LV14230B - Farmaceitiska kompozīcija Parkinsona slimības profilaksei un ārstēšanai - Google Patents

Description

Parkinsona slimība ir progresīva smadzeņu neirodeģeneratīva saslimšana, kas pieder pie kustību (motoro) traucējumu slimībām. Tai raksturīgie simptomi ir muskuļu stīvums, trīce, palēninātas kustības (bradikinēzija), līdz pat kustību zudumam (akinēzijai). Parkinsona slimības simptomus izraisa dopamīnu producējošo (dopamīnerģisko) šūnu bojāeja bazālajos ganglijos jeb nigrostriatālajos kodolos - striatum un substantia nīgra.

Mūsdienu tradicionālā Parkinsona slimības ārstēšana pamatojas uz dopamīnerģisko hipotēzi. Tāpēc farmakoterapeitiskās stratēģijas ir vērstas uz tādu vielu lietošanu, kas vai nu spēj stimulēt dopamīna sintēzi (levodopa), vai darboties kā dopamīna receptora agonisti (ropinirols, pramipeksols). Lai gan levodopa pieder pie Parkinsona slimības pirmās izvēles preparātiem, tā lietošanu ierobežo motorās komplikācijas - levodopa-inducētās diskinēzijas, kas būtiski pasliktina pacienta dzīves kvalitāti. Dopamīna receptora agonisti arī izraisa blaknes, galvenokārt miegainību vai bezmiegu, halucinācijas. Vēl vairāk, dopamīna receptori progresējoši zaudē savu jutību, un tādējādi simptomu intensitāte pastiprinās. Citas vielas, piem., COMT un MAO inhibītorus (tolkaponu un selegelīnu) lieto kā otrās izvēles preparātus.

Nesen literatūrā atzīmēti dati, kas liek revidēt levodopa efektus. Izrādās, ka Parkinsona slimības agrīnās fāzēs levodopa darbojas kā neirotoksiska molekula, izraisot nevēlamus efektus (Caudle W.M., Colebrooke R.E., Emson P.C., Miler G.W. Altered vesicular dopamine storage in Parkinson’s disease: apremature demise. Trends in Neurosciences, 2008, 3i, 303308). Līdz ar to pieaug interese ne tikai par jauniem - ne-dopaminerģiskiem Parkinsona slimības patoģenētiskiem aspektiem (Ahlskog J.E. Beating a dead horse: dopamine and

Parkinson’s disease. Neurology, 2007, 69, 1701-1711), bet arī par jaunām nedopaminerģiskām Parkinsona slimības farmakostratēģijām. Tādēļ šī izgudrojuma mērķis ir radīt jaunu farmaceitisku kompozīciju ar ne-dopaminerģiskiem darbības mehānismiem un zemu toksicitāti centrālās nervu sistēmas, īpaši Parkinsona slimības ārstēšanai.

Mēs negaidīti atklājām, ka pazīstamais zemas toksicitātes kardiovaskularās sistēmas preparāts meldonijs uzrāda neironus protektējošu darbību Parkinsona slimības modelī žurkām.

Parkinsona slimības modeļa radīšanai izmantots neirotoksīns 6-hidroksidopamīns (6-OHDA), kura intrastriatāla ievadīšana izraisa dopamīnu producējošo šūnu bojāeju. Meldonijam atklātā neuronālā protekcija bija pilnīgi negaidīta no dopamīnerģisko mehānismu aspekta, jo iepriekšējos pētījumos meldonijs (50 mg/kg intraperitoneāli žurkām) neizmainīja dopamīna saturu smadzeņu struktūrās, tajā skaitā striatumā (Germane K., Bērziņa D.A. Influence of mildronate on stress-induced alterations in catecholamine content and orgāns in rats.

Eksperim. Klin. Farmakoter., vol.19, Riga „Zinātne”, 991, 51-56).

