LV14945B - Ekspresijas sistēma HBc-preS1 vīrusveidīgo daļiņu iegūšanai - Google Patents
Ekspresijas sistēma HBc-preS1 vīrusveidīgo daļiņu iegūšanai Download PDFInfo
- Publication number
- LV14945B LV14945B LVP-13-85A LV130085A LV14945B LV 14945 B LV14945 B LV 14945B LV 130085 A LV130085 A LV 130085A LV 14945 B LV14945 B LV 14945B
- Authority
- LV
- Latvia
- Prior art keywords
- hbc
- presl
- virus
- protein
- particles
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
IZGUDROJUMA APRAKSTS
Situācijas apraksts
Vīrusveidīgo daļiņu tehnoloģija un pielietojums
Vīrusveidīgās daļiņas (VVD) ir vīrusu neinfekciozi strukturālie analogi, kas tiek iegūtas noteiktā ekspresijas sistēmās ekspresējot vīrusu strukturālos proteīnus. Viens no VVD pielietojumiem ir šobrīd praksē lietotās rekombinantās pretvīrusu vakcīnas (profilaktiskās HBV un cilvēka papilomas vīrusa vakcīnas) un plaša spektra rekombinanto vakcīnu kandidāti, ko veido himēras vīrusveidīgās daļiņas, kurām uz virsmas eksponēti noteiktu patogēnu antigēni. VVD tiek intensīvi pētītas kā funkcionālu substanču (adjuvantu, imunomodulatoru, antisens-RNS, zāļu) stabilizācijas un piegādes vektori [9,11].
Visu šo pētījumu jomas ir atkarīgas no augstas tīrības VVD pieejamības, ko var nodrošināt tikai efektīgas VVD iegūšanas sistēmas.
Pēc rekombinanto proteīnu sintēzes līmeņa visefektīgākās ir bakteriālās ekspresijas sistēmas
Hepatīta B vīrusa HBc proteīns
Viens no šobrīd strukturāli vislabāk izpētītajiem VVD objektiem, kam parādīta augsta svešu inserciju kapacitāte, ir hepatīta B vīrusa kor-antigēna (HBc) veidotās VVD [8]. HBV genoms (subtips ayw) klonēts [1,2] un HBc gēns ekspresēts arī Latvijā [3] un uz HBc virsmas lokalizētas insercijām optimālās pozīcijas [10]; izveidota arī efektīva VVD ekspresijas sistēma [5], kas pielietota dažādu antigēno struktūru eksponēšanai [6,15], HBV preSl rajona insercijas HBc proteīnā veiktas universālas HBV vakcīnas kontekstā, insertējot kā īsus, vīrusneitralizējošu epitopu DPAFR saturošus preSl fragmentus [14], tā arī garākus šo epitopu saturošus rajonus [12].
Universālas hepatīta B vīrusa vakcīnas koncepcija
Šobrīd tirgū esošās Hepatīta B vīrusa profilaktiskās vakcīnas veidotas uz HBV rekombinantā virsmas antigēna (sAg) īsākās formas (SHBs) bāzes, jaunākajās izstrādnēs iekļaujot arī HBV šī antigēna preSl/preS2 rajonus. Neviena no šīm vakcīnām tomēr nav terapeitiska. Uz hronisku B hepatītu mērķētai vakcīnai jāsatur arī T-šūnu epitopi, kas sAg struktūrā nav pārstāvēti. Izgudrojums attiecas uz universālas HBV vakcīnas kandidātu izstrādi, kas ietver kā profilaktisku (B-šūnu atbilde), tā terapeitisku efektu (T-šūnu atbilde), ko attiecīgi nodrošina abu tipu epitopu - B epitopu klātbūtne himerā proteīna preSl daļā un CTL klātbūtne HBc daļā. T-šūnu aktivācijai būtiska ir nukleīnskābju klātbūtne, ko vīrusveidīgo daļiņu gadījumā nodrošina iepakotās nukleīnskābes vai specifiski oligonukleotīdi. Izgudrojuma pretenzijas ietver HBc-preSl proteīna ekspresijas vektoru ar ekspresijas moduli, kurā var tikt mainīts HBc proteīna nukleīnskābju saistības rajona (proteīna C-gals) garums, līdz ar to, var tikt mainīts nukleīnskābju saturs kapsīdās un kapsīdu stabilitāte, kam var būt būtiska tehnoloģiska loma kapsīdu rekonstrukcijā no dimēriem in vitro apstākļos un kapsīdu atbrīvošanā no nespecifiski inkorporēta materiāla un uzpildīšanā ar specifisku un raksturotu nukleīnskābju materiālu.
