citados en la presente invención son independientes de sí los aminoácidos involucrados son los 20 aminoácidos que ocurren naturalmente, aminoácidos no naturales, o alguna combinación novedosa de éstos, en el caso del diseño de polipéptido de novo . Además, se podrían utilizar tanto los D-aminoácidos como los L-aminoácidos.

Las incumbencias de diseño de la presente invención se discuten en más detalle enseguida. 1. Electrostática Los inventores han ideado un proceso novedoso para identificar en la información de secuencia de aminoácidos porciones de secuencia de aminoácidos que tienen propiedades electrostáticas adecuadas para ELBL. Utilizando este proceso, los inventores han identificado 88,315 porciones de secuencia de aminoácido no redundantes en los datos de proteoma humano - la traducción de la porción del genoma que codifica todas las proteínas conocidas en el cuerpo humano. Esta información es públicamente disponible en el National Center for Biotechnology Information' s ("NCBI") sitio de la Red: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov>, entre otros lugares. Tal información está constantemente siendo actualizada conforme es adicionalmente analizado el genoma humano. Conforme se incrementa la cantidad de tal información, el número de porciones de secuencia de aminoácidos que podrían ser identificados en la información de secuencia humana mediante el proceso de selección de la presente invención como que tiene propiedades electrostáticas adecuadas para ELBL también se incrementará. Lo mismo es verdadero para cualquier organismo. Los principios bioquímicos y físicos aceptados, así como los resultados experimentales descritos enseguida, indican que las porciones de secuencia identificadas serán útiles para el diseño de polipéptidos para la nanofabricación de estructuras de ELBL. El criterio de selección clave es la carga promedio por longitud unitaria en pH neutro (pH 7, cercano al pH de la sangre humana) . Además, hay varias preferencias estructurales. Primero, se prefiere que cada porción de secuencia de aminoácidos consista de solamente 7 residuos. a. Número Total de Residuos en la Porción La longitud de porción de 7 se seleccionó en un esfuerzo para optimizar la biocompatibilidad, estructura física, y el número de porciones de secuencia no redundantes en los datos de secuencia de aminoácidos disponibles. Como se discute enseguida, se prefiere que por lo menos la mitad de los residuos de aminoácidos en cada porción de secuencia sean cargados. Además, se prefiere que todos los residuos cargados en cada porción sean de la misma carga. Estos requerimientos aseguran que cada porción será suficientemente soluble en el solvente acuoso y tenga suficiente carga en pH neutro para ser útil para ELBL. Debido a que solo un porcentaje relativamente pequeño de tipos de aminoácidos sean, cargados, conforme a la longitud de una secuencia de aminoácidos dada se incrementa, los nones disminuyen de modo que la secuencia tendrá un porcentaje suficiente de aminoácidos apropiadamente cargados para ELBL. 4 aminoácidos cargados es el mínimo preferido para un tamaño de porción de 7, debido a que menos que 4 cargas produce solubilidad del péptido sustancialmente disminuida y control disminuido sobre ELBL. Considerando la biocompatibilidad (discutida además enseguida) , cada porción de secuencia identificada es bastante larga en 7 residuos para constituir un epítope continuo (relevante a la respuesta inmune posible de un organismo en la cual podría ser introducida un péptido diseñado) , pero no mientras que corresponda sustancialmente a residuos tanto sobre la superficie de una proteína y en su interior; los requerimientos de carga ayudan a asegurar que la porción de secuencia ocurre en la superficie de la proteína plegada; un residuo cargado no puede ser formado en el núcleo de una proteína plegada. En contraste, una porción muy corta se presentaría al cuerpo para hacer una secuencia aleatoria, o una no específicamente "autosuficiente" y por lo tanto inducirá una respuesta inmune. Aunque la longitud ideal de un péptido para generar anticuerpos es un punto de alguna disputa, la mayoría de los antígenos de péptido varían en longitud de 12 a 16 residuos. Los péptidos que son de 9 residuos o más cortos pueden ser antígenos efectivos; los péptidos más largos de 12 a 16 aminoácidos pueden contener múltiples epítopes (Angeletti, R.H. (1999) Design of Useful Peptide Antígens, J. Bíomol . Tech . 10:2-10, la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) .

Así, para minibar la antigenicidad se preferiría un péptido más corto que 12 y, todavía mejor, más corto que 9 residuos. Las porciones preferidas no deben ser demasiado largas por otra razón: para minimizar la formación de estructura secundaria. La estructura secundaria disminuye el control de la estructura física de los polipéptidos (ver enseguida) y las películas hechas a partir de éstos. Además, el número máximo de porciones no redundantes se encuentra cuando el número de residuos en cada porción es 7. La Figura 6 muestra el número de porciones de secuencia no redundantes en la información de secuencia de aminoácidos humana disponible. El número más grande de porciones positivas es para una longitud de 5 residuos, mientras que el número más grande de porciones negativas es una longitud de 7 residuos. El número más grande de porciones positivas y negativas es aproximadamente el mismo para 5 y 7. Así, una longitud de porción de 7 residuos se presentaría que maximiza el número de porciones no redundantes. Por todas las razones anteriores, 7 residuos es la longitud preferida de porción para optimizar el diseño de polipéptido para ELBL. No obstante, es posible que en algunos casos porciones ya sea ligeramente más cortas o ligeramente más largas trabajarían igualmente bien. Por ejemplo, las porciones de 5 o 6 residuos de largo se pueden emplear, y las porciones en el orden de 8 a 15 residuos en longitud también podrían ser útiles. b. Número de Residuos Cargados Segundo, se prefiere que por lo menos 4 aminoácidos positivamente cargados (básicos) (Arg, His o Lys) o por lo menos 4 aminoácidos negativamente cargados (acidices) (Glu o Asp) estén presentes en cada porción de 7 residuos en pH neutro. Las combinaciones de cargas positivas y negativas son desfavorecidas en un esfuerzo para asegurar una densidad de carga suficientemente alta y pH neutro. Sin embargo, es posible que una porción que contiene aminoácidos tanto positivos como negativos podrían ser útiles para ELBL. Por ejemplo, una porción ligeramente más larga, es decir de 9 residuos, podría tener 6 aminoácidos positivamente cargados y 1 aminoácido negativamente cargado. Este es el balance de carga que es importante - el péptido total debe ser ya sea lo suficiente positivamente cargado o lo suficiente negativamente cargado en pH neutro. Modalidades preferidas de las porciones, sin embargo, contendrán solamente Glu o Asp o solamente Arg, His o Lys como los aminoácidos cargados (aunque otros aminoácidos no cargados podrían, y ordinariamente, harían formar parte de las porciones), a menos que los aminoácidos no naturales sean admitidos como aminoácidos acídicos o básicos. La Figura 5 es un diagrama de flujo que muestra las etapas involucradas en el proceso de selección para identificar secuencias de aminoácidos que tienen propiedades electrostáticas adecuadas. Se asume que solamente los 20 aminoácidos usuales están involucrados. Si la investigación para porciones negativamente cargadas, el proceso comienza al localizar un aminoácido en los datos de secuencia. Este aminoácido será llamado el "aminoácido iniciador" debido a que es el punto de inicio para el análisis de los aminoácidos circundantes (es. decir, - este comenzará la porción) . Enseguida, el aminoácido iniciador y los siguientes 6 residuos se examinan para ocurrencias de Arg, His o Lys. Si uno o más Arg, His o Lys se localiza en estos 7 aminoácidos, el proceso se comienza a renovar en otro aminoácido iniciador. Si no se encuentra Arg, His o Lys, los 7 aminoácidos se examinan para determinar el número de ocurrencias de Glu y/o Asp. Si hay por lo menos 4 ocurrencias de Glu y/o Asp en los 7 residuos, la porción de secuencia es catalogada. El proceso de selección es esencialmente el mismo para aminoácidos positivamente cargados, excepto que Glu- y Asp son reemplazados Arg, His y Lys, y Arg, His y Lys son reemplazados por Glu y Asp, respectivamente. Obviamente, también se podría comenzar el método en el inicio de la secuencia de aminoácidos (amino terminal) y proceder al final (carboxilo terminal) , o, alternativamente, se podría comenzar en un punto aleatorio y trabajar a través de todos los aminoácidos en la secuencia, aleatoriamente o sistemáticamente en cualquier dirección. Además, se podría utilizar el método para identificar porciones en la información de secuencia que contienen aminoácidos no naturales, por ejemplo, si los códigos se utilizaron para cada tipo de aminoácido no natural. En tal caso, se podría buscar para aminoácidos acídicos o básicos no naturales en lugar de Glu y Asp, y Arg, Lys, y His, respectivamente. Las incumbencias de diseños restantes, específicamente, estructura física, estabilidad física, biocompatibilidad y biofuncionalidad, tratan principalmente con la aplicación particular para la cual será utilizada los polipéptidos diseñados. Como se mencionó en lo anterior, más o menos peso será colocado en estas incumbencias durante el proceso de diseño, dependiendo de las propiedades de péptido deseadas para una aplicación particular. 