LU506452B1

LU506452B1 - Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung

Info

Publication number: LU506452B1
Application number: LU506452A
Authority: LU
Inventors: Zhiping Guo; Shilian Wu
Original assignee: Univ Lishui
Priority date: 2024-02-25
Filing date: 2024-02-25
Publication date: 2024-08-26

Abstract

Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung, umfassend die folgenden Schritte: S1 Konservierungsvorbereitung, S2 5 Beladungsbehandlung, S3 Ultra-Niedrigtemperatur-Konservierung, S4 Wiederherstellung der Kultur und S5 Berechnung der Regenerationsrate; Schritt S1 Konservierungsvorbereitung, umfassend die folgenden Schritte: S11: Farbstoffvorbereitung; S12: Konservierungslösungsvorbereitung; S13: Zellvorbereitung; und S14: Bestimmung der Intensität; Schritt S2 Beladungsbehandlung mit den folgenden Schritten: S21: Beladung der Kultur; S22: Beladung der Zellen; S23: Verglasungsbehandlung; S24: Behandlungskonservierung; Schritt S3 Tiefsttemperaturkonservierung mit den folgenden Schritten: S31: Lagerung bei Tiefsttemperaturanforderung; S32: Beobachtung bei Tiefsttemperatur; S33: Auswahl bei Tiefsttemperatur; Schritt S4: Wiederherstellungskultur mit den folgenden Schritten: S41: Auftauen der Zellen; S42: Dunkelkultur; S43: Zellkonservierung; Schritt S5: Berechnung der Regenerationsrate; diese Methode zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung kann die Vor- und Nachteile des Schemas der Ultra-Niedrigtemperatur-Konservierung schnell ermitteln und den optimalen Zeitpunkt und die Intensität der Behandlung bestimmen.

Description

Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung LU506452

Technischer Bereich

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das technische Gebiet der Konservierung von tierischen Zellen, insbesondere auf ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der

Zellkonservierung.

Technologie im Hintergrund

Zu den gängigen Methoden der Tierzellkultur gehören die Batch-Kultur, die Batch-

Replenishment-Kultur und die Perfusionskultur. Bei der Batch-Kultur werden Zellen und

Kulturmedium einmalig in einen Kulturreaktor gegeben, in dem die Zellen weiter wachsen, während sich Produkte bilden, und die Kultur nach einer gewissen Zeit beendet wird; Bei der

Herstellung von biologischen Arzneimitteln wie z. B. Antikörpern bezieht sich die Ultra-

Tieftemperatur-Konservierung im Allgemeinen auf die Technologie und Methode der

Konservierung von biologischem Material unter Verwendung von Flüssigstickstoff (-196 °C) oder

Flüssigstickstoffdampf, bei der alle biochemischen Reaktionen in den Zellen bei der Temperatur des Flüssigstickstoffs vorübergehend gestoppt werden, so dass die Zellen für einen theoretisch unbegrenzten Zeitraum konserviert werden können. Die Technologie der Ultra-Niedrigtemperatur-

Konservierung findet breite Anwendung bei der Langzeitkonservierung von Mikroorganismen und tierischen Keimplasma-Ressourcen;

Die Technik der Ultra-Tieftemperatur-Konservierung von tierischen Zellen zeichnet sich durch hohe genetische Stabilität, hohe Konservierungseffizienz, Schnelligkeit und Einfachheit im

Vergleich zur bestehenden Gewebekulturkonservierung aus. Allerdings hat die Methode eine komplizierte Operation Prozess, und die tierischen Zellen brauchen mehr als 2 Wochen oder mehr, um wieder Kultur nach der Ultra-Niedrigtemperatur-Konservierung zu beurteilen, ob die Ultra-

Niedrigtemperatur-Konservierung Methode erfolgreich ist oder nicht, so gibt es einen Bedarf für eine Methode zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung, um die oben genannten Probleme zu lösen.

Inhalt der Erfindung

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung der

Regenerationsrate der Zellkonservierung bereitzustellen, um die oben genannten Probleme der

Hintergrundtechnologie zu lösen.

