MX2007001516A

MX2007001516A - Sistemas de expresion inducibles para modular la expresion de genes objetivo en celulas eucarioticas y animales no humanos.

Info

Publication number: MX2007001516A
Application number: MX2007001516A
Authority: MX
Inventors: Yu Shen
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2005-08-05
Publication date: 2007-04-20
Also published as: US20060031948A1; EP1778844A1; US20060031945A1; WO2006017775A1; US20060031949A1; CA2576151A1; JP2008508887A

Abstract

La presente invencion se refiere a sistemas de expresion inducible y a las composiciones y metodos para modular la expresion de por lo menos un gene objetivo en una celula aucariotica y animales no humanos.

Description

SISTEMAS DE EXPRESIÓN INPUCIBLE PARA MODULAR LA EXPRESIÓN DE GENES OBJETIVO EN CÉLULAS EUCARIÓTICAS Y ANIMALES NO HUMANOS Campo de la Invención La presente invención se refiere en general al campo de biología molecular. Más específicamente, la presente invención se refiere a sistemas de expresión inducible para utilizarse en la modulación de genes objetivo en células eucarióticas y animales no humanos.

Antecedentes de la Invención La interferencia de ARN (ARNi) es un procedimiento para silenciar la expresión de gen utilizando ARN de estructura de cadena doble. Ei mecanismo de ARNi es conservado en plantas, invertebrados y vertebrados. Debido a su simpleza y carácter específico, la ARNi se ha vuelto el método de elección para estudiar la función dei gen en una variedad de organismos modelo (Ver, por ejemplo, Harmon, GJ., Nature, 418:244-251 (2002), Paddison, et ai., Cáncer Cell, 2:17-23 (2002), Sharp, P.A., Genes Dev., 15:485-490 (2001), Tuschl, T., Chembiochem., 2:239-245 (2001) and Zamore, P.D., Nat. Struct. Biol, 8:746-750 (2001)). Aunque el ARN de interferencia pequeño (ARNsi) químicamente sintetizado efectivamente puede sintetizar genes de interés cuando son transceptados a células, el uso de ARNsi se ha limitado a experimentos de término corto ya que el ARNsi se degrada con el tiempo o se diluye después de la división de célula. Para superar esta limitación, se desarrollo un sistema a base de vector que expresaba ARNs de horquilla corta (ARNshs) que comprenden un vastago de 19-29 bp con un tamaño de lazo de 4-9 nucleótidos. Los ARNshs son procesados en ARNsis a través de una enzima conocida como "pastilla" y exhiben silenciación de gen específico cuando se expresan en células humanas (Ver, por ejemplo, Brummelkamp, T.R., et al., Science, 296:550-553 (2002), Miyagishi, M., et al., Nat. Biotechnol, 20:497-500 (2002), Paddision, P.J., et al., Genes Dev., 16:948-958 (2002), Paul, C.P., et al., Nat. Biotechnol, 20:505-508 (2002) and Sui, G., et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 99:5515-5520 (2002)). Además, se ha demostrado que se pueden incorporar sistemas de expresión de ARNsh en cromosomas para establecer líneas de célula estable o para crear animales atacados para estudiar la función del gen in vivo (Ver, Paddision, PJ., et al., Genes Dev., 16:948-958 (2002), Brummelkamp, T.R., et al., Cáncer Cell, 2:243-247 (2002), Hemann, M.T., et al., Nat. Genet., 33:396-400 (2003), Tiscornia, G., et al., Proc. Nati. Acad. Sci, USA, 100:1844-1848 (2003), Barton, G.M., et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 99:14943- 14945 (2002), Hasuwa, H., et al., FEBS Lett., 532:227-230 (2002), Kunath, T., Nat. Biotechnol, 21:559-561 (2003) and Rubinson, D.A, et al., Nat. Genet., 33:401-406 (2003)). Por lo regular se seleccionan secuencias de promotor independientes de ARN-polimerasa lll para la expresión de ARNshs. A diferencia de los ARNms producidas por ARN-pol II, las transcripciones producidas por pol lll no tienen el extremo 5' y 3' la cola poli A, permitiendo así un procesamiento eficiente de ARNsh en ARNsi a través de ia enzima de pastilla. Aunque el desarrollo de sistemas de expresión de ARNsh permite el ataque objetivo estable en células o animales, la actividad constitutiva de las secuencias de promotor dependientes de pol lll impone varias restricciones sobre el uso de sistemas de expresión de ARNsh. Por ejemplo, la expresión constitutiva de ARNshs que activa genes con funciones de desarrollo críticas da como resultado la letalidad embriónica, que evita el estudio de la pérdida de fenotipos de función en animales adultos. Además, el ataque constitutivo de un objetivo con funciones críticas en células o animales por lo regular activa una respuesta de compensación, la cual podría alterar la consecuencia verdadera de la silenciación del gen. Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de la expresión controlada de ARNsh que sea útil para un análisis no derivado de la pérdida del fenotipo de función de genes esenciales en células y animales. Se han hecho intentos para desarrollar secuencias de promotor dependientes de pol lll sensibles a tetraciclina. En la técnica se conocen dos tipos de derivados sensibles tetraciclina de la secuencia de promotor de ARNsh U6 humana (Ver, Ohka a, J., et al., Human Gene Therapy, 11:577-585 (2000)). En las secuencias de promotor de tipo U6 de tetraciclina O1 (tetO1), un operador de tetraciclina de tipo 1 (operador tet) teniendo la secuencia de polinucieótido de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), fue diseñada por ingeniería entre el elemento de secuencia próximo (PSE) y la caja de TATA. En el promotor de tipo U6 de tetraciclina 02 (tet02), un operador tet de tipo 2 teniendo la secuencia de polinucleótido de ctccctatcagtgatagagaaa (SEC ID NO: 5), se diseño por ingeniería entre la caja de TATA y el sitio de inicio de transcripción (TSS). Tanto la caja TATA como el PSE juegan papeles importantes en la iniciación de la transcripción a través de ARN-polimerasa lll. Existe una razón de que la unión del represor de tetraciclina (tetR) a estas secuencias de promotor U6 modificadas en posiciones adyacentes a la caja TATA o al PSE podría interferir con la unión de complejo de proteína de activación (SNAPc) de ARN nuclear pequeño (ARNsn) al PSE y subsecuentemente prevenir la iniciación de transcripción. Se ha mostrado que las secuencias de promotor de tipo tet01 y tet02 exhiben actividad de transcripción dependiente de tetraciclina en una línea de célula que constitutivamente expresa tetR. Sin embargo, la tetO1 pareció tener una mejor respuesta al tratamiento con tetraciclina comparado con el promotor de tipo tet02 en un experimento de transcripción pasajera (Ver, Ohkawa, J., et al., Human Gene Therapy, 11:577-585 (2000)). La expresión controlada de ARNsh utilizando los promotores U6 de tipo tetO1 o tet02 o utilizando el promotor de ARNsh H1 humano con un diseño similar a aquel del promotor U6 de tipo tetO2 también es conocido en la técnica (Ver, Matsukura, S., et al., Nucleic Acid Res., 31:e77 (2003) y Czauderna, F., et al., Nucleic Acids Res., 31:e127 (2003)). El ataque inducible de metiltransferasa de ADN (DNMT), beta-catenina y P13 cinasa se logró en células estables utilizando estos sistemas. Aunque estos derivados de promotor dependientes de pol lll pareció estar herméticamente regulado en la literatura, se han observado varias fugas de estos sistemas de expresión por parte de los inventores de la presente invención cuando se utilizó la secuencia de promotor tetOl para expresar un ARNsh que activa una secuencia de polinucleótído de interés, tal como luciferasa. Aunque no pretende estar ligado por teoría, los inventores creen que probablemente la unión de tetR a un solo sitio en el promotor U6 no es suficiente para bloquear la actividad transcripcional basal del promotor. Cuando se utiliza un ARNsh potente, una ligera fuga del sistema puede conducir a una reducción importante de la proteína objetivo. Una regulación hermética es uno de los requerimientos más críticos y retadores para todos los sistemas de expresión controlados. Dependiendo del objetivo de interés, una ligera perturbación del nivel objetivo puede ser suficiente para ocasionar cambios fenotípicos. Un tercer tipo de derivado sensible a tetraciclina de la secuencia de promotor ARNsh U6 humana también es conocido en la técnica. En esta secuencia de promotor, se diseñaron por ingeniería promotores de tipo tetOl y tet02 en el promotor U6 (Ver, Ohkawa, J., et al., Human Gene Therapy, 11:577-585 (2000)). El operador tetOl fue diseñado por ingeniería entre el PSE y la caja TATA y el operador tetO2 se diseño por ingeniería entre la caja TATA y TSS. Sin embargo, Ohkawa et al. reportaron que la inclusión tanto de teto 1 y tetO2 dio como resultado la pérdida completa de la actividad transcripcional para la secuencia de promotor U6. Entonces, debido a las limitaciones potenciales asociadas con los sistemas de expresión de ARNsh inducible actualmente conocidos, existe la necesidad en la técnica de un sistema de expresión de ARNsh controlado con una mínima actividad transcripcional basal. Específicamente, existe la necesidad de un promotor fuertemente regulado que pueda ser utilizado en dichos sistemas de expresión con el fin de mejorar la tasa de éxito para hacer líneas de célula de ataque ¡nducible y animales no humanos.

