MX2007004633A - Tratamiento combinado con radiacion e inhibidor de cinasa del receptor del factor de crecimiento epidermico. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para manufacturar un medicamento propuesto para tratar tumores o metastasis de tumor en un paciente, caracterizado porque se usa una cantidad terapeuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa de EGFR y radiacion ionizante, con o sin agentes o tratamientos adicionales, tales como otros farmacos anti-cancerigenos. Un ejemplo preferido de un inhibidor de cinasa del EGFR que puede ser usado en la practica de esta invencion, es el compuesto HC1 de erlotinib (tambien conocido como TarcevaTM).

Description

TRATAMIENTO COMBINADO CON RADIACIÓN E INHIBIDOR DE CINASA DEL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a composiciones y métodos para manufacturar medicamentos propuestos para tratar pacientes con cáncer. En particular, la presente invención se dirige a un inhibidor de cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés) , en donde dicho inhibidor de cinasa del EGFR se usa en combinación con radiación ionizante. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es un nombre genérico para un intervalo amplio de enfermedades caracterizadas por un crecimiento no regulado, carencia de diferenciación, y la capacidad para invadir tejidos locales y formar metástasis. Estas enfermedades neoplásicas afectan, con varios grados de prevalencia, cada tejido y órgano en el cuerpo. Se han desarrollado una multitud de agentes terapéuticos durante algunas décadas pasadas, para el tratamiento de varios tipos de cánceres . Los tipos más comúnmente usados de agentes anticancerígenos incluyen: agentes de alquilación de ADN (por ejemplo, ciciofosfamida, ifosfamida) , antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, un antagonista de folato y 5-fluorouracilo, un antagonista de REF.; 181654 pirimidina) , interruptores del microtúbulo (por ejemplo, vincristina, vinblastina, paclitaxel) , intercaladores de ADN (por ejemplo, doxorubicina, daunomicina, cisplatino), y terapia hormonal (por ejemplo, tamoxifeno, flutamida) . De conformidad con el Instituto Nacional del Cáncer, el cáncer de pulmón es la causa más grande única de muertes por cáncer en los Estados Unidos y es responsable por casi 30% de muertes por cáncer en el país. De conformidad con la Organización Mundial de la Salud, existen más de 1.2 millones de casos alrededor del mundo de cáncer de pulmón y bronquial cada año, causando aproximadamente, 1.1 millones de muertes anualmente. Casi 90% de los cánceres de pulmón son causados por fumar. El NSCLC es la forma más común de cáncer de pulmón y cuenta por casi 80 por ciento de todos los casos. Las opciones de tratamiento para cáncer de pulmón son cirugía, terapia por radiación y quimioterapia, ya sea solas o en combinación, dependiendo de la forma y etapa del cáncer. Para NSCLC avanzado, agentes que se han mostrado por ser activos incluyen, cisplatino, carboplatino, paclitaxel, docetaxel, topotecano, irinotecano, vinorelbina, gencitabina (por ejemplo, gemzar®) , y los inhibidores de cinasa del EGFR, geftinib y erlotinib. Los regímenes de quimioterapia de combinación que contienen cisplatino y que contienen carboplatino, han sido mostrados por producir velocidades de respuesta objetiva que son superiores que aquellas logradas con quimioterapia de agente único (Weick, J.K., et al. (1991) J. Clin. Oncol. 9 (7) : 1157-1162) . Se ha reportado que el paclitaxel tiene actividad de agente único en pacientes con etapa IV, con velocidades de respuesta en el intervalo de 21% a 24% (Murphy .K., et al. (1993) J. Nati. Cáncer List. 85 (5) : 384-388) . Las combinaciones de paclitaxel han mostrado velocidades de respuesta relativamente altas, significando 1 año de supervivencia, y alivio de síntomas de cáncer de pulmón (Johnson D.H., et al. (1996) J. Clin. Oncol. 14 (7) :2054-2060) . Con un régimen de paclitaxel más carboplatino, las velocidades de respuesta han estado en el intervalo de 27% a 53% con velocidades de supervivencia de 1 año de 32% a 54%. Sin embargo, la eficacia de tales tratamientos es tal que no puede ser considerado un régimen específico como terapia estándar en la actualidad. Cánceres de cabeza y cuello, son tumores que se originan en la región de la cabeza o cuello, particularmente en la cavidad nasal, senos, labios, boca, glándulas salivares, garganta, laringe y en los nodos linfáticos del cuello superior. Como cáncer de pulmón, está frecuentemente asociado con el uso de tabaco. La mayoría de cánceres de cabeza y cuello son ya sea carcinomas de células escamosas o adenocarcinomas. Los cánceres de cabeza y cuello se consideran por aproximadamente 3 por ciento de todos los cánceres en los Estados Unidos, y son más comunes en el hombre y en personas de más de 50 años. El tratamiento para un cáncer de cuello y cabeza, depende de un número de factores, que incluye la ubicación exacta del tumor, la etapa del cáncer y la edad y salud general de la persona, y puede incluir cirugía, terapia de radiación y/o quimioterapia . La sobre-expresión de la cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , o su ligando TFG-alfa, está frecuentemente asociada con muchos cánceres, que incluyen, cánceres de mama, pulmón, colorectal y cabeza y cuello (Salomón D.S., et al. (1995) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19:183-232; Wells, A. (2000) Signal, 1:4-11), y se cree, contribuye al crecimiento maligno de estos tumores. Una mutación-supresión específica en el gen del EGFR, también se ha encontrado por incrementar tumorigenicidad celular (Halatsch, M-E. et al. (2000) J. Neurosurg. 92:297-305; Archer, G.E. et al. (1999) Clin. Cáncer Res. 5:2646-2652) . La activación de las trayectorias de señalización estimulada por el EGFR promueve procesos múltiples que están promoviendo potencialmente el cáncer, por ejemplo, proliferación, angiogénesis, motilidad e invasión celular, apoptósis e inducción disminuida de resistencia al fármaco. El desarrollo para uso como agentes anti-tumorales de compuestos que inhiben directamente la actividad de cinasa del EGFR, así como también anticuerpos que reducen la actividad de cinasa del EGFR bloqueando la activación de EGFR, son áreas de esfuerzo de investigación intensa (de Bono J.S. and Rowinsky, E.K. (2002) Trends in Mol. Medicine 8:S19-S26; Dancey, J. and Sausville, E. A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313) . Diversos estudios han demostrado o descrito que algunos inhibidores de cinasa del EGFR pueden mejorar la célula tumoral o eliminación de neoplasia cuando se usan en combinación con ciertos otros agentes o tratamientos anti-cancerígenos o quimioterapéuticos (por ejemplo, Shintani, S. et al. (2003) Int. J. Cáncer 107:1030-1037; Raben, D. et al. (2002) Semin. Oncol. 29:37-46; Herbst, R.S. et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1:719-732; Magne, N et al. (2003) Clin. Can. Res. 9:4735-4732; Magne, N. et al. (2002) British Journal of Cáncer 86:819-827; Torrance, CJ. et al. (2000) Nature Med. 6:1024-1028; Gupta, R.A. and DuBois, R.N. (2000) Nature Med. 6:974-975; Tortora, et al. (2003) Clin.

Cáncer Res. 9:1566-1572; Solomon, B. et al (2003) Int. J.

Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55:713-723; Krishnan, S. et al. (2003) Frontiers in Bioscience 8, el-13; Huang, S et al. (1999) Cáncer Res. 59:1935-1940; Contessa, J. N. et al. (1999) Clin. Cáncer Res. 5:405-411; Li , M. et al. Clin. (2002) Cáncer Res. 8:3570-3578; Ciardiello, F. et al. (2003) Clin. Cáncer Res. 9:1546-1556; Ciardiello, F. et al. (2000) Clin. Cáncer Res. 6:3739-3747; Grunwald, V. and Hidalgo, M. (2003) J. Nat. Cáncer Inst. 95:851-867; Seymour L. (2003) Current Opin. Investig. Drugs 4 (6) : 658-666; Khalil, M. Y. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther .3 :367-380; Bulgaru, A.M. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther.3:269- 279; Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313; Kim, E.S. et al. (2001) Current Opinión Oncol. 13:506-513; Arteaga, C.L. and Johnson, D.H. (2001) Current Opinión Oncol. 13:491-498; Ciardiello, F. et al. (2000) Clin. Cáncer Res. 6:2053-2063; Publicaciones de Patentes Nos.: US 2003/0108545; US 2002/0076408; y US 2003/0157104; y Solicitudes de Patentes Internacionales Nos.: WO 99/60023; WO 01/12227; WO 02/055106; WO 03/088971; WO 01/34574; WO 01/76586; WO 02/05791; y WO 02/089842. Un fármaco anti-neoplásico podría idealmente, eliminar células cancerígenas selectivamente, con un amplio índice terapéutico con relación a su toxicidad hacia células no malignas. Podría también retener su eficacia contra células malignas, aún después de exposición prolongada al fármaco. Desafortunadamente, ninguna de las quimioterapias actuales posee tal perfil ideal. Sin embargo, la mayoría posee índices terapéuticos muy estrechos. Además, las células cancerosas expuestas a concentraciones ligeramente sub-letales de un agente terapéutico, muy a menudo, desarrollarán resistencia a tal agente, y casi a menudo, resistencia cruzada también a varios otros agentes antineoplásicos. De este modo, existe una necesidad de tratamiento más eficaz para neoplasia y otros trastornos proliferativos. Las estrategias para mejorar la eficacia terapéutica de fármacos existentes han involucrado cambios en el programa para su administración, y también su uso en combinación con otros agentes o terapias de modulación anticancerígena o bioquímica. La terapia de combinación es bien conocida como un método que puede resultar en mayor eficacia y efectos colaterales disminuidos, con relación al uso de la dosis terapéuticamente relevante de cada agente solo. En algunos casos, la eficacia de la combinación de fármaco es aditiva (la eficacia de la combinación es aproximadamente igual a la suma de los efectos de cada fármaco solo) , pero en otros casos, el efecto es sinergístico (la eficacia de la combinación es mayor que la suma de los efectos de cada fármaco o terapia dados solos) . Sin embargo, permanece una necesidad crítica de tratamientos mejorados para cánceres de pulmón, cabeza y cuello y otros cánceres. Esta invención proporciona terapias de combinación anti-cancerígenas que reducen las dosificaciones para componentes o tratamientos individuales requeridos para eficacia, con ello, disminuyendo los efectos colaterales asociados con cada agente o terapia, mientras se mantiene o incrementa el valor terapéutico. La invención descrita en este documento, proporciona nuevas combinaciones terapéuticas, y métodos para usar combinaciones de terapias en el tratamiento de cánceres de pulmón, cabeza y cuello y otros . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para manufacturar un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR, en donde dicha cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR, se combina con una cantidad terapéuticamente efectiva de radiación ionizante, con o sin agentes o tratamientos adicionales, tales como otros fármacos ant i-cancerígenos . Un ejemplo preferido de un inhibidor de cinasa del EGFR que puede ser usado en la práctica de esta invención, es el compuesto HCl de erlotinib (también conocido como Tarceva ) . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS El archivo de esta patente contiene al menos, un dibujo realizado a color. Copias de esta patente con dibujo (s) a color, se proporcionarán por la Oficina de Marcas después de la petición y pago de las tasas necesarias .

