LT6458B - Grūdų užteršimo pelėsiniais grybais aptikimo būdas - Google Patents
Grūdų užteršimo pelėsiniais grybais aptikimo būdas Download PDFInfo
- Publication number
- LT6458B LT6458B LT2016001A LT2016001A LT6458B LT 6458 B LT6458 B LT 6458B LT 2016001 A LT2016001 A LT 2016001A LT 2016001 A LT2016001 A LT 2016001A LT 6458 B LT6458 B LT 6458B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- insect
- penicillium
- grain
- ead
- mold
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 238000011109 contamination Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 34
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 31
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 27
- 210000003790 arthropod antennae Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims abstract description 9
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 66
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 38
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 claims description 9
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 8
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 7
- 241001507683 Penicillium aurantiogriseum Species 0.000 claims description 7
- 241000595629 Plodia interpunctella Species 0.000 claims description 7
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 claims description 6
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 claims description 6
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000223602 Alternaria alternata Species 0.000 claims description 5
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 5
- 241001548413 Coreus marginatus Species 0.000 claims description 4
- 241000397823 Geotrupes stercorarius Species 0.000 claims description 4
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 claims description 4
- 241000254109 Tenebrio molitor Species 0.000 claims description 4
- 241001415096 Vespula germanica Species 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 238000002470 solid-phase micro-extraction Methods 0.000 claims description 4
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 claims description 3
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 3
- 241000228230 Aspergillus parasiticus Species 0.000 claims description 3
- 241000223678 Aureobasidium pullulans Species 0.000 claims description 3
- 241000257159 Musca domestica Species 0.000 claims description 3
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 claims description 3
- 241000228153 Penicillium citrinum Species 0.000 claims description 3
- 241001507673 Penicillium digitatum Species 0.000 claims description 3
- 241001136494 Talaromyces funiculosus Species 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 241000223194 Fusarium culmorum Species 0.000 claims 1
- 241001489200 Fusarium poae Species 0.000 claims 1
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 claims 1
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 6
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 abstract description 4
- 239000012855 volatile organic compound Substances 0.000 description 54
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 11
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 11
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 5
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 description 5
- 102000012547 Olfactory receptors Human genes 0.000 description 4
- 108050002069 Olfactory receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000864371 Penicillium viridicatum Species 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 3
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 241000959084 Ectomyelois ceratoniae Species 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 2
- 240000000064 Penicillium roqueforti Species 0.000 description 2
- 235000002233 Penicillium roqueforti Nutrition 0.000 description 2
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000004853 microextraction Methods 0.000 description 2
- 235000019645 odor Nutrition 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000002966 varnish Substances 0.000 description 2
- OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N (22E)-(24xi)-24-methylcholesta-5,22-dien-3beta-ol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)C=CC(C)C(C)C)C1(C)CC2 OILXMJHPFNGGTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N (22E)-cholesta-5,7,22-trien-3beta-ol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CCC(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 RQOCXCFLRBRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 7-Dehydrostigmasterol Natural products C1C(O)CCC2(C)C(CCC3(C(C(C)C=CC(CC)C(C)C)CCC33)C)C3=CC=C21 OQMZNAMGEHIHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256836 Apis Species 0.000 description 1
- 241000122824 Aspergillus ochraceus Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- 241000223195 Fusarium graminearum Species 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 244000141359 Malus pumila Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001123663 Penicillium expansum Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000877 Sex Attractant Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004464 cereal grain Substances 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940060799 clarus Drugs 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N ergosterol Chemical compound C1[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H](CC[C@]3([C@H]([C@H](C)/C=C/[C@@H](C)C(C)C)CC[C@H]33)C)C3=CC=C21 DNVPQKQSNYMLRS-SOWFXMKYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011898 label-free detection Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229930004725 sesquiterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000004354 sesquiterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/0004—Gaseous mixtures, e.g. polluted air
- G01N33/0009—General constructional details of gas analysers, e.g. portable test equipment
- G01N33/0027—General constructional details of gas analysers, e.g. portable test equipment concerning the detector
- G01N33/0031—General constructional details of gas analysers, e.g. portable test equipment concerning the detector comprising two or more sensors, e.g. a sensor array
- G01N33/0032—General constructional details of gas analysers, e.g. portable test equipment concerning the detector comprising two or more sensors, e.g. a sensor array using two or more different physical functioning modes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Combustion & Propulsion (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Išradime aprašytas paprastas, greitas ir ypatingai jautrus grūdų užteršimo pelėsiniais grybais nustatymo būdas. Šis išradimas susijęs su nustatymu grūdų viršerdvėje esančio arba nesančio specifinio lakaus metabolito (biomarkerio), naudojant dujų chromatografiją, sinchronizuotą su vabzdžio elektroantenografija ir vertinant ypatingai jautrių vabzdžių rūšių antenų uoslės receptorių atsakus ties sulaikymo laiku, atitinkančiu biomarkerio sulaikymo laiką.
Description
Technikos sritis
Grūdai dažnai gali būti užteršti juos gadinančiais pavojingais mikroorganizmais, kurie išskiria nepageidaujamus junginius taip pakeisdami grūdų skonį, todėl dauguma produktų tampa netinkami maistui. Be to šie mikroorganizmai gali gaminti toksines medžiagas, kurios kelia rimtą pavojų žmonių ir gyvulių sveikatai ir dėl grūdų netinkamumo panaudoti pagal paskirtį gali susidaryti labai dideli ekonominiai nuostoliai.
Išradimas susijęs su greitu ir jautriu grūdų užteršimo pelėsiniais grybais aptikimo būdu, paremtu pelėsinių grybų produkuojamų lakių metabolitų aptikimu, tam naudojant sinchronizuotą dujų chromatografijos ir vabzdžių elektroantenografijos metodą ir vertinant elektroantenografinį atsaką, registruojamą laiku, atitinkančiu chromatografo kolonėlėje sulaikymo laiką žinomo standarto, kuris būdingas pelėsiniais grybais užterštiems grūdams.
Technikos lygis
Užterštumui pelėsiniais grybais nustatyti naudojama daug įvairių metodų: molekuliniai, naudojant lateksinius agliutinacijos rinkinius, imunofermentinės analizės (ELISA), bioliuminescensiniai metodai (patentai CN 102094080, RU 2079128 ir kt.). Gali būti naudojami ir kiti esami metodai - mikroskopavimas, grybų kultūrų auginimas ant terpių, o taip pat kai kurių grybų metabolitų, tokių kaip chitino, ergosterolio ar mikotoksinų, nustatymas naudojant chromatografiją (WO 2013/135889; US patento paraiška Nr. 2014/0356978, ir t.t.) ar Ramano spektroskopiją (Grow A.E., Wood L.L., Claycomb J. L. et ai. 2003. New biochip technology for label-free detection of pathogens and theirtoxins. J. Microbiol. Methods. 53: 221-233).
JAV patente Nr. US 8,127,593 yra aprašytas pelėsinių grybelių nustatymo gyvenamose ir kitose patalpose būdas, paremtas tam tikrų lakių organinių junginių mišinio aptikimu.