Um das obige Ziel zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung die folgende technische

Lösung bereit: ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung, umfassend die folgenden Schritte: Schritt S1 Konservierungsvorbereitung, Schritt S2

Beladungsbehandlung, Schritt S3 Ultra-Niedrig-Temperatur-Konservierung, Schritt S4

Wiederaufnahme der Kultivierung und Schritt SS Berechnung der Regenerationsrate;

Schritt S1 Konservierungsvorbereitung, umfassend die folgenden Schritte:

S11: Farbstoffzubereitung: Fluoresceindiacetat oder eine Mischung aus Fluoresceindiacetat und Propidiumjodid wird zur Herstellung eines Zellfarbstoffs ausgewählt:

S12: Herstellung einer Konservierungslôsung, ausgewähltes Albumin, niedermolekulares

Heparin-Natrium, Alginat und Kochsalzlôsung wurden entsprechend dem Verhältnis gemischt, um eine Zellkonservierungslôsung herzustellen;

S13: Zellpräparation, die extrahierten und behandelten Testzellen wurden auf MS-Medium vorgebeugt und eine Woche lang bei 22-25°C unter den Kulturbedingungen von 12h/12h

Tag/Nacht-Zyklus nach einer Niedrigtemperaturbehandlung bei 4-6°C kultiviert;

S14: Bestimmung der Intensität, die zu bestimmenden Werte wurden ausgewählt und für die anschließende Bestimmung der Regenerationsrate aufgezeichnet; LU506452

Schritt S2: Beladungsbehandlung, bestehend aus den folgenden Schritten:

S21: Beladen der Kulturen, Behandlung der aus 2 hergestellten Zellkonservierungslôsung auf eine geeignete Temperatur von 25C°;

S22: Zellbeladung, Einbringen der kultivierten, untersuchten Zellen in die

Konservierungslôsung und deren Behandlung für 18-25 Minuten bei 25C°, und Bindung des

Fluoreszenzfarbstoffs an die kultivierten Zellen;

S23: Vitrifikation, nach Beendigung der Bindung des Fluoreszenzfarbstoffs an die kultivierten Zellen wird die Stammspitze in eine vorgekühlte PVS2-Lôsung überführt und 25-30

Minuten auf Eis behandelt;

S24: Behandlung und Konservierung, nach der Vitrifizierung der untersuchten Zellen werden sie mit heilendem Gewebe beladen;

Schritt S3: Ultra-Niedrig-Temperatur-Konservierung mit den folgenden Schritten:

S31: Ultra-Tieftemperatur-Anforderung, Auswahl einer Flüssigkeit für die Ultra-

Tieftemperatur-Konservierung von Zellen, Auswahl von flüssigem Stickstoff und Einlegen des verglasten Heilgewebes in flüssigen Stickstoff zur Konservierung;

S32: Beobachtung bei ultra-niedriger Temperatur, Überführung des Assays in ein

Gefrierrôhrchen, wenn keine Blasen mehr entstehen, und Einlegen in flüssigen Stickstoff für 30

Minuten;

S33: Ultra-Niedrigtemperatur-Selektion: Die Zellen des Assays wurden induziert und 2

Woche;

Schritt S4: Die Rückgewinnungskultur umfasst die folgenden Schritte:

S41: Auftauen der Zellen, wobei die Assay-Zellen aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und direkt in die Entladungslôsung überführt und 20-30 Minuten lang bei 25°C behandelt werden;

S42: Dunkelkultur, die aufgetauten Assay-Zellen werden in das Erholungsmedium fir die

Erholungskultur übertragen, und die ersten 7 Tage der Erholungskultur sind Dunkelkultur;

S43: Zellkonservierung, nach der Dunkelkultur werden die Zellen unter Licht weiter kultiviert;en lang in einem Induktionsmedium kultiviert;

Schritt SS: Berechnung der Regenerationsrate, bestehend aus den folgenden Schritten:

S51: Lebendzellrate, wobei Fluoresceindiacetat nach Bindung an lebende Zellen unter Licht bei einer Wellenlänge von 488 nm mit grüner Fluoreszenz angeregt wird;

S52: Rate der toten Zellen, wobei Propidiumiodid nach Bindung an die toten Zellen in den untersuchten Zellen nach Inkubation unter Licht eine rote Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 545 nm anregt;

S53: Gesamtberechnung, basierend auf der Fluoreszenzrate, die mit den ausgewählten

Assaywerten erzeugt wird, berechnet nach der Lebensfähigkeitsformel.