Figuras lA-ld: Impacto de erlotinib en distribución de fase del ciclo celular. Se cultivaron células UM-SCC6 (figura lA/figura ÍC) y H226 (figura lB/figura ID), + erlotinib (0.1 µM) por 48 horas, seguido por exposición a XRT (6 Gy) . Las células se tiñeron subsecuentemente con yoduro de propidio y la distribución del ciclo celular se determinó por evaluación de citometría de flujo de contenido de ADN. El impacto total de erlotinib sobre la fracción de fase S, después de XRT, se describe en (figura ÍC, figura ID) . Los datos representan valores medios de muestras duplicadas. Figuras 2A-2B: Efecto de erlotinib sobre apoptósis inducida por radiación. (Figura 2A) La apoptósis se analizó por espectroscopia fluorescente usando inhibidor pan-caspasa FAM-VAD-FMK como se describe en "Materiales y Métodos". Las células se expusieron a erlotinib (1.0 µM x 48 horas), XRT (6 Gy) o la combinación. Los datos representan valores medios de dos experimentos independientes. (Figura 2B) El análisis de manchado Western sobre lisados de células completas determina la escisión de polimerasa poli (.ADP-ribosa) . Se cosecharon células +_ 30 minutos de pre-tratamiento con erlotinib (1 µM) 10 y 24 horas después de la irradiación (6 Gy) . Figura 3 : Efecto de erlotinib sobre la activación del EGFR después de la exposición a radiación. Las líneas celulares indican + 24 horas de pre-tratamiento con erlotinib (1.0 µM) , 48 horas después de exposición a radiación (2 y 10 Gy) . Se evaluaron lisados de células completas por niveles del EGFR activados y totales. Figura 4: Efecto de erlotinib sobre expresión Rad51 inducida por radiación. Células UM-SCC6 (A) y H226(B), fueron ya sea expuestas a erlotinib (1.0 µM) , XRT (6 Gy) , o ambas, en combinación y cosechadas en tiempos indicados. Los lisados celulares completos se evaluaron por expresión Rad51. Figuras 5A-5B: Efecto de erlotinib sobre radiosensibilidad. Se examinó la influencia de erlotinib en radiosensibilidad, por supervivencia clonogénica en células UM-SCC1 (figura 5A) y H226 (figura 5B) , después de la exposición a varias dosis de radiación como se describe en "Materiales y Métodos". Las células se expusieron a erlotinib (0.1 µM) por 3 días antes de la irradiación. Las curvas de control se expusieron a radiación sin tratamiento de erlotinib. Los datos representan valores medios de dos experimentos independientes . Figura 6: Actividad antitumoral de erlotinib en combinación con radiación en xenógrafos de NSCLC y HNSCC. Células H226(106) o UM-SCC6 (106) , se inyectaron s.c., en el flanco de ratones atímicos como se describe en "Materiales y Métodos". Ratones fueron ya sea tratados con erlotinib (0.8 mg vía administración forzada oral diaria), XRT (fracción 2 Gy única dos veces por semana) , o ambas en combinación por 3 semanas. Los valores representan tamaño de tumor medio (mm3; n=6 /grupo) . Figura 7: Efecto de erlotinib en la expresión de PCNA y p-EGFR después de la radiación. Se determinó el teñido inmunohistoquímico usando secciones de tejido de tumor H226 humano representativo, tomadas de ratones tratados solo con radiación (XRT) , solo con erlotinib, o ambos, en combinación. Los teñidos positivos (rojo/marrón) , indican expresión de PCNA y p-EGFR. Figura 8: Análisis de microarreglo de ADNc de genes diferencialmente regulados por erlotinib (1.0 µM x 24 horas), seguido por radiación (6 Gly) en UM-SCC6. La intensidad de color se asignó a relaciones de expresión de gen; las sombras de verde, son genes que son regulados por disminución; de negro, que están sin cambio. Los genes en negritas, representan aquellos validados por TI-RCP cuantitativa y/o análisis de manchado western. Figuras 9A-9B: Validación de microarreglo de genes seleccionados diferencialmente regulados por erlotinib (1.0 µM x 24 horas), seguidos por radiación (6 Gy) en UM-SCC6, usando TI-RCP (figura 9A) verde SYBR cuantitativo y análisis de manchado western (figura 9B) . Se realizó TI-RCP en cada muestra por duplicado y la relación se calculó con relación a hidroximetilbilano sintasa (HMBS) y deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GADP) de los genes de mantenimiento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "cáncer" en un animal, se refiere a la presencia de células que poseen características típicas de células que ocasionan cáncer, tales como proliferación incontrolada, inmortalidad, potencial metastásico, velocidad de proliferación y crecimiento rápido y ciertos factores morfológicos característicos. A menudo, las células cancerosas estarán en la forma de un tumor, pero tales células pueden existir solas dentro de un animal, o pueden circular en la corriente sanguínea como células independientes, tales como células leucémicas. "Crecimiento celular anormal" como se usa en este documento, a menos que se indique de otro modo, se refiere a crecimiento celular que es independiente de mecanismos regulatorios normales (por ejemplo, pérdida de inhibición de contacto). Este incluye el crecimiento anormal de: (1) células tumorales (tumores) , que proliferan expresando una tirosina cinasa mutada o sobre-expresión de un receptor de tirosina cinasa; (2) células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las cuales, ocurre la activación aberrante de tirosina cinasa; (4) cualquier tumor que prolifera por el receptor de tirosina cinasa; (5) cualquier tumor que prolifera por activación aberrante de serina/treonina cinasa; y (6) células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las cuales, ocurre activación aberrante de serina/treonina cinasa. El término "tratar" como se usa en este documento, a menos que se indique de otro modo, significa invertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir, ya sea parcialmente o completamente, el crecimiento de tumores, metástasis de tumor, u otras células neopásicas o que causan cáncer en un paciente. El término "tratamiento", como se usa en este documento, a menos que se indique de otro modo, se refiere al acto de tratar. La frase "un método para tratar", o su equivalente, cuando se aplica a, por ejemplo, cáncer, se refiere a un procedimiento o curso de acción que es diseñado para reducir o eliminar el número de células cancerígenas en un mamífero, o para aliviar los síntomas de un cáncer. "Un método de tratamiento" de cáncer u otro trastorno proliferativo, no necesariamente significa que las células cancerosas u otro trastorno, en efecto, serán eliminados, que el número de células o trastornos en efecto, serán reducidos, o que los síntomas de un cáncer u otro trastorno en efecto, serán aliviados. A menudo, un método para tratar cáncer se realizará aún con una baja probabilidad de éxito, pero el cual, dado el historial médico y expectación de supervivencia estimada de un animal, sin embargo, significa un curso de acción benéfico total . El término "método para manufacturar un medicamento" , se refiere a la manufacturación de un medicamento para uso en la indicación como se especifica en este documento y en particular, para uso en tumores, metástasis de tumor o cáncer en general. El término se refiere al así llamado formato reivindicado "tipo Suizo" en la indicación especificada. El término "agente terapéuticamente efectivo", significa una composición que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o humano que está siendo buscado por el investigador, veterinario, doctor médico u otro especialista. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva", significa la cantidad del compuesto sujeto o combinación que provocará la respuesta médica o biológica de un tejido, sistema, animal o humano que está siendo buscado por el investigador, veterinario, doctor médico u otro especialista. Como se usa en este documento, el término "inhibidor de cinasa del EGFR", se refiere a cualquier inhibidor de cinasa del EGFR que es actualmente conocido en la técnica o que se identificará en el futuro, e incluye, cualquier entidad química que, después de la administración a un paciente, resulta en la inhibición de una actividad biológica asociada con la activación del receptor del EGF en el paciente, que incluye cualquiera de los efectos biológicos corriente abajo que resultan de otro modo, del enlace de EGFR a su ligando natural. Tales inhibidores de cinasa del EGFR, incluyen cualquier agente que puede bloquear la activación del EGFR o cualquiera de los efectos biológicos corriente abajo de la activación del EGFR que son relevantes para tratar el cáncer en un paciente. Tal inhibidor puede actuar enlazándose directamente al dominio intracelular del receptor e inhibiendo su actividad de cinasa. Alternativamente, tal inhibidor puede actuar ocupando el sitio de enlace al ligando o una porción del mismo del receptor del EGFR, con ello, haciendo al receptor inaccesible a su ligando natural, de manera que su actividad biológica normal se previene o reduce. Alternativamente, tal inhibidor puede actuar modulando la dimerización de polipéptidos del EGFR, o interacción del polipéptido del EGFR con otras proteínas, o mejorar la ubiquitinación y degradación endocitótica del EGFR. Los inhibidores de cinasa del EGFR incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de bajo peso molecular, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, constructos antisentido, ARNs inhibidores pequeños (es decir, ARN de interferencia por dsARN; ARNi), y ribozimas. En una modalidad preferida, el inhibidor de cinasa del EGFR, es una molécula orgánica pequeña o un anticuerpo que se enlaza específicamente al EGFR humano . Como se usa en este documento, el término "inhibidor de cinasa del EGFR" , se refiere a cualquier inhibidor de cinasa del EGFR que es actualmente conocido en la técnica o que se identificará en el futuro, e incluye cualquier entidad química que, después de la administración a un paciente, resulta en la inhibición de una actividad biológica asociada con la activación del receptor del EGF en el paciente, que incluye cualquiera de los efectos biológicos corriente abajo que resultan de otro modo del enlace al EGFR de su ligando natural. Tales inhibidores de cinasa del EGFR incluyen cualquier agente que puede bloquear la activación del EGFR o cualquiera de los efectos biológicos corriente abajo de la activación del EGFR que son relevantes para tratar cáncer en un paciente. Tal inhibidor puede actuar enlazándose directamente al dominio intracelular del receptor e inhibiendo su actividad de cinasa. Alternativamente, tal inhibidor puede actuar ocupando el sitio de enlace al ligando o una porción del mismo del receptor del EGFR, con ello, haciendo al receptor inaccesible a su ligando natural, de manera que su actividad biológica normal se previene o reduce. Alternativamente, tal inhibidor puede actuar modulando la dimerización de polipéptidos del EGFR, o interacción de polipéptido del EGFR con otras proteínas, o mejorando la ubiquitinación y degradación endocitótica del EGFR. Los inhibidores de cinasa del EGFR, incluyen pero no se limitan a, inhibidores de bajo peso molecular, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, constructos antisentido, ARNs inhibidores pequeños (es decir, ARN de interferencia por dsARN; ARNi), y ribozimas. En una modalidad preferida, el inhibidor de cinasa del EGFR es una molécula orgánica pequeña o un anticuerpo que se enlaza específicamente al EGFR humano. Los inhibidores de cinasa del EGFR que incluyen, por ejemplo, inhibidores de cinasa del EGFR de quinazolina, inhibidores de cinasa del EGFR de pirido-pirimidina, inhibidores de cinasa del EGFR de pirimido-pirimidina, inhibidores de cinasa del EGFR de pirrolo-pirimidina, inhibidores de cinasa del EGFR de pirazolo-pirimidina, inhibidores de cinasa del EGFR de fenilamino-pirimidina, inhibidores de cinasa del EGFR de oxindol, inhibidores de cinasa del EGFR de indolocarbazol , inhibidores de cinasa del EGFR de ftalazina, inhibidores de cinasa del EGFR de isoflavona, inhibidores de cinasa del EGFR de quinalona, e inhibidores de cinasa del EGFR de tirfostina, tales como aquellos descritos en las siguientes publicaciones de patentes, y todas las sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de dichos inhibidores de cinasa del EGFR; Publicaciones de Patentes Internacionales Nos.: WO 96/33980, WO 96/30347, WO 97/30034, WO 97/30044, WO 97/38994, WO 97/49688, WO 98/02434, WO 97/38983, WO 95/19774, WO 95/19970, WO 97/13771, WO 98/02437, WO 98/02438, WO 97/32881, WO 98/33798, WO 97/32880, WO 97/3288, WO 97/02266, WO 97/27199, WO 98/07726, WO 97/34895, WO 96/31510, WO 98/14449, WO 98/14450, WO 98/14451, WO 95/09847, WO 97/19065, WO 98/17662, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 99/07701, y WO 92/20642; Solicitudes de Patentes Europeas Nos.: EP 520722, EP 566226, EP 787772, EP 837063, y EP 682027; Patentes Estadounidenses Nos.: 5,747,498, 5,789,427, 5,650,415, y 5,656,643; y Solicitud de Patente Alemana No. DE 19629652. Ejemplos no limitantes adicionales de inhibidores de cinasa del EGFR de bajo peso molecular, incluyen cualquiera de los inhibidores de cinasa del EGFR descritos en Traxler, P., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents 8 (12) : 1599-1625. Como se usa en este documento, un "inhibidor de cinasa del EGFR", es preferiblemente, un compuesto de fórmula 1: en donde m es 1, 2 ó 3; cada R1 es seleccionado independientemente de hidrógeno, halo, hidroxi, amino, hidroxiamino, carboxi, alcoxicarbonilo (C?-C4) , nitro, guanidino, ureido,. carbamoil, ciano, trifluorometilo, (R6) 2N-carbonilo, y fenil-W-alquilo, en donde W se selecciona de un enlace único, O, S y NH; o cada R1 es seleccionado independientemente de ciano-alquilo- (C?-C ) y R9 en donde R9 se selecciona del grupo que consiste de R5, R50, (R6)2N, R7C(=0), R5ONH, A y R5Y; R5 es alquilo (C?-C4) ; R6 es hidrógeno o R5, en donde los R5 son los mismos o diferentes; R7 es R5, R50, o (R6)2N; A se selecciona de piperidino, morfolino, pirrolidino y 4-R6-piperazin-l-ilo, imidazol-1-ilo, 4-piridon-l-ilo, carboxi-alquilo (C?-C ) , fenoxi, fenilo, fenilsulfañilo, alquenilo- (C2-C ) , (R6)2-N-carbonil-alquilo- (C1-C4) ; y Y se selecciona de S, SO, S02 ; las porciones alquilo en (R2)2N son opcionalmente sustituidas con halo ó R9 en donde R9 es definido como anteriormente, y las porciones alquilo en R5 y R50 son opcionalmente sustituidas con halo, R60, o R9 en donde R9 y R6 son definidos como anteriormente, y en donde los grupos resultantes son opcionalmente sustituidos con halo o R9, con la condición de que un átomo de nitrógeno, oxígeno o azufre y otro heteroátomo, no se pueden unir al mismo átomo de carbono, y con la condición además, de que no más de tres unidades "R9" pueden comprender R1; o cada R1 es seleccionado independientemente de R5-sulfonilamino, ftalimido-alquilsulfonilamino- (C?-C4) , benzamido, bencensulfonilamino, 3-fenilureido, 2-oxopirrolidin-l-ilo, 2 , 5-dioxopirrolidin-l-ilo, y R10-alcanoilamino- (C2-C4) , en donde R10 se selecciona de halo, R60, -alcanoiloxi- (C2-C4) , R7C(=0), y (R6)2N; en donde dicho sustituyente benzamido o bencensulfonilamino o fenilo o fenoxi o anilino o fenilsulfañilo en R1, puede opcionalmente, portar uno o dos sustituyentes halógenos, alquilo (C?-C ) , ciano, metansulfonilo o alcoxi- (C?-C ) ; o cualesquiera dos R1 tomados junto con los carbonos a los cuales están unidos, comprenden un anillo de 5-8 elementos, que comprende al menos, uno o dos heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre o nitrógeno; y en donde los grupos alquilo y porciones alquilo de los grupos alcoxi o alquilamino pueden ser de cadena recta o si están comprendidos de al menos tres carbonos, pueden ser ramificados o cíclicos; R2 se selecciona de hidrógeno y alquilo (d-C6) opcionalmente sustituido; N es 1 ó 2 y cada R3 es seleccionado independientemente de hidrógeno, alquilo (C?-C6) , amino, halo, hidroxi ; R4 es azido o Rn-etinilo, en donde R11 se selecciona de hidrógeno, alquilo- (C?-C6) opcionalmente sustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan de hidrógeno, amino, hidroxi, R50, R5NH y (R5)2N. Más particularmente, el inhibidor de cinasa del EGFR de conformidad con la invención, se refiere a compuestos de fórmula 1, en donde m, n, R1 y R3 son como se definen anteriormente y R2 es hidrógeno y R4 es R11-etinilo, en donde R11 se selecciona de hidrógeno, alquilo- (C?-C6) opcionalmente sustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan de hidrógeno, amino, hidroxi, R50, R5NH, y (R5)2N o R4 es azido. El inhibidor de cinasa del EGFR de conformidad con la invención, también se refiere a compuestos de fórmula 1, en donde n es definido anteriormente y m es 1 ó 2, cada R1 es seleccionado independientemente de hidrógeno, hidroxi, amino, hidroxiamino, carboxi, nitro, carbamoil, ureido; R60, alcanoloxi- (C2-C4) , HOC(=0), A y (R6)2N, R6OKO, R6OKNH, CN y fenilo; R5NH opcionalmente halo sustituido, alcanoiloxi- (C2-C4) , R60, R7C(=0), (R6)2N, A, R6OKO, RsOKNH, C6H5Y, CN; (R6)2N(C=0), R5ONH, R5S, alquilsulfonilamino- (C?-C4) ; ftalimido-alquilsulfonilamino- (C?-C4) , 3-fenilureido, 2-oxopirrolidin-l-ilo, 2 , 5-dioxopirrolidin-l-ilo, halo-alcanoilamino- (C2-C4) , hidroxi-alcanoilamino- (C2-C4) , alcanoiloxi- (C2-C4) -alcanoilamino- (C2-C4) , alcoxi (C?-C4) -alcanoilamino- (C2-C ) , carboxi -alcanoilamino- (C2-C4) , alcoxicarbonilo (C1-C4) -alcanoilamino- (C1-C4) , carbamoil-alcanoilamino- (C2-C4) , N-alquilcarbamoil- (C2-C4) -alcanoilamino- (C2-C4) , N, N-di- [ (alquilo- (C?-C4) ] carbamoil-alcanoilamino- (C2-C4) , amino-alcanoilamino- (C2-C4) , alquilamino- (C1-C4) -alcanoilamino- (C2-C4) , di-alquilamino-(C1-C4) -alcanoilamino, y en donde dicho sustituyente fenilo o fenoxi o anilino en R1, puede opcionalmente, portar uno o dos halógenos, sustituyentes alquilo- (C?-C4) o alcoxi- (C?-C4) ; o cualesquiera dos R1 tomados junto con los carbonos a los cuales están unidos, comprenden un anillo de 5-8 elementos que comprende al menos, uno o dos heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre o nitrógeno; y en donde los grupos alquilo y porciones alquilo de los grupos alcoxi o alquilamino, pueden ser de cadena recta o si comprenden de al menos tres carbonos, pueden ser ramificados o cíclicos; cada R3 es seleccionado independientemente de hidrógeno, metilo, etilo, amino, halo e hidroxi; R4 es R?:L-etinilo, en donde R11 es hidrógeno. Más particularmente, el inhibidor de cinasa del EGFR de conformidad con la invención, se refiere a compuestos de fórmula I, en donde m, n, R1, R2 y R3 son como se definen anteriormente, y cada R1 es seleccionado independientemente de hidrógeno, hidroxi, amino, hidroxiamino, nitro, carbamoil, ureido, R5 opcionalmente sustituido con halo, R60, HOC(=0), H2NC(=0); R50 opcionalmente sustituido con halo, R60, alcanoiloxi- (C2-C4) , HOC(=0), (R6)2N, A, fenilo; R5NH, (R5)2N, R5NH2, (R5)2NH, R5NHC(=0), (R5)2NC(=0), R5S, fenilo-alcoxi- (C2-C4) , y en donde dicho sustituyente fenilo en Ri, puede opcionalmente, portar uno o dos sustituyentes halo, R5 ó R50; o cualesquiera dos R1 tomados junto con los carbonos a los cuales están unidos, comprenden un anillo de 5-8 elementos que comprende al menos, uno o dos heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre o nitrógeno; y en donde los grupos alquilo y porciones alquilo de los grupos alcoxi o alquilamino, pueden ser de cadena recta o si comprenden al menos tres carbonos, pueden ser ramificados o cíclicos. Ejemplos preferidos específicos de inhibidores de cinasa del EGFR de bajo peso molecular que pueden ser usados de conformidad con la presente invención incluyen, [6,7-bis (2-metoxietoxi) -4-quinazolin-4-il] - (3-etilfenil) -amina (también conocidos como OSI-774, erlotinib o Tarceva™ (HCl de erlotinib) ; OSI Phar aceuticals/Genetech/Roche) (Patente Estadounidense No. 5,747,498; Publicación Internacional de Patente No.: WO 01/34574, y Moyer, J.D. et al. (1997) Cáncer Res. 57:4838-4848); CI-1033 (anteriormente conocido como PD183805; Pfizer) (Sherwood et al., 1999, Proc. Am. Assoc. Cáncer Res. 40:723); PD-158780 (Pfizer); AG-1478 (Universidad de California) ; CGP-59326 (Novartis) ; PKI-166 (Novartis) ; EKB-569 (Wyeth) ; GW-2016 (también conocido como GW-572016 lapatinib ditosilato; GSK) ; y gefitinib (también conocido como ZDl 839 ó Iressa™; Astrazeneca) (Woodburn et al., 1997, Proc. Am. Assoc. Cáncer Res. 38:633). Un inhibidor de cinasa del EGFR de bajo peso molecular particularmente preferido que puede ser usado de conformidad con la presente invención es, [6, 7-bis (2 -metoxietoxi) -4-quinazolin-4-il] - (3-etinifenil) amina (es decir, erlotinib) , su sal de clorhidrato (es decir, HCl de erlotinib, Tarceva™) , u otras formas de sal (por ejemplo, mesilato de erlotinib) .