2. Estructura Física Una incumbencia de diseño que considera las porciones de secuencia de aminoácidos es su propensión a formar estructuras secundarias, notablemente a-hélice o ß-lámina. Los inventores han buscado de varias maneras controlar, notablemente minimizar, la formación de estructura secundaria de polipéptidos diseñados en un medio acuoso con el fin de maximizar el control sobre la formación de capa de película delgada. Primero, se prefiere que las porciones de secuencia sean relativamente cortas, debido a que las porciones largas son más probables que adopten una estructura tridimensional estable en solución. Segundo, los inventores colocan un residuo de glicina entre cada porción en modalidades preferidas de los diseños de polipéptido. La glicina tiene una propensión de a-hélice muy baja y una propensión de /5-lámina muy baja, haciéndola energéticamente muy desfavorable para una glicina y sus aminoácidos vecinos para formar estructura secundaria regular en solución acuosa. La prolina tiene propiedades similares en algunos aspectos y podría ser utilizada como una alternativa a la glicina para unir porciones. Tercero, los inventores han buscado minimizar la propensión de a-hélice y /i-lámina de los polipéptidos diseñados por sí mismos al enfocarse sobre porciones para las cuales la propensión de a-hélice sumada es menor que 7.5 y la propensión de /J-lámina sumada es menor que 8. (Propensión "sumada" significa la suma de las propensiones de a-hélice o ß-lámina de todos los aminoácidos en una porción) . Sin embargo, es posible, que las secuencias de aminoácidos que tienen una propensión de a-hélice sumada un poco más alta y/o propensión de ß-lámina sumada serán adecuados para ELBL bajo algunas circunstancias, ya que los residuos de Gly (o Pro) entre las porciones desempeñarán una función clave en inhibir la formación de estructura secundaria estable en el polipéptido diseñado. De hecho, puede ser deseable en ciertas aplicaciones para la propensión de un polipéptido para formar estructura secundaria que sea relativamente alta, como una característica de diseño específica de la fabricación de película delgada; los requerimientos de carga electrostática necesarios para ELBL todavía deben ser satisfechos, como es discutido en lo anterior. Con el fin de ser capaz de seleccionar secuencias de aminoácidos con propensiones de estructuras secundarias deseadas, los inventores primero calcularon las propensiones de estructura . secundaria para todos los 20 aminoácidos utilizando el método de Chou y Fasman (ver P. Chou y G. Fasman Biochemistry 13:211 (1974), que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) utilizando la información estructural de más de 1,800 estructuras cristalográficas de rayos X de alta resolución (1,334 que contienen 7-hélices y 1,221 que contienen ?-hebras) . Las estructuras se seleccionaron del banco de datos de proteína (un depositario públicamente accesible de estructuras de proteína) basado en: (a) método de determinación de. estructura (difracción de rayos X) ; (b) resolución (mejor que 2.0 Á) — "resolución" en este contexto se refiere al tamaño mínimo que una estructura puede resolver, como en el criterio de Rayleigh; y (c) diversidad estructural (menos de 50% de identidad de secuencia entre las estructuras cristalográficas de proteína utilizadas para calcular las propensiones de hélice y de lámina de los diversos aminoácidos) . La exposición razonada fue seleccionar estructuras de alta resolución determinadas por la metodología más confiable y no para desviar el cálculo de propensión al tener estructuras similares. Enseguida, por comparación si en 100,000 secuencias aleatorias no redundantes se produjeron utilizando un generador 'de número -aleatorio en una computadora personal. ' Los inventores luego calcularon las propensiones de estructura secundaria para las 88,315 secuencias de aminoácidos identificadas utilizando el proceso de selección descrito en la parte VII (B) (1) anterior (59,385 porciones de secuencias básicas no redundantes y 28,930 porciones de secuencia acídicas no redundantes) . Las propensiones para las secuencias aleatorias luego se compararon con las propensiones de las secuencias seleccionadas. La Figura 2 muestra la distribución de las propensiones de formación de estructura secundaria en estas porciones de secuencia. El rectángulo de la Figura 2 resalta las porciones de secuencia que los inventores han identificado como menos probables para formar estructuras secundarias sobre la base de las propensiones de estructura secundaria. 3. Estabilidad Física Otra incumbencia de diseño es el control de la estabilidad de las películas de ELBL de polipéptido. Enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, e interacciones hidrofóbicas proporcionan algo, aunque relativamente limitada, estabilidad a las películas de ELBL. En contraste, los enlaces de disulfuro covalentes podrían proporcionar resistencia estructural excepcional. Los inventores han ideado un proceso de novedoso para utilizar cisteína (o algún otro tipo de aminoácido que contiene sulfhidrilo) para "fijar" y "desfijar" capas adyacentes de película de ELBL de polipéptido. Este proceso permite que una película de nanofabricado de polipéptido permanezca estable en los extremos de pH, dando control más grande sobre su estabilidad mecánica y las propiedades difusivas (para discusiones de porosidad de películas de multicapas hechas de polielectrolitos no polipéptido, ver Caruso, F. , Niikura, K. , Furlong, N. y Okahata (1997) Langmuír 13:3427 y Caruso, F. , Furlong, N., Ariga, K. , Ichinose, L, y Kunitake, T. (1998) Langmuir 14:4559, ambas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades) . También, la incorporación de cisteína (o algún otro tipo de aminoácido que contiene sulfhidrilo) en una porción de secuencia .de un polipéptido diseñado permite el uso de péptidos relativamente cortos en la fabricación de película delgada, en virtud de la formación del enlace de disulfuro intermolecular. Sin la cisteína, tales péptidos no producirían generalmente de manera suficiente películas estables (ver la Figura 12, discutida enseguida) . Así, el uso novedoso de los inventores de la cisteína evitaría la necesidad para producir versiones largas costosas de los polipéptidos diseñados en un porcentaje sustancial de posibles aplicaciones. Esto será particularmente ventajoso en situaciones donde la película delgada va a ser fabricada sobre material para ser encapsulado, por ejemplo un cristal pequeño de un fármaco, un cristal de hemoglobina esférica pequeña, o una solución que contiene hemoglobina. Para aplicaciones en las cuales la estabilidad física de las películas es importante, las porciones de secuencia de aminoácidos que contienen cisteína (o algún otro tipo de aminoácido que contiene sulfhidrilo) se pueden seleccionar de la librería de porciones identificadas utilizando los métodos discutidos en lo anterior, o diseñados de novo utilizando los principios descritos en lo anterior. Los polipéptidos luego se pueden diseñar y fabricar basado en las porciones de secuencia de aminoácidos seleccionados o diseñados. Una vez que los polipéptidos se han sintetizado químicamente o producido en un organismo hospedero, el ensamble de ELBL de péptidos que contienen cisteína se hace en la presencia de un agente reductor, para prevenir la formación de enlace de disulfuro prematura. Después del ensamble, el agente reductor removido y se adiciona un agente oxidante. En la presencia del agente oxidante los enlaces de disulfuro se forman entre los residuos de cisteína, "fijando" de esta manera de manera conjunta_ o las capas de polipéptido que los contienen. Este método de "fijación" puede ser además ilustrado utilizando el siguiente ejemplo específico de fabricación de microcápsula . Primero, los polipéptidos diseñados que contienen cisteína se utilizan para formar multicapas mediante ELBL sobre una superficie esférica adecuadamente cargada, normalmente en solución acuosa a pH neutro y en la presencia de ditiotreitol ("DTT") , un agente reductor. Enseguida, el DTT se remueve por filtración, difusión o algún otro método conocido similar en la técnica, que causa que la cisteína forme pares de cadenas laterales de cisteína y de esta manera se estabilice la' película. Si las multicapas de péptido se construyen sobre una partícula de núcleo que contiene los materiales que se desean encapsular, por ejemplo un material cristalino, el proceso de fabricación se completa y la partícula de núcleo puede además ser hecha para disolverse en el medio ambiente encapsulado, por ejemplo mediante un cambio de pH. Sin embargo, si las multicapas se construyen en una partícula de núcleo "simulada", el núcleo debe ser removido. En el caso de partículas de melamina formaldehído ("MF") , por ejemplo, el núcleo es ordinariamente disuelto al disminuir el pH — la disolución es catalizada con ácido. Después de la disolución del núcleo, el pH de la solución se ajusta a 4, donde la carga parcial sobre los polianiones de péptido hace las icrocápsulas semipermeables (comparar Lvov y- colaboradores, (2001) Nano Letters 1:125, que es incorporada en la presente por referencia en totalidad) . Enseguida, se adiciona DTT 10 M a la solución de microcápsula para reducir la cistina a cisteína. Las microcápsulas luego pueden ser "cargadas" al transferirlas a una solución concentrada del material a ser encapsulado, por ejemplo una proteína ( ibid) . La proteína entra a las microcápsulas al mover hacia abajo su gradiente de concentración. La proteína encapsulada es "fijada" mediante la remoción de reductante y la adición de oxidante, para de esta manera promover la reformación de enlaces de disulfuro. Una ilustración esquemática del método de "fijación" y "desfijación" de cisteína de la presente invención se muestra en la 1 Figura 4. La cisteína puede formar enlaces de disulfuro tanto intra- e inter-moleculares . Además, los enlaces de disulfuro se pueden formar entre moléculas en la misma capa o capas adyacentes, dependiendo de la localización de los péptidos que contienen cisteína en la película. Con referencia a la Figura 4 (a) , los polipéptidos básicos 2 se enlazan mediante enlaces de disulfuro 3 en todas las capas en las cuales los péptidos básicos contienen cisteína. Los péptidos acídicos de la capa de intervención (representada en la figura por una capa translúcida 4) no contienen cisteína. Sin embargo, capas alternantes continúan atrayéndose entre sí electrostáticamente, si las cadenas laterales acídicas y básicas se cargan . en el pH del medio ambiente circundante. Con referencia a la Figura 4 (b) , los enlaces de disulfuro se muestran entre las capas. Tales estructuras se formarán cuando los polipéptidos tanto acídicos como básicos (es decir, capas de polipéptido alternantes) utilizadas para ELBL que contienen cisteína y el procedimiento utilizado ha sido adecuado para la formación de enlace de disulfuro. Con referencia a la Figura 4 (c) , las reacciones de reducción y oxidación se utilizan para regular la liberación de compuestos encapsulados 5 al romper y formar enlaces de disulfuro 3, respectivamente, y para regular de esta manera la difusión de partículas a través de la pared de la cápsula. La "fijación" y "desfijación" de cisteína es una manera novedosa de regular la integridad estructural y la permeabilidad de las películas de ELBL. Es conocido en la técnica que el glutaraldehído puede ser utilizado para reticular proteínas, y esta sustancia química por lo tanto podría ser utilizada para estabilizar películas de polipéptido. La reticulación del glutaraldehído, sin embargo, es irreversible. En contraste, el método de "fijación" y "desfijación" de cisteína de la presente invención es reversible y, por lo tanto, ofrece mejor control sobre la formación de estructura y, de manera importante, el uso de las películas y cápsulas que pueden ser fabricadas utilizando la presente invención. La sangre es un medio ambiente oxidante. Así, en ciertas aplicaciones biomédicas, por ejemplo glóbulos rojos artificiales o sistemas de suministro de fármacos fabricados a partir de polipéptidos diseñados, la exposición de la película de polipéptido reticulada de Cys a la sangre o a algún otro medio ambiente oxidante después de la formación de enlaces de disulfuro no se espera que cause que se rompan esos enlaces. Finalmente, también debe ser observado que las aplicaciones que involucran aminoácidos no naturales reemplazarían Cys con algún otro tipo de aminoácido que contiene sulfhidrilo. Por ejemplo, un sulfhidrilo podría ser adicionado a ß-aminoácidos tal co o el ácido D,L,.?