Izgudrojuma apraksts

Šis izgudrojums pirmo reizi demonstrē kardiovaskulārās sistēmas preparāta meldonija jaunu darbību Parkinsona slimības modelī žurkām, kas izpaudās kā smadzeņu šūnu aizsargāšana. Pirmkārt, meldonijs uzrāda izteiktu neiroprotektīvu darbību Parkinsona slimības modelī žurkām, kas iegūts ar neirotoksīnu 6-hidroksidopamīnu (6-OHDA), kura intrastriatāla ievadīšana izraisa dopamīnu producējošo šūnu deģenerāciju. Meldonijs šajā modelī preventē dopamīnu producējošās šūnas no bojāejas.

Noteicām meldonija ietekmi uz divu marķiermolekulu ekspresiju:

1) tirozīnhidroksilāzi (TH), atslēgas enzīmu, kas konvertē aminoskābi tirozīnu (prekursoru) par 3,4-dihidroksi-L-fenilalanīnu (L-DOPA), kurš savukārt tiek konvertēts par dopamīnu neironos;

2) glijas fibrilāro skābo proteīnu (glialfibrillary acidic protein, GFAP), astrocītu marķieri.

Uzskata, ka astrocīti nodrošina mijiedarbību starp neironiem, gliju un asinsvadiem (Allen

NJ, Barres BA, Glia - more than just brain glue. Nature, 2009, 457, 675-677).

TH ekspresija norāda uz to, ka šūna dzīvo un sintezē dopamīnu, bet normāla GFAP ekspresija - uz šūnas homeostāzi un kontaktiem starp neironālajām un gliālajām šūnām.

Ilgstoša un pārmērīga GFAP ekspresija liecina par reaktīvu astrogliozi, kas parasti iet paralēli ar Parkinsona slimības progresēšanu.

Meldonija neiroprotektīvo darbību raksturo iegūtie rezultāti.

Materiāli un metodes

Eksperimenti veikti uz Wistar vīriešu kārtas žurkām (no Rīgas Stradiņa Universitātes

Eksperimentālo dzīvnieku laboratorijas, Rīga, Latvija). Žurku svars eksperimenta sākumā 230-330 g. Visas eksperimenta procedūras veiktas saskaņā ar norādījumiem, kas minēti Eiropas direktīvās Directive 86/609/EEC European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Usedfor Experimental andother Scientific Purposes” (1986). Šīs procedūras akceptētas LR Pārtikas un veterinārā departamenta Dzīvnieku ētikas komisijā

Rīga, Latvija).

Meldonijs [3-(2,2,2-trimetilhidrazīnij)propionāta dihidrāts] saņemts no A/S “Grindeks” (Rīga, Latvija). To šķīdināja fizioloģiskajā šķīdumā, pagatavojot 2% šķīdumu. 6-Hidroksidopamīnu jeb 6-OHDA (no Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV) pagatavoja ex tempore 0,2% askorbīnskābes šķīdumā un turēja tumsā. Lietošanai izmantoja 6-OHDA šķīdumu, kas satur 20 pg/ml. Meldoniju ievadīja žurkām divas nedeļas, katru dienu to intraperitoneāli injicējot devā 50 mg/kg.

Experimenta dizains

Žurkas adaptēja eksperimentam, tad tās sadalīja četrās grupās pa 8 dzīvniekiem grupā.

Meldoniju vai fizioloģisko šķīdumu (1 ml/kg) ievadīja intraperitoneāli divas nedēļas. Trešajā nedēļā (15 dienā) smadzeņu struktūrā corpus striatum ievadīja neirotoksīnu 6-OHDA (kontroles grupai ievadīja mākslīgo cerebrospinālo šķīdumu, aCSF)

Grupas:

1. grupa: Fizioloģiskais šķīdums (FS) intraperitoneāli (i.p.) divas nedēļas, tad aCSF intrastriatāli (i.s.)

2. grupa: Meldonijs devā 50 mg/kg i.p divas nedēļas, tad aCSF intrastriatāli (i.s.)

3. grupa: FS i.p. divas nedēļas, tad 6-OHDA i.s.

