LT6339B - Dnr grandinės skėlimo 5-hidroksimetilcitozinų analizė - Google Patents

Abstract

Pateiktas 5-hidroksimetilcitozino liekanų vietų nustatymo genominėje DNR metodas, kuris apima tiriamos DNR veikimą DNR metiltransferaze ir selenoliu, kuomet DNR metiltransferazė prijungia selenolį prie 5-hidroksimetilcitozino liekanų, susidarant kovalentėms tarpnukleotidinėms jungtims, kurios lemia DNR grandinės trūkius minėtose vietose, veikiant piperidinu.

Description

Išradimas susijęs su metiltransferazių vykdoma sekai-specifine modifikacija ir 5-hidroksimetilcitozino liekanų analizę DNR, konkrečiai su metiltransferazių vykdomu selenolių prijungimu prie 5-hidroksimetil grupės minėtose liekanose, bei oksidatoriaus poveikyję vykstančiu šių liekanų kovalentiniu susiuvimu su gretimais nukleotidais ir DNR grandinės trūkių susidarymu susiūtų liekanų vietose veikiant piperidinui, kurie leidžia nustatyti 5-hidroksimetilcitozino liekanų vietas genominėje DNR.

Išradimo technikos lygis

Kovalentinė citozino modifikacija 5-je padėtyje yra viena iš geriausiai ištirtų epigenetinių DNR reguliacijos mechanizmų organizmuose nuo augalų iki žinduolių. Pirminė epigenetinė DNR modifikacija yra 5-metilcitozinas (5mC), kuris susidaro pernešant metilo grupę nuo kofaktoriaus SAM DNR metiltransferazių pagalba. Ši DNR modifikacija yra plačiai paplitusi žinduolių genome CpG sekose. Tačiau nauji tyrimai parodė, kad veikiant TET oksigenazėms 5mC gali būti paverstas j 5hidroksimetilcitoziną (hmC) ir po to į 5-formilcitoziną ar 5-karboksilcitoziną. Nors hmC yra antra labiausiai sutinkama modifikacija DNR (Tahiliani et ai., 2009, Science, 324, 930-935; Kriaucionis & Heintz, 2009, Science, 324, 929-930), jos biologinė reikšmė nėra pakankamai ištirta, didžia dalimi dėl tyrimo metodų netobulumo. Neseniai mes atradome netipinę metiltransferazės vykdomą reakciją, kurios metu susidaro hmC. hmC toliau gali būti modifikuojamas metiltransferazės nesant jos gamtiniam kofaktoriui SAM (Liutkeviciute et ai, Nat Chem. Biol., 2009, 5: 400-402). Neseniai mes atradome, kad hmC liekanos gali būti selektyviai modifikuojamos tioliais ar selenoliais, susidarant atitinkamai 5-alkitiometilcitozinams arba 5-alkilselenometilcitozinams specifinėse DNR sekose in vitro (Liutkeviciute et ai., Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 50, 2090-2093). Aprašyta, kad oksiduojant švelnias oksidantais, pvz, NaJO4, panašūs 5arilselenometilpirimidinų dariniai gali sudaryti kovalentinius metileno tiltelius su gretimais toje pat ar kitoje grandinėje esančiais purinais (Peng ir kt., 2008, J Am Chem Soc 130,10299-10306; Ding ir kt,. 2008 J Am Chem Soc 130,17981-17987); reakcija, manoma, vyksta 5-arilseleno(oksi)metilpirimidinų sigmatropinio persigrupavimo keliu susidarant elektrofiliniam 5-metilencitozino dariniui (IV, Pav. 1), kuris aktyviai reaguoja su kaimyninėmis guanino nukleobazėmis (Romieu et ai. 2000 Org Lett2, 1085-1088.; Bellon et ai. 2001 Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids 20, 967-971; Zhang and Wang 2003, J Am Chem Soc 125,12795-12802; Bellon et ai. 2006, Org Biomol Chem

4, 3831-3837; Hong et ai. 2006, J Am Chem Soc 128, 485-491; Ding et ai. 2008 J Am Chem Soc 130, 17981-17987; Peng et ai. 2008; J Am Chem Soc 130,10299-10306).