Europos patente Nr. EP2568283 atskleistas mikotoksinų nustatymo aplinkoje būdas, paremtas chemine analize pagal “pirštų atspaudų” principą. Šis metodas apima visos eilės lakių organinių junginių, susijusių su mikotoksikogeneze, analizę.
Tačiau visi šie būdai ne visada tinkami naudoti, nes yra pakankamai brangūs ir užima daug laiko, skirto vieno mėginio analizei arba reikalauja aukštos kvalifikacijos profesionalų darbo. Be to, kai kurios grūdus užkrečiančių grybų linijos negamina toksinų, todėl remiantis tiesioginiu nuodingųjų metabolitų aptikimu, būtų gaunamos klaidinančios išvados apie pelėsinių grybų buvimą/nebuvimą.
Elektroninė nosis taip pat taikyta grybų lakiems junginiams aptikti (Magan N., Evans P. 2000. Volatiles as an indicator offungal activity and differentiation between species, and the potential ūse of Electronics nose technology for early detection of grain spoilage. J. Stored Prod. 36: 319-340), tačiau nežiūrint didelio šio metodo jautrumo, jis nėra specifinis ir pernelyg priklausomas nuo aplinkos sąlygų.
Konkrečiai grūdų užterštumui ir kokybės kritimui nustatyti yra pasiūlyta analizuoti lakius organinius junginius (Stavvicki S., Kaminski E., Niewiarowicz A. et ai.
1973. The effect of microflora on the formation of odours in grain during storage. Annales de Technologie Agricole 22:449—476; Kaminski E., Stavvicki S., Wasowicz E.
1974. Volatile flavour compounds produced by moulds of Aspergillus, Penicillium and fungiimperfecti. Appl. Microbiol. 27:1001-1004.; Abramson D., Sinha, R.N., Mills, J.T. 1980. Mycotoxin and odor formation in moist cereal grain during granary storage. Cereal Chemistry 57: 346-351).
Išanalizavus daugelį pelėsiais užterštų grūdų pavyzdžių, buvo nustatyta, kad lakių organinių junginių (LOJ) emisijose yra tam tikrų bendrų junginių mišinių. Kaip antai jeigu lakūs organiniai junginiai ekstrahuojami iš pelėsiais užterštų grūdų pavyzdžių ir analizuojami, juose aptinkami dideli kiekiai alkoholių, aldehidų ir ketonų (Magan N., Evans P. 2000. Volatiles as an indicator offungal activity and differentiation betvveen species, and the potential ūse of Electronics nose technology for early detection of grain spoilage. J. Stored Prod. 36: 319-340).
Grūdų užterštumo grybais indikatoriais buvo pasiūlyta grupė Cz, Ce ir C9 lakių organinių junginių (JAV patentas Nr. US 4,314,027), o taip pat daugelis kitų grupių (WO 2013/135889). Šių junginių aptikimui ir analizei yra naudojami dujų chromatografijos arba dujų chromatografijos su masių spektrometrija (MS) metodai bei atitinkama įranga. Šių metodų taikymui reikia gana daug cheminių medžiagų, tame tarpe ypač aukšto grynumo (standartų).
Antra vertus yra žinomas elektroantenografinis (EAG) metodas, taikomas tokiems LOJ aptikti, į kuriuos reaguoja vabzdžių antenų uoslės receptoriai. Šis metodas remiasi potencialo pasikeitimo registravimu tarp elektrodų, prijungtų prie vabzdžio antenos pagrindo ir galiuko, ir remiasi tuo, kad uoslės receptorių reakcijos atsiranda kai šie receptoriai stimuliuojami kai kuriais LOJ, kaip antai - kairomonais. Pavyzdžiui, Europos patente EP0852723 pateikiama biosensorinė (EAG) sistema, turinti vabzdžio anteną, kuri skirta vieno ar kelių LOJ, atsirandančių augalą pažeidus vabzdžiui-kenkėjui, aptikimui ore.
Paminėtina dujų chromatografija (DC), taikoma kartu su elektroantenografiniu detektoriumi (EAD), dar žinoma kaip DC-EAD, taikoma vabzdžių infocheminiams junginiams nustatyti (Arn H., StadlerE., RausfcherS. 1975. The electroantennographic detector: a selective and sensitive tool in the gas chromatographic analysis of insect pheromones. Z. Naturforsch. 30C: 722-725; Baker T.C., Francke IV., MiilarJ.G. et ai. 1991. Identification and bioassay of sex pheromone components of carob moth, Ectomyelois ceratoniae (Zeller). J. Chem. Ecol. 17: 1973-1988). Šią sistemą sudaro vabzdžio antena, įtvirtinta tarp dviejų elektrodų, iš kurių sustiprintas elektrinis signalas registruojamas kompiuteriu. Tiriamų junginių srautas iš dujų chromatografo kolonėlės padalinamas j dvi dalis, viena iš kurių patenka į liepsnos jonizacinį detektorių (LJD), o kita - į EAD, kas leidžia vienu metu registruoti dviejų detektorių parodymus (vienas iš detektorių - LJD - yra neselektyvus, o kitas - EAD - labai selektyvus).
Remiantis JAV patentu Nr. US 4,314,027, kuris skirtas grūdų apkrėstumo pelėsinių grybų toksinais nustatymui, grūdų lakieji junginiai buvo absorbuojami kietafaziu sorbentu, esančiu specialiame įrenginyje. Vienintelis aprašyme pateikiamas išradimo įgyvendinimo pavyzdys atskleidžia kaip testuoti kukurūzų pavyzdį, apie kurį žinoma, kad jis yra užkrėstas aflatoksinu: imamas 100 g grūdų pavyzdėlis, iš kurio 120 min. renkami LOJ, vakuumuojant pavyzdį. Pavyzdys būtinai kaitinamas iki 100 °C, kad pakankamai išsiskirtų LOJ. Junginių grupės iš Cz - C9 alkoholių, ketonų ir aldehidų, t.y. lakių junginių, rodančių mikotoksinų buvimą, aptikimui naudojama dujų chromatografija. Duomenys interpretuojami stebint ar būdingi C7, Ce ir C9 junginiai yra ir jie lyginami su tų pačių junginių-standartų registravimu chromatografu.
Tokiai analizei atlikti reikia daugelio standartų (nuo C7 iki C9 alkoholių, ketonų ir aldehidų). Kaip minėta aukščiau kai kurie grūdus užteršiantys pelėsiniai grybai gali gaminti ir kitus metabolitus, tačiau ne mikotoksinus, ir mikotoksinų nebuvimas gali būti klaidingai konstatuojamas taikant minėtą metodą. Ši analizė gali duoti ir neapibrėžtą rezultatą, jei kai kurių (vieno ar kelių) markerinių junginių analizuojamame pavyzdyje nėra aptinkama.