Esošais tehnikas līmenis himēro HBc proteīnu ekspresijā
Strukturāliem un imūno loģiskiem pētījumiem HBc un tā himērie (tajā skaitā, preSl rajonus saturoši) un nehimērie atvasinājumi tikuši ekspresēts E..coli šūnās dažādu promoteru kontrolē, pamatā izmantojot inducējamos XPL, Ptac, PlacUV5, and PT7 promoterus [8,9,11] un daudzkopiju plazmīdas. Modificēta plazmīda pBR327 [13] un Ptrp promoters [7] izmantoti patenta LV 13587 aprakstītajā ekspresijas sistēmā [5]. Inducējamo sistēmu trūkums ir induktoru dārdzība un salīdzinoši mazie biomasas iznākumi. Tehnoloģiskie vīrusveidīgo daļiņu iznākumi publikācijās netiek uzrādīti.
Izgudrojumā HBc-preSl proteīnu ekspresija balstīta uz aprakstīto ekspresijas sistēmu [5], kas nodrošina augstu HBc-preSl proteīna ekspresijas līmeni un, līdz ar to, VVD attīrīšanas iespēju līdz augstai tīrības pakāpei. Izgudrojums attiecas uz preSl(20-47) un preSl(12-60/89-119) [12] saturošu HBc himēro proteīnu ekspresiju, kur HBc proteīns var būt HBV genotipu Α, B, C, D, E, F, vai G genotipu HBc proteīns. Ekspresijas sistēmas efektivitāti nodrošina ekspresijas vektora, E.coli celma, kultivēšanas apstākļu un vīrusveidīgo daļiņu attīrīšanas paņēmiena kombinācija. Izgudrojuma izklāsts
1. HBc-preSl VVD ekspresijas vektors
HBc-preSl proteīnu ekspresijas vektors ir modificēta pBR327 plazmīda [5,13], kas shematiski parādīts 1.zīmējumā.
1. zūn. apraksts:
ori- replikācijas ori, Ap (ampicilīna) rezistences gēns, NEO- neomicīna-kanamicīna rezistences gēns, Ptrp - E.coli Ptrp promoters [7, 10], HBc/preSl - HBc-preSl ekspresijas modulis.
HBc gēns ekspresijas modulī HBc gēns var būt no HBV genotipiem Α, B, C, D, E, F, GvaiH.
HBc proteīns var būt pilna garuma HBc proteīns (183 aminoskābes HBV D genotipa gadījumā) vai HBc proteīna no C-gala saīsinātie varianti. Šiem saīsinātajiem variantiem ir samazināts nukleīnskābju saistības potenciāls.
1. piemērs
Pilna garuma D genotipa HBcl-183 proteīna aminoskābju secība:
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTA
LRQAILCWGELMTLATWVGGNLEDPISRDLWSYVNTNMGLKFRQLLWFHI
SCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
Pasvītrotas aminoskābes D un P, starp kurām tiek ievietots preSl fragments, veidojot himēro HBc-preSl proteīnu.
HBV D genotipa gadījumā attiecīgie HBc un preSl rajonu sekvences tiek iegūtas, izmantojot plazmīdu pHB320, kas satur Latvijā izolētu HBV genomu, (subtips ayw) [1,2] un attiecīgos fragmentus klonējot ar standarta klonēšanas metodēm un izmantojot attiecīgus praimerus.
2. piemērs.
D genotipa HBc-preSl himērā proteīna, kas satur preSl(20-47) fragmentu, aminoskābju secība:
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTA LROAILCWGELMTLATWVGGNLEDhNPLGFFPDHOLDPAFRANTANPDWDF NPvdPISRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRP PAYRPPNAPILSTLPETTWRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC. Pasvītrots ir preSl(20-47) fragments, ar mazajiem burtiem apzīmētas nespecifiskās aminoskābes, kas ieviesušās klonēšanas rezultātā; preSl(20-47) fragments aprakstīts atsaucē [15]
3. piemērs.
