MD1197Y - Metodă de tratament al osteomielitei - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la medicină, în special la traumatologie, ortopedie şi chirurgia septică şi poate fi utilizată pentru tratamentul osteomielitei cu utilizarea celulelor mezenchimale şi stimularea cu interleukine.Metoda de tratament al osteomielitei constă în aseptizarea tegumentelor zonei afectate, efectuarea anesteziei intramusculare şi intramedulare, după care cu o seringă se introduce intraarticular un extract din măduva osoasă a embrionilor de pui de găină, care conţine câte 1...2 ml de suspensie de celule mezenchimale cu un conţinut de 1500000 celule la 1 ml de mediu nutritiv şi un amestec de interleukinele IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, luate în cantităţi egale, doza sumară fiind de 80000 UI/ml, extractul se introduce repetat peste fiecare 3...4 săptămâni, timp de 2...4 luni.

Description

Invenţia se referă la medicină, în special la traumatologie, ortopedie şi chirurgia septică şi poate fi utilizată pentru tratamentul osteomielitei cu utilizarea celulelor mezenchimale şi stimularea cu interleukine.

În prezent sunt cunoscute mai multe metode de tratament al osteomielitelor, printre care folosirea antibioticelor, metoda de chiuretaj a zonei afectate, excizia zonei afectate şi transplantarea în zonă a unui transplant luat din os sănătos ş. a. Dar toate aceste metode foarte frecvent dau eşec şi se termină cu amputarea membrului afectat sau cu sepsis şi decesul bolnavului.

Este cunoscută metoda de tratament al osteomielitei cu stimularea osteogenezei prin introducerea în zona osului lezat a unui substrat biologic activ, şi anume a suspensiei omogene de cultură tisulară pe mediu nutritiv, obţinută din oase fărâmiţate ale embrionului uman din prima jumătate a sarcinii [1].

Dezavantajul acestei metode este pericolul de transmitere recipienţilor a diverselor maladii prin agenţii patogeni din cultura tisulară (de exemplu, hepatita virală, lues, HIV etc.), prepararea necesită colectarea unei cantităţi importante de materie primă, culturi tisulare.

Este cunoscută utilizarea unui remediu biostimulator pentru tratamentul osteomielitei, ce conţine cultură tisulară primară obţinută din embrioni de pasăre, de exemplu, de găină sau prepeliţă, din ziua a 9...12-a a perioadei de incubare, supernatantul obţinut la separarea culturii tisulare având raportul componentelor respectiv de 1,0:1,5…1,0:3,0 [2].

Dezavantajele metodei cunoscute constau în utilizarea ţesuturilor integrale de embrion de pasăre, care conţin diverse substanţe biologic active, care pot provoca reacţii adverse, utilizarea citokinelor integrale din ţesuturi fără selectarea lor sunt utile doar în anumite stări patologice şi pot amplifica procesele inflamatorii ale ţesutului osos cu un efect regenerativ insuficient.

Problema pe care o rezolvă prezenta invenţie constă în elaborarea unei metode eficiente de tratament, cu capacitate de a spori regenerarea reparatorie a ţesuturilor osoase ale organismului, care ar reduce pericolul de infectare a recipientului şi perioada de tratament.

Metoda de tratament al osteomielitei, conform invenţiei, înlătură dezavantajele menţionate mai sus prin aceea că constă în aseptizarea tegumentelor zonei afectate, efectuarea anesteziei intramusculare şi intramedulare, după care cu o seringă se introduce intraarticular un extract din măduva osoasă a embrionilor de pui de găină, care conţine câte 1...2 ml de suspensie de celule mezenchimale cu un conţinut de 1500000 celule la 1 ml de mediu nutritiv şi un amestec de interleukinele IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, luate în cantităţi egale, doza sumară fiind de 80000 UI/ml, extractul se introduce repetat peste fiecare 3...4 săptămâni, timp de 2...4 luni.

Rezultatul invenţiei constă în sporirea eficacităţii metodei de tratament, reducerea perioadei de tratament, efectuarea tratamentului în condiţii de ambulatoriu, ceea ce micşorează mult cheltuielile pentru tratament, iar pacientul îşi continuă activitatea.

