LU602341B1 - Eine Entwicklung und Anwendung eines geschlechtschromosomenspezifischen molekularen Markers bei tibetischem Bocksdorn - Google Patents

Eine Entwicklung und Anwendung eines geschlechtschromosomenspezifischen molekularen Markers bei tibetischem Bocksdorn

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LU602341B1
LU602341B1 LU602341A LU602341A LU602341B1 LU 602341 B1 LU602341 B1 LU 602341B1 LU 602341 A LU602341 A LU 602341A LU 602341 A LU602341 A LU 602341A LU 602341 B1 LU602341 B1 LU 602341B1
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tibetan
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primers
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Qiong La
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Xizang Univ
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Abstract

Die vorliegende Erfindung offenbart die Entwicklung und Anwendung eines geschlechtschromosomenspezifischen molekularen Markers bei tibetischem Bocksdorn, wobei Loci, die mit der Geschlechtsspezifität zusammenhängen, durch die Verwendung von selbst geschriebenen Python-Skripten effizienter identifiziert werden. Auf der Grundlage der vorhandenen Loci wurde die Zuverlässigkeit der ausgewählten Loci durch Visualisierung der Sequenzierungsdaten der zweiten Generation von männlichen und weiblichen Individuen im Vergleich zum weiblichen Referenzgenom mit Hilfe der IGV-Software überprüft, und es wurde festgestellt, dass etwa 70 % der Loci sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Individuen offensichtliche Längenpolymorphismusvariationen aufwiesen, was die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Methode bestätigte. Nach der Entwicklung spezifischer Primer für die ausgewählten Loci wurden zwei Primerpaare, Hiti_08 und Hiti_17, erfolgreich entwickelt. Die beiden Paare geschlechtsspezifischer Primer können bei der Züchtung und dem Anbau von tibetischem Sanddorn eingesetzt werden, um das Verhältnis von männlichen und weiblichen Pflanzen angemessen anzupassen, die weiblichen und männlichen Individuen des tibetischen Sanddorns vor der Blüte zu unterscheiden und nicht durch die Wachstumsperiode der tibetischen Sanddornpflanzen eingeschränkt zu sein, was eine stabile und effiziente Methode zur Identifizierung von männlichen und weiblichen Pflanzen des tibetischen Sanddorns darstellt.

Description

Eine Entwicklung und Anwendung eines geschlechtschromosomenspezifischen LU602341 molekularen Markers bei tibetischem Bocksdorn
Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung gehört zum technischen Gebiet der pflanzlichen
Sexualchromosomen-Molekularmarker-Primer und bezieht sich insbesondere auf die
Entwicklung und Anwendung eines geschlechtschromosomenspezifischen molekularen
Markers bei tibetischem Bocksdorn.
Technologie im Hintergrund
Der tibetische Sanddorn (Hippophae tibetana), der zur Gattung Hippophae der Familie der
Elaeagnaceae gehört, ist ein zweihäusiger Strauch, der auf dem tibetischen Plateau endemisch ist. Als eine Pflanzengruppe mit bedeutenden wirtschaftlichen und ökologischen Werten hat der
Sanddorn große wissenschaftliche und industrielle Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Seine einzigartige Anpassungsfähigkeit an die Umwelt sowie sein Reichtum an Nährstoffen und bioaktiven Verbindungen haben dazu geführt, dass der tibetische Sanddorn ein großes Potenzial für die Anwendung in einer Reihe von Bereichen wie Anti-Aging-Kosmetik,
Arzneimittelentwicklung, Gesundheitsgetränke und Lebensmittelverarbeitung aufweist. Vor allem die Früchte des tibetischen Sanddorns sind weithin erforscht und verwendet worden, da sie reich an Vitamin C, Flavonoiden, essentiellen Fettsäuren und einer Vielzahl von
Verbindungen mit antioxidativer, entzündungshemmender und kardiovaskulärer Schutzwirkung sind. Aufgrund seiner zweihäusigen Natur ist der Blütenstand des tibetischen Sanddorns jedoch klein und kurzlebig, und selbst wenn er blüht, ist es nicht einfach, ihn schnell zu identifizieren, was eine Herausforderung für die Züchtung und den Anbau des tibetischen Sanddorns darstellt.
Im kommerziellen Anbau von Sanddorn ist es wichtig, das Verhältnis von männlichen und weiblichen Pflanzen zu rationalisieren. Bei tibetischen Sanddornsämlingen können die
Geschlechtsbestimmung und die Entfernung der überzähligen männlichen Pflanzen erst nach 3-4 Jahren der Blüte erfolgen. Sich auf die Geschlechtsbestimmung nach der Blüte zu verlassen, bedeutet nicht nur eine Verschwendung von Ressourcen, sondern erschwert auch die
Bewirtschaftung. Ali und Kaul (2012) stellten fest, dass in den natürlichen Populationen des tibetischen Sanddorns der Anteil der weiblichen und männlichen Pflanzen in den meisten
Populationen größer war als der der weiblichen. Daher ist eine frühzeitige und genaue
Identifizierung des Geschlechts besonders wichtig, was die Erhaltungskosten wirksam senken und den wirtschaftlichen Nutzen erhöhen kann. In den letzten Jahren wurde die molekulare
Markertechnologie in großem Umfang zur Geschlechtsidentifizierung bei einer Vielzahl von zweihäusigen Pflanzen eingesetzt, z. B. bei der weichen Dattel-Kiwi (Actinidia arguta), dem
Spinat (Spinacia oleracea) und der Papaya (Carica papaya). Allerdings sind geschlechtsspezifische molekulare Markerstudien für die Gattung Sanddorn noch sehr begrenzt.
Gegenwärtig konzentrieren sich Studien zur Geschlechtsbestimmung bei Sanddorn auf andere Arten der Gattung Sanddorn. So entwickelten Korekar et al. (2010) RAPD-Primer, die in der Lage waren, spezifisch weibliche Proben von Hippophae rhamnoides (Rhamnose-Sanddorn) zu amplifizieren, und entwickelten auf dieser Grundlage SCAR-Marker (HrX1 und HrX2).
Chawla et al. (2012) zeigten, dass der HrX1-Marker in der Lage war, bei tibetischem Sanddorn, der in Indien geerntet wurde, genau zwischen Männchen und Weibchen zu unterscheiden.
Allerdings waren diese Marker bei tibetischen Sanddornarten, die in Tibet gesammelt wurden, nicht verallgemeinerbar und konnten nicht zwischen Männchen und Weibchen unterscheiden.
Dies deutet darauf hin, dass es erhebliche Unterschiede in der Anwendbarkeit bestehender geschlechtsspezifischer molekularer Marker für Sanddorn in verschiedenen geografischen 602341
Populationen und Arten gibt.
