MX2007003314A - Combinaciones terapeuticas que comprenden inhibidor de poli(adp-ribosa)polimerasas. - Google Patents

Combinaciones terapeuticas que comprenden inhibidor de poli(adp-ribosa)polimerasas.

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Heidie Marie Steinfeldt
Theodore James Boritzki
Alan Hilary Calvert
Nicola Jane Curtin
Mohamed Raza Dewji
Zdenek Hostomsky
Christopher Jones
Rhonda Kaufman
Karen J Klamerus
Elizabeth Ruth Plummer
Steven David Reichn
Ian J Stratford
Hum David Thomas
Kaye Janine Williams
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Abstract

Esta invencion se refiere en lineas generales al uso de 8-fluoro-2-(4-[(metilamino)metil]fenil(-1,3,4,5-tetrahidro-6H- azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona representado por la formula 1 como quimiosensibilizador que potencia la eficacia de farmacos citotoxicos o radioterapia. (Ver Formula 1), esta invencion proporciona combinaciones farmaceuticas de 8-fluoro-2-(4-[( metilamino)metil]fenil(-1,3,4,5-tetrahidro-6H-azepino[5,4,3-cd] indol-6-ona, o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma y al menos un agente terapeutico adicional, kits que contiene dichas combinaciones y procedimientos para usar dichas combinaciones para tratar sujetos que padecen de enfermedades tales como cancer.

Description

COMBINACIONES TERAPÉUTICAS QUE COMPRENDEN INHIBIDOR DE POLKADP-RIBOSAIPOLIMERASAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EEUU N° 60/612,458 presentada el 22 de septiembre de 2004, y la Solicitud Provisional de EEUU N° 60/683,006 presentada el 19 de mayo de 2005, los contenidos de las cuales se incorporan por la presente como referencia en su totalidad.
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere en líneas generales al uso de 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]fenil}-1 ,3,4,5-tetrahidro-6/-/-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona como un quimiosensibilizador que mejora la eficacia de fármacos citotóxicos o radioterapia. Esta invención proporciona combinaciones farmacéuticas de 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]fenil}-1 ,3,4,5-tetrahidro-6/-/-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos un agente terapéutico adicional, kits que contienen dichas combinaciones y procedimientos para usar dichas combinaciones para tratar a sujetos que padecen enfermedades tales como cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El compuesto 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]fenil}-1 , 3,4,5-tetrahidro-6/-/-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona representado por la fórmula 1 i es una pequeña molécula inhibidora de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP). El compuesto de fórmula 1 y las sales del mismo, pueden prepararse como se describe en la Patente de EEUU N° 6,495,541 ; la Solicitud PCT N° PCT/IB2004/000915, la Publicación Internacional N° WO 2004/087713; las Solicitudes de patente provisionales N° 60/612,457, 60/612,459 y 60/679,296, las descripciones de las cuales se incorporan en este documento como referencia en su totalidad. Hasta la fecha, se han identificado dieciocho enzimas por homología de secuencia de ADN en la familia PARP y se han investigado las propiedades bioquímicas y enzimáticas de siete: PARP-1 y PARP-2 se estimulan por roturas en la cadena de ADN, PARP-3 interacciona con PARP-1 y el centrosoma, PARP-4, también conocida como PARP de compartimiento (VPARP), es la PARP más grande y está asociada a los compartimentos citoplásmicos, las tankirasas 1 y 2 (PARP-5a y 5b) están asociadas a proteínas teloméricas y la función de PARP-7 (TiPARP) no está clara actualmente, pero puede estar implicada en la función de células T y puede ser una poli(ADP-ribosilato)histona (Ame JC, Splenlehauer C y de Murcia G. The PARP Superfamily. Bioessays 26 882-893 (2004)). Los estudios de farmacología han demostrado que el compuesto de fórmula es un inhibidor de PARP-1 (K¡ = 1.4 nM) y PARP-2 (K¡ = 0.17 nM). En base a las similitudes estructurales en las secuencias de aminoácidos entre las enzimas PARP, el compuesto de fórmula ? probablemente también se une con alta afinidad a los otros miembros de la familia. La reparación mediada por enzimas de roturas de hélice única o doble en el ADN es un mecanismo potencial de resistencia a radioterapia o fármacos citotóxicos cuyo mecanismo depende del daño del ADN. La inhibición de las enzimas de reparación de ADN es, por lo tanto, una estrategia para la potenciación de estos agentes. PARP-1 , el miembro mejor caractepzado de la familia PARP, es una enzima nuclear que después de la activación por daño en el ADN media la transferencia de fragmentos de ADP-ribosa desde NAD+ a varias proteínas aceptoras. Dependiendo del grado del daño provocado en el ADN, la activación de PARP-1 y la posterior poli(ADP-ribosil)ación median la reparación del ADN dañado o inducen la muerte celular. Cuando el daño del ADN es moderado, PARP-1 juega un papel significativo en el procedimiento de reparación del ADN. A la inversa, en el caso de daño masivo en del ADN, la activación excesiva de PARP-1 agota las reservas de ATP (en un esfuerzo por reponer el NAD+), que por último conduce a la muerte celular por necrosis (Tentón L, Portarena I, Graziani G. Potential applications of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitors. Pharmacol Res 2002, 45, 73-85). Esta activación de PARP también puede conducir a la liberación de AIF (factor inductor de la apoptosis) que desencadena la vía apoptótica independiente de caspasas. (Hong SJ, Dawson TM y Dawson VL. Nuclear and mitochondrial conversations in cell death: PARP-1 y AIF. Trends in Pharmacological Sciences 25 259-264 (2004)). Como resultado del papel dual de PARP-1 , los inhibidores de esta enzima, tales como 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]fenil}-1 , 3,4,5-tetrahídro-6H-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona representado por la fórmula 1, pueden tener un papel como agentes quimiosensibilizadores (evitando la reparación del ADN, por ejemplo, después de una terapia anticáncer), o como tratamientos para una diversidad de patologías y estados tóxicos que implican estrés oxidativo o inducido por óxido nítrico y posterior hiperactivación de PARP. Dichas afecciones incluyen trastornos neurológicos y neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer)) (Love S, Barber R, Wilcock GK. Increased poly(ADP-ribosyl)ation of nuclear proteins in Alzheimer's disease. Brain 1999;122:247-53; Mandir AS, Przedborski S, Jackson-Lewis V, y col. Poly(ADP-ribose) polymerase activation mediates 1-metil-4-fenil-1 ,2,3,6-tetrahidropyridine (MPTP)-induced parkinsonism. Proc Nati Acad Sci USA 1999;96:5774-9); trastornos cardiovasculares (por ejemplo, infarto de miocardio, lesión por isquemia-reperfusión)) (Pieper AA, Walles T, Wei G, y col. Myocardial postischemic injury is reduced by poly(ADP-ribose) polymerase-1 gene disruption. J Mol Med 2000;6:271-82; Szabó G, Báhrle S, Stumpf N, y col. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibítion reduces reperfusion injury after heart transplantation. Circ Res 2002;90:100-6; Patente de Estados Unidos 6,423,705); enfermedades inflamatorias (Szabó C, Dawson V. Role of poly(ADP-ribose) synthetase in inflammation y ischaemia-reperfusion. TIPS 1998;19:287-98); disfuncíón vascular diabética (Soriano FG, Virág L, Szabó C. Diabetíc endothelial dysfunction: role of reactive oxygen y nitrogen species production y poly(ADP-ribose) polymerase activation. J Mol Med 2001 ;79:437-48); artritis (Szabó C, Virág L, Cuzzocrea S, y col. Protection against peroxynitrite-induced fibroblast injury and arthritis development by inhibition of poly(ADP-ribose) synthase. Proc Nati Acad Sci USA 1998, vol.95, pp. 3867-72); y nefrotoxicidad inducida por cisplatino (Racz y col. "BGP-15 - a novel poly(ADP-ribose) polymerase ¡nhibitor - protects against nephrotoxicity of císplatin without compromising its antitumor activity." Biochem Pharmacol 2002;63:1099-111 ). Además, se ha demostrado que células tumorales deficientes en BRCA2 son sumamente sensibles a inhibidores de PARP solos (Bryant y col. "Specific killing of BRCA2 deficient tumors with inhibitors of poly(ADP-ribose)polymerase," Nature, 2005, vol. 434, páginas. 913-917; Farmer y col. "Targeting the DNA repaír defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy," Nature, 2005, vol. 434, pp. 917-921 ). Los inhibidores de PARP también están implicados en la potenciación de la inducción de la expresión del gen Reg en células ß y del gen HGF y, por consiguiente, promueven la proliferación de células ß pancreáticas de los islotes de Langerhans y suprimen la apoptosis de las células (Publicación de Solicitud de Patente de EEUU 2004/0091453; Publicación PCT N° WO 02/00665). Además, los inhibidores de PARP también se usan en preparaciones cosméticas, especialmente en lociones para después del sol (Publicación PCT N° WO 01/82877). Actualmente no hay inhibidores de PARP comercializados. El cáncer sigue siendo una enfermedad con alta necesidad médica sin satisfacer. La quimioterapia citotóxíca sigue siendo el pilar principal de la terapia sistémica de la mayoría de los cánceres, particularmente enfermedad en fase final. Sin embargo, para pacientes con enfermedad avanzada o metastásica, pocos de los agentes o regímenes de quimioterapia citotóxica han sido eficaces en aumentar la supervivencia global. Además, el pequeño marco terapéutico asociado a los agentes citotóxicos da como resultado un toxicidad significativa junto con una eficacia por debajo de la óptima. Por lo tanto, un quimiosensibilizador que mejora la eficacia los fármacos citotóxicos a dosis bien toleradas satisfaría una necesidad crítica para los pacientes con cáncer. La radioterapia es una forma eficaz de tratamiento del cáncer usada en la mayoría de los tipos tumorales para el control de la enfermedad localizada. Por encima del 50% de los pacientes con cáncer recibirán radioterapia durante en transcurso de su enfermedad (Foroudi F. y col. An evidence-based estímate of appropriate radiotherapy utilization rate for breast cáncer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2002, 53:1240-53; Foroudi F. y col. An evidence-based estímate of the appropriate radiotherapy utilization rate for colorrectal cáncer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2003, 56:1295-307; Foroudi F. y col. Evidence-based estímate of appropriate radiotherapy utilization rate for prostate cáncer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2003, 55:51-63; Barbera L. y col. Estimating the benefit y cost of radiotherapy for lung cáncer. Int J Technol Assess Health Care. 2004, 20:545-51). Sin embargo, incluso en tratamiento de primera línea de cánceres, en el que se administra radioterapia con intención curativa (por ejemplo, cáncer de cabeza y cuello, sarcoma de tejidos blandos y carcinoma del cuello del útero), no todos los pacientes responden bien. Hay, por lo tanto, una necesidad de estrategias que mejoren la respuesta global del paciente. A menudo se administrará quimioterapia convencional antes de o después de la radioterapia. Un enfoque alternativo es combinar tratamiento de radiación con nuevos agentes anti-cáncer que se diseñan específicamente para mejorar la eficacia del tratamiento de radiación. Dichos agentes tienen efecto sobre cinco factores clave que dirigen la respuesta del tumor a la radiación ("Cell survival as a determinant of tumor response." Basic clinical radiobiology 3a Edición. Steel GG (Ed.). Arnold Press UK, páginas. 52-63, 2002). Estos son la capacidad de reparar el daño del ADN provocado por el tratamiento de radiación; la redistribución de las células a través del ciclo celular después del tratamiento de radiación (de modo que las células tumorales que estaban en una fase resistente en la primera dosis de radiación pueden haber progresado hasta una fase más sensible por la siguiente fracción de radiación); repoblación, por la que las células supervivientes continúan dividiéndose aumentando de este modo la carga tumoral entre fracciones de radiación; reoxigenación de las células que han sobrevivido a la ronda inicial de tratamiento de radiación como consecuencia de estar peor oxigenadas y, finalmente, la radiosensíbilidad inherente del tejido particular. De estos factores, el aumento de la reparación y la repoblación dan como resultado radioresistencía, mientras que la redistribución, reoxigenación y radiosensibilidad inherente pueden volver al tumor más sensible al tratamiento con radiación. Evidentemente, el uso de agentes que reducen la capacidad para reparar el ADN en combinación con radioterapia puede mejorar el resultado radioterapéutíco. La activación de PARP-1 y la posterior poli-(ADP-ribosilacíón) se observa en respuesta al daño del ADN inducido por radiación (Satoh MS & Lindahl T. "Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repaír." Nature. 1992, 356:356-358). Además, las líneas celulares y ratones knock-out generados para carecer de expresión y actividad de PARP-1 muestran una radiosensibilidad muy intensa que sostiene a PARP-1 como diana atractiva para radiopotenciación (Wang y col. "Mice lacking ADPRT y poly(ADP-ribosyl)ation develop normally but are susceptible to skin disease." Genes Dev. 1995, 9:509-20; de Murcia y col. "Requirement of poly(ADP-ribose) polymerase in recovery from DNA damage in mice y in cells." Proc Nati Acad Sci U S A. 1997, 94:7303-7; Masutani y col. "Function of poly(ADP-ribose) polymerase in response to DNA damage: gene-disruptíon study in mice." Mol Cell Biochem. 1999,193:149-52). Además de los efectos directos sobre la reparación del ADN, la clase de inhibidores de PARP-1 detallada son vasoactivos y, como tales, aumentan el potencial de reoxigenación tumoral entre las fracciones de radiación que pueden contribuir adicionalmente a una respuesta de radiación aumentada (Calabrese y col. "Anticancer chemo- and radio-sensitisatíon in vitro y in vivo by a potent novel poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) ¡nhibitor, AG14361." J. Nati. Cáncer Inst. 2004, 96: 56-67).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una realización, la presente invención proporciona una forma de dosificación para administración a un mamífero, comprendiendo la forma de dosificación un compuesto de fórmula 1: 1 una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 5,9 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero. En otra realización, la invención proporciona una forma de dosificación para administración a un mamífero, comprendiendo la forma de dosificación un compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 10 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero. En otra realización, la invención proporciona una forma de dosificación para administración a un mamífero, comprendiendo la forma de dosificación un compuesto de fórmula 1 , una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 5,9 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero, donde la forma de dosificación es un polvo liofilizado para inyección. En otra realización, la invención proporciona una forma de dosificación para administración a un mamífero, comprendiendo la forma de dosificación un compuesto de fórmula 1 , una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad eficaz para inhibir una enzima poli(ADP-ribosa) polimerasa en al menos el 50% durante al menos 24 horas en linfocitos sanguíneos periféricos después de la administración al mamífero. En otra realización, la invención proporciona una forma de dosificación para administración a un mamífero, comprendiendo la forma de dosificación un compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad eficaz para inhibir una enzima poli(ADP-ribosa) polímerasa en al menos el 50% durante al menos 24 horas en linfocitos sanguíneos periféricos después de la administración al mamífero, donde la forma de dosificación es un polvo liofilizado para inyección. En otra realización, la invención proporciona una forma de dosificación para administración a un mamífero, comprendiendo la forma de dosificación un compuesto de fórmula 1 , una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad de 1 a 48 mg/m2 expresada como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1. En otra realización, la invención proporciona una forma de dosificación para administración a un mamífero, comprendiendo la forma de dosificación un compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad de 1 a 48 mg/m2 expresada como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1 , donde la forma de dosificación es un polvo liofilizado para inyección. En otra realización, la invención proporciona una forma de dosificación para administración a un mamífero, comprendiendo la forma de dosificación un compuesto de fórmula 1 , una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad de 2 a 96 mg expresada como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1.
En otra realización, la invención proporciona una forma de dosificación para administración a un mamífero, comprendiendo la forma de dosificación un compuesto de fórmula ?, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad de 2 a 96 mg expresada como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1, donde la forma de dosificación es un polvo liofilizado para inyección. En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar cáncer en un mamífero, comprendiendo el procedimiento administrar al mamífero (a) un compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos en una cantidad eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 5,9 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero; y (b) una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente anti-cáncer. En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar cáncer en un mamífero, comprendiendo el procedimiento administrar al mamífero (a) un compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos en una cantidad eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 5,9 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero; y (b) una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente anti-cáncer, donde el agente anti-cáncer se administra en 1 hora después de la administración del compuesto de fórmula 1. En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar cáncer en un mamífero, comprendiendo el procedimiento administrar al mamífero (a) un compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos en una cantidad eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 5,9 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero; y (b) una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente anti-cáncer, donde el cáncer se selecciona entre cáncer de pulmón, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o ¡ntraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, carcinoma de las trompas de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello del útero, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, Enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, leucemia crónica o aguda, linfomas linfocíticos, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, adenoma de la pituitaria y combinaciones de los mismos. En otra realización, la invención proporciona un kit para tratar cáncer en un mamífero, comprendiendo el kit: (a) una cantidad de un compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, y un vehículo o díluyente farmacéuticamente aceptable en una primera forma de dosificación unitaria; (b) una cantidad de al menos un agente anti-cáncer y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en al menos una segunda forma de dosificación unitaria; y (c) recipiente para contener la primera y al menos la segunda formas de dosificación; donde la cantidad del compuesto de fórmula es eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 5,9 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero. En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar cáncer en un mamífero, comprendiendo el procedimiento administrar al mamífero (a) un compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos en una cantidad eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 5,9 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero; y (b) una combinación de irinotecano, 5-flourouracilo y leucovorina. En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para tratar cáncer en un mamífero, comprendiendo el procedimiento administrar al mamífero (a) un compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos en una cantidad eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 5,9 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero; y (b) una dosis de radiación eficaz para destruir el cáncer.