Ţinând cont de aceste mari probleme în tratamentul pacienţilor cu osteomielită, au fost efectuate studii ştiinţifice pentru a elabora o metodă nouă de tratament cu folosirea celulelor menzechimale şi stimularea cu citokină, care au însuşirea de a stimula formarea ţesutului necesar pentru a fi amplasat în locul celui distrus în zonele afectate. Ele au capacitatea de a produce factori de creştere (EGF), (Auerbach R. W. Angiogenesis - reducing factors: A raven Lymphocytes, 1981, Pol. 4, p. 6-88), factori de transformare celulară (TGF-p), (Bûcher N., MaltR. Regeneration of liver and Kidney. Boston, 1971, p. 231-238), factori de stimulare şi de creştere a endoteliilor vaselor sangvine (VEGF), (Carlin D., Boer J., Babinson D. In vitro reconstruction of a composite implantacafald, adhesive and cultur sells, for cartilage repair. VI congre traumatolog-ortop., 1993, p. 427), ( Dedus Chin V., Artiomov A., Gololobov V.Concepţia contemporană la tratamentul fracturilor prin arme de foc. Congr. IV Tr.-Ort., 1993, p. 121-122). Interleukinele sunt peptide hidrosolubile, cu rol reglator, sintetizate în special de limfocite, dar şi de alte celule. Efectul lor se exercită în primul rând asupra celulelor limfoide, dar şi asupra altor celule.

IL-1 are următoarele activităţi:

- induce sinteza proteinei C reactive de fază acută de către ficat, nivelul seric crescut al acestei proteine fiind un indicator al faptului că organismul se luptă cu un proces inflamator. Un nivel al proteinei C reactive mai mare de 20 ml/dl ar trebui să dea de bănuit faptul că infecţia este de natură bacteriană;

- stimulează diferenţierea şi activarea limfocitelor B, stimulează proliferarea limfocitelor T;

- creşte sinteza de interleukină 2 şi exprimarea receptorilor pentru interleukină 2 de pe limfocitele T;

- induce exprimarea moleculelor MHC II ale sistemului major de histocompatibilitate pe suprafaţa membranei celulelor prezentatoare de antigen;

- activează bucla autocrină de creştere a producţiei de interleukină 1 prin stimularea producţiei acesteia de către monocite;

- induce sinteza moleculelor de aderenţă a leucocitelor la endoteliu cu favorizarea diapedezei şi a chemotactismului leucocitar şi macrofagic la situsul de declanşare a procesului inflamator;

- reglează hematopoieza în măduva osoasă hematogenă;

- induce sinteza de hormoni glucocorticoizi de către glanda suprarenală, hormoni care au rol inhibitor asupra acţiunii interleukinei 1, dar care produc creşterea exprimării receptorilor membranari pentru interleukina 1 pe membranele celulelor sistemului imun;

- are rol de factor pirogen endogen, declanşând procesul de febră prin stimularea sintezei prostaglandinelor de tip 3 care sunt active asupra centrului hipotalamic al termogenezei determinând creşterea temperaturii centrale;

- stimulează producţia altor citokine, precum: G-CSF (factorul de creştere a coloniilor granulocitare), TNF- alfa (Tumoral Necrosis Factor alfa), Interleukinele 6, 8 şi 11 şi PDGF (factorul de creştere derivat din trombocite);

- prin inhibarea acţiunii limfocitelor T supresoare are rol de factor contrasupresor.

Activităţi biologice. IL-2 exercită efect stimulator asupra celulelor care au secretat-o (buclă autocrină), dar şi asupra altor limfocite (buclă paracrină), deoarece receptorul de mare afinitate pentru IL-2 se găseşte pe majoritatea celulelor limfoide.

Limfocitele stimulate proliferează şi exprimă, la densitate înaltă, receptorii de IL-2 pe suprafaţa lor. Astfel se produce expansiunea clonală a limfocitelor care au recunoscut specific un antigen. Interacţiunea IL-2 cu receptorul său declanşează activarea şi proliferarea celulară. Rolul primar al IL-2 este expansiunea clonală a limfocitelor CD4 şi CD8.

Efectele interleukinei IL2

Realizează o buclă autocrină prin stimularea limfocitelor care au produs-o iniţial cu creşterea continuă a concentraţiei de interleukină 2 din sistem, precum şi o buclă paracrină stimulând producerea de IL-2 şi de către alte limfocite aflate local în contact cu limfocitul primar care a declanşat producţia iniţială de IL-2.

Expansiunea clonală a limfocitelor este efectul principal al acestei interleukine, întrucât limfocitele stimulate proliferează şi exprimă pe suprafaţa lor receptori pentru IL-2 în cantitate foarte mare. Prin urmare, toate limfocitele care au recunoscut un anumit antigen (antigen-specifice) se expansionează clonal (proliferează şi numărul lor creşte foarte mult), deoarece interacţiunea IL-2 cu receptorul său specific de pe membrana limfocitară declanşează activarea şi proliferarea celulară a limfocitelor stimulate de către respectiva interleukină. Se produce astfel expansiunea clonală a limfocitelor T din categoriile CD 4 şi CD 8, deoarece numai expansiunea lor depinde de acţiunea IL-2.

