LV15490B - Mikotoksīnu noteikšanas paņēmiens raudzētā graudu vai ogu alkoholiskā vai bezalkoholiskā dzērienā - Google Patents

Abstract

Izgudrojums attiecas uz analītisko ķīmiju, konkrēti uz pārtikas piesārņojuma noteikšanas metodēm. Tas var tikt izmantots selektīvai divpadsmit mikotoksīnu, proti, aflatoksīna Bl, beauvericīna, deoksinivalenola, enniatīna A, enniatīna A1; enniatīna B, enniatīna B1; HT-2 toksīna, ohratoksīna A, sterigmatocistīna, T-2 toksīna un zearalenona satura noteikšanai alū, vīnā un citos raudzētos graudu vai ogu alkoholiskos un bezalkoholiskos dzērienos. Paņēmiens raksturīgs ar to, ka tas nodrošina automatizētu paraugu attīrīšanu no matricas komponentiem, izmantojot tiešsaistes cietās fāzes ekstrakcijas kolonnas ar grafitizētas ogles cieto sorbentu sistēmu, bet paraugu attīrīšanas un eluēšanas šķīdums ir divfāžu, kur pirmā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums ūdenī, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un otrā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums acetonitrilā, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, ar mainīgu fāžu attiecību. Paņēmiens nodrošina augstu attīrīšanas efektivitāti un analītisko jutību divpadsmit mikotoksīnu vienlaicīgai noteikšanai analizējamā paraugā, lietojot tiešsaistes augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju-nolidojuma laika masspektrometriju.

Description

IZGUDROJUMA APRAKSTS

[0001] Izgudrojums attiecas uz analītisko ķīmiju, konkrēti uz pārtikas piesārņojuma noteikšanas metodēm, un var tikt izmantots selektīvai divpadsmit mikotoksīnu, proti, aflatoksīna B1, beauvericīna, deoksinivalenola, enniatīna A, enniatīna Ai, enniatīna B, enniatīna Bi, HT-2 toksīna, ohratoksīna A, sterigmatocistīna, T-2 toksīna un zearalenona noteikšanai alū, vīnā un citos raudzētos graudu vai ogu alkoholiskos un bezalkoholiskos dzērienos.

[0002] Ir zināmas tradicionālas mikotoksīnu satura noteikšanas metodes alū, vīnā, kas ietver vairāku stadiju paraugu sagatavošanas procedūras, attīrīšanai lietojot šķidrumašķidruma ekstrakciju vai dispersīvo cietās fāzes ekstrakciju, bet analīzi veic ar šķidruma hromatogrāfiju kombinācijā ar fluorescences, ultravioletās gaismas vai masspektrometrijas detektoriem [Rubert, J., Soler, C., Marin, R., James, K.J., and Manes, J., 2013. Mass spectrometry strategies for mycotoxins analysis in European beers. Food Control 30: 122128.].

[0003] Tomēr piedāvātās paraugu sagatavošanas procedūras ir laikietilpīgas un darbietilpīgas, tām ir liels organisko šķīdinātāju un ķīmisko reaģentu patēriņš, turklāt vairākos gadījumos ir grūti realizēt vairāku mikotoksīnu vienlaicīgu noteikšanu, jo paraugu sagatavošanas procedūras neļauj pilnvērtīgi atbrīvoties no paraugu matricas atliekvielām (olbaltumvielām, cukuriem, polifenoliem, minerālsāļiem, alkohola), un tas var ietekmēt analīžu metožu selektivitātes un jutības pazemināšanos.

[0004] Šķidruma hromatogrāfijas metožu kombinēšana ar automatizētas padeves (online) cietās fāzes ekstrakcijas metodi ļauj nodrošināt paraugu sagatavošanas un analīzes procedūru pilnīgu automatizāciju. Samazināts šķīdinātāja patēriņš un mazāka nepieciešamība apstrādāt paraugus ir citas automatizētas padeves cietās fāzes ekstrakcijas metožu skaidras priekšrocības.

