LU506900B1 - Ein lösliches rekombinantes Protein für die Behandlung der Präeklampsie - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der rekombinanten Proteintherapie, insbesondere auf ein rekombinantes Protein zur Behandlung eines Modells von Schwangerschaftsbluthochdruck, wobei das rekombinante Protein menschliches lösliches CD83 (sCD83) ist, das von der extrazellulären Strukturdomäne des membranartigen CD83-Moleküls abgeleitet ist; Nach der in vitro-Konstruktion und Reinigung der extrazellulären Strukturdomäne des Proteins wurde in Endotoxin (LPS)-induzierten Präeklampsie-ähnlichen Modellmäusen festgestellt, dass die Injektion von sCD83 den systolischen Blutdruck in der Schwanzarterie und die Proteinurie signifikant teilweise umkehrte und sich positiv auf den Schwangerschaftsausgang auswirkte, wobei die Anzahl und Größe der Föten sowie das Gewicht und die Größe der Plazenta in der Behandlungsgruppe zunahmen. Darüber hinaus verbesserte sCD83 signifikant die pathologischen Veränderungen in der Plazenta und im Nierengewebe der Modellmäuse. In der Behandlungsgruppe wurden die Serumspiegel von Entzündungsfaktoren herabreguliert, während entzündungshemmende Faktoren hochreguliert wurden und die Spiegel von pro-angiogenen Faktoren erhöht waren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Studie auf eine positive therapeutische Wirkung von sCD83 in einem Präeklampsie-Modell hinweist.
Description
Ein lösliches rekombinantes Protein für die Behandlung der Präeklampsie LUS06900
Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den Anwendungsbereich rekombinanter Proteine, insbesondere auf die therapeutische Wirkung von lebensfähigem CD83 auf Präeklampsie-
Modellmäuse.
Technologie im Hintergrund
Präeklampsie (PE) ist eine schwangerschaftsspezifische Erkrankung, die in der Regel nach der 20. Schwangerschaftswoche auftritt und durch Bluthochdruck, Proteinurie und
Multiorganschäden gekennzeichnet ist, die die Gesundheit von Mutter und Kind stark beeinträchtigen. Es wird angenommen, dass die Plazenta die Ursache für die Entstehung der PE ist, wobei die Hyperinfiltration extrachorionischer Trophoblasten und der gestörte Umbau der
Spiralarterien des Uterus die wichtigsten pathologischen Merkmale sind.
Die genaue Pathogenese ist jedoch noch nicht vollständig geklärt, so dass es an präzisen klinischen Interventionen mangelt. Die derzeitige Behandlung der Präeklampsie beschränkt sich auf symptomatische Maßnahmen wie krampflösende und blutdrucksenkende Mittel, die häufig nicht zufriedenstellend sind.
Inhalt der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein lösliches rekombinantes Protein für die
Behandlung von Präeklampsie bereitzustellen, um die Probleme zu lösen, die sich aus dem oben beschriebenen Stand der Technik ergeben.
Ein rekombinantes menschliches SCD83-Protein wurde zunächst in vitro durch rekombinantes Protein hergestellt. Zunächst wurde auf die Informationen zum menschlichen
CD83-Protein (uniprot.org) Bezug genommen, das insgesamt 205 Aminosäurereste (AAs) enthält, wobei 1-19AAs als Signalpeptid und 145-166A As als Transmembran-Strukturdomänen fungieren, und 1-143 AAs als Zielfragment für die Expression ausgewählt wurden. Nach der Reinigung wurde es fur die anschließenden Interventionsexperimente mit Modellmäusen verwendet.
Ein Präeklampsie-Modell wurde durch eine Endotoxin-Injektion nach der Geburt konstruiert, und sCD83 wurde an den Tagen 13 und 16 der Trächtigkeit in einer Dosis von 100ug bzw. 50ug verabreicht. Blut-, Plazenta- und Nierenproben wurden allen Mäusen am 19.
Die Ergebnisse zeigten, dass der systolische Blutdruck in der Schwanzarterie und das
Urinprotein in der mit sCD83 behandelten Gruppe signifikant niedriger waren als bei den
Modellmausen, und dass die Anzahl der Foten sowie die Größe der Foten und der Plazenta in der behandelten Gruppe signifikant höher waren als in der Kontrollmodellgruppe. Die Ergebnisse der
H&F-Färbung deuteten darauf hin, dass in der PE-Modellgruppe eine Zunahme der — Trophoblastenknôtchen in der Plazenta zu verzeichnen war, die nach der Behandlung mit sCD83 gelindert wurde; auBerdem deutete die PAS-Färbung darauf hin, dass der Zustand der Umformung der Spiralarterie in der Plazenta gelindert wurde; die Glomeruli in der PE-Modellgruppe waren teilweise konkav mit defekten Rändern, was nach der Behandlung mit sCD83 deutlich rückgängig gemacht werden konnte; Im Serum der behandelten Mäuse war der Spiegel des entzündungshemmenden Faktors IL-10 signifikant erhöht, während die Spiegel der entzündungsfôrdernden Faktoren IL-1ß, TNF-a, IL-6 und MCP-1 signifikant gesenkt wurden. IPS regulierte die mit der Angiogenese zusammenhängenden Zytokine sFlt-1 und sENG hoch und senkte PIGF, während die Behandlung mit sCD83 die Spiegel der oben genannten Faktoren teilweise umkehrte.