Vorzugsweise umfasst der Schritt S23 außerdem eine Verglasungsbehandlung, wobei die

Verglasungslosung (Losung 2) WPM-Basismedium, 300 g/L Glycerin, 150 g/L Ethylenglykol, 150 g/L Dimethylsulfoxid und 0,4 mol/L Saccharose enthält.

Vorzugsweise handelt es sich bei der in Schritt S41 verwendeten Lösung zum Auftauen und

Entladen der Zellen um ein MS-Kulturmedium, das 2 M Glycerin und 0,4 M Saccharose enthält.

Vorzugsweise umfasst die Herstellung der Konservierungslôsung in Schritt S12 außerdem die folgenden Schritte:

S121, Herstellung einer 0,1 g/ml Alginat-Kochsalzlôsung,

S122, Herstellung der Konservierungslôsung: Ansaugen von 0,9%iger Kochsalzlôsung,

Zugabe von menschlichem Blutalbumin, Natriumheparin und der erhaltenen physiologische />06452

Alginat-Kochsalzlösung nacheinander und Mischen.

Vorzugsweise werden in Schritt S122 1,0 g Alginat abgewogen, 10 ml 0,9 %ige

Kochsalzlösung zugegeben, gut gemischt und durch einen 0,22 um-Filter gegeben; 80 ml 0,9 %ige

Kochsalzlôsung absaugen, nacheinander 5 ml menschliches Blutalbumin mit einem Masse-

Volumen-Verhältnis von 20 %, 32 ul Natriumheparin von 12 500 u/2 ml, 15 ml der erhaltenen

Alginat-Kochsalzlôsung absaugen und gut mischen, um 100 ml Zellkonservierungslôsung zu erhalten.

Vorzugsweise wird die Verglasung in Schritt S23 auf Eis durchgeführt, wobei die Verglasung 30 Minuten lang erfolgt.

Vorzugsweise ist beim Mischen das Volumenverhältnis von Testzellen zu

Konservierungslosung 1:8 und beim Mischen das Volumenverhältnis von Testzellen zu

Zellfarbstoff 1:2.

Vorzugsweise wird das Zellrickgewinnungsmedium in Schritt S4, der

Rickgewinnungskultur, durch die Etablierung eines Mediums gewonnen.

Vorzugsweise ist das Rückgewinnungsmedium ein MS-Festmedium, das 30 g/L Saccharose, 1,0 mg/L BA und 3 g/L Phytogel enthält.

Vorzugsweise ist das Rückgewinnungsmedium ein flüssiges MS-Medium, das 1,2 M

Saccharose enthält.

Im Vergleich zum Stand der Technik ist die vorliegende Lösung darauf ausgelegt, die

Regenerationsrate der Zellkonservierung mit den folgenden vorteilhaften Effekten zu bestimmen: (1) Die Regelung kann schnell beurteilen, die Vor- und Nachteile der Ultra-

Niedrigtemperatur-Konservierung Schema, und bestimmen die optimale Behandlung Zeit und

Intensität; In der vorliegenden Erfindung kann die Detektion von Fluoreszenz durch ein konfokales

Laserscanning-Mikroskop durchgeführt werden, wodurch die Funktion des konfokalen

Laserscanning-Mikroskops effektiv erweitert wird und gleichzeitig eine theoretische

Unterstützung fiir den Entwurf eines Schemas zur Konservierung von Tierzellen bei ultra-niedriger

Temperatur bereitgestellt wird, was von großer Bedeutung für die Entwicklung einer neuen

Generation von Technologien zur Konservierung bei ultra-niedriger Temperatur ist. (2) Das Protokoll 16st die Veränderungen in der Mikrotubuli-Struktur von Zellen während des

Prozesses der Ultra-Tieftemperatur-Konservierung, was die Forschungslücke in der Zytologie während des Prozesses der Ultra-Tieftemperatur-Konservierung füllt.