Be to, kadangi išvada priklauso nuo bendro surinktų LOJ kiekio (ekstrahuojamų iš tiriamo pavyzdžio), tai remiantis pateiktu pavyzdžiu, LOJ rinkimo trukmė turi būti ne mažesnė nei 2 vai. Būtinas specialus nestandartinis LOJ surinkimo įrenginys, kuris turi būti pripildytas specialaus sorbento ir pagamintas ir priderintas prie dujų chromatografo injektoriaus. Naudojantis tik vienu detektoriumi (be papildomo MS ar EAD) ir lyginant tiriamo pavyzdžio ir standarto chromatogramas gali būti padaryta klaidinga tyrimo išvada, sąlygota dar vienos aplinkybės - skirtingų junginių, turinčių panašius ar netgi visiškai tapačius sulaikymo laikus, pvz., terpenų ir kitų organinių junginių.
Akivaizdu, kad yra būtinas greitas ir aukšto jautrumo, o taip pat pagal gautus registracijos duomenis lengvai interpretuojamas būdas, kuriuo būtų galima patikimai ir ankstyvoje stadijoje nustatyti grūdų užterštumą pelėsiniais grybais, taip išvengiant grūdų produkcijos arba jos dalies nuostolių.
Išradimo esmė
Šio išradimo svarbiausias tikslas - sukurti grūdų užterštumo pelėsiniais grybais aptikimo būdą, kuris apima virš grūdų susidariusių LOJ mėginio surinkimą ir surinkto mėginio analizavimą dujų chromatografija, nustatant jame ir markerinį(ius) LOJ. Šis metodas pasižymi tuo, kad (i) dujų chromatografija sinchronizuoja su vabzdžio elektroantenografija ir (ii) grūdų užterštumą pelėsiniais grybais nustato vertinant vabzdžio antenos receptorių atsaką konkrečiu laiku, atitinkančiu vieno specifinio biomarkerio sulaikymo chromatografo kolonėlėje laiką.
Minėtas specifinis biomarkeris, nurodantis užteršimą pelėsiais, yra 3-metil-1butanolis.
Siūlomame būde dujų chromatografiją ir vabzdžio elektroantenografiją vykdo vienu metu.
Paprastai lygiagrečiai su vabzdžio elektroantenografine detekcija atlieka ir liepsnos jonizacinę detekciją. Tuo atveju tiriamų junginių srautas, išeinantis iš dujų chromatografo padalinamas j dvi lygias dalis (1:1), kurių viena patenka į liepsnos jonizacinį detektorių, o kita - į elektroantenografinį detektorių.
Optimaliame šio išradimo įgyvendinimo variante LOJ surinkimą nuo grūdų mėginio atlieka esant normaliam atmosferos slėgiui ir temperatūroje iki 40±5°C; LOJ surinkimas nuo 25 g grūdų pavyzdžio trunka mažiausiai 30 min.
Šiame išradime siūlomam būdui vykdyti tinkama naudoti elektroantenografijos stadijoje vabzdžio antena gali būti pasirenkama iš vabzdžių rūšių grupės, apimančios Plodia interpunctella, Tenebrio molitor L., Geotrupes stercorarius L., Leptinotarsa decemlineata (Say), Drosophila melanogaster (Meigen), Musca domestica L., Coreus marginatus L., Vespula germanica (Fabricius) ir Apis mellifera L., pirmenybė teiktina šioms rūšims: Drosophila melanogaster, Plodia interpunctella ir Apis mellifera.
Taikant šj metodą tinkamiausios naudoti elektroantenografijos stadijoje - yra Drosophila melanogaster antenos.
Šio išradimo būdas gali būti taikomas nustatyti bent jau grūdų užterštumui pelėsiniais grybais, pasirinktais iš grupės, apimančios Alternaria alternata, Alternaria brassicola, Aureobasidium pullulans, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochrachloron, Aspergillus parasiticus, Aspergillus oryzae, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium poae, Fuasarium sporotrichioides, Penicillium aurantiogriseum, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Penicillium cyclopium, Penicillium digitatum, Penicillium funiculosum, Penicillium roquefortii, Penicillium raistricki, Penicillium viridicatum, Penicillium expansum, Scopulariopsis brevicaulis, Rhizopus oryzae ir Gusarium spp.
Dar vienas svarbus šio išradimo objektas - tai sistema, skirta grūdų užteršimo pelėsiniais grybais aptikimui, kuri būtų itin jautri, leidžianti detektuoti ypač mažas grybų koncentracijas, t.y. pagal submikrogramų eilės išskiriamus LOJ kiekius.
Grūdų užteršimui pelėsiniais grybais aptikti sistema apima kietafazės mikroekstrakcijos įtaisą (KFME) ir dujų chromatografą (DC), sujungtą su elektroantenogramų detektoriumi (EAD)lygiagrečiai su liepsnos jonizaciniu detektoriumi (LJD), kur DC turi srauto dalytuvą, leidžianti sinchronizuotai registruoti LJD ir EAD atsakus.
Elektroantenogramų detektorius (EAD) apima vabzdžio anteną, įtvirtintą tarp dviejų elektrodų, nuo kurių sustiprintas elektrinis signalas gali būti registruojamas kompiuteriu, turinčiu specialią programinę įrangą, ir oro srovės tiekimo priemones, skirtas apipūsti vabzdžio antenai, kurių dėka iki antenos atnešami LOJ, išeinantys iš DC kolonėlės.
Dar vienas svarbus šio išradimo aspektas yra 3-meti-1 -butanolio panaudojimas kaip vienintelio biomarkerio grūdų užterštumo pelėsiniais grybais elektroantenografinei detekcijai.
Trumpas paveikslo aprašymas
Pav. 1 vaizduoja sinchronizuotą DC-EAD sistemos dviejų detektorių signalų įrašą, kai analizuojami erdvėje virš grūdų pavyzdžio surinkti lakūs organiniai junginiai. Registruojami dujų chromatografo (LJD) ir biologinio detektoriaus (EAD) atsakai į lakius junginius, kai tiriami:
A - neužkrėsti pelėsiniais grybais grūdai (neregistruojamas nei LJD, nei EAD atsakas kai biomarkerio nėra);
B - pelėsiniais grybais užkrėsti grūdai (silpnas LJD atsakas, bet stiprus EAD atsakas kai biomarkerio kiekis yra mažas);
C - pelėsiniais grybais užkrėsti grūdai (labai stiprus LJD atsakas bei stiprus EAD atsakas kai biomarkerio kiekis yra didelis);
D - pelėsiniais grybais užkrėsti grūdai (neregistruojamas LJD atsakas, bet aiškus EAD atsakas, kai yra labai mažas biomarkerio kiekis, kuris yra pakankamas aptikti EAD, bet nepakankamas - LJD).