Más preferiblemente, el inhibidor de cinasa del EGFR de conformidad con la invención, se refiere al compuesto HCl de erlotinib (también conocido como Tarceva™) . Los inhibidores de cinasa del EGFR basados en anticuerpo, preferidos, incluyen cualquier anticuerpo anti-EGFR o fragmento de anticuerpo que puede parcialmente o completamente, bloquear la activación del EGFR por su ligando natural. Ejemplos no limitantes de inhibidores de cinasa del EGFR a base de anticuerpo incluyen aquellos descritos en Modjtahedi, H., et al., 1993, Br. J. Cáncer 67:247-253; Teramoto, T., et al., 1996, Cáncer 77:639-645; Goldstein et al., 1995, Clin. Cáncer Res. 1:1311-1318; Huang, S. M. , et al., 1999, Cáncer Res. 15 : 59 (8) : 1935-40 ; and Yang, X., et al., 1999, Cáncer Res. 59:1236- 1243. De este modo, el inhibidor de cinasa del EGFR puede ser el anticuerpo monoclonal Mab E7.6.3 (Yang, X.D. et al. (1999) Cáncer Res. 59: 1236-43), o Mab C225 (ATCC Acceso No:. HB-8508) , o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene especificidad de enlace del mismo. Los inhibidores de cinasa del EGFR de anticuerpo monoclonal adecuados, incluyen pero no se limitan a, IMC-C225 (también conocido como cetuximab o Erbitux™; Imclone Systems) , ABX-EGF (Abgenix) , EMD 72000 (Merck KgaA, Darmstadt), RH3 (York Medical Bioscience Inc.), y MDX-447 (Medarex/ Merck KgaA) . Los inhibidores de cinasa del EGFR a base de anticuerpo adicional, pueden ser originados de conformidad con los métodos conocidos, administrando el antígeno o epítope apropiado a un animal hospedero seleccionado, por ejemplo, de cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas, y ratones, entre otros. Se pueden usar varios adyuvantes conocidos en la técnica, para mejorar la producción de anticuerpo . Aunque anticuerpos empleados en la práctica de la invención pueden ser policlonales, se prefieren anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales contra EGFR, pueden ser preparados y aislados usando cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Las técnicas para producción y aislamiento incluyen pero no se limitan a, la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kohier and Milstein (Nature, 1975, 256: 495- 497); la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:2026-2030); y la técnica de hibridoma EBV (Colé et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) . Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (véase por ejemplo, Patente Estadounidense No.: 4,946,778), pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena única anti-EGFR. Los inhibidores de cinasa del EGFR a base de anticuerpo, útiles en la práctica de la presente invención, también incluyen fragmentos de anticuerpo anti-EGFR que incluyen pero no se limitan a, fragmentos F (ab' ) . sub.2 , los cuales pueden ser generados por digestión de pepsina de una molécula anticuerpo intacta, y fragmentos Fab, los cuales pueden ser generados reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F (ab' ) . sub.2. Alternativamente, se pueden construir bibliotecas de expresión Fab y/o scFv (véase por ejemplo, Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281), para permitir rápida identificación de fragmentos que tienen la especificidad deseada al EGFR. Las técnicas para la producción y aislamiento de anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo, son bien conocidas en el arte, y se describe en Harlow and Lañe, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, and in J. W. Goding, 1986, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, London. Los anticuerpos anti-EGFR humanizados y fragmentos de anticuerpo, también pueden ser preparados de conformidad con técnicas conocidas, tales como aquellas descritas en Vaughn, T. J. et al., 1998, Nature Biotech. 16:535-539 y referencias citadas en este documento, y tales anticuerpos o fragmentos de los mismos, son también empleados en la práctica de la presente invención.

Los inhibidores de cinasa del EGFR para uso en la presente invención, se pueden basar alternativamente, en los constructos de oligonucleótido antisentido. Oligonucleótidos anti-sentido, que incluyen moléculas de ARN anti-sentido y moléculas de ADN anti-sentido, podrían actuar directamente para bloquear la traducción de ARNm del EGFR enlazándose a estos y de este modo, previniendo la traducción de la proteína o incrementando la degradación del ARNm, de este modo, disminuyendo el nivel de la proteína cinasa del EGFR, y así, la actividad en una célula. Por ejemplo, oligonucleótidos antisentido de al menos, aproximadamente 15 bases y complementarios a regiones únicas del EGFR que codifica la secuencia transcripta de ARNm, pueden ser sintetizados, por ejemplo, por técnicas convencionales de fosfodiéster y administrados por ejemplo, por inyección intravenosa o infusión. Son bien conocidos en la técnica, métodos para usar técnicas antisentido para inhibir específicamente la expresión del gen de genes cuya secuencia es conocida (por ejemplo, véase Patentes Estadounidenses Nos. 6,566,135; 6,566,131; 6,365,354; 6,410,323; 6,107,091; 6,046,321; y 5,981,732) . ARNs inhibidores pequeños (siARNs) , pueden también funcionar como inhibidores de cinasa del EGFR para uso en la presente invención. La expresión del gen del EGFR puede ser reducida contactando el tumor, sujeto o célula con un ARN de doble hebra pequeño (dsARN) , o un vector o constructo que ocasiona la producción de un ARN de doble hebra pequeño, de manera tal que la expresión del EGFR es específicamente inhibida (es decir, ARN de interferencia o ARNi) . Los métodos para seleccionar un dsARN apropiado o vector que codifica un dsARN, son bien conocidos en la técnica para genes cuya secuencia es conocida (por ejemplo, Tuschi, T., et al. (1999) Genes Dev. 13 (24) : 3191-3197; Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Harmon, GJ. (2002) Nature 418:244-251; McManus, M.T. and Sharp, P. A. (2002) Nature Reviews Genetics 3:737-747; Bremmelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296:550-553; Patentes Estadounidenses Nos.: 6,573,099 y 6,506,559; y Publicaciones Internacionales de Patentes Nos.: WO 01/36646, WO 99/32619, y WO 01/68836) . Las ribozimas también pueden funcionar como inhibidores de cinasa del EGFR, para uso en la presente invención. Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar el desdoblamiento específico del ARN. El mecanismo de acción de ribozima involucra hibridación específica de la secuencia de la molécula de ribozima al ARN objetivo complementario, seguido por escisión endonucleolítica . Las moléculas de ribozima de porción de cabeza de martillo que específicamente y eficientemente catalizan la escisión endonucleolítica de secuencias de .AR?m del EGFR, son con ello, empleadas dentro del alcance de la presente invención. Sitios de escisión de ribozima específicos dentro de cualquier objetivo de ARN potencial, son inicialmente identificados por exploración de la molécula objetivo por sitios de escisión de ribozima, los cuales incluyen típicamente, las siguientes secuencias, GUAU, GUU y GUC. Una vez identificados, las secuencias de AR? cortas de entre aproximadamente 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la región del gen objetivo que contiene el sitio de escisión, pueden ser evaluadas por características estructurales predichas, tales como estructura secundaria, que pueden proporcionar la secuencia de oligonucleótido inadecuada. La adecuabilidad de los objetivos candidatos puede también ser evaluada probando su accesibilidad para hibridación con oligonucleótidos complementarios, usando, por ejemplo, ensayos de protección de ribonucleasa. Tanto los oligonucleótidos antisentido como ribozimas empleados como inhibidores de cinasa del EGFR, pueden ser preparados por métodos conocidos. Estos incluyen técnicas para síntesis química, tales como por ejemplo, por síntesis química de fosforamadita de fase sólida. Alternativamente, las moléculas de ARN anti-sentido, pueden ser generadas por transcripción in vitro o in vivo de secuencias de AD? que codifican la molécula de AR?. Tales secuencias de AD? pueden ser incorporadas en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de polimerasa de ARN adecuados, tales como los promotores de polimerasa T7 ó SP6. Varias modificaciones a los oligonucleótidos de la invención, se pueden introducir como medios para incrementar la estabilidad intracelular y vida media. Las modificaciones posibles incluye pero no se limitan a, la adición de secuencias de flanqueo de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos a los extremos en dirección 5' y/o 3' de la molécula, o al uso de fosforotioato o 2'-0-metilo, en lugar de enlaces de fosfodiesterasa dentro de la estructura de oligonucleótido. Los datos presentados en los Ejemplos de este documento abajo, demuestran que la co-administración de un inhibidor de cinasa del EGFR con radiación ionizante, es efectiva para el tratamiento de cánceres avanzados, tales como cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorectal o cáncer pancreático. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para manufacturar un medicamento propuesto para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante. Preferiblemente, tal combinación está propuesta para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente. En el método de conformidad con la invención, el cáncer presente en el paciente puede ser cualquiera de aquellos referidos en este documento abajo, que incluye NSCLC, cáncer colorectal, cáncer de cabeza y cuello o cáncer pancreático. En una modalidad preferida del método, la invención se refiere a un método de manufactura de un medicamento, en donde el medicamento es una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR, en combinación con radiación ionizante la cual es administrada secuencialmente después del tratamiento previo con el inhibidor de cinasa del EGFR. En una modalidad preferida alternativa del método de manufactura de un medicamento de conformidad con la invención, el medicamento comprende una cantidad sub-terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR en combinación con radiación ionizante, la cual es administrada secuencialmente después del tratamiento previo con la cantidad sub-terapéuticamente efectiva del inhibidor de cinasa del EGFR. En otra modalidad preferida alternativa del método de manufactura de un medicamento de conformidad con la invención, el medicamento comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR, en combinación con una cantidad sub-terapéuticamente efectiva de radiación ionizante, la cual es administrada secuencialmente después del tratamiento previo con la cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor de cinasa del EGFR. En una modalidad, el medicamento está propuesto para tratamiento de cáncer de pulmón o tumores de cáncer de cabeza y cuello o metástasis de tumor . En cualquiera de los métodos de la presente invención, la administración de agentes puede ser realizada simultáneamente administrando separadamente, agentes al mismo tiempo, o en conjunto, como una combinación fija. También, en cualquiera de los métodos de la presente invención, la administración de agentes secuencialmente, puede ser en cualquier orden. Como se usa en este documento, la fuente de radiación ionizante de esta invención, puede ser ya sea externa o interna al paciente para quién el medicamento es manufacturado o quién está siendo tratado. Cuando la fuente es externa al paciente, la terapia es conocida como terapia de radiación de haz externo (EBRT) . Cuando la fuente de radiación es interna al paciente, el tratamiento es llamado braquiterapia (BT) . Los átomos radioactivos para uso en el contexto de esta invención, se pueden seleccionar del grupo que incluye, pero no se limita a, radio, cesio-137, iridio-192, americio-241, oro-198, cobalto-157, cobre-67, tecnetio-99, yodo-123, yodo-131, e indio-111. En donde el inhibidor de cinasa del EGFR de conformidad con esta invención, es un anticuerpo, también es posible etiquetar el anticuerpo con tales isótopos radioactivos. La radiación ionizante es un tratamiento estándar para controlar tumores inoperables o sin resección y/o metástasis de tumor. La terapia basada en la aplicación de una cantidad efectiva de radiación ionizante, se basa en el principio de que la radiación de dosis altas suministrada a un área objetivo, resultará en la muerte de células reproductivas en tanto tejido tumoral como normal. El régimen de dosificación de radiación es en general, definido en término de dosis absorbida por radiación (Gy) , tiempo y fraccionamiento, y debe ser cuidadosamente definida por el oncologista. La cantidad de radiación que un paciente recibe, dependerá de varias consideraciones, pero las dos más importantes son la ubicación del tumor con relación a otras estructuras u órganos críticos del cuerpo, y la extensión en la cual se ha esparcido el tumor. Un curso típico de tratamiento para un paciente que se somete a terapia de radiación, será un programa de tratamiento durante un periodo de 1 a 6 semanas, con una dosis total de entre 10 y 80 Gy administrados al paciente en una fracción diaria única de aproximadamente 1.8 a 2.0 Gy, 5 días a la semana. En una modalidad preferida de esta invención, existe sinergia cuando los medicamentos de combinación de conformidad con la invención, son aplicados a tumores en pacientes humanos. En otras palabras, la inhibición del crecimiento del tumor por medio del tratamiento de radiación de la combinación de esta invención, es mejorado cuando se combina con tratamiento usando un inhibidor de cinasa del EGFR. Los parámetros de terapias de radiación adyuvante están, por ejemplo, contenidos en la Publicación de Patente Internacional WO 99/60023. Detalles adicionales de la metodología del tratamiento de radiación de pacientes con cáncer, son bien conocidos por aquellos de habilidad en la técnica, y están fácilmente disponibles de la literatura extensiva en esta área (por ejemplo, Principies and Practice of Radiation Oncology (2003), 4th Edition, ISBN 0-7817-3525-4, ed. Pérez CA. et al., Lippincott Williams and Wilkins; Radiotherapy for head and Neck Cancers (2002) , 2nd Edition, ISBN 0-7817- 2650-6, Ang, K.K. and Garden, A.S., Lippincott Williams and Wilkins; Principies and Practice of Oncology (2001) , 6th Edition, ISBN 0-7817-2387-6, ed. DeVita, V.T. et al., Lippincott Williams and Wilkins) . La presente invención además, proporciona un método para manufacturar un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante, y está propuesta para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, en donde la fuente de radiación ionizante es un radiofarmacéutico, o incluye uso de un radiofarmacéutico. La presente invención además proporciona un método para manufacturar un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante, y está propuesta para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, en donde además, uno o más de otros agentes citotóxicos, quimioterapéuticos u anti -cancerígenos, o compuestos que mejoran los efectos de tales agentes, son empleados en dicha combinación. En el contexto de esta invención, otros agentes adicionales citotóxicos, quimioterapéuticos o anticancerígenos, o compuestos que mejoran los efectos de tales agentes, incluyen por ejemplo: agentes alquilantes o agentes con una acción alquilante, tales como ciciofosfamida (CTX; por ejemplo, cytoxan®) , clorambucil (CHL; por ejemplo, leukeran®) , cisplatino (CisP; por ejemplo, platinol®) , busulfan (por ejemplo, myleran®) , melfalan, carmustina (BCNU) , estreptozotocina, trietilenmelamina (TEM) , mitomicina C y similares; anti-metabolitos, tales como metotrexato (MTX) , etopósido (VP16; por ejemplo, vepesid®) , 6-mercaptopurina (6MP) , 6-tioguanina (6TG) , citarabina (Ara-C) , 5-fluorouracilo (5 -FU) , capecitabina (por ejemplo, Xeloda®) , dacarbazina (DTIC) , y similares; antibióticos, tales como actinomicina D, doxorubicina (DXR; por ejemplo, adriamycin®) , daunorubicina (daunomicina) , bleomicina, mitramicina y similares; alcaloides, tales como alcaloides vinca tales como vincristina (VCR), vinblastina, y similares; y otros agentes antitumorales, tales como paclitaxel (por ejemplo, taxol®) y derivados de paclitaxel, agentes citostáticos, glucocorticoides tales como dexametasona (DEX; por ejemplo, decadron®) y corticoesteroides tales como prednisona, inhibidores de la enzima del nucleósido tales como hidroxiurea, enzimas de depleción de aminoácido tales como asparaginasa, leucovorina, ácido fólico, raltitrexed y otros derivados de ácido fólico, y similares, diversos agentes antitumorales. Los siguientes agentes también pueden ser usados como agentes adicionales; arnifostina (por ejemplo, ethyol®) , dactinomicina, mecloretamina (mostaza de nitrógeno) , estreptozocina, ciciofosfamida, lornustina (CCNU) , doxorubicina lipo (por ejemplo, doxil®) , gencitabina (por ejemplo, gemzar®) , daunorubicina lipo (por ejemplo, daunoxome®) , procarbazina, mitomicina, docetaxel (por ejemplo, taxotere®) , aldesleucina, carboplatino, oxaliplatino, cladribina, camptotecina, CPT 11 (irinotecano) , 10-hidroxi 7-etil-camptotecina (SN38) , floxuridina, fludarabina, ifosfamida, idarubicina, mesna, interferón alfa, interferón beta, mitoxantrona, topotecano, leuprólido, megestrol, melfalan, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobromano, plicamicina, tamoxifeno, tenipósido, testolactona, tioguanina, tiotepa, mostaza de uracilo, vinorelbina, y clorambucilo. La presente invención además, proporciona un método para manufacturar un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante, y está propuesta para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, en donde además, se usan uno o más agentes anti-hormonales en dicha combinación. Como se usa en este documento, el término "agente anti-hormonal" , incluye compuestos orgánicos o peptídicos, naturales o sintéticos, que actúan para regular o inhibir la acción de la hormona en tumores. Agentes anti-hormonales incluyen por ejemplo: antagonistas del receptor esteroide, anti-estrógenos tales como tamoxifeno, raloxifeno, aromatasa que inhibe 4(5)-imidazoles, otros inhibidores de aromatasa, 42-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY 117018, onapristona, y toremifeno (por ejemplo, Fareston®) ; antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprólido, y goserelina; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; agonistas y/o antagonistas de hormonas de glicoproteína tales como hormona estimulante del folículo (FSH) , hormona estimulante de la tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) y LHRH (hormona de liberación de la hormona luteinizante) ; acetato de goserelina agonista de LHRH, comercialmente disponible como Zoladex® (AstraZeneca) ; N-acetil-3- (2-naftalenil) -D-alanil-4-cloro-D-fenilalanil-3- (piridinil-D-alanil-L-seril-N6- (3-piridinilcarbonil) -L-lisil-N6- (3-piridinilcarbonil) -D-lisil-L-leucil-N6- (1-metiletil) -L-lisil-L-prolina (por ejemplo, Antide®, Ares-Serono) de D-alaninamida antagonista de LHRH; el acetato de ganirelix antagonista de LHRH; el acetato de ciproterona antiandrógenos esteroidales (CPA) y acetato de megestrol, comercialmente disponibles como Megace® (Bristol-Myers Oncology); la (2-metil-N- [4 , 20-nitro-3- ( trifluorometil) fenilpropanamida de flutamida anti-andrógeno no esteroidal, comercialmente disponible como Eulexin® (Schering Corp.); la nilutamida anti-andrógeno no esteroidal, (5, 5-dimeti1-3- [4-nitro-3- (trifluorometi1-4 ' -nitrofenil) -4,4-dimetil-imidazolidin-diona) ; y antagonistas para otros receptores no permisivos, tales como antagonistas para RAR, RXR, TR, VR, y similares. El uso de agentes citotóxicos y otros anticancerígenos descritos anteriormente en regrumenes quimioterapéuticos, es en general, bien caracterizado en las técnicas de terapia de cáncer, y su uso en este documento, falla bajo las mismas consideraciones para monitorear la tolerancia y efectividad y para controlar las rutas de administración y dosificaciones, con algunos ajustes. Por ejemplo, las dosificaciones actuales de los agentes citotóxicos pueden variar, dependiendo de la respuesta de célula cultivada determinada usando métodos de histocultura. En general, la dosificación se reducirá, comparada con la cantidad usada en la ausencia de otros agentes adicionales . Las dosificaciones típicas de un agente citotóxico efectivo, pueden estar en los intervalos recomendados por el fabricante, y en donde se indica por respuestas in vitro o respuestas en modelos animales, pueden ser reducidas por hasta aproximadamente un orden de magnitud de concentración o cantidad. De este modo, la dosificación actual dependerá del juicio del especialista, la condición del paciente y la efectividad del método terapéutico, basado en la sensibilidad in vitro de las células malignas primarias cultivadas o muestra de tejido histocultivado, o la sensibilidad observada en los modelos animales apropiados. La presente invención además, proporciona un método para manufacturar un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante, y se pretende para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, en donde además, se usan uno o más inhibidores de angiogénesis en dicha combinación. Agentes anti-angiogénicos incluyen, por ejemplo: inhibidores del VEGFR, tales como SU-5416 y SU-6668 (Sugen Inc. of South San Francisco, Calif., USA), o como se describe en, por ejemplo, Solicitudes Internacionales Nos.: WO 99/24440, WO 99/62890, WO 95/21613, WO 99/61422, WO 98/50356, WO 99/10349, WO 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755, y WO 98/02437, y Patentes Estadounidenses Nos.: 5,883,113, 5,886,020, 5,792,783, 5,834,504 y 6,235,764; inhibidores del VEGF tales como IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Wash., USA); angiozima, una ribozima sintética de Ribozima (Boulder, Coló.); y anticuerpos a VEGF, tales como bevacizumab (por ejemplo, Avastin™, Genentech, South San Francisco, CA) , un anticuerpo humanizado recombinante a VEGF; antagonistas del receptor de integrina y antagonistas de integrina, tales como avß3, avß5 y oívßß integrinas, y subtipos de los mismos, por ejemplo, cilengitido (EMD 121974) , o los anticuerpos anti -integrina, tales como por ejemplo, anticuerpos humanizados específicos de vß3 (por ejemplo, Vitaxin®) ; factores tales como IFN-alfa (Patentes Estadounidenses Nos.: 41530,901, 4,503,035, y 5,231,176); fragmentos de angiostatina y plasminógeno (por ejemplo, kringle 1-4, kringle 5, kringle 1-3 (O'Reilly, M. S. et al. (1994) Cell 79:315-328; Cao et al. (1996) J. Biol.