In den letzten Jahren haben die rasche Entwicklung der Sequenzierungstechnologie und die Zusammenstellung einer großen Zahl hochwertiger Referenzgenome von Nicht-Modellarten neue Möglichkeiten für die Entwicklung molekularer Marker für das Geschlecht zweihäusiger
Pflanzen eröffnet. Derzeit haben mehrere Studien erfolgreich molekulare Marker entwickelt, die in der Lage sind, das Geschlecht von Pflanzen und Tieren zu unterscheiden, indem sie
Resequenzierungsdaten mit verschiedenen Analysemethoden kombinieren. She et al. (2021) analysierten beispielsweise Resequenzierungsdaten von 10 Spinatpflanzen (Spinacia oleracea) (5 weibliche und 5 männliche), um potenzielle männlich-spezifische Regionen (MSRs) zu identifizieren und geschlechtsspezifische Primer zu entwickeln; Guo et al. (2023) sequenzierten gemischte Pools von 15 weiblichen und männlichen Weichdattel-Kiwis (Actinidia arguta) getrennt, stellten geschlechtsgebundene molekulare Marker auf der Grundlage von männlich-spezifischen Kmer zusammen und entwickelten sie; Hui et al. (2022) analysierten die
Resequenzierung von 15 weiblichen bzw. 15 männlichen Longirostris (Leiocassis longirostris), um geschlechtsgebundene Regionen zu identifizieren und molekulare Marker zu entwickeln, die auf der Grundlage geschlechtsspezifischer Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) genau zwischen den Geschlechtern unterscheiden.
Obwohl es Versuche gegeben hat, molekulare Marker für die Geschlechtsidentifikation bei tibetischem Sanddorn zu entwickeln, sind diese Marker oft auf bestimmte Populationen oder
Arten beschränkt und nicht breit anwendbar. So wurden beispielsweise die von Korekar et al. (2010) entwickelten SCAR-Marker bei verschiedenen tibetischen Sanddornarten mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen angewandt, und einige der Marker konnten nicht spezifisch in tibetischem Sanddorn amplifiziert werden. Darüber hinaus beruhen die meisten der bestehenden
Methoden zur Geschlechtsidentifizierung auf komplexen genomischen Daten und teuren
Versuchsanlagen, was ihre breite Anwendung in der praktischen Produktion einschränkt. Diese
Probleme stellen die Erforschung und Anwendung der Geschlechtsidentifizierung bei tibetischem Sanddorn vor viele Herausforderungen. Die bestehenden Techniken, die dieser
Studie am nächsten kommen, sind kompliziert in der Datenanalyse, was zweifellos die
Schwierigkeit der Entwicklung spezifischer molekularer Marker erhöht.
Zu den spezifischen Problemen der vorhandenen Techniken gehören: 1) die Grenzen der vorhandenen Methoden zur Geschlechtsidentifizierung, die sich hauptsächlich auf morphologische Merkmale stützen und die Blüte der Pflanze abwarten müssen, was einen langen Zeitraum und eine geringe Effizienz mit sich bringt; 2) die Anwendbarkeit der vorhandenen molekularen Markertechniken, die meist auf bestimmte Populationen oder Arten beschränkt sind und denen es an Vielseitigkeit mangelt und die den Anforderungen der
Geschlechtsidentifizierung bei tibetischem Sanddorn nicht gerecht werden; 3. das Fehlen einer effizienten Technologie zur Geschlechtsidentifizierung: Das Fehlen einer schnellen, genauen und kostengünstigen Technologie zur Geschlechtsidentifizierung behindert die Forschung und die kommerzielle Anwendung des Tibetischen Sanddorns; 4. die Komplexität der neueren
Methoden zur Entwicklung von männlichen und weiblichen spezifischen molekularen Markern.
Daher zielt die vorliegende Erfindung in Anbetracht der oben genannten Mängel und
Unzulänglichkeiten des Standes der Technik darauf ab, geschlechtsspezifische molekulare
Marker zu entwickeln, die für den tibetischen Sanddorn durch eine effizientere Methode anwendbar sind, und eine Methode zur Identifizierung des Geschlechts des Sanddorns unter
Verwendung solcher molekularer Marker bereitzustellen, um die Schwierigkeiten seine- 602541
Geschlechtsidentifizierung zu lösen.
Inhalt der Erfindung
In Anbetracht dessen ist ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung die
Bereitstellung einer geschlechtschromosomenspezifischen molekularen
Marker-Primer-Kombination zur Identifizierung des Geschlechts von tibetischem Sanddorn mit den Nukleotidsequenzen, wie sie in Hiti_08 und Hiti_17 gezeigt sind:
Die in Hiti 08 gezeigte Primer-Sequenz, umfassend: eine Primer-Sequenz wie in
Hiti_08-F gezeigt und eine Primer-Sequenz wie in Hiti_08-R gezeigt;
Die für Hiti 17 gezeigten Primer-Sequenzen, enthaltend: Primer-Sequenzen, wie für
Hiti_17-F gezeigt, und Primer-Sequenzen, wie für Hiti_17-R gezeigt;
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn zu offenbaren, das die folgenden Schritte umfasst:
S1: Probensammlung und DNA-Extraktion: Sammlung von molekularem Material des nachzuweisenden tibetischen Sanddorns und Extraktion, um eine nachzuweisende DNA-Probe zu erhalten;
S2: Mit der aus S1 extrahierten nachzuweisenden DNA-Probe wurde ein herkômmliches
PCR-Amplifikationsexperiment mit den in Hiti_ 08 und Hiti_17 gezeigten Primerkombinationen durchgeführt;
S3: Die PCR-Produkte in S2 wurden durch 2%ige Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt und an ein biologisches Unternehmen zur Sequenzierung geschickt; auf der Grundlage der erhaltenen Zielsequenzen waren diejenigen, die zwei Banden erzeugten, männliche Proben und diejenigen, die eine Bande erzeugten, weibliche Proben;
Ferner handelt es sich bei dem molekularen Material in S1 um frische Blattproben von einer Reihe bestehender Verteilungsaufzeichnungspunkte, wobei jeweils weibliche und männliche Pflanzen der gleichen Anzahl von Stämmen ausgewählt werden; das molekulare
Material wird unter Verwendung von Kieselgel getrocknet und bei -20 Grad Celsius gelagert;
Die Gesamt-DNA wurde aus dem molekularen Material mit der
Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Methode extrahiert;
Das PCR-Reaktionssystem in S2 bestand ferner darin, dass die CR-Reaktion in einem
Gesamtvolumen von 30 ul durchgeführt wurde, das 15 ul Taq-Mix, 1 ul DNA-Matrize, 1 ul der jeweiligen Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 12 pl entionisiertes Wasser enthielt;
Das PCR-Reaktionsverfahren in S2 ist: Vordenaturierung bei 95°C fiir 3 Minuten, gefolgt von Denaturierung bei 95°C für 15 Sekunden, Annealing bei 58°C für 15 Sekunden, Extension bei 72°C fur 30 Sekunden für insgesamt 35 Zyklen, und schließlich vollständige Extension bei 72°C für 5 Minuten und Lagerung bei 4°C;
Andererseits ist es ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur
Entwicklung eines molekularen Marker-Primers zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn bereitzustellen, das die folgenden Schritte umfasst:
S1: Probensammlung und DNA-Extraktion: Sammlung des molekularen Materials des zu untersuchenden tibetischen Sanddorns und Extraktion der zu untersuchenden DNA-Proben;
S2: Resequenzierung des gesamten Genoms und Datenverarbeitung: Screening der in S1 gewonnenen DNA-Proben, die dem Qualitätsstandard entsprechen, und Übersendung an das biologische Unternehmen fiir den Aufbau der Bibliothek und die Sequenzierung; Anwendung der Methode der populationsgenetischen Datenanalyse zur Erkennung vor 602341
Populationsvariationen und Screening zur Gewinnung der männerspezifischen Fragmente;
S3: Screening und Verifizierung der geschlechtsbestimmenden Region: frauenspezifische
Fragmente wurden mit Hilfe eines Python-Skripts gescreent, und die gescreenten molekularen
Marker wurden mit der Software IGV v.2.16 zur Visualisierung und Lokalisierung weiter verifiziert; Sequenzen mit Deletion nach Einfügung eines langen Fragments bei den Männchen wurden ausgewählt, um als alternative Regionen für das Design der nachfolgenden Primer verwendet zu werden;
S4: Entwurf und Validierung von Primern: Es wurden Primer für geschlechtsgebundene
Regionen synthetisiert, und ein erstes Screening wurde sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Individuen durchgeführt;
SS: Universelle Validierung der Primer: Die geschlechtsspezifischen Marker, die ursprünglich in S4 untersucht wurden, werden in einer größeren Population auf ihre
Universalität getestet.