Detalus išradimo aprašymas
Kaip minėta aukščiau, pagrindinis šio išradimo tikslas yra sukurti būdą grūdų užterštumo pelėsiniais grybais nustatymui, panaudojant specifinį pelėsinių grybų produkuojamą lakų junginį. Būdas apima lakių junginių surinkimą ir dujų chromatografiją (DC), sinchronizuotą su vabzdžio elektroantenografija (EAD). Lakių junginių mišinys injekuojamas į DC ir lygiagrečiai registruojamas vabzdžio EAD atsakas. EAD atsakas pasirodo, jeigu lakių junginių mišinyje yra biomarkeris, žinomas kaip būdingas pelėsiniais grybais užterštiems grūdams.
Ištyrus visą eilę LOJ mišinių, surinktų nuo užterštų pelėsiniais grybais grūdų pavyzdžių, buvo nustatyta, kad pelėsiui aptikti pakanka vieno lakaus junginio. Vabzdžių sandėlių kenkėjų elgesio tyrimai parodė, kad specifinis LOJ arba kitaip biomarkeris yra tas junginys, kurį vabzdžiai naudoja pelėsiu užterštų grūdų atpažinimui. Toks junginys pasirodė esąs 3-metil-1 -butanolis; visais atvejais kai grūdai buvo užteršti pelėsiniais grybais, buvo gauti vabzdžių antenų EAD atsakai į šį junginį. Be to, atsakas į 3-metil-1-butanolį registruojamas anksčiau negu pvz., į seskviterpenus, kuriuos siūloma naudoti patente EP2568283. Taip pat 3-metil-1butanolis turi privalumą, nes yra ankstyvesnio užteršimo indikatorius, lyginant su kitais junginiais, atsirandančiais vėlesnėse užsikrėtimo stadijose, kai pelėsis grūduose jau ir vizualiai matomas.
3-metil-1-butanolio standartas buvo naudojamas DC analizei šio junginio sulaikymo laikui nustatyti.
Atitinkamai, pelėsinių grybų detektavimui pagal šį išradimą naudojama sistema, susidedanti iš kietafazės mikroekstrakcijos prietaiso (KFME) ir dujų chromatografo (DC), sinchronizuoto su elektroantenogramų detektoriumi (EAD).
KFME yra portatyvus, standartinis prietaisas, pritaikytas rinkti ir injekuoti į DC lakius organinius junginius ir kuris lengvai prijungiamas prie DC-EAD sistemos. Pagrindinės DC-EAD sudedamosios dalys yra: dujų chromatografas, vabzdžio antenos preparatas, registravimo elektrodai, stiprintuvas, registravimui ir analizei skirtas kompiuteris ir oro srovės tiekimo priemonės, generuojančios nuolatinę oro srovę, atnešančią LOJ iš DC prie vabzdžio antenos.
Tiriamas grūdų pavyzdys paimamas įprastu būdu. Grūdai suberiami į stiklinę kolbą, kuri uždengiama aliuminio folija ir laikoma pastovioje temperatūroje kol grūdų viršerdvyje nusistovi pastovi lakių junginių koncentracija. LOJ ekstrahuojami juos absorbuojant kietafaziu strypeliu, naudojant KFME laikiklį. Apsaugai nuo mechaninio pažeidimo strypelis yra KFME laikiklio adatos makštyje. Naudojant laikiklį strypelis išstumiamas tik LOJ rinkimui ir pernešimui į DC. Pelėsinių grybų išskiriamų LOJ rinkimui naudojamas strypelis padengtas divinilbenzeno/polidimetilsiloksano (DVB/PDMS) arba polidimetilsiloksano (PDMS) sluoksniu. Laikiklio adata praduriama kolbą dengianti folija, išstumiamas strypelis ir laikomas grūdų viršerdvyje tam tikrą laiką. Pakankama absorbcijos trukmė - nuo 30 min. iki 60 min. Per tą laiką grūdų pavyzdžio LOJ yra absorbuojami ant strypelio polimerinio apvalkalo.
Baigus absorbciją strypelis įtraukiamas į adatą, KFME laikiklis pernešamas nuo grūdų mėginio prie DC kur adata įstumiama į DC injekavimo portą. Vykstant desorbcijai dujos-nešėjos (vandenilis arba helis) nuneša LOJ mišinį į DC kolonėlę. LOJ srautas padalinamas į du, kurių vienas patenka į liepsnos jonizacinį detektorių (LJD), o kitas - į elektroantenogramų detektorių (EAD). EAD susideda iš vabzdžio antenos (įtvirtintos tarp dviejų elektrodų), stiprintuvo ir elektroninio prietaiso, kontroliuojančio oro srovę atnešančią LOJ prie antenos. Elektrodai su vabzdžio antena sujungiami naudojant fiziologinį tirpalą (pvz. KOH ar Ringerio tirpalas) arba elektrogelj, pavyzdžiui, naudojamą registruojant elektrokardiogramas. Fiziologinis tirpalas ir elektrogelis stabdo dehidrataciją ir pažeistų vabzdžio audinių gijimą bei įgalina užregistruoti antenų elektrinius signalus. Taip pat elektroantenogramas galima registruoti naudojant ir visą vabzdį ar jo galvą. Tokiu atveju registruojantis elektrodas jungiamas prie antenos galiuko, o indiferentinis elektrodas - prie vabzdžio kūno. LOJ iš chromatografo kolonėlės po srauto padalijimo nunešami prie LJD ir EAD (vabzdžio antenos). Srauto padalijimas leidžia tuo pačiu metu registruoti ir lyginti LJD ir EAD atsakus. Sustiprintas EAD signalas registruojamas kompiuterine programa.
Pelėsinių grybų išskiriami LOJ renkami ant strypelio, padengto divinilbenzeno/polidimetilsiloksano (DVB/PDMS) arba polidimetilsiloksano (PDMS) sluoksniu. Siekiant sumažinti mažiau polinių junginių absorbciją, verta naudoti PDMS sluoksniu padengtą strypelį. LOJ emisijos pusiausvyros nusistovėjimui grūdų viršerdvyje ir substrate reikia 15-60 min. (minimali 15 min. trukmė yra pakankama). LOJ absorbcijos trukmė nuo 30 iki 60 min. Absorbcijos laiko liginimas ne tik padidina visos analizės trukmę, bet ir dėl konkurencinės absorbcijos-desorbcijos proceso gali neigiamai paveikti analizės rezultatus. Absorbcija gali būti vykdoma temperatūrų intervale nuo kambario temperatūros iki 40 ± 5 °C. Žemesnė temperatūra gali lemti mažesnę tiriamo junginio (biomarkerio) emisiją, o aukštesnė - padidinti desorbciją. Taigi, optimali absorbcijos temperatūra lakaus biomarkerio surinkimui yra 40 °C. DC analizei gali būti naudojamos įvairaus polingumo silikageliu dengtos kolonėles, tokios kaip 100 % polietilenglikolio ar 5 % fenilmetilpolisiloksano. LOJ mišinio išskirstymui turi būti parenkama tinkama temperatūrinė chromatografavimo programa ir srauto greitis. Desorbcijos trukmė injekavimo porte gali būti nuo 1 iki 3 min, tačiau tinkamiausias analitės desorbcijai laikas yra 1,5 min. Nuolatinio oro srauto greitis, kuriuo apipučiama vabzdžio antena gali svyruoti nuo 0,25 iki 1,5 m/s, bet optimalus yra 0,5 m/s.