Die vorteilhaften Wirkungen der vorliegenden Erfindung im Vergleich zum Stand der Technik sind: LU506900
Das rekombinante Protein, das in der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen wird, verbessert einerseits die mit der Präeklampsie verbundenen Symptome, wie Bluthochdruck und Harnprotein, signifikant; es verbessert auch die schlechte Prognose und den pathologischen Zustand der
Plazenta und des Nierengewebes, zusätzlich zur deutlichen Umkehrung der Entzündungs- und
Angiogenese-bezogenen Faktoren im Serum.
Detaillierte Beschreibung
Um den Zweck der vorliegenden Erfindung, die technische Lösung für eine klare und vollständige Beschreibung, und die Vorteile klarer zu verstehen, sollte es verstanden werden, dass die spezifischen Ausführungsformen hier beschrieben sind ein Teil der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, und nicht alle der Ausführungsformen. Sie dient nur dazu, die
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu erläutern, und wird nicht dazu verwendet, die
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung einzuschränken, und alle anderen
Ausführungsformen, die von Personen mit normalem Fachwissen auf dem Gebiet unter der
Voraussetzung, dass keine schöpferische Arbeit geleistet wird, erhalten werden, fallen unter den
Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. 8-12 Wochen alte männliche und weibliche C57BL/6-Wildtyp-Mäuse wurden in einem
Verhältnis von 1:2 zusammen untergebracht, und durch Vaginalmikroskopie nachgewiesene
Spermatozoen wurden als 0 Tage trächtig erfasst. Die trächtigen Mäuse wurden in folgende
Gruppen eingeteilt: Blanko-Kontrollgruppe; LPS-induzierte PE-Modellgruppe: am 13. Tag der
Trächtigkeit wurde LPS (1,0 ug/kg, gelöst in 200 ul Kochsalzlösung, 200 ul/h) über die
Schwanzvene injiziert; sCD83-behandelte Gruppe: sCD83 (100 ug/jeweils) wurde 4 Stunden nach der LPS-Behandlung über die Schwanzvene injiziert. Am 16. Tag der Trächtigkeit wurde die obige
Injektion einmal wiederholt (50 ug/Maus). sCD83 wurde in der LPS-Modellgruppe in das gleiche
Volumen an Kochsalzlösung injiziert.
Alle Mäuse wurden unter Standardumgebungsbedingungen mit einer Raumtemperatur von 20-26°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40-70% und einem 12-Stunden-/12-Stunden-
Dunkel-Licht-Zyklus untergebracht. Der systolische Blutdruck in der Schwanzarterie wurde an den Tagen 13, 15 und 18 der Trächtigkeit gemessen. Nachdem die Mäuse 24 Stunden lang in
Stoffwechselkéfigen untergebracht worden waren, wurde am Tag 18 der Trächtigkeit Urin für die
Messung von Urinprotein gesammelt. Am 19. Tag der Trächtigkeit wurden alle Mäuse betäubt und anschließend hingerichtet. Plazenta, Nierengewebe und fötale Mäuse wurden sorgfältig gesammelt.
Zunächst wurde auf die Informationen des menschlichen CD83-Proteins (uniprot.org) Bezug genommen, das insgesamt 205 Aminosäurereste (AA) enthält. 1-19AA sind Signalpeptide, 145- 166AA sind transmembrane Strukturdomänen, und 1-143AA wurden als Zielfragmente für die
Expression ausgewählt. Die Gensynthese wurde nach der Codon-Optimierung durchgeführt, und das Zielfragment wurde durch doppelten Verdau (EcoRI/HindIII) in den pATX2-Vektor subkloniert, wobei am C-Terminus ein 6*His- oder GST-Tag hinzugefügt wurde. Die
Konstruktsequenz lautet wie folgt: pATX2+ EcoRI+ kozak(gccacc) + Signalpeptid + Zielprotein + 6*His (oder GST) + HindIII (MSR GLQ LLL LSC AYS LAP ATP EVK VAC SED VDL PCT
APW DPQ VPY TVS WVK LLE GGE ERM ETP QED HLR GQH YHQ KGQ NGS FDA PNE
RPY SLK IRN TTS CNS GTY RCT LQD PDG QRN LSG KVI LRV TGC PAQ RKE ETF KKY
RAG SHH HHH H). Anschließend wurden HEK293-Zellen verwendet, um die Zielproteine zu exprimieren, und es wurden Expressionsreinigungstests und Amplifikation durchgeführt, um rekombinante Proteine zu erhalten.