Definiciones y Abreviaturas de Términos La expresión "Compuesto I" se refiere a la sal fosfato de 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]fenil}-1 ,3,4,5-tetrahidro-6/-/-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona. La expresión "el compuesto de fórmula 1" se refiere a 8-fluoro-2-{4-[(metilam¡no)metil]fenil}-1 ,3,4,5-tetrahidro-6/-/-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona, base libre. "Crecimiento celular anormal", como se usa en este documento, salvo que se indique otra cosa, se refiere a un crecimiento celular que es independiente de los mecanismos reguladores normales (por ejemplo, pérdida de inhibición por contacto). El término "tratar", como se usa en este documento, salvo que se indique otra cosa, significa invertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o afección al que se aplica dicho término, o uno o más síntomas de dicho trastorno o afección. El término "tratamiento", como se usa en este documento, salvo que se indique otra cosa, se refiere al acto de tratar como se ha definido "tratar" inmediatamente antes. El término "radíosensibilízador", como se usa en este documento, significa un fármaco que hace a las células tumorales más sensibles a terapia por radiación. El término "radioterapia", como se usa en este documento, incluye radioterapia de emisión externa (XBRT) o teleterapia, braquiterapia o radioterapia de fuente sellada y radioterapia de fuente no sellada. Las diferencias entre estas tres divisiones principales de radioterapia se refieren a la posición de la fuente de radiación; la externa está fuera del cuerpo, mientras que radioterapia de fuente sellada o no sellada tiene material radiactivo suministrado internamente. La radioterapia de emisión externa es la forma más habitual de radioterapia donde el paciente permanece en una camilla y una fuente externa de rayos X se dirige a una parte particular del cuerpo. La radiación interacciona con los tejidos y se absorbe, dañando al ADN de la célula. La braquiterapía es el suministro de terapia de radiación usando fuentes selladas que se colocan lo más cerca posible del sitio a tratar. Se puede aplicar para el tratamiento de tumores donde la fuente de radiación puede colocarse en una cavidad corporal tal como el esófago o bronquios o en sitios donde el tumor es accesible a agujas o catéteres, colocándose las fuentes en su interior, tal como la cabeza y el cuello y la piel. La braquiterapía tiene aplicaciones potenciales a la mayoría de los sitios tumorales. Puede usarse como tratamiento primario o en combinación con radioterapia de emisión externa. Radioterapia de fuente no sellada se refiere al uso de formas solubles de sustancias radiactivas que se inyectan en el cuerpo. Hay una característica común a todas estas sustancias, y es el papel biológico de la sustancia parental no radiactiva. La terapia con protones es un caso especial de radioterapia de emisión externa donde las partículas son protones. El término "radio-ínmunoterapia", como se usa en este documento, significa radioterapia donde se unen radionúclidos citotóxicos a anticuerpos para suministrar toxinas directamente a las dianas tumorales. La terapia con radiación dirigida en lugar de toxinas dirigidas por anticuerpo (inmunotoxinas) tiene la ventaja de que las células tumorales adyacentes, que carecen de los determinantes antigénicos apropiados, pueden destruirse por radiación de fuego cruzado. La radioinmunoterapia a veces se llama radioterapia dirigida, pero esta última expresión también puede referirse a radionúclidos unidos a moléculas no inmunes (radioterapia). La expresión "sal o sales farmacéuticamente aceptables", como se usa en este documento, salvo que se indique otra cosa, incluye sales de grupos ácidos o básicos que pueden estar presentes en un compuesto. Los compuestos que son de naturaleza básica son capaces de formar una amplia diversidad de sales con diversos ácidos inorgánicos y orgánicos. Los ácidos que pueden usarse para preparar sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos básicos son aquéllos que forman sales de adición de ácidos no tóxicas, es decir, sales que contienen aniones farmacológicamente aceptables, tales como las sales acetato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bisulfato, bitartrato, borato, bromuro, edetato de calcio, camsilato, carbonato, cloruro, clavulanato, citrato, diclorhidrato, edetato, edisliato, estolato, esilato, etílsuccinato, fumarato, gluceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcínato, hidrabamina, bromhidrato, clorhidrato, yoduro, isotionato, lactato, lactobionato, laurato, malato, maleato, mandelato, mesilato, metiisulfato, mucato, napsilato, nitrato, oleato, oxalato, pamoato (embonato), palmitato, pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, tanato, tartrato, teoclato, tosilato, trietilyoduro, y valerato. Las sales particularmente preferidas incluyen sales fosfato y gluconato. La invención también incluye compuestos marcados con isótopos, que son idénticos a los enumerados en la Fórmula 1, pero que tienen uno o más átomos remplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número másico diferente de la masa atómica o número másico que habitualmente se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en compuestos de la invención incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro, tales como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F, y 36CI, respectivamente. Los compuestos de la presente invención y las sales farmacéuticamente aceptable de dichos compuestos que contienen los isótopos mencionados anteriormente y/u otros isótopos de otros átomos pertenecen al alcance de esta invención. Ciertos compuestos marcados con isótopos de la presente invención, por ejemplo, aquéllos en los que se incorporan isótopos radiactivos tales como 3H, 14C, 11C o 18F, son útiles en ensayos de distribución tisular de fármacos y/o sustrato. Los isótopos tritio, es decir, 3H, y carbono-14, es decir, 14C, son particularmente preferidos por su fácil preparación y detectabilidad y 11C o 18F para su uso en tomografía por emisión de positrones. Además, la sustitución con isótopos más pesados tales como deuterio, es decir, 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas como resultado de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una mayor semivida in vivo o la necesidad de menores dosificaciones y, por lo tanto, puede preferirse en algunas circunstancias. Un compuesto marcado de manera isotópica de Fórmula de esta invención puede prepararse en líneas generales realizando los procedimientos descritos para el compuesto no marcado, sustituyendo un reactivo no marcado con isótopos por un reactivo marcado con isótopos fácilmente adquírible.
ADP dífosfato de adenosina AE suceso adverso ALT alanina amínotransferasa ANC recuento absoluto de neutrófilos AST aspartato amínotransferasa AUC área bajo la curva concentración en plasma-tiempo AUC(o-24) área bajo la curva concentración en plasma-tiempo de 0 a 24 horas AUC (0-tlast) área bajo la curva concentración en plasma-tiempo de tiempo 0 a la última observación registrada BLD por debajo del límite de detección BSA área superficial del cuerpo BUN nitrógeno de urea en sangre Co concentración inicial CL eliminación Cmax concentración máxima en plasma CRC cáncer colorrectal CTCAEv3 Criterios de Terminología Habituales para Sucesos Adversos versión 3 CV cardiovascular DLT toxicidades limitantes de la dosis ADN ácido desoxirribonucleico CE50 concentración que produce el 50% del efecto máximo ECG electrocardiograma FcR receptor Fc 5-FU 5-fluorouracilo Gl gastrointestinal GIST tumor del estroma gastrointestinal GLP buena práctica de laboratorio HCT hematocrito hERG gen humano relacionado con el gen eter-a-go-go hERG-IKr bloqueo del canal del gen humano relacionado con el gen a-go- go HGB hemoglobina IG50 concentración inhibidora del 50% del crecimiento celular CI50 concentración inhibidora del 50% de la actividad enzimática IGF factor de crecimiento tipo insulina IGF-1 R receptor del factor de crecimiento tipo insulina, Tipo 1 IL interleuquina IP intraperitoneal IV intravenoso LLN límite inferior del normal LLOQ límite inferior de cuantificacíón LV leucovorina MMNG ?/-metil-?/ -nitro-?/-nitrosoguanid¡na MTD dosis máxima tolerada NAD dinucleótido de nicotinamida y adenina NOAEL nivel de efecto adverso no observado PARP poli(ADP-ribosa) polímerasa PBMCs monocitos sanguíneos periféricos PD farmacodinámica PID dosis inhibidora de PARP PK farmacocinética PO por vía oral RBC glóbulos rojos RECIST Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos QC Control de calidad SAE suceso adverso grave SWFI/SWI agua estéril para inyección {% semivída terminal aparente Tmax tiempo de existencia de Cmax ULN por encima del límite de lo normal Vdss volumen de distribución en el estado estacionario WFI agua para inyección BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa los datos de la eficacia de temozolomida en combinación con 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]fenil}-1 ,3,4,5-tetrahidro-6/-/-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona en forma de sal fosfato frente al xenoinjerto SW620.
La Figura 2 representa los datos de eficacia de temozolomida en combinación con 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]fenil}-1 ,3,4,5-tetrahidro-6H- azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona en forma de sal glucuronato frente al xenoinjerto SW620.
Las Figuras 3A-3C representan los perfiles de concentración media en plasma de 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]fenil}-1 ,3,4,5-tetrahidro-6/- -azepíno[5,4,3-cd]indol-6-ona-tiempo para el Día -7 (figura 3A) (la sal fosfato de 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]fenil}-1 ,3,4,5-tetrahidro-6H-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona sola) y los Días 1 (figura 3B) y 4 (figura 3C) (la sal fosfato de 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]feníl}-1 ,3,4,5-tetrahidro-6/-/-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona más temozolomida) cuando la sal fosfato se administró como una infusión IV de 30 minutos y la temozolomida oral se administró como 100 mg/m2. La Figura 4 representa la actividad Media de PARP en linfocitos sanguíneos periféricos después de administración de la sal fosfato de 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]fenil}-1 ,3,4,5-tetrahidro-6/-/-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. Formulaciones Farmacéuticas de 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metipfenil)-1 ,3,4,5-tetrahidro-6/-/-azepino[5,4,3-cd1indol-6-ona El compuesto de fórmula 1 y las sales del mismo pueden prepararse como se describe en la Patente de EEUU N° 6,495,541 ; solicitud PCT N° PCT/IB2004/000915; Solicitud de Patente Provisional de EEUU N° 60/612,457; y Solicitud de Patente Provisional de EEUU N° 60/612,459, las descripciones de la cuales se incorporan en este documento como referencia en sus totalidades. Ciertos materiales de partida pueden prepararse de acuerdo con procedimientos con los que estarán familiarizados los especialistas en la técnica y pueden hacerse ciertas modificaciones sintéticas de acuerdo con procedimientos con los que estarán familiarizados los especialistas en la técnica. El compuesto de fórmula 1 es capaz de formar una amplia diversidad de sales diferentes con diversos ácidos inorgánicos y orgánicos. Aunque dichas sales deben ser farmacéuticamente aceptables para la administración a mamíferos, a menudo es deseable en la práctica aislar ¡nicíalmente el compuesto de fórmula 1 de la mezcla de reacción en forma de sal farmacéuticamente inaceptable y después simplemente convertir esta última otra vez en el compuesto de base libre por tratamiento con un reactivo alcalino, y posteriormente convertir la última base libre en una sal de adición de ácidos farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácidos de los compuestos básicos de esta invención se preparan fácilmente tratando el compuesto básico con una cantidad sustancialmente equivalente del ácido mineral u orgánico elegido en un medio disolvente acuoso o en un disolvente orgánico apropiado, tal como metanol o etanol. Después de evaporación cuidadosa del disolvente, se obtiene fácilmente la sal sólida deseada. La sal acida deseada también puede precipitarse en una solución de la base libre en un disolvente orgánico añadiendo a la solución un ácido mineral u orgánico apropiado. Pueden encontrarse ejemplos específicos de preparación de una sal preferida, la sal fosfato, en la solicitud PCT N° PCT/IB2004/000915; Solicitud de Patente Provisional de EEUU N° 60/612,457; y Solicitud de Patente Provisional de EEUU N° 60/612,459, las descripciones de la cuales se incorporan en este documento como referencia en su totalidad. La administración del compuesto de fórmula 1 puede realizarse por cualquier procedimiento que posibilite el suministro del compuesto al sitio de acción. Estos procedimientos incluyen vías orales, vias intraduodenales, inyección parenteral (incluyendo intravenosa, subcutánea, intramuscular, intravascular o infusión), tópica, y administración rectal. El compuesto puede, por ejemplo, proporcionarse en una forma apropiada para administración oral en forma de un comprimido, cápsula, pildora, polvo, formulación de liberación sostenida, solución, suspensión, para inyección parenteral en forma de una solución estéril, suspensión o emulsión, para administración tópica en forma de pomada o crema o para administración rectal en forma de supositorio. El compuesto puede esta en formas de dosificación unitaria apropiadas para la administración única de dosificaciones precisas.
Preferiblemente, las formas de dosificación incluyen un vehículo o excipiente farmacéutico convencional y el compuesto de fórmula 1 como ingrediente activo. Además, las formas de dosificación pueden incluir otros agentes médicos o farmacéuticos, vehículos, adyuvantes etc. Las formas de administración ejemplares incluyen soluciones o suspensiones en soluciones acuosas estériles, por ejemplo, soluciones de propilenglicol o dextrosa acuosas. Dichas formas de dosificación pueden estar apropiadamente tamponadas, si se desea.
Los vehículos farmacéuticos apropiados incluyen diluyentes o cargas, agua y diversos disolventes orgánicos. La composición farmacéutica puede, si se desea, contener ingredientes adicionales tales como aromatizantes, aglutinantes, excipientes y similares. Por lo tanto, para administración oral, pueden emplearse comprimidos que contienen diversos excipientes, tales como ácido cítrico, junto con diversos disgregantes tales como almidón, ácido algínico y ciertos silicatos complejos y con agentes aglutinantes tales como sacarosa, gelatina y goma arábiga. Adicionalmente, a menudo son útiles agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato sódico y talco para propósitos de formación de comprimidos. Las composiciones sólidas de tipo similar también pueden emplearse en cápsulas de gelatina cargadas blandas y duras. Los materiales preferidos para las mismas incluyen lactosa o azúcar de la leche y polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas o elixires para administración oral, el compuesto activo de los mismos puede combinarse con diversos agentes edulcorantes y aromatizantes, sustancias colorantes o tintes y, si se desea, agentes emulsionantes o de suspensión, junto con diluyentes tales como agua, etanol, propílenglicol, glicerina, o combinaciones de los mismos. En realizaciones preferidas de las formas de dosificación de la invención, la forma de dosificación es una forma de dosificación oral, más preferiblemente, un comprimido o cápsula. En realizaciones preferidas de los procedimientos de la invención, el compuesto de fórmula 1 se administra por vía parenteral, por ejemplo, usando un polvo liofilizado. La preparación del polvo liofilizado para inyección para uso clínico se describe en la Solicitud de Patente Provisional de EEUU N° 60/612,459, la descripción de la cual se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Por ejemplo, la sal fosfato del compuesto de fórmula 1 puede formularse y suministrarse en forma de polvo liofilizado para inyección, 12 mg/vial (en forma de base libre), en viales de vidrio color ámbar Tipo I de 10 ml/20 mm. La composición de la sal fosfato del compuesto del producto farmacéutico de fórmula 1 puede constar de la sal fosfato del compuesto de fórmula 1, manitol, agua para inyección y nitrógeno. El producto farmacéutico resultante puede ser una torta blanquecina a amarilla. Cada vial de producto farmacéutico puede reconstituirse con 6 ml de agua estéril para inyección para producir 2.02 mg/ml (redondeado a 2 mg/ml), en forma de base libre del compuesto de fórmula 1 En realizaciones preferidas de la invención, las concentraciones en plasma del compuesto de fórmula ? se mantienen a o por encima de 5.9 ng/ml. Este valor se determinó a partir del efecto diana (IC89) para la inhibición del agotamiento de NAD+ celular y la formación de polimero de poli-ADP-ribosa y se ajustó para la unión de proteína. Específicamente, como se muestra en el Ejemplo 4, el compuesto de fórmula 1 a 5 nM (temozolomida PF50 = 1.3), redujo enormemente el consumo de NAD+ celular inducido por MNNG e inhibió la formación celular de poli-ADP-ribosa al 89% en células A549. Corrigiendo el efecto diana a 5 nM para la unión de proteína humana (27.4% de no unión media para concentraciones del compuesto de fórmula 1 entre 0.05 a 25 nM), se produjo una concentración en plasma de 5.9 ng/ml: 5 nM x 323.37 = 5.9 ng/ml 0.274 x 1000 II. Combinaciones Farmacéuticas de la Presente Invención y Su Uso En una realización de la presente invención el compuesto de fórmula 1 se usa para mejorar la eficacia de fármacos citotóxicos cuyo mecanismo depende del daño del ADN. Estos fármacos incluyen aunque sin limitación temozolomida (SCHERING), irinotecano (PFIZER), topotecano (GLAXO SMITHKLINE), cisplatino (BRISTOL MEYERS SQUIBB; AM PHARM PARTNERS; BEDFORD; GENSIA SICOR PHARMS; PHARMACHEMIE), y clorhidrato de doxorrubicina (AM PHARM PARTNERS; BEDFORD; GENSIA; SICOR PHARMS; PHARMACHEMIE; ADRIA; ALZA). Las cantidades terapéuticamente eficaces de los agentes de la invención pueden administrarse, típicamente en forma de una composición farmacéutica, para tratar enfermedades mediadas por la modulación o regulación de PARP. Una "cantidad eficaz" pretende significar la cantidad de un agente que, cuando se administra a un mamífero, incluyendo un ser humano, en necesidad de dicho tratamiento, es suficiente para lograr el tratamiento de una enfermedad mediada por la actividad de una o más enzimas PARP. Por lo tanto, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención es una cantidad suficiente para modular, regular, o inhibir la actividad de una o más enzimas PARP de modo que el estado de enfermedad que está mediado por esa actividad se reduzca o alivie. La cantidad eficaz de un compuesto dado variará dependiendo de factores tales como el estado de enfermedad y su gravedad y la identidad y condición (por ejemplo, peso) del mamífero en necesidad de tratamiento, pero puede, sin embargo, determinarse de manera rutinaria por un especialista en la técnica. "Tratar" pretende significar al menos la mitigación de un estado de enfermedad en un mamífero, incluyendo un ser humano, que está afectado, al menos en parte, por la actividad de una o más enzimas PARP e incluye: prevenir que suceda el estado de enfermedad en un mamífero, particularmente cuando se descubre que el mamífero está predispuesto a tener el estado de enfermedad pero aún no se ha diagnosticado que lo tiene; modulando y/o inhibiendo el estado de enfermedad; y/o aliviando el estado de enfermedad. El estado de enfermedad ejemplar incluye cáncer. La actividad del compuesto de fórmula 1 como modulador de la actividad de PARP puede medirse por cualquiera de los procedimientos disponibles por los especialistas en la técnica, incluyendo ensayos in vivo y/o in vitro. Los ejemplos de ensayos adecuados para mediciones de actividad incluyen los descritos en la Patente de EEUU N° 6,495,541 y los ejemplos específicos de la presente invención. La presente invención se refiere a procedimientos terapéuticos para tratar un estado de enfermedad mediado por la actividad PARP, por ejemplo, cáncer y una diversidad de patologías y estados tóxicos que implican estrés oxidativo o inducido por óxido nítrico y posterior hiperactivación de PARP. Dichas afecciones incluyen, aunque sin limitación, trastornos neurológicos y neurodegenerativos (por ejemplo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer), trastornos cardiovasculares (por ejemplo, infarto de miocardio, lesión por isquemia-reperfusión), disfunción vascular diabética y nefrotoxicidad inducida por cisplatino. Los procedimientos terapéuticos de la presente invención comprenden administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las formas polimórficas, o composiciones farmacéuticas analizadas anteriormente. Esta invención también se refiere un procedimiento para el tratamiento del crecimiento celular anormal en un mamífero, incluyendo un ser humano, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad del compuesto de fórmula 1, como se ha definido anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo, que es eficaz para tratar el crecimiento celular anormal. En una realización de este procedimiento, el crecimiento celular anormal es cáncer, incluyendo, aunque sin limitación, mesotelioma, tumor hepatobílliar (del conducto hepático y biliar), un tumor primario o secundario del SNC, un tumor cerebral primario o secundario, cáncer de pulmón (NSCLC y SCLC), cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza y el cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de ovarios, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, gastrointestinal (gástrico, colorrectal y duodenal), cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello del útero, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, Enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, cáncer testicular, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide crónica, linfomas linfocíticos, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, linfoma no de hodgkin, tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, adenoma de la pituitaria, cáncer adrenocortical, cáncer de la vesícula biliar, mieloma múltiple, colangiocarcinoma, fibrosarcoma, neuroblastoma, retínoblastoma, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. En otra realización de dicho procedimiento, dicho crecimiento celular anormal es una enfermedad proliferatíva benigna, incluyendo, aunque sin limitación, psoriasis, hipertrofia prostática benigna o reestenosis. Esta invención también se refiere un procedimiento para el tratamiento del crecimiento celular anormal en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad del compuesto de fórmula 1, o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo, que es eficaz para tratar el crecimiento celular anormal en combinación con un agente anti-tumoral seleccionado entre el grupo constituido por inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, anti-metabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, anticuerpos, agentes citotóxícos, anti-hormonas y anti-andrógenos. Esta invención también se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento del crecimiento celular anormal en un mamífero, incluyendo un ser humano, que comprende una cantidad del compuesto de fórmula 1, como se ha definido anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo que es eficaz para tratar el crecimiento celular anormal, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización de dicha composición, dicho crecimiento celular anormal es cáncer, incluyendo, aunque sin limitación, mesotelioma, tumor hepatobillíar (de los conductos hepático y biliar), un tumor primario o secundario del SNC, un tumor cerebral primario o secundario, cáncer de pulmón (NSCLC y SCLC), cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, gastrointestinal (gástrico, colorrectal y duodenal), cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de las trompas de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello del útero, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, Enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, cáncer testicular, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide crónica, linfomas linfocíticos, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, linfoma no de hodgkín, tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, adenoma de la pituitaria, cáncer adrenocortical, cáncer de la vesícula biliar, mieloma múltiple, colangiocarcínoma, fibrosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. En otra realización de dicha composición farmacéutica, dicho crecimiento celular anormal es una enfermedad proliferativa benigna, que incluye, aunque sin limitación, psoriasis, hipertrofia prostática benigna o reestenosis. La invención también se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento del crecimiento celular anormal en un mamífero, incluyendo un ser humano, que comprende una cantidad del compuesto de fórmula 1_, como se ha definido anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo, que es eficaz para tratar el crecimiento celular anormal en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y un agente antitumoral seleccionado entre el grupo constituido por inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, anti-metabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, anti-hormonas y anti-andrógenos. La invención también se refiere a un procedimiento para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de fórmula 1, o una sal farmacéuticamente aceptable o hidrato del mismo, en combinación con un agente anti-tumoral seleccionado entre el grupo constituido por agentes antiproliferativos, inhibidores de quinasa, inhibidores de la angíogénesis, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores de cox-l, inhibidores de cox-ll, inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores del factor de crecimiento, radiación, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, anticuerpos, agentes citotóxicos, antihormonas, estatinas y anti-andrógenos. La presente invención también se refiere a procedimientos terapéuticos de combinación para tratar un estado de enfermedad mediado por la actividad de PARP, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las formas polimórficas o composiciones farmacéuticas analizadas anteriormente, en combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más sustancias seleccionadas entre agentes anti-tumorales, agentes anti-angíogénesis, inhibidores de la transducción de señales y agentes antiproliferativos. Dichas sustancias incluyen las descritas en las Publicaciones PCT N° WO 00/38715, WO 00/38716, WO 00/38717, WO 00/38718, WO 00/38719, WO 00/38730, WO 00/38665, WO 00/37107 y WO 00/38786, las descripciones de las cuales se incorporan en este documento como referencia en su totalidad. Los ejemplos de agentes anti-tumorales incluyen temozolomida (SCHERING), irinotecano (PFIZER), topotecano (GLAXO SMITHKLINE), cisplatino (BRISTOL MEYERS SQUIBB; AM PHARM PARTNERS; BEDFORD; GENSIA SICOR PHARMS; PHARMACHEMIE), y clorhidrato de doxorrubícina (AM PHARM PARTNERS; BEDFORD; GENSIA; SICOR PHARMS; PHARMACHEMIE; ADRIA; ALZA). Los procedimientos terapéuticos de combinación incluyen administrar el compuesto de fórmula 1 y un agente anti-tumoral usando cualquier régimen de dosificación deseado. Por ejemplo, los regímenes pueden depender del agente de combinación del siguiente modo: (a) el compuesto de fórmula 1_, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, puede administrarse en una cantidad de 1 a 48 mg/m2 expresada como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1, diariamente x 5 días cada 28 días, 1 hora antes de 25-200 mg/m2 de temozolomida, preferiblemente, 100-200 mg/m2 de temozolomida; (b) el compuesto de fórmula 1_, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, puede administrarse en una cantidad de 1 a 48 mg/m2 expresada como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1, 1 hora antes de la dosis de irinotecano y 24 horas después. Intervalos de dosis para irinotecano: 62-125 mg/m2 a la semana x 4 semanas cada 6 semanas 175-350 mg/m2 cada 3 semanas 90-180 mg/m2 cada 2 semanas. (c) el compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, puede administrarse en una cantidad de 1 a 48 mg/m2 expresada como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1, diariamente x 5 días cada 21 días, 1 hora antes de la dosis de topotecano. Intervalo de dosis para topotecano: 0.75-1.5 mg/m2 diariamente x 5 días cada 21 días (d) el compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, puede administrarse en una cantidad de 1 a 48 mg/m2 expresada como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1, una vez cada 3-4 semanas o diariamente x 3-5 días cada 3-4 semanas, 1 hora antes de la dosis de cisplatino. Intervalo de dosis para cisplatino: 10-100 mg/m2 cada 3-4 semanas 10-40 mg/m2 diariamente x 3-5 días cada 3-4 semanas. (e) el compuesto de fórmula , una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, puede administrarse en una cantidad de 1 a 48 mg/m2 expresada como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1, 1 hora antes de la dosis de doxorrubicina y 24 horas después. Intervalo de dosis para doxorrubicina: 20-75 mg/m2 cada 21-28 días. Los procedimientos terapéuticos de combinación de la presente invención pueden incluir administrar el compuesto de fórmula 1, una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad de 1 a 48 mg/m2 expresada como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1, y un agente o agentes anti-tumorales usando, por ejemplo, regímenes de dosificación presentados en el cuadro 1.