4. grupa: Meldonijs devā 50 mg/kg i.p. divas nedēļas, tad 6-OHDA i.s.

Ķirurģiskās procedūras

Pēc divu nedēļu intraperitoneālas meldonija vai FS ievadīšanas žurkas anestezēja ar ketamīnu 75 mg/kg + ksilazīnu 10 mg/kg un ievietoja stereotakses aparatā (StoeltingInc., USA). 30 minūtes pirms šīs vispārējās anestēzijas žurkām ievadīja imipramīnu (20 mg/kg intraperitoneāli), lai aizsargātu adrenerģiskos neironus no 6-OHDA izraisītiem bojājumiem. Anestezētām žurkām ar Stoelting mikroinjektoru striatuma labajā pusē ievadīja aCSF vai 3 μΐ 6-OHDA šķīduma (6-OHDA koncentrācija 20 pg/ml) ar ātrumu 1 μΐ /min (kopējā 6OHDA bija deva 20 pg). Pēc injekcijas kanulu paturēja injekcijas vietā vēl 2 min, tad lēni to izvilka. Intrastriatalās ievadīšanas koordinātes (pēc Patinos & Watson): AP, -0.24; L, -3.0;

DV, -5.0 mm no bregmas.

Rotācijas

14., 21. un 28.dienā pēc ķirurģiskās manipulācijas un 6-OHDA ievadīšanas subkutāni ievadīja 0.2 mg/kg apomorfīnu (dopamīna receptora agonistu) un reģistrēja žurku asimetrisko (kontralaterālo) rotāciju skaitu 30 min laikā. Rotāciju intensitāte liecina par striatālā bojājuma denervācijas pakāpi.

Smadzeņu audu sagatavošana

Pēc rotācijas testa pabeigšanas (28. dienā) žurkas anestezēja ar ketamīnu (150 mg/kg) un veica smadzeņu perfuziju caur ascendējošo aortu ar 50 ml fizioloģisko šķīdumu, pēc tam ar

250 ml 4% paraformaldehīdu 0.1 M fosfāta buferī (pH 7.4). Smadzenes izņēma un fiksēja -80°C temperatūrā. Smadzeņu struktūru corpus striatum un substantia nigra audus sagrieza 24 kriostata sekcijās 10 pm biezumā pie -20°C (Leica CM1850, Leica Microsystems, Germany). Griezumus uzlika uz stikliņiem, kas pārklāti ar polilizīnu (3 griezumi uz katra stikliņa). Stikliņus ar griezumiem žāvēja istabas temperatūrā 15 minūtes, tad fiksēja acetonā (10-15 min), tad vēlreiz atstāja istabas temperatūrā 2 stundas. Tad stikliņus ar griezumiem ietina alumīnija folijā un uzglabāja pie -20° C (līdz imūnhistoķīmiskajiem pētījumiem).

Im ūnohistoķīm ija

Imūnhistoķīmijas pētījumos izmantoja EnVision kitus (DAKO, Glostrup, Denmark).

Preparātus fiksēja ledus aukstā acetona šķīdumā 5 minūtes, tad mazgāja ar Tris-buferētu fizioloģisko šķīdumu (TBS). Griezumus inkubēja ar peroksidāzi bloķējošu reaģentu (0.5% H2O2/PBS) 5 min, lai inhibētu endogēnās peroksidāzes aktivitāti. Tad preparātus inkubēja ar primārām poliklonāiām truša antivielām pret TH (Millipore, clone LNC1) - 18 stundas 4 °C temperatūrā, attiecīgu inkubāciju ar GFAP antivielām veica vienu stundu istabas temperatūrā.

Primārās antivielas saistīšanos noteica, preparātus (griezumus) inkubējot mitrajā kamerā 30 min ar EnVision reaģentu, tad skaloja ar TBS (pH=7,6) trīs reizes 5 min. Tad preparātus inkubēja ar hromogēnu 3’3-diaminobenzidīna-tetrahidrohlorīdu (DAB) 7 min, tad ar hematoksilīnu 2 min. Muguras smadzeņu gangliju audus izmantoja kā pozitīvo kontroli; kā negatīvo kontroli izmantoja preparātus, kurus neinkubēja ar primāro antivielu.