Un alt rol de bază al IL-2 în cadrul răspunsului imun este dat de faptul că ea determină diferenţierea limfocitelor T helper în limfocite T helper de tip 1 şi T helper de tip 2. IL-2 acţionează autocrin asupra limfocitelor T helper 1 şi paracrin asupra limfocitelor T helper 2. Activitatea citotoxică a limfocitelor T din clasa CD8 este stimulată de către IL-2.

Activarea limfocitelor B se produce datorită acţiunii IL-2, deoarece şi limfocitele B posedă receptori de mare afinitate pentru acest tip de citokină. Prin urmare ele proliferează, se transformă în plasmocite şi determină secreţia de anticorpi din clasele IgG, IgA şi IgM. Tot interleukina 2 determină comutarea izotipică cu transformarea anticorpilor de tip IgM în anticorpi de tip IgG, cu transformarea răspunsului imun nespecific în răspuns imun specific cu anticorpi specifici pentru antigenul declanşator.

Celulele Natural Killer (NK) stimulate de către IL-2 determină creşterea acţiunii lor citotoxice, însă nu şi proliferarea lor. Şi macrofagele sunt stimulate de către IL- 2 prin faptul că activitatea lor citotoxică faţă de celulele tumorale şi bacteriile intracelulare este mult amplificată. Creşte de asemenea şi activitatea antifungică a granulocitelor.

Interleukina 1 stimulează sinteza IL-2, la rândul ei IL-2 stimulează sinteza interleukinelor 4, 5 şi 6. Se intensifică de asemenea producţia de lactoferină şi TNF alfa.

IL-3 este o polipeptidă de 133 aminoacizi la om. Este produsă de limfocitele T şi de celulele NK, iar mastocitele şi eozinofilele stimulate produc cantităţi mici de IL-3. În reacţiile alergice, IL-3 modifică funcţiile mastocitelor, eozinofilelor şi macrofagelor. Efectele ei se exercită asupra celulelor din imediata vecinătate a celor care au produs-o, dar când se produce o activare masivă a limfocitelor (de exemplu, în infecţia gripală), IL-3 apare şi în circulaţie, iar efectele ei sunt sistemice. IL-3 stimulează activarea celulelor accesorii (granulocite, fagocite, plachete), cu funcţii de apărare şi reparare într-un focar inflamator. Stimulează diferenţierea celulelor stem în măduva hematopoetică, efectul fiind recuperarea funcţională a măduvei osoase consecutivă chimioterapiei citotoxice.

IL-4 este produsă de câteva seturi de limfocite şi are efecte multiple asupra celulelor limfoide. Sursa majoră de IL-4 sunt limfocitele Th2, o subpopulaţie esenţială pentru iniţierea RIMH faţă de agenţii patogeni extracelulari. IL-4 acţionează autocrin şi determină stimularea celulelor producătoare. Stimulează exprimarea moleculelor CMH II pe celulele B, precum şi secreţia IgE şi IgG1. De aceea a fost numit factorul stimulator al limfocitelor B. Induce diferenţierea celulelor TCD4 spre celule Th2, care la rândul lor secretă IL (IL-5, IL-10) stimulatoare ale RIMH. Este o citokină antiinflamatoare, producând inhibiţia citokinelor inflamatorii (IL-1, TNF) şi a PG.

IL-5 este secretată de limfocitele Th2 şi stimulează proliferarea şi diferenţierea limfocitelor B în răspunsul imun. Stimulează diferenţierea celulelor stem medulare în monocite şi eozinofile. Sinteza crescută a IL-5 determină eozinofilie.

IL-6 este o citochină multifuncţională, secretată de macrofage, de limfocitele T, de celulele endoteliale. Stimulează sinteza IgA în structurile limfoide asociate mucoaselor. Efectele IL-6 sunt sinergice cu ale IL-1. IL-6 este un mediator al răspunsului de fază acută. Răspunsul de fază acută este o reacţie sistemică antiinflamatoare, consecutivă infecţiei sau leziunii tisulare şi se caracterizează prin febră, leucocitoză, creşterea permeabilităţii vasculare, scăderea nivelului metalelor (Zn, Fe) şi al steroizilor plasmatici, dar creşte nivelul proteinelor de fază acută. Proteinele de fază acută sunt sintetizate de hepatocite sub acţiunea stimulatoare a unui factor specific, iar IL-6 are acţiune similară cu a factorului stimulator al hepatocitelor.