-amino-?-ciclohexilpropiónico; ácido D,L-3-aminobutanoico; o ácido 5- (metiltio) -3-aminopentanoico (ver http : //ww . synthatex . com) . 4. ' Biocompatibilidad La biocompatibilidad es una incumbencia de diseño mayor en aplicaciones biomédicas. En tales aplicaciones, el profesional de la presente invención se dirigirá a identificar la información genómica o proteómica que producirá polipéptidos "inertes inmunes", particularmente si el objeto fabricado o cubierto se pondrá en contacto con la sangre circulante. Para propósitos de la presente invención, se prefiere que el proceso de selección discutido en la parte VII (B) (I) anterior sea utilizado para analizar las secuencias de aminoácidos de proteínas de sangre. Esto maximizará las casualidades de minimizar la respuesta inmune de un organismo . Los algoritmos de computadora existen para predecir la antigenicidad de una secuencia de aminoácidos. Tales métodos, sin embargo, se conocen en la técnica que son semi-confiables en el mejor de los casos. En la presente invención, las porciones de secuencia identificadas utilizando el método de selección discutido anteriormente en la parte VII (B) (I) son altamente polares. Las porciones por lo tanto, deben ocurrir sobre la superficie del estado nativo de las proteínas de las cuales ellas son parte de la secuencia. La "superficie" es aquella parte de una proteína plegada que está en contacto con el solvente o inaccesible al solvente solamente debido a la naturaleza granular del agua. El "interior" es aquella parte de una proteína plegada que es inaccesible al solvente por o alguna otra razón. Una proteína soluble globular plegada es similar a un cristal orgánico, el interior que es tan densamente empacado como en la red de cristal y el exterior que está en contacto con el solvente, ag.ua . Debido a sus propiedades de carga, las porciones de secuencia de polipéptido identificados utilizando el método de la presente invención deben ocurrir principalmente, si no que exclusivamente, sobre la superficie de una proteína. Así, todos las porciones de secuencia identificadas en las proteínas de la sangre humana utilizando el proceso de selección de la invención actual están de manera efectiva siempre en contacto con el sistema inmune mientras que la proteína está en la sangre. Esto se mantiene para todas las conformaciones de la proteína que podrían llegar a ser pobladas en la corriente sanguínea, incluyendo estados desnaturalizados, debido a que es de manera alta energéticamente no favorable para transferir una carga de un medio acuoso a uno de baja dieléctrica (como ocurre en un interior de proteína) . Los principios bioquímicos aceptados indican, por lo tanto, que los polipéptidos diseñados de proteínas de la sangre utilizando el método de la presente invención ya sea que no induce una respuesta inmune o inducirán una respuesta inmune mínima. Por las mismas razones, los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención deben ser . biocompatibles . Todas las porciones de secuencia identificadas de datos genómicos utilizando el proceso de selección de la invención actual, no solamente aquellos en las proteínas de la sangre, deben ser biocompatibles, aunque el grado de respuesta inmune o cualquier otro tipo de respuesta biológica puede depender de los detalles específicos de una porción de secuencia. (Debido a que las secuencias de polipéptido sobre las cuales porciones están basadas actualmente ocurren en el organismo para el cual la película ha sido fabricada, este procedimiento, por lo menos en principio, trabajará igualmente bien para cualquier tipo de organismo. Por ejemplo, el procedimiento puede ser de valor significante para la ciencia veterinaria) . Tanto la respuesta inmune como la biocompatibilidad son importantes con considerando el uso de los péptidos diseñados en aplicaciones biomédicas, incluyendo, sin limitación, la manufactura de glóbulos artificiales, sistemas de suministro de fármaco, o polipéptidos para la fabricación de películas biocompatibles para cubrir implantes para la introducción a corto plazo o a largo plazo en un organismo. 5. Bioactividad En algunas aplicaciones de películas delgadas de polipéptido, recubrimientos, o microcápsulas, puede ser deseable modificar el diseño de los polipéptidos para incluir un dominio funcional para el uso en alguna capa de la estructura, frecuentemente la más externa. Un dominio funcional en este contexto es una región independientemente termoestable de una proteína que tiene biofuncionalidad específica (por ejemplo fosfotirosina de enlace) . Es bien conocido en la técnica que tal biofuncionalidad puede ser integrada con otras funcionalidades en una proteína de multi-dominio, como por ejemplo en la tensina de proteína, que comprende un dominio de enlace de fosfotirosina y un dominio de tirosina fosfatasa de proteína. La inclusión de tal dominio en un polipéptido diseñado podría funcionar de un número de maneras, incluyendo sin limitación el enlace de ligando específico, dirección in vivo, biodetección o biocatálisis . C. Usos para Polipéptidos Diseñados Utilizando el Método de la Presente Invención Como se mencionó en lo anterior, los polipéptidos de diseño adecuado son excelentes materiales para ELBL, y estructuras de película de polipéptido formadas utilizando ELBL serán útiles en un gran número de diferentes tipos de aplicaciones. Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención se han mostrado que son útiles para ELBL de estructuras de película para aplicaciones posibles en tecnología biomédica, tecnología de alimentos y la tecnología ambiental. Por ejemplo, tales polipéptidos se podrían utilizar para fabricar glóbulos rojos artificiales. 1. Glóbulos Rojos Artificiales Un número de diferentes procedimientos se han tomado para desarrollar substituto de glóbulos rojos. Un procedimiento involucra el uso de perfluorocarbonos . Las emulsiones de perfluorocarbono contienen hidrocarbonos fluorados sintéticos capaces de enlazar oxígeno y suministrarlos a los tejidos. Este procedimiento sin embargo, incrementa el bloqueo de celular reticulo-endotelial . Los perfluorocarbonos pueden llegar a ser atrapados en el sistema reticulo-endotelial, que puede dar por resultado consecuencias adversas. Otro procedimiento se enfoca sobre el camuflajeamiento de antígeno, que involucra recubrir glóbulos rojos con un polímero biocompatible llamado polietilenglicol (PEG) . Las moléculas de PEG forman enlaces covalentes permanentes sobre la superficie de la célula. El recubrimiento efectivamente oculta las moléculas antigénicas sobre la superficie de los glóbulos rojos, de modo que los anticuerpos del recipiente de sangre no reconocen las células como extrañas. Por ejemplo, el sistema inmune de una persona normal quien tiene sangre tipo A naturalmente tendrá anticuerpos que reconocen antígenos sobre la superficie de los glóbulos rojos del tipo B, conduciendo a la destrucción celular. La unión de PEG a la superficie de un glóbulo rojo tipo B "camuflajea" la superficie de la célula, de modo que sus antígenos de superficie no pueden ser reconocidos por más tiempo por el sistema inmune y los glóbulos rojos antigénica ente extraños no son destruidos tan rápidamente (ver Pargaonkar, N.A., G. Sharma y K.K. Vistakula. (2001) "Artificial Blood: Current Research Report", la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . Un número de enfermedades, incluyendo talasemia, que requieren transfusiones de sangre repetidas son frecuentemente complicadas por el desarrollo de anticuerpos para "aminorar" los antígenos de glóbulos rojos. Esta "alosensibilización" pueden transformar a estos pacientes casi imposibles de transfusión, volviendo la situación amenazante de la vida. En la prueba in vitro, los glóbulos rojos modificados con PEG no aparecen para activar la alosensibilización y también pueden ser útiles en situaciones clínicas donde la alosensibilización ya ha ocurrido (ver Scott, M.D. y colaboradores, (1997) "Chemical camouflage of antigenic determinants : Stealth erythrocytes", Proc . Na ti . Acad. Sci . EUA. 94 (14 ): 7566-7571, la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . Otros procedimientos involucran la hemoglobina purificada. La hemoglobina libre de células no modificada tiene limitaciones conocidas . Estas incluyen afinidad del oxígeno que es demasiado alta para la oxigenación del tejido efectiva, una vida media dentro del espacio intravascular que es demasiado corto para ser clínicamente útil, y una tendencia a someterse a la disociación en dímeros con el daño de tubular renal resultante y toxicidad. Debido a estas limitaciones, la hemoglobina utilizada para hacer un substituto de glóbulo rojo libre de célula debe ser modificado. Un número de técnicas de modificación se han desarrollado. La hemoglobina puede ser reticulada (un enlace covalente entre dos moléculas se hace mediante modificación química) y polimerizar utilizando reactivos tal como glutaraldehído. Tales modificaciones da por resultado un producto que tienen una P50 más alta (presión parcial de oxígeno en la cual 50% de todos los sitios de enlace de oxígeno son ocupados) aquella de la hemoglobina normal, y un incremento en la vida media en el plasma de hasta 30 horas. La fuente de la hemoglobina para este propósito puede ser humana (sangre donada actualizada) , bovina, - o recombinante humana. La solución de hemoglobina modificada se prepara a partir de hemoglobina altamente purificada y tomada a través de varios procesos bioquímicos, para eliminar fosfolípidos, endotoxinas y contaminantes virales (ver Nester, T. y Simpson, M (2000) "Transfusión medicine update", Blood Substitutes, la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . Biopure Corporation (Cambridge, mA) han estado utilizando hemoglobina modificada para su producto, Hemopure . . El efecto adverso potencial principal de las soluciones de hemoglobina modificada es un incremento en la resistencia vascular sistémica y pulmonar que puede conducir a una disminución en el índice cardiaco. Las disminuciones del índice cardíaco pueden deteriorar el suministro de oxígeno óptimo y exceder la ventaja de una solución que lleva oxígeno (ver Kasper S.M. y colaboradores, (1998) "The effects of increased doses of bovine hemoglobin on hemodynamics and oxygen transport in patients undergoing preoperative hemodilution for elective abdominal aortic surgery", Anesth . Analg. 