MD4646C1

MD4646C1 - Procedeu de obţinere a biomasei de larve de Galleria mellonella cu activitate biologică înaltă

Info

Publication number: MD4646C1
Application number: MDA20180081A
Authority: MD
Inventors: Чеслав ЧУХРИЙ
Original assignee: Чеслав ЧУХРИЙ
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2020-04-30
Also published as: EP3854209B1; EP3854209A4; MD4646B1; EA202100067A1; EP3854209A1; WO2020060382A1

Abstract

Invenţia se referă la biotehnologie, şi anume la obţinerea biomasei de larve de Galleria mellonella cu activitate cheratolitică, antioxidantă şi antiinflamatoare înaltă, care poate fi utilizată în calitate de materie primă pentru fabricarea preparatelor farmaceutice şi cosmetice.Procedeul de obţinere a biomasei de larve de Galleria mellonella cu activitate biologică înaltă constă în plasarea pupelor în recipiente cu mediu nutritiv, menţinerea lor până la eclozarea larvelor de prima vârstă, transferul larvelor în alte recipiente cu mediu nutritiv, cultivarea lor la temperatura de 27°C şi umiditatea de 75% timp de 19...21 de zile cu transferul larvelor de cel puţin 2 ori pe mediu nutritiv proaspăt şi colectarea larvelor, totodată mediul nutritiv conţine făină de grâu, făină de porumb, tărâţe de grâu, extract de drojdie, lapte praf, miere de albine, glicerol, pulbere de ceară, pinobanksin, pinocembrin şi apă.Rezultatul tehnic al invenţiei constă în sporirea cantităţii şi activităţii biologice a biomasei de larve obţinute.

Description

Invenţia se referă la biotehnologie, şi anume la obţinerea biomasei de larve de Galleria mellonela cu activitate cheratolitică, antioxidantă şi antiinflamatoare înaltă, care poate fi utilizată în calitate de materie primă pentru fabricarea preparatelor farmaceutice şi cosmetice.

Este cunoscut un procedeu de obţinere a biomasei de larve de Galleria mellonella, care include creşterea larvelor de vârsta 1-2 pe mediu nutritiv, ce conţine făină de grâu (110 g), drojdii de panificaţie (100 g), lapte praf (70 g), ceară (50 g), glicerol (80 g), tărâţe de grâu (350 g), miere de albine (50 g) şi apă (160 g); iar a larvelor de vârsta 3-4 - pe mediu ce conţine tărâţe de grâu (350 g), făină de grâu (110 g), drojdii de panificaţie (100 g), lapte praf (70 g), ceară (50 g), glicerol (80 g), apă (210 g) [1]. Larvele obţinute sunt destinate utilizării în calitate de gazdă pentru diferiţi patogeni în cadrul cercetărilor ştiinţifice.

Dezavantajul acestui procedeu constă în utilizarea unui mediu nutritiv sărac pentru larvele de vârsta a 3-4-a, care nu poate asigura o valoare biologică înaltă a biomasei.

Este cunoscut un procedeu de obţinere a biomasei de larve de Galleria mellonella, care include incubarea larvelor de ultima vârstă ori a pupelor în containere la întuneric timp de 1-3 săptămâni pentru obţinerea unui număr maximal de ouă, transferarea ouălor (de două ori pe săptămână) în containere cu hrană şi menţinerea lor timp de 20 de zile pentru obţinerea larvelor. Mediul nutritiv utilizat pentru hrănirea larvelor are următoarea componenţă: făină de porumb 250g, extract de drojdii 150g, făină de soia 100g, lapte praf 100g, miere de albine 200g, glicerol 200g, blocuri de ceară de albine. Larvele obţinute sunt caracterizate prin rezistenţă înaltă faţă de infecţiile cu Staphylococcus aureus, Escherichia coli şi Candida albicans şi sunt utilizate în calitate de gazde în studiul entomopatogenilor [2].