Breve Descripción de ia Invención En una modalidad, la presente invención se refiere a una secuencia de promotor dependiente de ARN po! lll. La secuencia de promotor puede ser un promotor U6, un promotor H1 o un promotor 7SK promotor. La secuencia de promotor de la presente invención comprende un elemento TATA, un elemento de secuencia próximo (PSE) 5' para el elemento TATA, un sitio de inicio de transcripción (TSS) 3' al elemento TATA, un primer operador de tetraciclina (primer operador tet) localizado entre el PSE y el elemento TATA y un segundo operador de tetraciclina (segundo operador tet) localizado entre el elemento TATA y TSS. En un aspecto, el primer operador tet está localizado entre el elemento TATA y el PSE y no forma una porción ni de PSE ni del elemento TATA. En otro aspecto, el primer operador tet está localizado entre el elemento TATA y el PSE y forma la porción de uno o tanto el PSE como el elemento TATA. El segundo operador tet está localizado entre el elemento TATA y el TSS. En un aspecto, el segundo operador tet está localizado entre el elemento TATA y el TSS y no forma una porción ni del TSS ni del elemento TATA. En otro aspecto, el segundo operador tet está localizado entre el elemento TATA y TSS y forma la porción de uno o tanto el TSS como el elemento TATA. La secuencia de polinucleótido del primer operador tet y el segundo operador tet puede ser idéntica o puede ser diferente. Si la secuencia de polinucleótido del primer operador tet y el segundo operador tet es idéntica, la secuencia de polinucleótido puede ser seleccionada del grupo que consiste de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), tccctatcagtgatagaga (SEC E) NO: 2), tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO: 3), tccctatcagtgatagagagg (SEC ID NO: 4) y ctccctatcaqtqatagaqaaa (SEC ID NO: 5). La secuencia de polinucleótido del primer operador tet y el segundo operador tet puede ser diferente una de la otra siempre que cuando el primer operador tet tenga la secuencia de polinucleótido de actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), que el segundo operador tet no tenga una secuencia de polinucleótido de ctccctatcagtgatagagaaa (SEC ID NO: 5). La secuencia de polinucleótido del primer operador tet se pude seleccionar del grupo que consiste de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), tccctatcagtgatagaga (SEC ID NO: 2), tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO: 3), tccctatcagtgatagagagg (SEC ' ID NO: 4) y ctccctatcagtgatagagaaa (SEC ID NO: 5). La secuencia de polinucleótido del segundo operador tet se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), tccctatcagtgatagaga (SEC ID NO: 2), tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO: 3), tccctatcagtgatagagagg (SEC ID NO: 4) y ctccctatcagtgatagagaaa (SEC ID NO: 5). Preferiblemente, si el primer operador tet tiene una secuencia de polinucleótido de tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO: 2), el segundo operador de tetraciclina tiene la secuencia de polinucleótido de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1). En otra modalidad, la presente invención se refiere a vectores que comprende los promotores aquí descritos. Más específicamente, los vectores de la presente invención comprende por lo menos una de las secuencias de promotor dependiente de ARN-pol lll descritas anteriormente que están operablemente enlazadas a por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés. Al menos una secuencia de polinucieótido de interés puede ser ADN o ADNc. En otra modalidad, la presente invención se refiere a una célula eucariótica que comprende por lo menos uno de los vectores descritos anteriormente. En otra modalidad, la presente invención se refiere a animales no humanos transgénicos. Ejemplos animales no humanos transgénicos son ratones, ratas, perros, gatos, cerdos, vacas, cabras, ovejas, primates (diferentes a seres humanos) y cobayos. Los animales no humanos transgénicos de la presente invención comprenden un transgen que comprende por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés que está operablemente enlazada por lo menos una de las secuencias de promotor dependientes de ARN-pol lll descritas aquí. La transcripción de por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés produce una molécula de ARN que modula la expresión de por lo menos un gen objetivo en dicho animal transgénico. La molécula de ARN que se produce puede ser un ARN de interferencia pequeña (ARNsi) o un ARN de horquilla corta (ARNsh). En otra modalidad, la presente invención se refiere a métodos para producir animal no humano transgénico. En un aspecto, un animal no humano transgénico puede ser producido de acuerdo con el siguiente método. El primer paso del método implica introducir un transgen en un oocito fertilizado de un animal no humano. Este transgen comprende por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés que está operablemente enlazada a por lo menos una de las secuencias de promotor dependientes de ARN-pol lll descritas aquí. La transcripción de por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés produce una molécula de ARN que modula la expresión de por lo menos un gen objetivo en dicho animal transgénico. La molécula de ARN que se produce puede ser ARNsi o ARNsh. El siguiente paso en el método involucra permitir que el oocito fertilizado se desarrolle a un embrión. El siguiente paso implica transferir el embrión a un animal no humano hembra pseudopreñado. El siguiente paso involucra permitir que el embrión se desarrolle a término. El siguiente paso involucra identificar el animal no humano transgénico conteniendo la secuencia de polinucleótido de interés. En otro aspecto, el animal no humano transgénico puede ser producido de acuerdo con el siguiente método. El primer paso del método involucra introducir un transgen en una célula del tallo embriónica de un animal no humano. Este transgen comprende por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés que está operablemente enlazada a por lo menos una de las secuencias de promotor dependiente de ARN-pol lll descritas aquí. La transcripción de por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés produce una molécula de ARN que modula la expresión de por lo menos un gen objetivo en dicho animal transgénico. La molécula de ARN que se produce puede ser un ARNsl o ARNsh. El siguiente paso en ei método involucra introducir dicha célula de tallo embriónica no humana en un blastocito. El siguiente paso en el método involucra implantar el blastoclto resultante en un animal no humano hembra pseudopreñado. El siguiente paso en el método involucra permitir que el animal no humano de surgimiento a un animal no humano quimérico. El siguiente paso involucra criar al animal no humano quimérico para producir un animal no humano transgénico conteniendo dicho transgen. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para inducir la transcripción de por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés en una célula eucariótica. En este método, cuando se induce la transcripción, por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés produce al menos una molécula de ARN que modula la expresión de por lo menos un gen objetivo en la célula eucariótica. El primer paso del método implica proporcionar una célula eucariótica que expresa la proteína tetR. Una vez que se ha provisto la célula eucariótica, el siguiente paso es transformar o transfectar esta célula con por lo menos un vector, tal como uno de los vectores previamente descritos aquí. Por ejemplo, el vector puede contener por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés que está operablemente enlazada al menos una secuencia de promotor dependiente de ARN-pol lll descrita aquí. El siguiente paso en el método involucra poner en contacto la célula con un agente de inducción. El agente de inducción se une a una proteína represora tet y hace que la secuencia de promotor transcriba la secuencia de polinucleótido de interés. La transcripción de la secuencia de polinucleótido produce por lo menos una molécula de ARN que modula la expresión de por lo menos un gen objetivo en la célula. El agente de inducción utilizado en el método antes descrito puede ser doxiciclina, tetraciclina o un análogo de tetraciclina. Además, la molécula de ARN producida en el método antes descrito puede ser ARNsi o ARNsh. Opcionalmente, el método descrito anteriormente además puede comprender el paso de transformar la célula eucariótica con un segundo vector que contiene una secuencia de polinucleótido operablemente enlazada a un promotor, en donde dicha secuencia de polinucleótido codifica un represor tet que se une a por lo menos un operador tet del promotor. Opcionalmente, por lo menos un vector utilizado en el método anterior además puede contener una segunda secuencia de polinucleótido de interés. En un aspecto, esta segunda secuencia de polinucleótido puede estar operablemente enlazada a una segunda secuencia de promotor y puede codificar una proteína de represor tet que se une a por lo menos uno de los operadores tet del promotor. En un segundo aspecto, esta segunda secuencia de polinucleótido puede ser enlazada en tándem con la primera secuencia de polinucleótido de interés. En este segundo aspecto, cuando la célula se pone en contacto con un agente de inducción, el agente de inducción se une a una proteína de represor tet y el promotor ocasiona la transcripción de cada una de la primera y segunda secuencias de polínucleótido de interés. Específicamente, la transcripción de la primera la secuencia de polinucleótido produce una primera molécula de ARN que modula la expresión de un primer gen objetivo y la transcripción de la segunda la secuencia de polinucleótido produce una segunda molécula de ARN que modula la expresión de un segundo gen objetivo. En una modalidad de la invención, por lo menos una de las secuencias de polinucleótido de interés codifica una tirosinasa. En un tercer aspecto, por lo menos un vector no solo contiene una segunda la secuencia de polinucleótido de interés que está enlazada en tándem con la primera secuencia de polinucleótido de interés, sino que también una tercera la secuencia de polinucleótido esta operablemente enlazada a una segunda secuencia de promotor. Esta tercera secuencia de polinucleótido codifica una proteína de represor tet que se une a por lo menos uno de los operadores tet del promotor. En este tercer aspecto, cuando la célula se pone en contacto con un agente de inducción, el agente de inducción se une a una proteína de represor tet y la secuencia de promotor ocasiona la transcripción de cada una de la primera y segunda secuencias de polinucleótidos de interés. Específicamente, la transcripción de la primera secuencia de polinucleótido produce una primera molécula de ARN que modula la expresión de un primer gen objetivo y la transcripción de la segunda secuencia de polinucleótido que produce una segunda molécula de ARN que modula la expresión de un segundo gen objetivo.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la alineación de secuencia de variantes del promotor U6. U6 es el promotor U6 humano de tipo silvestre (SEC ID NO: 6). 01 (SEC ID HO: 7) o 02 (SEC ID NO: 8) es el promotor U6 humano de tipo 01 y 02. 0102 1 (SEC ID NO: 9), 0102 2 (SEC ID NO: 10), 0102 3 (SEC ID NO: 11), 0102_4 (SEC ID NO: 12), 0102_5 (SEC ID NO: 13), y 0102 6 (SEC ID NO: 14) son variantes del promotor U6 con operadores tet tanto de tipo 01 como 02. 202 (SEC ID NO: 15) es la variante del promotor U6 con dos operadores tet de tipo 02. La secuencia en itálicas marcada representa al operador tet de tipo 02 La secuencia no itálica marcada representa al operador tet de tipo 01. Las Figuras 2A, 2B y 2C muestran la actividad transcripcional y respuesta de tetraciclina de las variantes del promotor U6. Las Figuras 3A, 3B y 3C muestran el ataque dependiente de tetraciciina de un gen endógeno en líneas de célula estables utilizando el sistema de expresión 202. Las Figuras 4A, 4B y 4C muestra una comparación del sistema de expresión 01 y 202 en ¡a preparación de líneas de célula estables. La Figura 5A muestra los niveles de proteína Hifla en células D54_Luc, D54_Hif25 y D54__Hif18. Las células se incubaron en presencia o ausencia de 1 µg/ml de doxiciclina. Después de treinta y seis horas, las células tanto no fueron tratadas (N) como fueron sometidas a tratamiento con hipoxia (H) durante dieciséis horas más. Las células fueron lisadas y analizadas a través de tinción western utilizando anticuerpos contra Hifla (panel superior) o Hiflß (panel inferior). La Figura 5B muestra la actividad del reportero H if 1 (1XHRE) o el reportero constitutivo (pGL3) en células D54_Luc, D54_Hif25 y D54_Hif18. Las células fueron transfectadas ya sea con pGL3-control/pRL-TK (panel izquierdo) o plásmidos 1xHRE/pRL-TK (panel derecho) en presencia o ausencia de 1 µg/ml de doxiciclina. Después de treinta y seis horas de la transfección, las células se sometieron a tratamiento con hipoxia. Se determinaron las actividades de luciferasa dieciséis horas después del tratamiento con hipoxia.

La Figura 5C muestra los niveles de ARNm de genes objetivo Hif1 PGK1 y LDH en células D54_Luc y D54_Hif25. Las células se incubaron en presencia o ausencia de 1 µg/ml de doxiciclina. Después de treinta y seis horas, las células tanto no fueron tratadas (N) como fueron sometidas a tratamiento con hipoxia (H) durante dieciséis horas más. Se preparó ARN total y se utilizó en PCR cuantitativa para analizar el nivel de los genes indicados. La Figura 6A muestra el nivel de ARNm Hifla promedio y la desviación estándar (SD) en tres tumores subcutáneos derivados de D54_Híf25 ( H if ) o D54_Luc (Luc) tratados con doxiciclina. Los ratones llevando tumores de 200-300 mm3 se les suministró doxiciclina (1 mg/ml) en los días 3, 6, 9 o 12. Los tumores se recogieron al final del tratamiento y se determinaron los niveles de ARNm Hifla a través de QPCR. Los tumores a los ratones sin tratamiento con Dox se utilizaron como controles. La Figura 6B muestra el nivel de ARNm Hifla promedio en cuatro tumores derivados de D54-Hif25 o D54_Luc extirpados de ratón tratados con agua (control) o doxiciciina (Dox) durante 45 días. Se determinó el nivel de ARNm Hifla a través de QPCR. La Figura 6C muestra los niveles de expresión promedio de Hifla y la desviación estándar de las mismas muestras de tumor para B). El nivel de expresión de Hifla se examinó a través de IHC, y se cuantificó utilizando Axio Vision 4 (Zeiss). La Figura 7A muestra el tamaño promedio del tumor y el error estándar (SE) producido en tumores subcutáneos generados en 15 ratones utilizando células D54-Hif25 (Hif25) o D54_Luc (Luc) y tratados con y sin doxiciclina. Después de que los tumores alcanzaron el tamaño promedio de 190 mm3, los ratones con los tumores fueron aleatorizados y se dividieron en dos grupos. A cada grupo se le suministró agua para beber conteniendo doxiciclina (Dox) o sin doxiciclina (control). Se midieron los tamaños de los tumores dos veces/semana utilizando un microcalibrador. La Figura 7B muestra el tamaño de tumor promedio y el error estándar (SE) de 8 ratones en tumores subcutáneos generados utilizando células D54-Hif18 (Hif18) o D54_Luc (Luc) y tratados con y sin doxiciclina. Después de que ios tumores alcanzaron el tamaño promedio de 150 mm3, los ratones con los tumores fueron aleatorizados y divididos en dos grupos. A cada grupo se le suministró agua para beber contiendo doxiciclina (Dox) o sin doxiciclina (control). Los tamaños de los tumores se midieron dos veces/semana utilizando un microcalibrador. Las Figuras 8A y 8B muestran ratones nacidos de embriones inyectados con el transgen 202-Tyr731 que exhibe diferente grados de cambio de color de piel comparado con los ratones de tipo silvestre. La Figura 8A muestra un color más ligero de piel de uno FO de los fundadores comparado con el color más oscuro de piel del ratón de tipo silvestre. La Figura 8B muestra tres crías que son de color blanco comparadas con el color más oscuro de las crías F1. Las crías de color blanco son positivas para el transgen 202-Tyr731 (SEC ID NO: 48).