IL-8 este produsă de macrofage, fibroblaste, celule endoteliale. Face parte din categoria chemokinelor. Acţiunea sa principală este cea chemotactică faţã de neutrofile, eozinofile, limfocite T în focarul inflamator. Sinteza ei rapidă este indusă de LPS, de infecţia virală, în celulele mononucleare din sânge, în fibroblaste, în cheratinocite. IL-8 stimulează activarea neutrofilelor (migrare transendotelială, eliberarea enzimelor lizosomale, intensificarea metabolismului oxidativ, generarea anionului superoxid în focarul inflamator). Are efecte asupra celulelor nelimfoide: este haptotactică (induce migrarea celulelor epiteliale spre suprafaţă).

Metoda de pregătire a compusului

Din embrionul de pui se separă oasele tubulare, care se fragmentează cu foarfecele curb până la dimensiuni de 2...3 mm. Ţesutul embrionar se spală cu soluţie Hank de 2...3 ori, apoi se introduce într-o retortă conică şi se acoperă cu soluţie de tripsină de 0,25%. Se supune separării măduvei osoase în centrifuga magnetică timp de 10 min, se adaugă soluţie Hank, se lasă să se sedimenteze ţesutul fragmentat, apoi se separă lichidul supernatant, care se centrifughează în eprubete conice la 1000 rot/min timp de 10 min. Din nou se retrage lichidul supernatant, iar sedimentul (celulele embrionare dezagregate) se dizolvă în mediul nutritiv 199 în proporţie egală. Emulsia celulară de cultură primară se strecoară prin filtru de capron. Se determină numărul celulelor în 1 ml de emulsie. Doza de celule mezenchimale a fost apreciată şi stabilită standard în camera Goriaeva, se dozează câte 1 500 000 de celule la 1 ml de mediu nitritiv.

Supernatantul de asemenea se strecoară prin filtru de capron. Masa de emulsie obţinută se repartizează în flacoane câte 1...2 ml. Se păstrează în flacoane de sticlă acoperite ermetic cu dopuri de cauciuc şi placă metalică la temperatura de 4...6°C. Remediul este inofensiv, nu este toxic, nu provoacă alergizarea şi infectarea organismului şi nu are contraindicaţii pentru aplicare.

Înainte de aplicare remediul se ţine la temperatura camerei timp de 2...3 ore. Remediul biostimulator se utilizează intraosos, intramuscular, intraarticular.

Din supernatant se obţin interleukine, şi anume IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, care au un rol extrem de important la stimularea creşterii celulare şi stoparea degradării cartilajului articular, care se obţin prim metoda cromatografică de lichide în fază normală. Cromatografia de lichide în fază normală se aplică de obicei la separarea compuşilor organici foarte polari, cum sunt aminoacizii. Cromatografia lichid-solid (LSC) este de obicei denumită ca o tehnică de separare în fază normală, caracterizată de utilizarea unui adsorbant anorganic sau a unei faze staţionare chimic legate cu grupări funcţionale polare, iar ca fază mobilă neapoasă - unul sau mai mulţi solvenţi organici apolari (în special hexanul) în amestec cu un solvent polar, până la realizarea unei valori optime a „tăriei” solventului din punct de vedere al polarităţii.

Cea mai importantă fază staţionară în cromatografia de lichide în fază normală este silicagelul (SiO2). Acesta este considerat un adsorbant foarte polar, datorită grupărilor silanol reziduale din matricea sa. După obţinerea interleukinelor menţionate fracţionate, se amestecă în cantităţi egale cu obţinerea unei doze sumare de 80000 UI/ml.

Totodată, celulele mezenchimale osteogene au însuşirea de a stimula formarea activă şi reamplasarea părţii osoase deteriorate în zona afectată.

Au fost folosite celulele menzechimale împreună cu interleukine extrase din măduva osoasă a embrionilor de pui de găină.

Metoda a fost realizată cu folosirea celulelor embrionare de pui de găină, care nu prezintă nici un pericol, pot fi pregătite în cantităţi nelimitate şi păstrate la temperatură joasă timp de 6...12 luni.

Metoda de tratament cu utilizarea celulelor mezenchimale şi interleukinelor în tratamentul osteomielitelor se efectuează în modul următor.