87:284-91, la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . Un estudio ha examinado la utilidad de estas soluciones en la fase de resucitación aguda de pacientes de trauma inestable. El diseño del estudio, sin embargo, fue pobre, y cualquier función de las soluciones en influenciar el efecto del paciente final no fue claro (ver Koenigsberg D. y colaboradores, (1999) "The efficacy trial of diaspirin cross-linked hemoglobin in the treatment of severe traumatic hemorrhagic shock", Acad. Emerg. Med. 6:379-80, la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) . Muchos de los problemas de la hemoglobina libre de célula pueden ser superados al encapsularla con una membrana artificial. Los liposomas están siendo utilizados para encapsular hemoglobina para el uso como un substituto de sangre. El procedimiento es técnicamente desafiante debido a que no solamente debe ser preparada la hemoglobina está debe ser encapsulada en concentración relativamente alta y rendimiento. Los productos finales deben ser estériles y los liposomas deben ser de tamaño relativamente uniformes. La hemoglobina encapsulada tiene varias ventajas sobre la hemoglobina libre de célula. En primer lugar, la membrana de célula artificial protege la hemoglobina de las fuerzas degradantes y oxidantes en el plasma. En segundo lugar, la membrana protege el endotelio vascular de los efectos tóxicos de la hemoglobina. Éstos se relacionan a la pérdida de heme, la producción de radicales libres de 02 y los efectos vasoconstrictores del enlace NO. En tercer lugar, la encapsulación grandemente incrementa la persistencia circulante de la hemoglobina. Además, la hemoglobina encapsulada puede ser secada por congelación para el almacenamiento conveniente. La encapsulación liposomal involucra fosfolípidos, como en las membranas celulares. Un problema mayor asociado con la encapsulación liposomal, sin embargo, es que es muy difícil regular el tamaño promedio y la distribución de los liposomas. Otro es que distinto a los glóbulos rojos, los liposomas frecuentemente no son muy estables, ya que ordinariamente carecen de citoesqueleto organizado. Todavía otro problema es que los liposomas frecuentemente consisten capas múltiples de fosfolípido. (Una revisión reciente del substituto de sangre se presenta en Stowell y colaboradores,- (2001) Progress in the development of RBC substitutes, Transfusión 41:287-299, la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Ver también Chang, T. 1998 "Modified hemoglobin-based blood substitutes: cross linked, recombinant and encapsulated hemoglobin", Artificial Cell 74 Suppl 2:233-41, la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad) .

Los substitutos de glóbulos rojos que emplean polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención deben ofrecer varias ventajas sobre los procedimientos para el desarrollo de substitutos de glóbulos rojos conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitación, funcionalidad de enlace de oxígeno y dióxido de carbono superior, menor costo de producción (gran escala y por lo tanto la producción a bajo costo es posible debido a que las bacterias pueden ser utilizadas para producir en masa los péptidos y debido a que el ELBL de péptido puede ser - automatizado) , la posibilidad de utilizar preparaciones adecuadas de hemoglobina como una plantilla para ELBL, biodegradabilidad del polipéptido, la "capacidad inerte" inmune de los polipéptidos diseñados basados en la estructura de la proteína de la sangre, y la estabilidad estructural exhibida por las películas de polipéptido diseñadas, que excede aquellas de los liposomas. El ensamble de ELBL de polipéptido produce películas semi-porosas, minimizando la cantidad de material requerido para fabricar un medio de encapsulación y permitiendo que la glucosa, oxígeno, dióxido de carbono y varios metabolitos se difundan tan libremente a través de las películas como un bicapa de lípido. En contraste, otros polímeros potencialmente adecuados para este propósito tienen efectos secundarios indeseables —• por ejemplo, el polilacturo se degrada en ácido láctico, la sustancia que causa calambres musculares, y el poli (sulfonato de estireno) no es biocompatible . Las microcápsulas podrían ser formadas de polipéptidos diseñados para encapsular hemoglobina que sirve como un substituto de glóbulos rojos. Las microcápsulas de polipéptido de hemoglobina también podrían ser diseñadas para incorporar enzimas, incluyendo superóxido dismutasa, catalasa y metemoglobina reductasa, que son ordinariamente importantes para la función del glóbulo rojo. Además, las microcápsulas nanofabricadas pueden predeciblemente ser deshidratadas, sugiriendo que los glóbulos rojos artificiales hechos como es descrito en la presente podrían ser deshidratados, sin la pérdida de función, particularmente debido a que la hemoglobina puede ser liofilizada (es decir, secada por congelación) y reconstituida sin pérdida de función, y las películas de poliiones son estables a la deshidratación. Esto será importante para "el almacenamiento a largo plazo, transporte de substitutos de sangre, aplicaciones en campos de batalla (particularmente en localizaciones remotas) , y exploración espacial. Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención también podrían ser utilizados para el suministro de fármaco. 2. Suministro de Fármaco Los "núcleos" de tamaño de miera de un material terapéutico adecuado en forma "cristalina" se pueden encapsular mediante polipéptídos diseñados, y las microcápsulas resultantes podrían ser utilizadas para el suministro de fármaco. El núcleo debe ser insoluble bajo algunas condiciones, por ejemplo alto pH o baja temperatura, y soluble bajo las condiciones donde la liberación controlada ocurrirá. La carga de superficie sobre los cristales se puede determinar mediante las mediciones de ?-potencial (utilizadas para determinar ?a carga en unidades electrostáticas sobre partículas coloidales en un medio líquido) . La proporción en la cual los contenidos de la microcápsula son liberados desde el interior de la microcápsula al medio ambiente circundante dependerá de un número de factores, incluyendo el espesor de la cubierta encapsulante, los polipéptidos utilizados en la cubierta, la presencia de enlaces de disulfuro, el grado de reticulación de los péptidos, temperatura, intensidad iónica, y el método utilizado para ensamblar los péptidos. Generalmente, entre más gruesa es la cápsula, más largo es el tiempo de liberación — el principio se asemeja a aquel de la cromatografía de filtración de gel. Algo de trabajo se ha hecho sobre la liberación sostenida de las microcápsulas de ELBL (ver Antipov, A. , Sukhorukov, G.B., Donath, E. y Mohwald, H. (2001) J. Phys . Chem . B, 105:2281-2284 y Freemantle, M. (2002) Polyelectrolyte multilayers, Chem . Eng. News, 80:44-48, ambas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades) . Los polielectrolitos que se han utilizado son PSS, PAH, PAA, PVS, PEÍ y PDDA. Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención deben ofrecer un número de ventajas en el contexto del suministro de fármaco, incluyendo sin limitación el control sobre las características físicas, químicas y biológicas de la microcápsula; la habilidad para hacer cápsulas con un diámetro de menos de 1 mm, haciendo las cápsulas adecuadas para inyección; baja probabilidad de inducir una respuesta inmune; generalmente alta biocompatibilidad de las cápsulas; control sobre las propiedades difusivas de las microcápsulas al variar el espesor de las capas y usando cisteína, como es discutido enseguida; la habilidad de las localizaciones específicas objetivo mediante la modificación de la superficie de microcápsula utilizando los grupos sulfhidrilo altamente reactivos en cisteína (como es bien conocido en la técnica, grupos sulfhidrilo libres, grupos amino libres y grupos carboxilo libres son sitios a los cuales se podrían unir las moléculas para dirección específica) , o mediante la incorporación de un dominio funcional específico del diseño del polipéptido; y la habilidad de las microestructuras para hacer tomadas por las células utilizando ya sea endocitosis o pinocitosis.

Los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención también se podrían utilizar para recubrimientos antimicrobianos. 3. Recubrimientos Antimicrobianos El método de la presente invención podría ser utilizado para manufacturar películas que comprenden péptidos antimicrobianos. Por ejemplo, una secuencia adecuada podría ser Histatin 5, que ocurre en humanos: Asp Ser His Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys His Glu Lys His His Ser His Arg Gly Tyr (SEQ ID NO: 8) La preponderancia de carga positiva en pH ligeramente básico hace esta secuencia muy adecuada para ELBL. Esta podría ser añadida a un péptido diseñado usando el método de la presente invención, dando por resultado un péptido antimicrobiano adecuado para el uso en ELBL. Este péptido podría ser utilizado como un recubrimiento anti-bioensuciamiento. Por ejemplo, el péptido podría ser utilizado para formar un recubrimiento sobre dispositivos utilizados para implantación. Existe un número de otras áreas en las cuales los péptidos diseñados usando el método de la presente invención podrían ser útiles. 4. Otros usos Otros usos posibles para los péptidos diseñados utilizando el método de la presente invención incluyen sin limitación cubiertas para alimentos, envolturas y capas de separación; estuches de alimentos, saquillos, bolsas y etiquetas; recubrimientos de alimentos; microcápsulas de ingredientes alimenticios; recubrimientos de fármaco, cápsulas y microcápsulas; artículos de servicio de alimentos desechables (platos, vasos, cubiertos); bolsas para basura; bolsas solubles en agua para fertilizantes y pesticidas; microcápsulas para fertilizantes y pesticidas; estiércoles agrícolas; recubrimientos de papel; empaque de relleno suelto; productos médicos desechables (por ejemplo, guantes y batas); y pañales desechables. D. Fabricación Una vez que las porciones de secuencia de aminoácidos son seleccionadas para aquellos identificados utilizando el método discutido en la Parte VII (B) (I) anterior o diseñado de novo, el polipéptido diseñado se sintetiza utilizando métodos bien conocidos en la técnica, tal como la síntesis en fase sólida y la química de F-moc o la expresión heteróloga después de la clonación y transformación del gen.