Descripción Detallada de la Invención Definiciones y Otros Términos Como se utiliza aquí, el término "gen" se refiere a una secuencia de polinucleótido que experimenta transcripción como resultado de la actividad de promotor. Un gen puede codificar para un polipéptido particular, o alternativamente, codificar para una molécula de ARN. Un gen puede incluir uno o más intrones y/o exones y/o una o más secuencias reguladoras y/o de control. Como se utiliza aquí, el término "agente de inducción" se refiere a cualquier compuesto que se une con carácter específico a una proteína del represor tet, incluyendo, pero no limitándose a, tetraciclina, doxiciclina o un análogo de tetraciclina. Como se utiliza aquí, los términos "modulación" o "modular" como se utilizan aquí intercambiablemente se refieren tanto a la sobre-regulación (es decir, activación o estimulación (por ejemplo, agonizando o potenciando)) como a la sobre-regulación (es decir, inhibición o supresión (por ejemplo, antagonizando, reduciendo o inhibiendo)). Como se utiliza aquí, el término "animal no humano" incluye todos los animales vertebrados, excepto los seres humanos, también incluye un animal individual en todas las etapas de desarrollo, incluyendo ias etapas embriónicas y fetal. Un "animal transgénico" es cualquier animal que contiene una o más células que llevan información genética alterada o recibida, directa o indirectamente, o a través de la manipulación genética deliberada a un nivel subcelular, tal como a través de recombinación activada o micro-inyección o infección con un virus recombinante. Por lo regular se utilizan ratones para modelos de animal transgénico ya que son los más fáciles de alojar, relativamente son no costosos, y son más fáciles de criar. Sin embargo, también se pueden hacer otros animales transgénicos no humanos de acuerdo con la presente invención, tales como, pero no limitándose a, primates, ratones, cabras, ovejas, conejos, perros, vacas, gatos, cobayos y ratas. Los animales transgénicos son aquellos que llevan un transgen, es decir, un gen clonado introducido y establemente incorporado, el cual se hace pasar a generaciones sucesivas. Como se utiliza aquí, el término "operablemente enlazado " se refiere a una yuxtaposición, en donde los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma pretendida. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótido de interés puede ser colocada adyacente a otra secuencia de polinucleótido que dirige la transcripción o transcripción y traducción de la secuencia de polinucleótido introducida de interés (es decir, facilita la producción de, por ejemplo, un polipéptido o un polínucleótido por la secuencia introducida de interés). Un promotor se considera operablemente enlazado a una secuencia de codificación si el promotor efectúa la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. Como se utiliza aquí, el término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solamente a la estructura primaria de la molécula. De esta manera, el término incluye ADN de estructura de cadena doble e individual, así como ARN de estructura de cadena doble e individual. También incluye modificaciones, tales como metilación o cubierta y formas no modificadas del polinucleótido. Los términos "pollnucleótido", "oligómero", "oligonucleótido", y "oligo" se utilizan aquí intercambiablemente. Como se utiliza aquí, el término " secuencia de polinucleótido de interés" se refiere a cualquier ADN, ADNc, ADN genómico, análogos de ácido nucleico, y AND sintético que es capaz de expresar una molécula de ARN, tal como, pero no limitándose a, ARN de interferencia pequeña (ARNsi) o ARN de horquilla corta (ARNsh), o una proteína u otra molécula en una célula objetivo (es decir, que es capaz de la producción de la proteína u otra molécula biológica en una célula objetivo). El ADN puede ser de estructura de cadena doble o de estructura de cadena individual, y si es de estructura de cadena individual, puede ser la estructura de cadena de codificación (sentido) o cadena de estructura sin codificación (anti-sentido). La secuencia de polinucleótido de interés generalmente está operablemente enlazada a otras secuencias de polinucleótidos necesarias para expresión, tal como por lo menos una secuencia de promotor. Cualquier secuencia de polinucleótido de interés puede ser utilizada en la presente invención. Ejemplos de secuencias de polinucleótidos pueden ser utilizadas en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, secuencias de pollnucleótido para atacar el gen 1RAK4 de ratón, tal como, ggaagaaauuagcaguagc ucucuugaa gcuacugcuaauuucuuccuu (SEC ID NO: 16), que se puede utilizar en métodos de ARNsh, secuencias de polinucleótido para atacar al gen STK33 humano, tal como, gggcauuucucagagaaugtt (SEC ID NO: 17) y ttcccguaaagagucucuuac (SEC ID NO: 18), cada una de las cuales se puede utilizar en métodos de ARNsi, secuencias de polinucleótido que codifican una proteína Ras de tipo 1 del inhibidor NFKB (también conocida como "NKIRAS 1") o ataque de un gen NKIRAS1 (ADNc que codifica una proteína humana NK1RAS1 que se puede encontrar en GenBank con el Número de Acceso NM-020345), secuencias de polinucleótido que codifican un factor 1 inducible con hipoxia, subunidad alfa (un factor de transcripción básico de hélice-lazo-hélice y también conocido como "HIF1A") o un gen de ataque HIF1A (ADNc que codifica una proteína HIF1A humana que se puede encontrar en GenBank con el Número de Acceso NM_001530), secuencias de pollnucleótidos que codifican cromosomas genómicos o atacan un cromosoma genómico, tal como, pero no limitándose a, un conteo genómico de cromosoma 8 (ADN genómico que codifica un contig genómico de cromosoma 8 humano que se puede encontrar en GenBank con el Número de Acceso NT 023736.16), secuencias de polinucleótido que codifican un miembro de la familia de cinasa o que atacan un gen que codifica un miembro de la familia de cinasa (ejemplos de miembros de una familia de cinasa, incluyen, proteínas de tipo II de receptor A de activina (también conocidas como "ACVRLI") (ADN que codifica una proteína ACVRL1 humana que se puede encontrar en GenBank con el Número de Acceso NM_000020) o proteínas ATM (ADN que codifica una proteína ATM humana que se puede encontrar en GenBank con el Número de Acceso NM_000051)), secuencias de polinucleótido que codifican proteínas supresoras de tumor o atacan un gen que codifica una proteína supresora de tumor (ejemplos de proteínas supresoras de tumor incluyen, la proteína p53 (ADN que codifica una proteína p53 humana que se puede encontrar en GenBank con el Número de Acceso NM_000546) o una proteína de retinoblastoma humana (ADN que codifica una proteína de retinoblastoma humana que se puede encontrar en GenBank con el Número de Acceso M15400)), secuencias de polinucleótido que codifican factores de transcripción o que atacan un gen que codifica un factor de transcripción (un ejemplo de un factor de transcripción incluye, la proteína myc (ADN que codifica una proteína myc humana se puede encontrar en GenBank con el Número de Acceso M13228)), secuencias de polinucleótidos que codifican Sam11 GTPases o que atacan un gen Sam11 GTPase (un ejemplo de Sam11 GTPases incluye ia proteína Ras (ADN que codifica una proteína Ras humana puede encontrarse en GenBank con el Número de Acceso NM_033360)), secuencias de polinucleótido que codifican ligasa E3 o que atacan un gen que codifica una ligasa E3 (un ejemplo de una ligasa E3 incluye la proteína SKP2 (ADN que codifica una proteína SKP2 humana se puede encontrar en GenBank con el Número de Acceso NM_032637)), etc. Como se utiliza aquí, el término "polipéptido" y "proteína" se utilizan aquí intercambiablemente e indican por lo menos una cadena molecular de aminoácidos enlazados a través de enlaces covalentes y/o no covalentes. Los términos no se refieren a una longitud específica del producto. De esta manera, se incluyen dentro de la definición de polipéptido, péptidos, oligopéptidos y proteínas. Los términos incluyen modificaciones post-traducción del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Además, dentro del significado de polipéptidos se incluyen fragmentos de proteína, análogos, proteínas mutadas o variantes, proteínas de fusión, y similares. Como se utiliza aquí, el término "gen objetivo" se refiere a una secuencia de polinucleótido, tal como, pero no limitándose a, una secuencia de polinucleótido de interés que codifica un polipéptido de interés o alternativamente, una molécula de ARN de interés, tal como, pero no limitándose a ARNsi o ARNsh. El gen objetivo puede ser un gen "esencial" requerido para la viabilidad de célula continua cuya función es la de ser interrumpida a través de los métodos de la presente invención. El término "gen objetivo" también se refiere a un gen que será atacado de acuerdo con los métodos descritos aquí. Como se utiliza aquí, el término "análogo de tetraciclina" se refiere a cualquier compuesto que esté relacionado con tetraciclina o doxiciclina y que se une con carácter específico a una proteína represora tet. La constante de disociación de tales análogos debe ser de por lo menos 1 x 10"6 M, preferiblemente mayor que 1 x 10"9 M. Ejemplos de análogos de tetraciclina se discuten por HIavka et al., "The Tetracyclines," in Handbook of Experimental Pharmacology 78, Blackwood et al. (eds), New York (1985) and Mitschef ("The Chemistry of Tetracycline Antibiotics," Medicinal Res. 9, New York (1978), la cual se incorpora aquí por referencia. Como se utiliza aquí, los términos "proteína represora de tetraciclina", "proteína represora tet ", y "tetR", los cuales se utilizan todos intercambiablemente aquí, se refieren a un polipéptido que 1) exhibe unión específica a un agente de inducción; 2) exhibe unión específica por lo menos una secuencia de operador tet cuando la proteína represora de tetraciclina no está unida a través de un agente de inducción; y/o 3) es capaz de ser reemplazado o compite con un operador de tetraciclina a través de un agente de inducción. El término "proteína represora de tetraciclina" incluye secuencias de nucleótido de proteína represora de tetraciclina de existencia natural (es decir, nativas) y sus derivados funcionales. Como se utiliza aquí, el término "secuencias reguladoras" se refiere a aquellas secuencias normalmente asociadas con (por ejemplo, dentro de 50 kb de) la región de codificación de un sitio que afecta la expresión de un polinucleótido (incluyendo la transcripción de un gen, y traducción, división, estabilidad o similares de un ARN mensajero). Las secuencias reguladoras incluyen, por ejemplo, promotores, mejoradores, sitios de inhibición y sitios de poliadeniiación. Como se utiliza aquí, el término "secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias de codificación a las cuales están ligadas. La naturaleza de dicha secuencia de control difiere dependiendo del organismo huésped, en procariotes, dichas secuencias de control generalmente incluyen secuencias de promotor, de sitio de unión ribosómico, y de terminación de transcripción; en eucariotes, generalmente, dicha secuencias de control incluyen secuencia de promotores y de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, a un mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes y secuencias de patrón de fusión. Como se utiliza aquí, el término "transgen" se refiere a una secuencia de polinucleótido (que codifica, por ejemplo, uno de los polipéptidos, o una transcripción antisentido de los mismos), la cual ha sido introducida a una célula. Un transgen puede ser parcial o completamente heterólogo, es decir, extraño, al animal transgénico o célula en donde se introduce, u homólogos a un gen endógeno del animal transgénico o célula en donde introduce, pero el cual se diseña para ser insertado, o se inserta en el genoma del animal de tal manera que altera el genoma de la célula en donde se inserta (por ejemplo, se inserta en un sitio que requiere de aquel del gen natural o su inserción da como resultado un ataque). Un transgen también puede estar presente en una célula en la forma de un episoma. Un transgen puede incluir una o más secuencias reguladoras de transcripción y cualquier otro ácido nucleico, tales como intrones, que pueden ser necesarios para la expresión óptima de una secuencia de polinucleótido seleccionada. Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a un vehículo a través del cual un polinucleótido o secuencia de ADN se introduce en la célula. No pretende limitarse a cualquier secuencia específica. El vector por sí mismo puede ser la secuencia de polinucleótido o de ADN que modula al gen endógeno o que puede contener la secuencia de polinucleótido que modula al gen endógeno. De esta manera, el vector puede ser simplemente un polinucleótido lineal o circular que contiene esencialmente solo aquellas secuencias necesarias para la modulación, o pueden ser estas secuencias en un polinucleótido más grande u otra construcción, tal como un genoma viral de ADN o ARN, un virón entero, u otra construcción biológica utilizada para introducir la secuencia de nucleótido críticas a una célula. También se entiende que la frase "construcción de vector", "vector recombinante" o "construcción" pueden ser utilizadas intercambiablemente con el término "vector" aquí. Como se utiliza aquí, las formas en singular "un," "una", "uno" y "el, la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen los mismos significados comúnmente entendidos por aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Cuando se proporciona una escala de valores, se entiende que cada valor de intervención, a la décima de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto claramente indique otra cosa, entre el límite superior e inferior de esa escala, y cualquier otro valor establecido o de intervención en esa escala establecida, queda abarcado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estas escalas más pequeñas independientemente pueden ser incluidos en las escalas más pequeñas, y también quedan abarcados dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en la escala establecida. Cuando la escala establecida incluye uno o ambos de los límites, las escalas que incluyen cualquiera o ambos de estos límites incluidos también quedan dentro de la invención. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado comúnmente entendido por aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se puede utilizar cualesquiera métodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí para la práctica o prueba de la invención, ahora se describirán métodos, dispositivos y materiales representativos.

Operones de Resistencia a Tetraciclina Aunque no crítica, la información con relación a operones de resistencia a tetraciclina (tet) en bacterias brevemente se proporciona para ayudar a facilitar el entendimiento de la presente invención. En un operon (tipo de unidad genética) tet, una secuencia de polinucleótido de interés y un gen que codifica la proteína represora tet (tetR) ambos están bajo el control de los mismos elementos de operador. En ausencia de un agente de inducción, la proteína represora tet se une a la secuencia de operador, evitando así esféricamente que la secuencia de promotor adyacente interactúe con activadores de transcripción, tales como polimerasa ARN. De esta manera, la transcripción de la secuencia de polinucleótido de interés queda bloqueada. Cuando el nivel del agente de inducción dentro de la bacteria se incrementa, el agente se une a la proteína represora tet evitando que está se una a la secuencia de operador. Como resultado, la polimerasa es capaz de unirse a la secuencia de promotor y la secuencia de polinucleótido es transcrita.

Promotores de la Presente Invención En una modalidad, la presente invención se refiere a secuencias de promotor dependiente de ARN-pol lll. Preferiblemente, secuencias de promotor dependientes de ARN-pol lll de la presente invención son inducibles, significando que tales promotores son promotores inducibles. Como se utiliza aquí, el término "inducible" o "promotor(es) inducible", ambos utilizándose aquí intercambiablemente, se refiere al hecho de que las secuencias de promotor de la presente invención son activadas bajo un grupo específico de condiciones químicas. Estas condiciones específicas son la presencia de un agente de inducción que se une a ia proteína represora tet. Por ejemplo, en la presente invención, cuando un agente de inducción está presente, la secuencia de promotor de la presente invención es activada y ocurre la transcripción de una secuencia de polinucleótido de interés, la cual está operablemente enlazada a dicha secuencia de promotor. La presente invención contempla que cualquier secuencia de promotor dependiente de ARN-pol lll puede ser utilizada aquí, incluyendo, pero no limitándose a la secuencia de promotor U6, secuencia de promotor H1 o secuencia de promotor 7SK. Las secuencias de promotor de la presente invención comprenden un elemento TATA, un elemento de secuencia próximo (PSE) que está localizado 5' al elemento TATA, un sitio de estado de transcripción (TSS) que está localizado 3' al elemento TATA, por lo menos un primer operador de tetraciclina (prímer operador tet) y por lo menos un segundo operador de tetraciclina (segundo operador tet). Las secuencias de promotor de la presente invención contienen por lo menos dos operadores de tetraciclina, pero secuencias de promotor conteniendo más de dos operadores de tetraciclina también son contempladas dentro del alcance de la presente invención. En la secuencia de promotor de la presente invención, el primer operador tet está localizado entre el elemento TATA y el PSE (Ver Figura 1). En un aspecto, el primer operador tet esta localizado entre el elemento TATA y el PSE y no forma una porción ni del PSE o el elemento TATA. En otro aspecto, el primer operador tet esta localizado entre el elemento TATA y el PSE y forma una porción de uno o tanto dei PSE como del elemento TATA. El segundo operador tet esta localizado entre el elemento TATA y el TSS (Ver Figura 1). En un aspecto, el segundo operador tet esta localizado entre el elemento TATA y el TSS y no forma una porción ni del TSS ni del elemento TATA. En otro aspecto, el segundo operador tet esta localizado entre el elemento TATA y el TSS y forma una porción de uno o tanto del TSS como del elemento TATA. La disposición de estos elementos sustancialmente no debe interferir con la habilidad de la secuencia de promotor para dirigir la transcripción de una secuencia de polinucleótido corriente abajo de interés o la traducción del producto de gen, si así se desea. Además, los procedimientos para sintetizar o purificar secuencias de promotor, operadores y otras secuencias de polinucleótido son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden ser empleados para construir vectores (los cuales serán descritos con mayor detalle más adelante) con elementos apropiadamente dispuestos como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1989). Al diseñar por ingeniería por lo menos dos operadores de tetraciclina dentro de las ubicaciones específicas de las secuencias de promotor descritas aquí, los inventores de la presente invención han encontrado que cuando las secuencia de promotor de la presente invención son operablemente enlazadas a por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés, que las secuencias de promotor exhiben actividad de transcripción basal más baja comparado con otros promotores dependientes de pol lll inducibles conocidos en la técnica. Consecuentemente, como resultado de los promotores de la presente invención que exhiben una regulación más hermética, estas secuencias de promotor enormemente mejoran la tasa de éxito para ser líneas de célula de ataque inducibles. Las secuencias de polinucleótido del primer operador tet y el segundo operador tet pueden ser iguales (es decir, idénticas) o pueden ser diferentes. El primer operador tet y el segundo operador tet pueden tener cualquier secuencia de polinucleótido siempre que dicha secuencia de polinucleótido sea tal que permita la unión de una proteína represora de tet a uno y/o ambos de dichos operadores en ausencia de un agente de inducción. Por ejemplo, si la secuencia de polinucleótido del primer operador tet y el segundo operador tet son idénticas, las secuencia de polinucleótido de dichos operadores se pueden seleccionar del grupo que consiste de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), tccctatcagtgatagaga (SEC ID NO: 2), tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO: 3), tccctatcagtgatagagagg (SEC ID NO: 4) y ctccctatcagtgatagagaaa (SEC ID NO: 5). Como se mencionó previamente, la secuencia de polinucleótido del primer operador tet y el segundo operador tet no tiene que ser idéntica y puede ser diferente una de la otra. Otra vez, como se mencionó previamente, el primer operador tet y el segundo operador tet pueden tener cualquier secuencia de polinucleótido siempre que dicha secuencia de polinucleótido sea tal que permita la unión de una proteína represora de tet a uno y/o ambos de dichos operadores en ausencia de un agente de inducción. Por ejemplo, la secuencia de polinucleótido del primer operador tet se puede seleccionar del grupo que consiste de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), tccctatcagtgatagaga (SEC ID NO: 2), tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO: 3) tccctatcagtgatagagagg (SEC ID NO; 4) y ctccctatcagtgatagagaaa (SEC ID NO: 5). La secuencia de polinucleótido del segundo operador tet se puede seleccionar independientemente del grupo que consiste de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), tccctatcagtgatagaga (SEC ED NO: 2), tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO: 3) tccctatcagtgatagagagg (SEC ED NO: 4) y ctccctatcagtgatagagaaa (SEC ED NO: 5). Sin embargo, si el primer operador tet tiene una secuencia de polinucleótido de actctatcattgatagagttat (SEC ED NO: 1), entonces el segundo operador tet no debe tener una secuencia de polinucleótido de ctccctatcagtgatagagaaa (SEC ED NO: 5). Sin embargo, se prefiere que el primer operador tet tenga una secuencia de pollnucleótido de tccctatcagtgatagagacc (SEC ED NO: 2) y que el segundo operador de tetraciclina tenga la secuencia de polinucleótido de: actctatcattgatagagttat (SEC ED NO: 1).