Dezavantajul procedeului constă în faptul că larvele obţinute se deosebesc esenţial după dimensiuni (de la 1 la 2 cm) şi calitatea biomasei din cauza vârstei diferite, ceea ce este inacceptabil în cazul utilizării biomasei în calitate de materie primă pentru obţinerea substanţelor cosmetice ori farmaceutice.

Mai este cunoscut procedeul de obţinere a larvelor de Galleria mellonella care constă în aceea că ouăle de insecte sunt plasate în cutii de plastic cu mediu nutritiv, unde se dezvoltă timp de 51 de zile. Mediul nutritiv utilizat are următoarea componenţă: 118 g făină de grâu, 206 g tărâţe de grâu, 118 g lapte praf, 88 g drojdie de bere, 24 g pulbere de ceară, 175 ml miere şi 175 ml glicerol. Larvele obţinute sunt utilizate în calitate de gazdă pentru obţinerea nematodelor entomofage [3].

Dezavantajul acestui procedeu constă în durata de 51 de zile a procesului de creştere, ceea ce duce la o scumpire semnificativă a tehnologiei de creştere a insectelor.

Cea mai apropiată soluţie de obiectul revendicat este procedeul de obţinere a biomasei de larve de Galleria mellonella [4] în scopul utilizării acesteia în calitate de materie primă pentru producerea preparatelor cosmetice şi farmaceutice cu efect cheratolitic. Acest procedeu include trei etape succesive: 1. Pregătirea condiţiilor pentru realizarea ciclului vital în crescătorie. Crescătoria de insecte prezintă încăperi cu suprafaţa de 20m2. Pereţii sunt vopsiţi cu o răşina specială care oferă posibilitatea dezinfectării cu soluţii dezinfectante. În încăperile în care se efectuează incubarea ouălor se menţine temperatura de 26±2°C şi umiditate de 70%. Încăperile în care are loc creşterea larvelor sunt echipate cu camere obscure cu sisteme automate de menţinere a temperaturii şi umidităţii. În aceste camere se menţine temperatura de 30-31°C şi umiditatea de 80%; 2. Creşterea insectelor. Imediat după ecloziunea larvelor din ou, larvele se transferă din încăperile de incubare în cele destinate creşterii larvelor. Larvele se introduc în camerele obscure în care se menţin condiţiile necesare, iar insectelor li se asigură hrana necesară - mediu nutritiv cu următoarea componenţă: extract din porumb galben 174,0- 206,0g, extract din porumb roşu 183,0-214,0g, glucoză 70,0-85,0g, fructoză 65,0- 81,0g, sucroză 4,0- 4,8g, maltoză 4,0-5,0g, cazeină 117,0-148,0g, retiol (vitamina A) 2500 -3000 UI, tocoferol acetat (vitamina E) 40-58 UI, vitamina C 0,05-0,06 g, riboflavina (vitamina B2) 0, 0014-0,0017g, pantotenat de calciu (vitamina B5) 0,005-0,01g, tiamină (vitamina B1) 0,002-0,003g, piridoxină 0,003-0,004g, biotină 0,00002-0,00003g, niacină (vitamina B3) 0,0002-0,0003g, pinobanksin 0,015-0,020g, pinocembrin 0,010- 0,015g, glicerol 120,0-139,0g, NaNO3 0,8-1,1g, KH2PO4 1,7-2,0g, NaCl 1,5-2,0g, CaCl2 0,4-0,5g, MgSO4٭7H2O 0,05-0,1g, ZnSO4*7H2O 0,005-0,01g, MnSO4*5H2O 0,007-0,015g, CuSO4*5H2O 0,007-0,008g, FeCl3*6H2O 0,0100- 0,0175g, EDTA 0,0060-0,0075g, ceară galbenă 250-350g, apă purificată - până la echilibrarea a 1000g. 3. Colectarea larvelor. Larvele se separă la intrarea lor în cea de-a VII-a vârstă, imediat după năpârlire. Această biomasă este utilizată pentru obţinerea unui complex activ cu acţiune cheratolitică.