Los polipéptidos diseñados se pueden sintetizar mediante una compañía de síntesis de péptido, por ejemplo SynPep Corp.

(Dublin, California) , se pueden producir en el laboratorio utilizando un sintetizador de péptidos, o se pueden producir mediante métodos recombinantes.

En una modalidad, un polipéptido diseñado consiste de porciones de secuencia de aminoácidos individuales unidos en tándem. La misma porción puede ser repetida, o diferentes porciones pueden ser unidas en el diseño de un polipéptido para ELBL. Por otra parte, dominios funcionales pueden ser incluidos, como es discutido en lo anterior. Otros aminoácidos que la glicina, podrían ser utilizados para enlazar las porciones de secuencia, y aminoácidos diferentes de los 20 usuales podrían ser incluidos en las porciones mismas, dependiendo de las propiedades deseadas del polipéptido. Otras propiedades podrían ser del mismo modo especificadas por los requerimientos de diseño, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la prolina podría ser incluida para la formación de vuelta, glicina para la flexibilidad de la cadena, e histidina para las propiedades de carga sensible al pH a casi pH neutro. Los aminoácidos "Hidrofóbícos" también podrían ser incluidos - el contenido de residuo hidrofóbico podría desempeñar una función de comportamiento del ensamble y contribuir a la estabilidad de una capa de una manera que se asemeja a la estabilización hidrofóbica de proteínas globulares. Se prefiere que los polipéptidos fabricados sean de por lo menos 15 aminoácidos de largo, aunque es más preferido que los polipéptidos fabricados sean de por lo menos 32 aminoácidos de largo. La razón para esto es que la pérdida de entropía por molécula es de esta manera termodinámicamente no favorable para polímeros cortos que la adsorción a una superficie opuestamente cargada es exhibida, aun si el polipéptido tiene una carga por longitud unitaria de 1; electrolitos largos absorben mejor que los cortos. Esto se ilustra en la Figura 12. Las masas de molécula promedio de los péptidos utilizados para los estudios de dependencia de longitud fueron 1,500-3,000 Da (poli-L-glutamato, "pequeño"), 3,800 Da (poli-L-lisina, "pequeño"), 17,000 Da (poli-L-glutamato, "medio"), 48,100 Da (poli-L-lisina, "medio"), 50,300 Da (poli-L-glutamato, "grande"), y 222,400 Da (poli-L-lisina, "grande"). Los datos mostrados en la Figura 12 claramente indican que ELBL depende de la longitud del péptido. La inclusión de Cys permite el uso de péptidos relativamente pequeños para ELBL, debido a que el grupo sulfidril se puede utilizar para formar enlaces de disulfuro entre los Polipéptidos. E. Experimentos 1. Ejemplo 1 — Diseño de Polipéptidos Basado en Secuencias de Proteína de Sangre Humana y su Uso en la Fabricación de Película de Polipéptido. Para este trabajo, secuencias de aminoácidos se seleccionaron utilizando el proceso descrito en la Parte VII (B) (I) anterior para identificar porciones de secuencia en la estructura primaria de proteínas' de sangre humana: Complemento C3 (gi 168766) fue la fuente de las porciones de secuencia aniónicas y lactotransferrina (gi 14505043) la fuente de las porciones de secuencia catiónicas . Como se discutió en lo anterior, las secuencias de proteína de sangre se utilizaron para minimizar la respuesta inmune de pacientes en quienes los dispositivos que involucran los polipéptidos podrían ser introducidos (incluyendo, por ejemplo, glóbulos rojos artificiales). En principio, este procedimiento debe ser aplicado para cualquier organismo que tiene un sistema inmune; este no está limitado a humano. Los polipéptidos se sintetizaron mediante SynPep Corp. (Dublin, California). Las secuencias de polipéptido fueron: Tyr Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp (SEQ ID NO: 2) Tyr Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln (SEQ ID NO: 1) Tyr Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Gly Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp (SEQ ID NO: 4) Tyr Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln (SEQ ID NO: 3) . Los residuos de aminoácido se representan por el código de tres letras dado en lo anterior. Una glicina se introdujo entre cada porción de 7 residuos para inhibir la formación de estructura secundaria. La glicina se seleccionó para este propósito debido a que permite la viabilidad más grande en combinación de los ángulos dihédricos (ver Ramachandran, G.N. and Saisekharan, V. (1968), Adv . Protein Chemistry, 23:283, que es incorporada por referencia en su totalidad) y tiene una propensión de baja hélice (0.677) y propensión de baja lámina (0.766). Alternativamente, la prolina podría ser sustituida por glicina entre las porciones sobre la base de las propensiones de estructura calculadas. Adicionalmente, una sola tirosina se incluyó en el N-terminal de cada péptido para la determinación de concentración mediante la adsorción de UV en 280 nm. Los polipéptidos fueron nombrados SN1 (SEQ ID NO:2), SP2 (SEQ ID NO : 1 ) , LN3 (SEQ ID NO: 4), y LP4 (SEQ ID NO: 3), respectivamente, que significa negativo corto, positivo corto, negativo largo y positivo largo. Estas secuencias son muy diferentes de polilisina (comúnmente utilizada en la técnica como un policatión) y poliglutamatos (comúnmente utilizado en la técnica como un polianión) que, aunque disponibles comercialmente y baratos, tienen una alta propensión de a-hélice bajo condiciones de pH leve y, crucialmente son inmunoreactivos . La carga calculada por longitud unitaria de los péptidos diseñados en pH neutro es de 0.5 unidades electrostáticas para SP y LP y 0.6 unidades electrostáticas para SN y LN. Los péptidos positivos son un poco más hidrofóbicos que los negativos, debido a la presencia de valina y la cadena lateral de hidrocarburo larga de arginina. (Como se mencionó en lo anterior, las interacciones hidrofóbicas entre las capas de polipéptido podrían estabilizar las películas en algún grado) . Las longitudes son consistentes con los estudios publicados que muestran que los poliiones pueden tener mayor que 20 grupos cargados (es decir, ácido aspártico y ácido glutámico; lisina, arginina e histidina) para ser adecuados para ELBL (ver Kabanov, V. y Zezin, A. (1984) Puré Appl . Chem . 56:343 y Kabanov, V. (1994) Polym . Sci . 36: 143, ambas de las cuales son incorporadas por referencia en la presente en. sus totalidades) . a. Demostración experimental i. Materiales Electrodos de QCM (USI-Syste , Japón) recubiertos con plata evaporada tuvieron un área de superficie de 0.16 ± 0.01 cm2 sobre cada lado, una frecuencia resonante de 9 MHz (AT-corte) , y una estabilidad a largo plazo de ± 2 Hz. El peso molecular del polipéptido se modificó mediante la espectrometría de masas de electrorocío . La pureza de péptido fue mayor que 70%. La solución reguladora del polipéptido fue fosfato de sodio 10 M o Tris-HCl 10 mM, DTT 1 mM, azida de sodio 0.1 M, pH 7.4. Todas las sustancias químicas diferentes de los polipéptidos se adquirieron de Sigma-Aldrich (EUA) . ii. Procedimientos Se hicieron experimentos utilizando pares de polipéptidos diseñados, uno negativo y uno positivo. Películas de multicapa que consiste de por lo menos 5-bicapas del SP2, SN1, LP4, y LN3 identificados en lo anterior se depositaron sobre los aparatos resonantes de QCM utilizando técnicas de ELBL estándares (una bi-capa consiste de una capa de policatión y una capa de polianión) . La concentración de polipéptido utilizada para la adsorción de capa fue de 2 mg-mL_1. Es conocido que la dependencia del espesor de la capa de poliión sobre la concentración de polielectrolito no es fuerte (ver Lvov, Y. y Decher, G. (1994) Crystallog. Rep. 39:628, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad); en el intervalo de concentración de 0.1 a 5 mg mL"1, la expresión de la bicapa fue aproximadamente independiente de la concentración para PSS/PAH. En contraste, las películas delgadas de polipéptido aparecen sustancialmente menos gruesas que aquellas fabricadas utilizando PSS/PAH de alto peso molecular (masa calculada utilizando los datos ?jf utilizando la ecuación de Sauerbrey bien conocida); ver Lvov, Y. y Decher, G. (1994) Crystallog. Rep. 39:628. Esto sigue del cálculo del espesor de la película sobre la base de masa depositada, como ordinariamente se hace en la técnica para proteínas. La expresión calculada para el ensamble de polipéptido diseñada mostrada en la Figura 3(c) es mayor que la longitud de extremo a extremo de los péptidos usados para hacer la película. DTT se incluyó en 1 M para inhibir la formación de enlace de disulfuro. El tiempo de adsorción fue de 20 minutos . Los resonadores se enjuagaron durante 1 min. en agua pura entre los ciclos de adsorción subsecuentes (removiendo quizás 10-15% del material débilmente absorbido) y se secaron a una corriente de N2 gaseoso. Luego la masa del péptido depositado se midió indirectamente mediante QCM. La medición de masa incluye algo de agua al secado, e iones de ba a masa similares a K+, Na+, y Cl-. La interpenetración parcial de las capas vecinas del péptido es probable (ver Decher, G. (1997) Science 227:1232; Schmitt y colaboradores, (1993) Macromolecules 26:7058; y Korneev y colaboradores, (1995) Physica B 214:954); esto podría ser importante para la eficiencia de la "fijación" de disulfuro. iii. Resultados Después de la adsorción del polipéptido y el enjuague y el secado del resonador QCM, la frecuencia resonante del resonador se midió. Esto debilitó el cálculo del desplazamiento de frecuencias sobre la adsorción y el cambio en la masa adsorbida. Una disminución en la frecuencia indica un incremento en la masa adsorbida. Los resultados se proporcionan en las Figuras 3 (a) y 3 (b) . La Figura 3 (a) muestra una comparación de los datos de adsorción para LP4 LN3 en diferentes soluciones reguladoras (fosfato de sodio 10 mM, pH 7.4, DTT 1 mM y Tris-HCl 10 mM, pH 7.4, DTT 1 mM) . Es claro de estos datos que la adsorción depende más de las propiedades de los péptidos que las propiedades específicas de la solución reguladora utilizada. La Figura 3 (b) muestra la frecuencia del resonador contra la capa adsorbida para diferentes combinaciones de SP2, SN1, LP4 y LN3 (específicamente, SP2/SN1, SP2/LN3, LP4/SN1 LP4/LN3) en fosfato de sodio 10 M, pH 7.4 y DTT 1 mM (las líneas simplemente conectan los puntos de datos experimentales) . Cada una de estas combinaciones involucró un polipéptido negativo y un polipéptido positivo como es requerido por ELBL. La Figura 3 (c) muestra una gráfica de la masa adsorbida calculada contra el número de capas para SN1 y LP4 en Tris-HCl 10 mM, pH 7.4 y DTT 1 mM (calculado de datos experimentales utilizando la ecuación de Sauerbrey) . La masa total adsorbida, aproximadamente 5 µg, corresponde aproximadamente a 1 mmol de péptido. La ecuación utilizada para este cálculo fue ?m = -0.87- 10"9 ?f, donde m es masa en gramos y / es la frecuencia en Hz (ver Lvov, Y., Ariga, K., Ichinose, L, y Kunitake, T. (1995) J. Am . Chem . Soc . 