Ferner handelt es sich bei dem molekularen Material in S1 um frische Blattproben von einer Reihe bestehender Verbreitungsregistrierungsstellen, wobei jeweils weibliche und männliche Pflanzen der gleichen Anzahl von Pflanzen ausgewählt wurden. Das molekulare
Material wurde mit Kieselgel getrocknet und bei -20 Grad Celsius gelagert; die Methode zur
Extraktion der Gesamt-DNA aus dem molekularen Material war die CTAB-Methode;
Die Screening-Operation in S2 besteht ferner darin, dass die Qualität und die
Konzentration der DNA-Proben unter Verwendung einer 1,0%igen Agarosegel-Elektrophorese und des NanoDrop2000 bewertet werden und die DNA-Proben, die die Qualitätsanforderungen für die Sequenzierung erfüllen, an ein biologisches Unternehmen zur Bibliothekserstellung und
Sequenzierung geschickt werden;
Bei der in S2 beschriebenen Sequenzierung handelte es sich um eine bipartite
Sequenzierung auf einer Novaseq X Plus PE150-Plattform mit einer Sequenzierungstiefe von 30x; die Rohdaten der Sequenzierung wurden einer Qualitätskontrolle und Datenbereinigung mit Fastp v0.21 unterzogen, und anschließend wurde die Datenqualität mit FastQCv0.11.9 bewertet; Die Identifizierung und Filterung von INDELs wurde mit dem Genome Analysis
Toolkit (GATK4) durchgeführt; die Daten wurden außerdem mit plinkv.1.9 gefiltert, um Loci mit einer Minor Allele Frequency (MAF) <0,01 und mehr als 50 % fehlenden Genotypdaten auszuschließen; Die genannten Schritte der Identifizierung und Filterung umfassen die
Entfernung von PCR-generierten repetitiven Sequenzen, die Erkennung von
Einzelprobenvarianten, die Erkennung von Populationsvarianten und die Filterung von INDELs zur Kennzeichnung und von Loci geringer Qualität; Filterkriterien werden auf QD < 2,0 || FS > 200,0 || SOR > 10,0 || MQRankSum < -12,5 || ReadPosRankSum < -8,0“ gesetzt;
Ferner ist die spezifische Operation von S3 wie folgt: durch das Python-Skript werden die
Variantenstellen mit langen Fragment-Insertionen/Deletionen in den männlichen Proben gescreent; die gescreenten Stellen werden manuell mit der IGV v.2.16-Software überprüft, und die Sequenzen mit langen Fragment-Insertionen/Deletionen in den männlichen Proben werden als alternative Regionen für das nachfolgende Primer-Design ausgewählt;
Ferner werden in S4 die entsprechenden Sequenzinformationen mit der Software seqkit v2.6.1 aus dem Referenzgenom extrahiert. Primer, von denen erwartet wird, dass sie Produkte mit einer Länge von 200-300 bp ergeben, werden in großen Mengen unter Verwendung von primer3 entworfen; die entworfenen Primer werden anschließend mit dem Referenzgenom durch blastn v2.5.0 abgeglichen, um ihre Spezifität zu überprüfen; und Primer mit hohelY802341
Spezifität unter den entworfenen Primern werden von Bio ausgewählt und synthetisiert;
Ferner wurde in der genannten S5, die genannte vorläufige Auswahl weitere universelle
Validierung der Operation ist: die Batch-synthetisierten Primer wurden auf konventionelle 5 PCR-Amplifikation Experimente auf tibetischen Sanddorn DNA-Proben (einschließlich 2 weibliche und 2 männliche Individuen) fiir vorläufige weibliche und männliche Differenzierung
Fähigkeit ersten Screening unterzogen. Das PCR-Reaktionssystem hatte ein Gesamtvolumen von 30 ul und enthielt 15 ul Taq-Mix, 1 ul DNA-Matrize, 1 ul der jeweiligen Vorwärts- und
Rückwärtsprimer und 12 pl entionisiertes Wasser; Das PCR-Verfahren bestand aus einer
Vordenaturierung bei 95°C für 3 min, gefolgt von einer Denaturierung bei 95°C für 15 s, einem
Annealing bei 58°C für 15 s und einer Verlängerung bei 72°C für 30 s für insgesamt 35 Zyklen sowie einer abschließenden vollständigen Verlängerung bei 72°C für 5 min und Lagerung bei 4°C; Die PCR-Produkte wurden durch 2%ige Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, und die
Primer, die männliche und weibliche Proben effektiv unterscheiden konnten, wurden anhand der Produktlänge ausgewählt; anschließend wurden die ausgewählten Primer verwendet, um die
Universalität weiterer Proben des tibetischen Sanddorns zu überprüfen, die aus verschiedenen
Regionen geerntet worden waren und von männlichen und weiblichen Proben unterschieden wurden.
Vorteilhafte Wirkung der vorliegenden Erfindung:
Durch die Verwendung des in diesem Projekt bereitgestellten Python-Skripts können Loci, die mit der Geschlechtsspezifität zusammenhängen, effizienter identifiziert werden. Auf der
Grundlage der vorhandenen Loci haben wir die Zuverlässigkeit der ausgewählten Loci visualisiert, indem wir den Vergleich der männlichen und weiblichen Sequenzierungsdaten der zweiten Generation mit der Referenzgenomsituation mit Hilfe der IGV-Software überprüft haben, und festgestellt, dass etwa 70 % der Loci sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen
Individuen offensichtliche polymorphe Varianten aufweisen. Dies bestätigt auch die
Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Methode.
In der vorliegenden Studie wurden zwei Paare geschlechtsspezifischer molekularer Marker erfolgreich zur Unterscheidung zwischen männlichen und weiblichen Individuen des
Tibetischen Sanddorns entwickelt, indem die Fragmente mit signifikanten Unterschieden zwischen weiblichen und männlichen Individuen kombiniert wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die beiden Paare von molekularen Markern in der Lage waren, zu 100 % zwischen
Männchen und Weibchen in verschiedenen Gruppen von Individuen zu unterscheiden.
Verglichen mit dem Stand der Technik sind die vorteilhaften Wirkungen der vorliegenden
Erfindung:
Der in der vorliegenden Erfindung offenbarte molekulare Marker kann für die Züchtung und den Anbau von Sanddorn verwendet werden, wobei das Verhältnis von männlichen und weiblichen Pflanzen sinnvoll eingesetzt werden kann, zwischen weiblichen und männlichen
Individuen des Sanddorns vor der Blüte unterschieden werden kann, nicht durch die
Wachstumsperiode der Sanddornpflanze eingeschränkt ist und eine stabile und hocheffiziente
Methode zur Identifizierung von männlichen und weiblichen Sanddornsorten bietet.