Išradimo esmė

Čia pirmąkart pademonstruota, kad veikiant DNR alifatiniu selenoliu ir esant DNR C5-MTazei bei toliau švelniai oksiduojant NaJO4, susidaro sekai-specifinės kovalentinės jungtys tarp hmC ir gretimo guanino (intra-grandininis guaninometilcitozino aduktas G^AmC); susidariusi jungtis lemia DNR grandinės trūkį veikiant piperidinu, kas leidžia nustatyti hmC buvimo vieta DNR.

hmC modifikacijų analizei CG dinukleotiduose naudojome MTazes M.Hhal ir M.Sssl, kurių atpažinimo sekos yra GCGC ir CG (modifikuoja pabrauktą citoziną). Demonstraciniuose eksperimentuose naudojome modelinį DNR substratą, turintį hmC nucleotidą, kuris buvo modifikuotas selenoliu (2-aminoetanselenolis, R1-SeH; Lselenocisteinas, R2-SeH ir 2-(2-aminoetoksi) etanselenolis, R3-SeH) esant vienai iš MTazių, bei veikiamas NalO4.

Kadangi guanino nukleozidų alkilinimas susilpnina N-glikozidinę jungtį, galima buvo tikėtis, kad susiūtieji guaninai nesunkiai atskils nuo DNR grandinės, susidarant chemiškai nestabiliam abaziniam taikiniui. Iš tiesų, po inkubacijos su piperidinu ir produktų analizės poliakrilamidiniame (PAA) gelyje denatūruojančiomis ir nedenatūruojančiomis sąlygomis buvo stebimas DNR grandinės trūkių susidarymas pozicijose, atitinkančiose prognozuojamas G^AmC dinukleotidų vietas. Taigi, eksperimentuose buvo stebimas padidintas DNR grandinės jautrumas trūkiams vietose atitinkančiose 5‘- kaimyninius guaninus (pav. 2), tuo būdu parodant hmC buvimo vietas DNR. Grandinės skilimas nebuvo stebimas kontroliniuose eksperimentuose, nesant selenolio ar nepaveikus NalO4.

Paveikslų aprašymai

Šis išradimas toliau detaliau aprašomas naudojant paveikslus, kuriuose pateikta:

Pav. 1. Chemo-enzimatinių reakcijų schema, apibudinanti MTazių-sąlygotą selenolio prijungimą, oksidaciją ir kovalentinį hmC liekanų susiuvimą, lemiantį DNR grandinės trūkį ties gretimais guaninais.

Pav. 2. Sekai-specifinis hmC modifikacijų nustatymas DNR, naudojant piperidinu indukuotą grandinės skilimą. 24-merinis DNR dupleksas, turintis 5‘-gale žymėtą tikslinę grandinę, po reakcijos su M.Hhal ir selenoliu bei oksidacijos NalO4 buvo inkubuotas su 1 M piperidinu, o po to analizuotas 15 % poliakrilamidiniame gelyje ir autoradiografijos metodu. Takeliuose 4, 6 ir 8, kuriuose buvo M.Hhal ir perjodatas, aiškiai matomas trumpesnių DNR grandinių, kurios baigiasi ties G-hmC dinukleotidais, susidarymas. Purinų” G+A takelis pagal Maxam-Gilbert įgalina DNR sekos sugretinimą, GhmCGC taikiniai yra paryškinti.

Detalus išradimo aprašymas

DNR substratų paruošimas

Oligonukleotidai

DNR oligonukleotidai (gryninti HPLC būdu) gauti iš IDT (JAV), IBA (Vokietija) ar Metabion (Vok.)

DNR substratu paruošimas

24-meriniai DNR dupleksai 5'-33P-TAATAATGMGCTAATAATAATAAT/3'ATTATTACGHGATTATTATTATTA paruošti “sulydant” atitinkamas oligonukleotidų grandines.