Smadzeņu kodolu - corpus striatum un substantia nigra audu pētījumus veica ar gaismas mikroskopu, kas savienots ar video attēlu sistēmu (Motic Image Advanced 3.2,

China, Xyameri). Audu novērtējumu veica divi pētnieki ar “aklo” metodi. Rezultātus izteica kā šūnu skaitu/mm².

Statistiskā analīze

Datu analīzei lietoja GraphPadPrism 4 version software. Rezultātus izteica kā vidējos lielumus ± SEM. Statistisko ticamību noteica pie p vērtībām < 0.05.

Meldonija. ietekme uz apomorfina inducētajām rotācijām

Žurkām, kurām nebija ievadīts 6-OHDA, ne fizioloģiskais šķīdums, ne meldonijs, ne apomorfīns neizraisīja rotācijas (dati nav parādīti). Rotācijas parādījās žurkām 14., 21. un 28.dienāpēc 6-OHDA injicēšanas; šis efekts bija īpaši izteikts 21.dienā (1 .att.). Meldonijs (50 mg/kg) būtiski samazināja apomorfina rotācijas žurkām, kurām bija ievadīts 6-OHDA, un šis efekts bija statistiski ticams 21. dienā pēc OHDA ievadīšanas (78.8 ± 13.5 vs.147.0 ± 20.9, p=0.003, 1 .att.); 14. un 28.dienu rezultāti grupai meldonijs + 6-OHDA neatšķīrās no 6OHDA grupas datiem 1 .att.).

Meldonija ietekme uz tirozmhidroksilāzes (TU) ekspresiju

Iegūtie rezultāti rāda, ka 6-OHDA ievērojami samazina (apmēram četras reizes) TH pozitīvo neironu skaitu striatumā (corpus striatuni), salīdzinot ar fizioloģiskā šķīduma kontroles grupu (5 ± 2 vs. 21 ± 10 šūnas/mm², p = 0.03, 2.att.). Meldonijs per se devā 50 mg/kg neietekmē TH ekspresiju striatumā. Taču meldonija divu nedēļu premedikācija šajā devā pilnībā novērš 65 OHDA izraisīto TH pozitīvo šūnu samazināšanos striatumā (27 ± 4 vs. 5 ± 2 šūnas/mm², p=0.0006), 2.att.

Arī nigrālajā kodolā (substantia nīgra) 6-OHDA samazināja TH pozitīvo neironu skaitu, taču, salīdzinot ar kontroles grupas datiem, tas nebija statistiski ticami (44 ± 14 vs. 95 ± 30 šūnas/mm , p=0.1,3.att.). Meldonija per se dose 50 mg/kg neietekmēja TH ekspresiju substantia nīgra, kamēr meldonijs uzrādīja tendenci palielināt 6-OHDA izraisīto TH šūnu skaita samazinājumu (64 ± 13 vs. 44 ± 14, p=0.3; 3.att.).

Meldonija ietekme uz GFAP (glial fibrillary acidic protein) ekspresiju

Striatumā (corpus striatum) 6-OHDA būtiski palielina (apmēram četras reizes) GFAP pozitīvo astrocītu skaitu, salīdzinot ar kontroles grupu (42 ± 6 vs. 11 ± 2 šūnas/mm , p=0.0011, 4.att.), kas norāda uz reaktīvo astrogliozi. Meldonijs deva 50 mg/kg per se neietekmēja GFAP pozitīvo šūnu skaitu, taču meldonijs samazināja līdz kontroles līmenim 6OHDA izraisīto GFAP šūnu skaita palielinājumu (20 ± 4 vs. 42 ± 6 šūnas/mm², p=0.01,

4.att.).