D genotipa HBc-preSl himērā proteīna, kas satur HBc-preS 1(12-60/89-119) fragmentu aminoskābju secība:
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTA
LROAILCWGELMTLATWVGGNLEDqMGQNLSTSNPLGFFPDHQLDPAFRAN
TANPDWDFNPNKDTWPDANKVGAPANPPPASTNRQSGRGPTPLSPPLRNTHP
QAdPISRDLWSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTP PAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC Pasvītrots ir preSl(12-60/89-l 19) fragments, ar mazajiem burtiem - nespecifiskās aminoskābes.Fragments preSl(12-60/89-119) aprakstīts atsaucē [12].
Abi preSl fragmenti ietver minimālo vīrusneitralizācijas epitopu DPAFR [14].
HBc gēna C-gala Arg kodoni, sākot ar 150. tripletu, ir optimizēti ekspresijai E.coli, kas augstas proteīnu ekspresijas apstākļos uzlabo translācijas kvalitāti.
4. piemērs.
D genotipa HBc proteīna C-gala aminoskābju kodoni, sākot ar 151. aminoskābi: cgt cgt cgt ggc cgt tcc cct cgt cgt cgt act ccc tcg cct cgc cgt cgt cgt tct caa tcg ccg cgt cgc cgt cgt tct caa tct cgt gaa tct caa tgt tag taa
Pasvītroti ir translācijas stop-kodoni.
Nukleīnskābju saistības modulēšanai, HBc proteīna C-gals var būt saīsināts.
5. piemērs.
D genotipa HBc proteīna C-gala struktūra, sākot ar 151. aminoskābi, var būt šāda: Variants HBcl-178: RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQS Variants HBcl-171: RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSP Variants HBcl-167: RRRGRSPRRRTPSPRRRR
Variants HBcl-163: RRRGRSPRRRTPSP
Variants HBcl-156: RRRGRSP
2. Saimniekšūnas
HBc-preSl ekspresijai, tiek izmantotas E.coli celma K802 (F ης mK+ e!4 McrA metBl lacYl [or latf-Y6] galK2 galT22 glnV44 mcrB) vai E.coli celma BL21 (F” ompT hsdSp, (rg mg) gal dcm lon) šūnas, kas, saskaņā ar 1. punktu, satur HBcpreSl vektoru. Saimniekšūnu celma izvēle atkarīga no HBc-preSl proteīna struktūras.
3. Biomasas, kas satur WD, iegūšana
Kultivēšana
Producenta, kas saskaņā ar 1. un 2. punktu, ir ekspresijas vektoru HBc-preSl saturošas E.coli saimniekšūnas, kultivēšana notiek 1-2 1 tilpuma kolbās. Pētījumos tika konstatēts, ka kultivēšanas barotne var būt gan standarta Trp-nesaturošā, gan Trpsaturoša barotne un ka induktora lietošana nav nepieciešama. Trp bagātā barotnē HBc-preSl proteīna sintēze notiek pakāpeniski un tiek sasniegti augstāki biomasas iznākumi ar nesamazinātu mērķproteīna sintēzes līmeni. Konstatēts arī, ka aerācijai kultivēšanas laikā jābūt ierobežotai, kas tiek nodrošināts, kolbas uzpildot ar barotni, kas aizņem 25 %.no kolbas tilpuma un inkubējot kolbas uz orbitālā kratītāja pie 200 apgr/min ar orbītas rādiusu 4 cm. Inkubācijas laiks var būt no 14 līdz 20 h pie temperatūras 37°C.
Trp-nesaturoša barotne ir standarta M9 sāļu barotne ar kazamīnskābju piedevu (kazeīna skābes hidrolizāts) ar šādu sastāvu (g/1): NH4CI -1,0, KH2PO4 -3,0, Na2HPO4 - 6,0, pH 7,4. Atsevišķi tiek pievienoti: (uz 1 litru) MgSC>41,0 M - 0,6 ml, 40%, glikoze - 5,0 ml, 20% (svars/tilpums) Kazamīnskābes (Casamino Acids, BD), - 50 ml. Trp-saturoša fosfātu barotne ir Trp bagātā, ar fosfātiem buferēta 2ΤΥ+Ρ barotne, kuras sastāvs (g/1) ir: Bakto triptons (Bacto Tryptone, BD) -16, rauga ekstrakts (Yeast Extract Technical, BD) -10, NaCI - 5, pH 6,8 -7,0.