Vectores de la Presente Invención Las secuencias de promotor de la presente invención típicamente serán incorporadas en al menos un vector de expresión (tal como, pero no limitándose a, un plásmido, un virus o fago). Aquellos expertos en la técnica conocen un- gran número de vectores adecuados y están comerciaimente disponibles y pueden ser utilizados en la presente invención. Los siguientes vectores son proporcionados a manera de ejemplo. Bacteriano: pINCY (Incite Pharmaceuticais Inc., Palo Alto, Calif), pSPORTI (Life Technologies, Gaithersburg, Md.), pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) pBs, phagescript, ps¡X174, pBluescript SK, pBsKS, pNHda, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eucariótico: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se pueden utilizar otros vectores siempre que sean replicables y viables en un huésped. Si se desea, se pueden generar grandes cantidades del vector ADN (por ejemplo, transfiriendo el vector a bacterias que hacen la proteína represora). El vector de expresión también contendrá por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés. Esta secuencia de polinucleótido de interés puede derivarse de cualquier fuente y puede ser insertada en el vector a través de una variedad de procedimientos que son conocidos por aquellos expertos en la técnica. En general, la secuencia de polinucleótído de interés puede ser insertada en sitios de endonucleasa de restricción apropiados.

Dichos procedimientos y otros están destinados a quedar dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica. El vector de expresión también puede contener un origen de replicación, un sitio de unión de ribosoma para la iniciación de traducción y un terminador de transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, el vector puede contener una o más secuencias del marcador seleccionable, tales como genes de resistencia a antibiótico (por ejemplo, ampicilina, higromicina, G418), ß-galactosidasa, u otros productos de gen que pueden ser utilizados para la selección de células conteniendo el vector. Como se mencionó brevemente antes, el vector puede contener por lo menos una la secuencia de polinucleótido de interés. El vector puede contener dos o más secuencias de polinucleótido de interés, en donde cada secuencia de polinucleótido está operablemente enlazada a su propia secuencia de promotor. La secuencia de promotor para cada secuencia de polinucleótido puede ser igual o diferente, siempre que por lo menos una secuencia de polinucleótido esté operablemente enlazada a por lo menos una secuencia de promotor de la presente invención. Por ejemplo, el vector puede contener una primera secuencia de promotor operablemente enlazada a una primera secuencia de polinucleótido de interés y una segunda secuencia de promotor operablemente enlazada a una segunda secuencia de polinucleótido. La primera y segunda secuencia de promotor cada una puede ser la secuencia de promotor de la presente invención o puede ser secuencias de promotor diferentes siempre que por lo menos una de la primera o segunda secuencia de promotores sea la secuencia de promotor de la presente invención. Ejemplos de secuencia de promotores adecuados que no son las secuencias de promotor de la presente invención y pueden ser operablemente enlazadas ya sea a la primera o segunda secuencia de polinucleótidos de interés incluye, pero no se limitan a, LTR o el promotor SV40, el E. coli lac o trp, el promotor phage lambda P sub L y otros promotores conocidos por aquellos expertos en la técnica. También se pueden incluir con dicho promotor otras secuencias reguladoras y/o de control. Alternativamente, la primera y segunda secuencias de polinucleótidos de interés pueden ser enlazadas en tándem y operablemente enlazadas en una forma apropiada a la secuencia de promotor de la presente invención. Los vectores descritos aquí pueden ser introducidos (es decir, transformados o transfectados) a células huésped, tales como células de mamífero (tal como, pero no limitándose a, simio, canino, felino, bovino, equino, roedor, murino, etc.) o de no mamífero (tales como, pero no limitándose a, insectos, reptiles, peces, aves, etc.), utilizando cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica incluyendo, pero no limitándose a, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, DEAE dextrano, lipofección, y endocitosis mediada por receptor, polibreno, bombardeo de partículas, y microinyección. Alternativamente, el vector puede ser suministrado a las células como una partícula viral (ya sea competente o deficiente de replicación). Ejemplos de virus útiles para el suministro de ácido nucleico incluyen, pero no se limita a, lentivirus, adenovirus, virus asociados con adeno, retrovirus, virus de Herpes, y virus de vacuna. Otros virus adecuados para el suministro de secuencias de polinucleótido a células que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica pueden ser equivalentemente utilizados en la presente invención. Las células huésped diseñadas por ingeniería pueden ser cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar las secuencias de promotor, seleccionar células transfectadas, etc. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas previamente utilizadas con la célula huésped seleccionada para expresión, y serán evidentes para aquellos expertos en la técnica. De preferencia, el vector recombinante es transferido, transformado o transfectado a una célula huésped que ha sido diseñada por ingeniería para expresar la proteína represora tet. Existe un número de formas para diseñar por ingeniería células huésped para que expresen la proteína represora tet. Por ejemplo, una forma es enlazar operablemente la secuencia de gen de represor tet a una secuencia de promotor y después incorporar esto al vector que contiene la secuencia de promotor de la presente invención operablemente enlazada a la secuencia de polinucleótido de interés en tándem y después transferir, transformar o transfectar el vector a las células huésped. En dicho vector de expresión, la secuencia de represor tet será operablemente enlazada a una segunda secuencia de promotor (la primera secuencia de promotor siendo la secuencia de promotor que contiene por lo menos dos operadores tet y operablemente enlazada a la secuencia de polinucleótido de interés). Si el vector recombinante contiene por lo menos dos secuencias de polinucleótido de interés, entonces la secuencia de represor tet será operablemente enlazada a una "segunda" o "tercera" secuencia de promotor dependiendo de si las secuencias de polinucleótido de interés cada una está operablemente enlazada a un solo promotor u operablemente enlazada a promotores separados. Alternativamente, las células pueden ser transformadas o transfectadas con un vector recombinante separado que contiene la secuencia de represor tet operablemente enlazada a una secuencia de promotor antes de la transferencia del vector que contiene la secuencia de promotor de la presente invención operablemente enlazada a la secuencia de polinucleótido de interés. Ejemplos de "una secuencia de promotor" o "segunda" o "tercera" secuencia de promotor que pueden ser operablemente enlazada a la secuencia de represor tet incluyen, pero no se limitan a, LTR o el promotor SV40, la lac o trp de E. coli, el promotor phage lambda P sub L y otros promotores que se sabe que controlan la expresión de secuencias de represor tet. También en dicho promotor se pueden incluir otras secuencias reguladoras y/o de control. Las células huésped que contienen el vector(s) incorporado pueden ser identificadas utilizando técnicas de hibridación que con bien conocidas por aquellos expertos en la técnica o utilizando la reacción de cadena de polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de polinucleótido específicas. Si la secuencia de polinucleótido transferida a las células produce una proteína que puede ser detectada, por ejemplo, a través de un ensayo inmunoiógico o enzimático, entonces la presencia de la proteína recombinante puede ser confirmada introduciendo tetracicllna a células y después realizando los ensayos ya sea en el medio que rodea las células o en iisatos celulares. Como se discutió previamente aquí, en ausencia de cualquier agente de inducción, las células huésped transformadas o transfectadas con los vectores recombinantes que contienen las secuencias de promotor descritas aquí exhiben una actividad transcripcional basal inferior comparado con otras secuencias de promotor dependientes de pol lll inducibles conocidas en la técnica. Sin embargo, la transcripción de por lo menos una la secuencia de polinucleótido de interés incorporada en las células huésped puede lograrse utilizando un agente de inducción. La cantidad de agentes de inducción que se agregará a las células huésped para lograr la transcripción de por lo menos una la secuencia de polinucleótido de interés puede ser fácilmente determinada por aquellos expertos en la técnica. Una vez inducida, la transcripción de por lo menos una secuencia de polinucleótido produce una molécula de ARN. De preferencia, esta molécula de ARN modula la expresión de un gen objetivo en la célula huésped. Si la célula huésped ha sido transformada o transfectada con un vector recombinante que contiene más de una secuencia de polinucleótido de interés, cada secuencia de polinucleótido producirá una molécula de ARN. De preferencia, estas moléculas de ARNs modularán la expresión de más de un gen objetivo en una célula huésped. Por ejemplo, si dichas células huésped se transforman o transfectan con dos secuencias de polinucleótido de interés, la primera secuencia de polinucleótido de interés puede, como resultado de la transcripción, producir una primera molécula de ARN que modula la expresión de un primer gen objetivo en dicha célula. La segunda secuencia de polinucleótido de interés también puede, como resultado de la transcripción, producir una segunda molécula de ARN que modula un segundo gen objetivo en dicha célula. Preferiblemente, el segundo gen objetivo es diferente al primer gen objetivo. También, de preferencia, la modulación se logra a través de la primera y/o segunda molécula de ARN en inhibición o supresión del primer y/o segundo gen objetivo. Sin embargo, la presente invención contempla que una molécula de ARN puede inhibir o suprimir a un primer gen objetivo, mientras que la segunda molécula de ARN puede activar o estimular un segundo gen objetivo.

ARN de Interferencia Pequeña y ARN de Horquilla Corta Se proporciona una pequeña descripción de ARNsi y ARNsh para ayudar a facilitar el entendimiento de la presente invención. Varias Publicaciones de Solicitud de Patente de E.U.A. y de P.C.T. enseñan métodos preferidos para diseñar, sintetizar, purificar y suministrar ARNsis y ARNshs a células. En particular, la Publicación de la Solicitud de Patente de E.U.A. 2003/0148519, la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad, proporciona composiciones y métodos para la expresión intracelular y suministro de ARNsis y ARNshs en células de mamífero; y la Publicación de E.U.A. de la Solicitud de Patente de E.U.A. 2002/0132788, la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad, proporciona un procedimiento para suministrar ARNsis a células in vivo con el propósito de inhibir la expresión del gen en esas células. Los ARNs de interferencia pequeña (ARNsis) son dúplex intermoleculares cortos, generalmente compuesto de dos estructuras de cadena diferentes de ARN (sentido y antisentido), cada uno con aproximadamente 21 nucleótidos, que forman alrededor de 19 pares de base, con 3' de estructura de cadena individual colgando de 1-3, preferiblemente 2 nucleótidos. Las regiones de pares de base de ios ARNsis generalmente y sustancialmente corresponden, pero de preferencia son exactos a un "gen objetivo" y su complemento, en la transcripción de ARN que será dirigida para degradación o inhibición de traducción. Los aspectos específicos y necesarios de los ARNsis requeridos para la inducción de la degradación eficiente o silenciación de transcripciones de ARN correspondientes han sido investigados junto con los aspectos del gen objetivo dentro de la transcripción activada. Los métodos para el diseño de ARNsis efectivos se describen en Tuschl et al., Genes & Dev., 13:3191-3197 (1999) y Elbashir et al., EMBO J., 20:6877-6888 (2001), cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia. Para los propósitos de la presente invención, los ARNs de estructura de cadena individual, individuales, que comprenden ARNsis son sintetizados endógenamente (dentro de células). Las dos estructuras de cadena individual complementarias después deben ser fijadas para formar un aspecto doble de ARN-ARNsi. El paso de fijación también ocurre endógenamente. Los ARNs de estructura de cadena individual endógenamente sintetizados, son sintetizados a través de polimerasas de ARN celulares, utilizando los vectores descritos aquí que contienen los promotores de la presente invención. Los ARNs de horquilla corta (ARNshs), son ARNs de estructura de cadena individual con regiones de auto-complementariedad que pueden formar pares entre sí, permitiendo que la estructura de cadena individual se duplique a un dúplex intramolecular con una estructura de tipo vástago-lazo. Aunque la región de lazo impar teóricamente puede ser de cualquier tamaño, es ventajoso para el lazo que sea suficientemente pequeño para permitir fácilmente secuencias de auto-complementaridad dentro del mismo ARN de estructura de cadena individual para encontrarse entre sí y los pares de base. Los tamaños preferidos de lazo son de 4 a 9 nucleótidos, y más grandes, siendo muy preferidos de 5-8 nucleótidos. Generalmente, la secuencia del lazo no es importante, sin embargo, no debe contener una secuencia palíndroma. Dentro de la célula, el lazo de un ARNshs es separado y un dúplex intramolecular, no diferente a un ARNsi, se forma. La región de vastago del ARNsh generalmente debe contener alrededor de 19-29 pares de base, y generalmente el extremo 3' de la ARNsh extendiéndose más allá de la región en pares está compuesto de múltiples residuos de timidllato. Las regiones de pares de base de ARNshs generalmente corresponden sustancial, preferible y exactamente a un gen objetivo y su complemento en la transcripción ARN que será activado para degradación, justo como la región de pares de base en ARNsis. Como las estructuras de cadena individuales de los ARNsis, los ARNshs pueden ser sintetizados ya sea endógena o exógenamente. Los ARNshs endógenamente sintetizados en general son sintetizados a través de polimerasa de ARNs utilizando los vectores descritos aquí que contienen los promotores de la presente invención.