Die in der vorliegenden Erfindung offengelegte Identifizierungsmethode ist nicht auf bestimmte Populationen oder Sorten beschränkt, hat eine breite Anwendbarkeit, ist nicht auf komplexe genetische Daten und kostspielige Realisierungsgeräte angewiesen und hat breitere
Anwendungsmoglichkeiten.
Beschreibung der beigefügten Zeichnungen LU602341
Um die technischen Lösungen der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung deutlicher zu veranschaulichen, werden die begleitenden Zeichnungen, die für die Beschreibung der Ausführungsformen verwendet werden, im Folgenden kurz vorgestellt werden, und es wird klar sein, dass die begleitenden Zeichnungen in der folgenden Beschreibung sind nur einige der
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, und dass für eine Person von gewôhnlichem
Geschick in der Kunst, andere begleitende Zeichnungen kônnen auf der Grundlage dieser
Zeichnungen ohne kreative Arbeit erhalten werden.
Bild 1 ist ein Streifen von Bild 1 Hiti 8 und Hiti_ 17 Primerpaare in Ausführungsform 1 der vorliegenden Erfindung Validierung Geschlechtsunterscheidung von Individuen aus verschiedenen Regionen zu unterscheiden zwischen Männern und Frauen.
Detaillierte Beschreibung
Die technischen Lösungen in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung klar und vollständig beschrieben, und es ist klar, dass die beschriebenen Ausführungsformen nur ein Teil der Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung sind, nicht alle Ausführungsformen. Ausgehend von den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fallen alle anderen Ausführungsformen, die von einem Fachmann ohne schöpferische Arbeit erreicht werden können, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
Ausführungsform 1 (1) Probensammlung und DNA-Extraktion
Proben von männlichen und weiblichen Pflanzen des tibetischen Sanddorns wurden aus sechs verschiedenen geographischen Populationen gesammelt (siehe Tabelle 1 für die
Sammelstellen). Aus jeder Population wurden vier weibliche und vier männliche Pflanzen nach dem Zufallsprinzip für die Entnahme frischer Blattproben ausgewählt. Die entnommenen molekularen Materialien wurden mit Kieselgel getrocknet und bei -20°C gelagert. Die Proben wurden mit CTAB gesammelt. Die Gesamt-DNA wurde mit der CTAB-Methode aus den
Blättern des tibetischen Sanddorns extrahiert, und die Qualität und Konzentration der DNA wurde mit Hilfe der 1,0%igen Agarosegel-Elektrophorese und NanoDrop 2000 bewertet, um sicherzustellen, dass die Proben den Qualitätsanforderungen für die Sequenzierung entsprechen.
Tabelle 1 Probenahmestellen von Sanddorn in Tibet
Bevölkerun
Ort Längengrad Breitengrad gszahl
Kreis Dingri, Tibet DR 86.9721 28.3862
Kreis Dangxiong,
DX-1 90.2140 29.9335
Tibet
Kreis Dangxiong,
DX-2 90.3474 29.9775
Tibet
Kreis Dangxiong,
DX-3 90.6756 30.2582
Tibet
- LU602341
Kreis Mozhugongka,
MZGK 92.2615 29.6894
Tibet
Tibet Kreis Baxu BS 96.9439 29.2703 (2) Resequenzierung des gesamten Genoms und Datenverarbeitung
DNA-Proben, die den Qualitätsstandards entsprachen, wurden an Beijing Novaseq
Technology Co. Ltd. geschickt, um DNA-Bibliotheken zu erstellen, und wurden bipartit auf der
Novaseq X Plus PE150-Plattform mit einer Sequenzierungstiefe von 30x sequenziert. Die
Rohdaten der Sequenzierung wurden mit Fastp v0.21 qualitätskontrolliert und bereinigt, und anschließend wurde die Datenqualität mit FastQC v0.11.9 (https://www bioinformatics babraham.ac.uk/projects/fastqc/) bewertet. Die bereinigten Daten wurden mit BWA v2.2.1 mit dem Referenzgenom des tibetischen Sanddorns verglichen und anschließend mit samtools v1.19 in das BAM-Format konvertiert. Die Identifizierung und
Filterung von INDELs wurde mit dem Genome Analysis Toolkit (GATK4) durchgeführt. Zu den wichtigsten Schritten gehörten die Entfernung von PCR-generierten repetitiven Sequenzen, die Erkennung von Einzelprobenvarianten, die Erkennung von Populationsvarianten sowie die
Kennzeichnung von INDELs und die Filterung von Loci geringer Qualität. Die Filterkriterien wurden auf QD < 2,0 || FS > 200,0 || SOR > 10,0 || MQRankSum <-12,5 || ReadPosRankSum < -8,0“ festgelegt. Die Daten wurden mit plinkv.1.9 weiter gefiltert, um Loci mit einer
Minor-Allel-Häufigkeit (MAF) < 0,01 und mehr als 50 % fehlenden Genotypdaten auszuschließen, und schließlich wurden 6554748 Loci aus 7706351 Varianten für die weitere
Analyse gefiltert. (3) Screening und Uberpriifung der geschlechtsbestimmenden Region
Da das Referenzgenom von weiblichen Pflanzen stammte, lag der Schwerpunkt auf dem
Vergleich von weiblichen und männlichen Sequenzierungsdaten mit demselben Locus im
Referenzgenom. Das Screening wurde mit Hilfe von selbst geschriebenen Python-Skripten auf abweichende Loci mit langen Fragment-Insertionen/Deletionen in den männlichen Proben durchgeführt. Schließlich wurden die gescreenten Loci manuell mit der Software IGV v.2.16 überprüft, um die Sequenzen mit Langfragment-Insertionen/Deletionen in den männlichen
Proben als alternative Regionen fiir das anschließende Primerdesign auszuwählen. (4) Primerentwurf und Validierung
Auf der Grundlage der Variantenloci, die für das Primerdesign verwendet werden konnten, wurden die entsprechenden Sequenzinformationen mit der Software seqkit v2.6.1 aus dem
Referenzgenom extrahiert. Da die Längen der variablen Segmente, die für das Primerdesign verwendet werden konnten, bei den manuellen Tests im Bereich von 30-60 bp lagen, wurden mit primer3 Primer entworfen, die Produkte von 200-300 bp Länge erzeugen sollten, um männliche und weibliche Proben anhand der Länge der Produkte visuell unterscheiden zu kônnen. Mismatches, Dimere, Hairpin-Strukturen und Primer-Dimere wurden beim Entwurf der
Primer so weit wie möglich vermieden. Die entworfenen Primer wurden anschließend mit Hilfe von blastn v2.5.0 mit einem Referenzgenom verglichen, um ihre Spezifität zu überprüfen.