Kodolā substantia nigra 6-OHDA injekcija arī palielināja (apmēram trīs reizes)

GFAP pozitīvo astrocītu šūnu skaitu (35 ± 5 vs. 10 ± 2 cells/mm², p=0.002). Meldonijs pats par sevi devā 50mg/kg neietekmēja šo šūnu skaitu, bet meldonija divu nedēļu ievadīšana uzrādīja tendenci pazemināt 6-OHDA efektu (25 ± 4 vs. 35 ± 5, p=0.1, 5.att.).

Kā redzams no šajā izgudrojumā prezentētajiem datiem, meldonijs devā 50 mg/kg, ievadīts intraperitoneāli katru dienu divas nedēļas pirms neirotoksīna 6-OHDA intrastriatālas injekcijas, pilnīgi protektēja 6-OHDA-inducēto dopamīnu producējošo neironu deģenerāciju bojātajā striatum struktūrā, novēršot tirozīnbidroksilāzes (ΊΉ) pozitīvo šūnu bojāeju; mazāk šis efektus bija izteikts citā (nebojātā) struktūrā - substantia nigra.

Meldonijs bojātajā struktūrā (striatum) protektēja arī OHDA izraisīto astrocītu 5 aktivāciju, kas demonstrē meldonija spēju regulēt sinaptisko aktivitāti starp neironiem, kā arī starp neironiem un astrocītiem, kuru funkcija (kaut arī vēl līdz galam nav noskaidrota) tiek saistīta ar signālizācijas kaskāžu homeostāzes uzturēšanu neironu-glijas-asinsvadu līmenī.

Tādējādi meldonija neiroprotektīvā aktivitāte, kas nepārprotami izpaužas Parkinsona slimības modelī žurkām, norāda uz meldonija kā jauna tipa pretparkinsona preparāta perspektivitāti Parkinsona slimības novēršanā un ārstēšanā. Parkinsona slimības un citu neirodeģeneratīvo slimību ārstēšanai meldoniju var lietot perorāli vai injekciju veidā. Uz meldonija struktūru bazētai farmaceitisku kompozīciju ražošanai var izmantot meldonija dihidrātu vai farmaceitiskai lietošanai atļautu sāls formu. Perorāli meldoniju var lietot tablešu, kaplēšu, granulu, šķīduma, pulvera vai kapsulu formā, kas satur devu 100 mg - 1500 mg/dienā, vislabāk 500-1000 mg/dienā. Meldonija ārstniecisko formu pagatavošanai var izmantot farmaceitiskai lietošanai atļautus nesējus un pildvielas, veicot standarta ražošanas procedūras. Meldonija intravenozo vai intramuskulāro injicējamo formu pagatavo kā 1040% šķīdumu, kā šķīdinātāju izmantojot ūdeni, izotonisko nātrija hlorīda šķīdumu, glikozes/ūdens šķīdumu vai buferētu (pH 6,5- 8,0) šķīdumu. Parkinsona slimības pacientu ārstēšanai ieteicamā meldonija dienas deva ir 100 mg -1000 mg, vislabāk 250-500 mg.

Augstāk norādītās meldonija farmaceitiskās kompozīcijas var tik lietotas dažādu neiroloģisko traucējumu profilaksei un terapijai, kad ir nepieciešama dopamīnu producējošo neironu deģenerācijas protekcija, galvenokārt lai stimulētu tirozīnhidroksilāzes ekspresiju smadzeņu nigrostriatālajā sistēmā.

Claims (5)

1/5

O Day14 □ Day21 ļ HDay28[

l.att. Apomorfīna izraisīto kontralaterālo rotāciju skaits žurkām (reģistrēts 30 min).

Rotācijas tests veikts pēc apomorfīna (0.2 mg/kg subkutāni) ievadīšanas 14., 21. un 28. dienā pēc 6OHDA injekcijas (20 pg) labajā striatumā. Fizioloģiskais šķīdums (Saline, 1 ml/kg) vai meldonijs devā 50 mg/kg (M50) ievadīti intraperitoneāli divu nedēļu laikā pirms 6-OHDA injekcijas. **p<0.01, M50 + 6-OHDA vs. Saline + 6-OHDA, 21.diena, nesapārotais t-tests.