117:6117 y Sauerbrey, G. (1959) Z . Physik 155:206, ambas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en sus totalidades. El espesor de película, d, se estima como d = -0.016? donde d está en nm (ver Yuri Lvov, "Electrostatic Layer-by-Layer Assembly of Proteins and Polyions" ín Protein Architecture: ínter f 'acial Molecular Assembly and Immobiliza tion Bíotechnology, (Y. Lvov & H. Móhwald eds., 2000) (New York: Dekker, 2000) pp. 125-167, la cual es incorporada en la presente por referencia) . En la línea de la Figura 3 (c) es un ajuste lineal a los puntos de datos experimentales. La linealidad de los datos es un indicador probable de precisión, el ensamble regular durante la adsorción y una densidad aproximadamente uniforme de los Polipéptidos en cada capa adsorbida. La adsorción ocurrió con un desplazamiento de frecuencia de -610 + 60 Hz (cationes) o -380 ± 40 Hz (aniones) . El crecimiento lineal de la masa de polipéptido depositada indica la repetibilidad de las etapas de adsorción temprana en el proceso de ensamble y el éxito general del proceso de fabricación de multicapa. iv. Conclusiones Los resultados anteriores muestran que los polipéptidos diseñados utilizando el método de la presente invención son adecuados para ELBL, a pesar de las diferencias cualitativas significantes de ' PSS y PAH, homopolímeros flexibles que tienen 1 carga por longitud unitaria en pH 7.4. La carga por longitud unitaria sobre poli-L-lisina y ácido poli-L-glutámico es 1 en pH 7.4, como con PSS y PAH, pero ambos de estos polipéptidos tienen una propensión marcada a formar estructura a-helicoidal bajo varias condiciones, haciéndolo sustancialmente menos adecuados para el ensamble de multicapa cuando se desea el control sobre la estructura de película delgada. Los polipéptidos monodispersos de la presente invención, sin embargo, permiten al profesional conocer, muy precisamente, la estructura del material que es utilizado para ELBL. Por otra parte, las preparaciones comerciales usuales de poli-L-lisina y ácido poli-L-glutámico son polidispersas, y la poli-L-lisina, ácido poli-L-glutámico, PSS, y PAH evocan una respuesta inmune (es decir, son inmunogénicos) en humanos. Debido a que los polipéptidos diseñados son fácilmente adsorbidos sobre una superficie opuestamente cargada, como es demostrado por el experimento, no es necesidad por una capa "precursora". Como es conocido en la técnica, las capas "precursoras" se depositan sobre un sustrato para aumentar la adsorción de sustancias menos adsorbentes . La falta de una capa precursora aumenta la biocompatibilidad de las películas poliiónicas debido a que los polímeros ordinariamente utilizados como precursores son inmunogénicos, o permiten el control menos preciso sobre la estructura polimérica o la estructura de película delgada que los polipéptidos diseñados. Las multicapas de los polipéptidos diseñados fueron estables en el pH de la sangre humana, 7.4. Así, las multicapas deben ser útiles para una amplia gama de aplicaciones biológicas. La adsorción de los polipéptidos diseñados, cada uno de menos de una carga por residuo, fue esencialmente completa en menos de 10 min. en 2 mg/mL y baja intensidad iónica. Esto implica que estos polipéptidos se pueden utilizar para formar películas de multicapa rápidamente y con facilidad relativa. El secado de la película de péptido con N2(g) después de la deposición de cada capa no deteriora el ensamble. El secado se hace para obtener una medición de frecuencia de QCM precisa, pero no se requiere para el ensamble. Los experimentos de ensamble de película se hicieron en una intensidad iónica menor que aquella de • la sangre, pero el proceso da un resultado cualitativamente similar en intensidad iónica más alta. La diferencia principal es la cantidad de péptido depositado por capa de adsorción - entre más alta es la intensidad iónica, más grande es la cantidad de péptido depositada. Esto se ilustra por la gráfica en la Figura 7, que muestra la cantidad de material depositado como una función de la intensidad iónica - los péptidos utilizados fueron ácido poli-L-glutámico y poli-L-lisina. La frecuencia resonante de QCM se gráfica contra la capa de adsorción. La masa molecular promedio de poli-L-glutamato fue de 84,600 Da, mientras que aquella de poli-lys fue de 84,000 Da. La concentración de péptido utilizada para el ensamble fue de 2 mg/mL. Los datos indican que la concentración de sal (intensidad iónica de la solución) influencia el ensamble de película delgada. En general, la cantidad de material depositada por capas se incrementa con la intensidad iónica en el intervalo de 0 -100 mM NaCl. Como el carácter esencial de ELBL con' polipéptidos diseñados parece que no depende sobre la selección de la solución reguladora bajo condiciones de carga neta relativamente alta por longitud unitaria e intensidad iónica baja, resultados cualitativamente similares se esperan en la intensidad iónica de la sangre humana. Así, la selección de la solución reguladora no debe alterar fundamentalmente la estabilidad de las multicapas en su medio ambiente objetivo. Sin embargo, aun si la selección de la solución reguladora afectó la estabilidad de las multicapas, el mecanismo de "fijación" sería disponible como una característica de diseño para estabilizar la cápsula. La deposición aparente más grande de polipéptidos positivos que los negativos puede resultar de la carga más alta por longitud unitaria sobre los polipéptidos positivos en pH 7.4. El material depositado en cada capa probablemente corresponde a aquel requerido para la neutralización de la carga de la superficie implícita. Las interacciones hidrofóbicas también podrían ayudar a explicar esta característica de comportamiento de adsorción. El cálculo de espesor de película delgada usual para proteínas y otros polímeros es probablemente inválido para polipéptidos cortos (espesor calculado en 60-90 nm, pero la longitud sumada de 10 polipéptidos es de aproximadamente 120 nm) . Esto probablemente resulta de una alta densidad de empaquetamiento de los polipéptidos relativamente cortos sobre la superficie de adsorción; el resultado también es consistente con el descubrimiento de que el espesor de película varía con la intensidad iónica, como los cambios en las propiedades estructuradas de un polímero ocurrirán y la clasificación de las cargas por iones reducirá la repulsión de carga intra-capa entre los péptídos adsorbidos. La expresión de la película delgada del polipéptido diseñado, discutida aquí se estima en 20-50 nm. Muchos aspectos de los sitios de diseño y fabricación podrían ser automatizados. Por ejemplo, un algoritmo de computadora podría ser utilizado para optimizar la estructura primaria de péptidos para ELBL al comparar las propiedades de péptido predichas con las propiedades físicas observadas, incluyendo la estructura en solución, comportamiento de adsorción y estabilidad de la película en extremo de pH. Además, el proceso de ensamble de película de polipéptido puede ser mecanizado, una vez que los detalles de las diversas etapas se han determinado lo suficiente. 2. Ejemplo 2 - Experimentos que Involucran Polipéptidos Diseñados De Novo que Contienen Cisteína a. Polipéptidos Los polipéptidos utilizados fueron: Tyr Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys Val Lys Cys Lys Gly Lys Val Lys (SEQ ID NO: 5) Tyr Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val 'Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu Val Glu Cys Glu Gly Glu Val Glu .(SEQ ID NO: 6) Distinto a los otros polipéptidos utilizados en los experimentos descritos en la presente, estos dos no fueron diseñados utilizando la información del genoma humano; ellos se diseñaron para el único propósito de estimar la función de la formación de enlace de disulfuro y la estabilización de película de polipéptido. b. Procedimientos Todos los experimentos se condujeron a temperatura ambiente . Todos los experimentos de ensamble utilizando QCM se condujeron en las mismas condiciones, excepto que las muestras que se ' someten a oxidación se secaron utilizando aire en lugar de gas de nitrógeno. Las condiciones de ensamble fueron Tris-HCl 10 mM, DTT 10 mM, pH 7.4. La concentración de péptido nominal fue 2 mg/ml . El número de capas formadas fue 14. Las condiciones de fijación de disulfuro para las muestras oxidantes fueron Tris-HCl 10 M, DMSO al 1%, saturación de agua con aire, pH 7.5. La duración de la etapa de "fijación" fue de 6 horas. Las condiciones para la reducción de las muestras fueron Tris-HCl 10 mM, DTT 1 mM, saturación de agua con nitrógeno, pH 7.5. La duración de esta etapa fue de 6 horas. Todos los experimentos de desensamble utilizando QCM se condujeron en las mismas condiciones, excepto que las muestras oxidantes se secaron utilizando aire en lugar de nitrógeno. Las condiciones de desensamble fueron KC1 10 mM, pH 2.0. Las muestras se enjuagaron con agua D.I. durante 30 segundos antes del secado. Tres tipos diferentes de experimentos se condujeron: (1) Reducción - sin tratamiento; el desensamble se condujo inmediatamente después del ensamble; (2) Reducción - 6 horas, como es descrito anteriormente para la reducción de muestras; y (3) Oxidación - 6 horas, como es descrito anteriormente para las muestras oxidantes. c. Resultados Los resultados se ilustran en la Figura 10. En los primeros dos experimentos (ambos de reducción) , todo el material depositado (100%) se desensambló dentro de 50 minutos. En contraste, en el experimento de oxidación, una cantidad sustancial de material permaneció después de la incubación sustancial del resonador de QCM recubierto con película de péptido en pH 2 durante 5 horas. La estabilidad de las películas de polipéptido en pH acídico se determina por las condiciones del ensamble; de esta manera, la estabilidad de la película o cápsula es una característica de diseño que ha llegado a ser posible al utilizar polipéptidos como los polielectrolitos para ELBL. d. Conclusiones Las fuerzas electrostáticas desempeñan una función clave en mantener conjuntamente las cargas opuestamente cargadas de polipéptido diseñados. El pH acídico, la carga neta sobre uno de los péptidos se neutraliza y la película de polipéptido se desensambla debido a la repulsión electrostática. Las condiciones de reducción previenen la formación del enlace de disulfuro. Por lo tanto, la atracción electrostática entre las capas es la única fuerza de enlace para estabilizar las capas bajo estas condiciones. En contraste, bajo las condiciones oxidantes se forman enlaces de disulfuro. El pH acídico, los enlaces de disulfuro inhiben el desensamble de la película. Los resultados indican que la estabilidad de la capa en pH acídico es afectada directamente por la formación de enlace de disulfuro intra- y/o intercapa - es decir entre moléculas en la misma capa, entre moléculas en capas adyacentes, o ambas. Esto se ilustra por los resultados mostrados en la Figura 10 - debido a la fijación de disulfuro, más de 30% de la película permaneció estable en pH acídico, a pesar de la repulsión electrostática en intensidad iónica relativamente baja. Los péptidos con más residuos de cisteína se anticipan para mejorar adicionalmente la eficiencia de fijación de disulfuro. Además, el ajuste de las condiciones del ensamble de péptido será un aspecto importante de las películas de ingeniería para tener la física deseada así como las propiedades químicas y biológicas . 