Überwachung des Blutdrucks und der Urinproteintests: Der systolische Blutdruck (SBP) }:/506900 der Schwanzarterie der Ratte (Maus) wurde jeden Tag nach der Verabreichung des Arzneimittels mit einem nicht-invasiven Blutdruckmessgerät gemessen. Urinprotein wurde alle 3 Tage nach erfolgreicher Modellierung nachgewiesen. Trächtige Ratten wurden vorab in Stoffwechselkäfigen untergebracht, 24 Stunden lang wurde Urin gesammelt, und der BCA-Proteinquantifizierungskit wurde zum Nachweis der Urinproteinwerte verwendet.
Trächtige Ratten wurden betäubt und am 19. Tag der Trächtigkeit hingerichtet, und es wurde
Blut aus dem Herzen entnommen, zentrifugiert und zur Messung der Konzentrationen relevanter
Entzündungsfaktoren verwendet. Bei jeder trächtigen Ratte wurde die Anzahl der Fôten gezählt, und die Plazenta und das Nierengewebe wurden aufbewahrt; die Fôten und die Plazenta wurden gewogen und protokolliert. Fin Teil des Plazenta- und Nierengewebes wurde in 4 %
Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettete Scheiben geschnitten. Nieren- und
Plazentagewebeschnitte wurden mit H&E (Hämatoxylin-Fosin-Färbung) gefärbt, um die
Schädigung zu beurteilen; die PAS-Färbung von Schnitten senkrecht zur Achse der endometrialen
Implantationsstelle wurde verwendet, um die Fibrinoidablagerungen in der Wand der spiralformigen Uterusarterie zu beurteilen.
H&E-Farbung: Paraffinschnitte wurden nacheinander in Xylol und Gradientenalkohol entparaffiniert und dann 5 Minuten lang mit Hämatoxylin gefärbt, in Leitungswasser gespült und 1 Minute lang mit Eosin-Färbelôsung gefärbt. Schließlich wurden die Schnitte mit Ethanol dehydriert, mit Xylol transparent gemacht und für die mikroskopische Betrachtung mit
Neutralharz versiegelt.
PAS-Färbung: Gemäß den Anweisungen des Kits wurde zunächst tropfenweise
Periodsäurelôsung zur Reaktion in einer feuchten Box hinzugefügt, um Licht zu vermeiden, und anschließend wurde tropfenweise Schiff-Reagenz hinzugefügt, um Lichtfärbung für 1 Stunde zu vermeiden. Tropfen der Hämatoxylin-Färbelôsung hinzufügen, mit destilliertem Wasser abspülen und trocknen, den Film mit Versiegelungslôsung versiegeln und unter dem Mikroskop beobachten.
Zytokin-Assay: Mit einem ELISA-Kit wurde der Gehalt an Zytokinen wie IL-1ß, TNF-a, IL- 6, MCP-1, sFlt-1, Seng und PIGF im Serum trächtiger Ratten bestimmt.
Obwohl Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gezeigt und beschrieben worden sind, wird der Fachmann erkennen, dass eine Vielzahl von Änderungen, Modifikationen,
Substitutionen und Variationen an diesen Ausführungsformen vorgenommen werden kônnen, ohne von dem Prinzip und dem Geist der vorliegenden Erfindung abzuweichen, deren Umfang durch die beigefügten Ansprüche und deren Aquivalente begrenzt ist.
Claims (2)
1. Ein lösliches rekombinantes Protein zur Behandlung von Präeklampsie, dadurch gekennzeichnet, dass: das rekombinante Protein von der extrazellulären Strukturdomäne (Aminosäurerestsequenz 1-143) des menschlichen CD83 abgeleitet ist.
2. Eine pflanzliche Zusammensetzung zur Behandlung der Plateau-Krankheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass: das lösliche rekombinante Protein gute therapeutische Wirkungen auf die Symptome und die Prognose in einer Präeklampsie-Modellmaus zeigt.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LU506900A LU506900B1 (de) | 2024-04-12 | 2024-04-12 | Ein lösliches rekombinantes Protein für die Behandlung der Präeklampsie |
Applications Claiming Priority (1)
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| LU506900A LU506900B1 (de) | 2024-04-12 | 2024-04-12 | Ein lösliches rekombinantes Protein für die Behandlung der Präeklampsie |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LU506900B1 true LU506900B1 (de) | 2024-10-14 |
Family
ID=93063233
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LU506900A LU506900B1 (de) | 2024-04-12 | 2024-04-12 | Ein lösliches rekombinantes Protein für die Behandlung der Präeklampsie |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| LU (1) | LU506900B1 (de) |
-
2024
- 2024-04-12 LU LU506900A patent/LU506900B1/de active IP Right Grant
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Effective date: 20241014 |