Šio išradimo būdas yra tinkamas aptikti grūdų užteršimą įvairiomis pelėsinių grybų rūšimis, tokiomis kaip Alternaria alternata, Alternaria brassicola, Aureobasidium pullulans, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochrachloron, Aspergillus parasiticus, Aspergillus oryzae, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium poae, Fuasarium sporotrichioides, Penicillium aurantiogriseum, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Penicillium cyclopium, Penicillium digitatum, Penicillium funiculosum, Penicillium roquefortii, Penicillium raistricki, Penicillium viridicatum, Penicillium expansum, Scopulariopsis brevicaulis, Rhizopus oryzae, Gusarium spp. ir kitomis.
Ypač svarbu taikant šj būdą - tinkamo vabzdžio antenos parinkimas. Antenos gali būti naudojamos tokių vabzdžių rūšių: Plodia interpunctella, Tenebrio molitor L., Geotrupes stercorarius L., Leptinotarsa decemlineata (Say), Drosophila melanogaster (Meigen), Musca domestica L., Coreus marginatus L., Vespula germanica (Fabricius) ir Apis mellifera L.
Tačiau Drosophila melanogaster, Plodia interpunctella ir Apis mellifera yra tinkamiausi vabzdžiai, nes jų antenų receptorių jautrumas išradime siūlomam biomarkeriui (3-metil-1 -butanoliui) yra didžiausias.
Išradimo įgyvendinimo pavyzdžiu aprašymas
Žemiau pateikiami konkretūs pavyzdžiai, iliustruojantys išradimo taikymą; tačiau jie nėra apribojantys šio išradimo apsaugos apimties.
Pavyzdys 1. Lakių junginių surinkimas iš grūdų mėginio
Grūdų pavyzdys dedamas į stiklinę kolbą, kurią uždengus triguba aliuminio folija, inkubuojama 40 °C temperatūroje 0,5 vai. Tada atliekama 1 vai. trukmės lakių organinių junginių (LOJ) kietafazė mikroekstrakcija. LOJ absorbcijai naudojamas polidimetilsiloksano (PDMS, 100 pm, Supelco, JAV) strypelis. Tuoj pat po mikroekstrakcijos LOJ 1,5 min. desorbuojami dujų chromatografe ir registruojami LJD ir EAD atsakai (DC-EAD).
Pavyzdys 2. DC-EAD
Ant KFME strypelio absorbuoti LOJ analizuojami DC-EAD. Ši analizė atliekama Clarus 500 dujų chromatografu (PerkinElmer, VValtham, MA, JAV), kuriame naudojama DB-Wax kapiliarinė kolonėlė (30 m; vidinis diametras 0.25 mm, sluoksnio storis 0.25 pm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, JAV) ir LOJ srauto dalintuvas, leidžiantis tuo pačiu metu registruoti LJD ir EAD atsakus į atskirtus mišinio LOJ.
Injektoriaus ir detektoriaus temperatūra - 240 °C. Analizės temperatūrinė programa: pradinė 40 °C temperatūra palaikoma 2 min, po to keliama iki 200 °C 5 °C/min. greičiu, po to keliama iki 240 °C 10 °C/min. greičiu ir palaikoma 14 min. Dujos nešėjos - vandenilio dujos (2.5 ml/min.).
Išeinantis iš kolonėlės srautas dalijamas į dvi dalis (1:1), kurių viena nukreipiama į LJD, o kita - j EAD. Vabzdžio antena naudojama kaip detektorius elektrofiziologiškai aktyviems lakiems junginiams nustatyti. Nukirptos vabzdžio antenos pagrindas pritvirtinamas prie indiferentinio stiklinio elektrodo, kuris užpildytas 0,9 % NaCI fiziologiniu tirpalu (llsanta, Lietuva) ir j kurį įkišta sidabrinė vielutė.
Registravimo elektrodas - toks pat fiziologiniu tirpalu užpildytas stiklinis kapiliaras, kurio galiukas suliečiamas su antenos galiuku. Toks paruoštas antenos preparatas yra prijungiamas prie IDAC-232 stiprintuvo (Syntech, Olandija), kuris turi jungtį su kompiuteriu, turinčiu DC-EAD atsakų registravimo programą GcEad V. 4.4 (Synthech, Olandija 1998). Junginiai, kurie sukelia atkartojamus antenos receptorių atsakus, laikomi EAD aktyviais.
Vabzdžio antenų receptorių atsakus sukeliantis 3-metil-1 -butanolis identifikuojamas lyginant jo sulaikymo laiką su autentiško sintetinio standarto sulaikymo laiku.
Pavyzdys 3. Tinkamiausi vabzdžiai-detektoriai
Siekiant atrasti ypatingai jautrų vabzdžių-detektorių rūšį, tinkamiausią užterštumui pelėsiais pagal biomarkerį 3-metil-1 -butanolį aptikti, buvo tirti 9 rūšių vabzdžių antenų elektrofiziologiniai atsakai. Vabzdžių antenų preparatai paruošti taip pat, kaip aprašyta 2 pavyzdyje.
pi testuojamo junginio (biomarkerio) tirpalo heksane užlašinama ant filtro popieriaus juostelės (5 x 45 mm) (Whatman®1, Anglija). Nugaravus tirpikliui, filtro popieriaus juostelė įdedama į Pastero pipetę, per kurią tekėdama oro srovė (7 ml/s) perneša kvapias medžiagas į nuolatinę oro srovę (20 ml/s), apipučiančią anteną. Stimuliavimo trukmė (0,5 s) nustatoma kontroleriu (CS 55; Syntech, Olandija). Buvo tiriamos šešios 3-metil-1-butanolio koncentracijos (0,1, 1, 10, 102, 103 ir 104 pg) didėjimo tvarka. Nugarintas tirpiklis (10 pi heksano) testuotas kaip kontrolinis stimulas prieš mažiausią koncentraciją ir po didžiausios koncentracijos. Reakcijos dydis mV nustatomas pagal pikinę amplitudę, t.y. įvertinus atstumą iki labiausiai nutolusio nuo nulinės linijos taško. Po kiekvieno stimuliavimo daroma 1 min. pertrauka, per kurią leidžiama antenos uoslės receptoriams atsistatyti.
Sandėlių kenkėjas P. interpunctella, medunešė bitė A. mellifera ir vaisinė muselė D. melanogaster buvo jautriausiai į 3-metil-1 -butanolį reaguojantys vabzdžiai. Nelauktai didžiausią jautrumą šiam biomarkeriui parodė D. melanogaster - vaisinė muselė, visiškai nesusijusi su sandėliuojamais grūdais. Vabalų T. molitor, G. stercorarius ir L. decemlineata, taip pat musių M. domestica, blakių C. marginatus ir vapsvų V. germanica jautrumas šiam junginiui buvo maždaug 100 kartų mažesnis.