Métodos para Modular la Expresión de Gen en Mamíferos no Humanos En otra modalidad, la presente invención se refiere a métodos para modular la expresión de por lo menos una gen objetivo en al menos una célula eucarióticas en un animal no humano. Estos métodos implican inducir la transcripción de una secuencia de polinucleótido de interés utilizando las secuencias de promotor y vectores recombinantes descritos aquí. Como se discutió previamente, la transcripción de dicha secuencia de polinucleótido de interés produce por lo menos una molécula de ARN. Ejemplos de moléculas de ARN que pueden ser producidas incluyen, pero no se limitan a, ARNsi o ARNsh. Estas moléculas de ARNs después pueden ser utilizadas para modular la expresión de por lo menos un gen objetivo en dichas células. Las secuencias de promotor y vectores de la presente invención descritas aquí se pueden utilizar en una variedad de métodos para modular la expresión de por lo menos una gen objetivo en una célula eucariótica. Más específicamente, el método implica proporcionar por lo menos una célula eucariótica y después transformar o transfectar dicha célula eucariótica con al menos uno e los vectores recombinantes descritos aquí. Al menos una secuencia de polinucleótido de interés contenida dentro de los vectores recombinantes descritos aquí, después de la transcripción preferiblemente produce por lo menos una molécula de ARN que modula la expresión de por lo menos una gen objetivo en dicha célula. Dependiendo del propósito pretendido, por lo menos una molécula de ARN puede ya sea 1) activar o estimular el gen objetivo o 2) inhibir o suprimir el gen objetivo. Por ejemplo, si un gen objetivo en una célula eucariótica va a ser "atacado", entonces la molécula de ARN producida puede ser ARNsi o ARNsh. Es conocido por aquellos expertos en la técnica que ARNsi o ARNsh puede ser utilizado para "atacar" genes objetivo. Por lo tanto, el resultado de esta modulación podría ser inhibir o suprimir el gen objetivo. Aquí se describen métodos para hacer secuencias de polinucleótido de interés que codifican ARNsi o ARNsh.

Animales no Humanos Transgénicos En otra modalidad, la presente invención se refiere a animales no humanos transgénicos que contienen las secuencias de promotor y vectores descritos aquí así como métodos para hacer dichos animales. Una variedad de métodos se puede utilizar para crear los animales no humanos transgénícos de la presente invención. Por ejemplo, la generación de una alteración específica de una secuencia de polinucleótido de un gen objetivo es un aspecto que puede ser utilizado. Las alteraciones se pueden lograr a través de una variedad de métodos enzimáticos y químicos utilizados in vitro. Uno de los métodos más comunes utiliza un oligonucleótido específico como un mutagen para generar eliminaciones precisamente diseñadas, inserciones y mutaciones de punto en un gen objetivo. En segundo lugar, un gen humano de tipo silvestre y/o un gen de animal no humano humanizado puede ser insertado a través de recombinación homologa. También es posible insertar un gen humano alterado o mutante (individual o múltiple) como construcciones genómicas o de minigen utilizando el promotor de la presente invención. Además, también se pueden hacer animales no humanos transgénicos, en donde por lo meno un gen objetivo endógeno es "atacado". La creación de animales atacados permite a aquellos expertos en la técnica determinar la función in vivo del gen que ha sido "atacado". El ataque de por lo menos un gen objetivo puede lograr acoplarse en una variedad de formas. Una estrategia que puede ser utilizada para "atacar" un gen objetivo es a través de la inserción de fragmentos artificialmente modificados del gen endógeno a través de recombinación homologa. En esta técnica, se introducen alelos mutantes a través de recombinación homologa a células de tallo embriónicas (ES). Las células del tallo embriónicas contienen una mutación de ataque en un alelo de gen que se está estudiando se introducen en un blastocito. Los animales resultantes son quimeras que contienen tejidos derivados tanto de las células ES transplantada como de células huésped. Los animales quiméricos con apareados para determinar si la mutación se incorporo en la línea germinal. Aquellos animales genómicos cada uno heterocigoto para la mutación de ataque son apareados para producir ratones de ataque homocigotos. Una segunda estrategia que puede ser utilizada para "atacar" por lo menos un gen involucra utilizar ARNsi y ARNsh y microinyección dé oocito o transfección o microinyección en células de tallo embriónicas como se describe más adelante. Como se mencionó previamente, ya que la secuencia de promotor de la presente invención exhiben regulación más hermética, estas secuencias de promotor enormemente mejoran la tasa de éxito para ser medios de célula de ataque inducibles y animales cuando se compara con otras secuencias de promotor conocidas en la técnica. Para crear un animal no humano transgénico que tenga una versión alterada de un gen objetivo humano, una secuencia de polinucleótido de interés puede ser insertada en una línea germinal de animal no humano utilizando técnicas estándares de microinyección o transfección de oocito o microinyección en células del tallo embriónicas. Alternativamente, si se desea atacar o reemplazar un gen endógeno, la recombinación homologa utilizando células del tallo embriónicas ARNsi o ARNsh utilizando microinyección o transfección de oocito o microinyección de células del tallo embriónicas puede ser utilizada como se describe aquí. Para la inyección de oocito, por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés que está operablemente enlazada al promotor de la presente invención puede ser insertada en el pro-núcleo de un oocito de animal no humano ya fertilizado. Este oocito después es reimplantado en una madre colactánea pseudopreñada. El animal no humano vivo al nacer después puede ser clasificado para integrantes analizando el ADN del animal (utilizando, por ejemplo, reacción de cadena de polimerasa (PCR)) tal como de la cola, para la presencia de la secuencia de polinucleótido de interés. Después se identifican los animales no humanos quiméricos. El transgen puede ser una secuencia genómica completa inyectada como un YAC o fragmento de cromosoma, un ADNc, un minigen conteniendo la región de codificación completa y otros elementos encontrados como necesarios para una óptima expresión. La infección retroviral o lentiviral (Ver, Lois C, et al., Science, 295:868-872 (2002) (la cual enseña métodos para transgénicos utilizando transgénesis lentiviral)) de embriones tempranos también se puede realizar para insertar un gen alterado. En este método, el gen alterado es insertador en un vector retroviral, el cual se utiliza para infectar directamente embriones de ratón durante las primeras etapas del desarrollo para generar una quimera, algunas de las cuales conducirán a la transmisión de línea germinal (Jaenisch, R., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 73: 1260-1264 (1976)). La recombinación homologa utilizando células de tallo embriónicas permite la clasificación de células de transferencia de gen para identificar los eventos de recombinación homologa raros. Una vez identificados, estos pueden ser utilizados para generar quimeras a través de la inyección de al menos un blastocito de animal no humano y una proporción de los animales resultantes mostrará transmisión de línea germinal a partir de la línea recombinante. Esta metodología de activación de gen es especialmente útil si la inactivación del gen es deseada. Por ejemplo, la inactivación del gen puede ser realizada diseñando un fragmento de polinucleótido que contiene secuencias de un exón que flaquea un marcador seleccionado. La recombinación homologa conduce a la inserción de las secuencias marcadoras a la mitad de un exón, inactivando el gen. El análisis de ADN de clones individuales después puede ser utilizado para reconocer los eventos de recombinación homologa. Alternativamente, el "ataque" de un gen objetivo puede lograrse utilizando ARNsi o ARNsh. En una estrategia, se puede utilizar microinyección de oocito como se describe aquí. Específicamente, un transgen que comprende por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés que expresa por lo menos una molécula de ARN que es ARNsi o ARNsh y que operativamente esta enlazada a por lo menos una secuencias de promotor dependiente de ARN-pol lll de la presente invención se prepara utilizando los métodos descritos aquí. Este transgen es introducido a un oocito fertilizado de animal no humano preferiblemente a través de inyección. El oocito fertilizado después se deja desarrollar a un embrión. El embrión resultante después es transferido a un animal no humano hembra seudopreñado y después se deja seguir hasta el nacimiento. Después, los animales no humanos vivos al nacer son clasificados para animales quiméricos que contienen el transgen obteniendo una muestra y analizando el ADN del animal (utilizando técnicas tales como PCR) y dichos animales no humanos quiméricos son identificados. Cuando estos animales no humanos son tratados con un agente de inducción, se induce la transcripción, el ARNsi o ARNsh es expresado, y el gen objetivo es reprimido o "atacado". En ausencia del agente de inducción, el gen no es reprimido o "atacado". En una segunda estrategia, se puede utilizar la microinyección de células de tallo embriónicas como se describe aquí. Específicamente, un transgen que comprende por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés que expresa por lo menos una molécula de ARN que es ARNsi o ARNsh esta operablemente enlazada a por lo menos una secuencias de promotor dependiente de ARN-pol lll de la presente invención se prepara utilizando los métodos descritos aquí. Este transgen es introducido a células de tallo embriónicas del animal no humano que pueden ser utilizadas para generar quimeras introduciendo estas células del tallo embriónicas, preferiblemente a través de inyección, en al menos un blastocisto de animal no humano. El blastocisto resultante después es implantado en un animal no humano hembra seudopreñado y después se deja nacer para dar un animal no humano quimérico. Se puede utilizar PCR para identificar a los animales de interés. Después, los animales no humanos nacidos vivos son clasificados para animales quiméricos que contienen ei transgen obteniendo y analizando una muestra de dicho ADN del animal (utilizando técnicas tales como PCR) y dichos animales no humanos quiméricos son identificados. Este animal no humano quimérico después puede ser utilizado para crianza para producir un animal no humano transgénico que establemente contenga este transgen dentro de su genoma. Como con el método previo, cuando estos animales no humanos son tratados con un agente de inducción, la transcripción es inducida, el ARNsi o ARNsh es expresado, y el gen objetivo es reprimido o "atacado". En ausencia del agente de inducción, "el gen no es reprimido ni "atacado". Los métodos para hacer animales transgénicos se describen, por ejemplo, en Wall et al., J. Cell Biochem., June: 49(2), 113-20 (1992); Hogan, et al., ¡n "Manipulating the mouse embryo", A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1992); en WO 91/08216 o patente de E.U.A. No. 4,736,866 las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad. A manera de ejemplo, y no de limitación, se proporcionarán ahora ejemplos de la presente invención.

EJEMPLO 1: Desarrollo de un Promotor U6 Herméticamente Regulado Para la Expresión de ARNsh a. Ensayo de Luciferasa Se transfectaron construcciones del reportero de luciferasa, pGL-3 (Promega, Madison Wisconsin) y pRL-TK (Promega, Wisconsin) a células utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California). Se determinó la actividad de tuciferasa utilizando el Sistema de Ensayo Doble de Luciferasa (Promega, Madison, Wisconsin). b. Análisis western Se lisaron directamente células en placas de 6 cavidades en un regulador de pH de muestra IX Laemmii. Las proteínas se separaron a través de SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF, y se realizó la tinción western utilizando anticuerpos contra Chk1 (1:200, Santa Crutz Biotechnology, Santa Crutz, CA 95060), H1F-1 alpha (1:500, BD Bioscience, Palo Alto, CA 94303) o tetR (1:2000, Mo Bi Tec, Alemania). c. Cultivo de célula Se desarrollaron células D54-MG (una línea de célula de propietario perteneciente a Abbott Laboratories) en un medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de bovino fetal al 10% (FBS). Se desarrollaron células HeLa-TREx (Invitrogen) en un medio esencial mínimo (MEM) suplementado con FBS al 10%. Se desarrollaron células H1299 (una línea de célula de propietario perteneciente a Abbott Laboratories) en un medio RPMI1640 suplementado con FBS al 10%. Todas las células se mantuvieron a 37°C en un ambiente de 5% C02. Las líneas de célula D54-MG-tetR se establecieron transfectando la línea de célula de origen de D54-MG con pcADN6/TR (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA92008) y se seleccionaron utilizando 10 µg/ml de blasticidina. d. Clonación Molecular El promotor U6 se sintetizó utilizando la reacción de cadena de polimerasa (PCR). Todas las reacciones de PCR se realizaron de acuerdo con Advantage2 PCR Kit (BD Bioscience Clontech, Palo Alto, CA) utilizando los siguientes iniciadores: U6_1: gatcgaattccaggcaaaacgcaccacgtgacggagcgtgaccgcgcgccgagcgcgcgcc aaggtcgggcagga (SEC ID NO: 19).

U6_2: aacagccttgtatcgtatatgcaaatatgatggaatcatgggaaataggccctcttcctgcccgac cttggcgcg (SEC ID NO: 20).

U6_3: atatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattag tataaaata (SEC ID NO: 21).

U6_4: aaacataattttaaaactgcaaactacccaagaaattattactttctacgtcacgtattttatactaa tatcttt (SEC ID NO: 22).

U6_5: gcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttct tggct (SEC ID NO: 23).

U6_6: tctagaagcttggtgtttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatact (SEC ID NO: 24).

Después de ser ensamblado utilizando ios iniciadores U6_1, U6_2, U6_3, U6_4, U6_5 y U6_6, el promotor U6 de longitud completa se amplificó utilizando el par iniciador U6_5'PCR (gatcgaattccaggcaaaacgcaccacgtg) (SEC ID NO: 25) y U6_3'PCR (tctagaagcttggtgtttcgtcctttccac) (SEC ID NO: 26). El fragmento de PCR amplificado se clonó a los sitios EcoRI y Hindlll de pBluescriptlI (SK+) para crear pU6.