[0005] Ir zināmi mikotoksīnu noteikšanas paņēmieni alū un vīnā, kur paraugu cietās fāzes ekstrakcijas un analīzes kontrolei tiek lietotas automatizētu sešu vai desmit kanālu pārslēgšanas vārsta iekārtas. Iekārtas nodrošina automatizētu parauga attīrīšanas operāciju, savienojot parauga ievadīšanas inžektora cilpu tiešsaistē ar cietās fāzes ekstrakcijas kolonnu un kolonnu ar atkritumu novadīšanas konteineru, kā arī automatizētu attīrītā parauga desorbēšanu no cietās fāzes cietā sorbenta un tūlītēju analīzi šķidruma hromatogrāfa analītiskajā kolonnā. Kustīgās fāzes eluentu plūsmas ātrumu parauga attīrīšanas un analīzes režīmos kontrolē divi sūkņi, kas nodrošina nemainīgu eluentu padevi uz cietās fāzes ekstrakcijas un analītiskajām kolonnām [Fumes, В. H., Andrade, M. A., Franco, M. S., and

Lanςas, F. M., 2017. On-line approaches for the determination of residues and contaminants in complex samples. J. Sep Sci 40: 183-202].

[0006] Zināmie automatizētas padeves cietas fazes ekstrakcijas paņēmieni mikotoksinu noteikšanai alus un vīna paraugos, ir ierobežoti ar viena vai divu mikotoksīnu (ohratoksīns A, citrinīns) satura noteikšanu, pielietojot metodes, kas ir kombinētas ar fluorescences, ultravioletās gaismas, vai masspektrometrijas detektoru iekārtām [Lhotska, I., Šatinsky, D., Havlikova, L., and Solich, P., 2016. A fully automated and fast method using direct sample injection combined with fused-core column on-line SPE-HPLC for determination of ochratoxin A and citrinin in lager beers, Anal and Bioanal Chem 408: 3319-3329; Campone, L., Piccinelli, A. L., Celano, R., Pagano, I., Russo, M., & Rastrelli, L. (2018). Rapid and automated on-line solid phase extraction HPLC-MS/MS with peak focusing for the determination of ochratoxin A in wine samples. Food chemistry, 244, 128-135]. Zināmajos paņēmienos tiek veikta selektīva viena vai dažu mikotoksīnu noteikšana alus vai vīna paraugos, metožu trūkumi ir samērā ilgs analīzes laiks, procedūrās paredzēts lietot vairāk nekā divas šķīdinātāju sistēmas fāzes ekstrakcijai un mikotoksīnu eluēšanai uz analītisko kolonnu, turklāt cietās fāzes ekstrakcijas attīrīšanas un nosakāmo mikotoksīnu koncentrēšanas stadijām nepieciešamas priekškolonnas un citi tehniski risinājumi, kas sarežģī mikotoksīnu noteikšanas metodes.

[0007] Vistuvākais piedāvātajam mikotoksīnu noteikšanas paņēmienam ir paņēmiens [Lhotska, I., Šatinsky, D., Havlikova, L., and Solich, P., 2016. A fully automated and fast method using direct sample injection combined with fused-core column on-line SPE-HPLC for determination of ochratoxin A and citrinin in lager beers, Analytical and Bioanalytical Chemistry 408: 3319-3329], kas ietver divu mikotoksīnu (ohratoksīna A un citrinīna) noteikšanu tumšā alus paraugos, automatizētas padeves cietās fāzes ekstrakcijas stadijā par cieto sorbentu lietojot sakausētas serdes C18 apgrieztās fāzes silikagela aizsargkolonnu ar kausēta kodola sastāvu.