Zona osului afectat de osteomielită, în partea externă la nivelul cutaneului, se prelucrează cu preparate antiseptice (alcool de 70%), se izolează cu un câmp steril, se infiltrează zona ţesuturilor moi cu preparate anestetice (lidocaină de 1% sau 2% sau ultracaină), se introduce un preparat anestezic şi în medula osoasă a osului afectat, apoi cu seringa se introduc, în dependenţă de mărimea zonei afectate, celule mezenchimale în doză de 1500000 celule (1 ml) sau 3000000 celule (2 ml) în combinare cu o doză sumară de 80000 UI/ml de interleukine, şi anume IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, care se conţin în cantităţi egale în 1 ml. Peste 3 sau 4 săptămâni procedura se repetă. Durata tratamentului este de 3...4 luni. Tratamentul se realizează în condiţii de ambulatoriu. Aceasta micşorează mult cheltuielile pentru tratament, pacientul continuându-şi activitatea de lucru având un comportament normal.

Au fost supuşi tratamentului 32 de pacienţi cu vârsta de la 15 până la 70 de ani cu osteomielite, forma fistulară cronică, la care tratamentul cu metode obişnuite au dat eşec (durata tratamentului cu metode tradiţionale a durat de la 3 până la 8 ani). În urma investigaţiilor, dintre ei: cu osteomielită hematogenă cronică au fost 8 pacienţi, posttraumatică 19 pacienţi, prin arme de foc - 3 pacienţi şi după panariţii la falange - 2 pacienţi.

Durata de observaţie la distanţă în timp este de la 1 la 6 ani.

Din numărul total de pacienţi, la 30 de pacienţi procesul osteomielitei a fost complet lichidat, iar structura osului afectat a fost restabilită, iar la 2 au fost doar ameliorări temporare din cauza abandonării tratamentului.

În dinamica observării la distanţă n-au avut loc recidive ale procesului osteomielitei. Pacienţii sunt consideraţi însănătoşiţi definitiv.

Folosirea celulelor mezenchimale la tratamentul osteomielitelor (osteitelor) permite de a lichida complet procesul osteomielitei şi de a restabili structura osului afectat.

Exemplul 1

Pacientul P., 26 ani, cu o traumă prin armă de foc la 1/3 medie a gambei. În dinamica tratamentului fractura ambelor oase a gambei s-a complicat cu osteomielită. A fost operat în clinică la spitalul de urgenţă din Chişinău, apoi peste 5 luni la Spitalul Republican de Traumatologie şi Ortopedie.

Durata tratamentului după intervenţiile chirurgicale a constituit 2 ani, fără succes, s-au format 3 fistule. Peste 2 ani a fost operat în Clinica de Traumatologie din Kiev. Ameliorări după operaţie au fost timp de 6 luni, după care s-a agravat procesul osteomielitei. La consultaţie repetată pacientului i s-a propus amputaţia piciorului.

Pacientului i s-a propus tratament prin metoda revendicată. În dinamica tratamentului, peste 3 luni s-au închis toate fistulele. După finalizarea seriei de tratament, la controlul dinamic, şi anume peste 6 luni s-au restabilit 2/3 din structura osului afectat. Peste un an s-a restabilit structura completă a oaselor afectate. La distanţă, peste 5 ani, ambele oase ale gambei sunt complet restabilite. Procesul osteomielitei pe această durată de timp nu s-a manifestat.

Exemplul 2

Pacienta N., 16 ani, s-a adresat cu osteomielită la falanga distală a indicelui la mâna dreaptă după panariciu. Tratamentul după metoda tradiţională a adus la distrucţia completă a osului.

Pacientei i s-a propus amputarea falangei, ea a refuzat şi s-a adresat pentru a efectua tratamentul conform metodei descrise. După tratament, timp de 2 luni a fost lichidat procesul inflamator, iar osul afectat în zona falangei s-a restabilit complet. Pacienta este considerată însănătoşită definitiv.

1. SU 1169639 A1 1984.02.20

2. MD 1585 F1 2001.01.31

Claims (1)

1. Metodă de tratament al osteomielitei, care constă în aseptizarea tegumentelor zonei afectate, efectuarea anesteziei intramusculare şi intramedulare, după care cu o seringă se introduce intraarticular un extract din măduva osoasă a embrionilor de pui de găină, care conţine câte 1...2 ml de suspensie de celule mezenchimale cu un conţinut de 1500000 celule la 1 ml de mediu nutritiv şi un amestec de interleukinele IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, luate în cantităţi egale, doza sumară fiind de 80000 UI/ml, extractul se introduce repetat peste fiecare 3...4 săptămâni, timp de 2...4 luni.