Chem. 271: 29461-29467; Cao et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:22924-22928); endostatina (O'Reilly, M. S. et al. (1997) Cell 88:277; y Publicación de Patente Internacional No.: WO 97/15666); tromboespondina (TSP-I; Frazier, (1991) Curr. Opin. Cell Biol. 3:792); factor de plaquetas 4 (PF4); activador de plasminógeno/inhibidores de urocinasa; antagonistas del receptor de urocinasa; heparinasas; análogos de fumagillina tales como TNP-4701; suramin y análogos de suramin; esteroides angiostáticos; antagonistas del bFGF; antagonistas flk-1 y flt-1; agentes anti -angiogénesis tales como inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa de matriz 2) e inhibidores de MMP- 9 (metaloproteinasa de matriz 9) . Ejemplos de inhibidores de metaloproteinasa de matriz empleados, son descritos en las Publicaciones Internacionales de Patentes Nos.: WO 96/33172, WO 96/27583, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, y WO 99/07675, Publicación de Solicitudes de Patentes Europeas Nos.: 818,442, 780,386, 1,004,578, 606,046, y 931,788; Publicación de solicitud de Patente Británica No. 9912961 y Patentes Estadounidenses Nos.: 5,863,949 y 5,861,510. Inhibidores MMP-2 y MMP- 9 preferidos, son aquellos que tienen poca o ninguna actividad de inhibición de MMP-1. Más preferidos, son aquellos que inhiben selectivamente a MMP-2 y/o MMP- 9, con relación a otras metaloproteinasas de matriz (es decir, MMP- 1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP- 12, y MMP- 13) . La presente invención además, proporciona un método para manufacturar un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante, y está propuesta para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, en donde además, uno o más agentes pro-apoptóticos o que estimulan la apoptósis de células tumorales, son usados en dicha combinación. La presente invención además, proporciona un método para manufacturar un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante, y está propuesta para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, en donde además, se usan uno o más inhibidores de transducción de señal en dicha combinación. Los inhibidores de transducción de señal incluyen, por ejemplo: inhibidores del receptor erbB2 , tales como moléculas orgánicas, o anticuerpos que se enlazan al receptor erbB2 , por ejemplo, trastuzumab (por ejemplo, Herceptin®); inhibidores de otras tirosinas-cinasas de proteína, por ejemplo, imitinib (por ejemplo, Gleevec®) ; inhibidores ras; inhibidores raf; inhibidores MEK; inhibidores mTOR; inhibidores de cinasa dependientes de ciclina; inhibidores de la proteína cinasa C; e inhibidores PDK-1 (véase, Dancey, J. and Sausville, E. A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313, para una descripción de varios ejemplos de tales inhibidores, y su uso en ensayos clínicos para el tratamiento de cáncer) . Inhibidores del receptor ErB2 incluyen, por ejemplo: inhibidores del receptor ErbB2 , tales como GW-282974 (Glaxo Wellcome pie) , anticuerpos monoclonales tales como AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc. of The Woodlands, Tex., USA) , e inhibidores erbB2 tales como aquellos descritos en las Publicaciones Internacionales Nos.: WO 98/02434, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 98/02437, WO 97/13760, y WO 95/19970, y Patentes Estadounidenses Nos.: 5,587,458, 5,877,305, 6,465,449 y 6,541,481. La presente invención además, proporciona un método para manufacturar un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante, y está propuesta para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, en donde además, se usa un anticuerpo anti-HER2 o un fragmento inmunoterapéuticamente activo del mismo, en dicha combinación. La presente invención además, proporciona un método para manufacturar un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante, y está propuesta para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, en donde además, uno o más agentes anti-proliferativos adicionales son usados en dicha combinación. Agentes antiproliferativos adicionales incluyen, por ejemplo: Inhibidores de la transferasa de proteína farnesilo de la enzima e inhibidores del receptor de tirosina cinasa PDGFR, que incluyen, los compuestos descritos y reivindicados en las Patentes Estadounidenses Nos.: 6,080,769, 6,194,438, 6,258,824, 6,586,447, 6,071,935, 6,495,564, 6,150,377, 6,596,735 y 6,479,513, y Solicitud de Patente Internacional WO 01/40217. La presente invención además, proporciona un método para manufacturar un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante, y está propuesta para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, en donde además, se usa un inhibidor de COX II (ciclooxigenasa II) en dicha combinación. Ejemplos de inhibidores COX-II empleados incluyen, alecoxib (por ejemplo, Celebrex™) , valdecoxib, y rofecoxib. La presente invención además, proporciona un método para manufacturar un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante, y está propuesta para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente, en donde además, uno o más agentes capaces de mejorar las respuestas inmunes antitumorales, son usados en dicha combinación . Agentes capaces de mejorar las respuestas inmunes antitumorales incluyen, por ejemplo, anticuerpos CTLA4 (antígeno 4 del linfocito citotóxico) (por ejemplo, MDX-CTLA4) y otros agentes capaces de bloquear el CTLA4. Anticuerpos CTLA4 específicos que pueden ser usados en la presente invención, incluyen aquellos descritos en la Patente Estadounidense No. 6,682,736. La presente invención además, proporciona un método para manufacturar un medicamento para reducir los efectos colaterales causados por el tratamiento de tumores o metástasis de tumor, caracterizado porque se usa una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y combinación de radiación ionizante, y está propuesta para administración al paciente simultáneamente o secuencialmente en cantidades que son efectivas para producir un efecto aditivo, o superaditivo o sinergístico antitumoral, y que son efectivas en la inhibición del crecimiento del tumor. La presente invención además, proporciona un método para el tratamiento de cáncer, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento (i) una primera cantidad efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable; y (ii) una segunda cantidad efectiva de radiación ionizante. La presente invención además, proporciona un método para el tratamiento de cáncer, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento (i) una primera cantidad sub-terapéutica de un inhibidor de cinasa del EGFR, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable; y (ii) una segunda cantidad efectiva de radiación ionizante. La presente invención además, proporciona un método para el tratamiento de cáncer, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento (i) una primera cantidad efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable; y (ii) una segunda cantidad sub-terapéutica de radiación ionizante. La presente invención también, proporciona un método para el tratamiento de cáncer, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento (i) una primera cantidad sub-terapéutica del inhibidor de cinasa del EGFR, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable; y (ii) una segunda cantidad sub-terapéutica de radiación ionizante . En los métodos precedentes, el orden de administración de las primeras y segundas cantidades puede ser simultáneo o secuencial, es decir, la radiación ionizante puede ser administrada antes del inhibidor de cinasa del EGFR, después del inhibidor del EGFR, o al mismo tiempo como el inhibidor de cinasa del EGFR. En una modalidad preferida, el inhibidor de cinasa del EGFR, es administrado antes de la radiación ionizante. En el contexto de esta invención, una "cantidad efectiva" de un agente o terapia, es como se define anteriormente. Una "cantidad sub-terapéutica" de un agente o terapia, es una cantidad menor que la cantidad efectiva para tal agente o terapia, pero cuando se combina con una cantidad efectiva o sub-terapéutica de otro agente o terapia, puede producir un resultado deseado por el especialista debido a, por ejemplo, sinergia en los efectos eficaces resultantes, o efectos colaterales reducidos.