[0008] Zināmais mikotoksīnu noteikšanas paņēmiens ietver šādas stadijas:

paraugu priekšsagatavošanu, veicot filtrēšanu caur teflona membrānas filtru, filtrāta (100 μl tilpums) ievadīšanu inžektora cilpā;

filtrāta ievadīšanu no inžektora cilpas caur sešu kanālu vārstu kolonnā, kas sastāv no cietās serdes C18 apgrieztās fāzes silikagela aizsargkolonnas ar kausēta kodola cieto sorbentu;

mikotoksīnu adsorbēšanu uz cietā sorbenta virsmas;

uz cietā sorbenta virsmas adsorbēto mikotoksīnu ekstrakta attīrīšanu, cauri kolonnai eluējot mazgāšanas šķīdumu (4 ml) divas minūtes, par kustīgo fāzi lietojot maisījumu, kas sastāv no ūdens/metanola/etiķskābes (attiecīgi 65,5:30:0,5 tilpuma %), plūsmas ātrums visu analīzes laiku tiek uzturēts 2 ml/min, regulējot to ar pirmā sūkņa palīdzību, lai aizvadītu parauga matricas atliekvielas ar mazgāšanas šķīdumu uz atkritumu savākšanas konteineru;

sešu kanālu vārsta pārslēgšanu eluēšanas režīmā uz šķidruma hromatogrāfa analītisko kolonnu un sekojošu mikotoksīnu desorbēšanu no cietā sorbenta virsmas un tūlītēju attīrītā mikotoksīnu ekstrakta ievadīšanu šķidruma hromatogrāfijas analītiskajā kolonnā ar cietās serdes C18 apgrieztās fāzes silikagela cietā sorbenta sastāvu;

kolonnā ievadīto mikotoksīnu satura noteikšanu ar UV spektrometrijas detektoru, analīzes laikā lietojot divfāžu eluenta sistēmu, kur pirmā fāze ir ūdens, kas satur 0,5 tilpuma % etiķskābes, un otrā fāze ir organiskais šķīdinātājs (100 % acetonitrils). Mikotoksīnu satura hromatogrāfiskajai analīzei tiek lietoti sekojoši apstākļi: analīzes sākumā pirmās fāzes saturs tiek uzturēts vienu minūti 55 tilpuma %, pēc divām minūtēm un 30 sekundēm pirmās fāzes saturu lineāri samazina līdz 25 tilpuma %, un pēc 30 sekundēm atkal palielina līdz 55 tilpuma %; plūsmas ātrums visu analīzes laiku tiek uzturēts 1 ml/min, regulējot to ar otrā sūkņa palīdzību;

sešu kanālu vārsta pārslēgšanu cietās fāzes ekstrakcijas režīmā un hromatogrāfijas kolonnas sistēmas līdzsvarošanu, caur analītisko kolonnu trīs minūtes eluējot kustīgo fāzi ar pirmās fāzes saturu 55 tilpuma %, lai sagatavotu to nākamo analīžu veikšanai.

[0009] Tomēr zināmais mikotoksīnu noteikšanas paņēmiens ietver specifisku membrānas filtru lietošanu paraugu priekšattīrīšanai un sakausētas serdes C18 silikagela priekškolonnas cietā sorbenta lietošanu mikotoksīnu satura noteikšanai. Turklāt pielietotais mazgāšanas šķīdums nenodrošina pilnīgu mikotoksīnu ekstraktu atdalīšanu no alus paraugu matricas atliekvielām. Zināmā paņēmiena pielietotā analītiskās noteikšanas metode kombinācijā ar piedāvāto paraugu sagatavošanu nenodrošina pietiekami augstu mikotoksīnu noteikšanas jutību un selektivitāti un ir pielietojama tikai selektīvai skābo mikotoksīnu, proti, ohratoksīna A un citrinīna, noteikšanai raudzētu graudu vai ogu alkoholiskajos vai bezalkoholiskajos dzērienos.

[00010] Tehniskais uzdevums, kuru risina piedāvātais izgudrojums, ir automatizētas padeves cietās fāzes ekstrakcijas - šķidruma hromatogrāfijas metodes efektivitātes, jutības un precizitātes uzlabošana, lai radītu universālu automatizētu metodi divpadsmit mikotoksīnu ar atšķirīgām fizikāli-ķīmiskajām īpašībām satura noteikšanai raudzētā graudu vai ogu alkoholiskajā un bezalkoholiskajā dzērienā.