Pavyzdys 4. Pelėsinių grybų LOJ detekcija
Šiame pavyzdyje buvo testuojami 25 g kviečių mėginiai. Pirmasis mėginys švarūs, pelėsiais neužkrėsti kviečių grūdai. Kiti kviečių mėginiai buvo užkrečiami laboratorijoje Aspergillus flavus arba Alternaria alternata pelėsiniais grybais.
Kiekvieno mėginio LOJ buvo renkami pagal 1 pavyzdyje aprašytą KFME metodiką. Po to buvo atliekama absorbuotų LOJ DC-EAD analizė pagal 2 pavyzdyje aprašytą metodiką, siekiant nustatyti ar surinktų LOJ mišinyje yra/nėra 3-metil-1butanolio, indikuojančio užteršimą pelėsiniais grybais.
Tyrimo rezultatai pateikti 1 paveiksle. (Pav. 1). Neužteršto grūdų mėginio DCEAD tyrimų rezultatų grafiniame vaizde nei DC, nei EAD juostose reakcijų smailių ties 3-metil-1 -butanoliui būdingu sulaikymo laiku nėra, t.y. nei LJD, nei EAD nerodo atsako, t.y. 3-metil-1 -butanolio LOJ mišinyje nėra, o kartu tai reiškia jog grūdai pelėsiu neužteršti (Pav. 1, A). Grūdų mėginių, užkrėstų Aspergillus flavus (Pav 1, B), Alternaria alternata (Pav. 1, C) pelėsiniais grybais, LOJ DC-EAD analizės grafinis vaizdas rodo reakcijų smailes tiek DG, tiek EAD juostoje ties sulaikymo laiku, būdingu 3-metil-1butanoliui, taigi, tiek vienas, tiek kitas grūdų mėginys užterštas pelėsiniais grybais. Biologinio detektoriaus - EAD atsakas yra ryškus tiek esant mažai (Pav 1, B), tiek didelei (Pav. 1, C) 3-metil-1 -butanolio koncentracijai.
Ketvirto grūdų mėginio, užkrėsto Aspergillus flavus (Pav. 1, D), LOJ mišinyje 3-metil-1 -butanolio koncentracija buvo mažesnė už LJD detekcijos slenkstį (Pav. 1, D DC juostoje smailė neregistruojama), tačiau biologinis detektorius - EAD, ties sulaikymo laiku, būdingu 3-metil-1 -butanoliui, registruoja vabzdžio receptorių atsaką, todėl išvada - šis mėginys užterštas pelėsiniais grybais. Šis pavyzdys rodo didesnį EAD jautrumą nei LJD.
Analogiški rezultatai buvo gauti tiriant grūdus, užterštus ir kitais pelėsiniais grybais, tokiais kaip Fusarium graminearum, Penicillium aurantiogriseum ir kt.
Aukštas metodo efektyvumas buvo pasiektas dėl žemiau išvardintų sąlygų:
Nepaprastai didelis jautrumas, detekcijai pakankama LOJ koncentracija viršerdvyje yra ppb eilės;
Paprasta analizė, kuri remiasi tik vienu markeriniu junginiu, nereikia indeksų skaičiavimo ir lyginimo, kurie atliekami kai analizuojama visa eilė junginių;
Nėra neaiškumų, kurie dažnu atveju atsiranda skaičiuojant indeksus;
Tyrimui reikalinga tik standartinė įranga;
EAD registravimui tinkamiausia vaisinė muselė - Drosophila melanogaster yra lengvai laboratorijos sąlygomis kultivuojamas vabzdys.
Iš pateiktų rezultatų matyti, kad siūlomas išradimas turi keletą naujų privalumų:
1. Pelėsinių grybų aptikimas yra greitas ir supaprastintas, nes pakanka registruoti tik vieną lakų junginį.
2. Rezultatai neperkrauti bereikalinga informacija, todėl perskaityti ir suprasti tyrimo rezultatus gali kiekvienas, tam nereikia kvalifikuotų profesionalų.
3. Didesnis būdo jautrumas leidžia užteršimą detektuoti ankstyvoje stadijoje (tik pradėjus daugintis pelėsiniam grybui), o tai labai svarbu, nes ankstyvas pelėsinių grybų aptikimas leidžia imtis priemonių ir išvengti galimų grūdų produkcijos nuostolių.
Naujas techninis sprendimas leidžia grūdų mėginio lakius junginius surinkti įprastu kietafazės mikroekstrakcijos (KFME) būdu esant normaliam slėgiui ir temperatūrai, artimai kambario temperatūrai. Analizei pakanka mažo grūdų mėginio iki 25 g grūdų. Užterštumo analizei naudojami du detektoriai, būtent - liepsnos jonizacinis (LJD) ir elektroantenogramų (EAD) detektorius, kurie daro analizę patikimesnę ir tikslesnę.
Reikalingas minimalus aukšto švarumo standartų skaičius, t.y. tik vienas.
Siūlomo būdo jautrumas lyginant su kitais žinomais būdais (pvz. JAV patentas Nr. US 4,314,027) yra didesnis dėl jo papildymo vabzdžio EAD. LJD gali registruoti ppm eilės medžiagos koncentraciją ore, tuo tarpu EAD užregistravimui (sužadinti vabzdžio uoslės receptoriams) pakanka nuo 1 iki kelių ppb koncentracijos, t.y. 1000 kartų mažesnės. MS analizė ir su ja susijusi įranga, naudojant siūlomą būdą, nereikalinga. Surenkant LOJ nereikia naudoti vakuumavimo ir mėginio kaitinimo virš °C. Pakanka trumpo DC-EAD įrašo (apie 10 min) kad galima būtų padaryti išvadą.
Tuo atveju, kai abiejų detektorių - LJD ir EAD - atsakai yra aiškiai matomi, pelėsinių grybų produkuojamo biomarkerio koncentracija yra ppm ribose, o kai LJD atsako nėra (triukšmų lygyje), tačiau yra EAD atsakas, užteršimas pelėsiais yra mažesnis ir jų produkuojamo biomarkerio koncentracija yra ppb ribose. Atsižvelgiant į tai, pelėsių detekcija gali būti vykdoma išjungus LJD, ir naudojant tik EAD.
Išradimo privalumai lyginant su kitais žinomais būdais (paminėtas aukščiau) grūdų užteršimui pelėsiniais grybais nustatyti.
- visa analizė, nuo mėginio surinkimo iki DC-EAD užrašymo, trunka apie 45 min. (iki 1 valandos), t. y. žymiai trumpiau nei aukščiau paminėtame metode.
- būdas pranašesnis, nes galima detektuoti ir tas pelėsinių grybų linijas, kurios negamina miktotoksinų (pavyzdžiui, Aspergillus ochraceus linijos tokios kaip KA-95, KA-101, KA-284).
- analizė yra daug paprastesnė nei kituose žinomuose būduose, nes pakanka aptikti ir analizuoti tik vieną biomarkerj.
