LT3973B - Human follicle stimulating hormone receptor - Google Patents

Human follicle stimulating hormone receptor Download PDF

Info

Publication number
LT3973B
LT3973B LTIP1631A LTIP1631A LT3973B LT 3973 B LT3973 B LT 3973B LT IP1631 A LTIP1631 A LT IP1631A LT IP1631 A LTIP1631 A LT IP1631A LT 3973 B LT3973 B LT 3973B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
fsh
receptor
fragment
leu
fsh receptor
Prior art date
Application number
LTIP1631A
Other languages
English (en)
Inventor
Christie Ann Kelton
Shirley Vui Yen Cheng
Noreen Patrice Nugent
Rene Lynn Schweickhardt
Original Assignee
Applied Research Systems
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24688922&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=LT3973(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Applied Research Systems filed Critical Applied Research Systems
Publication of LTIP1631A publication Critical patent/LTIP1631A/xx
Publication of LT3973B publication Critical patent/LT3973B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/16—Masculine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Description

Šis išradimas susijęs su žmogaus folikulą stimuliuojančio hormono receptoriumi ir jo sinteze, naudojant rekombinantinės DNR metodus.
Folikulą stimuliuojantis hormonas (FSH) yra hipofizio veiklos heterodimerinis glikoproteininis hormonas, kuris siejasi struktūriniu panašumu su liuteinizacijos hormonu (LM) ir skydliaukės hormonu (TSH), kurie abu taip pat yra produkuojami hipofizyje ir chorioniniu gonadotropinu (CG), kuris produkuojamas placentoje. Hormonai yra santykinai dideli (28-38 kilodaltonai) ir yra sudaryti iš paprasto a subvieneto, nekovalentiškai surišto su atskiru β subvienetu, kas suteikia receptoriaus surišimo specifiškumą.
Ląsteliniai receptoriai šiems hormonams yra žinomi kaip membranos receptorių G baltymus surišančios klasės nariai, kurie, kai aktyvuoti, stimuliuoja adenilcikiazės aktyvumo padidėjimą. To pasėkoje išauga viduląstelinio transportinio adenozin-3', 5'-monofosfato (cAMP) lygis, ir tas įgalina steroidų sintezės ir sekrecijos padidėjimą. Pagal aminorūgščių sekų hidrofiliškumą ir hidrofobiškumą, išskirti trys pagrindiniai domenai: (1) hidrofilinė N-galo sritis, laikoma N-galo ekstraląsteliniu domenu, (2) septyni hidrofobiniai segmentai membranoje, yra laikoma transmembraniniu domenu, ir (3) C-galo sritis, kurioje yra galimos fosforilinimo vietos (serino, treonino ir tirozino liekanos), laikoma C-galo viduląsteliniu ar citoplazminiu domenu. Glikoproteininio hormono receptorių šeima nuo kitų G baltymus surišančių receptorių, tokių kaip β2-adrenergikai, rodopsinas ir K receptorius, skiriasi hidrofilinio N-galo domeno, kuris dalyvauja hormono surišime, dideliu dydžiu.
FSH receptorius pasireiškia sėklidžių Sertoli ląstelėse ir kiaušidės granuliuotose ląstelėse. Pripažinta, kad reikalingas iš principo grynas žmogaus FSH receptorius, natūraliai gautų preparatų išgryninimas yra nepraktiškas ir neturėtų būti reikšmingas nustatant aminorūgščių seką. Neseniai viena grupė klonavo kDNR koduojančią žiurkės FSH receptorių, nustatė aminorūgščių seką ir ekspresavo jį žinduolių ląstelėse (Sprengel, Mol. Endocrinol. 4:525, 1990). Kita grupė, bandant klonuoti TSH receptorių, atrodo, taip pat klonavo ir identifikavo žmogaus FSH receptoriaus trasmembraninės srities dalį (Parmentier, Science 246:1620,1989).