CUADRO 1 CRC = cáncer colorrectal; 5-FU = 5-fluorouracilo; LV = leucovorina. *S¡ la primera infusión se tolera bien, las infusiones posteriores pueden administrarse durante 60 minutos y después 30 minutos.
Los esquemas de dosificación enumerados en el cuadro 1 pueden modificarse. Por ejemplo, el irinotecano puede darse a una dosis de 50-350 mg/m ,2. , 5-FU puede darse a una dosis de 370 mg/m - 3.0 g. LV puede darse a 20-500 mg/m2. Los procedimientos terapéuticos de combinación de la presente invención que incluyen administrar el compuesto de fórmula 1^ una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad de 1 a 48 mg/m2 expresada como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1, y un agente o agentes anti-tumorales, pueden usarse, por ejemplo, en el tratamiento de pacientes en los que, por ejemplo, falló el tratamiento con los regímenes presentados en el cuadro 2.
CUADRO 2 Las unidades de dosificación se representan en mg por m2 de BSA. Por ejemplo, la fórmula de Mosteller, la fórmula de DuBois y DuBois, la fórmula de Haycock, la fórmula de Gehan y George, y la fórmula de Boyd son aplicables para medir la BSA (Mosteller RD: Símplified Calculation of Body Surface Área. N Engl J Med 22 de octubre de 1987;317(17):1098; DuBois D; DuBois EF: A formula to estímate the approxímate surface área if height and weight be known. Arch Int Med 1916 17:863-71 ; Haycock G.B., Schwartz G.J., Wisotsky D.H. Geometric method for measuring body surface área: A height weight formula validated in infants, children and adults. The Journal of Pediatrics 1978 93:1 :62-66; Gehan EA, George SL, Estimation of human body surface área from height and weight. Cáncer Chemother Rep 1970 54:225-35; Boyd E, The growth of the surface área of the human body. Minneapolis: university of Minnesota Press, 1935; Lam TK, Leung DT: More on símplified calculation of body-surface área. N Engl J Med 28 de abril de 1988;318(17):1130). Otros ejemplos adicionales de agentes anti-tumorales incluyen agentes antiproliferativos, inhibidores de quinasa, inhibidores de la angiogénesis, inhibidores de factores de crecimiento, inhibidores de cox-l, inhibidores de cox-ll, inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, anti-metabolitos, antibióticos intercalantes, inhibidores de factores de crecimiento, radiación, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, modificadores de la respuesta biológica, anticuerpos, agentes citotóxicos, antihormonas, estatinas y anti-andrógenos.
En una realización de la presente invención, el agente antitumoral usado junto con el compuesto de fórmula 1 y composiciones farmacéuticas descritas en este documento es un agente anti-angíogénesis, inhibidor de quinasa, inhibidor de pan quinasa o inhibidor de factores de crecimiento. Los inhibidores de pan quinasa preferidos incluyen SU-11248, descrito en la Patente de EEUU N° 6,573,293 (Pfizer, Inc, NY, EEUU). Los agentes anti-angíogénesis, incluyen aunque sin limitación los siguientes agentes, tales como inhibidor de EGF, inhibidores de EGFR, inhibidores de VEGF, inhibidores de VEGFR, inhibidores de TIE2, inhibidores de IGF1 R, inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II), inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa de matriz 2) e inhibidores de MMP-9 (metaloproteinasa de matriz 9). Los inhibidores de VEGF preferidos, incluyen por ejemplo, Avastin (bevacizumab), un anticuerpo monoclonal anti-VEGF de Genentech, Inc. de South San Francisco, California. Los inhibidores de VEGF adicionales incluyen CP-547.632 (Pfizer Inc., NY, EEUU), AG13736 (Pfizer Inc.), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171), VEGF Trap (Regeneron./Aventis), Vatalanib (también conocido como PTK-787, ZK-222584: Novartis & Schering AG), Macugen (pegaptanib octasodio, NX-1838, EYE-001 , Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Inc. of Kirkiand, Washington, USA); y angiozyme, una ribozima sintética de Ribozyme (Boulder, Colorado) y Chiron (Emeryville, California) y combinaciones de los mismos. Se describen inhibidores de VEGF útiles en la práctica de la presente invención en las Patentes de EEUU N° 6,534,524 y 6,235,764, incorporándose ambas en su totalidad para todo propósito. Los inhibidores de VEGF particularmente preferidos incluyen CP-547.632, AG13736, Vatalanib, Macugen y combinaciones de los mismos. Se describen otros inhibidores de VEGF adicionales, por ejemplo, en el documento WO 99/24440 (publicado el 20 de mayo de 1999), Solicitud Internacional PCT PCT/IB99/00797 (presentada el 3 de mayo de 1999), el documento WO 95/21613 (publicado el 17 de agosto de 1995), el documento WO 99/61422 (publicado el 2 de diciembre de 1999), la Patente de Estados Unidos 6,534,524 (describe AG13736), la Patente de Estados Unidos 5,834,504 (expedida el 10 de noviembre de 1998), el documento WO 98/50356 (publicada el 12 de noviembre de 1998), la Patente de Estados Unidos 5,883,113 (expedida el 16 de marzo de 1999), la Patente de Estados Unidos 5,886,020 (expedida el 23 de marzo de 1999), la Patente de Estados Unidos 5,792,783 (expedida el 11 de agosto de 1998), la Patente de EEUU N° US 6,653,308 (expedida el 25 de noviembre de 2003), el documento WO 99/10349 (publicado el 4 de marzo de 1999), el documento WO 97/32856 (publicado el 12 de septiembre de 1997), el documento WO 97/22596 (publicado el 26 de junio de 1997), el documento WO 98/54093 (publicado el 3 de diciembre de 1998), el documento WO 98/02438 (publicado el 22 de enero de 1998), el documento WO 99/16755 (publicado el 8 de abril de 1999) y el documento WO 98/02437 (publicado el 22 de enero 1998), todos los cuales se incorporan en este documento como referencia es sus totalidades. Otros agentes antiproliferativos que pueden usarse con los compuestos de la presente invención incluyen inhibidores de la enzima farnesil proteina transferasa e inhibidores del receptor tirosina quinasa PDGFr, incluyendo los compuestos descritos y reivindicados in las siguientes solicitudes de patente de Estados Unidos: 09/221946 (presentada el 28 de diciembre de 1998); 09/454058 (presentada el 2 de diciembre de 1999); 09/501163 (presentada el 9 de febrero de 2000); 09/539930 (presentada el 31 de marzo de 2000); 09/202796 (presentada el 22 de mayo de 1997); 09/384339 (presentada el 26 de agosto de 1999); y 09/383755 (presentada el 26 de agosto de 1999); y los compuestos descritos y reivindicados en las siguientes solicitudes de patente provisionales de Estados Unidos: 60/168207 (presentada el 30 de noviembre de 1999); 60/170119 (presentada el 10 de diciembre de 1999); 60/177718 (presentada el 21 de enero de 2000); 60/168217 (presentada el 30 de noviembre de 1999), y 60/200834 (presentada el 1 de mayo de 2000). Cada una de las solicitudes de patente anteriores y solicitudes de patente provisionales se incorporan en este documento como referencia en su totalidad. Los inhibidores de PDGRr incluyen, aunque sin limitación, los descritos en la publicación de solicitud de patente internacional número WO01/40217, publicada el 7 de julio de 2001 , y la publicación de solicitud de patente internacional número WO2004/020431 , publicada el 11 de marzo de 2004, los contenidos de las cuales se incorporan en su totalidad paro todo propósito. Los inhibidores de PDGFr preferidos incluyen CP-673.451 y CP-868.596 de Pfizer y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los inhibidores de GARF preferidos incluyen AG-2037 de Pfizer (pelitrexol) y sus sales farmacéuticamente aceptables. Se describen inhibidores de GARF útiles en la práctica de la presente invención en la Patente de EEUU N° 5,608,082 que se incorpora en su totalidad para todo propósito. Los ejemplos de inhibidores de COX-II que pueden usarse junto con el compuesto de fórmula 1 y composiciones farmacéuticas descritas en este documento incluyen CELEBREX™ (celecoxib), parecoxib, deracoxíb, ABT-963, MK-663 (etoricoxib), COX-189 (Lumiracoxib), BMS 347070, RS 57067, NS-398, Bextra (valdecoxib), paracoxib, Vioxx (rofecoxib), SD-8381 , 4-Metil-2-(3.4-dimetilfenil)-1 -(4-sulfamoil-fenil)-1 H-pirrol, 2-(4-Etoxifenil)-4-metil-1 -(4-sulfamoilfenil)- 1 H-pirrol, T-614, JTE-522, S-2474, SVT-2016, CT-3, SC-58125 y Arcoxía (etoricoxíb). Adicíonalmente, se describen inhibidores de COX-II en las Solicitudes de Patente de EEUU N° 10/801 ,446 y 10/801 ,429, los contenidos de las cuales se incorporan en su totalidad para todo propósito. En una realización preferida el agente anti-tumoral es celecoxib como se describe en la Patente de EEUU N° 5,466,823, los contenidos de la cual se incorporan como referencia en su totalidad para todo propósito. La estructura para Celecoxib se muestra a continuación: En una realización preferida, el agente anti-tumoral es valecoxib como se describe en la Patente de EEUU N° 5,633,272, los contenidos de la cual se incorporan como referencia en su totalidad para todo propósito. La estructura para valdecoxib se muestra a continuación: En una realización preferida, el agente anti-tumoral es parecoxib como se describe en la Patente de EEUU N° 5,932,598, los contenidos de la cual se incorporan como referencia en su totalidad para todo propósito. La estructura para paracoxib se muestra a continuación: En una realización preferida, el agente anti-tumoral is deracoxib como se describe en la Patente de EEUU N° 5,521 ,207, el contenido de la cual se incorpora como referencia en su totalidad para todo propósito. La estructura para deracoxib se muestra a continuación: En una realización preferida el agente anti-tumoral es SD-8381 como se describe en la Patente de EEUU N° 6,034,256, el contenido de la cual se incorporan como referencia en su totalidad para todo propósito. La estructura para SD-8381 se muestra a continuación: En una realización preferida, el agente anti-tumoral es ABT-963 como se describe en la Publicación Internacional Número WO 2002/24719, el contenido de la cual se incorpora como referencia en su totalidad para todo propósito. La estructura para ABT-963 se muestra a continuación: En una realización preferida, el agente anti-tumoral es rofecoxib como se muestra a continuación: En una realización preferida, el agente anti-tumoral es MK-663 (etoricoxib) como se describe en la Publicación Internacional Número WO 1998/03484, el contenido de la cual se incorpora como referencia en su totalidad para todo propósito. La estructura para etoricoxib se muestra a continuación: En una realización preferida, el agente anti-tumoral es COX-189 (Lumiracoxib) como se describe en la Publicación Internacional Número WO 1999/11605, el contenido de la cual se incorpora como referencia en su totalidad para todo propósito. La estructura para Lumiracoxib se muestra a continuación: Lumiracoxib CAS No. 220991-20- Novartis WO 99/11605 En una realización preferida, el agente anti-tumoral es BMS-347070 como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6,180,651 , el contenido de la cual se incorpora como referencia en su totalidad para todo propósito. La estructura para BMS-347070 se muestra a continuación: BMS 347070 CAS No . 197438 - 48-5 6 . 180 . 651 En una realización preferida, el agente antí-tumoral es NS-398 (CAS 123653-11-2). La estructura para NS-398 (CAS 123653-11-2) se muestra a continuación: NS-398 CAS No. 123653-11-2 En una realización preferida, el agente anti-tumoral es RS 57067 (CAS 17932-91-3). La estructura para RS-57067 (CAS 17932-91-3) se muestra a continuación: RS 57067 CAS No. 17932-91-3 En una realización preferida, el agente anti-tumoral es 4-Metil-2-(3.4-dimetilfenil)-1 -(4-sulfamoil-fenil)-1 H-pirrol. La estructura para 4-Metil-2-(3.4-dimetilfenil)-1-(4-sulfamoil-fenil)-1 H-pirrol se muestra a continuación: En una realización preferida, el agente anti-tumoral es 2-(4-Etoxifenil)-4-metil-1-(4-sulfamoilfenil)-1 H-pirrol. La estructura para 2-(4- Etoxifenil)-4-metíl-1-(4-sulfamoilfenil)-1 H-pirrol se muestra a continuación: En una realización preferida, el agente anti-tumoral es meloxicam. La estructura para meloxicam se muestra a continuación: otros inhibidores útiles como agentes anti-tumorales usados junto con el compuesto de fórmula 1 y composiciones farmacéuticas descritas en este documento, incluyendo aspirina y fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) que inhiben la enzima que produce prostaglandinas (ciclooxigenasa I y II), dando como resultado niveles más bajos de prostaglandinas, incluyen aunque sin limitación los siguientes, Salsalato (Amigesic), Diflunisal (Dolobid), Ibuprofeno (Motrin), Ketoprofeno (Orudis), Nabumetona (Relaten), Piroxicam (Feldene), Naproxeno (Aleve, Naprosyn), Diclofenaco (Voltaren), Indometacin (Indocin), Sulíndac (Clinoril), Tolmetin (Tolectin), Etodolac (Lodine), Ketorolac (Toradol), Oxaprozin (Daypro) y combinaciones de los mismos. Los inhibidores de COX-I preferidos incluyen ibuprofeno (Motrin), nuprin, naproxeno (Aleve), indometacina (Indocin), nabumetona (Relaten) y combinaciones de los mismos. Los agentes dirigidos usados junto con el compuesto de fórmula 1 y composiciones farmacéuticas descritas en este documento incluyen inhibidores de EGFr tales como Iressa (gefitínib, AstraZeneca), Tarceva (erlotinib u OSI-774, OSI Pharmaceuticals Inc.), Erbitux (cetuximab, Imclone Pharmaceuticals, Inc.), EMD-7200 (Merck AG), ABX-EGF (Amgen Inc. y Abgenix Inc.), HR3 (Cuban Goverment), anticuerpos IgA (University of Erlangen-Nuremberg), TP-38 (IVAX), proteína de fusión de EGFR, vacuna de EGF, inmunoliposomas anti-EGFr (Hermes Biosciences Inc.) y combinaciones de los mismos Los inhibidores de EGFr preferidos incluyen Iressa, Erbitux, Tarceva y combinaciones de los mismos. La presente invención también se refiere a agentes anti-tumorales seleccionados entre inhibidores del receptor pan erb o inhibidores del receptor ErbB2, tales como CP-724.714 (Pfizer, Inc.), CI-1033 (canertinib, Pfizer, Inc.), Herceptin (trastuzumab, Genentech Inc.), Omitarg (2C4, pertuzumab, Genentech Inc.), TAK-165 (Takeda), GW-572016 (lonafamib, GlaxoSmithKIine), GW-282974 (GlaxoSmithKIine), EKB-569 (Wyeth), PKI-166 (Novartis), dHER2 (HER2 Vaccine, Corixa y GlaxoSmithKIine), APC8024 (HER2 Vaccine, Dendreon), anticuerpo bíespecífico anti-HER2/neu (Decof Cáncer Center), B7.her2.lgG3 (Agensys), AS HER2 (Research Institute for Rad Biology & Medicine), anticuerpos biespecíficos trifuncionales (University of Munich) y mAB AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc) y mAB 2B-1 (Chiron) y combinaciones de los mismos. Los agentes anti-tumorales erb selectivos preferidos incluyen Herceptin, TAK-165, CP-724.714, ABX-EGF, HER3 y combinaciones de los mismos. Los inhibidores del receptor pan erbb preferidos incluyen GW572016, CI-1033, EKB-569, y Omitarg y combinaciones de los mismos. Otros inhibidores de erbB2 adicionales incluyen los descritos en los documentos WO 98/02434 (publicado el 22 de enero de 1998), WO 99/35146 (publicado el 15 de julio de 1999), WO 99/35132 (publicado el 15 de julio de 1999), WO 98/02437 (publicado el 22 de enero de 1998), WO 97/13760 (publicado el 17 de abril de 1997), WO 95/19970 (publicado el 27 de julio de 1995), la Patente de Estados Unidos 5,587,458 (expedida el 24 de diciembre de 1996), y la Patente de Estados Unidos 5,877,305 (expedida el 2 de marzo de 1999), cada una de las cuales se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. También se describen inhibidores del receptor ErbB2 útiles en la presente invención en las Patentes de Estados Unidos N° 6,465,449, y 6,284,764, y la Solicitud Internacional N° WO 2001/98277 cada uno de los cuales se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Adicionalmente, pueden seleccionarse otros agentes antitumorales entre los siguientes agentes, BAY-43-9006 (Onyx Pharmaceuticals Inc.), Genasense (augmerosen, Genta), Panitumumab (Abgenix/Amgen), Zevalin (Schering), Bexxar (Coríxa/GlaxoSmithKIine), Abarelix, Alimta, EPO 906 (Novartis), díscodermolida (XAA-296), ABT-510 (Abbott), Neovastat (Aeterna), enzastaurina (Eli Lilly), Combrestatin A4P (Oxigene), ZD-6126 (AstraZeneca), flavopíridol (Aventis), CYC-202 (Cyclacel), AVE-8062 (Aventis), DMXAA (Roche/Antisoma), Thymitaq (Eximias), Temodar (temozolomida, Schering Plough) y Revilímd (Celegene) y combinaciones de los mismos. Pueden seleccionarse