Como se usa en este documento, el término "paciente", preferiblemente se refiere a un humano en necesidad del tratamiento con un inhibidor de cinasa del EGFR por cualquiera de los propósitos, y más preferiblemente, a un humano en necesidad de tal tratamiento para tratar el cáncer, o una condición o lesión precancerosa. Sin embargo, el término "paciente", puede también referirse a animales no humanos, preferiblemente, mamíferos tales como perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas y primates no humanos, entre otros, que están en necesidad del tratamiento con un inhibidor de cinasa del EGFR. En una modalidad preferida, el paciente es un humano en necesidad de tratamiento para cáncer, o condición o lesión precancerosa. El cáncer es preferiblemente, cualquier cáncer tratable, ya sea parcialmente o completamente, por administración de un inhibidor de cinasa del EGFR. El cáncer puede ser por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCL, por sus siglas en inglés) , cáncer de pulmón de células bronquioalviolares, cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cerviz, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, Enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido suave, cáncer de uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, leucemia aguda o crónica, linfomas linfocíticos, neoplasmas del sistema nervioso central (CNS) , tumores del eje espinal, glioma troncal cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimonas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario, que incluye, versiones refractorias de cualquiera de los cánceres anteriores, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. La condición o lesión precancerosa incluye, por ejemplo, el grupo que consiste de leucoplacia oral , queratosis actínica (queratosis solar) , pólipos precancerosos del colon o recto, displasia epitelial gástrica, displasia adenomatosa, síndrome de cáncer de colon sin polipósis hereditario (HNPCC, por sus siglas en inglés) , esófago Barrett, displasia de vejiga, y condiciones cervicales precancerosas . Preferiblemente, el cáncer es cáncer de colon y más preferiblemente, cáncer colorectal. También, preferiblemente, el cáncer es cáncer de pulmón y más preferiblemente, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCL) . También, preferiblemente, el cáncer es cáncer pancreático. También preferiblemente, el cáncer es cáncer de cabeza y cuello. Para propósitos de la presente invención, "combinación", "co-administración de" y "co-administración" de un inhibidor de cinasa del EGFR con un segundo agente o compuesto (por ejemplo, un agente citotóxico, quimioterapéutico o anti -cancerígeno) (ambos componentes referidos aquí posteriormente como los "dos agentes activos) , se refieren a cualquier administración de los dos agentes activos, ya sea separadamente o en conjunto, en donde los dos agentes activos son administrados como parte de un régimen de dosis apropiados, diseñado para obtener el beneficio de la terapia de combinación. De este modo, los dos agentes activos pueden ser administrados ya sea como parte de la misma composición farmacéutica, o en composiciones farmacéuticas separadas. El segundo agente puede ser administrado antes de, al mismo tiempo como, o subsecuente a la administración del inhibidor de cinasa del EGFR, o en alguna combinación del mismo. En donde el inhibidor de cinasa del EGFR, es administrado al paciente a intervalos repetidos, por ejemplo, durante el curso estándar de tratamiento, el segundo agente puede ser administrado antes de, al mismo tiempo como, o subsecuente a, cada administración del inhibidor de cinasa del EGFR, o alguna combinación del mismo, o a intervalos diferentes con relación al tratamiento del inhibidor de cinasa del EGFR, o en una dosis única antes de, en cualquier tiempo durante, o subsecuente al curso del tratamiento con el inhibidor de cinasa del EGFR. El inhibidor de cinasa del EGFR, típicamente será administrado al paciente en un régimen de dosis que proporciona el tratamiento más efectivo del cáncer (de tanto perspectivas de eficacia como de seguridad), para el cual, el paciente está siendo tratado, como se conoce en la técnica y como se describe en por ejemplo, Publicación de Patente Internacional No.: WO 01/34574. Conduciendo el método de tratamiento de la presente invención, el inhibidor de cinasa del EGFR, puede ser administrado en cualquier manera efectiva conocida en la técnica, tal como por administración oral, tópica, intravenosa, intra-peritoneal , intramuscular, intraarticular, subcutánea, intranasal, intra-ocular, vaginal, rectal o transdérmica, dependiendo del tipo de cáncer a ser tratado, el tipo de inhibidor de cinasa del EGFR usado (por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpo, ARNi o constructo antisentido) , y el juicio médico del especialista que prescribe como se basa, por ejemplo, en los resultados de los estudios clínicos publicados. La cantidad de inhibidor de cinasa del EGFR administrado y la sincronización de administración de inhibidor de cinasa del EGFR, dependerá del tipo (especies, género, edad, peso, etc.) y condición del paciente a ser tratado, la severidad de la enfermedad o condición a ser tratada, y la ruta de administración. Por ejemplo, inhibidores de cinasa del EGFR de moléculas pequeñas, pueden ser administrados a un paciente en dosis que varían desde 0.001 hasta 100 mg/kg de peso corporal por día o por semana, en dosis únicas o divididas, o por infusión continua (véase por ejemplo, Publicación de Patente Internacional No. WO 01/34574) . En particular, el HCl de erlotinib, puede ser administrado a un paciente en dosis que varían desde 5-200 mg por día, ó 100-1600 mg por semana, en dosis únicas o divididas, o por infusión continua. Una dosis preferida es 150 mg/día. Los inhibidores de cinasa del EGFR a base de anticuerpo, o constructos de ribozima o ARNi antisentido, pueden ser administrados a un paciente en dosis que varían desde 0.1 hasta 100 mg/kg de peso corporal por día o por semana en dosis únicas o divididas, o por infusión continua. En algunos casos, los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo mencionado anteriormente, pueden ser más que adecuados, mientras que en otros casos, las dosis todavía más grandes, pueden ser empleadas sin ocasionar algún efecto secundario peligroso, con la condición de que tales dosis más grandes, sean primero divididas en varias dosis pequeñas para administración a lo largo del día.

Los inhibidores de cinasa del EGFR y un segundo agente, pueden ser administrados ya sea separadamente, o en conjunto por la misma o diferentes rutas, y en una amplia variedad de formas de dosificación diferentes. Por ejemplo, el inhibidor de cinasa del EGFR, es preferiblemente administrado oralmente o parenteralmente. La administración oral es preferible en donde el inhibidor de cinasa del EGFR es HCl de erlotinib (Tarceva™) . El inhibidor de cinasa del EGFR puede ser administrado con varios portadores inertes farmacéuticamente aceptables en la forma de tabletas, cápsulas, pastillas, trociscos, dulces duros, polvos, rocíos, cremas, pomadas, supositorios, jaleas, geles, pastas, lociones, ungüentos, elixires, jarabes y similares. La administración de tales formas de dosificación se puede llevar a cabo en dosis única o múltiple. Los portadores incluyen diluyentes o rellenadores sólidos, medio acuoso estéril y varios solventes orgánicos no tóxicos, etc. Composiciones farmacéuticas orales pueden ser adecuadamente endulzadas y/o saborizadas. El inhibidor de cinasa del EGFR y un segundo pueden ser combinados juntos con varios portadores inertes farmacéuticamente aceptables en la forma de rocíos, cremas, pomadas, supositorios, jaleas, geles, pastas, lociones, ungüentos y similares. La administración de tales formas de dosificación se puede llevar a cabo en dosis únicas o múltiples. Los portadores incluyen diluyentes o rellenadores sólidos, medio acuoso estéril y varios solventes orgánicos no tóxicos, etc. Todas las formulaciones que comprenden los inhibidores de cinasa del EGFR proteináceos se deben seleccionar para evitar la desnaturalización y/o degradación y pérdida de actividad biológica del inhibidor. Se conocen en la técnica métodos para preparar las composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor de cinasa del EGFR, y se describe, por ejemplo en la Publicación de Patente Internacional No. WO 01/34574. En vista de las enseñanzas de la presente invención, serán aparentes métodos de preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden tanto un inhibidor de cinasa del EGFR como un segundo agente a partir de las publicaciones citadas anteriormente y de otras referencias conocidas, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18ava edición (1990). Para administración oral de inhibidores de cinasa del EGFR, se combinan tabletas que contienen uno o ambos de los agentes activos con cualquiera de varios excipientes tales como, por ejemplo, celulosa microcristalina, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato dicalcio y glicina, a lo largo con varios desintegrantes tales como almidón (y preferiblemente almidón de maíz, papa o tapioca) , ácido algínico y ciertos complejos de silicatos, junto con aglutinantes de granulación como polivinil pirrolidona, sacarosa, gelatina y acacia. Adicionalmente, agentes de lubricación tales como estearato de magnesio, lauril sulfato de sodio y talco, son a menudo muy útiles para propósitos de tableteado. También se pueden emplear composiciones sólidas de tipo similar como rellenadores en cápsulas de gelatina; materiales preferidos en esta conexión también incluyen azúcar de lactosa o leche, así como polietilen glicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas y/o elixires para administración oral, el inhibidor de cinasa del EGFR puede ser combinado con varios agentes edulcorantes o saborizantes, materia colorante o tintes, y sí, se desea, agentes emulsificantes y/o de suspensión así como, junto con diluyentes tal como agua, etanol, propilen glicol, glicerina y varias combinaciones de los mismos. Para administración parenteral de ya sea uno o ambos de los agentes activos, se pueden emplear soluciones en ya sea aceite de sésamo o cacahuate o en propilen glicol acuoso, así como soluciones acuosas estériles que comprenden el agente activo o una sal del mismo soluble en agua correspondiente. Tales soluciones acuosas estériles son preferiblemente amortiguadas, y también son preferiblemente proporcionadas isotónicas, por ejemplo, con suficiente salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para propósito de inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Las soluciones aceitosas son adecuadas para propósitos de inyección intra-articular, intramuscular y subcutánea. La preparación de todas estas soluciones bajo condiciones estériles es fácilmente lograda por técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Cualquier formulación parenteral seleccionada para administración de inhibidores de cinasa del EGFR proteináceos se debe seleccionar para evitar la desnaturalización y pérdida de actividad biológica del inhibidor. Adicionalmente, es posible para administrador tópico ya sea uno o ambos de los agentes activos, por medio de, por ejemplo, cremas, lociones, jaleas, geles, pastas, ungüentos, pomadas y similares, de conformidad con la práctica farmacéutica estándar. Por ejemplo, se puede preparar una formulación tópica que comprende ya sea un inhibidor de cinasa EGFR o un segundo agentes en aproximadamente 0.1% (p/v) hasta aproximadamente 5% (p/v) de concentración. Para propósitos veterinarios, pueden ser administrados agentes activos separadamente o juntos a animales que usan cualquiera de las formas y por cualquiera de las rutas descritas anteriormente. En una modalidad preferida, el inhibidor de cinasa del EGFR es administrado en la forma de una cápsula, bolo, tableta, dosificador líquido, por inyección o como un implante. Como una alternativa, el inhibidor de cinasa del EGFR puede ser administrado con el alimento animal. El segundo agente es preferiblemente administrado en la forma de un dosificador líquido, por inyección o como un implante. Tales formulaciones son preparadas en una manera convencional de conformidad con prácticas veterinarias estándar. La presente invención además proporciona un kit que comprende un contenedor único que comprende tanto un inhibidor de cinasa del EGFR como un segundo agente. La presente invención además proporciona un kit que comprende un primer contenedor que comprende un inhibidor de cinasa del EGFR y un segundo contenedor que comprende un segundo agente . En una modalidad preferida, los contenedores del kit pueden además incluir un portador farmacéuticamente aceptable. El kit puede además incluir un diluyente estéril, el cual es preferiblemente almacenado en un contenedor adicional separado. El kit puede además incluir un envase insertado, que comprende instrucciones impresas dirigidas al uso del tratamiento combinado como un método para tratar cáncer. La invención también abarca una composición farmacéutica que es comprendida de un inhibidor de cinasa del EGFR y un segundo agente en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede ser usada en los métodos de la invención descritas en este documento para el tratamiento de un paciente con un inhibidor de cinasa EGFR combinado con radiación ionizante. Preferiblemente, la composición es comprendida de un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva no tóxica de un compuesto inhibidor de cinasa del EGFR y un segundo agente (que incluye sales de cada componente del mismo farmacéuticamente aceptables) . Sin embargo, dentro de esta modalidad preferida, la invención abarca una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedad, el uso el cual resulta en la inhibición de crecimiento de células neoplásicas, tumores benignos o malignos, o metástasis, que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva no tóxica de un compuesto inhibidor de cinasa EGFR y un segundo agente (que incluye sales de cada componente del mismo farmacéuticamente aceptables) . El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales preparadas de bases o ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Cuando un compuesto de la presente invención es acídico, su sal correspondiente puede ser convenientemente preparada de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, que incluyen bases inorgánicas y bases orgánicas. Sales derivadas de bases inorgánicas incluyen sales de aluminio, amonio, calcio, cobre (cúpico y cuproso) , férrico, ferroso, litio, magnesio, manganeso (mangánico y manganoso) , potasio, sodio, zinc y similares. Particularmente preferidos son las sales de amonio, calcio, magnesio, potasio y sodio. Sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, así como aminas cíclicas y aminas sustituidas tales como aminas sustituidas que se originan naturalmente y sintetizadas. Otras bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables, de las cuales las sales pueden ser formadas incluyen resinas de intercambio iónico tales como, por ejemplo, arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetano, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolin, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares. Cuando un compuesto de la presente invención es básico, su sal correspondiente puede ser convenientemente preparada de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, que incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos. Tales ácidos incluyen, por ejemplo, ácido acético, bencensulfónico, benzoico, camforsulfónico, cítrico, etansulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metansulfónico, mucínico, nítrico, pamoico, pentoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluensulfónico y similares. Particularmente preferidos son ácidos cítrico, bromhídrico, clorhídrico, maleico, fosfórico, sulfúrico y tartárico. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden un compuesto inhibidor de cinasa del EGFR y un segundo agente (que incluyen sales de cada componente del mismo farmacéuticamente aceptable) como ingrediente activo, un portador farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros agentes o adyuvantes terapéuticos. Otros agentes terapéuticos puede incluir aquellos agentes citotóxico, quimioterapéutico o anti-cancerígenos, o agentes los cuales mejoran los efectos de tales agentes, como se listan anteriormente. Las composiciones incluyen composiciones adecuadas para administración oral, rectal, tópica y parenteral (que incluye subcutánea, intramuscular e intravenosa) , aunque la ruta más adecuada en caso dado dependerá del hospedante particular, y naturaleza, y severidad de las condiciones para las cuales el ingrediente activo es administrado. Las composiciones farmacéuticas pueden ser convenientemente presentadas en forma de dosificaciones unitarias y preparadas por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. En la práctica, los compuestos representados por un compuesto inhibidor de cinasa del EGFR y un segundo agente en combinación (que incluye sales de cada componente del mismo farmacéuticamente aceptables) de esta invención pueden ser combinadas como el ingrediente activo en mezclas íntimas con un portador farmacéutico de conformidad con técnicas de formación de compuestos farmacéuticos convencionales. El portador puede tomar una amplia variedad de formas, dependiendo de la forma de preparación deseada para administración, por ejemplo, oral o parenteral (que incluye intravenosa). Así, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser presentadas como unidades discretas para administración oral tales como cápsulas, sellos o tabletas, cada una contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo. Además, las composiciones pueden ser presentadas como un polvo, como granulos, como una solución, como una suspensión en un líquido acuoso, como un líquido no acuoso, como una emulsión aceite en agua, o como una emulsión líquida agua en aceite. Además, las formas de dosificación comunes se muestran anteriormente, un compuesto inhibidor de cinasa EGFR y un segundo agente en combinación (que incluyen sales de cada componente del mismo farmacéuticamente aceptable) puede también ser administrado por medios de liberación controlada y/o dispositivos de suministro. Las composiciones de combinación pueden ser preparadas por cualquiera de los métodos de farmacia. En general, tales métodos incluyen una etapa de llevar en asociación con los ingredientes activos que constituyen uno o más ingredientes necesarios. En general, las composiciones son preparadas mezclando uniformemente e íntimamente el ingrediente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos . El producto puede entonces ser convenientemente formado en la presentación deseada. Así, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden incluir un portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto inhibidor de cinasa EGFR y un segundo agente en combinación (que incluye sales de cada componente del mismo farmacéuticamente aceptable) . Un compuesto inhibidor de cinasa del EGFR y un segundo agente en combinación (que incluye sales de cada componente del mismo farmacéuticamente aceptable) , puede también ser incluido en las composiciones farmacéuticas en combinación con uno o más de otros compuestos terapéuticamente activos. Otros compuestos terapéuticamente activos pueden incluir aquellos agentes citotóxicos, quimioterapéuticos o anti-cancerígenos, o agentes los cuales mejoran los efectos de tales agentes, como se listan anteriormente. Así, en una modalidad de esta invención, una composición farmacéutica puede comprender un compuesto inhibidor de cinasa del EGFR en combinación con un agente anticancerígeno, en donde el agente anti -cancerígeno es un elemento seleccionado del grupo que consiste de fármacos de agentes de alquilación, antimetabolitos, inhibidores de microtúbulo, podofilotoxinas, antibióticos, nitrosoureas, terapias de hormona, inhibidores de cinasa, activadores de apoptósis de célula del tumor y anti-angiogénico. El portador empleado puede ser, por ejemplo, un líquido, sólido o gas. Ejemplos de portadores sólidos incluyen lactosa, térra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio y ácido esteárico. Ejemplos de portadores líquidos son jarabe de azúcar, aceite de cacahuate, aceite de olivo y agua. Ejemplos de portadores gaseosos incluyen dióxido de carbono y nitrógeno. En la preparación de las composiciones para forma de dosificación oral, puede ser empleado cualquier medio farmacéutico conveniente. Por ejemplo, se pueden usar agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, preservativos, agentes colorantes y similares para formar preparaciones líquidas orales tales como suspensiones, elixires y soluciones; mientras que se pueden usar portadores tales como almidones, azucares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y similares para formar preparaciones sólidas orales tales como polvos, cápsulas y tabletas. Por que son ya sea fácil para administración, tabletas y cápsulas son las unidades de dosificación oral preferidas por lo cual se emplean portadores farmacéuticos sólidos. Opcionalmente, las tabletas pueden ser revestidas por técnicas acuosas y no acuosas estándar. Se puede preparar una tableta que contiene la composición de esta invención por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes o adyuvantes accesorios. Se pueden preparar tabletas comprimidas comprimiendo, en una máquina adecuada, el ingrediente activo en una forma libre de flujo tal como un polvo o granulos, opcionalmente mezclado con un agente aglutinante, lubricante, diluyente inerte, activo en la superficie o dispersante. Se pueden hacer tabletas moldeadas moldeando en una máquina adecuada, una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Cada tableta preferiblemente contiene de aproximadamente 0.05 mg, hasta aproximadamente 5 g del ingrediente activo y cada pomada o cápsula preferiblemente contiene de aproximadamente 0.05 mg hasta aproximadamente 5 g del ingrediente activo. Por ejemplo, una formulación pensada para la administración oral a humanos puede contener de aproximadamente 0.5 mg hasta aproximadamente 5 g del agente activo, compuestos con una cantidad apropiada y conveniente del material portador que puede variar de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 95 por ciento de la composición total. Formas de dosificación unitaria generalmente contendrán entre aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 2 g del ingrediente activo, típicamente 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 800 mg ó 1000 mg. Composiciones farmacéuticas de la presente invención adecuadas para administración oral pueden ser preparadas como soluciones o suspensiones de los compuestos activos en agua. Se puede incluir un tensoactivo adecuado tal como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilen glicoles líquidos y mezclas de los mismos en aceites. Además, se puede incluir un preservativo para prevenir el crecimiento perjudicial de microorganismos. Composiciones farmacéuticas de la presente invención adecuadas para uso inyectable, incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles. Además, las composiciones pueden estar en la forma de polvos estériles para las preparaciones extemporáneas de tales soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma inyectable final puede ser estéril y puede ser efectivamente fluido y fácil capacidad inyectable. Las composiciones farmacéuticas pueden ser estables bajo las condiciones de manufactura y almacenaje; así, preferiblemente deben ser preservadas contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un medio solvente o de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, polietilen glicol y polietilen glicol líquido) , aceites vegetales y mezclas de los mismos adecuadas. Composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden estar en la forma adecuada para demanda tópica tal como, por ejemplo, en aerosol, crema, ungüento, loción, polvo para espolvorear o similares. Además, las composiciones pueden estar en la forma adecuada para uso en dispositivos transdérmicos. Estas formulaciones pueden ser preparadas, utilizando la combinación de un compuesto inhibidor de cinasa del EGFR con un segundo agente (que incluyen sales de cada componente del mismo farmacéuticamente aceptables) de esta invención, vía métodos de procesamiento convencionales. Como un ejemplo, una crema o ungüento se prepara mezclando material hidrofílico y agua, junto con aproximadamente 5% en peso hasta aproximadamente 10% en peso del compuesto, para producir una crema o ungüento que tiene una consistencia deseada. Composiciones farmacéuticas de esta invención pueden estar en una forma adecuada para administración rectal en donde el portador es un sólido. Es preferible que la mezcla forme supositorios de dosificación unitaria. Portadores adecuados incluyen manteca de cacao y otros materiales comúnmente usados en la técnica. Los supositorios pueden ser convenientemente formados primero mezclando la composición con el (los) portador (es) ablandador o de fusión seguido por enfriamiento y formación en moldes. Además a los ingredientes portadores antes mencionados, las formulaciones farmacéuticas descritas anteriormente pueden incluir, como sea apropiado, uno o más ingredientes portadores adicionales tales como diluyentes, amortiguadores, agentes saborizantes, aglutinantes, agentes activos de la superficie, espesantes, lubricantes, preservativos (que incluyen anti-oxidantes) y similares. Además, otros adyuvantes pueden ser incluidos para dar la formulación isotónica con la sangre del receptor proyectado. Las composiciones que contienen un compuesto inhibidor de cinasa del EGFR y un segundo agente en combinación (que incluye sales de cada componente del mismo farmacéuticamente aceptables) pueden también ser preparados en forma concentrada líquida o en polvo. Niveles de dosificación para los compuestos de la combinación de esta invención serán aproximadamente como se describe en este documento, o como se describe en la técnica para estos compuestos. Se entenderá, sin embargo, que los niveles de dosificación específicos para cualquier paciente particular dependerán en una variedad de factores que incluyen la edad, peso corporal, saluda general, sexo, dieta, tiempo de administración, ruta de administración, velocidad de excreción, combinación de fármaco y la severidad de la enfermedad particular sometida a terapia. Esta invención será mejor entendida a partir de los Detalles experimentales como siguen. Sin embargo, un experto en la técnica fácilmente apreciará que los métodos específicos y resultados discutidos son solamente ilustrativos de la invención como se describe más completamente en las reivindicaciones sigues después de esto, y no se consideran en cualquier manera limitados a esto. Detalles Experimentales: Introducción Los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) pertenecientes a la familia ErbB que consiste de cuatro receptores de membrana celular estrechamente relacionados: EGFR (HER o ErbBl) , ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3), y ErbB4 (HER4) (Yarden, Y., et al. (2001) Nat. Rev.