Durch diesen Screening-Schritt wurden Primer mit hoher Spezifität ausgewählt und für die
Synthese an Bioengineering (Shanghai) Co. (5) Überprüfung der Universalität der Primer
Um die Spezifität der Primer zu überprüfen, wurden die chargensynthetisierten Primer zunächst konventionellen PCR-Amplifikationsexperimenten an einer kleinen Anzahl von tibetischen Sanddorn-DNA-Proben (darunter zwei weibliche und zwei männliche Individuen) 602341 unterzogen, um zunächst die Primer zu screenen, die zwischen männlichen und weiblichen
Individuen unterscheiden können. Die PCR-Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 30 uL durchgeführt, bestehend aus 15 pL Taq-Mix, 1 pL. DNA-Matrize, 1 pL der jeweiligen
Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 12 pL entionisiertem Wasser. Das PCR-Programm war auf eine Vordenaturierung bei 95 °C für 3 Minuten eingestellt. Es folgte eine Denaturierung bei 95°C für 15 Sekunden, ein Annealing bei 58°C für 15 Sekunden, eine Verlängerung bei 72°C für 30 Sekunden für insgesamt 35 Zyklen und schließlich eine vollständige Verlängerung bei 72°C für 5 Minuten und Lagerung bei 4°C. Die PCR-Produkte wurden durch 2%ige
Agarosegel-Flektrophorese aufgetrennt, so dass die Primer, die effektiv zwischen männlichen und weiblichen Proben unterschieden, nach Produktlänge ausgewählt wurden. Die ausgewählten Primer wurden dann verwendet, um die Genauigkeit von 48 Proben (24 weibliche und 24 männliche) aus sechs tibetischen Sanddornpopulationen in Tingri, Baju, Dangxiong und
Mozzhugongka, Tibet, zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Primerpaare in der
Lage waren, genau zwischen den getesteten weiblichen und männlichen Proben zu unterscheiden: zwei Banden wurden in allen männlichen Proben gebildet und eine Bande in den weiblichen Proben (ergänzende Abb. 1).
Durch die oben genannten Analysen wurden in dieser Studie erfolgreich zwei Paare geschlechtsspezifischer molekularer Marker für die Unterscheidung von männlichen und weiblichen Pflanzen im Tibetischen Sanddorn entwickelt, die zur genauen Identifizierung des
Geschlechts des Tibetischen Sanddorns verwendet werden können (siehe Tabelle 2 für die spezifischen Informationen zu den beiden Primerpaaren). Dies ist auch ein weiterer Beleg für die Zuverlässigkeit unseres neuen Ansatzes zur geschlechtsspezifischen Fragmentauswahl, der auch auf andere Arten angewendet werden kann.
Tabelle 2 Sequenzinformationen der beiden Primerpaare Hiti_08 und Hiti_17
Molekulare
Primer-Sequenz (5' - 3")
Marker
F:TTAGGTCACCTCCTCATGTGTTTAAT
Hiti 08 5 R:GACTAAAAACACCCTTATCAAACGGT
F:GCACATCTTCCACAGATACATCATC
Hiti_17 5 R:GGCTAAAGAATTGTCTACATGACCA
Ausführungsform 2
Eine Kombination von geschlechtschromosomenspezifischen molekularen
Marker-Primern zur Identifizierung des Geschlechts von tibetischem Sanddorn, umfassend:
Ein Primer-Paar für die in Hiti_08 gezeigte Sequenz, umfassend: eine Primer-Sequenz wie in Hiti_08-F gezeigt und eine Primer-Sequenz wie in Hiti_08-R gezeigt;
Ein Primer-Paar für die in Hiti_17 gezeigte Sequenz, bestehend aus: einer Primer-Sequenz wie in Hiti_17-F gezeigt und einer Primer-Sequenz wie in Hiti_17-R gezeigt; (Siehe Tabelle 2 für Einzelheiten zu den Primerpaaren Hiti 08 und Hiti 17
Sequenzinformationen) gezeigt.
Ausführungsform 3
In der vorliegenden Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn die folgenden Schritte: LU602341
S1: Probensammlung und DNA-Extraktion: Sammlung von molekularem Material des nachzuweisenden tibetischen Sanddorns und Extraktion, um eine nachzuweisende DNA-Probe zu erhalten;
S2: An der aus S1 extrahierten nachzuweisenden DNA-Probe wurde ein herkémmliches
PCR-Amplifikationsexperiment mit den in Hiti_08 und Hiti_17 gezeigten Primerkombinationen durchgeführt;
S3: Auftrennung des PCR-Produkts in S2 durch 2%ige Agarosegel-Elektrophorese und
Übersendung an ein biologisches Unternehmen zur Sequenzierung; Gewinnung der durch die
Primer amplifizierten Zielsequenz und Beurteilung des Geschlechts des Sanddorns auf der
Grundlage der Zielsequenz, wobei diejenigen, die zwei Banden erzeugen, männliche Proben und diejenigen, die eine Bande erzeugen, weibliche Proben sind;
In dieser Ausführungsform handelt es sich bei dem molekularen Material in S1 um frische
Blattproben von einer Anzahl bestehender Verteilungsaufzeichnungspunkte, wobei jeweils weibliche und männliche Pflanzen der gleichen Anzahl von Stämmen ausgewählt werden; das molekulare Material wird unter Verwendung von Silicagel getrocknet und bei -20 Grad Celsius gelagert; das Verfahren zur Extraktion der Gesamt-DNA aus dem molekularen Material ist das
CTAB- Verfahren;
In dieser Ausführungsform besteht das PCR-Reaktionssystem in S2 darin, dass für die
CR-Reaktion ein Gesamtvolumen von 30 ul verwendet wurde, das 15 ul Taq-Mix, 1 ul
DNA-Matrize, 1 ul der jeweiligen Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 12 ul entionisiertes
Wasser umfasst;
In dieser Ausführungsform ist das PCR-Reaktionsverfahren in S2: Vordenaturierung bei 95°C für 3 Minuten, gefolgt von Denaturierung bei 95°C für 15 Sekunden, Annealing bei 58°C für 15 Sekunden, Verlängerung bei 72°C für 30 Sekunden, für insgesamt 35 Zyklen, und schließlich vollständige Verlängerung bei 72°C für 5 Minuten und Lagerung bei 4°C;
Gemäß der Umsetzung der vorliegenden Ausführungsform wird ein Verfahren zur
Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn abgeleitet, das eine
Kombination von geschlechtschromosomenspezifischen molekularen Marker-Primern zur
Identifizierung des Geschlechts von tibetischem Sanddorn in der technischen Lösung der vorliegenden Erfindung verwendet, und das Verfahren zur Identifizierung in der vorliegenden technischen Lösung wird mit dem folgenden Stand der Technik verglichen:
Bestehende Technik 1
Bestehende Methoden zur Geschlechtsbestimmung des tibetischen Sanddorns beruhen hauptsächlich auf morphologischen Merkmalen, insbesondere auf der Beobachtung der morphologischen Merkmale der Pflanze nach der Blüte, um zwischen männlichen und weiblichen Pflanzen zu unterscheiden. Bei dieser Methode muss die Blüte der Pflanze abgewartet werden, was in der Regel 3-4 Jahre dauert, bevor das Geschlecht der Pflanze genau bestimmt werden kann. Ihre Nachteile: (1) Langer Zyklus: Es muss die Blüte des Tibetischen
Sanddorns abgewartet werden, die in der Regel 3-4 Jahre dauert, wodurch sich der
Züchtungszyklus stark verlängert. (2) Geringe Effizienz: Die Geschlechtsbestimmung ist vor der Blüte nicht möglich, was zu einer schwierigen Frühzucht und einer erheblichen Verschwendung von Ressourcen führt. (3) Begrenzte Genauigkeit: Morphologische Identifizierungsmethoden stützen sich auf die äußere Erscheinung der Pflanze, die leicht von Umweltfaktoren beeinflusst wird, und die
Genauigkeit ist unzureichend. LU602341
In Bezug auf die oben genannten Mängel des Standes der Technik hat die vorliegende
Erfindung die folgenden vorteilhaften Auswirkungen: (1) Kurze Zykluszeit: Die vorliegende
Erfindung verwendet eine Kombination von Geschlechtschromosom-spezifischen molekularen
Marker-Primern, die für die Geschlechtsidentifikation im Sämlingsstadium verwendet werden können und spart die Zeit des Wartens auf die Blüte. (2) Hohe Effizienz: Die schnelle und genaue Geschlechtsidentifizierung mittels
PCR-Technologie verbessert die Effizienz von Zucht und Management. (3) Hohe Genauigkeit: Die auf molekularen Markern basierende Identifizierungsmethode wird nicht durch Umweltfaktoren beeinflusst und hat eine höhere Genauigkeit und
Zuverlässigkeit.