Šis išradimas apima iš esmės gryną žmogaus FSH receptorių, jo fragmentą ar mutantą, kuris suriša FSH, minėtą receptorių, fragmentą ar mutantą koduojančia DNR, ekspresijos vektorius, turinčius minėtą DNR, transfekuotas minėtais ekspresijos vektoriais ląsteles, ir minėto receptoriaus, fragmento ar mutanto gavimo būdus, kultivuojant minėtas transfekuotas ląsteles. Šis išradimas taip pat apima farmacines kompozicijas, turinčias minėtą receptorių, fragmentą ar mutantą, kaip pacientų gydymo tokiomis kompozicijomis metodą, siekiant sumažinti endogeninio FSH bioaktyvumą. Taip pat šiame išradime atskleidžiamas patobulintas žmogaus FSH tyrimas, naudojant receptorių fragmentą ar mutantą.
Trumpas figūrų aprašymas.
Fig. 1 yra žmogaus FSH receptoriaus kDNR klonų žemėlapis. Parodytas nepilnas restrikcinės endonukleazės žemėlapis buvo nustatytas, derinant DNR sekų duomenis, gautus iš penkių klonų kiekvienos dalies. Yra pažymėtas 0.2 kb padidėjimas. Regionai, kuriems priklauso klonai, yra pažymėti ištisinėmis linijomis po restrikciniu endonukleazinių žemėlapiu. Klono pažymėjimas ir apytikslis dydis kilobazėmis yra pažymėti atitinkamai kairėje ir dešinėje kiekvienos ištisinės linijos pusėje. Apytikslis koduojamo baltymo amino-galinio ekstraląstelinio domeno, transmembraninio domeno ir karboksi-galinio viduląstelinio domeno išsidėstymas yra pažymėtas punktyrinėmis rodyklėmis virš restrikcinės endonukleazės žemėlapio. Intarpo pozicija (tikriausiai introno arba introno dalies) 5-10 klone yra pažymėta atvira dėžute.
Fig. 2A ir 2B vaizduoja strategiją, panaudotą pilno ilgio žmogaus FSH receptoriaus kDNR konstravime, siekiant, kad žinduolių ląstelių linijoje ekspresuotųsi koduojamas baltymas.
Fig. 3 yra ekspresijos vektoriaus plazmidės diagrama, panaudota išvesti CHO-DUKX ląstelių linijas stabiliai transfekuotas žmogaus FSH receptoriumi.
Fig. 4 yra ekspresijos vektoriaus plazmidės diagrama, panaudota išvesti Y1 ląstelių linijas stabiliai transfekuotas žmogaus FSH receptoriumi.
Fig. 5 iliustruoja viduląstelinius cAMP kiekius, matuotus CHO-DUKX ląstelių linijoje CHOHFSHR4Q-13, paveikus skirtingomis FSH (rutuliukai) arba LH (trikampiukai) dozėmis. Kiekvienas taškas atitinka vidutinę reikšmę. Standartinės paklaidos nurodytos vertikaliais brūkšniais.
Fig. 6 iliustruoja progesterono kiekius, išmatuotus Y1 ląstelių linijos Y1HFSHR4-38 kultūriniame skystyje, paveikus skirtingomis FSH dozėmis.
Vertikalūs brūkšniai žymi standartinę paklaidą, matuojant progesteroną po kiekvienos FSH dozės.