Dezavantajul acestui procedeu constă în aplicarea unui mediu nutritiv foarte complex, alcătuit din peste 30 de componente, iar biomasa de larve este colectată imediat după năpârlire, perioadă, când cantitatea de enzime cu efect cheratolitic scade ca rezultat al utilizării lor în procesul de eliminare a scheletului extern vechi.

De asemenea, un dezavantaj al tuturor procedeelor descrise mai sus constă în faptul că întreaga perioadă de dezvoltare a etapei de larvă a insectei Galleria mellonella, care include de la 3 la 10 năpârliri, are loc în aceleaşi vase (containere) în care au fost introduse ouăle, ori larvele de prima şi a doua vârstă. Aceasta duce la acumularea produselor activităţii vitale a insectelor şi la scăderea productivităţii de biomasă a larvelor.

Problema pe care o rezolvă prezenta invenţie constă în elaborarea unui procedeu nou, eficient de obţinere a biomasei de larve de Galleria mellonella, care să asigure o activitate biologică înaltă a acestei biomase.

Esenţa invenţiei constă în aceea că se propune un procedeu de obţinere a biomasei de larve de Galleria mellonella cu activitate biologică înaltă, care constă în plasarea pupelor în recipiente cu mediu nutritiv, menţinerea lor la temperatura de 27°C şi umiditatea de 75% până la eclozarea larvelor de prima vârstă, transferul larvelor după 6 ore de la eclozare în alte recipiente cu mediu nutritiv, cultivarea lor la temperatura de 27°C şi umiditatea de 75% timp de 19…21 zile cu transferul larvelor de cel puţin 2 ori pe mediu nutritiv proaspăt şi colectarea larvelor, totodată mediul nutritiv are următoarea componenţă, g/kg:

Făină de grâu 185 - 200 Fină de porumb 180 - 190 Tărâţe de grâu 110 - 130 Extract de drojdie 15 - 20 Lapte praf 120 - 140 Miere de albine 75 - 95 Glicerol 80 - 90 Pulbere de ceară 40 - 55 Pinobanksin 0,02 - 0,03 Pinocembrin 0,02 - 0,03 Apă purificată restul.

Rezultatul tehnic al invenţiei constă în sporirea cantităţii şi activităţii biologice a biomasei de larve obţinute.

Astfel, procedeul de obţinere a biomasei de larve de Galleria mellonella include un mediu mai simplu şi mai puţin costisitor, care asigură obţinerea unei cantităţi mai mari de biomasă (149,7±2,9 mg biomasă la 1g mediu utilizat faţă de 113,6± 6,2, în cazul prototipului) cu o activitate biologică mai înaltă.

Rezultatul tehnic al invenţiei se datorează faptului că pe durata dezvoltării larvelor de Galleria mellonella se fac cel puţin două transferuri de larve pe mediu proaspăt, ceea ce previne efectul de inhibiţie provocat de acumularea produselor activităţii vitale în recipientele de creştere a insectelor.

Exemple de realizare a invenţiei

Exemplul 1

Obţinerea biomasei de larve de Galleria mellonella cu activitate cheratolitică

Pupele se scot din frigider, unde se păstrează la temperatura de 3-5°C şi se lasă la temperatura camerei timp de 2 ore. După acest interval de timp pupele sunt transferate în recipiente acoperite cu capac găurit, care conţin o cantitate mică de mediu nutritiv (1/10 din volumul recipientului) pentru dezvoltarea ulterioară a pupelor, trecerea lor în faza de imago şi depunerea ouălor. Pentru a iniţia eclozarea larvelor din ou recipientele sunt menţinute la temperatura de 27°C si umiditatea relativa de 75%, în condiţii de întuneric. După 48 de ore de la plasarea pupelor in recipiente apar larvele de prima vârstă. Procesul se monitorizează pentru a oferi un randament de 80% ieşire, dar nu mai mult de 6 ore.

Mediul nutritiv utilizat are următoarea componenţă, g/kg:

Făină de grâu 185 Fină de porumb 180 Tărâţe de grâu 110 Extract de drojdie 15 Lapte praf 120 Miere de albine 75 Glicerol 80 Pulbere de ceară 40 Pinobanksin 0,02 Pinocembrin 0,02 Apă purificată restul.