1. Farmaceitiska kompozīcija, kas kā darbīgo vielu satur savienojumu, kas izvēlēts no grupas, kas sastāv no 3-(2,2,2-trimetilhidrazīnij)propionāta dihidrāta un 3-(2,2,25 trimetilhidrazīnijjpropionāta farmaceitiskai lietošanai atļautām sālīm, kā ari farmaceitiski akceptējamu pildvielu vai šķīdinātāju, lietošanai par līdzekli neiroprotekcijai un dopamīnu producējošo šūnu deģenerācijas profilaksei un novēršanai centrālās nervu sistēmas slimību gadījumos.

2.att. Tirozīnhidroksilāzes (TH) pozitīvo neironu skaits striatumā (šūnas/mm²). Fizioloģiskais šķīdums (Saline, 1 ml/kg) un meldonijs devā 50 mg/kg (M50) ievadīti intraperitoneāli katru dienu divas nedēļas pirms intrastriatālas (labajā pusē) 6-OHDA vai mākslīgā cerebrospinālā šķīduma (aCSF) injekcijas.

*p=0.03, Saline + 6-OHDA vs. Saline + aCSF; ***p<0.0001, M50 + 6-OHDA vs. Saline + 6-OHDA. Mann-Whitney U-tests.

2/5

2. Farmaceitiskas kompozīcijas pēc p. 1. lietošana, kas atšķiras ar to, ka šī kompozīcija tiek

10 lietota tirozīna hidroksilāzes ekspresijas stimulācijai nigrostriatālajā sistēmā.

3.att. Tirozīnhidroksilāzes (TH) pozitīvo neironu skaits nigrālajā kodolā - substantia nīgra (šūnas/mm²). Fizioloģiskais šķīdums (Saline, 1 ml/kg) un meldonijs devā 50 mg/kg (M50) ievadīti intraperitoneāli katru dienu divas nedēļas pirms intrastriatālas (labajā pusē) 6-OHDA vai mākslīgā cerebrospināiā šķīduma (aCSF) injekcijas.

3/5

3. Farmaceitiskas kompozīcijas pēc p. 1. lietošana, kas atšķiras ar to, ka šī kompozīcija tiek lietota gliālā fibrilārā skābā proteīna ekspresijas regulācijai nigrostriatālajos kodolos.

4.att. GFAP (glial fibrillary acidicprotein) pozitīvo astrocītu skaits striatumā (šūnas/mm²). Fizioloģiskais šķīdums (Saline, 1 ml/kg) un meldonijs devā 50 mg/kg (M50) ievadīti intraperitoneāli katru dienu divas nedēļas pirms intrastriatālas (labajā pusē) 6-OHDA vai mākslīgā cerebrospinālā šķīduma (aCSF) injekcijas.

*p=0.0011, Saline + 6-OHDA vs. Saline + aCSF; **p=0.01, M50 + 6-OHDA vs. Saline + 6-OHDA. Mann-Whitney U-tests.

5/5

4/5

4. Farmaceitiskas kompozīcijas pēc p. 1. lietošana, kas atšķiras ar to, ka centrālās nervu sistēmas slimība ir Parkinsona slimība.

5.att. GFAP (glialfibrillary acidicprotein) pozitīvo astrocītu skaits substantia nīgra (šūnas/mm²). Fizioloģiskais šķīdums (Saline, 1 ml/kg) un meldonijs devā 50 mg/kg (M50) ievadīti intraperitoneāli katru dienu divas nedēļas pirms intrastriatālas (labajā pusē) 6-OHDA vai mākslīgā cerebrospinālā šķīduma (aCSF) injekcijas.

p=0.002, Saline + 6-OHDA vs. Saline + aCSF. Mann-Whitney U-test.