otros agentes anti-tumorales entre los siguientes agentes, CyPat (acetato de ciproterona), Histerelina (acetato de histrelina), Plenaíxis (depósito de abarelíx), Atrasentan (ABT-627), Satraplatino (JM-216), talomid (Talidomida), Teratope, Temilífeno (DPPE), ABI-007 (paclitaxel), Evísta (raloxifeno), Atamestano (Bíomed-777), Xyotax (paclitaxel de poliglutamato), Targetin (bexarotina) y combinaciones de los mismos. Adicionalmente, pueden seleccionarse otros agentes antitumorales entre los siguientes agentes, Trizaone (tirapazamina), Aposyn (exisulínd), Nevastat (AE-941), Ceplene (diclorhidrato de histamina), Orathecin (rubitecano), Virulizin, Gastrimmune (G17DT), DX-8951f (mesilato de exatecano), Onconasa (ranpirnasa), BEC2 (mitumoab), Xcytrin (motexafin gadolinio) y combinaciones de los mismos. Pueden seleccionarse agentes anti-tumorales adicionales entre los siguientes agentes, CeaVac (CEA), NeuTrexin (glucuronato de trimetresato) y combinaciones de los mismos. Pueden seleccionarse agentes anti-tumorales adicionales entre los siguientes agentes, OvaRex (oregovomab), Osidem (IDM-1), y combinaciones de los mismos. Pueden seleccionarse agentes anti-tumorales adicionales entre los siguientes agentes, Advexin (ING 201), Tirazone (tirapazamina), y combinaciones de los mismos. Pueden seleccionarse agentes anti-tumorales adicionales entre los siguientes agentes, RSR13 (efaproxiral), Cotara (1311 chTNT 1/b), NBI-3001 (IL-4) y combinaciones de los mismos. Pueden seleccionarse agentes anti-tumorales adicionales entre los siguientes agentes, Canvaxin, vacuna de GMK, PEG Interon A, Taxoprexin (DHA/paciltaxel) y combinaciones de los mismos. Otros agentes anti-tumorales preferidos incluyen el inhibitor PD325901 de MEK1/2 de Pfizer, el inhibidor ARRY-142886 de MEK de Array Biopharm, el inhibidor BMS-387.032 de CDK2 de Bristol Myers, el inhibidor PD0332991 de CDK de Pfizer y AXD-5438 de AstraZeneca y combinaciones de los mismos. Adicionalmente, también pueden utilizarse inhibidores de mTOR tales como CCI-779 (Wyeth) y derivados RAD001 de rapamicina (Novartis) y AP-23573 (Ariad), inhibidores SAHA de HDAC (Merck IncJAton Pharmaceuticals) y combinaciones de los mismos. Otros agentes anti-tumorales adicionales incluyen el inhibidor VX- 680 de aurora 2 (Vértex) y el inhibidor XL844 de Chk1/2 (Exilixis). Los siguientes agentes citotóxicos, por ejemplo, uno o más seleccionados entre el grupo constituido por epirrubicina (Ellence), docetaxel (Taxotere), paclitaxel, Zinecard (dexrazoxano), rituxímab (Rituxan) mesilato de imatinib (Gleevec), y combinaciones de los mismos, pueden usarse junto con el compuesto de fórmula 1 y composiciones farmacéuticas descritas en este documento. La invención también contempla el uso de los compuestos de la presente invención junto con terapia hormonal, incluyendo aunque sin limitación, exemestano (Aromasin, Pfizer Inc.), leuprorelina (Lupron o Leuplin, TAP/Abbott/Takeda), anastrozol (Arímidex, Astrazeneca), goserelina (Zoladex, AstraZeneca), doxercalciferol, fadrozol, formestano, citrato de tamoxifeno (tamoxifeno, Nolvadex, AstraZeneca), Casodex (AstraZeneca), Abarelix (Praecis), Trelstar y combinaciones de los mismos. La invención también se refiere a agentes de terapia hormonal tales como anti-estrógenos incluyendo, aunque sin limitación fulvestrant, toremifeno, raloxifeno, lasofoxifeno, letrozol (Femara, Novartis), anti-andrógenos tales como bicalutamida, flutamida, mifepristona, nilutamida, CasodexT^'-ciano-S-^-fluorofenilsulfonil^-hidroxí^-metil-S'-(trifluorometil)propionanilida, bicalutamída) y combinaciones de los mismos. Además, la invención proporciona un compuesto de la presente invención solo o en combinación con uno o más productos de cuidados de apoyo, por ejemplo, un producto seleccionado entre el grupo constituido por Filgrastim (Neupogen), ondansetron (Zofran), Fragmin, Procrit, Aloxi, Emend, o combinaciones de los mismos. Los agentes citotóxicos particularmente preferidos incluyen Camptosar, Erbitux, Iressa, Gleevec, Taxotere y combinaciones de los mismos. Los siguientes inhibidores de topoisomerasa I también pueden utilizarse como agentes anti-tumorales: camptotecína, irinotecano HCl (Camptosar), edotecarina, oratecína (Supergen), exatecano (Daiichi), BN-80915 (Roche) y combinaciones de los mismos. Los inhibidores de topoisomerasa II particularmente preferidos incluyen epirrubícina (Ellence). Los compuestos de la invención pueden usarse con agentes antitumorales, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos, agentes antitumorales obtenidos de plantas, derivados de camptotecina, inhibidores de tirosína quinasa, anticuerpos, interferones y/o modificadores de la respuesta biológica. Los agentes alquilantes incluyen, aunque sin limitación, N-óxido de mostaza nitrogenada, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán, busulfán, mitobronitol, carbocuona, tiotepa, ranimustina, nimustina, temozolomida, AMD-473, altretamina, AP-5280, apazicuona, brostalicín, bendamustina, carmustina, estramustina, fotemustina, glufosfamida, ifosfamida, KW-2170, mafosfamida y mitolactol; los compuestos alquilantes coordinados con platino incluyen aunque sin limitación, cisplatino, Paraplatino (carboplatino), eptaplatino, lobaplatino, nedaplatino, Eloxatin (Oxaliplatino, Sanofi) o satrplatino y combinaciones de los mismos. Los agentes alquilantes particularmente preferidos incluyen Eloxatin (Oxaliplatino).
Los antimetabolitos incluyen, aunque sin limitación, metotrexato, ribósido de 6-mercaptopurina, mercaptopurina, 5-fluorouracílo (5-FU) solo o en combinación con leucovorina, tegafur, UFT, doxifluridina, carmofur, cítarabina, citarabina ocfosfato, enocitabina, S-1 , Alimta (premetrexed disodio, LY231514, MTA), Gemzar (gemcitabina, Eli Lilly), fludarabina, 5-azacitidina, capecitabina, cladribína, clofarabina, decítabina, eflornitína, etinilcitidina, arabinósido de citosina, hidroxiurea, TS-1 , melfalán, nelarabina, nolatrexed, ocfosfato, premetrexed disodio, pentostatina, pelitrexol, raltitrexed, triapina, trimetrexato, vidarabína, vincristina, vinorelbina; o por ejemplo, uno de los anti-metabolitos preferidos descritos en la Solicitud de Patente Europea N° 239362 tal como ácido ?/-(5-[?/-(3.4-dihidro-2-metil-4-oxoquinazolin-6-¡lmetil)-?/-metilamino]-2-tenoil)-L-glutámico y combinaciones de los mismos. Los antibióticos incluyen antibióticos intercalantes aunque sin limitarse a: aclarubicína, actinomicina D, amrubicina, anamicina, adriamicina, bleomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, elsamitrucina, epirrubicina, galarrubicína, idarrubicina, mitomicina C, nemorrubicína, neocarzinostatina, peplomícina, pírarrubicína, rebecamicína, estimalamer, estreptozocina, valrubicina, zinostatina y combinaciones de los mismos. Las sustancias anti-tumorales obtenidas de plantas incluyen, por ejemplo, las seleccionadas entre inhibidores mitóticos, por ejemplo vinblastina, docetaxel (Taxotere), paclitaxel y combinaciones de los mismos. Los agentes inhibidores citotóxicos de topoisomerasa incluyen uno o más agentes seleccionados entre el grupo constituido por aclarubicina, amonafida, belotecano, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, 9-aminocamptotecina, diflomotecano, irinotecano HCl (Camptosar), edotecarina, epirrubicina (Ellence), etop?sido, exatecano, gimatecano, lurtotecano, mitoxantrona, pirarrubicína, pixantrona, rubitecano, sobuzoxano, SN-38, taflupósido, topotecano y combinaciones de los mismos. Los agentes inhibidores citotóxicos de topoisomerasa preferidos incluyen uno o más agentes seleccionados entre el grupo constituido por camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, 9-aminocamptotecina, irinotecano HCl (Camptosar), edotecarina, epirrubicina (Ellence), etopósido, SN-38, topotecano, y combinaciones de los mismos. Los agentes inmunológicos incluyen interferones y numerosos agentes potenciadores inmunes distintos. Los interferones incluyen ¡nterferón alfa, interferón alfa-2a, interferón, alfa-2b, interferón beta, interferón gamma-la, interferón gamma-1b (Actimmune), o interferón gamma-n1 y combinaciones de los mismos. Otros agentes incluyen filgrastim, lentinano, sizofilan, TheraCys, ubenimex, WF-10, aldesleuquína, alemtuzumab, BAM-002, dacarbazina, daclizumab, denileuquina, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab, imiquimod, lenograstim, lentinano, vacuna de melanoma (Corixa), molgramostím, OncoVAX-CL, sargramostim, tasonermin, tecleuquina, timalasin, tositumomab, Virulizin, Z-100, epratuzumab, mítumomab, oregovomab, pemtumomab (Y-muHMFG1), Provenge (Dendreon) y combinaciones de los mismos. Los modificadores de la respuesta biológica son agentes que modifican los mecanismos de defensa de organismos vivos o respuestas biológicas, tales como supervivencia, crecimiento, o diferenciación de células tisulares para dirigirlas para que tengan actividad anti-tumoral. Dichos agentes incluyen krestina, lentinano, sizofiran, picibanil, ubenimex y combinaciones de los mismos. Otros agentes anticáncer incluyen alitretínoína, ampligén, atrasentan bexaroteno, bortezomíb. Bosentan, calcitriol, exisulind, finasterida, fotemustina, ácido ibandrónico, miltefosina, mitoxantrona, l-asparaginasa, procarbazina, dacarbazina, hidroxícarbamida, pegaspargasa, pentostatína, tazaroteno, Telcyta (TLK-286, Telik Inc.), Velcade (bortemazib, Millenium), tretinoína, y combinaciones de los mismos. Otros compuestos anti-angíogénicos incluyen acitretina, fenretínida, talidomida, ácido zoledrónico, angiostatina, aplidina, cilengitida, combretastatina A-4, endostatina, halofuginona, rebimastat, removab, Revlimid, escualamina, ukrain, Vitaxina y combinaciones de los mismos. Los compuestos coordinados con platino incluyen aunque sin limitación, cisplatino, carboplatino, nedaplatíno, oxaliplatino, y combinaciones de los mismos. Los derivados de camptotecína incluyen aunque sin limitación camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, 9-aminocamptotecina, irinotecano, SN-38, edotecarina, topotecano y combinaciones de los mismos. Otros agentes antitumorales incluyen mitoxantrona, I-asparaginasa, procarbazina, dacarbazína, hidroxicarbamida, pentostatina, tretínoína y combinaciones de los mismos. También pueden utilizarse agentes anti-tumorales capaces de potenciar las respuestas inmunes antitumorales, tales como anticuerpos CTLA4 (antígeno de línfocito citotóxico 4), y otros agentes capaces de bloquear CTLA4, tales como MDX-010 (Medarex) y compuestos CTLA4 descritos en la Patente de Estados Unidos N° 6,682,736; y agentes antiproliferativos tales como otros inhibidores de la farnesil proteina transferasa, por ejemplo los inhibidores de la farnesil proteina transferasa. Además, los anticuerpos CTLA4 específicos que pueden usarse en la presente invención incluyen los descritos en la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/113,647 (presentada el 23 de diciembre de 1998) y en la Patente de Estados Unidos N° 6,682,736, incorporándose ambas en este documento como referencia su totalidad. Los anticuerpos IGF1 R específicos que pueden usarse en la presente invención incluyen los descritos en la Solicitud de Patente Internacional N° WO 2002/053596, que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. Los anticuerpos CD40 específicos que pueden usarse en la presente invención incluyen los descritos en la Solicitud de Patente Internacional N° WO 2003/040170 que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad. También pueden emplearse agentes de terapia génica como agentes anti-tumorales, tales como TNFerade (GeneVec), que expresa TNFalfa en respuesta a radioterapia. En una realización de la presente invención, pueden usarse estatinas junto con el compuesto de fórmula 1 y composiciones farmacéuticas. Las estatinas (inhibidores de la HMG-CoA reductasa) pueden seleccionarse entre el grupo constituido por Atorvastatina (Lipitor, Pfizer Inc.), Provastatina (Pravachol, Bristol-Myers Squibb), Lovastatina (Mevacor, Merck Inc.), Simvastatina (Zocor, Merck Inc.), Fluvastatina (Lescol, Novartis), Cerivastatina (Baycol, Bayer), Rosuvastatina (Crestor, AstraZeneca), Lovostatina y Niacina (Advicor, Kos Pharmaceuticals), derivados y combinaciones de los mismos. En una realización preferida, la estatina se selecciona entre grupo constituido por Atovorstatina y Lovastatina, derivados y combinaciones de los mismos. Otros agentes útiles como agentes anti-tumorales incluyen Caduet. Los procedimientos incluyen administrar el compuesto de fórmula 1 usando cualquier régimen de dosificación deseado. En una realización específica, el compuesto se administra una vez por día, aunque una administración más o menos frecuente pertenece al alcance de la invención. El compuesto de fórmula 1 puede administrarse en el mismo programa que el agente citotóxico con el que se coadministra. En casos en los que la semivida del agente citotóxico es larga (es decir, >10 horas) también puede considerarse administrar el compuesto de fórmula 1 solo el día después de administrar el agente citotóxico. El compuesto de fórmula 1 puede administrarse al mamífero, incluyendo un ser humano, preferiblemente por inyección intravenosa durante un periodo de 30 minutos. En otra realización de la presente invención, el compuesto de fórmula 1 se usa como radiosensíbilizador que potencia la eficacia de radioterapia. De acuerdo con la presente invención, el compuesto de fórmula ? puede usarse en combinación con cualquier tipo de radioterapia incluyendo radioterapia de emisión externa (XBRT) o teleterapia, braquiterapia o radioterapia de fuente sellada, radioterapia de fuente no sellada y radio-inmunoterapia. De acuerdo con la presente invención, para maximizar la respuesta tumoral clínica, habitualmente se da radiación en forma de fracciones diarias de 2-4Gy hasta una dosis total de 50-60 Gy. Un especialista en la técnica apreciará que los protocolos precisos diferirán dependiendo del sitio de la enfermedad y si la radiación se administra con intención curativa o como tratamiento paliativo. Puede encontrarse información adicional con respecto a diferentes tipos de radioterapia, por ejemplo, en "Absorbed Dose Determination in External Beam Radiotherapy," International Atomic Energy Agency, Viena, 2000, Technical Reports Series N° 398; "Principies and Practice of Brachytherapy: Usíng Afterloading Systems," Joslín y col. (Eds.), Arnold Publishers, 1a Edición, 2001 ; "Protón Therapy and Radiosurgery," Smit y col. (Eds.), Springer-Verlag Telos, 1a Edición, 2000; Greig y col. "Treatment with unsealed radioisotopes," Br. Med. Bull., 1973, 29(1):63-68; "Radioimmunotherapy of Cáncer," Abrams y col. (Eds.), Marcel Dekker, 1a Edición, 2000. La Patente de EEUU N° 6,649,645 enseña una terapia combinada de radiación e inhibidor de ciclooxigenasa-2 para el tratamiento de trastornos neoplásicos. En otra realización de la presente invención, el compuesto de fórmula 1 se usa en combinación con radioterapia y al menos un agente anti-tumoral. En otra realización de la presente invención, el compuesto de fórmula 1 se usa en combinación con radioterapia y al menos un radiopotencíador tal como, por ejemplo, antagonistas del receptor del factor de crecimiento. Los procedimientos y composiciones de la presente invención proporcionan uno o más beneficios. Una combinación del compuesto de fórmula 1 con quimioterapia o terapia de radiación de la presente invención puede administrarse a una dosis baja, es decir, a una dosis más baja que la que se ha usado convencionalmente en situaciones clínicas para cada uno de los componentes individuales administrados solos. Un beneficio de disminuir la dosis de las quimioterapias o terapias de radiación de la presente invención administradas a un mamífero incluye una disminución en la incidencia de efectos adversos asociados a dosificaciones más altas. Disminuyendo la incidencia de efectos adversos, se contempla una mejora de la calidad de vida de un paciente que está experimentando tratamiento de cáncer. Los beneficios adicionales de disminuir la incidencia de efectos adversos incluyen una mejora en la conformidad del paciente, y una reducción de la cantidad de hospitalizaciones necesarias para el tratamiento de efectos adversos.