3. Ejemplo 3 - Experimentos que Involucran Polipéptidos Diseñados que Contienen Cisteína a. Materiales Los elementos esenciales de este experimento fue un instrumento de icrobalanza de cristal de cuarzo; resonadores recubiertos de plata (frecuencia resonante de 9 MHz) ; el péptido de 48 residuos negativo (LN3) (SEQ ID NO:4); y un péptido de 48 residuos positivos llamado "SP5" de la siguiente secuencia: Tyr Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His Gly Lys Gly Lys Lys Ser Cys His (SEQ ID NO : 7 ) Similar a los otros péptidos diseñados discutidos anteriormente en la Parte VII (E) (1),. SP5 se diseñó utilizando el proceso descrito anteriormente en la parte VII (B) (1) para analizar la secuencia de aminoácidos de la lactotransferrina de proteína de sangre humana (gi | 4505043) . La solución reguladora de ELBL fue Tris 10 mM, pH 7.4, NaCl 10 mM y DTT 1 mM. La solución reguladora de desensamble fue KCl 10 mM, pH 2. Soluciones de péptido 2 mL se prepararon para SP5 y LN3 al adicionar 4 mg de cada péptido a 2 mL de la solución reguladora anterior y al ajustar el pH de cada solución a 7.4; la concentración de péptido fue de 2 mg-mL_1. b. Procedimiento para Monitorear el Ensamble de las Capas del Polipéptido sobre Resonadores de QCM . Los procedimientos de reducción fueron como sigue: (1) La frecuencia del resonador se midió y se registró antes de la adsorción de péptido; (2) El resonador se sumergió en la solución de péptido SP5 durante 20 min; (3) El resonador se sumergió en la solución de enjuague de SP5 durante 30 segundos; (4) El resonador se removió de la solución de enjuague y se secó utilizando gas de nitrógeno; (5) La frecuencia resonante de QCM del resonador se registró; (6) El resonador se sumergió en la solución de péptido LN3 durante 20 min; (7) El resonador se sumergió en la solución de enjuague de LN3 durante 30 segundos; (8) El resonador 1 se removió de la solución de enjuague y se secó utilizando gas de nitrógeno; (9) La frecuencia resonante de QCM del resonador se registró; (10) Las etapas 2 hasta 9 se repitieron hasta que 16 capas se adsorbieron sobre el resonador. Los procedimientos de oxidación fueron los mismos como los procedimientos de reducción, excepto que el resonador se enjuagó en agua D.I. en .lugar de la solución reguladora de SP5 o la solución reguladora LN3 y se secó con aire en lugar de nitrógeno antes de cada medición. c. Procedimientos de Fijación Los procedimientos de reducción fueron como sigue: El resonador se colocó en una solución acuosa que contiene DTT 1 mM durante 6 horas. DTT como un agente de reducción, inhibió la formación de enlace de disulfuro. Los procedimientos de oxidación fueron como sigue: El resonador se colocó en una solución acuosa saturada con aire que contiene DMSO al 1% durante 6 horas. DMSO, como un agente de oxidación, promovió la formación de enlace de disulfuro. d. Desensamble sobre el Resonador i. Soluciones Las condiciones de reducción fueron como sigue: KCl 10 M, DTT 1 mM, pH 2. Las condiciones de oxidación fueron como sigue: KCL 10 mM, DMSO al 20%, pH 2. ii. Procedimientos para el Desensamble Los procedimientos de reducción fueron como sigue: (1) La frecuencia resonante inicial del resonador se midió mediante QCM y se registró; (2) El resonador se sumergió en la solución de desensamble de reducción durante 5 min.; (3) El resonador se enjuagó en solución reguladora de reducción durante 30 seg.; (4) El resonador se secó con N2 gaseoso; (5) La frecuencia resonante del resonador se midió mediante QCM y se registró; (6) Las etapas 2 hasta 5 se repitieron para tiempos de lectura de 5, 10, 15, 20, 30, 60 y 90 min. Los procedimientos de oxidación fueron los mismos como para los procedimientos de reducción, excepto que el enjuague del resonador se hizo en agua D.I. saturada con aire en lugar de la solución reguladora de reducción. e. Resultados La Figura 8 muestra el incremento aproximadamente lineal en la masa depositada durante el ensamble de película delgada de SP5 y LN3. Ambos resonadores muestran deposición casi idéntica de masa a través del proceso de ensamble, a pesar de las diferencias en las condiciones del ensamble. La Figura 9 muestra el porcentaje de material restante durante el desensamble de película. Las capas sometidas a las condiciones de oxidación mostraron una pérdida mínima de material en el pH acídico con casi 90 a 95% de retención de masa. En contraste, las capas sometidas a las condiciones de reducción perdieron casi todo el material de película dentro de los primeros 5 minutos a la exposición al pH acídico. f. Conclusiones Los resultados demuestran que en el pH acídico, los enlaces de disulfuro previenen la degeneración de la capa y mantienen . las capas de manera conjunta firmemente. La estabilidad de capa en pH acídico es directamente afectada por la formación de enlaces de disulfuro intra- y/o intercapa. La formación de enlace de disulfuro es dependiente sobre la concentración y la proximidad de residuos de cisteína entre sí. El incremento de la concentración por longitud de cadena unitaria del polipéptido por lo tanto directamente influenciaría la formación de enlace de disulfuro y la estabilidad de película delgada. El incremento de la intensidad iónica de las soluciones reguladoras utilizadas para el ensamble de película influencia la concentración de cisteína en la película al incrementar la cantidad de material depositada por ciclo de adsorción y el espesor de cada capa. El número incrementado de aminoácidos de cisteína en una sola capa de esta manera incrementaría el número de enlaces de disulfuro formados y, en la oxidación, incrementaría la estabilidad de la película. Otras modalidades de la invención son posibles y modificaciones se pueden hacer sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, la descripción detallada en lo anterior no se propone para limitar la invención. Más bien, el alcance de la invención es definido por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para identificar, en información de secuencia de aminoácidos, y registrar un número deseado de porciones de secuencia de aminoácidos que tienen una longitud definida y una carga neta de una cierta polaridad para el uso en el autoensamble de capa por capa electrostático, caracterizado porque comprende las etapas de: a. obtener una secuencia de aminoácidos para un péptido o una proteína de un organismo particular; . b. localizar un aminoácido iniciador en la secuencia de aminoácidos; c. examinar el aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos para determinar el número de aminoácidos cargados que tiene una polaridad opuesta a la cierta polaridad; d. si el número de los aminoácidos cargados que tienen una polaridad opuesta a la cierta polaridad es uno o más, continuar el método en la etapa g; e. examinar el aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos para determinar el número de aminoácidos cargados que tienen la cierta polaridad; f. si el número de aminoácidos cargados que tienen la cierta polaridad es igual a, o mayor que x, registrar la porción de secuencia de aminoácidos que consiste del aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos; g. localizar otro aminoácido iniciador en la secuencia de aminoácidos; y h. repetir el método comenzando en la etapa c hasta que el número deseado de porciones de secuencia de aminoácidos se han identificado o todos los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos se han utilizado como el aminoácido iniciador en la etapa c; en donde x es mayor que o igual a aproximadamente la mitad de n . 2 . El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque n es menor que o igual a 11, pero mayor que o igual a 3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque n - 8 y x = 5. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque n = 6 y x = 4. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque por lo menos una de las porciones de secuencia de aminoácido registradas comprende cisteína. 6. Un método para diseñar un polipéptido para uso en el autoensamble de capa por capa electrostático, caracterizado porque comprende las etapas de: a. identificar, en información de secuencia de aminoácidos, y registrar una o más porciones de secuencia de aminoácidos que tienen una longitud definida y una carga neta de una 5 cierta polaridad utilizando las siguientes etapas : i. obtener una secuencia de aminoácidos para un péptído o una proteína de un organismo particular; 10 ii. localizar un aminoácido iniciador en la secuencia de aminoácidos; ííi. examinar el aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos para determinar el número de aminoácidos cargados que tienen una 15 polaridad opuesta a la cierta polaridad; iv. si el número de los aminoácidos cargados que tienen una pluralidad opuesta a cierta polaridad es uno o más, continuar el método de la etapa vii; 20 v. examinar el aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos para determinar el número de aminoácidos cargados que tienen la cierta polaridad; vi. si el número de aminoácidos cargados que 25 tienen la cierta polaridad igual a o mayor que x, registrar la porción de secuencia de aminoácidos que consiste del aminoácido iniciador y los siguientes n aminoácidos; vii . localizar otro aminoácido iniciador en la secuencia de aminoácidos y viii. repetir el método comenzando en la etapa iii hasta que el número deseado de porciones de secuencia de aminoácidos se han identificado o todos los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos se han utilizado como el aminoácido iniciador en la etapa iii, en donde x es mayor que o igual a aproximadamente la mitad de n ; y b. Unir una pluralidad de las porciones de secuencia de aminoácidos registradas para formar un polipéptido . 