Beschreibung der beigefiigten Zeichnungen

Bild 1 zeigt ein Flussdiagramm der konstruktiven Lösung der vorliegenden Erfindung.

Detaillierte Beschreibung

Die technischen Lösungen in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im

Folgenden in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen in den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung klar und vollständig beschrieben, und es ist offensichtlich, dass die beschriebenen Ausführungsformen nur einen Teil der Ausführungsformen der vorliegenden

Erfindung und nicht alle Ausführungsformen darstellen. Ausgehend von den Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fallen alle anderen Ausführungsformen, die von einer Person mit gewöhnlicher Fachkenntnis auf dem Gebiet der Technik ohne schopferische Arbeit erzielt werden, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.

Unter Bezugnahme auf Bild 1 wird eine erste technische Lösung für die vorliegende

Erfindung bereitgestellt: ein Verfahren zur Bestimmung einer Regenerationsrate der

Zellkonservierung, umfassend die Schritte S1 Konservierungsvorbereitung, 4506452

Beladungsbehandlung, S3 Ultra-Niedrig-Temperatur-Konservierung, S4 Wiederherstellung der

Kultur und S5 Berechnung der Regenerationsrate;

Schritt S1: Konservierungspräparat, bestehend aus den folgenden Schritten:

S11: Farbstoffzubereitung, Auswahl von Fluoresceindiacetat oder einer Mischung aus

Fluoresceindiacetat und Propidiumjodid zur Herstellung eines Zellfarbstoffs:

S12: Herstellung einer Konservierungslösung, Auswahl von Albumin, niedermolekularem

Heparin-Natrium, Alginat und Kochsalzlösung, die in einem bestimmten Verhältnis gemischt werden, um eine Zellkonservierungslösung herzustellen;

Tag/Nacht-Zyklus nach einer Niedrigtemperaturbehandlung bei 4-6°C kultiviert;

S14: Bestimmung der Intensität, die zu bestimmende Werte wurden ausgewählt und für die anschließende Bestimmung der Regenerationsrate aufgezeichnet;

Schritt S2: Beladungsbehandlung, bestehend aus den folgenden Schritten:

S21: Beladen der Kulturen, Behandlung der aus 2 hergestellten Zellkonservierungslösung auf eine geeignete Temperatur von 25C°;

S22: Zellbeladung, Einbringen der kultivierten, untersuchten Zellen in die

Konservierungslösung und deren Behandlung für 18-25 Minuten bei 25C°, und Bindung des

Fluoreszenzfarbstoffs an die kultivierten Zellen;

Minuten auf Eis behandelt;

Schritt S3: Ultra-Niedrig-Temperatur-Konservierung mit den folgenden Schritten:

Minuten;

Wochen lang in einem Induktionsmedium kultiviert;

Schritt S4: Die Rückgewinnungskultur umfasst die folgenden Schritte:

S43: Zellkonservierung, nach der Dunkelkultur werden die Zellen unter Licht weiter kultiviert;

S52: Rate der toten Zellen, wobei Propidiumiodid nach Bindung an die toten Zellen in den untersuchten Zellen nach Inkubation unter Licht eine rote Fluoreszenz bei einer Wellenlänge vor}506452 545 nm anregt,

Assaywerten erzeugt wird, berechnet nach der Lebensfähigkeitsformel. 5 Umfasst auch Schritt S23 Verglasungs-Behandlung, wobei die Verglasungslôsung 2 Lösung

WPM-Basismedium, 300 g/L Glycerin, 150 g/L Ethylenglykol, 150 g/L Dimethylsulfoxid und 0,4 mol/L Saccharose umfasst, wobei WPM das Basismedium ist, und ferner die folgenden

Komponenten umfasst: 2,4D 1 mg/L, Polyvinylpyrrolidon (PVP) 1 g/L, Casein (ch) 1 g/L,

Aktivkohle (AC) 1 g/L, Saccharose (SUC) mit 3 Massenprozent und Agar mit 0,3 Massenprozent.