[00011] Piedāvātais mikotoksīnu noteikšanas paņēmiens raudzētā graudu vai ogu alkoholiskajā un bezalkoholiskajā dzērienā ietver šādas stadijas:

paraugu priekšsagatavošanu, veicot filtrēšanu caur celulozes papīra filtru;

filtrāta degazēšanu vismaz ultraskaņas vannā, lai aizvāktu projām gaistošus un gāzveida analizējamā parauga matricas savienojumus;

degazētā filtrāta ievadīšanu inžektora cilpā;

degazētā filtrāta ievadīšanu no inžektora cilpas caur sešu kanālu vārstu cietās fāzes ekstrakcijas kolonnā, kas sastāv no grafitizētas ogles cietā sorbenta;

mikotoksīnu adsorbēšanu uz cietā sorbenta virsmas;

mikotoksīnu automatizētas padeves cietās fāzes ekstrakciju uz cietā sorbenta virsmas, divas minūtes cauri kolonnai eluējot divfāžu mazgāšanas šķīdumu, kur pirmā fāze ir 0.5 mM amonija acetāta šķīdums ūdenī, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un otrā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums acetonitrilā, kas satur 0,1 tilpuma %; pirmā šķīduma saturs mazgāšanas šķīdumā ir 70 tilpuma %; eluēšanas plūsmas ātrums ir 0,70 ml/min, lai aizvadītu parauga matricas atliekvielas ar mazgāšanas šķīdumu uz atkritumu savākšanas konteineru;

sešu kanālu vārsta pārslēgšanu eluēšanas režīmā uz šķidruma hromatogrāfa analītisko kolonnu un sekojošu mikotoksīnu desorbēšanu no cietā sorbenta virsmas un attīrītā mikotoksīnu ekstrakta ievadīšanu šķidruma hromatogrāfijas analītiskajā kolonnā ar tradicionāli lietotu C18 silikagela sorbenta sastāvu;

kolonnā ievadīto mikotoksīnu satura noteikšanu ar nolidojuma laika masspektrometrijas detektoru;

hromatogrāfijas kolonnas sistēmas līdzsvarošanu, lai sagatavotu to nākamo analīžu veikšanai, otrās fāzes saturs 30 tilpuma % tiek noturēts trīs minūtes.

[00012] Piedāvātais mikotoksīnu noteikšanas paņēmiens atšķiras no tuvākā zināmā paņēmiena ar to, ka paraugu priekšsagatavošanas laikā filtrēšanu veic caur celulozes papīra filtru;

veic filtrētā parauga degazēšanu ultraskaņas vannā, lai aizvāktu gaistošus un gāzveida matricas savienojumus;

cietās fāzes adsorbciju veic uz grafitizētas ogles cietā sorbenta virsmas;

mikotoksīnu automatizētas padeves cietas fāzes ekstrakcijas laikā cietā sorbenta virsmu mazgā ar divfāžu mazgāšanas šķīdumu, kur pirmā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums ūdenī, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un otrā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums acetonitrilā, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un pirmās fāzes saturs mazgāšanas šķīdumā ir 70 tilpuma %, eluēšanas plūsmas ātrums ir 0,70 ml/min;

mikotoksīnu satura noteikšanu veic ar šķidruma hromatogrāfijas - nolidojuma laika masspektrometriju.

[00013] Filtrēta analizējama parauga degazēšana dod iespeju atbrīvot paraugus no gaistošiem savienojumiem (alkohola, flavonoīdiem u.c.), kas var traucēt mikotoksīnu noteikšanu.