Atsevišķi tiek pievienoti (uz vienu litru): fosfātu šķīdums -150 ml, 40%glikoze - 5 ml. Fosfātu šķīdums (g/1): KH2PO4 - 23,13, K2HPO4- 125,41.
Mērķproteīna ekspresija tiek veikta selektīvā barotnē, kas satur abus selektīvos aģentus - antibiotiķus Ap (gala konc.50-100 pg /ml) un Km (gala konc.8-10 pg/ml) Biomasas iznākums Trp-nesaturošā barotnē ir 6-8 g/1, bet Trp-saturošajā barotnē ΙΟΙ 2 g/1. Mērķproteīna sintēzes līmenis, atkarībā no HBc-preSl varianta (noteikta HBV genotipa HBc proteīns) svārstās no 2-10 % no šūnas kopproteīna.
Mērķproteīna ekstrakcija
Biomasa tiek dezintegrēta ar augstspiediena presi (French press) 3 ciklos, pie spiediena 20000 psi. Mērķproteīna ekstrakcija tiek veikta ar 1M urīnvielu 0,1% Tween 20 klātbūtnē, +4 °C, 30 min. Supematantam, kas tiek iegūts pēc centrifugēšanas pie lOOOOg 30 min, tiek pievienots amonija sulfāts līdz 35% no piesātinājuma, kam seko inkubācija uz ledus 60 min, centrifugēšana pie lOOOOg 30 min un precipitāta šķīdināšana PBS, kas satur 1M urīnvielu un 0,1% Tween 20. Hromatogrāfija un formulācija
Mērķproteīni no saimniekšūnas komponentiem tiek attīrīti divpakāpju hromatogrāfijā pie +4 °C - vispirms mērkproteīnu saturošajam materiālam tiek veikta jonapmaiņas hromatogrāfija uz Fractogel EMD DEAE un pēc frakciju analīzes SDS-PAGE un agarozes gēlā (TAE buferis), attiecīgajām frakcijām tiek veikta tangenciālā filtrēšana, izmantojot 500 kD caurlaides filtru. Pēc tam seko gēlfiltrācija uz Sepharose 4. Fast Flow un frakciju analīze kā iepriekš un mērkproteīnu saturošo frakciju filtrēšana (ja nepieciešams), izmantojot Amicon 100 kD filtru. Mērķproteīns tiek formulēts PBS buferī, kas satur glicerīnu 50 % pēc tilpuma. Mērkproteīnu koncentrācija gala preparātos ir 1-5 mg/ml, tīrības pakāpe >95%.Vīrusveidīgo daļiņu iznākums - 2-30 mg no g svaigas biomasas.
4. HBc-preSl vīrusveidīgo daļiņu raksturojums
5. piemērs
Elektronmikroskopija vīrusveidīgajām daļiņām, kas iegūtas, izmantojot HBc-preSl proteīna producentus 1875 un 1876, kas ekspresē himēros HBc-preSl proteīnus, ko veido pilna garuma D genotipa HBc proteīns ar attiecīgi preSl (20-47) (producents 1875), vai preSl(12-60/89-119) insertu (producents 1876) uzrāda homogēnas sfēriskas struktūras, kas līdzīgas nehimērā HBc proteīna vīrus veidīgajām daļiņām (2.zīm.).
2.zīmējuma apraksts:
A - HBc-preSl (20-47) daļiņas, B - HBc-preSl(12-60/89-l 19) daļiņas.
No abu producentu šūnām iegūto daļiņu imunogenitātes raksturojums (imunizētu peļu serumu anti-preSl un anti-HBc titri), daļiņu izmēri un homogenitātes rādītājs (polidispersija) apkopoti Tabulā. Daļiņu vidējais hidrodinamiskais diametrs ir 34.6 un 40.2 nm, attiecīgi īso (1875) vai garo preSl fragmentu (1876) saturošajām vīrus veidīgajām daļiņām. Daļiņu anti-HBc atbilde, salīdzinot ar HBc-proteīna vīrusveidīgo daļiņu anti-HBc imunoatbildi, ir ievērojami samazināta, savukārt antipreSl atbilde HBc-preSl(20-47) preparātam ir apmēram divreiz augstāka kā HBcpreSl (12-60/89-119) preparātam (Tabula).