Išradime panaudotas žmogaus FSH receptorius, ir jo FSH surišantys fragmentai ar mutantai, remiasi polipeptidais, kurie sugeba atpažinti ir selektyviai susirišti žmogaus FSH ir kurie produkuoja nežymų imunologinį atsaką žmogaus organizme. Taigi, pateikiamas išradimas apima žmogaus FSH receptorių, turintį aminorūgščių seką atvaizduotą Seka ID Nr:2, ir taip pat kaip ir FSH-surišantys fragmentai ar mutantai, išlaiko labai aukštą homologiškumo laipsnį (identiškumas mažiausiai 95%), su pavaizduota aminorūgščių seka, ar bent su ekstraląsteline dalimi. Žmogaus FSH receptoriaus fragmentai, aprašomi šiame išradime, apima fragmentus, liekančius po to, kai citoplazminiai ir/arba transmembraniniai domenai yra nuskelti nuo viso polipeptido. Išradime ypač išskiriamas fragmentas yra N-galo ekstraląsteline dalis, turinti maždaug nuo 1 iki 349 aminorūgščių, žmogaus FSH receptoriaus aminorūgščių sekos, atvaizduotos Seka ID Nr:2. Kadangi kelios kilpos apsukę transmembranines sritis (išvardintas sekančioje dalyje, Seka ID Nr:2) yra taip pat ekstraląstelinės, jos gali būti susijungę (pavyzdžiui per atitinkamas tarpines molekules) į fragmentus, turinčius aminorūgščių liekanų sekas N-gale ekstraląstelinėje dalyje, tuo pagerindamos ryšį. Polipeptidai gali būti glikolizilinti, kaip kad yra natūraliuose receptoriuose arba gali būti dalinai ar pilnai deglikozilinti.
Yra manoma, kad tiktai dalis aukščiau aprašyto N-galo ekstraląstelinio domeno gali būti efektyviai panaudota FSH surišimui, kadangi labai tikėtina, kad pilnas eksraceliuliarinis domenas nėra būtinas šiam tikslui. Taigi, fragmentas kuris yra kažkiek trumpesnis, negu pilno ekstraląstelinio domeno 349 aminorūgštys, gali būti lengvai padaromas ir testuojamas, norint nustatyti efektyvų susirišimą su FSH. Tokia ilga, kaip ekstraląstelinės dalies FSH-surišanti sritis, išlieka nepažeista ir viso panaudojamo fragmento ilgis nėra lemiamas. Pagal šią nuostatą, taip pat tikimasi, kad rūgštys, kurios neinterferuoja, gali būti pridėtos prie bet kurio ekstraląstelinio domeno galo ar FSH-surišančio fragmento, nepakenkiant polipeptido FSH-surišimo sugebėjimui. Atsižvelgiant į tai, šis išradimas apima žmogaus FSH receptoriaus fragmentus, susidedančius iš ekstraląstelinio domeno dalių ir kurios išlaiko iš esmės tokias pačias FSH-surišimo savybes, kaip pilnas ekstraląstelinis domenas.
Aukščiau aprašytų receptorių ir fragmentų mutantinės formos yra taip pat šio išradimo sritis. Tokie mutantai apima nuo vienos iki dešimties aminorūgščių liekanų konservatyvius pakeitimus, ir tokių pakeitimų lokalizacija ir prigimtis buvo parinkta taip, kad nežymiai degradavo receptoriaus ar fragmento, kuris buvo modifikuotas, FSH-surišančios savybės.
Neaktyvuotas žmogaus FSH receptorius, fragmentas ar mutantas paruošiamas išskiriant ar klonuojant DNR, koduojamą kDNR ar genomine biblioteka, liguojant į DNR vektorių, transfekuojant į recipijento ląsteles tuo vektoriumi, kultivuojant transfekuotas recipijento ląsteles tokiose sąlygose, kurios įgalina receptoriaus, fragmento ar mutanto ekspresiją ir receptoriaus, fragmento ar mutanto išskyrimą iš kultūros.
DNR, kuri yra naudojama vektorių ekspresijai, gali būti genomo DNR ar kDNR, koduojanti žmogaus FSH receptorių ir gali turėti sritis padidinančias ekspresiją, tokias kaip intronai, promotoriai, sustiprintojai ir t.t. DNR gali būti lengvai modifikuota pakeičiant, iškerpant ar įterpiant nukleotidus (pavyzdžiui, specifinė vietos mutagenezė) taip, kad nepakentų ekspresuoto baltymo biologiniam ar FSH-surišimo aktyvumui. Pavyzdžiui, konservatyvūs pakeitimai (mutacijos) kurių metu yra pakeičiama nuo vienos iki dešimties aminorūgščių, gali būti padarytos nepakenkiant ekspresuoto baltymo (muteino) bendrai struktūrai ir aktyvumui. Analogiškai, tam tikros DNR dalys, tokios kaip dalys, kurios koduoja citoplazminius ir/arba transmembraninius domenus, gali būti iškirptos taip, kad tiktai vienas baltymo fragmentas, toks kaip tirpus ekstraląstelinis domenas, bus ekspresuojamas. Žmogaus FSH receptorius, FSH-surišimo fragmentas ar mutantas gali taip pat būti ekspresuojamas kaip sulietas baltymas. Toks sulietas baltymas, įjungus polipeptidą C-gale, suteiks savybes, įgalinančias palengvinti baltymo gryninimą ar išgryninto baltymo imobilizaciją ant kieto substrato, naudojamo FSH tyrimuose ar FSH gryninimo metodikoje. Kitas toks sulietas baltymas, įjungus nuskeltą polipeptidą Ngale, palengvins ekspresiją.