[00014] Eksperimentāli tika piemeklēts piemērots divfāžu mazgāšanas šķīdums, kur pirmā šķīduma fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums ūdenī, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un otrā šķīduma fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums acetonitrilā, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes. Eksperimentāli tika konstatēts, ka otrās fāzes (organisko šķīdinātāju acetonitrilu saturošās fāzes) saturs 30 tilpuma % mazgāšanas šķīdumā nodrošina pietiekamu daudzumu ūdens, lai pilnībā noņemtu matricā sastāvā esošās olbaltumvielas un minerālsāļus, tādējādi novēršot sāls atlikumu pārnešanu uz jonu avotu, aizsērējumu radošo daļiņu veidošanos un sekmē analītiskās kolonnas veiktspēju tālākā eluēšanas stadijā, nosakot mikotoksīnu saturu analizējamā paraugā.

[00015] Eksperimentāli noteikts, ka sūkņa, kas regulē plūsmas padevi uz cietās fāzes ekstrakcijas kolonnu, piemērotākais plūsmas ātrums ir 0,7 ml/min, bet otrā sūkņa, kas regulē eluenta plūsmas padevi uz analītisko kolonnu, piemērotākais plūsmas ātrums ir 0.35 ml/min, kas tiek uzturēti visā procesa laikā.

[00016] Inžekcijas piemērotākais tilpums ir 500 μl, kas nodrošina pietiekamu metodes jutību analizējamo divpadsmit mikotoksīnu satura noteikšanai un novērš masspektrometra detektora piesātinājumu, kas varētu traucēt korektu mikotoksīnu satura noteikšanu masas / lādiņa nobīžu dēļ nosakāmo mikotoksīnu masspektros.

[00017] Eksperimentāli tika konstatēts, ka cietās fāzes ekstrakcijā visu divpadsmit mikotoksīnu selektīvai adsorbēšanai piemērotākā ir cietās fāzes ekstrakcijas kolonna, kura sastāv no porainām grafītiskā ogles cietā sorbenta daļiņām (daļiņu izmērs ir 30μm). Šajā kolonnā ir iespējams efektīvi adsorbēt uz cietā sorbenta virsmas polārus mikotoksīnus (beauvericīns, enniatīni, deoksinivalenols) un nepolārus mikotoksīnus (zearalenons, sterigmatocistīns), kā arī skābo mikotoksīnu - ohratoksīnu A.

[00018] Divpadsmit mikotoksīnu satura noteikšanu analizējamā paraugā ar šķidruma hromatogrāfijas - nolidojuma laika masspektrometrijas metodi ieteicams veikt, lietojot divfāžu eluenta sistēmu, kur pirmā fāze ir 0.5 mM amonija acetāta šķīdums ūdenī, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un otrā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums acetonitrilā, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un mikotoksīnu satura hromatogrāfiskajai analīzei var tikt lietoti šādi apstākļi: pirmās fāzes saturs analīzes sākumā ir 70 tilpuma % un tiek uzturēts nemainīgs vienu minūti, pēc tam 30 sekunžu laikā tas tiek samazināts no 70 līdz 2 tilpuma % un uzturēts šādā līmenī trīs minūtes, pēc tam triju minūšu un 30 sekunžu laikā pirmās fāzes saturs tiek atkal palielināts līdz 70 tilpuma %, bet eluenta plūsmas ātrums visu analīzes laiku tiek uzturēts 0,35 ml/min, regulējot to ar otrā sūkņa palīdzību.

[00019] Eksperimentāli konstatēts, ka piedāvātais paņēmiens ļauj arī nodrošināt selektīvāku atsevišķu mikotoksīnu noteikšanu. Piemēram, alus un citu raudzētu graudu dzērienu paraugos deoksinivalenolu bieži pavada deoksinivalenola-3-glikozīds, kas var tālākā hromatogrāfiskā analīzē uzrādīt mākslīgi paaugstinātu deoksinivalenola saturu. Piedāvātajā paņēmienā šis trūkums ir novērsts.

[00020] Piedāvāto mikotoksīnu noteikšanas paņēmienu realizē šādi.

