MD1090Z - Procedeu de inducere a haploizilor la orz - Google Patents

Procedeu de inducere a haploizilor la orz Download PDF

Info

Publication number
MD1090Z
MD1090Z MDS20160028A MDS20160028A MD1090Z MD 1090 Z MD1090 Z MD 1090Z MD S20160028 A MDS20160028 A MD S20160028A MD S20160028 A MDS20160028 A MD S20160028A MD 1090 Z MD1090 Z MD 1090Z
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
anthers
fhg
days
dark
temperature
Prior art date
Application number
MDS20160028A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Inventor
Светлана СМЕРЯ
Лариса АНДРОНИК
Екатерина МАКОВЕЙ
Наталия МАЩЕНКО
Original Assignee
Институт Генетики, Физиологии И Защиты Растений Академии Наук Молдовы
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Институт Генетики, Физиологии И Защиты Растений Академии Наук Молдовы filed Critical Институт Генетики, Физиологии И Защиты Растений Академии Наук Молдовы
Priority to MDS20160028A priority Critical patent/MD1090Z/ro
Publication of MD1090Y publication Critical patent/MD1090Y/ro
Publication of MD1090Z publication Critical patent/MD1090Z/ro

Links

Landscapes

  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

Invenţia se referă la biotehnologie, şi anume la un procedeu de inducere a haploizilor la orz.Procedeul, conform invenţiei, include colectarea spicelor la etapa de microsporogeneză, sterilizarea acestora, menţinerea la întuneric la o temperatură de 4°C în decurs de 3 zile, excizarea anterelor din spiculeţul central al părţii de mijloc a spicului, inocularea anterelor într-un mediu nutritiv ce conţine 0,7 M manitol, 40 mM CaCl2 şi 8 g/l agaroză şi incubarea la întuneric la o temperatură de 24°C timp de 4 zile, transferarea anterelor pe mediul nutritiv de inducere FHG cu un conţinut de Ficol de 200 g/l şi suplimentat cu 0,0001% de glicozide iridoice obţinute din plante de Linaria genistifolia, menţinerea la întuneric la o temperatură de 24°C în decurs de 12..14 zile, după care anterele cu răspuns pozitiv se transferă pe mediul FHG cu un conţinut de Ficol de 400 g/l.