Mol. Cell Biol. 2 (2) :127-137) . Se ha observado expresión incrementada de EGFR en una amplia variedad de tumores, que incluyen cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) y SCC (carcinoma de célula escamosa) de la C y C (cabeza y cuello) (Grandis, J.R. and Tweardy, D.J. (1993) Cáncer Res. 53 (15) :3579-3584; Rusch, V. et al., (1993) Cáncer Res. 53(10 Supl) : 2379-2385) . Se ha mostrado la activación de la trayectoria de transducción de señal del EGFR por mejorar los procesos celulares involucrados en el crecimiento y progreso del tumor, incluyendo la premoción de proliferación, angiogénesis, invasión y metástasis (Yarden, Y., et al. (2001) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2(2) : 127-137) . Se ha controlado la expresión incrementada del EGFR con progreso de la enfermedad y pobres resultados clínicos globales (Maurizi, M., et al. (1996) Br . J. Cáncer 74(8) : 1253-1257; Grandis, J.R., et al. (1998) J. Nati. Cáncer Inst. 90(11) : 824-832) . Además, se ha descrito una correlación positiva entre la expresión del EGFR y resistencia del tumor a quimioterapia y radiación ionizante (Wosikowski, K., et al. (1997) Clin, Cáncer Res. 3(12 Pt 1) : 2405-2414; Ang, K.K., et al. (2002) Cáncer Res 62(24) : 7350-7356) . Un amplio espectro de estudios in vitro e in vivo han demostrado el potencial para el objetivo del EGFR en tratamiento cancerígeno (Moyer, J.D., et al. (1997) Cáncer Res 57(21) : 4838-4848) . El erlotinib (TarcevaTM, OSI-774) es un inhibidor de tirosina cinasa selectivo del EGFR (TKI) que bloquea las trayectorias de transducción de señal implicado en la proliferación de células cancerígenas, supervivencia y otros procesos dependientes de hospedantes que promueven el progreso del cáncer. Inhibe la actividad de autofosforilación del EGFR TK y EGFR purificado en células de tumor intactas, con valores de concentración inhibitoria al 50% de 2 y 20 mmol/ml, respectivamente (Moyer, J.D., et al. (1997) Cáncer Res 57 (21) : 4838-4848) . El erlotinib está bajo investigación en ensayos clínicos para el objetivo de una variedad de sitios de tumor, ambos usados como un agente único, así como en combinación con quimioterapia y/o radiación (Sandler, A. (2003) Oncology 17(11 Supl. 12) :17-22; Hidalgo, M. (2003) Oncology 17(11 Supl. 12) : 11-6; Hidalgo, M. et al. (2003) Semin. Oncol. 30(3 Supl. 7) : 25-33; Hidalgo, M. et al. (2001) J. clin. Oncol. 19 (13 ): 3267-79 ; Soulieres, D. et al. (2004) J. Clin. Incol . 22(l):77-85; Malik, S.N. et al. (2003) Clin. Cáncer Res 9 (7) : 2478-86; Malik, S.N., et al. (2003) Clin. Cáncer Res 9 (7) : 2478-86 ; Grunwald, V., and Hidalgo M. (2003) J. Nati. Cáncer Inst. 95 (12) : 851-67) . Una serie de recientes estudios publicados demostraron fuertes evidencias preclínicas con respecto a la capacidad de inhibición del EGFR para mejorar la actividad anti-tumor de radiación ionizante, aunque el mecanismo es la base, estos procesos no se han caracterizado completamente (Huang, S.M., et al. (1999) Cáncer Res. 59 (8) : 1953-40; Huang, S.M., et al. (2002) Cáncer Res. 62 (15) : 4300-6; Milas, L. et al. (2000) Clin Cáncer Res. 6(2) :701-8; Bianco, C, et al. (2002) Clin Cáncer Res. ( 10 ) : 3250-8 ; Raben, D. et al., (2002) Semin. Oncol. 29(1 Supl. 4) :37-46) . Este estudio examina la capacidad in vitro e in vivo del erlotinib del EGFR TKI para modular la respuesta a radiación en líneas de célula del tumor en humano e injertos heterólogos . Los resultados sugieren fuerte potencial para sinergia mecánica entre respuesta de inhibición y radiación del EGFR a varios niveles, incluyendo cinéticas de ciclo celular, inducción de apoptósis y el objetivo de repoblación celular acelerada. La relación de potencial entre señalización EGFR y reparación de lesión de ADN es fortalecida por nuevos datos con respecto a la inhibición de la expresión Rad51 para erlotinib. Para ganar penetración adicional con respecto a la influencia de la señalización del EGFR en respuesta a radiación, se realizaron estudios de microarreglo para examinar la regulación del gen diferencial. Varias promesas conducen a la señalización del EGFR unida y se identifican la respuesta de radiación que involucra estructura celular reguladora de genes, adhesión, apoptósis y angiogénesis de tumor.

Materiales y Métodos Reactivos Se obtuvo medio de cultivo celular de Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD) . Se obtuvieron anticuerpos primarios contra EGFR y EGFR-1 C19 de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) ; se obtuvo pEGFR-1068 de Cell Signaling Technologies (Beverly, MA) ; se obtuvo PCNA y Rad51 de Neomarker (Freemont, CA) ; y se obtuvo -tubulina de Oncogene Research Products (Cambridge, MA) . Se adquirió el sistema de detección quimioluminiscente ECL+ de Amersham (Arlington Heights, IL) . Todos los otros químicos se adquirieron de Sigma Chemical Co . (St. Louis, MO) . El erlotinib se proporcionó generosamente por OSI Pharmaceuticals (Melville, NY ) . Todos los otros se adquirieron de Sigma Chemicals Co . (St. Louis, MO ) . Líneas Celulares Se obtuvieron las células H226 y DU145 humanas de la American Type Culture Collection (Rockville, MD) y se mantuvieron en medio de cultivo completo que consiste de RPMl (7.4) suplementado con suero de bovino fetal al 10% y penicilina y estreptomicina al 1% cada una. Las líneas celulares UM-SCCl (suelo de montaña) y UM-SCC6 (base de la lengua) se proporcionaron por Dr . Thomas E. Carey (Universidad de Michigan) y se mantuvieron en medio de cultivo completo que consiste de DMEM (7.4) suplementado con suero de bovino fetal al 10%, hidrocortisona al 1%, y penicilina y estreptomicina al 1% cada una. Análisis del Ciclo Celular. Las células se colectaron después de 72 horas de exposición a erlotinib, 24 horas de exposición a radiación 6 Gy o en combinación. Las células se colectaron por tripsinización, se lavaron con PBS, después se fijaron en etanol al 95% y se almacenaron a 42C por hasta 7 días antes del análisis de ADN. Después se removieron de etanol por centrifugación, las células después se incubaron con fosfato-ácido cítrico amortiguado [0.2 M de Na2HP04 (pH 7.8) y 4 mM de ácido cítrico] a temperatura ambiente por 45 minutos. Después de la centrifugación, las células se tiñeron con una solución que contiene 33 µg/ml de Pl (yoduro de propidio), 0.13 mg/ml de RNase A, 10 mM de EDTA y Tritón X-100 al 0.5% a 42C por 24 horas. Se analizaron los núcleos teñidos para fluorescencia ADN-PI usando un citómetro de flujo Becton Dickinson FACScan. Se analizaron las distribuciones de ADN resultantes por Modfit (Verity Sofware House, Inc., Topsham, ME) para la proporción de células en fases sub-GO, Gl, S y G2-M del ciclo celular. Apoptósis por Fluoresceína Etiquetada con Inhibidores de Caspasa . Se sembraron células en cajas de petri de 100 mm a una densidad de 6 x 105 células por placa y en tratamiento, se colectaron por tripsinización, se centrifugaron y la pelotilla celular se suspendió nuevamente a una concentración final de 2 x 106 células/ml. Se analizó la actividad de caspasa por espectroscopia fluorescente de conformidad con el protocolo del fabricante (Chemicon International) . Brevemente, 300 µl de células se incubaron con lx de Fluoresceína etiquetada con inhibidor FAM-VAD-FMK de pan caspasa (Ekert, P.G., et al. (1999) Cell Death Differ. 6 (11) : 1081-6) a 372C por 1 hora en una atmósfera humidificada de C02 al 5%. Las células después se lavaron dos veces con amortiguador, finalmente se suspendieron nuevamente en 320 µl de PBS. Una alícuota de 100 µl de la suspensión celular se transfirió a una placa de 96 cavidades negra por triplicado. Se analizó la fluorescencia en un lector de placa de fluorescencia SpectraMax a 550 nM de excitación y 600 nM de emisión de longitud de onda. -Análisis de InmunoBlot. Siguiendo el tratamiento, las células se sometieron a lisis con amortiguador RIPA y se sonicaron en cóctel inhibidor de proteinasa completo (Roche) y ortovanadato de sodio. Quince µg de extractos de proteína se mezclaron con amortiguador muestra SDS y se electroforizaron en un gel SDS-poliacrilamida al 10% bajo condiciones de reducción. Las proteínas separadas se transfirieron en membranas de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . La membrana se incubó por 1 hora en amortiguador de bloqueo (salina amortiguada Tris con Tween al 0.1% (TBS-T) y leche seca sin grasa al 5%) . Las membranas después se incubaron con anticuerpos primarios específicos. Después de lavado por tres veces con el amortiguador TBS-T, la membrana se incubó con anticuerpo secundario como peroxidasa de rábano picante (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N J ) a una dilución 1:5000 por 1 hora a temperatura ambiente. Las señales se visualizaron con el sistema de detección ECL+ y autoradiografía. Para western Blots de a- tubulina, las membranas de sonda de anticuerpo se retiraron con amortiguador Re-Probe Western (Geo-tech, St. Louis, MO) y se bloquearon en salina amortiguada Tris con Tween al 0.1% (TBS-T) con leche seca sin grasa al 5% y se incubaron con anticuerpo anti-a-tubulina de conejo . Supervivencia a la radiación. Se definió la supervivencia después de exposición a radiación como la capacidad de las células a mantener su capacidad clonigénica y para formar colonias. Brevemente, después de la exposición a radiación, las células se tripsini zaron, se contaron y se sembraron para formación de colonia en cajas de petri de 35 mm a 50-5000 células/caja. Después de intervalos de incubación de 14-21 días, las colonias se tiñeron con violeta cristal y manualmente se cuantificaron. Las colonias que consisten de 50 células o más, se registraron y 5 cajas de replicado que contienen 10-150 colonias/caja se cuantificaron para cada tratamiento. Los experimentos se realizaron en duplicado. Ensayo para Crecimiento de Tumor en Ratones Desnudos Atímicos . Se realizaron estudios in vivo como previamente se describe (Huang, S.M., et al. and Harari PM. (2000) Clin. Cáncer Res. (6) : 2166-74) . Brevemente, las células UM-SCCl y H226 (~1 x 106) se inyectaron, c.s. en el área de flanqueo de ratones desnudos atímicos en el día 0. Experimentos animales incluyen cuatro grupos de tratamiento, solo radiación (2 Gy por fracción), erlotinib solo (0.8 mg/día) y radiación en combinación con erlotinib. El erlotinib se administró de forma oral por alimentación forzada diariamente por 3 semanas. Se suministró el tratamiento de radiación dos veces en 3 semanas usando gigas de ratón habitual, designados por exponer únicamente el lecho de tumor por radiación. Determinación Inmunohistoquímica de PCNA y pEGFR. Se detectaron la expresión del EGFR proliferativa y fosforilada en secciones histológicas de injertos heterólogos H226 como previamente se describe (Huang, S.M., y Hari PM. (2000) Clin. Cáncer Res. (6) : 2166-74) . Brevemente, se fijaron los especímenes de tumor cortados en formalina amortiguada neutral al 10%. Las secciones se secaron, desparafinizaron y rehidrataron. Después se apagó la actividad de peroxidasa endógena y se bloquearon sitios de enlace no específicos, se incubaron los portaobjetos a 42C durante la noche con dilución 1:100 del anticuerpo primario dirigido contra PCNA y p-EGFR seguido por 30 minutos de incubación en anticuerpo secundario anti-ratón de cabra biotinilada. Los portaobjetos después se incubaron con peroxidasa de estreptavidina y se visualizaron usando el cromógeno DAB (Lab Vision Corp., Freemont, CA) . Microarreglo de ADN. Se hizo el análisis de microarreglo de ADN de la expresión del gen como se describe por los Brown and Derisi Labs (disponible en su sitio de red protocolo de microarreglo, actualmente en www.microarrays.org/protocols.html). Los clones de ADNc que verificaron la secuencia en el microarreglo de ADNc humano están disponibles de Research Genetics (www.resgen.com). Los productos RCP purificados, generados usan los insertos del clon como plantilla, se mancharon en portaobjetos de microscopio revestidos de poli-L-lisina usando un arreglo robótico Ommigrid (GeneMachines, Ca) equipado con broches tipo pluma (Majer Scientific, Az) .