Die vorliegende Erfindung schränkt die Quelle der Synzytialembryonen der tierischen Zellen nicht spezifisch ein, und die Induktionskultur der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine

Dunkelkultur, und die Temperatur der Dunkelkultur beträgt vorzugsweise 25°C. Die vorliegende

Erfindung hat keine besondere Einschränkung hinsichtlich des Herstellungsverfahrens des

Induktionsmediums, das durch Mischen der Komponenten, Sterilisieren bei 121°C und Einstellen des pH-Werts auf 5,8 hergestellt werden kann.

Schritt S41: Auftauen der Zellen, wobei die Entladungslôsung eine MS-Kulturlôsung 1st, die 2M Glycerin und 0,4M Saccharose enthält.

Der Schritt S12, Herstellung der Konservierungslôsung, umfasst außerdem die folgenden

Schritte:

S121, Herstellen einer 0,1 g/ml Alginat-Salzlôsung;

S122, Herstellen der Konservierungslosung: Ansaugen von 0,9%iger Kochsalzlôsung, aufeinanderfolgende Zugabe von Humanalbumin, Natriumheparin und der erhaltenen

Alginatsalzlôsung und Mischen.

In diesem Schritt S122 wurden 1,0 g Alginat abgewogen, 10 ml 0,9 %ige Kochsalzlôsung hinzugefügt, gut gemischt und durch einen 0,22-um-Filter gegeben; 80 ml 0,9 %ige

Kochsalzlôsung absaugen und nacheinander 5 ml menschliches Blutalbumin mit einem Masse-

Volumen-Verhältnis von 20 %, 32 ul Natriumheparin von 12.500 u/2 ml, 15 ml der erhaltenen

Alginat-Kochsalzlôsung absaugen und gut mischen, um 100 ml der Zellkonservierungslôsung zu erhalten. In der ultrasauberen Bank wurde in das sterilisierte 1,5-ml-Zentrifugenrôhrchen 1 ml

WPM-Flüssigmedium (mit 3 % Saccharose, pH-Wert 5,8) gegeben, wobei die Skala mit dem untersten Teil der konkaven Flüssigkeitsoberfläche von 1 ml übereinstimmte. Verwenden Sie eine

Pinzette, um das embryonale Heilungsgewebe von P. thunbergii in gutem Wachstumszustand zu holen, übertragen Sie auf 1,5 ml Zentrifugenrôhrchen, bis der unterste Teil der konkaven

Flüssigkeitsoberfläche gleich der Skala 1,25 ml Skala war, messen Sie das Volumen von P. thunbergii embryonalen Heilungsgewebe von 0,25 ml; nach dem Laden Behandlung, Verglasung,

Ultra-Niedrigtemperatur-Konservierung, Auftauen im Wasserbad bei 40°C, Entladen Behandlung,

Waschen und Wiederaufnahme Kultur.

Der Schritt S23 Verglasung wird auf Fis durchgeführt und die Verglasung wird 30 Minuten lang durchgeführt.

Beim Mischen beträgt das Volumenverhältnis von Testzellen zu Konservierungslôsung 1:8, und beim Mischen beträgt das Volumenverhätnis von Testzellen zu Zellfarbstoff 1:2.

In Schritt S4, der Rückgewinnungskultur, wird das Zellrückgewinnungsmedium durch die

Etablierung des Mediums gewonnen.

Bei dem beschriebenen Erholungsmedium handelte es sich um ein festes MS-Medium, das 30 g/L Saccharose, 1,0 mg/L BA und 3 g/L Phytogel enthielt. FDA konnte sich an lebende Zellen binden und zur Emission von grüner Fluoreszenz bei 488 nm angeregt werden, und je stärker dt&/506452

Fluoreszenz, desto stärker die Lebensfähigkeit der Zellen. FDA (10 ug/mL) wurde zur Markierung der lebenden Zellen verwendet, und mit dem konfokalen Lasermikroskop wurden die

Fluoreszenzveränderungen des embryonalen Heilungsgewebes von Thicknesse nach einer