Como alternativa, los procedimientos y combinación de la presente invención también pueden maximizar el efecto terapéutico a dosis más altas.
EJEMPLOS Los ejemplos y preparaciones proporcionados a continuación ilustran y ejemplifican las combinaciones, formas de dosificación y procedimientos de la presente invención. Se entiende que el alcance de la presente invención no está limitado de ningún modo por el alcance de los siguientes ejemplos.
Materiales Todos los compuestos químicos se obtuvieron de Sigma (Poole, Dorset, UK) salvo que se indique otra cosa. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) se obtuvo de Gibco (Paisley, UK), la sacarosa, el hidróxido sódico y el cloruro potásico se suministraron por BDH (Lutterworth, UK) y la digítonina por Boehringer Mannheim (Roche Díagnostics, Lewes, UK). El kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Perbio Science, Rockford, IL, EEUU) se usó para la determinación de las concentraciones de proteínas. La leche en polvo se obtuvo de Marvel Premier Brands UK Ltd (Spalding, UK), y los kits de Detección de Transferencias de Western ECL de Amersham (Little Chalfont, UK). Nycomed® Lymphoprep se obtuvo de Axis-Shield (Oslo, Noruega) y los tubos de recogida de sangre con EDTA de BD Vacutainer (Plymouth, UK). El anticuerpo primario monoclonal de ratón 10H se suministró generosamente por el Catedrático Alexander Bürkle, y el anticuerpo secundario de cabra anti-ratón (conjugado con HRP) se obtuvo de DAKO (Ely, UK). El oligonucleótido usado para estimular la actividad de PARP se sintetizó inicialmente por el Dr J Lunec (Northern Institute for Cáncer Research, Newcastle), y los suministros posteriores se obtuvieron de Invitrogen (Glasgow, UK). El polimero poli(ADP ribosa) (PAR) se obtuvo de BIOMOL Research Lab (Plymouth, PA, EEUU).
Cultivo tisular de células SW620 y L1210 (control de calidad) Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Sigma) suplementado con suero de ternero fetal al 10% (v/v) (Invitrogen) y 1 U/ml de solución de penicilina-estreptomicina (Sigma), en una incubadora Hereus (Fischer Scientific, Manchester, UK) mantenida a 37°C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5% en aire. Las células L1210 usadas se obtuvieron de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) y se hicieron crecer como una suspensión a una densidad de aproximadamente 6x105/ml en la recogida, para asegurar el crecimiento exponencial. Se resuspendieron alícuotas de 1x106 células para su uso como muestras de control de calidad en 1 ml de medio más DMSO al 10% (v/v) y suero de ternera fetal al 10% (v/v) y se congelaron a -80°C.
Preparación de muestras de xenoinjerto tumoral Los tumores se escindieron y se congelaron rápidamente en nitrógeno liquido y se almacenaron a -80°C hasta que se homogeneizaron para el análisis. La muestra se descongeló en hielo y se anotó el peso en seco. El tejido se homogeneizó usando un instrumento Pro 2000 (Pro Scientific Inc, Monroe, CT, EEUU) en 3 volúmenes (es decir, 1 mg más 3 µl de tampón isotónico - Hepes 7 mM, KCl 26 mM, dextrano 0.1 mM, EGTA 0.4 mM, MgCI2 0.5 mM, sacarosa 45 mM, pH 7.8), dando un homogeneizado con una dilución global de 1 en 4. El homogeneizado se mantuvo en hielo durante todo el procedimiento, y la homogeneización se realizó en ráfagas de 10 segundos para evitar el calentamiento excesivo de la muestra. Antes del ensayo, las muestras se diluyeron adicíonalmente con tampón isotóníco cuando era necesario dando una dilución final de 1 en 40 para el ensayo de incorporación de [32P]NAD o 1 en 1000 para el ensayo de inmunotransferencia.
Preparación de PBL y muestras tumorales Se recogió sangre completa en tubos vacutainer con EDTA y se obtuvieron PBL humanos por linfopreparación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las biopsias tumorales se recogieron de la sala de operaciones en un recipiente estéril y se colocaron inmediatamente en hielo. En 30 minutos, las muestras tumorales se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C hasta la homogeneización para el análisis. La muestra se descongeló en hielo y se anotó el peso en seco. Para pesos por encima de 100 mg, el tejido se homogeneízó usando un instrumento Pro 2000 (Pro Scíentific Inc, Monroe, CT, EEUU) en 3 volúmenes (es decir, 1 mg más 3 µl de tampón isotónico - Hepes 7 mM, KCl 26 mM, dextrano 0.1 mM, EGTA 0.4 mM, MgCI2 0.5 mM, sacarosa 45 mM, pH 7.8), dando un homogeneízado con una dilución global de 1 en 4. Cuando se habían obtenido muestras más pequeñas, se homogeneizaron en 99 ó 999 volúmenes, dando diluciones finales de 1 en 100 y 1 en 1000, respectivamente. El homogeneizado se mantuvo en hielo durante todo el procedimiento, y la homogeneización se realizó en ráfagas de 10 segundos para evitar un calentamiento excesivo de la muestra. Salvo que se ensayaran en el día de la homogeneización, las muestras se volvieron a congelar a -80°C y se almacenaron a esta temperatura hasta que se analizaron. Antes del ensayo, las muestras se diluyeron adícionalmente con tampón isotóníco cuando fue necesario, dando una dilución final de 1 en 1000.
Ensayo de PARP usando incorporación de [32P1NAD Como se describe en: Calabrese CR, Almassy R, Barton S, Batey MA, Calvert AH, Canan-Koch S, Durkacz BW, Hostomsky Z, Kumpf RA, Kyle S, Li J, Maegley K, Newell DR, North M, Notarianni E, Stratford IJ, Skalitzky D, Thomas HD , Wang L-Z, Webber SE, Williams KJ y Curtin NJ. Preclinical evaluation of a novel poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) inhibitor, AG14361 , with significant anticancer chemo- y radio-sensitizatíon activity. JNCI 96 56-67 (2004) y Bowman KJ, Newell DR, Calvert AH y Curtin NJ. Dífferential effects of the poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor NU1025 on topoisomerase I y II inhibidor cytotoxicity. Br. J Cáncer 84 106-112 (2001). basándose en procedimientos publicados previamente (Halldorsson H., Gray D. A., y Shall S. (1978). Poly(ADP-ribose)polymerase activity in nucleotide permeable cells. FEBS Letters 85: 349-352, Grube, K., Küpper, J.H. & Bürkle, A. Direct stimulation of poly(ADP-ribose) polymerase in permeabilised cells by double-stranded DNA oligomers. Anal. Biochemistry. 1991 ; 193: 236-239). La inhibición de PARP se determinó en células permeabilizadas con digitonina (0.15 mg/ml) (8x 105- 1x106/reacción), estimuladas con oligonucleótido de ADN de doble cadena de 12 unidades de extremos romos añadido de manera exógena (2.5 µg/ml), midiendo la inhibición de la incorporación de NAD+ 75 µM + [32P]NAD+ (Amersham), en las macromoléculas celulares durante una incubación de 6 min a 25°C, que después precipitaron en TCA al 10% enfriado en hielo, NaPPi al 10% p/v) como se ha descrito previamente. En resumen, las células se suspendieron en tampón hipotónico (HEPES 9 mM pH 7.8, dextrano al 4.5% (v/v), MgCI2 4.5 mM y DTT 5 mM) a 1.5 x 107/ml en hielo durante 30 minutos, y después se añadieron 9 vol de tampón isotónico (HEPES 40 mM pH 7.8, KCl 130 mM, dextrano al 4% (v/v), EGTA 2 mM, MgCI22.3 mM, sacarosa 225 mM y DTT 2.5 mM). La reacción se inició añadiendo 300 µl de células 100 µl de NAD+ 300 µM que contenía [32P]-NAD+ (Amersham, UK), y se terminó por la adición de 2 ml de TCA al 10% (p/v) + fosfato sódico al 10% (p/v) enfriado en hielo.
Después de 30 min en hielo, los polímeros de ADP marcados con 32P -ribosa se filtraron en filtros Whatman GC/C (Whatman International Ltd, Kent, UK), se lavaron 5 veces con TCA al 1% (v/v) / pirofosfato sódico al 1% (v/v), se secaron y se contaron. Los valores de Cl50 de inhibición de PARP se calcularon a partir de curvas ajustadas con programas informáticos (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Los homogeneizados tumorales se ensayaron de una forma similar; sin embargo, el procedimiento de homogeneizacíón introduce suficiente daño al ADN para estimular al máximo la actividad de PARP y, por lo tanto, no se necesitó el oligonucleótido. Los resultados se expresan en términos de pmol de PAR anterior por mg de tumor.
Ensayo de PARP usando anticuerpos monoclonales Como se describe en Plummer ER, Middleton MR, Jones C, Olsen A, Hickson I, McHugh P, Margison G, McGown G, Thorncroft M, Watson AJ, Boddy AV, Calvert AH, Harris AL, Newell DR, Curtin NJ. Temozolomide pharmacodynamics in patients with metastatic melanoma: DNA damage and activíty of repair enzymes ATase and PARP-1. Clinical Cáncer Research. 11 3402-3409 (2005) basándose en la modificación de procedimientos publicados previamente (Pfieffer R, Brabeck C, Burkle A: Quantitative nonisotopic immuno-dot-blot method for the assessment of cellular poly(ADP-ribosyl)ation capacity. Analytical Biochemistry 1999; 275:118-122). Las células cultivadas o preparaciones de linfocitos rápidamente descongeladas se lavaron dos veces en PBS enfriado en hielo. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 0.15 mg/ml de digitonina a una densidad de aproximadamente 1-2 x106 células por ml durante 5 minutos para permeabilizar las células, después de lo que se añadieron 9 volúmenes de tampón enfriado en hielo (HEPES 7 mM, KCl 26 mM, dextrano 0.1 mM, EGTA 0.4 mM, MgC 0.5 mM, sacarosa 45 mM, pH 7.8) y la muestra se colocó en hielo. Se contó la densidad de células permeabilizadas (es decir, teñidas con azul de tripán) y la suspensión celular se diluyó si era necesario con el tampón anterior para conseguir una densidad celular que permitiera añadir a cada tubo de reacción 20.000 células permeabilizadas. En el ensayo se midió la actividad de PARP estimulada al máximo por exposición a un oligonucleótido de extremos romos en presencia de sustrato NAD+ [25], a 26°C en un baño de agua oscilante. Se mezclaron cinco µl de NAD+ 7 mM y 5 µl de 200 µg/ml de oligonucleótido palindrómico (CGGAATTCCG) con células permeabilízadas y tampón de reacción (Tris HCl 100 mM, MgCI2 120 mM, pH 7.8) a un volumen final de 100 µl. La reacción se paró después de 6 minutos por la adición de inhibidor de PARP en exceso (400 µl de Compuesto I 12.5 µM) y las células se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Hybond N, Amersham) usando un colector de 24 pocilios. Se cargó una curva patrón de PAR purificado en cada membrana (0-25 pmol de equivalente monomérico) para permitir la cuantificación. La incubación durante una noche con el anticuerpo primario (1 en 500 en PBS-MT (PBS más Tween 20 al 0.05% Más Leche en polvo al 5%) a 4°C se siguió de 2 lavados en PBS-T (PBS más Tween 20 al 0.05%) y después incubación en anticuerpo secundario (1 en 1000 en PBS-MT) durante 1 hora a temperatura ambiente. La membrana incubada se lavó frecuentemente con PBS durante el transcurso de una hora y después se expuso durante un minuto a solución de reacción ECL suministrada por el fabricante. Se midió la quimioluminiscencia detectada durante una exposición de 5 minutos usando un iluminador de UV Fuji LAS3000 UV (Raytek, Sheffield, UK) y se dígitalizó usando el software de formación de imágenes (Fuji LAS Image versión 1.1 , Raytek). La imagen conseguida se analizó usando un Analizador de Imagen Aida (versión 3.28.001 ), y los resultados se expresaron en LAU/mm2. Se midieron las áreas de fondo en la transferencia expuesta y la media de la señal de fondo de la membrana se restó de todos los resultados. La curva patrón del polímero PAR se analizó usando un modelo de regresión no lineal de unión a un sitio no ponderado y la lectura de las incógnitas de la curva patrón generada de ese modo. Los resultados después se expresaron en relación a la cantidad de células cargadas. Se procesaron muestras QC por triplicado de 5000 células L1210 con cada ensayo, analizando todas las muestras de un paciente en la misma transferencia. Los homogeneizados tumorales se ensayaron de un modo similar; sin embargo, el procedimiento de homogeneización introduce suficiente daño al ADN para estimular al máximo la actividad de PARP y por lo tanto no se necesitó el oligonucleótido. La concentración de proteínas del homogeneizado se midió usando el ensayo de proteína BCA y el lector de placas Titertek Multiscan MCC/340. Los resultados se pueden expresar en términos de pmol de PAR anterior por mg de proteína o por mg de tumor. El ensayo de actividad de PARP en monocitos sanguíneos periféricos (PBMC) se basa en el procedimiento de Boulton y col. ("Potentiation of temozolomide-induced cytotoxicity: a comparative study of the biological effects of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors." 1995. British J.
Cáncer 72, 849-856). Todos los procedimientos deben realizarse a 0-4°C.
Preparación de PBMC 1. Recoger 5 ml de sangre en un tubo con Heparina de Litio y mezclar suavemente. 2. Diluir la sangre heparinizada 1 :1 con PBS en un tubo universal desechable de 30 ml (volumen final 10 ml). 3. Poner en capas cuidadosamente la sangre diluida sobre 8-10 ml de Lymphoprep pre-enfriado en un tubo universal desechable de 30 ml. Tener cuidado de no mezclar la sangre con el fluido de separación. 4. Centrifugar las muestras durante 15 minutos en un rotor de oscilación (Mistral centrifuge) a 800xG, a 4°C, velocidad de frenado 0. 5. Después de la centrifugación, debe verse una banda de leucocitos en la superficie de contacto. Esta banda celular debe recogerse usando una pipeta Pasteur de vidrio y ponerse en un tubo Universal desechable de 30 ml. 6. Diluir la suspensión de linfocitos con 20 ml de PBS enfriado en hielo y centrifugar las células durante 10 minutos a 500xG, 4°C. 7. Retirar el sobrenadante. 8. Resuspender el sedimento en 20 ml PBS enfriado en hielo y centrifugar a 333xG / 4°C durante 5 minutos. 9. Retirar el sobrenadante y resuspender las células en 500 µl de medio pre-enfriado (RPMI más suero de ternera fetal al 10%) suplementado con DMSO al 10%. 10. Transferir a un tubo Eppendorf tapado a rosca etiquetado y congelar. 11. Almacenar a -70°C.
Ensavo de PARP de PBMC 1. Se prepara solución de 32P NAD 600 µM reciente en el día del experimento como se ha detallado anteriormente. Se retira el oligonucleótido de reserva del almacenamiento y se descongela. 2. Se calienta un baño de agua a 26°C y se ajusta para que se agite a 70 oscilaciones por minuto. 3. Los tubos de ensayo de reacción se preparan del siguiente modo. 4. Cada muestra de PBMC y un patrón QC se ensaya por triplicado, con muestras TO, + oligo y - oligo x 3. (Total de 9 tubos por muestra.) 5. Se calcula la densidad celular en cada suspensión. Se diluye 1 :1 una muestra de 10 µl de cada suspensión celular con Azul de Tripán y se cuenta la cantidad de células permeabilízadas por ml en un hemocitómetro. 6. Se calientan los tubos de ensayo de reacción y la suspensión de células permeabilizadas en el baño de agua a 26°C durante 7 minutos. 7. La suspensión celular permeabílizada se agita en vórtice brevemente y la reacción se inicia añadiendo 300 µl (aprox. 1x106 células) de a cada tubo de reacción de ensayo. 8. La reacción se para exactamente 6 minutos después de la adición de las células añadiendo 2 ml de TCA al 10% + NaPPi al 10% enfriado en hielo y agitando en vórtice. 9. El tubo después se incuba en hielo durante al menos una hora (en esta fase del ensayo la precipitación debe suceder, durante al menos una hora, los tubos de ensayo pueden dejarse durante una noche si la temperatura se mantiene a =4°C) antes de la filtración. 10. Se añaden 2 ml TCA al 10% + NaPPi al 10% enfriado en hielo a los tubos T0 antes de la adición de las células permeabilizadas, para corregir la unión no específica del radiomarcador al filtro.
Preparación de muestras de tumor/tejido 1. Se pesan las muestras de tumor congeladas 2. Se añaden 3 volúmenes (es decir, 3 µl de solución añadida por cada 1 mg de tejido) de tampón isotónico más DTT a la muestra de tumor. Esto se almacena en hielo hasta y durante la homogeneización. 3. La muestra se homogeneiza en hielo en una cámara de Clase II durante ráfagas de 10 segundos hasta que se ven trozos macroscópicos detectables de tejido. 4. Se diluye 1 en 10 suficiente volumen del homogeneizado con tampón isotónico más DTT para proporcionar una dilución global de 1 en 40 de la muestra original. Un volumen final de 3 ml es suficiente para hacer muestras triplicadas y el posterior ensayo de proteínas. 5. El homogeneizado diluido se almacena en hielo y se ensaya en una hora del siguiente modo.
Ensayo de PARP de muestras de tumor/tejido 1. Se prepara una solución de 32P NAD 600 µM reciente en el día del experimento como se ha detallado anteriormente. Se retira la reserva de oligonucleótido del almacenamiento y se descongela. 2. Se calienta un baño de agua a 26°C y se ajusta para que se agite a 70 oscilaciones por minuto. 3. Los tubos de ensayo de reacción se preparan según el cuadro A para las muestras QC y según el cuadro B para el homogeneizado.
CUADRO A CUADRO B 4. Cada muestra QC se ensaya por triplicado, con muestras T0, + oligo y - oligo x 3. (Total de 9 tubos por muestra, si el recuento de células es bajo, se omiten las muestras -oligo.) Los homogeneizados también se ensayan por triplicado con muestras T0 y de reacción x3. (Total 6 tubos por muestra). 5. Se añaden 2 ml de TCA al 10% + NaPPi al 10% enfriado en hielo a los tubos TO antes de la adición del homogeneizado o las células, para corregir la unión no específica del radio-marcador al filtro. 6. Los homogeneizados de los tubos de ensayo de reacción y las células QC se calientan en el baño de agua a 26°C durante 7 minutos. 7. Cada preparación se agita en vórtice brevemente y la reacción se inicia añadiendo 300 µl de ésta a cada tubo de reacción. 8. La reacción se para exactamente 6 minutos después de la adición del homogenizado añadiendo 2 ml de TCA al 10% + NaPPi al 10% enfriado en hielo y agitando con vórtice. 9. Después, el tubo se incuba en hielo durante al menos una hora antes de la filtración. 10. Se diluye 1 :1 una muestra de 10 µl de la suspensión QC con Azul de Tripán y se cuenta la cantidad de células permeabilizadas por ml en un hemocitómetro. 11. Los homogeneizados restantes se centrifugan a 500 xG durante 5 minutos a 4°C, se retiran 200 µl del sobrenadante y se ponen en un microtubo tapado a rosca etiquetado para la medición de proteínas. Las muestras de sobrenadante se pueden almacenar durante al menos un mes a -20°C si no se ensayan inmediatamente.