Se generaron variantes del promotor U6 regulado con tetraciclina pU6_01, pU6_02, pU6_0102_1, pU6_0102_2, pU6_0102_3, pU6_0102_4, pU6_0102_5, pU6_0102_6 y pU6_202 a través de modificación de PCR de! promotor U6. Se utilizó U6_5'PCR como el iniciador 5' y se utilizaron los siguientes iniciadores como los iniciadores 3', respectivamente: Olrev: ggtgtttcgtcctttccacaagatatataactctatcaatgatagagtactttcaagttacggtaagc atatgata (SEC ID NO: 27). 02rev: tttctctatcactgatagggagatatataaagccaagaaatcgaaatac (SEC ID NO: 28) 0102_rev: tctagaagcttggtgtttcgtcctttccacaagatatataactctatcaatgataga (SEC ID NO: 29). 0102_1: ggtttctctatcactgatagggatatataactctatcaatgata (SEC ID NO: 30). 0102_2: ggtgtctctatcactgatagggatatataactctatcaatgatagagtactttcaa (SEC DD NO: 31). 0102_3: ggtctctatcactgatagggagatatataactctatcaatgataga (SEC ID NO: 32). 0102_4: tctctatcactgatagggagagatatataactctatcaatgatagagt (SEC ID NO: 33). 0102_5: ataactctatcaatgatagagtactttcaagttacggtaagcatctctatcactgatagggaacata attttaaaactgcaaact (SEC ID NO: 34). 0102_6: ataactctatcaatgatagagtactttcaagttacggtaagcatatgatctctatcactgataggga attttaaaactgcaaactac (SEC ID NO: 35). 202: ggtctctatcactgatagggagatatataatctctatcactgatagggagtttcaagttacggtaag catatgatagtcc (SEC ID NO: 36).

En resumen, se generaron pU6_01 y pU6_02 a través de PCR utilizando pU6 como plantilla y U6_5'PCR y 01 rev o pU6_02 como iniciadores respectivamente. Las variantes del promotor U6 reguladas con tetraciclina pU6__0102_1, pU6_0102_2, pU6_0102_3, y pU6_0102_4, se crearon a través de PCR utilizando pU6_01 como plantilla, U6_5'PCR como iniciador 5', y 0102_1, 0102_2, 0102_3, o 0102 4 como iniciadores 3' respectivamente. Se generaron pU6_0102_5 y pU6_0102_6 a través de dos pasos de PCR. En el primer paso, pU6_01 se utilizó como plantilla, los pares de iniciador U6_5'PCR y 0102_5 o U6_5'PCR y 0102_6 se utilizaron como iniciadores, respectivamente. En el segundo paso, los productos de PCR del primer paso cada uno se utilizó como una plantilla, y U6_5'PCR y 0102_rev se utilizaron como iniciadores. La variante de promotor U6 con dos operadores tet de tipo 02, pU6_202, se generó a través de PCR utilizando pU6 como plantilla y U6_5'PCR y 202 como iniciadores. Las variantes del promotor U6 que expresan luciferasa de activación de ARNshs, o HIF-1a se designaron como U6_luc, 01_luc, 02_luc, 0102_luc1, 0102_luc2, 0102_luc3, 0102_luc4, 0102_luc5, 0102_luc6, 202_luc, y 2O2_Hif1. Estas construcciones fueron generadas a través de PCR a partir de cada variante de promotor utilizando los iniciadores U6_5'PCR y los siguientes iniciadores 3' respectivamente, con la excepción de que el iniciador 0102_luc_rev se utilizó para crear tanto 0102_luc5 y 0102_luc6. Los fragmentos de PCR se clonaron en el sitio EcoR I y Hind III de pBluescript II (SK+). 01_luc: gatcaaagcttaaaaaaggacatcacttacgctgagtctcttgaactcagcgtaagtgatgtccg gtgtttcgtcctttccacaa (SEC ID NO: 37). 02_luc: tagaagctt aaaaa ggacatcacttacgctgag tctcttgaa ctcagcgtaagtgatgtcc tttctctatcactgatag (SEC ID NO: 38). 0102 luc rev: gatcaaagcttaaaaaaggacatcacttacgctgagtctcttgaactcagcgtaagtgatgtccg gtgtttcgtcctttccacaa (SEC ID NO: 39). 0102_luc1: gatcaaagcttaaaaaaggacatcacttacgctgagtctcttgaactcagcgtaagtgatgtccg gtttctctatcactgataggg (SEC ID NO: 40). 0102_iuc2: gatcaaagcttaaaaaaggacatcacttacgctgagtctcttgaactcagcgtaagtgatgtccg gtgtctctatcactgataggg (SEC ID NO: 41). 0102_luc3: gatcaaagcttaaaaaaggacatcacttacgctgagtctcttgaactcagcgtaagtgatgtccg gtctctatcactgatagggag (SEC ID NO: 42). 0102_luc4: gatcaaagcttaaaaaaggacatcacttacgctgagtctcttgaactcagcgtaagtgatgtcctc tctatcactgatagggagag (SEC ID NO: 43). 202_luc: gatcaaagcttaaaaaaggacatcacttacgctgagtctcttgaactcagcgtaagtgatgtccg gtctctatcactgatagggag (SEC ID NO: 44). 202_HIF1A: gatcaaagcttaaaaaagacagtacaggatgcttgctctcttgaagcaagcatcctgtactgtcg gtctctatcactgatagggag (SEC ID NO: 45). e. Actividad de Transcripción y Respuesta de Tetraciclina de Variantes del Promotor U6 Los plásmidos que utilizan cada una de las variantes del promotor U6 para expresar los ARNshs se designan como U6_luc, 01_luc, 0102_luc1, 0102_luc2, 0102Juc3, 0102_luc4, 0102_luc5, y 0102_luc6. Cada uno de estos plásmidos (0.008 µg) o un vector de control (es vector de control es idéntico al vector pU6 pero no contiene un ARNsh contra luciferasa) fue co-transfectado con 1 µg pGL3-control y 0.5 µg pRL-TK (Los plásmidos del control pGL3 y pRL-TK cada uno expresa luciferasa de luciérnaga y luciferasa de renilla. El ARNsh en cada una de estas construcciones fue diseñado para inhibir luclferasa de luciérnaga. La luciferasa de renilla se utilizo para propósitos de normalización. La transfección fue realizada utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. La actividad de luciferasa en células transfectadas se determinó 72 horas después de la transfección. U6_luc, 01_luc, 0102_3, 0102 4, 0102_luc5, 0102_luc6 (0.2 µg each) y un plásmido de control también fueron co-transfectados en forma separada con 1 µg pGL3-control, 0.5 µg pRL-TK y 1 µg de pcADN6/TR. Además, un plásmido de control, U6_luc, 01_iuc, 02_luc, y 202_luc (cada 2 µg) fueron co-transfectados en forma separada con 1 µg pGL3-control, 0.5 µg pRL-TK y 1 µg de pcADN6/TR. Para tratamiento con doxiciclina, las células fueron cambiadas a un medio de cultivo conteniendo 1 µg /ml de doxiciclina 24 horas después de la transfección. Se determinó la actividad de luciferasa 48 horas antes de la inducción a través de doxiciclina. f. Comparación de ¡os sistemas de expresión tetOl y 202 para hacer líneas de célula estable expresando ARNsh de luciferasa Se transfectaron células D54MG-tetR con 01_luc (01_luc1 ....01_luc4), 202_luc (202_luc1 ... 202_luc7) establemente integrados o el vector 202 (de control) con 1 µg pGL3-control y 0.5 µg pRL-TK. Para el tratamiento con doxiciclina, las células fueron cambiadas a un medio conteniendo 1 µg/mi de doxiciclina 24 horas después de la transfección. Se determinaron las actividades de luciferasa 48 horas después de la inducción a través de doxiciclina. Las células fueron lisadas después de tratamiento con 1 µg/ml de doxlciclina durante 48 horas y se analizaron a través de tinción western utilizando un anticuerpo anti-tetR. La misma tinción fue dividida e inmunoteñida con un anticuerpo anti-actina para mostrar la carga igual de muestra en cada carril. g. Comparación del sistema de expresión tetOl y 202 para hacer líneas de célula estable que expresan ARNsh de Hif-1 Se trataron líneas de célula D54-MG-TetR con un cásete integrado 01 _H if 1 o un cásete 202_Hif1con 1 µg/ml de doxiciclina durante 48 horas seguido por un tratamiento de seis horas con 100 µM de desferoxamina (DFO). Las células fueron lisadas en 1X de regulador de pH de muestra Laemmii y se analizaron a través de tinción western utilizando un anticuerpo contra Hif-1 alpha (1:500). h. Resultados Los inventores de la presente invención primero examinaron si se podían diseñar por ingeniería dos operadores tet en el promotor U6 sin eliminar la actividad de transcripción. Un operador tet de tipo 01 primero fue diseñado por ingeniería entre el PSE y la caja TATA para crear un promotor U6 de tipo 01 que es idéntico a aquel reportado por Ohkawa, J., et al., Human Gene Therapy, 11:577- 585 (2000) (Ver, Figura 1, 01). Después se creó un panel de promotores U6 humanos modificados con dos operadores tets reemplazando parte del promotor de tipo 01 con un operador tet de tipo 02 (Ver Figura 1). Las actividades de transcripción de los promotores U6 humanos modificados se analizaron a través de la habilidad de cada promotor para expresar una luciferasa que tiene por objetivo el ARNsh e inhibir la actividad de reportero. Con base en un experimento de dosis-respuesta utilizando U6_iuc, que utilice el promotor U6 silvestre para dirigir la expresión de una ARNsh de luciferasa, una cantidad del plástico de ARNsh (0.008 µg) que exhibe un 80% de inhibición de la actividad de reportero se seleccionó para la evaluación de la actividad de transcripción exhibida por los promotor U6 modificados. El grado de inhibición varió en células transfectadas con derivados U6 que contienen los operadores tet tanto de tipo 01 como 02. Se observó un grado similar de inhibición en ia actividad de luciferasa en células transfectadas con 01_luc, 0102_luc3, 0102_luc4, 0102_luc5, y 0102_luc6, sugiriendo que la introducción de un operador tet de tipo 02 adicional al promotor de tipo 01 en estas posiciones tiene solamente un efecto marginal sobre la actividad de transcripción (Figura 2A, 0102_3, 0102 4, 0102 5, y 0102_6). Después se examinaron los derivados del promotor U6 activos para su respuesta al agente de inducción, doxiciclina. Se observó una fuerte inhibición de la actividad de luciferasa en células transfectadas con 01_luc, 0102_luc5, y 0102_luc6, sin considerar la presencia o ausencia de doxiciclina, sugiriendo que estos promotores son muy débiles bajo estas condiciones experimentales (Ver, Figura 2B, O, 0102_luc5, y 0102_luc6). En contraste, las células transfectadas con Q102__luc3 y 0102_luc4 exhibieron una actividad de luciferasa mucho menor en presencia de doxiciclina que en ausencia de doxiciclina. Sin embargo, aún en ausencia de doxiciclina, las células transfectadas con 0102_luc3 y 0102_luc4 exhibieron una reducción del >50% de la actividad de luciferasa, comparado con células transfectadas con un vector de control (Ver, Figura 2B, 0102_3, y 0102_4), sugiriendo que estos promotores siguen siendo muy débiles a pesar de su regulación mejorada comparada con el promotor de tipo 01. Para mejorar más el sistema de inducción, el operador tet de tipo 02 fue introducido para reemplazar ai operador tet de tipo 01 en 0102_3 para generar un promotor de tipo 202 (Ver, Figura 1, 202). Ya que el operador tet de tipo 02 tiene una afinidad de unión mayor para tetR que el operador tet de tipo 01 (Ver, Hillen, W., et al., Annu. Rev, Microbiol, 48:345-69 (1994)), los Inventores creen que probablemente fue que tetR podría unirse más herméticamente al promotor de tipo 202 que el promotor de tipo 0102_3, dando como resultado una actividad de transcripción basal reducida del promotor. En ausencia de doxiciclina, 0102_luc3 ocasionó una reducción dei >70% de la actividad de luciferasa, comparado con el plásmido de control. Bajo las mismas condiciones, 202_luc no ocasionó más de un 30% de inhibición de la actividad de luciferasa (Ver, Figura 2C), indicando que el promotor 202 en realidad tiene una actividad basal menor comparado con el promotor 0102_3. Mientras tanto, 02_luc ocasionó una reducción de aproximadamente 85% de la actividad de luciferasa, sugiriendo que los dos operadores tet de tipo 02 son necesarios al mismo tiempo para proporcionar un control hermético de la expresión de ARNsh en ausencia de doxiciclina (Ver, Figura 2C). En presencia de doxiciclina, tanto 0102_luc3 y 202_luc exhibieron una inhibición de más de 80% de la actividad de luciferasa, sugiriendo que los promotores de tipo 202 y 0102_3 tiene actividades similares después de inducción (Ver, Figura 2C). Estos resultados demostraron que es posible diseñar por ingeniería dos operadores tet en el promotor U6 sin sacrificar dramáticamente la actividad de transcripción. Mientras tanto, con dos operadores tet de tipo 02 flanqueando la caja TATA, la variante del promotor U6 resultante, 202, exhibió la mejor respuesta a doxiciclina comparado con las variantes del promotor U6 con un solo operador tet (01 o 02) o una combinación de operadores tet de tipo 01 y 02. Para determinar si el promotor 202 retiene la habilidad de responder a doxiciclina después de integrarse a cromosomas, los inventores utilizaron una línea de célula de expresión tetR comercial, HeLaTREx, (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008) para establecer clones estables que llevan el promotor 202 enlazado a un Hifla humano de activación en ARNsh (202_Hif1). Entre los cinco clones que llevan el cásete 202_Hif1, dos clones exhibieron una reducción de más de 90% de la proteína Hifla después de inducción (Ver, Figura 3A, H if 1 -6 y Hif 1 -7). Estos resultados demostraron que el promotor 202 retiene su propiedad sensible a doxiciclina después de integrarse a un cromosoma. Al utilizar el clon 202_Hif1 mejor regulado (Hif 1 -7), los inventores además caracterizaron la dependencia de tiempo y dosis de inducción de doxiclina del sistema de expresión 202. Una reducción importante de una proteína Hifla se observó inmediatamente después de 12 horas de inducción, y una inhibición demás de 90% de la proteína H if- 1 se observó 24 horas después del tratamiento con doxiciclina. Una inducción mayor no condujo a una inhibición más completa de la proteína Hifla (Ver, Figura 3B). La concentración de doxiciclina que se requirió para una inducción máxima del sistema 202 se determinó en un experimento de dosis-respuesta. Se observó una inhibición de más del 90% de la proteína Hif-1 en presencia de 0.1 ng/ml de doxiciclina y la inhibición máxima de la proteína Hifla se alcanzó en presencia de 10 ng/ml de doxiciclina (Ver, Figura 3C). Estos resultados resaltan la rápida respuesta y sensibilidad extrema del sistema 202 a la inducción de doxiciclina. Ei uso de sistemas de expresión inducible dependientes de pol lll para el ataque objetivo regulado es conocido en la técnica (Ver, van de Wetering, M., et al., EMBO Rep., 4:609-615 (2003), Matskura, S., et al., Nucleic Acid Res., 31:e77 (2003) and Czauderna, F., et al., Nucleic Acids Res., 31:e127 (2003)). En contraste a estas observaciones reportadas, los inventores de la presente invención observaron una falta severa del promotor 01 y 02 en sus estudios iniciales (Ver, Figura 2C, 01 y 02). Para determinar si la carencia observada del sistema en la literatura podría tener un impacto negativo sobre la habilidad de utilizar estos sistemas para crear líneas de célula estables, los inventores directamente compararon la tasa de éxito para hacer líneas de células inducibles utilizando los sistemas tanto de 01 como de 202. Una línea de célula D54MG con alto nivel de expresión tetR se estableció primero, y los plásmidos que utilizan los promotores 01 o 202 para dirigir la expresión de la luciferasa con activación en ARNshs (01_luc y 202_luc) o Hifla humana (01 _Hif 1 y 202_Hif1) fueron transfectados con un gen resistente a hidromicina en esta línea de célula. Los clones resistentes a fármacos se seleccionaron y analizaron a través de PCR para identificar clones que llevan el cásete de expresión de ARNsh inducible. Los inventores obtuvieron cuatro clones con 01_luc establemente integrado y siete clones con el cásete 202_luc establemente integrado según analizado antes de PCR. Todos los clones presentaron un nivel similar de expresión tetR (Ver, Figura 4B). Estos clones se examinaron para su respuesta a inducción de doxiciclina. Ninguno de los cuatro clones 01_luc exhibió una reducción dependiente de doxiciclina importante de la reducción de la actividad de luciferasa (Ver, Figura 4A, 01_luc1 a 01_luc4). De manera interesante, tres de los cuatro clones 01_luc exhibieron inhibición constitutiva de la actividad de luciferasa sin considerar la presencia o ausencia de doxiciclina, indicando una falta severa del sistema 01 (Ver, Figura 4A, 01_luc1, 01__luc2, y 01_luc4). En contraste, entre los siete clones 202_luc, dos clones exhibieron una clara Inhibición dependiente de doxlciclina de la actividad de luciferasa (Ver, Figura 4A, 202_luc2, 202_luc4), y tres clones presentaron grado modesto de inhibición dependiente de doxiciclina de la actividad de luciferasa (Ver, Figura 4A, 202_luc1, 202_luc5, y 202_luc7). El cásete de expresión de ARNsh para el clon 01_3, 202_ 3 y 202_6 puede ser insertado en el sitio inactivo de transcripción en un cromosoma, dando como resultado ninguna inhibición de la actividad de luciferasa sin considerar la presencia o ausencia de doxiciclina. También se obtuvieron resultados similares a partir de los clones 01_Hif1 y de los clones 202_Hif1. Entre los diez clones 01__Hif1 analizados, ninguno de ellos exhibió una reducción aparente de la proteína Hifla después de tratamiento con doxiciclina (Ver, Figura 4C, superior). En contraste, dos de los once clones 202_Hif1 exhibieron una reducción importante de la proteína Hifla después de tratamiento con doxiciclina (Ver, Figura 4C, inferior, clon 5 y 11).