- didesnis būdo jautrumas lyginant su esamais būdais, nes į pastaruosius nėra įtrauktas biologinis (ypač jautrus) detektorius.
- mėginius analizuoti galima ne tik laboratorijoje, bet ir grūdų sandėliavimo vietose, turint portatyvinę DC-EAD įrangą.
Šio išradimo siūlomas būdas yra draugiškas aplinkai; nereikia naudoti organinių tirpiklių.
Pramoninis pritaikomumas
Išradimas gali būti naudingas žemės ūkyje vertinant grūdų kokybę sandėliavimo vietose, taip pat pašarų kokybės vertinimui, maisto pramonėje vertinant maistinių grūdų, kruopų ar miltų kokybę ir kt.
Claims (11)
- IŠRADIMO APIBRĖŽTIS1. Grūdų užteršimo pelėsiniais grybais aptikimo būdas, apimantis virš grūdų susidariusių lakių junginių mėginio surinkimą ir surinkto mėginio analizavimą dujų chromatografija, nustatant jame markerinį(ius) lakų(ius) junginį(ius), besiskirian t i s tuo, kad (i) dujų chromatografiją sinchronizuoja su vabzdžio elektroantenografija ir (ii) grūdų užteršimą pelėsiniais grybais nustato vertinant antenų receptorių atsaką tam tikru sulaikymo laiku, kuris būdingas vieninteliam specifiniam biomarkeriui.
- 2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtas vienintelis specifinis biomarkeris, indikuojantis užteršimą pelėsiniais grybais, yra 3-metil-1butanolis.
- 3. Būdas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad chromatografiją ir vabzdžio elektroantenografiją atlieka vienu metu.
- 4. Būdas pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad lygiagrečiai su vabzdžio elektroantenografine detekcija atlieka liepsnos jonizacinę detekciją, padalinant iš chromatografo išeinančių dujų-nešėjų srautą tarp liepsnos jonizacinio detektoriaus ir elektroantenografinio detektoriaus santykiu 1:1.
- 5. Būdas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad lakių junginių nuo grūdų mėginio surinkimą vykdo esant normaliam atmosferos slėgiui ir temperatūroje iki 40+5 °C, renkant lakius junginius nuo 25 g grūdų mėginio bent 30 min.
- 6. Būdas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad tinkama naudoti elektroantenografijos stadijoje vabzdžio antena pasirenkama iš vabzdžių rūšių grupės, apimančios Plodia interpunctella, Tenebrio molitor L., Geotrupes stercorarius L., Leptinotarsa decemlineata (Say), Drosophila melanogaster (Meigen), Musca domestica L., Coreus marginatus L., Vespula germanica (Fabricius) ir Apis mellifera L., geriausiai Drosophila melanogaster, Plodia interpunctella ir Apis mellifera.
- 7. Būdas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad tinkamiausia naudoti elektroantenografijos stadijoje yra Drosophila melanogaster antena.
- 8. Būdas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad grūdų užteršimo pelėsiniai grybai yra pasirinkti iš grupės, apimančios Alternaria alternata, Alternaria brassicola, Aureobasidium pullulans, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochrachloron, Aspergillus parasiticus, Aspergillus oryzae, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium poae, Fuasarium sporotrichioides, Penicillium aurantiogriseum, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Penicillium cyclopium, Penicillium digitatum, Penicillium funiculosum, Penicillium roųuefortii, Penicillium raistricki, Penicillium viridicatum, Penicillium expansum, Scopulariopsis brevicaulis, Rhizopus oryzae ir Gusarium spp.
- 9. Sistema, skirta grūdų užteršimo pelėsiniais grybais aptikimui būdu pagal bet kurį iš 1-8 punktų, besiskirianti tuo, kad ji apima kietafazės mikroekstrakcijos įtaisą (KFME) ir dujų chromatografą (DC), sujungtą su elektroantenografiniu detektoriumi (EAD) lygiagrečiai su liepsnos jonizaciniu detektoriumi (LJD), kur DC turi srauto dalytuvą, leidžiantį sinchronizuotai registruoti LJD ir EAD signalus.
- 10. Sistema pagal9punktą, besiskirianti tuo, kad elektroantenografinis detektorius (EAD) apima vabzdžio anteną, patalpintą tarp dviejų elektrodų, nuo kurių sustiprintas signalas gali būti registruojamas kompiuteriu, ir oro srovės tiekimo priemones, skirtas apipūsti vabzdžio antenai iš DC išeinančiais lakiais junginiais.
- 11. 3-metil-1 -butanolio panaudojimas grūdų užteršimo pelėsiniais grybais elektroantenografiniam aptikimui.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2016001A LT6458B (lt) | 2016-01-06 | 2016-01-06 | Grūdų užteršimo pelėsiniais grybais aptikimo būdas |
| PCT/IB2016/051320 WO2017118881A1 (en) | 2016-01-06 | 2016-03-09 | Method for detection of mould contamination in grain |
| EP16715617.3A EP3400438B1 (en) | 2016-01-06 | 2016-03-09 | Method for detection of mould contamination in grain |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| LT2016001A LT6458B (lt) | 2016-01-06 | 2016-01-06 | Grūdų užteršimo pelėsiniais grybais aptikimo būdas |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT2016001A LT2016001A (lt) | 2017-07-10 |
| LT6458B true LT6458B (lt) | 2017-09-25 |
Family
ID=55702033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT2016001A LT6458B (lt) | 2016-01-06 | 2016-01-06 | Grūdų užteršimo pelėsiniais grybais aptikimo būdas |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3400438B1 (lt) |
| LT (1) | LT6458B (lt) |
| WO (1) | WO2017118881A1 (lt) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109799332A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-05-24 | 北京农业质量标准与检测技术研究中心 | 链格孢酚单甲醚的磁免疫荧光定量检测方法 |
| CN114813977B (zh) * | 2021-01-19 | 2023-05-12 | 南京财经大学 | 利用气味指纹图谱对稻谷中玉米象进行无损检测的方法 |
| CN112946153B (zh) * | 2021-02-03 | 2022-10-21 | 仲恺农业工程学院 | 一种同时测定塑料桶装植物油中多种污染物的方法 |
| CN113466359B (zh) * | 2021-06-04 | 2023-04-07 | 北京农业智能装备技术研究中心 | 一种挥发性化学农药喷雾漂移污染检测系统 |
| CN114381541A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-04-22 | 大连民族大学 | 一种检测粮食储存环境气溶胶中的霉菌监测粮食霉变的新方法及应用 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4314027A (en) | 1980-07-21 | 1982-02-02 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Method of detecting mold toxin infected grains |
| RU2079128C1 (ru) | 1994-09-05 | 1997-05-10 | Акционерное общество "Астросолар" | Способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами и устройство для измерения биолюминесценции проб зерна |
| EP0852723B1 (de) | 1995-09-29 | 2002-07-03 | Forschungszentrum Jülich Gmbh | Biosensorsystem zur messung einer oder mehrerer, insbesondere organischer, durch pflanzenschädigungen verursachten spurenkomponenten in luft |
| US8127593B2 (en) | 2007-03-05 | 2012-03-06 | Centre Scientifique Et Technique Du Batiment (Cstb) | Method for detecting fungal contamination |
| CN102094080B (zh) | 2009-12-09 | 2012-11-14 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法与应用 |