Se prepară containere noi cu mediu nutritiv. După 6 ore de la începutul eclozării larvele de prima generaţie sunt scoase cu ajutorul pensetei din recipientele în care au apărut şi se plasează în recipientele pregătite.

Creşterea larvelor durează 20 de zile de la data primului transfer. Temperatura în containere se menţine 27oC şi umiditatea relativă de 75% în condiţii de întuneric.

Pe durata acestor zile se efectuează două transferuri de larve în recipient cu mediu nutritiv proaspăt la cea de a 7-a zi şi la cea de-a 14-a zi.

Pentru obţinerea biomasei de larve cu activitate cheratolitică înaltă colectarea larvelor se face la cea de-a 19 zi de cultivare, până a începe procesul de năpârlire a larvelor de vârsta a VI-a. Larvele sunt spălate de 2 ori cu patru volume de soluţie fiziologică şi clătite de doua ori cu 4 volume de apă purificată.

Biomasa obţinută este supusă testelor calitative şi cantitative.

Activitatea cheratolitică a fost determinată în baza unui test spectrofotometric cu utilizarea cheratin-azurului (keratin azure) (Cai C., Chen J., Qi J., Yin Y., Zheng X. Purification and characterization of keratinase from a new Bacillus subtilis strain. Journal of Zhejiang University SCIENCE B, 2008, 9(9), p. 713-720), care se realizează în modul următor: 5 mg pulbere de cheratin-azur se suspendează în 1 ml tampon Tris-HCI de 50 mM (pH 8,0). Amestecul de reacţie conţine 1 ml de suspensie de cheratin-azure şi 1 ml extract cu activitate cheratolitică. Reacţiile se efectuează la 50°C într-o baie de apă cu agitare constantă de 200 r/min timp de 30 min. După incubare, reacţia se întrerupe prin adăugarea a 2 ml de acid trichloroacetic de 0,4 M urmată de centrifugare la 3000g timp de 20 min. Absorbanţa supernatantul se măsoară la 595 nm. Controlul se prepară la fel, iar extractul se înlocuieşte cu keratinază. Activitatea cheratolitică exprimată în unităţi de activitate per mg substanţă (UN/mg) prezintă cantitatea de enzimă care determină creşterea absorbţiei cu 0,01 între probă şi martor la 595 nm în condiţiile date.

Rezultatele obţinute sunt prezentate în Tabelul 1.

Tabelul 1

Parametrul monitorizat Conform celei mai apropiate soluţii Conform procedeului propus în invenţie Costul unui kg de mediu nutritiv 100% 25% Cantitatea de biomasă larvală (mg) la 1g de mediu 113,6±6,2 149,7±2,9 Activitatea cheratolitică, UN/mg substanţă uscată 1, 96 ±0,05 4,05±0,04

Datele din Tabelul 1 demonstrează că utilizarea unui mediu simplificat duce la ieftinirea considerabilă a costului de producere a larvelor (cheltuielile pentru mediul nutritiv în soluţia propusă constituie 25% din costul mediului în prototip), iar cantitatea de biomasă obţinută la utilizarea unui gram de mediu creşte cu 31,8%, comparativ cu prototipul. De asemenea creşte şi activitatea cheratolitică a biomasei de două ori.

Exemplul 2

Obţinerea biomasei de larve de Galleria mellonella cu activitate atioxidantă înaltă

Pupele se scot din frigider, unde se păstrează la temperatura de 3-5oC, şi se lasă la temperatura camerei timp de 2 ore. După acest interval de timp pupele sunt transferate în recipiente acoperite cu capac găurit, care conţin o cantitate mică de mediu nutritiv (1/10 din volumul recipientului) pentru dezvoltarea ulterioară a pupelor, trecerea lor în faza de imago şi depunerea ouălor. Pentru a iniţia eclozarea larvelor din ou recipientele sunt menţinute la temperatura de 27oC şi umiditatea relativă de 75%, în condiţii de întuneric. După 48 de ore de la plasarea pupelor în recipiente apar larvele de prima vârstă. Procesul se monitorizează pentru a oferi un randament de 80% ieşire, dar nu mai mult de 6 ore.