Las células expuestas a radiación ± 24 horas de pretratamiento a erlotinib se solubilizaron y se homogenizaron en Trizol (Invitrogen) y se aisló el ARN total de conformidad con las instrucciones del fabricante e íntegramente se probaron. Una vez aislados, se usó el ARNm como una plantilla para generación de ADNc usando transcriptasa inversa (TI) . La inclusión de amino alil-dUTP en la reacción TI seguida por etiquetación fluorescente subsecuente de ADNc usando tintes de éster NHS monofuncionales (como se describe en www.microarrays.org/protocols.html) . En cada experimento, se prepararon sondas de ADNc fluorescente a partir de una muestra de ARNm experimental ( Cy5 -etiquetado ) y una muestra de ARNm control ( Cy3 -etiquetado ) aislado a partir de células sin tratar. La muestra de ADNc experimental se acopló a Cy5 NHS-éster monofuncional y la muestra ADNc de referencia a un Cy3 NHS-éster (Amersham) . Las sondas etiquetadas después se hibridizaron a microarreglos de ADNc humanos 20K. Las imágenes fluorescentes de microarreglos hibridizados se obtuvieron usando un explorador de microarreglo GenePix 4000A (www.axon.com, Axon Instruments, Ca) . La relación Cy5/Cy3 se colectó y las series de datos para cada experimento se expusieron para genes que son diferencialmente expresados en el fármaco tratado contra líneas celulares control (relacines mayores que 1.5 o menores que 0.75. Las series de datos de análisis individuales después se visualizaron usando el Programa TreeView. Los genes identificados son subsecuentemente puestos en categorías usando la red a base del programa ontológico del gen FatiGO (Al-Shahrour, F., et al. (2004) Bioinformatics 20:578-580: detalles también en el sitio de red en http://fatigo.bioinfo.cnio.es/) . RCP en Tiempo Real cuantitativo. Para además validar el microarreglo encontrado, se realizó RCP en tiempo real cuantitativo (RCPC) usando el tinte verde SYBR como se describe previamente (Kleer, C.G., et al. (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100 (20) : 11606-11611) . Brevemente, se aisló 1 µg de ARN total de cada muestra se trascribió de forma inversa en la primera hebra de ADNc. Se mostraron niveles de umbral para cada experimento durante la fase exponencial de la reacción RCP usando el sofware SDS v 1.7 (Applied Biosystems), y se calculó la cantidad de ADN en cada muestra interpolando su valor Ct contra una curva estándar de valores Ct obtenidos de ADNc serialmente diluido de una mezcla de todas las muestras usando Microsoft Excel . Todas las curvas estándar tienen valores R2 = 99 sobre tres ordenes de magnitudes. La cantidad calculada del gen objetivo para cada muestra después se dividió por la cantidad calculada promedio de los genes de mantenimiento deshidrogenasa gliceril-3 fosfato (GAPD) y sintasa hidroximetilbilano (HMBS) correspondiente a cada muestra para dar una expresión relativa del gen objetivo para cada muestra. Todos los cebadores de oligonucleótido se analizaron por Tecnologías de ADN Integradas. Los cebadores para HMBS y GAPD son como se describen (Vandesompele, J., et al. (2002) Genome Biol.; 3(7): RESEARCH0034) . Cebadores para oligonucleótido para CXCLl, Il-lß, y Egr-1 están disponibles en la demanda. Todos los experimentos se realizaron por duplicado . Estadísticas Los efectos de erlotinib y/o radiación o inhibición del crecimiento en estudios de injerto heterólogos se valoraron por análisis de regresión múltiples usando el procedimiento PROC GLM en SAS (Versión 8, SAS Institute, Inc., Cary NC, 1999) . Se evaluaron estudios de combinación que determinan inducción de apoptósis usando la prueba de Student con el valor P resultante que representa a dos pruebas laterales de significancia estadística. Resultados Cinéticas de ciclo celular. Se evaluó la capacidad de erlotinib para inhibir la progresión del ciclo celular y para modular la interacción con radiación vía citometría de flujo. El efecto de erlotinib en la distribución de la fase del ciclo celular para las líneas celulares UM-SCC6 y H226 se resume en la Fig. 1. El erlotinib y la radiación ionizante inducen acumulación de células en Gl y G2 , respectivamente, y reducen el número de células en la fase S. Cuando se combina con radiación, erlotinib promueve una reducción adicional en la fracción de fase S. Este impacto de erlotinib en la distribución de fase del ciclo celular puede contribuir a mejorar la radiosensibilidad como se describe abajo. El erlotinib mejora la apoptósis inducida por radiación. Además se evaluó si los mecanismos de interacción entre erlotinib y radiación involucran la eliminación celular mediada por apoptósis en líneas celulares HNSCC y NSCLC. Como se muestra en la Fig. 2a, erlotinib (1 µM) y solo radiación (6 Gy) induce un incremento en apoptósis del 10-25% y 25-50%, respectivamente, como se determinó por actividad de caspasa. Sin embargo, el tratamiento combinado con radiación y erlotinib resultó en un incremento aditivo en apoptósis en células H226 y UM-SCCl, y un incremento supra-aditivo en inducción de apoptósis (p<.05) en células UM-SCC6. El mejoramiento de apoptósis inducida por radiación por erlotinib además se conformó usando análisis de manchado western para determinar el desdoblamiento del sustrato de eliminación, polimerasa poli (ADP-ribosa) (PARP). Como se muestra en la Fig 2b, 10 y 24 horas después del tratamiento, erlotinib y radiación solo inducen desdoblamiento PARP moderado. Además el incremento en desdoblamiento PARP se demostró cuando erlotinib se combinó con radiación en células UM-SCCl . Este mejoramiento en el desdoblamiento PARP con la combinación erlotinib/radiación es aún más pronunciado en las células UM-SCC6 (datos no mostrados) . Erlotinib inhibe la activación del EGFR inducida por radiación. El tratamiento con radiación ionizante puede inducir la trayectoria proliferativa del EGFR por la liberación de TGF-a y activación de tirosina cinasa del EGFR. Este efecto se ha propuesto por representar un mecanismo central para repoblación celular acelerada durante el tratamiento de radiación ( Schmidt-Ullrich , R.K., et al. (1997) Oncogene 15 ( 10 ) : : 1191 - 1197 ) . Como se describe en la fig. 3, incrementa la autofosforilación del EGFR se confirmó después de la exposición a radiación (2 y 10 Gy) en tres distintas líneas celulares (C y C, pulmón, próstata) . Esta activación inducida por radiación de fosforilación del EGFR es profundamente inhibida por exposición a pretratamiento de células de tumor a 1 µM de erlotinib por 24 horas en cultivo.

Erlotinib disminuye la expresión de RAD51 inducida por radiación. La proteína de reparación Rad51 representa un componente central de recombinación homologa durante la reparación del ADN (Chen, G., et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(18): 12748- 12752; Yuan, Z.M., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 (7) :3799-3802) . La inhibición de la expresión de Rad51 ha sido mostrada por correlacionarse con sensibilidad de radiación incrementada (Ohnishi, T., et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 245 (2) : 319-324) . Para examinar el efecto de erlotinib en la expresión de Rad51 después de la expresión a radiación, se expusieron células H226 y UM-SCC6 a radiación +_ pretratamiento con erlotinib. Como se representa en la Figura 4, ambas líneas celulares demostraron poca o ninguna expresión Rad51 de línea base detectable. Un incremento en la expresión de Rad51 se demostró después de la exposición a radiación en una manera dependiente del tiempo (10 y 24 horas) . Este incremento en la expresión de Rad51 se atenuó significantemente cuando las células se pretrataron con 1 µM de erlotinib por 24 horas. Erlotinib incrementa la radiosensibilidad Para examinar el potencial de utilidad de combinar erlotinib con terapia de radiación en líneas de células de carcinoma humano, se condujeron experimentos para evaluar la influencia de erlotinib en supervivencia clonogénica. La figura 5 representa curvas de supervivencia clonogénica para líneas de células UM-SCCl y H226 expuestas a erlotinib antes de la exposición a radiación . Estos resultados demuestran que el tratamiento con erlotinib antes de la radiación, induce radiosensibilización modesta pero consistente , como se manifiesta por una reducción en la supervivencia clonogénica comparada con controles en UM-SCCl a 3 , 6 y 9 Gy (p< . 01 ) y en H226 a 6 y 9 Gy (p<0 . 5 ) . El erlotinib aumenta la respuesta tumoral in vivo de xenógrafos NSCLC a SCC a radiación. Se inocularon líneas de células humanas NSCLC (H226) y SCC (UM-SCC6) , s . c . en ratones atímicos hembra y se dejaron crecer por 10 días antes de la aleatorización en cuatro grupos . Diez días fue el intervalo de tiempo requerido para que los xenógrafos alcanzaran -20 mm3 en volumen. Como se muestra en la Figura 6, el tratamiento con radiación sola o erlotinib solo, produce modesta inhibición de crecimiento del tumor en xenógrafos tanto H226 como UM-SCC6. Cuando se combinan con radiación, el erlotinib mejora el perfil de inhibición de crecimiento del tumor durante el periodo de observación de 55 días . Los análisis estadísticos confirman esta inhibición del crecimiento del tumor por ser sinergísticos en los xenógrafos H226 y aditivos en los UM-SCC6 (p<0 . 05 ) . Expresión in vivo de PCNA y p-EGFR . La expresión de marcadores de proliferación de tumor ( PCNA) y EGFR activado (p-EGFR) , se examinó en xenógrafos de tumor H226. El teñido inmunohistoquímico con PCNA, demostró que el número de células de proliferación es más largo en el grupo de control, intermedio en los grupos que reciben tratamiento de modalidad única con ya sea radiación o erlotinib, y más pequeño en el grupo de tratamiento combinado. El inmunoteñido para p-EGFR, demostró actividad similar en los grupos de control y tratados con radiación, con inhibición marcada en el grupo combinado de erlotinib/radiación. (Figura 7) Tomados en conjunto, estos resultados complementan los datos in vitro, los cuales demuestran la capacidad de erlotinib para modular la proliferación celular, apoptósis y activación de señalización del EGFR como se muestra en las Figuras 1-3. Análisis de microarreglo Para identificar un grupo de genes que se enlazan a la señalización del EGFR con respuesta de radiación, se usó un microarreglo de ADNc de 20,000 elementos (20K) que consiste de genes nombrados, conocidos, así como también numerosos extremos de secuencia expresados (ESTs) (Dhanasekaran, S. M. , et al. (2001) Nature 412 ( 6849) : 822-816). Se realizó experimentación inicial en células UM-SCC6 para determinar la relación temporal de la expresión del gen después de la exposición a radiación. Estos estudios preliminares (datos no mostrados) , identifican el grupo más grande de genes diferencialmente regulados por emerger aproximadamente 24 horas después de la exposición a radiación. Subsecuentemente, se realizaron estudios de arreglo en células UM-SCC6 24 horas después de la exposición a radiación +_ pretratamiento con erlotinib. Se identificaron diversas series de genes diferencialmente regulados (relaciones mayores de 2 o menos de 0.5), que involucran 14 clases funcionales (Figura 8) . Se validaron estos hallazgos de microarreglo de ADN para un grupo seleccionado de genes, los cuales pueden influenciar la capacidad de radiosensibi li zación de erlotinib, que incluyen Egr-1, CXCLl, e IL-lß (Figura 9) . Estos estudios de validación, confirman un incremento inducido por radiación potente de expresión de Egr-1, CXCLl e IL-lß, la cual se inhibió por pretratamiento de exposición a erlotinib. Discusión Este estudio caracteriza la capacidad del erlotinib de TKI del EGFR para modular la respuesta a radiación en líneas de células de carcinoma humano y xenógrafos. Estos resultados incrementan los datos preclínicos que surgen, demostrando una interacción anti-tumoral favorable entre los agentes inhibidores del EGFR y radiación. La significancia potencial de esta interacción favorable, recientemente realizó una importante clínica principal con resultados de un ensayo Fase III en pacientes con cáncer de CyC avanzado. Este estudio internacional demostró un doblamiento cercano de supervivencia mediana para pacientes tratados con el inhibidor del EGFR cetuximab, sobre aquellos logrados con radiación sola (Bonner, J.A., et al. (2004) J. Clin. Oncol., 22: (14S) (Julio 15 Suplemento)) . Hubo un mejoramiento estadísticamente significante (posición log p = 0.02) en control de enfermedad locoregional (8% a 2 años) y supervivencia total (13% a 3 años) favoreciendo el brazo de cetuximab. Estos resultados pivotantes, estimularán nuevos ensayos clínicos que incorporan inhibidores del EGFR en combinación con radiación, para una variedad de tipos de cáncer en los cuales, la radiación desempeña un papel de tratamiento central. Maximizando las ganancias clínicas potenciales en el futuro, los ensayos pueden beneficiar de un entendimiento mejorado de mecanismos específicos fundamental a estas interacciones favorables de EGFR/radiación . En paralelo con varios reportes que se refieren al anticuerpo monoclonal del EGFR cetuximab (ErbituxTM, C225) y el geftinib TKI (IressaTM, ZD1839) , la magnitud de radiosensibi li zación con erlotinib, parece magnificada en el establecimiento in vivo (Huang, S.M., et al. (1999) Cáncer Res. 59(8) : 1935-40; Huang, S.M., and Harari PM . (2000) Clin. Cáncer Res. (6) :2166-74) . Los datos actuales sugieren explicaciones potenciales para este efecto mejorado al nivel de cinéticas del ciclo celular, repoblación celular acelerada, y reparación de daño de ADN. Además, los estudios de microarreglo de ADN preliminar, sugieren varios factores angiogénicos, citocinas, proteínas estructurales y de adhesión, que son modulados por erlotinib, y pueden desempeñar un papel en la respuesta a radiación in vivo mejorada. Reportes previos han sugerido la capacidad de la inhibición del EGFR para interferir con la actividad o localización del ADN-PK, el cual desempeña una función central en la reparación de rompimientos de doble hebra del ADN (DSB) (Bandyopadhyay, D., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 ( 3 ) : 1568-1573 ) . El estudio actual además, soporta una relación entre la señalización del EGFR y el daño /reparación del ADN, enlazando erlotinib con la proteína de reparación del daño de ADN, Rad51. La Rad51 representa una proteína clave en la recombinación homologa durante la reparación de DSB del ADN (Chen, G., et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (18) : 12748-12752; Yuan, Z.M., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 ( 7 ) : 3799 -3802 ) . La atenuación de la expresión del Rad51 se ha mostrado por mejorar la sensibilidad a radiación (Ohnishi, T., et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 245 ( 2 ) : 319 - 324 ) y la sobre expresión de Rad51 por células tumorales, sugiere que este representa un objetivo molecular pobre para modulación de radiosensibilidad tumoral (Raderschall , E., et al. (2002) Cáncer Res. 62(1) :219- 225) . Los datos de expresión de proteína en la Figura 4, demuestran la capacidad de erlotinib para atenuar la expresión inducida por radiación de Rad51. Aunque, se han identificado nuevas hallazgos, interacciones similares con otras trayectorias de señalización de tirosina cinasa, que incluyen bcr-abl (Yuan, Z.M., et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 (7) : 3799-3802 ; Russell J.S., et al. (2003) Cáncer Res. 63 (21 ) : 7377-7383 ) y factor de crecimiento similar a la insulina (Trojanek J., et al. (2003) Mol. Cell. Biol. ( 21 ) : 7510-7524 ) . La sensibilidad de fase del ciclo celular diferencia a los efectos citotóxicos de radiación, está bien establecida, con la fase S más resistente y G2 /M más sensible a radiación (Hall EJ . (2000) Radiobiology For the Radiologist. 5 ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins ) . En el estudio actual, la exposición independiente de células a erlotinib o radiación, provoca una detención de fase Gl y G2/M característico, respectivamente. La exposición a erlotinib sola, reduce el porcentaje de células en la fracción de fase S resistente a radiación. Cuando se combina con radiación de fracción única, el erlotinib precipita una disminución adicional en la fracción de fase S. Los tratamientos de radiación subsecuente podrían por lo tanto, esperarse encuentre un porcentaje superior de células en fases de radiación más sensible del ciclo celular. Esta integración de cinética del ciclo celular, podría explicar la respuesta a radiación mejorada demostrada usando modelos in vivo, los cuales usan regímenes de radiación fraccionada. Las terapias citotóxicas pueden activar la supervivencia de clonogenes de tumor para dividirse más rápidamente que antes, un fenómeno llamado repoblación acelerada. Esta proliferación de células tumorales durante un curso de tratamiento de radiación ha sido bien definida como un factor que impacta adversamente, la respuesta tumoral total y control local último (Fowler J.F., et al. (1992) Int.