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque n es menor que o igual a 11, pero mayor que o igual a 3. 8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque n = 8 y x = 5. 9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque n = 6 y x = 4. 10. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque por lo menos una de la pluralidad de porciones de secuencias de aminoácidos unida comprende cisteína . 11. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque por lo menos una de las porciones de secuencia de aminoácidos unida tiene una propensión de a-hélice sumada de menos de 7.5 y una propensión de ß-lámina sumada que es menor que 8. 12. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque además comprende la etapa de incluir en el polipéptido un dominio funcional. 13. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos proviene del proteoma del organismo. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos proviene de una proteína de sangre del organismo. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el organismo es un humano. 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque por lo menos una de la pluralidad de porciones de secuencia de aminoácidos unidas comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO:l. 17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque por lo menos una de la pluralidad de porciones de secuencia de aminoácidos unida comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 2. 18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque por lo menos una de la pluralidad de porciones de secuencia de aminoácidos unidas comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 3. 19. El método ae conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque por lo menos una de la pluralidad de porciones de secuencia de aminoácidos unidas comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 4. 20. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque por lo menos una de la pluralidad de porciones de secuencia de aminoácidos unidas comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 5. 21. Una película delgada, la película caracterizada porque comprende una pluralidad de capas de polipéptidos, las capas de polipéptidos que tienen cargas alternantes, donde por lo menos uno de los polipéptidos comprende una o más porciones de secuencias de aminoácidos que consisten de n aminoácidos, por lo menos x de la cual son positivamente cargados y ninguno es negativamente cargado, por lo menos x de la cual son negativamente cargados y ninguno es positivamente cargado, en donde x es mayor que o igual a aproximadamente la mitad de n . 22. La película delgada de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el por lo menos uno de los polipéptidos comprende aminoácidos no naturales. 23. La película delgada de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la película delgada además comprende por lo menos un polipéptido antimicrobiano. 24. La película delgada de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el polipéptido antimicrobiano comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 8. 25. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el por lo menos uno de los polipéptidos comprende un dominio funcional. 26. La película delgada de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos es identificada por el método de: a. obtener una secuencia de aminoácidos para un péptido o una proteína de un organismo particular; b. localizar un aminoácido iniciador de la secuencia de aminoácidos; c. examinar el aminoácido iniciador y los siguientes n-1 aminoácidos para determinar el número de aminoácidos cargados que tienen una polaridad opuesta a la cierta polaridad; d. si el número de los aminoácidos cargados que tiene una polaridad opuesta a la cierta polaridad es uno o más, continuar el método en la etapa g; e. examinar el aminoácido iniciador y los siguientes n-1 aminoácidos para determinar el número de aminoácidos cargados que tienen la cierta polaridad; f. si el número de aminoácidos cargados que tienen la cierta polaridad es igual a o mayor que x , registrar la porción de secuencia de aminoácidos que consiste del aminoácido iniciador y los siguientes n-1 aminoácidos; g. localizar otro aminoácido iniciador en la secuencia de aminoácidos; y h. repetir el método comenzando en la etapa c hasta que el número deseado de porciones de secuencia de aminoácidos se han identificado o todos los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos se han utilizado como el aminoácido iniciador en la etapa iii; en donde x es mayor que o igual a aproximadamente la mitad de p. ' 27. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque n es menor que o igual a 12, pero mayor que o igual a 4. 28. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque n = 9 y x = 5. 29. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque n = 7 y x = 4. 30. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos comprende cisteína. 31. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos tiene una propensión de a-hélice sumada de menos de 7.5 y una propensión de /3-lámina sumada de menos de 8. 32. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos está comprendida de proteínas de sangre humana. 33. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO:l. 34. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 2. 35. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 3. 36. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 4. 37. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 7. 38. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la película delgada forma una microcápsula. 39. La película delgada de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la microcápsula comprende un núcleo, y el núcleo comprende hemoglobina. 40. La película delgada de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la hemoglobina está en forma cristalizada. 41. La película delgada de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la hemoglobina está en forma líquida. 42. La película delgada de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la microcápsula comprende un núcleo, y el núcleo comprende un fármaco terapéutico. 43. La película delgada de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque el fármaco terapéutico está en forma cristalizada. 44. La película delgada de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque el fármaco terapéutico está en forma líquida. 45. La película delgada de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada 'porque la película delgada está formada sobre un sustrato sólido. 46. La película delgada de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque el sustrato sólido es una micropartícula . 47. La película delgada de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque el sustrato es un implante médico. 48. Un método para diseñar polipéptidos para el uso en el autoensamble de capa por capa electrostático, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a. diseñar de novo una pluralidad de porciones de secuencia de aminoácidos, en donde por lo menos una de las porciones de secuencia de aminoácidos consiste de n aminoácidos, por lo menos x de la cual son positivamente cargados y ninguno es negativamente cargado, o por lo menos x de la cual son negativamente cargados y ninguno es positivamente cargado, x es mayor que o igual a aproximadamente la mitad de n; y b. unir la pluralidad de las porciones de secuencia de aminoácidos para formar un polipéptido. 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque n es menor que o igual a 12, pero mayor que o igual a . 50. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque n = 9 y x = 5. 51. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque n = 6 y x = 4. 52. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos tiene una propensión de a-hélice sumada de menos de 7.5 y una propensión de ß-lámina sumada de menos de 8. 53. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos comprende uno o más aminoácidos no naturales. 54. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la por lo menos una porción, de secuencia de aminoácidos comprende aminoácidos de mano derecha. 55. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque además comprende la etapa de unir por lo menos un péptido antimicrobiano junto con la pluralidad de porciones de secuencia de aminoácidos. 56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el por lo menos un péptido antimicrobiano comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 8. 57. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque además comprende la etapa de incluir un dominio funcional en la formación del polipéptido. 58. Un método para controlar la estabilidad mecánica y la porosidad de una película delgada de multicapa, caracterizado porque comprende la etapa de proporcionar una película delgada de multicapa, la película que comprende una pluralidad de capas de polipéptidos, las capas de polipéptidos que tienen cargas alternantes, en donde por lo menos una de las capas de polipéptidos comprende uno o más aminoácidos que contienen sulfhidrilo libre. 59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el uno o más aminoácidos que contienen sulfhidrilo libre es cisteína. 60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque por lo menos un conjunto de capas adyacentes de polipéptidos comprende cisteína. 61. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque por lo menos una de las capas de polipéptidos comprende aminoácidos no naturales. 62. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque por lo menos una de las capas de polipéptidos comprende un péptido antimicrobiano. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el péptido antimicrobiano comprende la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 8. 64. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque por lo menos una de las capas de polipéptídos comprende un dominio funcional. 65. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque los polipéptidos comprenden por lo menos una porción de secuencia de aminoácidos que consiste de n aminoácidos, por lo menos x de la cual son positivamente cargados y ninguno es negativamente cargado, o por lo menos x de la cual son negativamente carga'dos y ninguno es positivamente cargado, en donde x es mayor que o igual a aproximadamente la mitad de n .