Mediul nutritiv utilizat are următoarea componenţă, g/kg:

Făină de grâu 200 Fină de porumb 190 Tărâţe de grâu 130 Extract de drojdie 20 Lapte praf 140 Miere de albine 95 Glicerol 90 Pulbere de ceară 55 Pinobanksin 0,03 Pinocembrin 0,03 Apă purificată restul.

Creşterea larvelor durează 20 de zile de la data primului transfer. Temperatura in containere se menţine 27oC si umiditatea relativă de 75% în condiţii de întuneric.

Pentru obţinerea biomasei de larve cu activitate antioxidantă înaltă colectarea larvelor se face la cea de-a 20 zi de cultivare. Larvele sunt spălate de 2 ori cu patru volume de soluţie fiziologică şi de doua ori cu 4 volume de apa purificata.

Biomasa obţinută este supusă testelor calitative şi cantitative.

Activitatea antioxidantă se determină prin metoda de determinare a capacităţii antioxidante cu aplicarea radicalului cation ABTS·+ (2,2 azinobis 3-etilbenzotiazolină-6-acidului sulfonic) (Re R. et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. In: Free Radical Biology & Medicine. 1999, vol.10, p. 1231-1237). În calitate de echivalent pentru calculul cantitativ în această metodă se utilizează troloxul. Rezultatele testului se exprimă în unităţi TEAC (trolox equivalent antioxidant activity).

Oxidarea ABTS în scopul formării radicalului cation ABTS se realizează cu utilizarea persulfatului de potasiu. Pentru aceasta se prepară soluţia stoc a reagentului ABTS de 7 mM în apă deionizată, la care se adaugă persulfatul de potasiu în concentraţia de 2,45 mM în raport de 1:1. Reacţia de formare a radicalului ABTS decurge la întuneric, la temperatura camerei timp de cel puţin 12-16 ore. Soluţia de lucru se prepară din soluţia stoc de ABTS, care se dizolvă în etanol sau apă distilată până la stabilizarea valorii absorbanţei la 0,700 ± 0,020 unităţi la lungimea de undă de 734 nm.

Amestecul reactant constă din 0,3 ml extract antioxidant şi 2,7 ml soluţie ABTS. Reacţia de reducere decurge la temperatura camerei timp de 6 min, după care se măsoară absorbanţa la lunginea de undă de 734 nm.

Valoarea indicelui TEAC este exprimată în mg trolox la g de substanţă (biomasă), şi se calculează în baza curbei de calibrare executată în aceleaşi condiţii experimentale.

Rezultatele obţinute sunt prezentate în Tabelul 2.

Tabelul 2

Parametrul monitorizat Conform celei mai apropiate soluţii Conform procedeului propus în invenţie Costul unui kg de mediu nutritiv 100% 25% Cantitatea de biomasă larvală (mg) la 1g de mediu 118,4 156,1 Activitatea antioxidantă Echivalent mg trolox /g biomasa 28,4±0,2 36,8±0,6

Datele din Tabelul 2 demonstrează că cantitatea de biomasă obţinută la utilizarea unui gram de mediu creşte cu 31,7%, comparativ cu prototipul. De asemenea creşte şi activitatea antioxidantă a biomasei de 1,3 ori.

Exemplul 3

Obţinerea biomasei de larve de Galleria mellonella cu activitate antiinflamatoare

Pupele se scot din frigider, unde se păstrează la temperatura de 3-5oC, şi se lasă la temperatura camerei timp de 2 ore. După acest interval de timp pupele sunt transferate în recipiente acoperite cu capac găurit, care conţin o cantitate mică de mediu (1/10 din volumul recipientului) nutritiv pentru dezvoltarea ulterioară a pupelor, trecerea lor în faza de imago şi depunerea ouălor. Pentru a iniţia eclozarea larvelor din ou recipientele sunt menţinute la temperatura de 27oC si umiditatea relativă de 75%, în condiţii de întuneric. După 48 de ore de la plasarea pupelor în recipiente apar larvele de prima vârstă. Procesul se monitorizează pentru a oferi un randament de 80% ieşire, dar nu mai mult de 6 ore.