Pagal šį išradimą produkuojamas žmogaus FSH receptorius yra iš principo neaktyvuotas, turint galvoje, kad jis yra visiškai laisvas nuo papildomų biologinių agentų normaliai susijusių su FSH receptoriumi, išskirtu iš natūralių šaltinių, tokių kaip pavyzdžiui: bakterijų, virusų ir kitų baltymų. Receptorius gali būti įjungtas į farmacines kompozicijas, sumaišant su atitinkamais farmaciškai priimtinais nešikliais.
Paprastai, vaistinės kompozicijos gali būti paruošiamos įvesti oraliniu, parenteraliniu (įskaitant poodines, į raumenis ir intravenines injekcijas), vaginaliniu ir rektaliniu, transbukaliniu (įskaitant poliežuvinį), transdermaliniu ar intranazaliniu būdais. Kompozicijos, įvedamos parenteraliniu būdu, paprastai būna skysto tirpalo, dispersinės suspensijos ar emulsijos, geriau kai būna izotoninės; vaginaliniam ar rektaliniam naudojimui - kremo ar žvakutės pavidalo; oraliniam ar transbukaliniam naudojimui - kaip tabletės ar kapsulės; ir intranazaliniam įvedimui - miltelių, nosies lašų ar aerozolių pavidalo. Gali būti naudojamos įvairios lėto išsiskirstymo, implantuoto depo ar injekcinės dozinės formos. Siekiant kontroliuoti preparato išnešiojimą po organizmą, aktyvusis komponentas gali būti taip pat inkorporuotos į polimerų matricas, liposomas ir mikrorutuliukus.
Šios kompozicijos gali būti suformuotos patogiomis vienetinėmis dozėmis ir taip pat gali būti paruoštos bet kokiu metodu, gerai žinomu farmakologijoje. Vaistinėse formose parenteraliniam įvedimui paprastu užpildu gali būti sterilus vanduo ar fiziologinis tirpalas, alkileno glikoliai -pvz. propileno glikolis, polialkilenglikoliai - pvz. polietileno glikolis, augalinės kilmės aliejus, hidrintas naftalenas ir pan. Vaistinės formos, skirtos vaginaliniam ar rektaliniam įvedimui, pvz. žvakutės, gali turėti užpildu pvz. poliakilenglikolius, vazeliną, kakao riebalus, ir pan. Vaistinės formos skirtos nazaliniam naudojimui gali būti miltelių pavidalo ir turėti tokius užpildus, pvz. laktozę ar dekstraną, taip pat gali būti vandeniniai ar aliejiniai tirpalai nosies lašų ar dozuojančių aerozolių pavidalo. Transbukaliniam naudojimui, tipiški užpildai apjungia cukrų, kalcio stearatą, apdorotą krakmolą ir pan. Į tirpalą ar miltelių pavidalo vaistinę formą gali būti pridedama viena ar daugiau paviršiaus aktyvių medžiagų rūgščių ar druskų. Atitinkamos farmaciškai priimtinos paviršiaus aktyvių medžiagų druskos bus tokios, kurios išlaiko savybę padidinti peptidų absorbciją, kaip junginio, į kurį jos įjungiamos, savybę ir kurios nėra žalingos organizmui ar kaip kitaip kontraindukuojančios.