Description

Invenţia se referă la biotehnologie, şi anume la un procedeu de inducere a haploizilor la orz.
Una din cele mai aplicabile metode de inducere a haploizilor la orz este cultura in vitro a anterelor ca urmare a inducerii embriogenezei microsporale. Această cale este de perspectivă, fiind utilizată pe larg în crearea a numeroase linii de cereale, dar reuşita acestei tehnici este influenţată în primul rând de factorii genetici, care determină frecvenţa formării calusurilor şi embrionilor. Deosebit de important în obţinerea răspunsului pozitiv în cultura anterelor este pretratamentul spicelor/anterelor şi componenţa mediilor nutritive ce conduc microsporii spre formarea de structuri embriogene.
Este cunoscut procedeul bazat pe prelevarea spicelor la stadiul de microspori uninucleaţi (ce corespunde fazei de burduf), sterilizarea şi plasarea în cutii Petri cu puţină apă distilată sterilă pentru 3 zile în frigider la 4°C, excizarea anterelor, inocularea lor pe mediul nutritiv ce conţine manitol (0,7M), CaCl2 (40mM) şi agaroză (8g/l) şi incubarea la întuneric timp de 4 zile la 24°C, după care acestea sunt transferate în cutii Petri ce conţin mediul de inducere FHG şi plasate la întuneric la o temperatură de 24°C [1].
Neajunsul procedeului cunoscut este rata redusă a anterelor ce prezintă răspuns pozitiv la condiţiile in vitro în vederea obţinerii plantelor haploide.
Problema pe care o rezolvă invenţia propusă constă în sporirea cotei de antere care formează structuri embriogene de natură microsporală.
Invenţia soluţionează problema prin aceea că se propune un procedeu de inducere a haploizilor la orz, care include colectarea spicelor la etapa de microsporogeneză, sterilizarea acestora cu clorură şi cu alcool etilic de 70%, plasarea în cutii Petri cu apă distilată sterilă, menţinerea la întuneric la o temperatură de 4°C în decurs de 3 zile, excizarea, sub un microscop binocular, a anterelor din spiculeţul central al părţii de mijloc a spicului, inocularea anterelor într-un mediu nutritiv ce conţine 0,7 M manitol, 40 mM CaCl2 şi 8 g/l agaroză în cutii Petri, izolarea cutiilor cu parafilm şi incubarea la întuneric la o temperatură de 24°C timp de 4 zile, transferarea anterelor pe mediul nutritiv de inducere FHG cu un conţinut de Ficol de 200 g/l şi suplimentat cu 0,0001% de glicozide iridoice, obţinute din plante de Linaria genistifolia, prin extragere cu soluţie hidrometanolică la fierbere şi separare cromatografică ulterioară, menţinerea la întuneric la o temperatură de 24°C în decurs de 12..14 zile, după care anterele cu răspuns pozitiv se transferă pe mediul FHG cu un conţinut de Ficol de 400 g/l.
Glicozidele iridoice sumare (GIS) din Linaria genistifolia s-au obţinut din material vegetal uscat (300 g partea aeriană). La materialul vegetal mărunţit s-au adăugat 1,5 l de soluţie apoasă de metanol 60%, apoi a fost supus refluxului prin fierbere timp de 6 ore, procedura fiind repetată de 3 ori. Extractele obţinute au fost combinate şi concentrate prin distilare în vid, după care reziduul apos a fost decantat cu cloroform. Fracţia apoasă a fost trecută prin coloană cu Sephadex LH-20. Coloana a fost spălată consecutiv cu apă, soluţie apoasă de metanol de 10% şi metanol pur. Ambele eluate metanolice au fost combinate şi evaporate prin distilare în vid până la uscare. Extractul uscat obţinut (4,6 g) reprezintă GIS (Mashcenco N., Gurev A., Lupascu G., Gorincioi E. Iridoid glycosides from Linaria genistifilia (L.) Mill. in biological control of soil-borne fungal pathogens of wheat and some structure consideration. Chemistry Journal of Moldova. General, Industrial and Ecological Chemistry. 2015, 10 (1), 57-63).
Rezultatul invenţiei constă în sporirea cotei de antere care formează structuri embriogene de natură microsporală în crearea haploizilor la orz.
Exemplu de realizare a invenţiei
În cercetare au fost antrenate soiurile de orz Strălucitor, Ciuluc şi Galactic. Plantele au fost crescute în condiţii de câmp conform tehnicilor standard. Spicele au fost colectate la etapa de microsporogeneză, stadiul microsporilor uninucleaţi (ce corespunde fazei de burduf). Etapa a fost apreciată prin examinarea citologică a preparatelor temporare prin colorare cu carmină acetică.
Spicele identificate la stadiul de microspori uninucleaţi au fost colectate. După sterilizare cu clorură de sodiu, spicele au fost trecute prin alcool 70%, apoi plasate în cutii Petri cu puţină apă distilată sterilă pentru 3 zile în frigider la 4°C, întuneric. Pentru fiecare genotip au fost selectate câte cel puţin 5 spice. În incinta boxei cu flux laminar, sub un microscop binocular, din spiculeţul central al părţii de mijloc a spicului au fost excizate anterele şi inoculate pe mediul nutritiv ce conţine manitol (0,7M), CaCl2 (40mM) şi agaroză (8 g/l). Cutiile Petri în care au fost inoculate anterele au fost izolate cu parafilm şi incubate la 24°C, întuneric, pentru 4 zile. După 4 zile anterele au fost transferate în cutii Petri ce conţin mediul nutritiv de inducere FHG (tabelul 1) şi menţinute la 24°C, la întuneric. După 12…14 zile anterele cu răspuns pozitiv au fost transferate pe mediu FHG cu conţinut de Ficol 400g/l.
Tabelul 1
Compoziţia mediului nutritiv utilizat pentru inducerea embriogenezei la orz
Nr. FHG de inducere a embriogenezei Componentele mediului nutritiv Cantitatea (mg/l) Macroelemente 1 KNO3 1900 2 NH4NO3 165 3 CaCl2·2H2O 440 4 MgSO4·7H2O 370 5 KH2PO4 170 6 Fe Na2EDTA 37,5 Microelemente 7 MnSO4·4H2O 22,3 8 H3BO3 6,2 9 ZnSO4·7H2O 8,6 10 KI 0,83 11 Na2MoO4·2H2O 0,25 12 CuSO4·5H2O 0,025 13 CoCl2·6H2O 0,025 Vitamine 14 Mioinozitol 100 15 Tiamină HCl 0,4 Alţi factori 16 Glutamină 730 17 BAP 1 18 Maltoză 62000 19 Ficol 200000 pH 5,8
Procedeul, conform invenţiei, include suplimentarea mediului nutritiv de inducere FHG cu GIS (Nr.1). Pentru stabilirea concentraţiei optime au fost utilizate două variante: 0,001% GIS şi 0,0001% GIS. De asemenea, a fost aplicată schema de inoculare fără pretratament (Nr.2), conform căreia după sterilizare anterele au fost plasate pe cele trei variante ale mediului nutritiv de inducere (FHG, FHG+0,001% GIS şi FHG+0,0001% GIS).
Conform rezultatelor obţinute (tabelul 2) s-a constatat că GIS a prezentat efect stimulator în inducerea reacţiei pozitive a anterelor pe mediul nutritiv FHG doar în concentraţia de 0,0001% (varianta FHG+0,0001% GIS). În varianta fără pretratament GIS a avut un impact pozitiv doar la soiul Ciuluc.
Tabelul 2
Cota anterelor de orz cu răspuns pozitiv la condiţiile in vitro de cultivare în dependenţă de pretratamentul aplicat (%)
Genotip Nr.1 Pretratament Nr.2 Fără pretratament Antere inoculate (nr.) FHG FHG+0,001% GIS FHG+0,0001% GIS FHG FHG+0,001% GIS FHG+0,0001% GIS Strălucitor 0,7 0 1,39 0 0 0 144 Ciuluc 0,36 0 0,72 1,07 0 1,61 562 Galactic 0,58 0 1,72 0,58 0 0 175
În varianta cu pretratament (Nr.1) GIS a condus la o creştere a răspunsului pozitiv al anterelor de cca 2 ori la soiurile Ciuluc şi Strălucitor, iar la Galactic de 2,97 ori.
După una-două săptămâni de recultivare in vitro a anterelor cu răspuns pozitiv a fost atestată inducerea embriogenezei. Capacitatea embriogenă a microsporilor a fost influenţată de genotip, precum şi de mediul nutritiv (tabelul 3).
Tabelul 3
Capacitatea embriogenă a microsporilor de orz cultivaţi in vitro conform variantei cu pretratament
Genotip FHG FHG+0,0001% GIS Cota anterelor cu răspuns pozitiv Structuri embriogene Cota anterelor cu răspuns pozitiv Structuri embriogene Strălucitor 0,7 1 1,39 1,67 Ciuluc 0,36 2,44 0,72 3,15 Galactic 0,58 1,5 1,72 2,83
Aplicarea schemei cunoscute de inducere a androgenezei pe mediul FHG a generat formarea de la 1 până la 2,4 structuri embriogene per anteră în dependenţă de genotipul analizat.
Suplimentarea mediului nutritiv FHG cu GIS a favorizat sporirea cotei de structuri embriogene la toate trei genotipuri incluse în studiu. Conform procedeului propus capacitatea embriogenă a sporit la soiul Ciuluc de cca 1,3, la soiul Strălucitor de 1,67, iar la soiul Galactic de 1,89 ori. Creşterea numărului de structuri embiogene formate ca rezultat al diferenţierii microsporilor contribuie la eficientizarea căii de obţinere a haploizilor la soiurile de orz cu capacitate androgenă redusă.
1. Cistue L., Valles M. P., Echavarri B., Sanz J.M., Castillo A. Barley anther culure. In: Maluszynski M., Kasha K. J., Forster B.P., Szarejko I. Doubled haploid production in crop plants. A manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London, 2003, p. 29-34