Mediul nutritiv utilizat are următoarea componenţă, g/kg:

Făină de grâu 190 Fină de porumb 180 Tărâţe de grâu 125 Extract de drojdie 18 Lapte praf 130 Miere de albine 90 Glicerol 90 Pulbere de ceară 55 Pinobanksin 0,03 Pinocembrin 0,03 Apă purificată restul.

Pentru obţinerea biomasei de larve cu activitate antiinflamatoare înaltă colectarea larvelor se face la cea de-a 21 zi de cultivare. Larvele sunt spălate de 2 ori cu patru volume de soluţie fiziologică şi de doua ori cu 4 volume de apă purificată.

Biomasa obţinută este supusă testelor calitative şi cantitative.

Scăderea nivelului de eliberare a interleucinei 8 (IL8) se testează in vitro pe cultură de fibroblaşti normali umani. Inducerea eliberării factorilor proinflamatori se realizează cu aplicarea acidului benzoic în prezenţa produsului testat. În calitate de control a fost utilizată cultura tratată cu acid benzoic în prezenţa soluţiei fiziologice. Nivelul de IL8 a fost determinat cu aplicarea metodei imunofermentative ELISA (kitul pentru determinarea IL8, Thermo Fisher).

Rezultatele obţinute sunt prezentate în Tabelul 3.

Tabelul 3

Parametrul monitorizat Conform celei mai apropiate soluţii Conform procedeului propus în invenţie Costul unui kg de mediu nutritiv 100% 25% Cantitatea de biomasă larvală la 1g de mediu 121,3±2,7 160,0±0,8 Scăderea cantităţii de IL8 eliberată (% la martor) 28,5±0,7 37,1±0,2

Datele din Tabelul 3 demonstrează că cantitatea de biomasă obţinută la utilizarea unui gram de mediu creşte cu 31,9% comparativ cu prototipul. De asemenea a fost înregistrat un nivel mai înalt al activităţii antiinflamatoare, exprimat prin scăderea nivelului factorului proinflamator - interleucinei 8 (o scădere cu 37,1% în soluţia propusă faţă de o scădere de 28,5% în cazul celei mai apropiate soluţii).

1. RU2210210 C1 2003.08.20

2. A.L. Jorjão, L.D. Oliveira, L. Scorzoni, L.M.A. Figueiredo-Godoi, M.C.A. Prata, A.O.C. Jorge, J. C. Junqueira. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence, 2018, 9(1), p. 383-389.

3. C.van Zyl, A.P.Malan. Cost-Effective Culturing of Galleria mellonella and Tenebrio Molitor and Entomopathogenic Nematode Production in Various Hosts. African Entomology, 2015, 23(2), p. 361-375.

4. MD 4198 B1 2013.02.28

Claims

Procedeu de obţinere a biomasei de larve de Galleria mellonella cu activitate biologică înaltă, care constă în plasarea pupelor în recipiente cu mediu nutritiv, menţinerea lor la temperatura de 27°C şi umiditatea de 75% până la eclozarea larvelor de prima vârstă, transferul larvelor după 6 ore de la eclozare în alte recipiente cu mediu nutritiv, cultivarea lor la temperatura de 27°C şi umiditatea de 75% timp de 19...21 de zile cu transferul larvelor de cel puţin 2 ori pe mediu nutritiv proaspăt şi colectarea larvelor, totodată mediul nutritiv are următoarea componenţă, g/kg:

Făină de grâu 185 - 200 Făină de porumb 180 - 190 Tărâţe de grâu 110 - 130 Extract de drojdie 15 - 20 Lapte praf 120 - 140 Miere de albine 75 - 95 Glicerol 80 - 90 Pulbere de ceară 40 - 55 Pinobanksin 0,02 - 0,03 Pinocembrin 0,02 - 0,03 Apă purificată restul.