Selenoliu paruošimas

Selenoliai (R-SeH) paruošti prieš pat naudojimą iš atitinkamų diselenidų (RSe-Se-R) pastaruosius redukuojant ditiotreitoliu (DTT). Diselenidai R1-Se-Se-R1 ir R2Se-Se-R2 yra komerciškai prieinami junginiai, tuo trarpu diselenidas R3-Se-Se-R3 (6) buvo susintetintas pagal žemiau aprašytas metodikas:

2-(2-chloretoksi)etanamino hidrochloridas (2)

Dietilenglikolaminas (3,0 g, 30 mmol) ištirpintas 150 ml 1,2-dichloretano, tirpalas prisotintas vandenilio chlorido dujomis. Į gautą suspensiją atšaldytą ledų vonioje supiltas sulfinilchloridas (6 ml, 81 mmol). Mišinys paliktas sušilti iki kambario temperatūros, vėliau mišinys kaitintas 65 °C (smėlio vonios) temperatūroje 1 vai. Tada tirpalas atšaldytas iki kambario temperatūros, tikslinis produktas išsodintas 80 ml dietileterio. Nuosėdos filtruotos, išeiga 3,8 g (83%). Balta kristalinė medžiaga, higroskopinė (lyd.t. 86-89°C).

¹H BMR (300 MHz, DMSO-De): δ = 2,97 (pi s, 2H, CH₂N); 3,67 (t, J = 5,4Hz, 2H, NCH2CH2O); 3,70-3,80 (m, 4H, CICH2CH2O); 8,15 (pi s, 3H, CH2NH3).

¹³C BMR (75 MHz, DMSO-De): δ = 39,0; 44,1; 67,1; 71,05.

Tiref-butil 2-(2-chloretoksi)etilkarbamatas (3)

J 2-(2-chloretoksi)etanamino hydrochlorido (2) (1,1 g, 6,88 mmol) suspensiją dichlorometane (15 ml) supiltas trietilaminas (0,955 ml, 6,87 mmol). Tirpalui išskaidrėjus j mišinį Šubertas di-fref-butil karbonatas (1,35 g, 6,19 mmol). Reakcijos mišinys maišytas 3 dienas kambario temperatūroje (argono atmosfera). Tada 15 ml 0,5 M HCI supilta į reakcijos mišinį, organinis sluoksnis atskirtas, plautas sūrymu ir džiovintas natrio sulfatu. Nugarinus dichlormetaną gautas 1 g (70%) tikslinio produkto bespalvės alyvos pavidalu.

¹H BMR (300 MHz, CDCb): δ = 1,47 (s, 9H, C(CH₃)₃); 3,30-3,40 (m, 2H, CH2N); 3,59 (t, J = 5,1 Hz, 2H, NCH2CH2O); 3,60-3,77 (m, 4H, CICH2CH2O); 4,95 (pi s, 1H, NHBoc).

¹³C BMR (75 MHz, CDCb): δ = 28,6; 40,5; 43,1; 70,5; 71,2; 79,6; 156,2.

N, A/'-bis-Boc-bis[2-(2-aminoetoksi)etil]diselenidas (5) į iref-butil 2-(2-chloretoksi)etilkarbamato (3) (0,5 g, 2,23 mmol) tirpalą dimetilformamide (5 ml) Šubertas kalio selenocianatas (1,3 g, 9,03 mmol). Reakcijos mišinys kaitintas 90°C (smėlio vonios) temperatūroje 8 vai. Tada tirpalas atšaldytas iki kambario temperatūros, į mišinį įpiltas vanduo (10 ml). Tikslinis produktas ekstrahuotas dietileteriu, organinis sluoksnis du kartus praplautas vandeniu (2x10 ml) ir džiovintas natrio sulfatu. Nugarinus dietileterį gautas Bis-Boc diselenido 5 ir pakeitimo produkto 4 mišinys. Šie junginiai jų neatskiriant ištirpinti etanolyje (0,5 ml), į šį mišinį supiltas 6M NaOH (0.1 ml) vandeninis tirpalas. Reakcijos mišinys užvirintas ir iš karto atšaldytas iki kambario temperatūros. Produktas ekstrahuotas dietileteriu, organinis sluoksnis džiovintas natrio sulfatu. Nugarinus dietileterį gauta 0,41 g (69%) tikslinio produkto gelsvos alyvos pavidalu.

¹H BMR (300 MHz, CDCIs): δ = 1,48 (s, 9H, C(CH₃)₃); 3,13 (t, J = 6,9 Hz, 2H, SeCHaCHzO); 3,29-3,40 (m, 2H, CH₂N); 3,56 (t, J = 5,1 Hz, 2H, NCH2CH2O); 3,77 (t, J = 6,9 Hz, 2H, SCH2CH2O); 5,00 (pi s, 1H, NHBoc).