[00021] 1. piemērs (alus parauga analīze)

[00022] Alus paraugu saņem tumša stikla pudelē, vai metāla kārbā un pēc ievākšanas tūlīt transportē uz laboratoriju. Ja alus paraugs ir izlejams, to ievāc tumšā stikla traukā, lai aizsargātu no alus foto oksidācijas. Alus paraugu līdz analīzes veikšanai uzglabā oriģinālajā iepakojumā vai tumšā stikla traukā + 4 °C temperatūrā, bet ne ilgāk kā trīs nedēļas līdz analīzes veikšanai.

[00023] Alus paraugu pirms analīzes filtrē caur celulozes filtru. Alus paraugu (100 ml) degazē vismaz 15 minūtes ultraskaņas vannā, lai aizvadītu alkoholu un citas gaistošas vielas un gāzveida produktus. Degazētu alus parauga filtrātu (0,5 ml) hromatogrāfiskajā pudelītē ievieto autosamplerā. Autosamplers ir aprīkots ar 500 μl inžektora cilpu, divu sūkņu sistēmu (pirmais sūknis - plūsmas ievades sūknis ir paredzēts alus parauga aizvadīšanai uz cietās fāzes ekstrakcijas kolonnu, otrais sūknis paredzēts attīrīta mikotoksīnu ekstrakta eluēšanai uz šķidruma hromatogrāfijas analītisko kolonnu), programmējamu sešu kanālu vārstu. Sešu kanālu vārsta sistēma tiešsaistē ir savienota divos pārslēdzamos režīmos, kur pirmajā režīmā vārsts savieno inžekcijas cilpu ar cietās fāzes ekstrakcijas kolonnu un atkritumu novadīšanas konteineru, bet otrajā režīmā, pārslēdzot vārstu, iespējams novadīt analizējamo mikotoksīnu ekstraktu no cietās fāzes ekstrakcijas kolonnas uz šķidruma hromatogrāfijas analītisko kolonnu. Degazēto filtrātu (500 μl) ievada inžektora cilpā un no tās caur sešu kanālu vārstu cietās fāzes ekstrakcijas režīmā novada uz cietās fāzes ekstrakcijas cieto sorbentu cietās fāzes ekstrakcijas kolonnā, kas satur porainu grafitizētas ogles cieto sorbentu (daļiņu izmērs 30μm). Šajā stadijā notiek mikotoksīnu adsorbēšana uz cietā sorbenta virsmas. Sešu kanālu vārstu otrajā minūtē pārslēdz eluēšanas režīmā uz šķidruma hromatogrāfa analītisko kolonnu. Mikotoksīnu automatizētas padeves cietās fazes ekstrakciju veic, eluējot cauri kolonnai divas minūtes 2 ml divfāžu mazgāšanas šķīduma, kur pirmā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums ūdenī, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un otrā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums acetonitrilā, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, pirmās fāzes saturs mazgāšanas šķīdumā ir 70 tilpuma %, eluēšanas plūsmas ātrums ir 0,70 ml/min. Parauga matricas atliekvielas ar mazgāšanas šķīdumu tiek aizvadītas uz atkritumu savākšanas konteineru, bet mikotoksīni paliek uz cietā sorbenta virsmas. Sešu kanālu vārstu otrajā minūtē pārslēdz eluēšanas režīmā un attīrīto analizējamo mikotoksīnu ekstraktu no cietās fāzes ekstrakcijas kolonnas novada uz šķidruma hromatogrāfijas analītisko kolonnu.