EJEMPLO 1 Inhibición de Poli-ADP-ribosa Polimerasa El análisis cristalográfico del compuesto de fórmula 1 unido a la enzima diana inhibida reveló que el fármaco se une al sitio activo de PARP-1 , formando 3 enlaces de hidrógeno. La actividad inhibidora de la enzima PARP del compuesto de fórmula 1 se ensayó como se describe en la Patente de EEUU 6,495,541. La K, determinada usando la incorporación de 32P-NAD+ en el polímero por PARP-1 humana de longitud completa purificada, is 1.4 nM (Cuadro 3). El compuesto de fórmula 1 también es un potente inhibidor de PARP-2 (K, = 0.17 nM) y, en base a las fuertes similitudes estructurales en las secuencias de aminoácidos entre las diversas enzimas de la familia PARP (tankirasa, V-PARP), la sal fosfato del compuesto de fórmula 1 (Compuesto I) probamente también se unirá con alta afinidad a estas enzimas. + CUADRO 3 Constantes Cinéticas para la Interacción del compuesto de fórmula 1 con PARP Compuesto K, PARP-1 K, PARP-2 (nM ± SD*) (nM ± SD*) compuesto de 1 ,4 ± 0,2 0,17 ± 0,05 fórmula 1 SD=desviación típica EJEMPLO 2 Inibhición de crecimiento celular La actividad inhibidora del crecimiento intrínseco del compuesto de fórmula 1 después de exposición continua de 5-días (Cuadro 4) se determinó en las líneas celulares A549, LoVo y SW620 como se describe en la Patente de EEUU 6,495,541. Los valores de IG50 (la concentración necesaria para inhibir el crecimiento en un 50%) variaron de 7 a 12 µM. De manera similar, se determinó la capacidad del compuesto de fórmula 1 0.4 µM (es decir, <5% de la CI50) para aumentar la potencia inhibidora del crecimiento de temozolomida y topotecano (Cuadro 2). El factor de potenciación a la concentración CI50; FP50, se calculó como: IG50 de temozolomida o topotecano solo/ IG50 de temozolomida o topotecano + 0.4 µM del compuesto de fórmula 1. Hubo una disminución de 8 veces en la IG50 de temozolomida en las células LoVo y una disminución de 3.5 veces en la IG50 de temozolomida en células A549 después de la adición de 0.4 µM del compuesto de fórmula 1. Hubo una disminución de 1.6 veces en la IG50 de topotecano en las células LoVo y una disminución de 2.6 veces en la CI50 de topotecano tanto en células A549 como SW620 después de la adición de 0.4 µM del compuesto de fórmula 1.
CUADRO 4 Inhibición del Crecimiento Celular por el compuesto de fórmula 1 y Potenciación de Temozolomida y Topotecano por 0.4 µM del compuesto de fórmula 1 Línea celular A549 LoVo SW620 IG50 del compuesto of formula 1 7 12 11 (µM) FP50 de Temozolomida 3 5 8 1 FP50 de Topotecano 1 6 1 7 2 6 EJEMPLO 3 Quimiosensibilización de Agentes Quimioterapéuticos Convencionales por el Compuesto I Los estudios in vitro de células tumorales humanas realizados de acuerdo con el procedimiento descrito en la Patente de EEUU 6,495,541 han demostrado que a concentraciones sub-micromolares, el compuesto de fórmula 1 potencia la sensibilidad de células a temozolomida y los inhibidores de topoisomerasa tipo I, topotecano y SN-38 (el metabo to activo de ipnotecano) frente a células de cáncer de pulmón macrocítico H460 (NSCLC) (Cuadro 5) CUADRO 5 Efecto del compuesto de fórmula 1 en forma de Sal Glucuronato sobre la Potencia In Vitro de Agentes Quimioterapéuticos Convencionales en Células de NSCLC H460 Humanas Agente quimioterapéutíco Tipos FP50 (H460)a Paclitaxel Antagonista de microtúbulo 0.77 5-Fluorouracilo Antagonista de pirimidina 0.92 Gemcitabína Antagonista de pírimídina 1.2 6-tioguanina Antagonista de purina 1.1 Doxorrubicina Antibiótico de antraciclina 1.1 Oxaliplatino Compuesto de platino 0.98b Císplatino Compuesto de platino 1.2 Etopósido Inhibidor de topoisomerasa II 0.75 b Topotecano Inhibidor de topoisomerasa I 1.6 SN-38 Inhibidor de topoisomerasa I 2.2 Temozolomida Agente de metilación monofuncional 3.7 b a FP50= IG50 (Agente Único)/ IG50 (Agente +0.4 µM del compuesto de fórmula 1) en células de NSCLC H460 Humanas. b En estos experimentos, la sal glucuronato de fórmula 1 se sustituyó por el Compuesto I (la sal fosfato del compuesto de fórmula 1).
EJEMPLO 4 Inhibición del Agotamiento de NAD Celular y Formación de Polimero Poli-ADP-ribosa por el compuesto de fórmula 1 Se cuantificaron los polímeros de Polí(ADP_ribosa) y NAD+ como se describe por Abou-Ela y col (Anal Biochem. (1988), 174:239-250) con modificaciones minoritarias del siguiente modo. Se sembraron células A549 (ATCC, Rockville, MD.) en placas de cultivo de 35 mm y se dejaron crecer hasta la confluencia. Se retiró el medio y se remplazó por medio fresco que contenía 20-50 µCi mi"1 [3H] adenina. Las células se marcaron durante 16 h a 37°C. El medio se remplazó por medio fresco durante 45 min antes de la manipulación experimental. Después de la manipulación experimental, el medio se retiró y las células se aclararon con solución salina tamponada con fosfato enfriada en hielo, pH 7.2, y se recogieron por la adición de 1 ml de ácido tricloroacético al 20% enfriado en hielo. Se retiró el material insoluble en ácido de las placas raspando. Las placas se lavaron una vez con 1 ml de ácido tricloroacético al 20% y las muestras se sometieron a centrifugación. El sobrenadante se guardó para la determinación del NAD+. El sedimento se disolvió en 0.2 ml de ácido fórmico al 98% enfriado en hielo, después se diluyó a 10 ml con H2O desionizada enfriada en hielo. Se añadieron doscientos microlitros de 10 mg/ml de albúmina de suero bovino para facilitar la precipitación. La concentración de ácido tricloroacético se ajustó al 20% por la adición de 2.55 ml de ácido tricloroacético al 100%. La fracción insoluble en ácido se recogió por centrifugación. Determinación de NAD*. El sobrenadante de ácido tricloroacético se diluyó a 10 ml con formiato amónico 250 mM, pH 8.6, y se ajustó a pH 8.6 con hidróxido amónico concentrado. La muestra se aplicó a una columna de 0.5 ml de DHB-Sepharose que se había pre-lavado con 10 ml de formiato amónico 250 mM, pH 8.6. La columna se lavó con 10 ml de formiato amónico 250 mM, pH 8.6 y 2 ml de H2O. El NAD+ se eluyó con 4 ml de formiato amónico 250 mM, pH 4.5. Determinación de polímeros de ADP-ribosa. El sedimento insoluble en ácido se disolvió en 1 ml de cloruro de guanidinio, acetato amónico 250 mM, EDTA 10 mM, pH 6.0; y 1 ml de KOH 1 M, EDTA 100 mM. La muestra se incubó a 37°C durante 2 h. La muestra se diluyó a 10 ml con cloruro de guanidinio 1 M, acetato amónico 250 mM, EDTA 10 mM, pH 9.0 (tampón A), se ajustó a pH 9.0 y se aplicó a una columna de 0.5 ml de DHBB (Bio Rad) que se había pre-lavado con 5 ml de H2O y 10 ml de tamp?n A. Después de la aplicación, la columna se lavó con 25 ml de tampón A, seguido de 10 ml de bicarbonato amónico 1 M, EDTA 1 mM, pH 9.0. La poli(ADP-ribosa) se eluyó con 0.5 ml de H2O. La muestra se liofilizó a sequedad, después se suspendió en 2 ml de MOPS 50 mM, McG¡n 5 mM pH 7.5. La suspensión se digirió por la adición de 1 unidad de fosfodiesterasa 1 de veneno de Serpiente (Worthington Biochemicals) y 1 unidad de BAP durante 3 h a 37° C. Análisis de HPLC: el análisis se realizó por HPLC en una columna de fase inversa de 5 µm Beckman C18 ODS, con una fase móvil de formiato amónico 7 mM y metanol al 7% a un caudal de 1 ml/min. Cada muestra se co-inyectó con 10 nmol de adenosina y de desoxiadenosina. Se recogió una fracción de columna de un mililitro y se contó en 5 ml de fluido de centelleo. La potenciación in vitro de temozolomída por el compuesto de fórmula 1 tiene correlación con la inhibición del agotamiento de NAD celular inducido por agentes alquilantes y el bloqueo de la formación de polímero de poli-ADP-ribosa con un intervalo eficaz de 5 a 400 nM. Después del daño del ADN, el NAD celular se incorpora rápidamente en el polímero de poli-ADP-ribosa. El compuesto de fórmula 1, 5 nM (FP50 = 1.3), reduce enormemente el consumo de NAD celular inducido por MNNG e inhibe la formación de poli-ADP-ribosa celular en un 89% (Cuadro 6). El compuesto de fórmula 1 aumenta la potencia de temozolomida en células A549 al menos 2 veces a concentraciones tan bajas como 50 nM, que corresponden a una inhibición del 93% del agotamiento de NAD inducido por MNNG y una inhibición del 95% de la formación de polímero poli-ADP-ribosa. El compuesto de fórmula 1 también inhibe la actividad catalítica de PARP, medida como inhibición del consumo de NAD celular en células leucemia de ratón P388 y linfocitos sanguíneos periféricos de ratón después de la activación de PARP por MNNG, peróxido de hidrógeno o radiación gamma (datos no mostrados).
CUADRO 6 Inhibición de Actividad de PARP por el compuesto de fórmula 1 en células A549 In Vitro MNNG El compuesto Concentración de fórmula 1 NAD Polímero FP50 FP50 Concentración (%DMSOa) (%MNNGb) (Topotecano) (Temozolomida) Ninguno3 Ninguno 100a 1 25 µMb Ninguno 44 100 25 µM 0.0005 µM 77 40 1.4 1 25 µM 0.005 µM 95 11 1.8 1.3 25 µM 0.05 µM 96 5 2.1 2.2 25 µM 0.1 µM 97 4 2.2 2.6 25 µM 0.4 µM 97 4 2.4 3.5 a Control con DMSO b control sólo con MNNG EJEMPLO 5 Estudios de Eficacia Antitumoral In Vivo para el Compuesto de Fórmula 1 - Temozolomida Los experimentos in vivo se realizaron como se describe en Calabrese y col (JNCI (2004), 96:56-67). Para estos estudios, el cálculo de la dosis de Compuesto I (la sal fosfato) y la dosis de sal glucuronato se basaron en la base libre.
En estos estudios, el Compuesto I no mostró efectos antitumorales de agente único. En estudios de combinación el Compuesto I aumentó la potencia de dosis de irradiación gamma, irinotecano, y temozolomida. En un experimento de dosis única el compuesto de fórmula 1 potenció los efectos antitumorales de 200 mg/kg de temozolomida en un intervalo de 10 veces de dosificaciones no tóxicas en el xenoinjerto de carcinoma de colon humano SW620 en ratones (Cuadro 7).
CUADRO 7 Actividad In Vivo Activity del Compuesto de Fórmula 1 en Combinación con una Dosis Única de Temozolomida Frente al Xenoinjerto de Carcinoma de Colon SW620 Humano Modelo tumoral Dosis Dosis Régimen0 Potenciamiento Temozolomida3 compuesto de (%)d fórmula 1 b SW620 200 mg/kg 0.1 mg/kg Dosis única 50e SW620 200 mg/kg 0.3 mg/kg Dosis única 80e SW620 200 mg/kg 1 mg/kg Dosis única 107e SW620 200 mg/kg 5 mg/kg Dosis única 111 -' ' a la dosificación de Temozolomida se suministró por sonda oral. la dosificación del compuesto of fórmula 1 se suministró por inyección intraperitoneal. c n = 5 para todos los grupos. d %Potenciamiento = 100 x(Retraso con temozolomida + compuesto de Fórmula 1 - Retraso con temozolomida sola)/Retraso con temozolomida sola. El retraso se calcula como tiempo hasta RTV(volumen tumoral relativo)4 en el grupo tratado - tiempo hasta RTV4 en controles, donde RTV4 es el volumen tumoral equivalente a 4x el volumen tumoral al inicio del tratamiento. e Significativamente diferente del agente único de temozolomida (ensayo de Mann-Whitney) f 2 muertes debidas a toxicidad. En un experimento de dosis repetida (QD x 5 para cada agente) frente al xenoinjerto de SW620, el compuesto de fórmula 1 (en forma de sal glucuronato) a 0.05, 0.15, y 0.5 mg/kg en combinación con 68 mg/kg de temozolomida potenció la actividad de temozolomida en los 3 grupos de combinación (68 mg/kg de temozolomida) + 0.05, 0.15, ó 0.5 mg/kg de sal glucuronato del compuesto de fórmula 1. Se observó una proporción de disminución completa del 100% en los grupos de combinación con 0.15 ó 0.5 mg/kg de la sal glucuronato del compuesto de fórmula 1. No se observó pérdida de peso corporal con combinaciones de dosis de la sal glucuronato del compuesto de fórmula 1 (68 mg/kg de temozolomida + 0.05 ó 0.15 mg/kg de la sal glucuronato del compuesto de fórmula 1). Se observó una muerte tóxica con el grupo de combinación de dosis alta (68 mg/kg de temozolomida + 0.5 mg/kg de la sal glucuronato del compuesto de fórmula 1). En un experimento similar frente a xenoinjertos de LoVo, la sal glucuronato del compuesto de fórmula 1 (0.5 mg/kg) potenció la actividad antitumoral de temozolomída (68 mg/kg) en un 67% (Cuadro 8, Figura 1). No se observó pérdida de peso corporal en ningún grupo de dosis en el experimento de LoVo. En ningún estudio de combinación de observó antagonismo.
CUADRO 8 Eficacia de Temozolomida en Combinación con el Compuesto de Fórmula 1 En Forma de la Sal Glucuronato Frente a Xenoinjertos de SW620 y LoVo Modelo Dosis Dosis Régimen0 Potenciamiento6 tumoral Temozolomida3 el compuesto de (%) fórmula 1 b' c SW620 68 mg/kg 0.05 mg/kg Una vez al día durante 35 5 días SW620 68 mg/kg 0.15 mg/kg Una vez al dia durante 270f 5 días SW620 68 mg/kg 0.5 mg/kg Una vez al día durante >60, a 5 dias LoVo 68 mg/kg 0.05 mg/kg Una vez al día durante - 5 días LoVo 68 mg/kg 0.15 mg/kg Una vez al día durante - 5 días LoVo 68 mg/kg 0.5 mg/kg Una vez al dia durante 67f 5 dias a las dosificaciones de Temozolomida se suministraron por sonda oral. b las dosificaciones del compuesto de fórmula 1 se suministraron por inyección intraperitoneal. c el compuesto de fórmula 1 (equivalente de la base libre) dosificado en forma de sal glucuronato. d n = 5 para todos los grupos. e %Potenciamiento = 100 x(Retraso con temozolomida + compuesto de Fórmula 1 - Retraso con temozolomida sola)/Retraso con temozolomida sola. El retraso se calcula como tiempo hasta RTV(volumen tumoral relativo)4 en el grupo tratado - tiempo hasta RTV4 en controles, donde RTV4 es el volumen tumoral equivalente a 4x el volumen tumoral al inicio del tratamiento. f Significativamente diferente del agente único de temozolomida (Ensayo de Mann-Whitney) 9 1 muerte debida a toxicidad.
EJEMPLO 7 Estudios de Eficacia Antitumoral In Vivo Para El Compuesto De Fórmula 1 - Irinotecano Los experimentos in vivo se realizaron como se describe en Calabrese y col (J. Nati. Cáncer Inst. (2004), 96:56-67). Como agente único el inhibidor de la topoisomerasa I, irinotecano (25 mg/kg, QW x 3 IP), no inhibió significativamente el crecimiento tumoral de SW620. La combinación de 25 mg/kg de irinotecano con el compuesto de fórmula 1 dosificado en forma de sal glucuronato dio como resultado efectos antitumorales sustanciales y potenciamiento de la actividad de irinotecano en todos los grupos de combinación (25 mg/kg de irinotecano + 0.05, 0.15, ó 0.5 mg/kg del compuesto de fórmula 1 (Cuadro 9). No se observó toxicidad significativa en los grupos de agente único de irinotecano o en los grupos con irinotecano e inhibidor de PARP combinados. La inhibición del crecimiento tumoral (porcentaje de potenciamiento) aumentó con dosificaciones en aumento del compuesto de fórmula 1. En un experimento similar frente a xenoinjertos de LoVo el compuesto de fórmula 1 (0.5 mg/kg) potenció la actividad antitumoral de irinotecano (25 mg/kg) en un 86% (Cuadro 9). En ningún estudio de combinación se observó antagonismo.
CUADRO 9 Eficacia del Irinotecano en Combinación Con El Compuesto De Fórmula 1 en Forma de Sal Glucuronato Frente a Xenoinjertos de SW620 y LoVo a, e Modelo Dosis Dosis Régimen Potenciamiento tumoral Irinotecano3 el compuesto de (%) fórmula 1 GSM SW620 25 mg/kg 0.05 mg/kg Una vez a la semana x 3 700 SW620 25 mg/kg 0.15 mg/kg Una vez a la semana x 3 1100f SW620 25 mg/kg 0.5 mg/kg Una vez a la semana x 3 1100f LoVo 25 mg/kg 0.0 mg/kg Una vez a la semana x 3 0 LoVo 25 mg/kg 0.15 mg/kg Una vez a la semana x 3 71 LoVo 25 mg/kg 0.5 mg/kg Una vez a la semana x 3 86f a las dosificaciones de Irinotecano se suministraron por inyección intraperitoneal. b las dosificaciones de la sal glucuronato del compuesto de fórmula 1 se suministraron por inyección intraperitoneal. c n = 5 para todos los grupos. d %Potenciamiento = 100 x(Retraso con irinotecano + compuesto de Fórmula 1 - Retraso con irínotecano solo)/Retraso con irinotecano solo. El retraso se calcula como tiempo hasta RTV(volumen tumoral relativo)4 en el grupo tratado - tiempo hasta RTV4 en los controles, donde RTV4 es el volumen tumoral equivalente a 4x el volumen tumoral al inicio del tratamiento. e el compuesto de fórmula 1 (equivalente de la base libre) dosificado en forma de sal glucuronato. f Significativamente diferente del agente único de irinotecano (Ensayo de Mann-Whitney) EJEMPLO 8 Farmacodinámica del Compuesto de Fórmula 1 - Temozolomida El tratamiento de ratones que albergan el xenoinjerto de carcinoma de colon humano SW620 con 10 mg/kg del compuesto de fórmula 1 solo (QD x 5) dio como resultado una ausencia de retraso del crecimiento tumoral y fue no tóxico. El cuadro 10(a) representa la concentración en plasma y tumor del compuesto de fórmula 1 después de administración intraperitoneal de la sal fosfato (Compuesto I). En un experimento de combinación de dosis repetida (QD x 5 para cada agente) frente al xenoinjerto de SW620, 0.1 mg/kg del compuesto de fórmula 1 potenciaron los efectos antitumorales de 68 mg/kg de temozolomida en un 28% sobre los de 68 ó 136 mg/kg de temozolomida sola (Cuadro 10(b)). Aumentando la dosificación del compuesto de fórmula 1 a 1 mg/kg se potenciaron los efectos antitumorales de la temozolomida (68 mg/kg) en un 100 %. La combinación de 10 mg/kg del compuesto de fórmula 1 y 68 mg/kg de temozolomida fue tóxica. En un estudio paralelo los niveles en plasma y tumor del compuesto de fórmula 1 se midieron por un ensayo de HPLC/EM. Además se evaluó el grado de inhibición de la actividad catalítica de PARP en tumor usando la incorporación de P32-NAD en el polímero poli-ADP-ribosa en homogeneizados de tumores SW620 de animales tratados. A la dosificación eficaz del compuesto de fórmula 1 (1.0 mg/kg), las concentraciones en plasma del compuesto de fórmula 1 apenas fueron detectables a las 6 horas pero los niveles en tumor de 40 a 60 ng/ml fueron detectables a las 6 y 24 h después de la inyección. La actividad catalítica de PARP se inhibió en un 50% a las 6 h y en un 25% a las 24 h. A la dosificación tóxica del compuesto de fórmula 1 (10 mg/kg), las concentraciones en plasma del compuesto de fórmula 1 fueron 30 ng/ml a las 6 h pero apenas detectables a las 24 h. Los niveles en tumor del compuesto de fórmula 1 >200 ng/m fueron detectables en todo momento hasta 24 h después de una dosificación de 10 mg/kg del compuesto de fórmula 1 y la actividad catalítica de PARP se inhibió en un 90% a las 6 h y en un 75% a las 24 h.