| WO2013135889A1 (de) | 2012-03-16 | 2013-09-19 | Georg-August-Universität Göttingen, Stiftung Öffentlichen Rechts | Volatile biomarker für die detektion von mykotoxin produzierenden pilzlichen pathogenen bei maispflanzen |
| US20140356978A1 (en) | 2012-02-03 | 2014-12-04 | Charm Sciences, Inc. | Extraction of Mycotoxins |
| EP2568283B1 (fr) | 2011-09-08 | 2015-11-04 | Centre Scientifique et Technique du Batiment | Procédé de détermination d'une empreinte chimique spécifique de la production de mycotoxines |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7655253B2 (en) * | 2004-11-24 | 2010-02-02 | Bedoukian Research, Inc. | Navel orangeworm pheromone composition |
| WO2012021531A2 (en) * | 2010-08-10 | 2012-02-16 | Sterling International, Inc. | Repellents for pestiferous social wasps |
-
2016
- 2016-01-06 LT LT2016001A patent/LT6458B/lt not_active IP Right Cessation
- 2016-03-09 EP EP16715617.3A patent/EP3400438B1/en active Active
- 2016-03-09 WO PCT/IB2016/051320 patent/WO2017118881A1/en active Application Filing
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4314027A (en) | 1980-07-21 | 1982-02-02 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Method of detecting mold toxin infected grains |
| RU2079128C1 (ru) | 1994-09-05 | 1997-05-10 | Акционерное общество "Астросолар" | Способ определения степени поражения зерна микроскопическими грибами и устройство для измерения биолюминесценции проб зерна |
| EP0852723B1 (de) | 1995-09-29 | 2002-07-03 | Forschungszentrum Jülich Gmbh | Biosensorsystem zur messung einer oder mehrerer, insbesondere organischer, durch pflanzenschädigungen verursachten spurenkomponenten in luft |
| US8127593B2 (en) | 2007-03-05 | 2012-03-06 | Centre Scientifique Et Technique Du Batiment (Cstb) | Method for detecting fungal contamination |
| CN102094080B (zh) | 2009-12-09 | 2012-11-14 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法与应用 |
| EP2568283B1 (fr) | 2011-09-08 | 2015-11-04 | Centre Scientifique et Technique du Batiment | Procédé de détermination d'une empreinte chimique spécifique de la production de mycotoxines |
| US20140356978A1 (en) | 2012-02-03 | 2014-12-04 | Charm Sciences, Inc. | Extraction of Mycotoxins |
| WO2013135889A1 (de) | 2012-03-16 | 2013-09-19 | Georg-August-Universität Göttingen, Stiftung Öffentlichen Rechts | Volatile biomarker für die detektion von mykotoxin produzierenden pilzlichen pathogenen bei maispflanzen |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GROW A.E. ET AL.: "New biochip technology for label-free detection of pathogens and their toxins.", J. MICROBIOL. METHODS, 2003 |
| MAGAN N., EVANS P.: "Volatiles as an indicator of fungal activity and differentiation between species, and the potential use of Electronics nose technology for early detection of grain spoilage", J. STORED PROD., 2000, pages 319 - 340, XP055067728, DOI: doi:10.1016/S0022-474X(99)00057-0 |
| STAWICKI S. ET AL.: "The effect of microflora on the formation of odours in grain during storage.", ANNALES DE TECHNOLOGIE AGRICOLE, 1973 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2017118881A1 (en) | 2017-07-13 |
| LT2016001A (lt) | 2017-07-10 |
| EP3400438A1 (en) | 2018-11-14 |
| EP3400438B1 (en) | 2021-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| LT6458B (lt) | Grūdų užteršimo pelėsiniais grybais aptikimo būdas | |
| Garcia-Alcega et al. | Fingerprinting outdoor air environment using microbial volatile organic compounds (MVOCs)–A review | |
| Schütz et al. | Detection of volatiles released by diseased potato tubers using a biosensor on the basis of intact insect antennae | |
| Cuevas-Glory et al. | A review of volatile analytical methods for determining the botanical origin of honey | |
| Cai et al. | Determination of characteristic odorants from Harmonia axyridis beetles using in vivo solid-phase microextraction and multidimensional gas chromatography–mass spectrometry–olfactometry | |
| Lan et al. | Miniaturised air sampling techniques for analysis of volatile organic compounds in air | |
| Karpas et al. | Determination of volatile biogenic amines in muscle food products by ion mobility spectrometry | |
| Statheropoulos et al. | Analysis of expired air of fasting male monks at Mount Athos | |
| Kafle et al. | State of ion mobility spectrometry and applications in agriculture A review | |
| Ferreira et al. | Study of major aromatic compounds in port wines from carotenoid degradation | |
| Sekine et al. | Determination of acetaldehyde and acetone emanating from human skin using a passive flux sampler—HPLC system | |
| Beauchamp et al. | Odorant detection by on-line chemical ionization mass spectrometry | |
| Brandt et al. | Subtle chemical variations with strong ecological significance: stereoselective responses of male orchid bees to stereoisomers of carvone epoxide | |
| Kalinová et al. | Can chemical cues from blossom buds influence cultivar preference in the apple blossom weevil (Anthonomus pomorum)? | |
| Cruickshank | Defenses triggered by the invader: chemical defenses | |
| Zhang et al. | Progress on the analytical methodology for biological volatile organic compounds | |
| Matsumoto et al. | Novel analytical approach to find distinctive odor compounds from garlic cloves infested by the potato-rot nematode Ditylenchus destructor using gas chromatography–olfactometry (GC–O) with heart-cut enrichment system | |
| CN113189145A (zh) | 一种基于电子鼻技术的鲜花花香成分芳樟醇含量预测方法 | |
| Granero et al. | Single step determination of fragrances in Cucurbita flowers by coupling headspace solid-phase microextraction low-pressure gas chromatography–tandem mass spectrometry | |
| JP2002539429A (ja) | 状態検出方法 | |
| US20220349870A1 (en) | Method for Detecting American Foulbrood in a Beehive | |
| Wang et al. | Detection of Zygosaccharomyces rouxii and Candida tropicalis in a high-sugar medium by a metal oxide sensor-based electronic nose and comparison with test panel evaluation | |
| CN113466359B (zh) | 一种挥发性化学农药喷雾漂移污染检测系统 | |
| Zheng et al. | Early identification of fungal leaf blight disease (Alternaria alternate) on Platycladus orientalis plants by using gas chromatography-ion mobility spectrometry | |
| Potter et al. | A re-examination of corn (Zea mays L.) ear volatiles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Patent application published |
Effective date: 20170710 |
|
| FG9A | Patent granted |
Effective date: 20170925 |
|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20230106 |