EJEMPLO 2: Preparación de líneas de célula de cáncer que atacan Hifla bajo el control de doxiciclina Para determinar el efecto terapéutico potencial de la inhibición de Hif 1 , se establecieron líneas de célula estables a partir de células de origen de D54MG que expresan un ARNsh contra Hifla bajo el control de doxiciclina. Primero se clasificó un panel de 8 ARNshs contra Hifla para las habilidades para atacar el objetivo (datos no mostrados), y se seleccionaron los mejores ARNsh para la creación de líneas de célula de ataque Hifla. El promotor 202, un promotor de U6 modificado que herméticamente regula la expresión de ARNsh (Xiaoyu Lin, In press), se seleccionó para dirigir la expresión del ARNsi de Hifla. Los clones estables que fueron producidos exhibieron variaciones en su habilidad para atacar Hifla después de inducción con doxiciclina, presumiblemente debido al efecto de diferentes sitios de integración en la expresión de ARNsh (Figura 5A y datos no mostrados). Comparado con D54_Luc, una línea de célula de control que expresa un ARNsh contra luciferasa después de inducción de doxiciclina, todos los clones D54_Hif produjeron niveles similares de la proteína Hifla en ausencia de doxiciclina, sugiriendo que el sistema de expresión 202 está muy herméticamente regulado (Figura 5A). Además se analizaron múltiples clones que exhibieron grados variables de ataque de Hifla después de inducción, para actividad de transcripción dependiente de Hif 1 contra ei reporte Hif1, el cual contiene HRE del promotor enolasa. Sorprendentemente, una reducción del 80% de la proteína Hifla solo tuvo un efecto marginal sobre la actividad del reportero (Figura 5B, D54__Hif18). La falta de inhibición en la actividad del reportero no se debió a la función redundante de Hif2a, ya que estas células tienen Hif2a escasamente detectable, y transfectando estas células con una ARNsi potente contra Hif2a se fallo la generación de una inhibición adicional de la actividad de reportero (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que aún niveles muy bajos de la proteína Hifla son suficientes para activar la transcripción de factores corriente abajo dependientes de H if 1 y en el caso de Hifla, se requieren de niveles muy altos de ataque con el fin de inhibir la trayectoria de Hif1. En células que exhibieron un complete ataque de la proteína Hifla, se observó un 80% de reducción de la actividad de reportero con el tratamiento con doxiciclina (Figura 5B, D54_Hif25). La transfección de estas células con ARNsi potente contra Hif2a no dio como resultado una inhibición adicional de la actividad del reportero (datos no mostrados), indicando que Hifla es la forma predominante en estas células. El análisis de QPCR indicó que el tratamiento con doxiciclina en células D54_Hif25 dio como resultado en una transcripción reducida de factores corriente abajo de H if 1 tales como PGKl, y LDH (Figura 5C, D54_Hif25). Como un control, también se analizaron en paralelo las células D54_Luc. El tratamiento con doxiciclina en células D54_Luc ocasionó la reducción del reportero luciferasa (Figura 5B, D54_Luc) pero no el ataque de la proteína Hifla (Figura 5A, D54_Luc) o inhibición de genes objetivo de H if 1 (Figura 5C, D54_Luc). Estos resultados demostraron que la expresión de una ARNsh contra Hifla dio como resultado el daño de la transcripción dependiente de Hif1, y este efecto inhibidor resulto de la inhibición específica de Hifla a través de ARNsh en lugar de un efecto no específico debido a la expresión de ARNsh o tratamiento con doxiciclina.

EJEMPLO 3: Inhibición dependiente de doxiciclina de Hifla en tumores de xenoinjerto Para determinar si se puede inducir un ataque objetivo en tumores de xenoinjerto, se inyectaron células D54_Hlf25 subcutáneamente en ratones SCID. Después de que los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 200 mm3, a los ratones se les administró agua para beber conteniendo 1 mg/ml de doxiciclina para inducir ia expresión de ARNsh de Hifla. Después de tratar a los ratones con doxiciclina durante 3, 6, 9, o 12 días, los tumores fueron recogidos y analizados a través de QPCR para determinar el nivel del mensajero Hlfla. Se observó una reducción del 80% de la ARNm de Hifla en tumores de ratones que recibieron doxiciclina durante 3 días, y el ataque se sostuvo durante un período de tratamiento total de 12 días (Figura 6A). El examen de las muestras de tumor a través de inmunohistoquímica indicó una clara reducción de la proteína Hifla a partir del día 3 en adelante (datos no mostrados). Para determinar si la habilidad para inducir ataque objetivo puede verse dañado, con el tratamiento con doxiciclina a largo plazo o cuando los tumores alcanzan un tamaño muy grande, se realizó otro análisis del ataque de Hifla en tumores de ratones tratados con doxiciclina durante 45 días. El tamaño de tumor promedio al final del tratamiento fue de 2000 mm3. Se observó un grado comparable de ataque de Hifla en estos tumores comparado con los tumores de ratones que estuvieron con el tratamiento bajo doxiciclina durante 3 días (Figura 6B). El análisis de inmunohístoquímica también demostró que la proteína Hifla se redujo a un nivel escasamente detectable en estos tumores (Figura 6C). Estos resultados indican que se puede sostener una fuerte supresión de la expresión objetivo durante un período largo de tiempo, aún cuando los tumores alcanzan un tamaño grande. Como un control, las células D54_Luc también se inyectaron subcutáneamente para crear tumores de xenoinjerto, y también se examinó el ataque de Hifla en estos tumores. No se observó ninguna reducción de ARNm de Hifla o proteína en tumores D54_Luc después de inducción con doxiclclina (Figura 6A, 6B, y 6C), sugiriendo que la reducción de Hifla en los tumores D54-Hif25 resultó específicamente de ia expresión de ARNsh Hifla.

EJEMPLO 4: Efecto de inhibición mediada por ARNsi de Hifla en el crecimiento de tumor D54MG Para determinar el efecto terapéutico potencial para inhibir Hifla en tumores establecidos, se utilizaron células D54_Hif25 o D54_Luc (Luc) para generar tumores de xenoinjerto, y se inició el ataque de Hífla cuando los tumores alcanzaron el tamaño promedio de 190 mm3. El ataque de Hifla dio como resultado dos fases de crecimiento de tumor. En la fase inicial (Figura 3 A, día 1 - día 11), los tumores continuaron su crecimiento pero a una velocidad de crecimiento ligeramente más lenta comparado con el tumor con Hlfla funcional. En esta segunda fase, los tumores exhibieron una regresión pequeña pero reproducible y pasajera, después se volvió a asumir el crecimiento sin Hifla (Figura 5A, día 11 y después). Aunque todo el crecimiento de tumor fue más lento el grupo tratado con doxiciclina comparado con el grupo de control, todos los tumores en el grupo tratado finalmente se desarrollaron para un tamaño grande, lo cual dio como resultado la terminación de los animales (Figura 7A). Los tumores de xenoinjerto generados de células D54_Luc crecieron a la misma velocidad sin considerarles la presencia o ausencia de doxiciclina en el agua para beber, indicando que el fenotipo de crecimiento más lento de los tumores que expresan ARNsh Hifla es una consecuencia de ataque de Hifla (Figura 7A). Un efecto inhibidor similar dei ataque Hifla sobre el crecimiento de tumor se observó utilizando dos clones independientes que expresan ARNsh de Hifla después de tratamiento con doxiciclina, demostrando que el efecto observado es consistente y no se debe a un clon aberrante (datos no mostrados). Estos resultados sugirieron que la pérdida de Hifla en tumores establecidos causo una crisis pasajera que conduce a una regresión del tumor. Sin embargo, los tumores son capaces de adaptarse a la pérdida del Hifla y continuar creciendo a una velocidad más lenta. La disponibilidad de varios clones que exhibieron un 80% de ataque de la proteína Hifla después de tratamiento con doxiciclina in vitro permitió la determinación de si una inhibición parcial de Hifla sería suficiente para generar un beneficio terapéutico in vivo. Se generaron tumores de xenoinjerto utilizando las células D54_Hif18, se inicio un ataque de Hifla a un tamaño de tumor promedio de 150 mnr Consistente con la falta de inhibición importante de la transcripción dependiente de H if 1 in vitro (Figura 5B, D54_Hif18), el tratamiento con doxiciclina fallo para generar un efecto importante sobre el crecimiento del tumor en estos tumores (Figura 7B). Estos al nivel de la proteína Hifla para impactar negativamente el crecimiento de tumor in vivo.

EJEMPLO 5: Creación de ratones atacados con tirosinasa a. Creación de ratones de ataque utilizando inyección pro-nuclear La inyección pro-nuclear es un método bien establecido para crear animales transgénicos. En este aspecto, se inyecto un fragmento de ADN (el transgen) en la etapa pro-nuclear de huevos fertilizados y los huevos fertilizados se implantaron en animales pseudopreñados. En un experimento típico, se inyectaron 50 - 80 huevos en los cuales la mitad de los huevos inyectados sobrevivirá a la generación de neonatos y un 5% - 20% de los neonatos contendrá el transgen. Se seleccionó tirosinasa como un objetivo para el ataque. La tirosinasa es una enzima clave en la producción de melanina, y el ataque de tirosinasa en ratones generará un cambio de color en la piel aparente. b. Utilización de transgenes dirigidos a través del promotor 202 e inyección pro-nuclear para crear ratones atacados con tirosinasa Para determinar si un promotor dependiente de pol lli modificado, tal como el promotor 202, es adecuado para la creación de animales de ataque, se crearon transgenes que utilizaron los promotores 202 para expresar los dos mejores ARNshs contra tirosinasa (202-Tyr731 (SEC ID NO: 46) y 202-Tyr338 (SEC ID NO: 47)). Estos transgenes se muestran más adelante. Los caracteres en negritas representan la secuencia de ARNsh los caracteres subrayados representan las secuencias de promotor. El primer grupo de inyecciones se realizó utilizando embriones de ratones que no expresan al represor (tetR). En raíones sin la expresión de tetR, el promotor 202 espera que sea constitutivamente activo.