CUADRO 10(a) Concentración en Plasma y Tumor del Compuesto de Fórmula 1 después de Administración Intraperitoneal de la Sal Fosfato (Compuesto I) Dosis Compuesto de fórmula 1 Compuesto of fórmula 1 en a.b compuesto of fórmula 1 Tiempo en plasma tumor (mg/kg) (h) (ng/ml ± SDe) (ng/gm ± SDe) 1 0 0.5 107 ± 32.3 98.3 ± 25 2 1 0 6 6.64 ± 1.55 49.5 ± 2 12 1 0 24 1 85 ± 0.14 BLQC 10 0.5 1867 + 102 767 ± 55.6 10 6 64.4 ± 11 523 ± 37 3 10 24 2 34 ± 0 33 167 ± 54 2 a las dosificaciones del compuesto de fórmula 1 se suministraron por inyección intraperitoneal. b el compuesto de fórmula 1 (equivalente de la base libre) se dosificó en forma de sal fosfato. c BLQ: Por debajo del límite de cuantificación CUADRO 10(b) Eficacia y Farmacodinámica del Compuesto de Fórmula 1 en Forma de Sal Glucuronato en Combinación con Temozolomida Frente al Xenoinjerto de Carcinoma de Colon Humano SW620 Dosis Compuesto de compuesto de fórmula 1 en fórmula 1a bd Tiempo plasma Actividad de Potenciamiento' (mg/kg) (h) (ng/ml ± SDe) PARP (%) (%) Control 100 Temozolomida solac 100 01 05 127 ± 23 776 ± 133 289 01 6 oo±oo 902 ± 115 01 24 oo±oo 1004±75 10 05 920 ± 280 249 ± 162 >1009 10 6 47±40 686 ± 362 10 24 OO±OO 702 ±190 10 05 1532 + 134 34± 14 N/Ah 10 6 980 ± 280 48 ± 087 10 24 178 ±295 183 ± 127 a las dosificaciones del compuesto de fórmula 1 se suministraron por inyección intraperitoneal. b el compuesto de fórmula 1 (equivalente de la base libre) dosificado en forma de sal glucuronato. c las dosificaciones de Temozolomida se suministraron por sonda oral d Dosificación del compuesto de fórmula 1, suministrado i.p., en combinación con 68 mg/kg de Temozolomida, suministrada p.o. e SD = desviación típica f Potenciamiento calculado como ((Retraso (combinación) / Retraso (temozolomida sola)) x 100 - 100) 9 Significativamente diferente del agente único de temozolomída (Ensayo de Mann-Whitney) h N/A, no aplicable, 5/5 muertes debidas a toxicidad EJEMPLO 9 Estudios de Farmacocinética en Animales La farmacocinética del compuesto de fórmula 1 (sustancia fármaco de la base libre), después de administración IV de sales del compuesto de fórmula 1, se evaluó en Ratones CD-1 , ratas Wistar, perros Beagle, y monos cinomolgos y se resume en Cuadro 11. La dosificación IV a todas las especies dio como resultado una eliminación de moderada a rápida (34 a 136 ml/min/kg) y un gran volumen de distribución (7 a 15 l/kg), indicando que este compuesto se distribuye bien en el cuerpo. La semivida terminal fue relativamente corta a moderada (2 a 5 horas). Los estudios de combinación del Compuesto I (la sal fosfato) con temozolomída se realizó en ratones y ratas para investigar el impacto potencial de este agente citotóxico en la farmacocinética del compuesto de fórmula 1. Para el estudio de combinación en ratón, un grupo de 8 ratones recibió una dosis IV única de 6.5 mg/kg del Compuesto I (equivalente a 5 mg/kg del compuesto de fórmula 1) mientras que un segundo grupo de 8 ratones recibió una dosis IV única de 6.5 mg/kg del Compuesto I y una dosis oral única de 200 mg/kg de temozolomida. Cada uno de los grupos de tratamiento de dosis se dividió en 2 grupos cohorte de 4 ratones. La razón del muestreo de sangre en cohortes se debe a las limitaciones de volumen sanguíneo de las especies de ratón. La sangre se extrajo de cada cohorte en momentos de muestreo farmacocinético alternos. Para el estudio de combinación en rata, un grupo de 2 ratas recibió una dosis IV única de 6.5 mg/kg del Compuesto I (5 mg/kg) mientras que un segundo grupo de 2 ratas recibió tanto la dosis IV de 6.5 mg/kg del Compuesto I como una dosis oral de 50 mg/kg de temozolomida. Los resultados del estudio de combinación del Compuesto I y temozolomida en ratones y ratas demostraron que este agente citotóxico tiene sólo efectos minoritarios en el perfil farmacocinético del compuesto de fórmula 1 (Cuadro 12 y Cuadro 13). De manera similar, el Compuesto I demostró tener sólo efectos minoritarios en el perfil farmacocinétíca de temozolomida (datos no mostrados). Además, los estudios de combinación del Compuesto I e irinotecano se realizaron en ratones CD-1 macho y ratas Wistar macho. Para el estudio de combinación en ratón, un grupo de 15 ratones recibió una dosis IV única de 6.5 mg/kg del Compuesto I (equivalente a 5 mg/kg del compuesto de fórmula 1) mientras que un segundo grupo recibió tanto una dosis IV de 6.5 mg/kg del Compuesto I como una dosis IV de 45 mg/kg de irinotecano. Se sacrificaron tres ratones por grupo de dosis a cada uno de los tiempos puntuales de recogida. Para el estudio de combinación en rata, un grupo recibió una dosis IV de 6.5 mg/kg del Compuesto I mientras que el segundo grupo recibió tanto la dosis IV de 6.5 mg/kg del Compuesto I como la dosis de 45 mg/kg de irinotecano. Se recogió sangre de cada rata para cada tiempo puntual. Los resultados de este estudio sugieren que a las dosis administradas no hay interacciones fármaco-fármaco entre el Compuesto I e irinotecano que den como resultado una farmacocinética alterada (Cuadro 14 y Cuadro 15).
CUADRO 11 Parámetros Farmacocinéticos Medios de una Dosis IV Única del Compuesto de Fórmula 1 en Ratones, Ratas, Perros, y Monos Especie Dosis Vss CL t./2 AUC(o^) (mg/kg) (i/kg) (ml/min/kg) (horas) (µg h/ml) Ratón3 5D 10 136 2 3 0 62 Rata3 5b 10 85 2 8 0 99 Perro 15c 15 2 ± 2 3 61 8 ± 8 2 4 5 ± 1 1 4 1 ± 0 5 M Moi no 15c 7 2 ± 1 2 33 8 ± 3 1 5 2 ± 0 8 7 4 ± 0 7 Media por grupo de n = 15 ratones, todos los demás n = 2 ó 3 (± SD) a Los datos de ratón y de rata son de los estudios de combinación con temozolomida b el compuesto de fórmula 1 (equivalente de la base libre) dosificado en forma de Compuesto I (sal fosfato) c el compuesto de fórmula 1 (equivalente de la base libre) dosificado en forma de sal glucuronato CUADRO 12 Parámetros Farmacocinéticos Medios por Grupo del Compuesto de Fórmula 1 en Ratones Dosificados con el Compuesto I (sal fosfato) Solo o en Combinación con Temozolomida Compuesto I Compuesto I (+ TEMO) Vía de Administración IV IV (Oral) Dos?s(mg/kg)a 5 5 (200) AUC(&ß) (µg /ml) 0 62 0 95 CL (ml/min/kg) 136 88 Vss (l/kg) 10 9 t-?/2 (horas) 2 3 2 2 a Compuesto I (sal fosfato del compuesto de fórmula 1); dosis corregidas para la sal.
CUADRO 13 Parámetros Farmacocinéticos Medios del Compuesto de Fórmula 1 en Ratas Dosificadas con el Compuesto I (sal fosfato) Solo o en Combinación con Temozolomida Compuesto I Compuesto I (+ TEMO) Vía de Administración IV IV (Oral) Dos?s(mg/kg)3 5 5 (50) AUC(0.8, (µg h/ml) 1 0 0 7 CL (ml/min/kg) 85 123 Vss (l/kg) 10 11 t1/2 (horas) 2 8 1 6 a Compuesto I (sal fosfato del compuesto de fórmula 1); dosis corregidas para la sal.
CUADRO 14 Parámetros Farmacocinéticos Medios por Grupo del Compuesto de Fórmula 1 IV en Ratones Dosificados con < el Compuesto 1 (sal fosfato) Solo o en Combinación cor i Irinotecano Compuesto I Compuesto 1 (+ IRINO) Vía de Administración IV IV (IV) Dos?s(mg/kg)3 5 5 (45) AUC(0-„) (µg h/ml) 0 93 1 12 CL (ml/min/kg) 90 75 V„ (l/kg) 11 6 3 Compuesto I (sal fosfato del compuesto de fórmula 1), dosis corregidas para la sal CUADRO 15 Parámetros Farmacocinéticos Medios (SD) del Compuesto de Fórmula 1 IV en Ratas Dosificadas con el Compuesto I (sal fosfato) Solo o en Combinación con Irinotecano Compuesto I Compuesto I (+ IRINO) Vía de Administración IV IV (IV) Dos?s(mg/kg)a 5 5 (45) AUC(o-„, (µg h/ml) 0 70 (0 06) 0 91 (0 03) CL (ml/min/kg) 119 (10 99) 91 (2 87) V„ (l/kg) 16 (4 13) 14 (0 88) ti/2 (h) 2 2 (0 28) 2 3 (0 07) Compuesto I (sal fosfato del compuesto de fórmula 1), dosis corregidas para la sal EJEMPLO 10 Efectos en Seres Humanos: un Ensayo en Fase 1 del Compuesto I Inhibidor de PARP Intravenoso en Combinación con Cinco Dias de Temozolomida Oral Dada Cada Cuatro Semanas Este es un estudio de aumento de dosis multicentro de etiqueta descubierta que se realiza en 2 partes. La parte 1 del estudio se abrió a pacientes con tumores avanzados. Después de una dosis de ensayo de agente único de Compuesto I dado el Día 7, el Compuesto I se dio en forma de infusión IV diaria durante 5 días con temozolomida (100 mg/m /dosis). En cohortes secuenciales de pacientes, se aumentaron las dosis del Compuesto I hasta que se identificó la dosis inhibidora de PARP (DIP, véase sección D a continuación) por datos farmacodinámicos y farmacocinéticos. La DIP se ha determinado que es 12 mg/m2. El aumento entre pacientes del Compuesto I se permitió después de que se estableciera seguridad en la dosis más alta en una cohorte previa. La parte 2 del estudio se abre a pacientes con melanoma metastásico. Cohortes secuénciales de pacientes reciben la DIP del Compuesto I además de dosis en aumento de temozolomida hasta que se establece el MTD de los fármacos combinados o la dosis de temozolomida alcanza un máximo de 200 mg/m2. Los pacientes que entran en la parte 2 del estudio deben consentir una biopsía pre- y post-tratamiento para medir la inhibición de PARP. El aumento entre pacientes de temozolomida se permite después de que se establezca seguridad en la dosis más alta en una cohorte previa. Se consintieron los resultados clínicos y se trataron 17 pacientes en la parte 1 del estudio. El cuadro 16 muestra la demográfica de estos pacientes. CUADRO 16 Demográfica de los Pacientes en la Parte 1 del Estudio en Fase 1 ID Compuesto I Edad Sexo Origen Estado Área Superficial Cohorte Dosis media % étnico funcional Corporal Media (N° de (mg/m2) (años) Hombres % (WHO) (m2) pacientes) (Intervalo) Blancos 0/1 % (Intervalo) 1 (3) 56 (49- 33 100 67/33 1 74 (1 32-1 82) 62) 2 (4) 55 (32- 100 100 75/25 2 29 (1 86-2 44) 72) 3 (3) 55 (36- 67 100 0/100 1 80 (1 71-2 01 ) 56) 4 (4) 55 (31 - 75 100 25/75 1 94 (1 82-2 10) 68) 5 (3) 12 65 (59- 100 100 33/67 2 06 (2 04-2 26) 71) Total (17) 56 (31 - 76 100 41/59 2 01 (1 32-2 44) 72) Los diagnósticos de cáncer primario de estos pacientes, todos con enfermedad avanzada, fueron mama (1), colon (2), riñon (1), hígado (1), páncreas (2), próstata (1), recto (1), melanoma (3), sarcoma de tejido blando (3), y estómago (2). Doce (71%) de los pacientes recibieron quimioterapia anterior, 3 (18%) de los pacientes no, y de 2 (12%) no se tiene información. A. Farmacocinética y Metabolismo del Producto en Seres Humanos The farmacocinética del compuesto de fórmula 1 se evaluó en el estudio de aumento de dosis de etiqueta descubierta en Fase 1 del Compuesto I IV en combinación con temozolomida. En la parte 1 del estudio (aumento de dosis del Compuesto I), se recogieron muestras de sangre seriadas para la determinación del compuesto de fórmula 1 en los siguientes tiempos: Ciclo 1 , Día -1 (C1 D-7, dosis única del Compuesto I) Ciclo 1 , Día 1 (C1D1 , dosis única del Compuesto I más temozolomida) Ciclo 1 , Dia 4 (C1 D4, dosis múltiple del Compuesto I más temozolomida) El análisis PK se realizó sobre los datos provisionales preliminares usando el conjunto nominal de tiempos.
B. Análisis PK en Todos los Ciclos hasta el Día 4 La determinación del compuesto de fórmula 1 plasma humano se realizó usando extracción por precipitación de proteínas seguido de HPLC en fase inversa con detección por espectrometría de masas en tándem Se usaron las siguientes condiciones cromatográficas- Columna Analítica Thermo Hypersil Keystone Betabasic C8, 5 µm, 100 x 2,1 mm DI Composición de la Fase Móvil A ácido fórmico al 0 1% en agua Composición de la Fase Móvil B ácido fórmico al 0 1% en acetonitplo Caudal 200 µl/mm Volumen de Inyección 10 µl Lavado de la Aguja de Agua acetonitrilo ácido fórmico (500 500 1 , v v v) Automuestreo Tiempos de Retención Típicos* Compuesto de fórmula 1 1 5 minutos d6-Compuesto de fórmula 1 1 5 minutos * Los tiempos de retención son aproximados, y pueden variar entre y en los lotes analíticos Lo siguiente son parámetros de espectrometría de masas típicos y pueden variar entre los instrumentos para obtener la respuesta equivalente: Espectrómetro de Masas Saex API 365 Ionización Sciex Turbo Ion Spray Turbo Pulverización de Iones modo de iones positivos Tensión de Pulverización de Iones 4000 V Temperatura del Turbo Calentador 450°C Transiciones de Masa (nominal) Compuesto de fórmula 1 m/z = 324 4 ? m/z 293 2 d6- Compuesto de fórmula 1 m/z = 330 3? m/z 299 1 Tiempo de Residencia Compuesto de fórmula 1 350 ms de- Compuesto de fórmula 1 150 ms Presión del Gas de Nebulización 6 Ajuste de la Cortina de Gas 8 CAD 2 Se presenta un resumen de los parámetros de PK preliminares de los 17 pacientes en el cuadro 17 y los perfiles de concentración media en plasma-tiempo del compuesto de fórmula 1 para cada cohorte de dosis se muestran en las Figuras 3A-3C.
CUADRO 17 Resumen de los Parámetros Farmacocinéticos Preliminares (Media (CV%)) del compuesto de fórmula 1 Después de Infusión IV de 30-minutos del Compuesto I Solo (C1D-7), o del Compuesto I Más 100 mg/m2 de Temozolomida Oral (C1D1 y C1D4) B.1. Análisis PK en el Ciclo 1 Dia -7 (C1 D-7) Después de infusión IV del Compuesto I solo durante 30 minutos (C1 D-7), descendieron las concentraciones en plasma del compuesto de fórmula 1 de un modo multi-exponencial con una semivida terminal media de aproximadamente 6.2 - 10.7 horas. Entre 2 a 12 mg/m2 del Compuesto I solo dado en forma de infusión IV de 30-minutos, hubo proporcionalidad de dosis lineal en AUC(0.24) y Cma . El AUC0.24 a 1 mg/m2 no se incluyó en la evaluación de proporcionalidad de dosis porque las concentraciones estaban por debajo del límite del ensayo analítico (LLOQ = 2 ng/m) para todos los pacientes después de 3 horas de dosificación. La eliminación corporal total media fue 27 l/h (C1D-7), que es aproximadamente un 30% del flujo sanguíneo hepático. El volumen en estado estacionario medio de distribución fue 197 I (C1 D-7).
B.2. Análisis PK en el Ciclo 1 Día 1 (C1D1) Después de una dosis oral de 100 mg/m2 de temozolomida y dosis únicas de 1 a 12 mg/m2 del Compuesto I, las concentraciones del compuesto de fórmula 1 fueron similares a las de Compuesto I dado solo. AUC(0-24) del compuesto de fórmula 1 en C1 D-7 (Compuesto I solo) fue comparable con el de C1 D1 (Compuesto I más temozolomida) a todas las dosis.
B.3. Análisis PK en el Ciclo 1 Dia 4 (C1 D4) Después de 4 días de dosificación diaria del Compuesto I más temozolomida, hubo una acumulación minima del compuesto de fórmula 1 en plasma en base a la inspección visual de los perfiles individuales de concentración en plasma-tiempo. Sin embargo, hubo una tendencia de aumento (intervalo: 50% a 75%) del AUC(0-24) del compuesto de fórmula 1 entre la dosis en el Ciclo 1 Día 4 y la dosis en el Ciclo 1 Día 1 (Cuadro 17).