J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 23 ( 2 ) : 457 -467 ) . Un mecanismo propuesto para repoblación celular acelerada involucra la capacidad de radiación ionizante para activar el EGFR, el cual está ligado a varios componentes críticos de señalización mitogénica y proliferativa ( Schmidt-Ullrich, R.K., et al. (1997) Oncogene 15(10) : 1191-1197) . En el presente estudio, se demuestra la capacidad de erlotinib para inhibir la activación inducida por radiación de la señalización del EGFR (Figura 3) , con ello, proporcionando un método potencial para combatir la repoblación acelerada durante la radiación fraccionada. Para examinar además las interacciones potenciales de EGFR/radiación, se realizaron análisis de microarreglo preliminar de células de tumor humano. Estos estudios identifican >100 genes que son diferencialmente expresados (es decir, genes que son significantemente regulados ascendentemente o descendentemente) , después de la radiación y subsecuentemente normalizados o invertidos por pretratamiento con erlotinib. Los genes identificados representan varias clases funcionales distintas involucradas en diversos procesos oncogénicos que incluyen, estructura celular, inflamación, adhesión, apoptósis, y angiogénesis de tumor. Se seleccionaron genes particulares los cuales pueden proporcionar una idea con respecto a la sinergia mecanística entre la señalización del EGFR y la respuesta a radiación que incluye: Egr-1 y las quimiocinas IL-lß y CXCLl, las cuales han sido ligadas a la activación del NF-KB. El Egr-1 codifica un factor de transcripción de dedo de zinc, el cual puede ser inducido por una variedad de estímulos, que incluyen, factores de crecimiento, citocinas y mitógenos. Se ha reportado una serie de agentes que dañan el ADN por inducir sobre regulación significante de Egr-1 (Quiñones A., et al. (2003) Life Sci. 72 ( 26 ) : 2975 -2992 ) . La inhibición de la expresión del Egr-1 se ha demostrado por inhibir la replicación celular endotelial vascular y migración, formación del microtúbulo, expresión del VEGF y angiogénesis de tumor (Lucerna M., et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(13) : 11433-11440. Epub 2002 Nov 8; Fahmy R.G., et al. (2003) Nat. Med. 9(8) : 1026-1032) . Adicionalmente, la expresión del Egr-1 ha sido demostrada por incrementar la expresión del EGFR durante hipoxia (Nishi H, et al. (2002) Cáncer Res. 62 ( 3 ) : 827 - 834 ) . Este estudio demuestra la capacidad del erlotinib para atenuar la expresión del Egr-1 después de la exposición a radiación. Se inducen varias interleucinas y quimiocinas y liberan después de la exposición a radiación ionizante. Estas moléculas pueden participar ya sea directamente o indirectamente en respuesta a radiación subsecuente (Fornace AJ . , et al. (2001) Radiation Therapy. In: Straus M., editor. The Molecular Basis of Cáncer. 2nd ed . Philadelphia: W.B. Saunders Company; p. 423-465) . Se identificaron dos citocinas, IL-lß y XCXLl , las cuales pueden contribuir al crecimiento de tumor y supervivencia durante la radiación y pueden reforzar un enlace entre la señalización del EGFR y el sistema de señalización de pro- supervivencia , factor-kapa nuclear B (NF-KB) (Kapoor G.S., et al. (2004) Mol. Cell. Biol. 24(2) : 823-36; Biswas, D.K., et al. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 97(15) : 8542-7; Habib, A. A., et al. (2001) J Biol. Chem. 276 (12) : 8865-8874. Epub Diciembre 14 de 2000) . Varios reportes indican que el IL-lß inducido por radiación, puede proporcionar radioprotección (Fornace A. J., et al. (2001) Radiation Therapy. In : Straus M., editor. The Molecular Basis of Cáncer. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company; p. 423-465), así como también estimular la proliferación de células tumorales, angiogénesis e invasión (Giavazzi, R., et al. (1990) Cáncer Res. 50 ( 15 ) : 4771-4775 ; Song, X, et al. (2003) J. Immunol . 171 ( 12 ) : 6448 - 6456 ; Dinarello, CA . (1996) Blood 87 ( 6 ) : 2095-2147 ) . El IL-lß, ejerce muchos efectos biológicos activando el factor de transcripción de NF-KB, el cual en cambio, regula la expresión de una variedad de procesos inflamatorios y oncogénicos (Jung, YJ . , et al. (2003) FASEB J. ( 14) : 2115-2117. Epub Septiembre 4 de 2003) . La capacidad de erlotinib para atenuar la transcripción inducida por radiación de Il-lß, puede por lo tanto, disminuir la actividad de enlace al ADN de NF-KB. Este enlace entre la señalización de ErbB y actividad de NF-KB, ha sido reportado recientemente, usando los inhibidores de ErbB trastuzumab y cetuximab (Guo, G., et al. (2004) Oncogene 23(2) :535-545; Sclabas, G.M., et al. (2003) J. Gas trointes t . Surg. (1) : 37-43) . El CXL1 de quimiocina CXC, previamente designado como proteína relacionada con actividad/crecimiento estimulado del crecimiento de melanoma (MGSA/GRO) , ha sido caracterizado recientemente como una de las quimiocinas involucradas en la respuesta a la radiación (Van der Meeren, A., et al. (2003) Radiat. Res. 160(6) :637- 646) . El CXCLl ha sido mostrado por desempeñar un papel importante en la tumorigénesis y angiogénesis y su sobre expresión ha sido asociada con el progreso del tumor (Dhawan, P., and Richmond A. (2002) J. Biol. Chem 277 ( 10 ) : 7920- 2928. Epub 2001 Dec 28) . La expresión incrementada de CXCLl ha sido atribuida a la activación constitutiva de NF-KB a través de la señalización de cinasa MAP (Dhawan, P., and Richmond A. (2002) J. Biol. Chem 277 ( 10 ) : 7920 -2928. Epub 2001 Dec 28) . Por lo tanto, la capacidad de erlotinib para inhibir la señalización de cinasa MAP e influenciar la activación de NF-KB, puede reflejar una interacción mecanística de enlace a la trayectoria de señalización con la expresión de CXCLl. Conclusiones Estos resultados preclínicos, identifican los mecanismos celulares potenciales por medio de los cuales, la inhibición de señalización del EGFR puede mejorar la respuesta a radiación tumoral. El primer ensayo clínico Fase III para examinar la recombinación del inhibidor del EGFR más radiación (cáncer de CyC ) , indica resultado favorable con supervivencia incrementada del paciente sobre aquellos logrados con radiación sola (Bonner, J.A., et al. (2004) J. Clin. Oncol., 22: (14S) (Julio 15 Suplemento) ) . El ensayo clínico Fase III recientemente reportado que confirma la extensión de supervivencia en pacientes NSCLC refractarios que reciben erlotinib (Shepherd, F.A., et al. (2004) J. Clin. Oncol., 22: (14S) (Julio 15 Suplemento)), también sugiere oportunidades para explorar procedimientos de combinación en cáncer de pulmón, en donde la radiación desempeña un papel de tratamiento central. Los esfuerzos sistemáticos por definir los mecanismos moleculares y celulares específicos para esta interacción favorable de inhibición de señalización del EGFR con radiación, deben auxiliar en el diseño de ensayos clínicos futuros. Incorporación por Referencia Todas las patentes, solicitudes de patentes publicadas y otras referencias descritas en este documento, están por este medio, expresamente incorporadas aquí por referencia. Equivalentes Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de valorar, no usando más que la experimentación de rutina, muchas equivalentes a modalidades de la invención descrita específicamente en este documento. Tales equivalentes están propuestas para ser abarcadas dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Uso de un inhibidor de cinasa del EGFR y radiación ionizante, para la manufactura de un medicamento para tratar tumores o metástasis de tumor.
2. 2. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en el cual, se usa una cantidad efectiva de un inhibidor de cinasa del EGFR y una cantidad efectiva de radiación ionizante .
3. 3. Uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 , en donde el medicamento es para cáncer.
4. 4. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde los tumores o metástasis de tumor a ser tratados, se seleccionan de cáncer de pulmón, cáncer colorectal, NSCLC, cáncer de pulmón de células bronquioalviolares, cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo, melanoma intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cerviz, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, Enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido suave, cáncer de uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, leucemia aguda o crónica, linfomas linfocíticos, neoplasmas del sistema nervioso central, tumores del eje espinal, glioma troncal cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitoma, schwanoma, ependimona, meduloblastoma, meningioma, carcinoma de células escamosas y tumores de adenoma pituitario o metástasis de tumor.
5. 5. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde los tumores o metástasis de tumores son refractarios .
6. 6. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los tumores o metástasis de tumores a ser tratados, son tumores de cáncer de pulmón o metástasis de tumor.
7. 7. Uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde el cáncer de pulmón es NSCLC .
8. 8. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los tumores o metástasis de tumor a ser tratados, son tumores de cáncer pancreático o metástasis de tumor.
9. 9. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los tumores o metástasis de tumor a ser tratados, son tumores de cáncer de cabeza y cuello o metástasis de tumor.
10. 10. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el inhibidor de cinasa del EGFR comprende erlotinib.
11. 11. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que adicionalmente comprende administrar uno o más de otros agentes anti-cancerígenos.
12. 12. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde los otros agentes anticancerígenos se seleccionan de un agente alquilante, ciciofosfamida, clorambucil, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, busulfano, melfalano, carmustina, estreptozotocina, trietilenmelamina, mitomicina C, y anti-metabolito, metotrexato, etopósido, 6-mercaptopurina, 6-tiocguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, capecitabina, gencitabina, dacarbazina, un antibiótico, actinomicina D, doxorubicina, daunorubicina, bleomicina, mitramicina, un alcaloide, vinblastina, paclitaxel, docetaxel, vinorelbina, un glucocorticoide, dexametasona, un corticoesteroide, prednisona, inhibidores de la enzima del nucleósido, hidroxiurea, una enzima de depleción de aminoácido, asparaginasa, topotecano, irinotecano, leucovorina, y un derivado de ácido fólico.
13. 13. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicho otro agente anti-cancerígeno es un elemento seleccionado del grupo que consiste de fármacos de alquilación, antimetabolitos, inhibidores del microtúbulo, podofilotoxinas, antibióticos, nitrosoureas, terapias hormonales, inhibidores de cinasa, activadores de apoptósis de célula tumoral y agentes antiangiogénicos.
14. 14. Inhibidor de cinasa del EGFR y radiación ionizante, caracterizado porque es para uso como un medicamento en particular, para uso en cáncer.
15. 15. Erlotinib y radiación ionizante caracterizados porque son para uso como medicamento, en particular, para uso en cáncer.