Bestehende Technik 2
Zusammenfassung des technischen Inhalts: Korekar et al. (2010) entwickelten
RAPD-Primer, die in der Lage sind, spezifisch weibliche Proben von Hippophae rhamnoides (Rattenpflaumendorn) zu amplifizieren, und entwickelten auf dieser Grundlage SCAR-Marker (HrX1 und HrX2). Diese Marker ermöglichen die Identifizierung des Geschlechts in bestimmten Populationen. Sie haben jedoch Mängel: (1) Populationsbeschränkung: Die Anwendbarkeit dieser SCAR-Marker ist in verschiedenen geografischen Populationen sehr unterschiedlich, insbesondere beim tibetischen
Sanddorn, wo keine spezifische Amplifikation erreicht werden kann. (2) Unzureichende Anwendbarkeit: Die vorhandenen SCAR-Marker sind bei tibetischem
Sanddorn nicht universell einsetzbar und können nicht effektiv zwischen männlichen und weiblichen Tieren unterscheiden. (3) Hohe Komplexität: Die Abhängigkeit von komplexen genomischen Daten und teuren
Versuchsgeriten schränkt die breite Anwendung in der praktischen Produktion ein.
Im Vergleich zum Stand der Technik 2, die vorteilhaften Auswirkungen der vorliegenden
Erfindung: (1) Breite Anwendbarkeit: Die geschlechtsspezifischen molekularen Marker, die durch die vorliegende Erfindung entwickelt wurden, haben eine gute Anwendbarkeit in verschiedenen geographischen Populationen, insbesondere im tibetischen Sanddorn, der eine hohe
Genauigkeit aufweist. (2) Hohe Vielseitigkeit: Im Vergleich zu den bestehenden SCAR-Markern sind die molekularen Marker der vorliegenden Erfindung in der Lage, spezifische Amplifikation und
Geschlechtsdifferenzierung in mehreren tibetischen Sanddornarten durchzuführen. (3) Einfachheit: Die Methode zur Geschlechtsidentifizierung der vorliegenden Erfindung ist kostengünstig und der experimentelle Prozess ist einfach, was für eine groß angelegte
Produktion und kommerzielle Anwendung geeignet ist.
Bestehende Technik 3
Zusammenfassung des technischen Inhalts: Chawla et al. (2012) zeigten, dass
HrX1-Marker in der Lage sind, bei tibetischem Sanddorn, der in Indien geerntet wurde, genau zwischen männlich und weiblich zu unterscheiden. Diese Marker sind jedoch nicht universell in tibetischen Sanddornpopulationen in Tibet. Ihre Unzulänglichkeiten: (1) Regionale Begrenzung: HrX1-Marker sind nur in tibetischen Sanddornpopulationen innerhalb einer bestimmten geografischen Region wirksam und nicht in tibetischen
Sanddornpopulationen in der tibetischen Region. (2) Geringe Stabilität: Die
Amplifikationsergebnisse des Markers sind nicht stabil, und es gibt signifikante Unterschiede in 602341 verschiedenen Proben, was seine breite Anwendung beeinträchtigt. (3) Komplizierter Betrieb:
Der experimentelle Prozess ist kompliziert und zeitaufwendig, was es schwierig macht, seine
Anwendung in der praktischen Produktion zu fördern.
Vorteilhafte Wirkungen der vorliegenden Erfindung im Vergleich zum Stand der Technik3: (1) Hohe regionale Anpassungsfähigkeit: Der durch die vorliegende Erfindung entwickelte geschlechtschromosomspezifische molekulare Marker zeigt eine hohe Vielseitigkeit und
Genauigkeit in tibetischen Sanddornpopulationen in der tibetischen Region. (2) Hohe Stabilität: Die Amplifikationsergebnisse des Markers sind stabil und reproduzierbar, und es können konsistente Identifikationsergebnisse in verschiedenen Proben erzielt werden. (3) Vereinfachter Betrieb: Das experimentelle Verfahren der vorliegenden Erfindung ist einfach und schnell, für die Bedürfnisse der Geschlechtsidentifizierung in der tatsächlichen
Produktion anwendbar und hat einen hohen Werbewert;
Durch die obigen Vergleiche zeigt die vorliegende Erfindung signifikante Vorteile in der
Geschlechtsidentifikationstechnologie des tibetischen Sanddorns, bietet eine effiziente, genaue und kostengünstige geschlechtschromosomspezifische molekulare
Marker-Identifikationsmethode, überwindet die Mängel des Standes der Technik und hat eine breite Palette von Anwendungsmöglichkeiten.
Ausführungsform 4
In dieser Ausführungsform wird ein Verfahren zur Entwicklung eines molekularen
Marker-Primers zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:
S1: Probensammlung und DNA-Extraktion: Sammlung von molekularem Material des — nachzuweisenden tibetischen Sanddorns und Extraktion, um eine nachzuweisende DNA-Probe zu erhalten;
S2: Resequenzierung des gesamten Genoms und Datenverarbeitung, Screening der in S1 erhaltenen DNA-Proben, die dem Qualitätsstandard entsprechen und an ein biologisches
Unternehmen zur Bibliothekserstellung und Sequenzierung geschickt werden, unter
Verwendung populationsgenetischer ~~ Datenanalysemethoden zur Erkennung von
Populationsvariationen und Screening, um männliche und weibliche spezifische Fragmente zu erhalten:
S3: Screening und Verifizierung der geschlechtsbestimmenden Region: männerspezifische
Fragmente wurden mit Hilfe eines Python-Skripts gescreent, und die gescreenten molekularen
Marker wurden mit der Software IGV v.2.16 zur Visualisierung und Positionierung weiter verifiziert; Sequenzen mit Deletion nach Einfiigung langer Fragmente bei Männern wurden als alternative Regionen für das anschließende Primerdesign ausgewählt;
S4: Primerentwurf und -validierung: Es wurden Primer für geschlechtsgebundene
Regionen synthetisiert, und ein erstes Screening wurde sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Individuen durchgeführt;
SS: Validierung der Generalisierung der Primer: Die geschlechtsspezifischen Marker, die ursprünglich in S4 untersucht wurden, wurden auf ihre Generalisierung in einer größeren
Population getestet.
In dieser Ausführungsform handelt es sich bei dem molekularen Material in S1 um frische
Blattproben von einer Anzahl bestehender Verteilungsaufzeichnungspunkte, die aus derselben
Anzahl weiblicher bzw. männlicher Pflanzen ausgewählt wurden. Das molekulare Materiat/602341 wurde unter Verwendung von Kieselgel getrocknet und bei -20 Grad Celsius gelagert; die
Methode zur Extraktion der Gesamt-DNA aus dem molekularen Material war die
CTAB-Methode; in Bezug auf die Verteilungspunkte sind die in dieser Ausführungsform ausgewählten Verteilungspunkte diejenigen, die in Tabelle 1 gezeigt werden, sind aber nicht darauf beschränkt, nur die oben genannten Verteilungspunkte zu umfassen.
