LU102870B1 - Recombinant corynebacterium strain for modifying 5'-end sequence of 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase (hts) gene and use thereof - Google Patents

Claims (10)

1. Anspriiche I. Rekombinanter Corynebacterium-Stamm zum Modifizieren einer 5'-Ende-Sequenz eines 4- Hydroxy-Tetrahydrodipicolinatsynthase (HTS)-Gens, wobei in einem Corynebacterium- Wirtsstamm ""GAAGGTAA-! eine Nukleosidsequenz von Nukleosiden -19 bis -12 vor ein Startcodon ATG in der 5'-Endsequenz des HTS-Gens durch "’TGTGGTAT-“? ersetzt wird, um die Stabilität einer Sekundärstruktur der 5'-Endsequenz des HTS-Gens zu verringern, um eine einfachere Transkription oder Expression derselben zu ermôglichen.
2. 2. Rekombinanter Corynebacterium-Stamm nach Anspruch 1, wobei der Corynebacterium- Wirtsstamm Corynebacterium glutamicum ist; Vorzugsweise ist das Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum CICC23604 oder Corynebacterium glutamicum CGMCC 1.15647.
3. 3. Rekombinanter Corynebacterium-Stamm nach Anspruch 1, wobei das HTS-Gen eine Aminosäuresequenz in SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 8 hat; vorzugsweise ist die Aminosäuresequenz des HTS eine Aminosäuresequenz mit einer Sequenzidentität von >99,7% zu SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 8.
4. 4. Rckombinanter Corynebacterium-Stamm nach Anspruch 1, wobei das HTS-Gen eine Nukleotidsequenz aufweist, die in SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 9 gezeigt ist; vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz des HTS-Gens eine Nukleotidsequenz mit einer Sequenzidentität von 929,7% zu SEQ ID NO. 2 oder SEQ ID NO. 9.
5. 5. Rckombinanter Corynebacterium-Stamm nach Anspruch 1, wobei die 5'-Endsequenz des HTS- Gens in SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 10 gezeigt ist.
6. 6. Konstruktionsverfahren des rekombinanten Corynebacterium-Stammes nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte: Schritt 1, Synthetisieren einer Nukleotidsequenz des stromaufwärts liegenden homologen Arms PTGTGGTAT-!? — stromabwärts des homologen Arms, wobei der stromaufwärts liegende homologe Arm und der stromabwärts liegende homologe Arm 500-600 bp Nukleosidsequenzen von den Nukleosiden -19 bis -12 vor beziehungsweise nach einem Start Codon ATG in der 5'- Endsequenz des HTS-Gens sind; Schritt 2, Ligieren der Nukleotidsequenz des stromaufwärts gelegenen homologen Arms “9TGTGGTAT-?-stromabwärts des homologen Arms mit einem pK 19mobsacB-Vektor, um einen Ersatzvektor zu konstruieren;

   Schritt 3, Transformieren des Ersatzvektors in kompetente Corynebacterium-Wirtszellen und Screenen einer Kanamycin-resistenten positiven Transformante, um einen rekombinanten Stamm zu erhalten, der einen ersten homologen Single-Crossover durchlaufen hat; und Schritt 4, nach der natürlichen Passage des rekombinanten Stamms, der den ersten homologen Single Crossover durchlaufen hat, Screening von Kolonien, die auf einem Medium mit 10 % Saccharose, aber nicht auf einem Kanamycin-resistenten Medium wachsen kônnen, und Verifizieren der Kolonien, um einen rekombinantes Corynebacterium-Stamm zu erhalten, der zwei homologe einzelne Kreuzungen durchlaufen hat.
7. 7. Bauverfahren nach Anspruch 6, wobei eine oder mehrere der folgenden Bedingungen erfüllt sind: i. die Nukleotidsequenz des stromaufwärts liegenden homologen Arms "’TGTGGTAT-? — stromabwärts des homologen Arms in Schritt 2 wird zwischen die Restriktionsstellen von Hind IIT und EcoR I des pK 19mobsacB-Vektors ligiert; ii. in Schritt 3 werden Kanamycin-resistente Genprimer verwendet, um die Kanamycin-resistente positive Transformante durch PCR-Amplifikationstechnologie zu screenen, wobei die Sequenzen der Primer wie folgt sind: F1: 5-ATGATTGAACAAGATGGATTGC-3', dargelegt in SEQ ID NO.15, und R1: 5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3', dargestellt in SEQ ID NO. 16; ein System der PCR-Amplifikation umfasst: 10 pL 2x HiFi-PCRmaster, 1 uL 10 pmol/L Upstream-Primer, 1 uL 10 pmol/L Downstream-Primer, 1 pL Template und 7 pL. ddH,O; ein Programm der PCR-Amplifikation ist: anfängliche Denaturierung bei 95°C für 5 min; 30 Zyklen Denaturierung bei 94 °C für 30 s, Annealing bei 56 °C für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 1 min; Verlängerung bei 72 °C für 10 min und Lagerung bei 4 °C;

   1. in Schritt (4) wird die Verifizierung durch die PCR-Amplifikation durchgeführt, wobei die PCR-Amplifikation eine Primersequenz wie folgt aufweist: F2: 5-AAATGAGGGAATGTGGTAT-3', dargestellt in SEQ ID NO. 17, R2: 5'-TTATAGAACTCCAGCTTTTTTCA-3', dargestellt in SEQ ID NO.18; ein System der PCR-Amplifikation umfasst: 10 pL 2x HiFi-PCRmaster, 1 uL 10 pmol/L Upstream-Primer, 1 uL 10 pmol/L Downstream-Primer, 1 pL Template und 7 pL. ddH,O; ein Programm der PCR-Amplifikation ist: anfängliche Denaturierung bei 95°C für 5 min; 30 Zyklen Denaturierung bei 94 °C fiir 30 Sekunden, Annealing bei 56 °C fiir 30 Sekunden und Verlängerung bei 72 °C für 1 Minute; Verlängerung bei 72 °C für 10 min und Lagerung bei 4 °C; und iv, in Schritt (4) ist das Medium ein LBG-Medium, umfassend: 5 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/l NaCl.
8. 8. Verwendung des rekombinanten Corynebacterium-Stammes nach Anspruch 1 zur Herstellung von L-Lysin.
9. 9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Verwendung beabsichtigt ist, den rekombinanten Corynebacterium-Stamm in ein flüssiges LBG-Medium für die Impfkultur zu beimpfen und danach 2-5 Vol.-% Impfmaterial auf ein Fermentationsmedium für die Fermentationskultur zu beimpfen: das LBG-Medium umfasst: 5 g/l Glucose, 10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/1 NaCl; das Fermentationsmedium enthält: 100 g/L Glucose, 20 g/L Pepton, 30 mL/L Maisquellwasser, 5 g/L. Harnstoff, 25 g/L. (NH,),S0,, 0,34 g/L L-Leucin, 2 g /L KH,PO,, 1,5 g/L. MgSO, 7H,0 und 0,001 g/L Biotin.
10. 10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Impfkultur bei 200-220 U/min und 28-30°C fiir 18- 25 h durchgefiihrt wird; die Fermentationskultur wird bei 200-220 U/min und 28-30°C durchgeführt.