¹³C BMR (75 MHz, CDCIs): δ = 28,7; 29,4; 40,6; 70,1; 71,0; 79,6; 156,2.

bis[2-(2-aminoetoksi)etil]diselenido hidrochloridas (6)

Į N, /\/^,-bis-Boc-bis[2-(2-aminoetoksi)etil]diselenido (5) (0.18 g, 0.34 mmol) tirpalą acetono (2 ml) ir vandens (2 ml) mišinyje supilta kone. HCI (0.28 ml, 3.4 mmol). Reakcijos mišinys kaitintas 60°C temperatūroje 24 vai. Tirpikliai nugarinti sumažintame slėgyje, gauta 0.07 g (85%) tikslinio produkto bespalvių kristalų pavidale.

¹H BMR (300 MHz, DMSO-De): δ = 2.95-3.05 (m, 2H, CH2N); 3.15 (t, J = 6,6 Hz, 2H, SeCH₂CH₂O); 3.65 (t, 2H, J = 5,4 Hz, CH2O); 3.73 (t, 2H, J = 6,6 Hz, OCH2); 8.05 (pi s, 3H, CH2NH3).

¹³C BMR (75 MHz, DMSO-De): δ = 29.2; 39.1; 66.8; 71.0.

Sekai-specifinis hmC modifikacijų nustatymas DNR, naudojant grandinės skėlimo piperidinu reakciją

DNR (30 nM taikinių kone.) veikiama 200 nM M.Hhal (taikinio seka GCGC) ir 12.5 mM selenolio reakcijos buferyje (15 mM Na-citratas pH 5.5, 0.2 mg/mL BSA) 1 vai. kambario temperatūroje. DNR išgryninama naudojant Oligo Clean & Concentrator™-5 (Zymo Research) ir Oligo Clean-Up and Concentration (Norgen Biotek Corp.) rinkinį ir inkubuota su 20 mM NalO4 (10 mM Na-PO4 pH 7.5 buferyje) 1 vai kambario temperatūroje. Pridėjus oiperidino iki 1M koncentracijos reakcija inkubuota 30 min 90°C temp., ir po to liofilizuota. Likutis suspenduotas gelio užnešimo tirpale (STOP solution, Thermo Fisher Scientific), denatūruotas 3 min 95°C temp. ir užneštas į 15% PAA gelį su 7 M ūrėja. Elektroforezė vykdyta 1-4 vai 90 mM Trisborato (pH 8.3), 2 mM Na2EDTA buferyje 60 W pastovaus galingumo režime. Geliai nusausinti VVhatman 3MM popieriumi ir radioaktyvios juostos autoradiografuotos su vaizdinimo plokšte (Fujifilm) bei skanuotos su FLA-5100 vaizdintuvu. Purinų (G+A) takeliai paruošti naudojant tradicines Maxam-Gilbert cheminės sekoskaitos reakcijas (Sambrook and Russell, 2001). Sanger’io sekoskaitos reakcijas vykdytos naudojant CycIeReader™ DNA Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific).

Claims (5)

1. Būdas, skirtas 5-hidroksimetilintų DNR CG vietų padėčių modifikavimui, kur būdas apima DNR paveikimo alifatiniu selenoliu žingsnį, dalyvaujant metiltransferazei, po to sekančiu oksidavimu švelniais reagentais, besiskiriantis tuo, kad šio poveikio pasėkoje susidaro kovalentinis ryšys tarp taikinio 5-hidroksimetilcitozino (hmC) liekanos ir gretimo guanino liekanos.

2. Būdas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad alifatinis selenolis yra parinktas iš 2-aminoetilselenolio, L-selenocisteino ir 2-(2-aminoetoksi)etilselenolio.

3. Būdas pagal 1 arba 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėta metiltransferazė yra DNR citozino-5 metiltransferazė, geriau M.Hhal arba M.SssI.

4. Būdas pagal bet kurį iš 1-3 punktų, besiskiriantis tuo, kad minėtas švelnus reagentas yra NalO4.

5. Būdas pagal bet kurį ankstesnį punktą, besiskiriantis tuo, kad papildomai apima modifikuotos DNR sekos paveikimo piperidinu pakopą, kur piperidinu indukuotas DNR grandinės skilimas rodo hmC liekanos buvimo DNR vietą.