In dieser Ausführungsform besteht die Screening-Operation in S2 darin, die Qualität und
Konzentration der DNA-Proben unter Verwendung von 1,0 % Agarose-Gelelektrophorese und
NanoDrop2000 zu bewerten und DNA-Proben auszuwählen, die den Qualitätsanforderungen für die Sequenzierung entsprechen;
In dieser Ausführungsform handelt es sich bei der in S2 beschriebenen Sequenzierung um eine bipartite Sequenzierung auf einer Novaseq X Plus PE150-Plattform mit einer
Sequenzierungstiefe von 30x; die Rohdaten der Sequenzierung wurden einer Qualitätskontrolle und Datenbereinigung mit Fastp v0.21 unterzogen, und anschließend wurde die Datenqualität mit FastQCv0.11.9 bewertet; Die Identifizierung und Filterung von INDELs wurde mit dem
Genome Analysis Toolkit (GATK4) durchgeführt; die Daten wurden außerdem mit plinkv.1.9 gefiltert, um Loci mit einer Minor Allele Frequency (MAF) <0,01 und mehr als 50 % fehlenden
Genotypdaten auszuschließen; Die beschriebenen Identifizierungs- und Filterungsschritte umfassen: Entfernung von PCR-generierten repetitiven Sequenzen, Erkennung von
Einzelprobenvarianten, Erkennung von Populationsvarianten, Kennzeichnung von INDELs und
Filterung von Loci geringer Qualität; Die Filterkriterien wurden auf „QD < 2,0 || FS > 200,0
SOR > 10,0 || MQRankSum < -12,5 || ReadPosRankSum < -8,0“ festgelegt;
In dieser Ausführungsform wird S3 wie folgt durchgeführt: Über ein Python-Skript wird ein Screening nach den Variantenstellen mit Langfragment-Insertionen/Deletionen in den männlichen Proben durchgeführt; die gescreenten Stellen werden manuell mit der
IGV-Software inspiziert, und die Sequenzen mit Langfragment-Insertionen/Deletionen in den männlichen Proben werden als alternative Regionen für das anschließende Primerdesign ausgewählt;
In dieser Ausführungsform werden in S4 die entsprechenden Sequenzinformationen mit der Software seqkit v2.6.1 aus dem Referenzgenom extrahiert. Primer, von denen erwartet wird, dass sie Produkte mit einer Länge von 200-300 bp ergeben, wurden in großen Mengen unter
Verwendung von primer3 entworfen; die entworfenen Primer wurden anschließend mit dem
Referenzgenom durch blastn v2.5.0 verglichen, um ihre Spezifität zu überprüfen; Primer mit hoher Spezifität unter den entworfenen Primern wurden ausgewählt und von Bio;
In dieser Ausführungsform wurde in S5 die universelle Validierung wie folgt durchgeführt:
Ein Routine-PCR-Amplifikationsexperiment wurde an tibetischen Sanddorn-DNA-Proben (einschließlich 2 weiblicher und 2 männlicher Individuen) mit chargensynthetisierten Primern durchgeführt. Das PCR-Reaktionssystem hatte ein Gesamtvolumen von 30 uL und enthielt 15 uL Taq-Mix, 1 uL DNA-Template, 1 pL der jeweiligen Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 12 pL entionisiertes Wasser; Das PCR-Verfahren bestand aus einer Vordenaturierung bei 95°C für 3 min, gefolgt von einer Denaturierung bei 95°C für 15 s, einem Annealing bei 58°C für 15 s und einer Verlängerung bei 72°C für 30 s für insgesamt 35 Zyklen sowie einer abschließenden vollständigen Verlängerung bei 72°C für 5 min und Lagerung bei 4°C; Die PCR-Produkte wurden durch 2%ige Agarosegel-Flektrophorese aufgetrennt, und Primer, die effektiv zwischen männlichen und weiblichen Proben unterscheiden konnten, wurden anhand der Produktlänge ausgewählt; die ausgewählten Primer wurden verwendet, um die Genauigkeit von Proben aut V602341 einer Reihe von tibetischen Sanddornpopulationen zu überprüfen.
Die oben offengelegten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind nur als Hilfe bei der Darstellung der Erfindung gedacht. Die bevorzugten Ausführungsformen sind keine erschôpfende Aufzählung aller Details, noch beschränken sie die Erfindung auf die spezifischen
Ausführungsformen nur beschrieben. Viele Modifikationen und Variationen können in
Übereinstimmung mit dieser Beschreibung vorgenommen werden. Diese Ausführungsformen werden in dieser Beschreibung ausgewählt und speziell beschrieben, um die Prinzipien und praktischen Anwendungen der vorliegenden Erfindung besser zu erklären, so dass die Fachleute auf dem Gebiet, zu dem sie gehört, die Erfindung gut verstehen und nutzen können. Die vorliegende Erfindung ist nur durch die Ansprüche und deren gesamten Umfang und
Aquivalente begrenzt.

Claims (10)

Ansprüche LU602341
1. Eine Kombination von geschlechtschromosomenspezifischen molekularen Marker-Primern zur Identifizierung des Geschlechts von tibetischem Sanddorn, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleotidsequenzen wie in Hiti_08 und Hiti_17 gezeigt sind; Die in Hiti 08 gezeigte Primer-Sequenz, umfassend: eine Primer-Sequenz wie in Hiti_08-F gezeigt und eine Primer-Sequenz wie in Hiti_08-R gezeigt; Die in Hiti 17 gezeigte Primer-Sequenz, umfassend: eine Primer-Sequenz, wie in Hiti_17-F gezeigt, und eine Primer-Sequenz, wie in Hiti_17-R gezeigt.
2. Ein Verfahren zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn unter Verwendung der Kombination von molekularen Marker-Primern wie in Anspruch 1 beschrieben zur Identifizierung, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: S1: Probensammlung und DNA-Extraktion: Sammeln von undifferenzierten männlichen und weiblichen molekularen Materialien, die an der Verteilungsstelle des tibetischen Sanddorns nachgewiesen werden sollen, und Extraktion, um eine nachzuweisende DNA-Probe zu erhalten; S2: An der in S1 extrahierten nachzuweisenden DNA-Probe wurde ein herkömmliches PCR-Amplifikationsexperiment mit den in Hiti_08 und Hiti_17 gezeigten Primerkombinationen durchgeführt; S3: Die PCR-Produkte in S2 wurden durch 2%ige Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, und die Bestimmung von männlich und weiblich erfolgte anhand der Anzahl der Banden; diejenigen, die zwei Banden erzeugten, waren männliche Proben, und diejenigen, die eine Bande erzeugten, waren weibliche Proben.
3. Ein Verfahren zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das molekulare Material in S1 eine frische Blattprobe von einer Anzahl bestehender Verteilungsaufzeichnungspunkte ist, wobei die gleiche Anzahl weiblicher bzw. männlicher Pflanzen ausgewählt wird; das molekulare Material unter Verwendung von Kieselgel getrocknet und bei -20 Grad Celsius gelagert wird; und das Verfahren zur Extraktion der Gesamt-DNA aus dem molekularen Material das CTAB- Verfahren ist.