Transgenes dirigidos por el promotor 202: 202-Tyr731: gaattccaggcaaaacgcaccacgtgacggagcgtgaccgcqcgccgagcgcgcgccaagg tcgggcaggaa aqggcctattt cccatqattccatcatattt catatacgatacaa gct ttaqaqaqataattagaattaattcga ctgtaaacacaaagatattagtataa aatacgtgacgtagaaagtaataatttcttqg tagttt cagttttaaaattatgttttaaaatgga ctatcatat cttaccgtaacttgaaa ctccctatcagtgatagagattatatatctccctatcagtgatagagaccgtgacatttgcacag atgattcaagagatcátctgtgcaaatgtcacttttttaagctt (SEC ID NO: 46) 202-Tyr338: gaatt cea qgcaaaacg cacea cgtgacggagcgtgaccqcgcgccgagcgc cgccaagg tcgqgcaqqaa aqggcctattt cccatgattccatcatatttacatatacqatacaaggctqttaqagaqataattagaattaattcga ctgtaaacacaaagatattagtataa aatacgtgacqtaqaaagtaataatttcttqqqtaqtttqcagttttaaaattatgttttaaaatqqa ctatcatatqcttaccgtaacttqaaa ctccctatcagtgatagagattatatatctccctatcaqtgatagagaccggcaacttcatgggtt tcattcaagagatgaaacccatg aagttgccttttttaagctt (SEC ID NO: 47) Entre 20 crías que nacieron de embriones inyectados con el transgen 202-Tyr731 (SEC ID NO: 46), tres crías tuvieron un transgen establemente integrado y exhibieron diferentes grados de cambio de color de piel como se muestra en las Figuras 8A-B. La Figura 8A muestra un color de piel más ligero de un FO de los iniciadores cuando se comparó con el color de piel más oscuro del atón de tipo silvestre. El genotipo de los ratones se determinó a través de PCR utilizando iniciadores específicos de transgen. La Figura 8B muestra que las tres crías son de color blanco comparado con el color más oscuro de las otras crías F1 y son positivas para el transgen 202-Tyr731 (SEC ID NO: 46). Esta progenie transgénica F1 de los iniciadores positivos que exhibieron un color de piel claro, demuestra que el efecto de silencio mediado por ARNsi puede ser transmitido a través de generaciones. Los embriones que fueron inyectados con el transgen 202- Tyr338 (SEC ID NO: 47) dieron surgimiento a 40 crías y dos embriones muertos. Aunque ninguno de los 40 neonatos tubo el transgen, los dos embriones muertos poseyeron el transgen 202-Tyr338 (SEC ID NO: 47), sugiriendo que el transgen 202-Tyr338 (SEC ID NO: 47) ocasionó letalidad embriónica debido al efecto fuera objeto de la ARNsh Tyr338. Estos resultados sugieren que el promotor 202 es muy adecuado para la creación de animales atacados. Se pueden emplear dos aspectos paralelos para ser animales atacados condiciones utilizando el sistema 202. El primer aspecto involucra el co-suministro de un cásete de 202-ARNsh con el cásete CAGGS-tetR en un transgen. El promotor de beta-actina de pollo es un promotor bien caracterizado para expresión de gen ubicua. El cásete CAGGS-tetR utilice el promotor de beta-actina de pollo para dirigir la expresión de tetR, que dará como resultado la expresión de tetR en la mayoría de los tejidos dei ratón. Este aspecto se puede utilizar para crear animales de ataque condiciones en un corto período de tiempo. El segundo aspecto involucra la creación de una línea de ratón con la expresión de tetR ubicua. Esta línea de ratón después se puede utilizar como la línea parental para proyectos de ataque condicionales para lograr una regulación más uniforme de objetivo. Se ha mostrado que los genes en el sitio ROSA26 son ubicuamente expresados. Por lo tanto, un cásete de expresión tetR será encerrado en el sitio ROSA26 para obtener una línea de ratón con la expresión de tetR ubicua. Un experto en la técnica fácilmente podría apreciar que la presente invención esta bien adaptada para realizar los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como aquellos inherentes en la presente. Los complejos moleculares y los métodos, procedimientos, moléculas, compuestos específicos descritos aquí son actualmente representativos de modalidades preferidas, son ilustrativos, y no pretenden ser limitaciones del alcance de la invención. Será fácilmente evidente para un experto en ia técnica que se pueden hacer sustituciones y modificaciones variables a la invención aquí descrita sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación con indicativas de los niveles de aquellos expertos en la técnica a los cuales pertenece la invención. Todas las patentes y publicaciones se incorporan aquí por referencia al mismo grado como si la cada publicación individual fuera específica e individualmente indicada como incorporada por referencia. La invención ilustrativamente descrita aquí convenientemente puede ser practicada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no están específicamente descritas aquí. De este manera, por ejemplo, en cada caso en la presente cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente de", y "que consiste de" pueden ser reemplazados entre sí con cualquiera de los otros términos. Los términos y expresiones que han sido empleados, se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no se pretende que en el uso de dichos términos y expresiones se excluyan cualesquier equivalentes de las características mostradas y descritas o por sus porciones, sino que se reconozca que varias modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención reclamada. De esta manera, se debe entender que aunque la presente invención ha sido específicamente descrita por modalidades preferidas y aspectos funcionales, la modificación y variación de los conceptos aquí descritos puede ser restablecida por aquellos expertos en la técnica, y que dichas modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de la invención como se define por las reivindicaciones anexas. Además, cuando las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos de Markush, aquellos expertos en la técnica reconocerán que la invención también de esta manera se prescriben términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush. Por ejemplo, si X se describe como seleccionada del grupo que consiste de bromo, cloro, y yodo, las reivindicaciones para X que es bromo y ias reivindicaciones para X bromo y cloro son completamente descritas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una secuencias de promotor dependiente de ARN-pol lll que comprende un elemento TATA, un elemento de secuencia próximo (PSE) 5' al elemento TATA, y un sitio de inicio de transcripción (TSS) 3' al elemento TATA, un primer operador de tetraciclina localizado entre el PSE y el elemento TATA y un segundo operador de tetraciclina localizado entre el elemento TATA y el TSS, en donde el primer operador de tetraciclina tiene una secuencia de polinucleótido que es idéntica a una secuencia de polinucleótido del segundo operador de tetraciclina.

2. La secuencia de promotor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer operador de tetraciclina y el segundo operador de tetraciclina cada uno tiene una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), tccctatcagtgatagaga (SEC ID NO:2), tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO:3) y tccctatcagtgatagagagg (SEC ID NO:4).

3. La secuencia de promotor de la reivindicación 1, en donde el promotor es un promotor U6, un promotor H1 o un promotor 7SK.

4. Un secuencia de promotor dependiente de ARN-pol lll que comprende un elemento TATA, un elemento de secuencia próximo (PSE) 5' al elemento TATA, y un sitio de inicio de transcripción (TSS) 3' al elemento TATA, un primer operador de tetraciclina localizado entre PSE y el elemento TATA y que forma una porción de PSE o del elemento TATA y un segundo operador de tetraciclina localizado entre el elemento TATA y el TSS, en donde el primer operador de tetraciclina tiene una secuencia de polinucleótido que es idéntica a una secuencia de polinucleótido del segundo operador de tetraciclina.

5. La secuencia de promotor de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el primer operador de tetraciclina y el segundo operador de tetraciclina cada uno tiene una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), tccctatcagtgatagaga (SEC ID NO:2), tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO:3) y tccctatcagtgatagagagg (SEC ID NO:4).

6. La secuencia de promotor de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el promotor es un promotor U6, promotor H1 o un promotor 7SK.

7. Una secuencia de promotor dependiente de ARN-poi lll que comprende un elemento TATA, un elemento de secuencia próximo (PSE) 5' al elemento TATA, y un sitio de inicio de transcripción (TSS) 3' al elemento TATA, un primer operador de tetraciclina localizado entre el PSE y el elemento TATA y un segundo operador de tetraciclina localizado entre el elemento TATA y el TSS, en donde el primer operador de tetraciclina tiene una secuencia de polinucleótido que es diferente a una secuencia de polinucleótido de un segundo operador de tetraciclina, siempre y cuando el primer operador de tetraciclina tenga la secuencia de polinucleótido de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), el segundo operador de tetracicllna no tenga una secuencia de polinucleótido de: ctccctatcagtgatagagaaa (SEC ID NO:5).

8. La secuencia de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el segundo operador de tetraciclina tiene una secuencia de polinucleótido seleccionada de! grupo que consiste de: tccctatcagtgatagaga (SEC ID NO:2), tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO:3) y tccctatcagtgatagagagg (SEC ID NO:4).

9. La secuencia de promotor de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el primer operador de tetraciclina tiene la secuencia de polinucleótido de: tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO:2) y el segundo operador de tetraciclina tiene la secuencia de polinucleótido de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1).

10. La secuencia de promotor de acuerdo con ia reivindicación 7, en donde el promotor es un promotor U6, un promotor H1 o un promotor 7SK.

11. Una secuencia de promotor dependiente de ARN-pol lll que comprende un elemento TATA, un elemento de secuencia próximo (PSE) 5' al elemento TATA, y un sitio de inicio de transcripción (TSS) 3' al elemento TATA, un primer operador de tetraciclina localizado entre el PSE y elemento TATA y que forma una porción del PSE o el elemento TATA y un segundo operador de tetraclclina localizado entre el elemento TATA y el TSS, en donde el primer operador de tetraciclina tiene una secuencia de polinucleótido que es diferente a una secuencia de polinucleótido dei segundo operador de tetraciclina, siempre y cuando el primer operador de tetraciclina tenga la secuencia de polinucleótido de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO:1), el segundo operador de tetraciclina tenga una secuencia de polínucleótido de: ctccctatcagtgatagagaaa (SEC ID NO:5).

12. La secuencia de promotor de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el segundo operador de tetraciclina tiene una secuencia de polinucleótido seleccionada del grupo que consiste de: tccctatcagtgatagaga (SEC ID NO:2), tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO:3) y tccctatcagtgatagagagg (SEC ID NO:4).

13. La secuencia de promotor de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el primer operador de tetraciclina tiene la secuencia de polinucleótido de: tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO:2) y el segundo operador de tetraciclina tiene la secuencia de poiinucleótido de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1).

14. La secuencia de promotor de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el promotor es un promotor U6, un promotor H1 o un promotor 7SK.

15. Un vector que comprende: por io menos una secuencia de promotor dependiente de ARN-pol lll de la reivindicación 1, operablemente enlazada a por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés.

16. El vector de acuerdo con la reivindicación 15, en donde por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés es ADN o ADNc.

17. Un vector que comprende: por lo menos una secuencia de promotor dependiente de ARN- pol lll de la reivindicación 5, operablemente enlazada a por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés.

18. El vector de acuerdo con la reivindicación 17, en donde por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés es ADN o ADNc.

19. Un vector que comprende: por lo menos una secuencia de promotor dependiente de ARN-pol lll de la reivindicación 7, operablemente enlazada a por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés.

20. El vector de acuerdo con la reivindicación 19, en donde por lo menos una la secuencia de polinucleótido de interés es ADN o ADNc.

21. Un vector que comprende: por lo menos una secuencia de promotor dependiente de ARN-pol lll de la reivindicación 11 operablemente enlazada a por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés.

22. El vector de acuerdo con la reivindicación 21, en donde por lo menos una de la secuencia de polinucleótido de interés es ADN o ADNc.

23. Una célula eucariótica que comprende el vector de la reivindicación 15.

24. Una célula eucariótica que comprende el vector de la reivindicación 17.

25. Una célula eucariótica que comprende el vector de la reivindicación 19.

26. Una célula eucariótica que comprende el vector de la reivindicación 21.

27. Un animal no humano transgénico que comprende: un transgen que comprende por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés operablemente enlazada a una secuencia de promotor dependiente de ARN-poi III, en donde la transcripción de dicha secuencia de polinucleótido de interés produce una molécula de ARN que modula la expresión de por lo menos una gen objetivo en dicho animal no humano transgénico y además en donde dicha secuencia de promotor comprende un elemento TATA, un elemento de secuencia próximo (PSE) 5' al elemento TATA, y un sitio de inicio de transcripción (TSS) 3' al elemento TATA, un primer operador de tetraciclina localizado entre PSE y el elemento TATA y un segundo operador de tetraciciina localizado entre ei elemento TATA y el TSS, en donde el primer operador de tetraciclina tiene una secuencia de polinucleótido que es idéntica a una secuencia de polinucleótido del segundo operador de tetraciclina.

28. El animal de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el primer operador de tetraciclina y ei segundo operador de tetraciclina cada uno tiene una secuencia de polinucleótido selecciona del grupo que consiste de: actctatcattgatagagttat (SEC ID NO: 1), tccctatcagtgatagaga (SEC ID NO:2), tccctatcagtgatagagacc (SEC ID NO:3) y tccctatcagtgatagagagg (SEC ID NO:4).

29. El animal de acuerdo con ia reivindicación 27, en donde el promotor es un promotor U6, un promotor H1 o un promotor 7SK.

30. Ei animal de acuerdo con la reivindicación 27, en donde el animal se selecciona del grupo que consiste de: ratón, rata, perro, gato, cerdo, vaca, cabra, oveja, primate y cobayos.

31. El animal de acuerdo con la reivindicación 27, en donde por lo menos una secuencia de polinucleótido de interés es ADN o ADNc.

32. El animal'de acuerdo con la reivindicación 27, en donde la molécula de ARN es a ARN de interferencia pequeña o ARN de horquilla corta.