[00024] Šķidruma hromatogrāfijas analīzei lieto tradicionālu apgrieztās fāzes C18 silikagela kolonnu. Mikotoksīnu satura noteikšanu veic ar šķidruma hromatogrāfiju - nolidojuma laika masspektrometriju. Tiek lietota divfāžu eluenta sistēma, kur pirmā fāze ir 0.5 mM amonija acetāta šķīdums ūdenī, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un otrā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums acetonitrilā, kas satur 0,1 tilpuma %. Mikotoksīnu satura hromatogrāfiskajai analīzei tiek lietoti šādi apstākļi: pirmās fāzes saturs analīzes sākumā ir 70 tilpuma %, un tiek uzturēts nemainīgs vienu minūti, pēc tam 70 sekunžu laikā tas tiek samazināts no 30 līdz 2 tilpuma % un uzturēts šādā līmenī trīs minūtes, pēc tam triju minūšu un 30 sekunžu laikā pirmās fāzes saturs tiek atkal palielināts līdz 70 tilpuma %; eluenta plūsmas ātrums visu analīzes laiku tiek uzturēts 0,35 ml/min, regulējot to ar otrā sūkņa palīdzību. Vienā paraugā vienā analīzē var selektīvi noteikt divpadsmit mikotoksīnu, proti, aflatoksīna B1, beauvericīna, deoksinivalenola, enniatīna A, enniatīna Ai, enniatīna B, enniatīna Bi, HT-2 toksīna, ohratoksīna A, sterigmatocistīna, T-2 toksīna un zearalenona, saturu.

[00025] Pēc analīzes veic hromatogrāfijas kolonnas sistēmas līdzsvarošanu, lai sagatavotu to nākamo analīžu veikšanai, otrās fāzes saturs 30 tilpuma % tiek noturēts trīs minūtes.

[00026] 2. piemērs (alus paraugs)

[00027] Parauga priekšsagatavošanu un ievadīšanu cietās fāzes ekstrakcijas kolonnā veic, kā aprakstīts 1. piemērā. Tālāk veic mikotoksīnu automatizētas padeves cietas fāzes ekstrakciju uz cietā sorbenta virsmas, eluējot cauri kolonnai divas minūtes 2 ml divfāžu mazgāšanas šķīduma, kur pirmā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums ūdenī, kas satur 0,1tilpuma % skudrskābes un otrā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums acetonitrilā, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, pirmās fāzes saturs mazgāšanas šķīdumā ir lielāks nekā 70 tilpuma % (eluēšanas plūsmas ātrums ir 0,70 ml/min). Parauga ievadīšanu analītiskajā kolonnā un parauga analīzi veic, kā aprakstīts 1. piemērā.

[00028] Ja organiskās fāzes (acetonitrila) saturs ir mazāks nekā 30 %, tas ietekmē parauga matricas komponentu eluēšanu līdz ar mikotoksīniem uz analītisko kolonnu un vismaz par samazina 20 % analītiskas noteikšanas jutību. Šādi apstākļi nav piemēroti, lai nodrošinātu precīzu divpadsmit mikotoksīnu noteikšanu analizējamā paraugā.

[00029] 3. piemērs (alus paraugs)

[00030] Parauga priekšsagatavošanu un ievadīšanu cietās fāzes ekstrakcijas kolonnā veic, kā aprakstīts 1. piemērā. Tālāk veic mikotoksīnu automatizētas padeves cietas fāzes ekstrakciju uz cietā sorbenta virsmas, cauri kolonnai 2. minūšu laikā eluējot 2 ml divfāžu mazgāšanas šķīduma, kur pirmā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums ūdenī, kas satur 0,1tilpuma % skudrskābes un otrā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums acetonitrilā, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, pirmās fāzes saturs mazgāšanas šķīdumā ir 70 tilpuma % (eluēšanas plūsmas ātrums ir lielāks nekā 0,70 ml/min). Parauga ievadīšanu analītiskajā kolonnā un parauga analīzi veic, kā aprakstīts 1. piemērā.

[00031] Ja eluēšanas plūsmas ātrums parauga attīrīšanas stadijā ir lielāks nekā 0,7 ml/min, tas ietekmē daļēju mikotoksīnu pāreju līdz ar parauga matricas komponentiem atkritumu konteinerā un nosaka atgūstamības samazināšanos par 10-40 % atkarībā no nosakāmā mikotoksīna. Šādi apstākļi nav piemēroti, lai nodrošinātu precīzu divpadsmit mikotoksīnu noteikšanu analizējamā paraugā.