Stimulējot imunizētu peļu liesas šūnas ar HBc proteīna vīrusveidīgām daļiņām] in vitro [12] T-šūnu stimulācijas indekss (SI) ir ~7-8.
HBc-preSl daļiņām piemīt preSl un HBc antigenitāte imunoblotā, attiecīgi ar monoklonālajām anti-preSl MA18/7 [14] un monoklonālajām anti-HBc 13C9 antivielām [10]. Iegūtās vīrusveidīgās daļiņas reaģē imunodifūzijā ar poliklonālajām trušu anti-HBc antivielām.
Tabula
HBc-preSl virusveidigo daļiņu imuuogenitate, izmērs un homogenitāte
Producents | HBc/preSl inserts | anti-HBc titrs, l/x | anti-preSl titrs (pret preSl 20-47 peptīdu), l/x, | Daļiņu diametrs, nm | Daļiņu polidispersija |
1875 | HBcl 83/20-47 | 25000 | 12150 | 34.6 ±0.5 | 0,08 |
1876 | HBcl83/preSl(12- 60/89-119) | 11150 | 3825 | 40.2 ±1.0 | 0,072 |
5. Oligonukleotīdu iepakošana HBc-preSl vīrusveidīgajās daļiņās
Oligonukleotīdu (ODN) iepakošanai vīrusveidīgās daļiņās izmanto osmotiskā šoka metodi un apstrādi ar RNāzi-A pēc iepriekš aprakstītas metodes [6]. Lai atbrīvotos no neiepakotā ODN un RNāzes, izmanto Superose 6 kolonnu (3 .zīm.).
3.zīmējuma apraksts:
A - sadalījums uz Superose 6 kolonas pēc apstrādes ar RNāzi A ODN 1668 klātbūtnē; B - frakcijas 2, 3,4 natīvā agarozes gēla elektroforēzē, krāsots ar EtBr;
C - frakcijas 2, 3,4 natīvā agarozes gēla elektroforēzē, krāsots ar Coomassie Blue G250;
D - frakcijas 2, 3,4 SDS-PAGE, labajā malā - HBcl-183 proteīns;
E - natīvā gēla elektroforēze: 1 - marķieris, 2 - HBcl-183-preS 1(20-47) daļiņas pēc attīrīšanas no E.coli lizāta, 3 - HBcl-183-preSl(20-47) daļiņas pēc apstrādes ar RNāzi-A ODN 1668 klātbūtnē, 4 - ODN, kas iepakots HBcl-183-preSl(20-47) daļiņās
9
Atsauces
1. Bichko W, Kozlovskaya TM, Dishler A, Pumpen P, Janulaitis A, Gren EJ. Restriction map of the hepatitis B vīrus DNA cloned in Escherichia coli. Gene. 1982 Dec; 20(3), 481-4.
2. Bichko, V., Pushko, P., Dreilina, D., Pumpen, P., Gren, E. Subtype ayw variant of hepatitis B virus. DNA primary structure analysis. FEBS Lett., 1985,185(1), 208-212.
3. Borisova, G.P., Pumpen, P.P., Bychko, V.V., Pusho, P.M., Kalis, J.V., Dishler, A.V., Gren, E.J., Tsibinogin, V.V., and Kukaine, R.A. .Structure and expression in Eschrichia coli celis of the core antigen gene of the human hepatitis B virus (HBV). Doki. Akad. Nauk SSSR. 1984,279,1245-1249.
4. Borisova, G., Borschukova, O., Skrastina, D., Dislers, A., Ose, V., Pumpens, P., Grens, E. Behavior of a short preSl epitope on the surface of hepatitis B core pārticies. Biol. Chem., 1999, 80(3), 315-24.
5. Dislers A., Sominska I,Kazaks A, Petrovskis A, Zariņa I. Expression system for producing recombinant virus-like pārticies. Latvian Patent 2008: LV 13587 (B) Int.CI: C12N15/71, A61K39/29.
6. Kazaks A, Balmaks R, Voronkova T, Ose V, Pumpens P. Melanoma vaccine candidates from chimeric hepatitis B core virus-like pārticies carrying a tumorassociated MAGE-3 epitope. J.of Biotechnology, 2008, v3, ppl429-1436.