B.4. Variabilidad ínter- y Intra-paciente La variabilidad interpaciente del AUC(o-24) del compuesto de fórmula 1 fue del 14% al 85% y de Cmax fue del 7% a 95%. Sin embargo, la variabilidad interpaciente en cada cohorte fue <60% en general tanto para AUC(o-24) como para Cma? (Cuadro 17). La variabilidad intrapaciente de AUC(o-24) y Cma se evaluó comparando el Compuesto I solo en C1D-7 con el Compuesto I + temozolomida en C1 D1. La variabilidad intrapaciente varió del 7% al 47% para AUC(0.24) y del 3% al 44% para Cmax.
C. Determinación de la Dosis Inhibidora de PARP: Metodología de Ensavo Un ensayo farmacodinámico para la actividad e inhibición de PARP usa anticuerpos monoclonales para medir la cantidad de polímero PAR que se forma en condiciones establecidas en linfocitos sanguíneos periféricos permeabilizados y muestras tumorales homogeneizadas. La cantidad de polímero formado puede usarse como correlación para la actividad de PARP, por lo que la disminución de la formación de polímero se correlaciona con el grado de inhibición de PARP. La actividad de PARP se expresa como porcentaje de la medida inicial, y se calcula dividiendo la cantidad de polímero PAR formado después de la infusión por la cantidad formada antes de la infusión. La viabilidad de este ensayo se ensayó satisfactoriamente en los 12 pacientes del estudio en Fase 2 de agente único de temozolomida en pacientes con melanoma metastásico. Este estudio mostró que el agente único de temozolomída no inhibió la actividad de PARP ni en linfocitos sanguíneos periféricos ni en muestras de biopsia tumoral.
D. Farmacodinámica Evaluada a partir del Estudio Clínico en Fase 1 En el estudio de aumento de dosis de etiqueta descubierta en Fase 1 del Compuesto I IV en combinación con temozolomida, uno de los objetivos principales del estudio fue determinar la DIP del Compuesto I; la DIP se definió como la dosis a la que la actividad de PARP en línfocitos sanguíneos periféricos se redujo a menos del 50% de la medida inicial, y hubo un estancamiento (+/- 10% absoluto) en el grado de inhibición de PARP entre 2 niveles de dosis del Compuesto I. La definición se basó en la actividad de PARP observada 24 horas después de la administración del Compuesto I en el Día 1. Usando un ensayo farmacodinámico para la actividad de PARP descrito en la Sección C anterior, se evaluó la inhibición de PARP en linfocítos sanguíneos periféricos y tejido tumoral en un ensayo clínico en Fase 1. Como se ha indicado anteriormente, la inscripción en la Parte 2 de la Fase 1 del estudio se ha restringido a pacientes que tienen melanoma metastásico con enfermedad biopsiable. Se ha solicitado el consentimiento a todos los pacientes para las bíopsias de pre-tratamiento y post-tratamiento de manera que pueda evaluarse la actividad de PARP en el tumor. En la Fase 1 del estudio, se recogieron muestras de sangre completa de todos los pacientes en el día en el que se administró la dosis de ensayo del Compuesto I (normalmente el Día 7), y en los Días 1 y 4. El ritmo de recogida fue antes de la infusión del Compuesto I, al final de la infusión, de 4 a 6 horas después de la infusión, y 24 horas después de la infusión (antes de la infusión al día siguiente). El Compuesto I se administró por infusión IV durante 30 minutos. Los linfocitos sanguíneos periféricos se recogieron de las muestras de sangre, y cuando fue posible, las muestras se analizaron por triplicado. En el cuadro 18 se resume la actividad de PARP en linfocitos sanguíneos periféricos después de la administración del Compuesto I en el Día 1. Se mostró una marcada inhibición de PARP (al menos una disminución del 50% en la actividad media de PARP) en todos los pacientes independientemente de la dosis después de completarse la infusión de 30 minutos del Compuesto I en el Día 1. Dependiendo del paciente, se observó una inhibición máxima en los tiempos puntuales de 0.5 ó 4 a 6 horas. La inhibición duradera de la actividad de PARP se mostró en todos los pacientes en las cohortes 4 y 5, donde la reducción media >50% en la actividad de PARP se observó 24 horas después de su dosis del Dia 1 del Compuesto I. Como se muestra en el cuadro 19, la actividad de PARP se ha inhibido en un 50%-93% en muestras de tumor tomadas de 6 pacientes en la parte 2 del estudio, 4-6 horas después de administrarles una dosis de 12 mg/m2 del Compuesto I en el Día 1 , 4 ó 5 de su primer ciclo.
CUADRO 18 Actividad de PARP a las 0.5, 4 a 6, v 24 Horas Después de la Administración del Compuesto I en el Día 1 % Pretratamiento Actividad de PARP Cohorte N° de Dosis Inicial Tiempo N° de Media Intervalo Pacientes del (h) Pacientes (%) (%) Tratados Compuesto con I (mg/m2) Muestras 1a 3 1 0 5 2 18 17-18 4-6 2 57 BLD-114 24 2 77 40-114 2 4 2 0 5 3 10 9-21 4-6 3 27 15-62 24 2 36 22-48 3 3 4 0 5 2 42 23-60 4-6 3 28 22-47 24 3 108 50-264 4 4 8 0 5 3 1 1-22 4-6 3 16 5-30 24 3 9 7-31 5-8 12 12 0 5 12 14 5 BLD-59 4-6 12 13 BLD-83 24 12 29 3-73 9 6 18 0 5 6 6 0-21 4-6 6 7 5 0-21 24 6 14 0-34 PARP = poli (ADP-pbosa) po merasa, BLD = por debajo del límite de detección a Sólo para la primera cohorte, las muestras no se recogieron en el Día 1. Los datos corresponden a muestras recogidas después de la dosis de ensayo del Compuesto I (normalmente el Día 7) CUADRO 19 Inhibición de PARP en Tumores Las biopsias post-tratamiento se tomaron a las 4-6 horas después del tratamiento en el día indicado, excepto *: tomadas a las 24 horas después del tratamiento en el día 1 (antes del día 2 de tratamiento).
EJEMPLO 11 Efectos en Seres Humanos Un Ensavo en Fase 1/2 del Compuesto I Inhibidor de PARP Intravenoso en Combinación con el Régimen "FOLFIRI" en Pacientes con Cáncer Colorrectal Avanzado en los que ha Fallado un Régimen "FOLFOX" en el Ajuste Metastásico de Primera Línea Un inicio en la parte de Fase 1 del estudio identifica la dosis del Compuesto I en combinación con irinotecano, 5-FU y leucovorina para su uso en una parte de Fase 2. La parte de Fase 2 es un estudio multicentro de etiqueta descubierta del Compuesto I dado en combinación con FOLFIRI para pacientes que han recibido quimioterapia FOLFOX anteriormente para la cáncer colorrectal metastásíco de 1a línea. La parte de Fase 1 del ensayo son 2 partes. La parte 1 es un estudio de aumento de dosis de etiqueta descubierta que evalúa la seguridad y la tolerancia de la combinación del Compuesto I con irinotecano (véase el cuadro 20 - Parte 1 ). La parte 2 añade 5-FU + leucovorina a la combinación ya establecida en la parte 1 (véase el cuadro 20 - Parte 2). A los pacientes se les dosifican ciclos de 2 semanas para facilitar la transición a la Fase 2 del esquema de dosificación FOLFIRI. Los pacientes han probado histológica o citológicamente que el cáncer colorrectal es refractario a o que no ha dado resultado con FOLFOX en el ajuste metastásico de primera línea, que tienen al menos de 18 años de edad, tienen un buen estado funcional (WHO 0 o 1), tienen un funcionamiento adecuado de la médula ósea, el hígado y el riñon determinados por ensayos sanguíneos rutinarios, proporcionan consentimiento con conocimiento de causa, así como el cumplimiento de varios criterios de entrada diferentes Los pacientes reciben la dosis inhibidora de PARP de Compuesto I (como se ha determinado en una Fase 1 anterior del estudio y en la parte 1 de este ensayo) y FOLFIRI En la Fase 2, los números de ciclo se refieren a cada ciclo de 2 semanas de FOLFIRI, que se da de una manera convencional El innotecano (dosis basada en la Fase 1) se da por vía intravenosa durante 90 minutos en el Día 1 La infusión de leucovonna (LV 200 mg/m2) comienza simultáneamente con la del irmotecano, y transcurre durante 2 horas en el Día 1 Un bolo de 5-FU (400 mg/m2) y 46 horas de infusión de 5-FU (2400 mg/m2) sigue inmediatamente a la infusión de leucovonna El Compuesto I se añade a ipnotecano en dosis en escala en cohortes de pacientes en serie como se muestra en el cuadro 20 El Compuesto I inicialmente se da a una dosis inicial de 12 mg/m2 dada por infusión intravenosa de 30 minutos 1 hora antes de cada dosis de i notecano y de nuevo 24 horas después La dosis inicial de irmotecano es de 150 mg/m2 (aproximadamente el 80% de la dosis completa de ipnotecano usada en el régimen FOLFIRI) Se recogen muestras de sangre en el ciclo 1 para determinar los perfiles de PK del Compuesto I, innotecano, y SN-38 Se usa la Toxicidad Limitante de la Dosis (DLT) para determinar la dosis máxima tolerada (MTD) y se evalúa en las 4 primeras semanas Inícialmente, se introducen 3 pacientes en cada nivel de dosis. Si se observa una DLT en 1 de los 3 primeros pacientes de cualquier cohorte, se inscriben 3 pacientes adicionales. La MTD se define como el mayor nivel de dosis al que <1/6 de los pacientes experimentan DLT durante las 4 primeras semanas. No se realizan aumentos de dosis de Compuesto I por encima de 18 mg/m2. Una vez que los 6 pacientes tratados a la MTD han completado 4 semanas, empieza la parte de la Fase 2. MTD se define como una dosis por debajo de la cual más del 30% (de 2 hasta 6 pacientes) de la cohorte, experimentaron toxicidad limitante de dosis debida a la combinación de fármacos durante los primeros 21 días de tratamiento. Se sustituyen los pacientes que no completaron el tiempo pre-requerido para la evaluación de las DLT por cualquier razón distinta de toxicidad relacionada con el tratamiento. La MTD es la dosis inicial recomendada para los ensayos de la fase 2.
CUADRO 20 Dosis de la fase 1 La velocidad de respuesta objetiva es el punto final fundamental para la Fase 2 del estudio. Se evalúa la respuesta tumoral de los pacientes cada 3 ciclos de FOLFIRI. La velocidad de respuesta objetiva (RR) de la combinación de Compuesto I con FOLFIRI se determina usando los criterios del Criterio de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST). New guidelines to evalúate the response to treatment in solid tumors. J Nati Cáncer Inst, 2000, v. 92, páginas. 205-216.
EJEMPLO 12 Radiosensibilización por el compuesto de fórmula 1 Un factor que contribuye a la resistencia a la radiación in vivo es la capacidad de células quiescentes para reparar una lesión potencíalmente letal (PLD) (Weichselbaum, R. R. y Little, J. B. The differential response of human tumors to fractionated radiation may be due to a post-irradiatio repair process. Br. J. Cáncer 1982; 46: 532-537). Los modelos in vitro de PLD miden el aumento de supervivencia de las células con crecimiento detenido irradiadas después de retrasar su siembra en placas para la formación de las colonias. La recuperación de una lesión potencialmente letal se midió in vitro usando células LoVo que se habían detenido en la fase Gi haciéndolas crecer hasta confluencia para mimetizar la población de células quiescentes radio-resistentes en tumores. Las células se expusieron a 8 Gy de irradiación ? (Gammacel 1000 Élite, Nordían International Inc. Canadá), y se recogieron y se sembraron en placas para el ensayo de formación de colonias inmediatamente o se mantuvieron como cultivos confluyentes de crecimiento detenido durante un periodo de recuperación de 24 horas antes de recogerlas y sembrarlas en placas para el ensayo de formación de colonias. Cuando se indica, se añadió el compuesto de Fórmula 1 0.4 µM 30 minutos antes de la irradiación y estuvo presente durante toda la incubación de recuperación. Como se muestra en el cuadro 21 , la supervivencia celular aumentó aproximadamente 7 veces después de 24 horas de recuperación en medio de control. La incubación con el compuesto de fórmula ? durante el periodo de recuperación inhibió la recuperación de PLD en un 64.9%.
CUADRO 21 Inhibición de la Recuperación de una Lesión Potencialmente Letal (PLDR) a% PLDR se calcula a 100x(supervivencia a las 24h-supervivencia a tiempo 0)/supervivencia a tiempo 0 b% de inhibición de recuperación se calcula como 100-((PLDR en presencia del compuesto de Fórmula 1/PLDR de control)x100) cmedia de 3 experimentos independientes La eficacia in vivo del compuesto de fórmula 1 como agente radiopotenciador se ha evaluado usando dos enfoques independientes: ensayo clonogénico ex-vivo y análisis de retraso del crecimiento tumoral. Para el primer enfoque, xenoinjertos establecidos de LoVo se trataron con el compuesto de fórmula 1 (15 ó 30 mg/kg; compuesto precursor) 30 minutos antes de la radiación localizada de tumor a una dosis de 5 Gy. 24h después se escindieron los tumores, se disgregaron para obtener suspensiones celulares sencillas y se sembraron en placas para el ensayo de formación de colonias. Como se muestra en el cuadro 22, la fracción que sobrevive (SF) de las células tumorales tratadas con el compuesto de fórmula 1 y 5 Gy se potenció en comparación con radiación sola. La SF para las combinaciones de 15 mg/kg y 30 mg/kg de IR se equipararon con lo que se habría conseguido usando dosis de radiación de 8 Gy o 9.5 Gy, dando factores de modificación de la dosis (DMF) de 1.6 y 1.9 respectivamente.
CUADRO 22 Radiopotenciación ex-vivo por el compuesto de fórmula 1 a Eficacia de formación de colonias (%células sembradas en placas) b Fracción de supervivencia: eficacia de formación de colonias (CFE) como función de los tumores de control no tratados c Factor de modificación de la dosis: número de veces que aumenta la dosis de radiación que sería necesaria para dar el mismo nivel de supervivencia clonogénica que la combinación de Fórmula 1 más radiación Para estudios de retraso del crecimiento tumoral, se trataron xenoínjertos de LoVo de aproximadamente 250 mm3 de volumen con una radiación de 10 Gy, se administraron en fracciones de 2 Gy una vez al día durante 5 días. En los grupos de combinación, el compuesto de fórmula 1 se administró 30 minutos antes de cada fracción de 2 Gy a una dosis de 15 ó 0.15 mg/kg (de nuevo se usó el compuesto precursor). El punto final experimental se definió como el tiempo necesario para que el volumen tumoral relativo aumentara cuatro veces el volumen medido al inicio del tratamiento (RTV4). Los retrasos del crecimiento se calcularon a partir de la diferencia de tiempo necesario para conseguir RTV4 (días) entre tumores tratados con IR/Fórmula 1 y controles sin tratar. Como se muestra en el cuadro 23, ambas dosis del compuesto de fórmula 1 provocaron un potenciamiento significativo (36%) de la actividad de radiación frente a xenoinjertos de LoVo.
CUADRO 23 Eficacia de la irradiación X en Combinación con el Compuesto de Fórmula 1 Frente a Xenoinjertos de LoVo Modelo Dosis de Dosis del Régimen Potenciamiento tumoral IRa compuesto de (%) fórmula 1b LoVo 2 Gy 0.15 mg/kg Diariamente x 36e 5 LoVo 2 Gy 15 mg/kg Diariamente 36f x5 a Irradiación local del tumor. b las dosificaciones del compuesto de Fórmula 1 se suministraron por inyección intraperitoneal. c n = 5 para todos los grupos. d Potenciamiento calculado como % Potenciamiento = 100 x(Retraso de Crecimiento con IR + Compuesto de Fórmula 1 - Retraso de Crecimiento con IR solo)/Retraso de Crecimiento con IR solo. e Significativamente diferente de IR solo p = 0.015 (Ensayo de Mann-Whítney) f Significativamente diferente de IR solo p = 0.009 (Ensayo de Mann-Whitney) Las descripciones de todas las referencias citadas se incorporan en este documento como referencia en su totalidad.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una forma de dosificación para administración a un mamífero, comprendiendo la forma de dosificación un compuesto de fórmula 1 : una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 5.9 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero. 2 - Una forma de dosificación que comprende un compuesto de fórmula 1 : 1 una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad eficaz para inhibir una enzima polí(ADP-ribosa) polimerasa en la menos un 50% durante al menos 24 horas en linfocitos sanguíneos periféricos. 3.- Una forma de dosificación para administración a un mamífero que padece de cáncer, comprendiendo la forma de dosificación un compuesto de fórmula 1 : 1 una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad eficaz para inhibir una enzima polí(ADP-ribosa) polimerasa con cáncer en la menos un 50%. 4.- La forma de dosificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada además porque comprende el compuesto de fórmula 1 en una cantidad de 1-48 mg/m2 expresado como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1. 5.- La forma de dosificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada además porque comprende el compuesto de fórmula 1 en una cantidad de 2 a 96 mg expresado como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1. 6.- La forma de dosificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada además porque la forma de dosificación es un polvo liofilizado para inyección. 1.- La forma de dosificación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada además porque la sal farmacéuticamente aceptable es una sal fosfato. 8.- Una composición que comprende un compuesto de fórmula 1 : una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, en una cantidad de aproximadamente 2 a aproximadamente 96 mg expresado como masa equivalente de la base libre del compuesto de fórmula 1, y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente anti-cáncer seleccionado entre el grupo constituido por temozolomida, irinotecano, topotecano, cisplatino, carboplatino, y doxorrubicina. 9.- La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque comprende el compuesto de fórmula 1 , irínotecano, 5-flourouracilo y leucovorina. 10.- El uso de la composición de conformidad con la reivindicación 8 ó 9 en la fabricación de un medicamento útil para tratar el cáncer en un mamífero. 11.- El uso que se reclama en la reivindicación 10, en donde el cáncer se selecciona entre cáncer de pulmón, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza y el cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, carcinoma de los trompas de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello del útero, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, Enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, leucemia crónica o aguda, linfomas linfocíticos, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, adenoma de la pituitaria, y combinaciones de los mismos. 12.- Un kit que comprende: (a) una cantidad de un compuesto de fórmula 1 : 1 una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en una primera forma de dosificación unitaria; (b) una cantidad de al menos un agente anti-cáncer y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en la menos una segunda forma de dosificación unitaria; y (c) recipiente para contener la primera y al menos la segunda formas de dosificación. 13.- El uso de (a) un compuesto de fórmula 1: una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos en una cantidad eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 5.9 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero; y (b) una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente anti-cáncer, en la elaboración de un medicamento útil para tratar cáncer en un mamífero. 14.- El uso que se reclama en la reivindicación 13, en donde el agente anti-cáncer se adapta para ser administrable en 1 hora después de la administración del compuesto de fórmula 1. 15 - El uso de un compuesto de fórmula 1 : una sal farmacéuticamente aceptable o solvato, o una mezcla de los mismos en una cantidad eficaz para proporcionar un valor de concentración en plasma sostenido de al menos 5.9 ng/ml del compuesto de fórmula 1 durante al menos 24 horas después de la administración al mamífero; en la elaboración de un medicamento útil para tratar cáncer en un mamífero, en donde el medicamento se adapta para ser adminístrable con una dosis de radiación eficaz para destruir el cáncer. 16.- El uso que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde el cáncer se selecciona entre cáncer de pulmón, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza y el cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, carcinoma de los trompas de falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello del útero, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, Enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, leucemia crónica o aguda, linfomas linfocítícos, cáncer de la vejiga, cáncer del riñon o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, adenoma de la pituitaria, y combinaciones de los mismos.
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