Claims (1)

  1. Procedeu de inducere a haploizilor la orz, care include colectarea spicelor la etapa de microsporogeneză, sterilizarea acestora cu clorură şi cu alcool etilic de 70%, plasarea în cutii Petri cu apă distilată sterilă, menţinerea la întuneric la o temperatură de 4°C în decurs de 3 zile, excizarea, sub un microscop binocular, a anterelor din spiculeţul central al părţii de mijloc a spicului, inocularea anterelor într-un mediu nutritiv ce conţine 0,7 M manitol, 40 mM CaCl2 şi 8 g/l agaroză în cutii Petri, izolarea cutiilor cu parafilm şi incubarea la întuneric la o temperatură de 24°C timp de 4 zile, transferarea anterelor pe mediul nutritiv de inducere FHG cu un conţinut de Ficol de 200 g/l şi suplimentat cu 0,0001% de glicozide iridoice, obţinute din plante de Linaria genistifolia, prin extragere cu soluţie hidrometanolică la fierbere şi separare cromatografică ulterioară, menţinerea la întuneric la o temperatură de 24°C în decurs de 12..14 zile, după care anterele cu răspuns pozitiv se transferă pe mediul FHG cu un conţinut de Ficol de 400 g/l.
MDS20160028A 2016-02-26 2016-02-26 Procedeu de inducere a haploizilor la orz MD1090Z (ro)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MDS20160028A MD1090Z (ro) 2016-02-26 2016-02-26 Procedeu de inducere a haploizilor la orz