Įvedamo aktyvaus ingradiento dozė pagal įvedimo būdą ir dažnį, akivaizdžiai priklauso nuo paciento gydymo poreikio ir sąlygų, norimo pasiekti terapinio efektyvumo ir gydytojo sprendimų gydymo metu.
Farmacinės kompozicijos, į kurias įeina žmogaus FSH receptorius, FSHsurišantys fragmentai ar mutantai, gali būti įvedami pacientui terapiškai efektyviomis dozėmis tam, kad susirištų su endogeniniu organizme cirkuliuojančiu FSH ir tokiu būdu kontroliuoti esamą bioaktyvaus FSH kiekį. Taigi, pateikiamo išradimo farmakologinės kompozicijos yra efektyviai naudojamos sumažinti endogeninio FSH bioaktyvumui. Pacientėms moterims toks gydymo būdas gali būti efektyviai naudojamas sutrukdant folikulo augimą ir subrendimą, tuo būdu sutrukdant nėštumui. Pacientams vyrams toks gydymas gali būti efektyvus norint sutrukdyti spermatogenezę. Iš dalies, atitinkamos formakologinės kompozicijos aukščiau aprašytiems tikslams turi žmogaus FSH receptoriaus fragmentą, kuris talpina N-galo ekstraląstelinį domeną ar paprastą dalį su įprastomis tokiomis pačiomis FSH-surišančiomis savybėmis.
Iš esmės grynas žmogaus FSH receptorius gali būti taip pat naudingai pritaikomas tradiciniuose FSH receptoriaus tyrimuose, tokiuose kaip pvz. Reichert, Endocrinology 94:483, 1974. Pagal pateikiamą išradimą, gauto gryno receptoriaus ar fragmento, surišančio FSH, pakeitimas žymiai pagerins tokių tyrimų lygį ir išdirbimą. Fragmentas, turintis N-galo ekstraląstelinį domeną ar FSH-surišantį fragmentą ir/arba sulietą baltymą gali taip pat imobilizuotis afiniškai siekiant išvalyti FSH iš skysčių, ekstraktų ir t.t.
Receptorius gali būti įkomponuotas į stabilių ląstelių liniją, geriau tam tikslui panaudojant eukariotinių ląstelių linijas, dar geriau - žinduolių ląstelių linijas, kurios stimuliuojamos receptoriaus, sugeba produkuoti išmatuojamą biologinį atsaką. Ląstelės atsako, esant FSH, išmatavimas tyrimo metu (pvz. testuojant serumą, plazmą, kultūrinę terpę, audinių homogenatą, ir t.t.) įgalins bioaktyvumo indikaciją ir tuo būdu suteiks galimybę naudoti labai patogų diagnostinį metodą. Tokios ląstelių linijos taip pat gali būti panaudojamos rūšiuojant chemines bibliotekas substancijoms, kurios gali sąveikauti su FSH receptoriumi ar testuojant peptidus ar mažus baltymus pagal jų sugebėjimą susirišti su FSH receptoriumi greitoje ekspresskryningo sistemoje. Kaip pavyzdys tokios sistemos yra tokia sistema, kur surištas ligandas rekombinantiniam FSH receptoriui, sąlygoja gamybą ar matuojamo produkto, tokio kaip cAMP ar progesterono, gamybos blokavimą. Tokia sistema gali būti toliau stiprinama efektyviai surišančiu ir lengvai išmatuojamu žymės elementu, pasižyminčiu bioliuminescencija (pvz.liuciferazės genas) atsakančiu į receptoriaus signalą transdukcijos keliu (pvz. naudojant cAMP atsako elementą).
Iš esmės grynas žmogaus FSH receptorius, FSH-surišantys fragmentai ar mutantai taip pat gali būti panaudojami rentgeno spindulių kristalografinėje analizėje vystant molekulių modelius. Tokie modeliai naudojami nustatant tretinę žmogaus FSH receptoriaus hormono-surišimo domeno struktūrą. Ši informacija įgalina pažvelgti į kontakto tarp FSH ir jo receptoriaus rūpimų sričių struktūrą, turint tikslą sukonstruoti peptidus, turinčius FSH agonistinį ar antagonistinį aktyvumą.