7. Ovchinnikov, I.A, Sverdlov, E.D, Tsarev, S.A, Khodkova, E.M, Monastyrskaia, G.S. Direct expression of the gene of human leukocyte interferon F in Escherichia coli celis. Doki. Akad. Nauk SSSR (In Russian). 1982,265(1), 238-42.
8. Pumpens P., Grens E. Hepatitis B core pārticies as a universal display modei: a structure-function basis for development. FEBS Letters. 1999,442,1-6.
9. Pumpens, P., Grens, E. Artificial genes for chimeric virus-like pārticies. In: Artificial DNA: Methods and Applications. Edited by Y.E.Khudyakov & H.A.Fields. CRC Press LLC, Boca Raton, 2002, pp. 249-327.
10. Pushko P, Sallberg M, Borisova G, Ruden U, Bichko V, Wahren B, Pumpens P, Magnius L. Identification of hepatitis B virus core protein reģions exposed or intemalized at the surface of HBcAg pārticies by scanning with monoclonal antibodies.Virology. 1994,202(2): 912-20.
11. Pushko P, Pumpens P, Grens E. Development of virus-like particle technology from small highly symmetric to large complex virus-like particle structures. Intervirology. 2013; 56(3), 141-65.
12. Skrastina D, Bulavaite A, Sominskaya I, Kovalevska L, Ose V, Priede D, Pumpens P, Sasnauskas K.High immunogenicity of a hydrophilic component of the hepatitis B virus preSl sequence exposed on the surface of three virus-like particle carriers.Vaccine. 2008,26(16), 1972-81.
13. Soberon, X., Covarrubias,L. and Bolivar, F.: Construction and characterization of new cloning vehicles, IV. Deletion derivatives of pBR322 and pBR325. Gene, 1980, 9, 287-305.
14. Sominskaya, I., P.Pushko, D.Dreilina, T.Kozlovskaya, and P.Pumpen. Determination of the minimal length of preSl epitope recognized by a monoclonal antibody which inhibits attachment of hepatitis B virus to hepatocytes .Med. Microbiol. Immunol. 1992, v.181, p 215-226.
15. Sominskaya I, Skrastina D, Dislers A, Vasiljev D, Mihailova M, Ose V, Dreilina D, Pumpens P. Construction and immunological evaluation of multivalent hepatitis B virus (HBV) core virus-like pārticies carrying HBV and HCV epitopes. Clin Vaccine Immunol. 2010, 17(6):1027-33.
Claims (7)
- Pretenzijas1. HBc-preSl ekspresijas vektors, kas ir ar HBc-preSl ekspresijas moduli, promotera Ptrp, kanamicīna rezistences marķiergēniem modificēta plazmīda pBR327.
- 2. HBc-preSl ekspresijas modulis saskaņā ar 1. pretenziju, kas kodē himēro HBcpreSl proteīnu, kuru veido HBV Α, B, C, D, E, F vai G genotipu pilna garuma vai saīsināts HBc proteīns ar preSl(20-47) vai preSl(12-60/89-l 19) insertu.
- 3. HBc-preSl producents, kas ir E.coli celma K802 vai E.coli celma BL21 saimniekšūnas, kas satur HBc-preSl ekspresijas vektora saskaņā ar 1. pretenziju.
- 4. HBc-preSl producenta saskaņā ar 3. pretenziju kultivēšanas paņēmiens, kurā kultivēšanu veic kolbās, triptofanu-saturošā vai triptofanu-nesaturošā barotnē pie ierobežotas barotnes aerācijas.
- 5. HBc-preSl vīrusveidīgo daļiņu attīrīšanas paņēmiens, izmantojot producentu saskaņā ar 3. pretenziju, kas sastāv no gulsnēšanas ar amonija sulfātu (35 %), jonapmaiņas hromatogrāfijas uz anjonīta kolonas un gēlfiltrācijas.
- 6. HBc-preSl vīrusveidīgās daļiņas, kas iegūtas saskaņā ar 5. pretenziju.