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MDS20160028A MD1090Z (ro) 2016-02-26 2016-02-26 Procedeu de inducere a haploizilor la orz

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MD1090Y MD1090Y (ro) 2016-11-30
MD1090Z true MD1090Z (ro) 2017-06-30

Family

ID=57424883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDS20160028A MD1090Z (ro) 2016-02-26 2016-02-26 Procedeu de inducere a haploizilor la orz

Country Status (1)

Country Link
MD (1) MD1090Z (ro)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MD1193Z (ro) * 2017-03-31 2018-04-30 Николае ЕРЕМИЯ Procedeu de hrănire a albinelor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cistue L., Valles M. P., Echavarri B., Sanz J.M., Castillo A. Barley anther culure. In: Maluszynski M., Kasha K. J., Forster B.P., Szarejko I. Doubled haploid production in crop plants. A manual. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London, 2003, p. 29-34 *

Also Published As

Publication number Publication date
MD1090Y (ro) 2016-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Refaay et al. Effect of foliar application with Chlorella vulgaris, Tetradesmus dimorphus, and Arthrospira platensis as biostimulants for common bean
Singh et al. Buckwheat (Fagopyrum sp.) genetic resources: What can they contribute towards nutritional security of changing world?
Yoon et al. Evaluation of phenolic compounds, antioxidant and antimicrobial activities from transgenic hairy root cultures of gherkin (Cucumis anguria L.)
Jäger et al. Improvement of maize (Zea mays L.) anther culture responses by algae-derived natural substances
Yadav et al. Arbuscular mycorrhizal fungi induced acclimatization and growth enhancement of Glycyrrhiza glabra L.: a potential medicinal plant
Baishya et al. In vitro co-cultivation of Piriformospora indica filtrate for improve biomass productivity in Artemisia annua (L.)
Uyen et al. In vitro mutation breeding of Paphiopedilum by ionization radiation
Khandy et al. Obtaining and study of callus and suspension plant cell cultures of Tribulus terrestris L., a producer of steroidal glycosides
CN104813917B (zh) 一种辣椒的育种方法
El-Nagar et al. Bioprospecting endophytic fungi for bioactive metabolites with seed germination promoting potentials
CN104472345B (zh) 一种聚合双抗普通花叶病和黑胫病种质资源的选育方法
Yemets et al. Establishment of in vitro culture, plant regeneration, and genetic transformation of Camelina sativa
CN104762216B (zh) 一种抗盐胁迫真菌菌株及选育方法和其应用
Moura et al. Proteomics changes during the incompatible interaction between cowpea and Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz and Sacc
Hegde et al. In vitro androgenesis in Capsicum (Capsicum annuum L.)
Ogata et al. Possible involvement of abscisic acid in the induction of secondary somatic embryogenesis on seed-coat-derived carrot somatic embryos
MD1090Z (ro) Procedeu de inducere a haploizilor la orz
WO2017144065A1 (en) Sustainable and industrial production of guaianolides based on organ tissue culture
Amini et al. Improvement of in vitro embryo maturation, plantlet regeneration and transformation efficiency from alfalfa (Medicago sativa L.) somatic embryos using Cuscuta campestris extract
Chen et al. Somatic embryogenesis and mass spectrometric identification of proteins related to somatic embryogenesis in Eruca sativa
Thomas et al. Dendrobium protoplast co-culture promotes phytochemical assemblage in vitro
Han et al. Ginsenoside Rb1 in asymmetric somatic hybrid calli of Daucus carota with Panax quinquefolius
Gevrenova et al. Root in vitro cultures of six Gypsophila species and their saponin contents
Nitnaware et al. Genetic engineering in safflower (Carthamus tinctorius L.): Retrospect and prospect
RU2605912C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ КОРНЕЙ Silene linicola К1601 - ПРОДУЦЕНТА ЭКДИСТЕРОИДОВ

Legal Events

Date Code Title Description
FG9Y Short term patent issued
KA4Y Short-term patent lapsed due to non-payment of fees (with right of restoration)