[00032] 4.-6. piemēri tiek realizēti analoģiski kā 1. piemērs

[00033] 4. piemērs (kvass).

[00034] Ņemot vērā augstu gāzveida produktu saturu, parauga iepriekšsagatavošanā degazēšanas laiku nepieciešams palielināt vismaz līdz 25 minūtēm.

[00035] 5. piemērs (vīns).

[00036] Ņemot vērā augstu gāzveida produktu saturu, parauga priekšsagatavošanā degazēšanas laiku nepieciešams palielināt vismaz līdz 25 minūtēm.

[00037] 6. piemērs (dzirkstošais vīns).

[00038] Ņemot vērā augstu gāzveida produktu saturu, parauga priekšsagatavošanā degazēšanas laiku nepieciešams palielināt vismaz līdz 30 minūtēm.

Claims (2)

1. PRETENZIJAS

   1. Mikotoksīnu noteikšanas paņēmiens raudzētu graudu vai ogu alkoholiskajā vai bezalkoholiskajā dzērienā, kas ietver: paraugu priekšsagatavošanu, veicot filtrēšanu, parauga ievadīšanu caur sešu kanālu vārstu cietās fāzes ekstrakcijas kolonnā, mikotoksīnu adsorbēšanu uz cietā sorbenta virsmas;

   uz cietā sorbenta virsmas adsorbēto mikotoksīnu cietās fāzes ekstrakciju un ekstrakta attīrīšanu ar mazgāšanas šķīdumu, sešu kanālu vārsta pārslēgšanu eluēšanas režīmā un sekojošu mikotoksīnu desorbēšanu no cietā sorbenta virsmas uz šķidruma hromatogrāfijas analītisko kolonnu, mikotoksīnu satura noteikšanu, izmantojot divfāžu eluenta sistēmu, hromatogrāfiskās sistēmas līdzsvarošanu, raksturīgs ar to, ka paraugu priekšsagatavošanas laikā filtrēšanu veic caur celulozes papīra filtru;

   veic filtrētā parauga degazēšanu ultraskaņas vannā;

   cietās fāzes adsorbciju veic uz grafitizētas ogles cietā sorbenta virsmas;

   mikotoksīnu automatizētas padeves cietas fāzes ekstrakcijas laikā cietā sorbenta virsmu mazgā ar mazgāšanas šķīdumu, kas satur divfāžu sistēmu, kur pirmā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums ūdenī, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un otrā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums acetonitrilā, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un pirmās fāzes saturs mazgāšanas šķīdumā ir 70 tilpuma %, eluēšanas plūsmas ātrums ir 0,70 ml/min;

   mikotoksīnu satura noteikšanu veic ar šķidruma hromatogrāfijas - nolidojuma laika masspektrometriju.
2. 2. Paņēmiens saskaņā ar 1. pretenziju, raksturīgs ar to, mikotoksīnu satura noteikšanu ar šķidruma hromatogrāfijas - nolidojuma laika masspektrometriju veic, lietojot divfāžu eluenta sistēmu, kur pirmā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums ūdenī, kas satur 0,1tilpuma % skudrskābes, un otrā fāze ir 0,5 mM amonija acetāta šķīdums acetonitrilā, kas satur 0,1 tilpuma % skudrskābes, un mikotoksīnu satura hromatogrāfiskajai analīzei tiek lietoti šādi apstākļi: pirmās fāzes saturs analīzes sākumā ir 70 tilpuma % un tiek uzturēts nemainīgs vienu minūti, pēc tam 30 sekunžu laikā tas tiek samazināts no 70 līdz 2 tilpuma % un uzturēts šādā līmenī trīs minūtes, pēc tam triju minūšu un 30 sekunžu laikā pirmās fāzes saturs tiek atkal palielināts līdz 70 tilpuma %, bet eluenta plūsmas ātrums visu analīzes laiku tiek uzturēts 0,35 ml/min, regulējot to ar otrā sūkņa palīdzību.