- 7. Vīrusveidīgo daļiņu saskaņā ar 6. pretenziju ekspresijas sistēma, kas atšķiras ar to, ka HBc-preSl proteīna veidoto vīrusveidīgo daļiņu iznākums pēc attīrīšanas, atkarībā no specifiskā HBc-preSl proteīna struktūras un izcelsmes, ir no 2 līdz 30 mg kapsīdu no viena g svaigu šūnu.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
LVP-13-85A LV14945B (lv) | 2013-06-21 | 2013-06-21 | Ekspresijas sistēma HBc-preS1 vīrusveidīgo daļiņu iegūšanai |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
LVP-13-85A LV14945B (lv) | 2013-06-21 | 2013-06-21 | Ekspresijas sistēma HBc-preS1 vīrusveidīgo daļiņu iegūšanai |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
LV14945A LV14945A (lv) | 2015-01-20 |
LV14945B true LV14945B (lv) | 2015-10-20 |
Family
ID=52296889
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
LVP-13-85A LV14945B (lv) | 2013-06-21 | 2013-06-21 | Ekspresijas sistēma HBc-preS1 vīrusveidīgo daļiņu iegūšanai |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
LV (1) | LV14945B (lv) |
-
2013
- 2013-06-21 LV LVP-13-85A patent/LV14945B/lv unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
LV14945A (lv) | 2015-01-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sominskaya et al. | Construction and immunological evaluation of multivalent hepatitis B virus (HBV) core virus-like particles carrying HBV and HCV epitopes | |
Freivalds et al. | Highly efficient production of phosphorylated hepatitis B core particles in yeast Pichia pastoris | |
ES2526744T3 (es) | Vacuna del VHB y procedimiento de preparación de la misma | |
Wizemann et al. | Purification of E. coli-expressed HIS-tagged hepatitis B core antigen by Ni2+-chelate affinity chromatography | |
EP0101617B1 (en) | Recombinant dna containing a hepatitis b virus gene, mammalian cells transformed with the cloned viral dna, and production of hepatitis b virus proteins | |
Pumpens et al. | Evaluation of HBs, HBc, and frCP virus-like particles for expression of human papillomavirus 16 E7 oncoprotein epitopes | |
US20130236491A1 (en) | Spherical nano and microparticles derived from plant viruses for the display of foreign proteins or epitopes | |
CA2405438A1 (en) | Hepatitis b core antigen fusion proteins | |
Zhang et al. | Enhanced immunogenicity of modified hepatitis B virus core particle fused with multiepitopes of foot‐and‐mouth disease virus | |
Mihailova et al. | Recombinant virus-like particles as a carrier of B-and T-cell epitopes of hepatitis C virus (HCV) | |
Dishlers et al. | The hepatitis B virus core variants that expose foreign C-terminal insertions on the outer surface of virus-like particles | |
Freivalds et al. | Assembly of bacteriophage Qβ virus-like particles in yeast Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris | |
JP2702899B2 (ja) | 肝炎b型ウイルスワクチン | |
Skrastina et al. | Chimeric derivatives of hepatitis B virus core particles carrying major epitopes of the rubella virus E1 glycoprotein | |
Liekniņa et al. | Novel ssRNA phage VLP platform for displaying foreign epitopes by genetic fusion | |
US10125175B2 (en) | Method for enhancing immunogenicity of epitope peptide of HPV antigen, virus-like particle, and method for preparing HPV vaccine | |
JP2603312B2 (ja) | 酵母中でb型肝炎ウイルス蛋白質を生産するための方法 | |
ATE290399T1 (de) | Hbv/hcv virus-ohnliche particle | |
Skrastina et al. | High immunogenicity of a hydrophilic component of the hepatitis B virus preS1 sequence exposed on the surface of three virus-like particle carriers | |
Zhang et al. | Cost‐effective purification process development for chimeric hepatitis B core (HBc) virus‐like particles assisted by molecular dynamic simulation | |
Prange et al. | DNA-mediated immunization to hepatitis B virus envelope proteins: preS antigen secretion enhances the humoral response | |
LV14945B (lv) | Ekspresijas sistēma HBc-preS1 vīrusveidīgo daļiņu iegūšanai | |
Wang et al. | Major immunodominant region of hepatitis B virus core antigen as a delivery vector to improve the immunogenicity of the fusion antigen ROP2-SAG1 multiepitope from Toxoplasma gondii in Mice | |
Voronkova et al. | Chimeric bacteriophage fr virus-like particles harboring the immunodominant C-terminal region of hamster polyomavirus VP1 induce a strong VP1-specific antibody response in rabbits and mice | |
Kazaks et al. | Stop codon insertion restores the particle formation ability of hepatitis B virus core-hantavirus nucleocapsid protein fusions |