4. Ein Verfahren zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das PCR-Reaktionssystem in S2 wie folgt ist: die CR-Reaktion wird unter Verwendung eines Gesamtvolumens von 30 pL durchgeführt, das 15 pL Taq-Mix, 1 uL DNA-Matrize, 1 pL der jeweiligen Vorwärts- und Riuckwiartsprimer und 12 pL entionisiertes Wasser umfasst; Das PCR-Reaktionsverfahren in S2 wurde wie folgt beschrieben: Vordenaturierung bei 95°C fiir 3 min, gefolgt von Denaturierung bei 95°C für 15 s, Annealing bei 58°C für 15 s, Verlängerung bei 72°C für 30 s für insgesamt 35 Zyklen und schließlich vollständige Verlängerung bei 72°C für 5 min und Lagerung bei 4°C.
5. Ein Verfahren zum Entwerfen eines molekularen Markerprimers zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: S1: Probensammlung und DNA-Extraktion: Sammlung des zu untersuchenden molekularen Materials des tibetischen Sanddorns, das eindeutig zwischen den Geschlechtern unterschieden wurde, und Extraktion, um die zu untersuchende DNA-Probe zu erhalten; S2: Resequenzierung des gesamten Genoms und Datenverarbeitung, Screening der in S1 gewonnenen DNA-Proben, die dem Qualitätsstandard entsprechen und an ein biologische&U802341 Unternehmen zur Bibliothekserstellung und Sequenzierung geschickt werden, Anwendung der Methode der populationsgenetischen Datenanalyse zur Erkennung von Populationsvariationen und Screening zur Gewinnung des männerspezifischen Fragments; S3: Screening und Verifizierung der geschlechtsbestimmenden Regionen: frauenspezifische Fragmente wurden mithilfe von Python-Skripten gescreent, und die gescreenten molekularen Marker wurden mit der Software IGV v.2.16 zur Visualisierung und Lokalisierung weiter verifiziert; die Sequenzen mit langen Fragment-Insertionen oder -Deletionen bei den Männchen wurden als alternative Regionen für das Design der nachfolgenden Primer ausgewählt; S4: Design und Validierung der Primer: Es wurden Primer für geschlechtsgebundene Regionen synthetisiert, und ein erstes Screening wurde an einer Vielzahl von Individuen durchgeführt, bei denen eine klare Unterscheidung zwischen Männchen und Weibchen möglich war; SS: Validierung der Generalisierung der Primer: Die geschlechtsspezifischen Marker, die zunächst in S4 gescreent wurden, werden auf ihre Generalisierung in einem breiten Spektrum von Gruppen getestet, die eindeutig zwischen Männern und Frauen unterschieden haben.
6. Ein Verfahren zum Entwerfen eines molekularen Marker-Primers zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das molekulare Material in S1 eine frische Blattprobe von einer Anzahl bestehender Verbreitungsaufzeichnungspunkte ist, wobei die gleiche Anzahl von Stämmen weiblicher bzw. männlicher Pflanzen ausgewählt wird; Das molekulare Material wurde unter Verwendung von Kieselgel getrocknet und bei -20 Grad Celsius gelagert; das Verfahren zur Extraktion der Gesamt-DNA aus dem molekularen Material war das CTAB-Verfahren.
7. Ein Verfahren zum Entwerfen eines molekularen Marker-Primers zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Screening-Vorgang in S2 darin besteht: die Qualität und Konzentration der DNA-Proben unter Verwendung von 1,0 % Agarose-Gelelektrophorese und NanoDrop2000 zu bewerten und DNA-Proben auszuwählen, die die Qualitätsanforderungen für die Sequenzierung erfüllen; Bei der in S2 beschriebenen Sequenzierung handelte es sich um eine bipartite Sequenzierung auf der Novaseq X Plus PE150-Plattform mit einer Sequenzierungstiefe von 30x; die Rohdaten der Sequenzierung wurden einer Qualitätskontrolle und Datenbereinigung mit Fastp v0.21 unterzogen, und anschließend wurde die Datenqualität mit FastQCv0.11.9 bewertet; Die Identifizierung und Filterung von INDELs wurde mit dem Genome Analysis Toolkit (GATK4) durchgeführt; die Daten wurden außerdem mit plinkv.1.9 gefiltert, um Loci mit einer Minor Allele Frequency (MAF) <0,01 und mehr als 50 % fehlenden Genotypdaten auszuschließen; Die beschriebenen Identifizierungs- und Filterungsschritte umfassen: Entfernung von PCR-generierten repetitiven Sequenzen, Erkennung von Einzelprobenvarianten, Erkennung von Populationsvarianten, Kennzeichnung von INDELs und Filterung von Loci geringer Qualität; Die Filterkriterien wurden auf „QD < 2,0 || FS > 200,0 SOR > 10,0 || MQRankSum < -12,5 || ReadPosRankSum < -8,0“ festgelegt.
8. Ein Verfahren zum Entwerfen eines molekularen Marker-Primers zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass S3 wie folgt durchgeführt wird: Durch ein Python-Skript wird ein Screening nach den Varianten-Loci mit Langfragment-Insertion/Deletion in der männlichen
Probe durchgeführt; Die gescreenten Loci werden manuell mit Hilfe der IGV-Softwar& V602341 überprüft, um Sequenzen mit Langfragment-Insertionen/Deletionen in männlichen Proben als alternative Regionen für das nachfolgende Primerdesign auszuwählen.
9. Ein Verfahren zum Entwerfen eines molekularen Marker-Primers zur Identifizierung von männlichen und weiblichen Exemplaren des tibetischen Sanddorns gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in S4 entsprechende Sequenzinformationen aus einem Referenzgenom unter Verwendung der Software seqkit v2.6.1 extrahiert werden; Primer, von denen erwartet wird, dass sie Produkte mit einer Länge von 200-300 bp erzeugen, unter Verwendung von primer3 in großen Mengen entworfen werden; Die entworfenen Primer wurden anschließend mit Hilfe von blastn v2.5.0 mit dem Referenzgenom verglichen, um ihre Spezifität zu überprüfen; die Primer mit hoher Spezifität unter den entworfenen Primern wurden von dem biologischen Unternehmen ausgewählt und synthetisiert.
10. Ein Verfahren zum Entwerfen eines molekularen Marker-Primers zur Identifizierung von männlichem und weiblichem tibetischem Sanddorn nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in S5 die Operation zur universellen Validierung darin bestand, dass ein herkömmliches PCR-Amplifikationsexperiment an tibetischem Sanddorn-DNA-Proben (einschließlich 2 weiblicher und 2 männlicher Individuen) mit den chargensynthetisierten Primern durchgeführt wurde; Das PCR-Reaktionssystem hatte ein Gesamtvolumen von 30 uL und enthielt 15 uL Taq-Mix, 1 ul. DNA-Template, 1 ul der jeweiligen Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 12 uL entionisiertes Wasser, Das PCR-Verfahren bestand aus einer Vordenaturierung bei 95°C für 3 min, gefolgt von einer Denaturierung bei 95°C für 15 s, einem Annealing bei 58°C für 15 s und einer Verlängerung bei 72°C für 30 s für insgesamt 35 Zyklen sowie einer abschließenden vollständigen Verlängerung bei 72°C für 5 min und Lagerung bei 4°C; Die PCR-Produkte wurden durch 2%ige Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, und Primer, die effektiv zwischen männlichen und weiblichen Proben unterscheiden konnten, wurden anhand der Produktlänge ausgewählt; die ausgewählten Primer wurden verwendet, um die Genauigkeit von Proben aus einer Reihe von tibetischen Sanddornpopulationen zu überprüfen.
LU602341A 2024-07-18 2025-07-01 Eine Entwicklung und Anwendung eines geschlechtschromosomenspezifischen molekularen Markers bei tibetischem Bocksdorn LU602341B1 (de)

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