Erholungszeit von O h, 1 Tag, 2 Tagen, 3 Tagen, 4 Tagen, 5 Tagen und 6 Tagen beobachtet. Die

Ergebnisse sind in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Die Lebensfähigkeit der Zellen nahm zunächst während der Erholungskultur ab, die niedrigste Zelllebensfähigkeit war nach 48 Stunden erreicht und begann dann anzusteigen, und der Lebensfähigkeitswert nach 6 Tagen lag nahe an der

Kontrolle, so dass 48 Stunden der genaueste Zeitpunkt für die Bestimmung der

Lebensfähigkeitsrate des embryonalen Heilgewebes von Houpao war.

Unter Bezugnahme auf Bild 1 wird eine erste technische Lôsung für die vorliegende

Erfindung bereitgestellt: ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der

Zellkonservierung, das die folgenden Schritte umfasst: S1 Konservierungsvorbereitung, S2

Beladungsbehandlung, S3 Ultra-Niedrigtemperatur-Konservierung, S4 Wiederherstellung der

Kultur und S5 Berechnung der Regenerationsrate;

Schritt S1: Konservierungspräparat, bestehend aus den folgenden Schritten:

Fluoresceindiacetat und Propidiumjodid zur Herstellung eines Zellfarbstoffs:

S12: Herstellung einer Konservierungslôsung, Auswahl von Albumin, niedermolekularem

Heparin-Natrium, Alginat und Kochsalzlôsung, die in einem bestimmten Verhältnis gemischt werden, um eine Zellkonservierungslôsung herzustellen;

Tag/Nacht-Zyklus nach einer Niedrigtemperaturbehandlung bei 4-6°C kultiviert;

S14: Bestimmung der Intensität, die zu bestimmenden Werte wurden ausgewählt und für die anschließende Bestimmung der Regenerationsrate aufgezeichnet;

Schritt S2: Beladungsbehandlung, bestehend aus den folgenden Schritten:

S22: Zellbeladung, Einbringen der kultivierten, untersuchten Zellen in die

Fluoreszenzfarbstoffs an die kultivierten Zellen;

S23: Vitrifikation, nach Beendigung der Bindung des Fluoreszenzfarbstoffs an die kultivierten Zellen wird die Stammspitze in eine vorgekühlte PVS2-Lösung überführt und 25-30

Minuten auf Eis behandelt;

Schritt S3: Ultra-Niedrig-Temperatur-Konservierung mit den folgenden Schritten:

S31: Ultra-Tieftemperatur-Anforderung, Auswahl einer Flüssigkeit für die Ultra-Tiefkühl-

Konservierung von Zellen, Auswahl von flüssigem Stickstoff und Einbringen des vitrifizierten

Heilungsgewebes in flüssigen Stickstoff zur Konservierung;

Gefrierröhrchen, wenn keine Blasen mehr entstehen, und Einlegen in flüssigen Stickstoff für 30

Minuten;

Wochen lang in einem Induktionsmedium kultiviert; LUS06452

Schritt S4: Die Rückgewinnungskultur umfasst die folgenden Schritte:

S42: Dunkelkultur, die aufgetauten Assay-Zellen werden in das Erholungsmedium für die

S53: Gesamtberechnung auf der Grundlage der mit den ausgewählten Testwerten erzeugten

Fluoreszenzrate gemäß der Lebensfähigkeits-Formel.

Beim Mischen beträgt das Volumenverhältnis der Assay-Zellen zur Konservierungslösung 1:8, und beim Mischen beträgt das Volumenverhältnis der Assay-Zellen zum Zellfarbstoff 1:2.

Das Rückgewinnungsmedium ist ein flüssiges MS-Medium, das 1,2 M Saccharose enthält.

Der Unterschied zur ersten technischen Lösung besteht darin, dass die Rückgewinnung der untersuchten Zellen mit Hilfe eines geformten Mediums erreicht wird.

Die übrigen Schritte der zweiten mittleren technischen Lösung sind die gleichen wie bei der ersten mittleren technischen Lösung.

Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die Details der oben beschriebenen beispielhaften Ausführungsformen beschränkt ist und dass sie in anderen spezifischen Formen realisiert werden kann, ohne vom Geist oder den wesentlichen Merkmalen der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Dementsprechend sind die Ausführungsformen als beispielhaft und in jeder Hinsicht nicht einschränkend zu betrachten, und der Umfang der vorliegenden Erfindung wird durch die beigefügten Ansprüche und nicht durch die vorstehende

Beschreibung begrenzt und soll daher alle Variationen umfassen, die unter die Bedeutung und den

Umfang der entsprechenden Elemente der Ansprüche fallen. Etwaige beigefügte

Kennzeichnungen in den Ansprüchen sind nicht als Einschränkung der Ansprüche, auf die sie sich beziehen, zu betrachten.

Darüber hinaus sollte verstanden werden, dass, obwohl diese Spezifikation in

Übereinstimmung mit den Ausführungsformen beschrieben wird, nicht jede Ausführungsform nur eine unabhängige technische Lösung enthält, und diese Beschreibung der Spezifikation dient nur der Klarheit, und der Fachmann sollte die Spezifikation als Ganzes betrachten, und die technischen

Lösungen in den verschiedenen Ausführungsformen können in geeigneter Weise kombiniert werden, um andere Ausführungsformen zu bilden, die vom Fachmann verstanden werden können.

Claims

Ansprüche LU506452

1. Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: Schritt S1 Vorbereitung der Konservierung, Schritt S2 Behandlung der Beladung, Schritt S3 Konservierung bei ultra-niedriger Temperatur, Schritt S4 Wiederherstellung der Kultur und Schritt S5 Berechnung der Regenerationsrate; Schritt S1: Konservierungsvorbereitung, umfassend die folgenden Schritte: S11: Farbstoffvorbereitung, Auswahl von Fluoresceindiacetat oder einer Mischung aus Fluoresceindiacetat und Propidiumjodid zur Herstellung eines Zellfarbstoffs: S12: Herstellung einer Konservierungslösung, Auswahl von Albumin, niedermolekularem Heparin-Natrium, Alginat und Kochsalzlösung, die in einem bestimmten Verhältnis gemischt werden, um eine Zellkonservierungslösung herzustellen; S13: Zellpräparation, die extrahierten und behandelten Testzellen wurden auf MS-Medium vorgebeugt und eine Woche lang bei 22-25°C unter den Kulturbedingungen von 12h/12h Tag/Nacht-Zyklus nach einer Niedrigtemperaturbehandlung bei 4-6°C kultiviert; S14: Bestimmung der Intensität, die zu bestimmenden Werte wurden ausgewählt und für die anschließende Bestimmung der Regenerationsrate aufgezeichnet; Schritt S2: Beladungsbehandlung, bestehend aus den folgenden Schritten: S21: Beladen der Kulturen, Behandlung der aus 2 hergestellten Zellkonservierungslösung auf eine geeignete Temperatur von 25C°; S22: Zellbeladung, Einbringen der kultivierten, untersuchten Zellen in die Konservierungslösung und deren Behandlung für 18-25 Minuten bei 25C°, und Bindung des Fluoreszenzfarbstoffs an die kultivierten Zellen; S23: Vitrifikation, nach Beendigung der Bindung des Fluoreszenzfarbstoffs an die kultivierten Zellen wird die Stammspitze in eine vorgekühlte PVS2-Lösung überführt und 25-30 Minuten auf Eis behandelt; S24: Behandlung und Konservierung, nach der Bestimmung der Zellen nach der Vitrifikationsbehandlung werden sie mit heilendem Gewebe beladen; Schritt S3: Ultra-Niedrigtemperatur-Konservierung mit den folgenden Schritten: S31: Ultra-Niedrigtemperatur-Anforderungen, Auswahl der Flüssigkeit für die Ultra- Niedrigtemperatur-Konservierung von Zellen, Auswahl von flüssigem Stickstoff und Einlegen des vitrifizierten Heilungsgewebes in flüssigen Stickstoff zur Konservierung; S32: Beobachtung bei ultra-niedriger Temperatur, Überführung des Assays in ein Gefrierröhrchen, wenn keine Blasen mehr erzeugt werden, und Einlegen in flüssigen Stickstoff für 30 Minuten; S33: Ultra-Niedrigtemperatur-Selektion: Die Zellen des Assays wurden induziert und 2 Wochen lang in einem Induktionsmedium kultiviert; Schritt S4: Die Rückgewinnungskultur umfasst die folgenden Schritte: S41: Auftauen der Zellen, wobei die Assay-Zellen aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und direkt in die Entladungslôsung überführt und 20-30 Minuten lang bei 25 °C behandelt werden; S42: Dunkelkultur, die aufgetauten Assay-Zellen werden in das Erholungsmedium für die Erholungskultur übertragen, und die ersten 7 Tage der Erholungskultur sind Dunkelkultur; S43: Zellkonservierung, nach der Dunkelkultur werden die Zellen unter Licht weiter kultiviert; Schritt SS: Berechnung der Regenerationsrate, bestehend aus den folgenden Schritten:

S51: Lebendzellrate, wobei Fluoresceindiacetat nach Bindung an lebende Zellen unter Licht/S06452 bei einer Wellenlänge von 488 nm mit grüner Fluoreszenz angeregt wird; S52: Rate der toten Zellen, wobei Propidiumiodid nach Bindung an die toten Zellen in den untersuchten Zellen nach Inkubation unter Licht eine rote Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 545 nm anregt; S53: Gesamtberechnung, basierend auf der Fluoreszenzrate, die mit den ausgewählten Assaywerten erzeugt wird, berechnet nach der Lebensfähigkeitsformel.

2. Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner den Schritt S23 Verglasungsbehandlung umfasst, wobei die Verglasungslösung 2 Lösung WPM-Basismedium, 300 g/L Glycerin, 150 g/L. Ethylenglykol, 150 g/L Dimethylsulfoxid und 0,4 mol/L Saccharose umfasst.

3. Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellauftaulösung des Schritts S41 eine MS- Kulturlösung ist, die 2 M Glycerin und 0,4 M Saccharose enthält.

4. Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt S12, Herstellung der Konservierungslösung, außerdem die folgenden Schritte umfasst: S121, Herstellen einer 0,1 g/ml Alginat-Kochsalzlôsung; S122, Herstellen der Konservierungslösung: Ansaugen von 0,9 %iger Kochsalzlösung, aufeinanderfolgende Zugabe von Humanalbumin, Natriumheparin und der erhaltenen Alginatsalzlösung und Mischen.

5. Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt S122 1,0 g Alginose abgewogen, zu 10 ml 0,9 %iger Kochsalzlösung hinzugefügt, gut gemischt und durch einen 0,22 um-Filter geleitet wurde; 80 ml 0,9 %ige Kochsalzlösung absaugen, nacheinander 5 ml menschliches Blutalbumin mit einem Masse-Volumen-Verhältnis von 20 %, 32 ul Natriumheparin von 12.500 u/2 ml, 15 ml der erhaltenen Alginat-Kochsalzlösung absaugen, gut mischen und 100 ml Zellkonservierungslösung erhalten.

6. Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass: der Schritt S23 Vitrifikationsbehandlung auf Eis durchgeführt wird und die Vitrifikationsbehandlung 30 Minuten lang durchgeführt wird.

7. Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass: beim Mischen das Volumenverhältnis der untersuchten Zellen zur Konservierungslösung 1:8 beträgt, und beim Mischen das Volumenverhältnis der untersuchten Zellen zum Zellfarbstoff 1:2 beträgt.

8. Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass: in dem Schritt S4 Rückgewinnungskultur das Zellrückgewinnungsmedium durch Mediumherstellung erhalten wird.

9. Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass: das Rückgewinnungsmedium ein MS-Festmedium ist, das 30 g/L. Saccharose, 1,0 mg/L BA und 3 g/L Phytogel enthält.

10. Ein Verfahren zur Bestimmung der Regenerationsrate der Zellkonservierung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass: das Wiederherstellungsmedium ein flüssiges MS- Medium ist, das 1,2 M Saccharose enthält.