Siūloma rekombinantinė technika tinkanti pateikiamo išradimo baltymų ir DNR produkavimui, įskaitant identifikacinę atitinkamų mutacijų techniką, vektorius, recipijento ląsteles, kultivavimo sąlygas ir t.t., yra gerai žinomas kvalifikuotas būdas ir yra adekvačiai aprašyta pvz. US 4,761, 371 ir WO 88/09818, kurių ištraukomis čia remiamasi. Eksperimentų metodikos, kultivavimo terpė bakterijoms ir bakteriofagams, cheminiai tirpalai naudojami žemiau pateiktuose pavyzdžiuose, yra detaliai aprašyti Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 red., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, jeigu atskirai nenurodyta.
pavyzdys. Žmogaus FSH receptoriaus kDNR klonų izoliavimas ir charakterizavimas
Bibliotekos parinkimas
Žiurkių FSH receptoriaus kDNR klonas panašus į tą, kuris aprašytas Sprengel'io, Mol. Endocrinol. 4:525, 1990, buvo gautas iš dr. William'o Moyle, Medicinos ir Stomotologijos Universiteto New Jersey Robert Wood Johnson Medicinos Mokyklos. Šis kDNR klonas buvo įterptas į SV40 vėlyvosios ekspresijos vektorių pSVL (Pharmacia LKB, produkto numeris 27-4509-01) ir pavadintas pSVLFSHR. 2.1 kb DNR fragmentas, turintis regioną, atitinkantį pilną FSH receptoriaus baltymą koduojantį regioną, buvo iškirptas iš plazmidės naudojant restrikcinių endonukleazių saitus Xbal ir BamHl. Iškirpta DNR buvo frakcionuota pagal dydį gel-eiektroforezės metodu, o 2.1 kb žiurkių FSH receptoriaus fragmentas elektroeliujuotas iš gelio. Šiuo išgrynintu DNR fragmento bandiniu atrinktos bibliotekos identifikuojant žmogaus FSH receptoriaus kDNR klonus.
λ gtll kDNR biblioteka, sukonstruota iš ekstrahuotos iš žmogaus sėklidžių RNR, buvo nupirkta iš Clontech, Palo Alto, CA (katalogo numeris HLIOlOb) ir buvo amplifikuota prieš panaudojant. Dvidešimt amplifikuotos bibliotekos alikvotų, ekvivalenčių maždaug 7.5 x 10^ ližės vienetams (plaque forming units - pfu), buvo adsorbuota j 0.5 ml E.coli Y1088 kamieno suspensijos gazoną. Suspensija buvo paruošta, auginant per naktį Y1088 kultūrą 37°C NZYM arba LB, kuri papildyta 0.2% maltozės ir 10 mM MgSOą, surenkant ląsteles ir po to suspenduojant jas 10 mM MgSOą iki O.D-6qq0.5. Apie 6.5 ml išlydytos NZYM agarozės (0,7%), esant 48°C, buvo pridėta į kiekvieną fago/ląstelės suspensiją, ir gautas mišinys supiltas ant vienos iš dvidešimties 150 mm NZYM agaro lėkštelių (pašildytos iki 42°C). Bendras fagų, užneštų pirminiam atrinkimui, kiekis buvo apie 1.5 x 10^. Inkubuojama 4 vai. 42°C, po to kelias vai. atšaldoma 4°C, ir kiekvienos lėkštelės kopija buvo padaryta ant nitroceliuliozinio filtro (Millipore) pagal Benton'o ir Davies'o procedūras (Science, 196:180, 1977). Feinberg'o ir Vogelstein'o atsitiktinių oligonukleotidųpradmenų procedūra (Anai. Biochem. 137:266, 1983) buvo panaudota generuoti nuo žiurkių FSH receptoriaus DNR fragmento šablono, aprašyto ankstesniame paragrafe, 32p pažymėtą bandinį, kurio specifinis aktyvumas 1-2 x 10^ cpm/ųg. Fago dublikatų ant nitroceliuliozės filtro prehibridizacija atlikta 37°C, apie 6 vai. buferyje, kuriame yra 50% formamido, 5x SSC (1 x SCC yra 0.15 M natrio chloridas, 0.015 M natrio citratas), 20 mM natrio fosfato buferio, pH 7.2, 10xDenhardt'o reagento (50xDenhardt'o reagentas yra 1% Fikolo, 1% polivinilpirololidono ir 1% BSA) ir 100 ųg/ml tRNR. Filtrų hibridizacija atlikta tame pačiame buferyje, išskyrus tai, kad buvo pridėta žiurkių FSH receptoriaus DNR bandinio iki maždaug 3x10^ cpm/ml koncentracijos.
Denatūruota plazmidinė DNR buvo neutralizuota ir išsodinta etanoliu, pridedant 7.5 μΐ 7.5 M amonio acetato ir 110 μΐ 100 % etanolio ir atšaldant mišinį skystame azote. Išsodinta DNR buvo surinkta centrifuguojant mikrofugoje 10 min. DNR nuosėdos plautos 70 % etanoliu ir išdžiovintos. Sekvenavimo reakcijos atliktos su DNR polimeraze - Sekvenaze T7 (United States Biochemical), remiantis gamintojų instrukcijomis. Preliminarios sekvenavimo reakcijos atliktos su pUC18 polilinkerinio regiono tiesioginiais ir atvirkštiniais praimeriais (Pharmacia LKB). Gauti duomenys naudojami žmogaus FSH receptoriaus specifiniams sekvenavimo praimeriams sukurti. Praimeriai buvo sintezuoti arba 391 Applied Biosystems modelio DNR sintezatoriumi, arba užsakyti iš National Biosciensces, Ine., Hamel, MN. Keletas DNR sekvenavimo duomenų buvo gauti, sublokuojant pirminių klonų mažesnius restrikcinės endonukleazės fragmentus į pUC18 ir pakartojant sekvenavimo reakcijas su tiesioginiais ir atvirkštiniais praimeriais.
Preliminaraus sekvenavimo duomenys parodė, kad nė viena iš penkių izoliuotų kDNR neišreiškia pilno ilgio žmogaus FSH receptoriaus baltymą koduojančio regiono, bet, kombinuojant klonų sekvenavimo duomenis, padaroma išvada apie pilną baltymo seką. Penkių klonų giminingų vietų, lyginant su pilna žmogaus FSH receptoriaus kDNR seka, schematinė diagrama parodyta Fig.l. Pilna žmogaus FSH receptoriaus kDNR seka, gauta kombinuojant klonų persidengiančias sekas, panaudojus Genetics Computer Group (GCG) fragmentų apjungimo kompiuterinę programą, yra atvaizduota kaip seka ID Nr:l, o iš jos gauta aminorūgščių seka kaip ID Nr:2. Išanalizavus žmogaus FSH receptoriaus DNR seką, identifikuojamas ilgas atviras skaitymo rėmelis (ORF) iš 2085 nukleotidų, kurie koduoja 695 aminorūgščių baltymą. Taigi žmogaus FSH receptorius yra 3 am.r. ilgesnis negu žiurkės. Bendras procentinis identiškumas tarp žiurkės ir žmogaus FSH receptoriaus DNR ir baltymo sekų buvo nustatytas, panaudojus GCG Bestfit programą, ir yra 87% bei 90% atitinkamai. Ekstraląstelinė žmogaus FSH receptoriaus N-galo hidrofilinė dalis yra 349 am.r. ilgio ir yra 87% identiška su atitinkamu žiurkės FSH receptoriaus regionu. Dviejų rūšių septyni membraniniai regionai, sujungti trimis ekstraląstelinėmis ir trimis viduląstelinėmis kilpomis, yra identiški 95%, o C-galo viduląsteliniai regionai yra identiški 81%. Nepilna aminorūgščių seka publikuota Parmentier, Science 246: 1620 - 1622, 1989, atitinka sekos ID Nr:2 aminorūgštis nuo 399 iki 525.
5-10 klono variante už T nukleotido, 448 pozicijoje, ID Nr:l sekoje yra 0.25 kb intarpas. Jo DNR seka nebuvo panaši į kurią nors žiurkės arba žmogaus FSH receptoriaus DNR dalį, o taip pat nebuvo panaši į kurią nors žinomą seką, esančią Genbank arba EMBL DNR sekų duomenų bazėse. Atitinkamas 11-11 klono regionas neturėjo šio intarpo. LH receptoriaus kDNR klonai, izoliuoti iš žmogaus skydliaukės kDNR bibliotekos, turi panašius atvejus (Frazier, Mol. Endocrinol. 4:1264-1276, 1990). Šie atvejai, matyt yra kilę iš nepilnai ir/arba neteisingai sujungtų iRNR molekulių. 3' sujungimo pastovi seka (CAG'G) intarpo 5-10 gale akivaizdžiai patvirtina šį paaiškinimą.
pUC18 plazmidės, turinčios 11-11 (pavadintas pHFSHRll-11), 15-6 (pavadintas pHFSHR15-6) ir 5-10 (pavadintas pHFSHR5-10) kDNR intarpus, buvo deponuotos American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, 1 kovo, 1991 ir gavo papildomus numerius ATCC68538, ATCC68540 ir ATCC68539 atitinkamai. Deponavimas buvo atliktas pagal visus Budapešto Sutarties reikalavimus.
pavyzdys. Vektorių, ekspresuojančių pilną žmogaus FSH receptorių žinduolių ląstelėse, konstravimas
Žmogaus FSH receptoriaus DNR, kuri ekspresuojasi žinduolių ląstelėse, konstravimo strategija parodyta Fig. 2A ir 2B. Atsižvelgiant į Fig. 2A, 5' 691 bazių porų (bp) Nsil-BamHl fragmentas, kurio pradžia ATG, buvo išgrynintas iš pHFSHRll-11 ir subklonuotas į pUC18, kuri restriktuota su Pstl ir BamHl. Gauta plazmidė pHFSHRll-llnb buvo linearizuota su Sphl. Galai užbukinti, veikiant DNR polimerazės 1 Klenovo fragmentu (New England Biolabs, Beverly, MA).Ligavus Xhol linkerius (New England Biolabs, Beverly, MA) su užbukintais galais, mišinys buvo restriktuotas su Xhol bei BamHl ir maždaug 700 bp žmogaus FSH receptoriaus 5' fragmentas buvo išgrynintas gelfiltruojant. Fragmentas iš žmogaus FSH receptoriaus kDNR regiono vidurio buvo izoliuotas iš pHFSHRll-11, iškerpant su BamHl bei Sphl ir išgryninant gelfiltracija atitinkamą 734 bp fragmentą. 3' žmogaus FSH receptoriaus fragmentas, turintis iš TAA stop kodoną, buvo izoliuotas iš pHFSHR15-6, pirmiausia, kerpant plazmidę Dra3, po to užbukinant galus DNR polimeraze T4. Xhol linkeriai buvo liguoti su užbukintais galais ir gautas mišinys restriktuotas Sphl bei Xhol, o 3' 690 bp (maždaug) SphlXhol fragmentas izoliuotas ir išgrynintas.
Atsižvelgiant į Fig. 2B, 5' 700 bp Xhol-BamHl ir vidurinis 734 bp BamHlSphl žmogaus FSH receptoriaus kDNR fragmentai buvo subklonuoti į pUC18Xhol (sukurtas šioje laboratorijoje, pakeitus pUC18 polilinkeryje Smal saitą į Xhol su Xhol linkeriais), kuri kirpta su Xhol ir Sphl. Gauta pHFSHRl. 4xs plazmidė buvo kirpta su Xhol ir Sphl. Sukarpyta DNR buvo elektroforetiškai frakcionuota pagal fragmentų dydį 5-6% poliakrilamidiniame gelyje, ir maždaug 1400 bp fragmentas, turintis 5' ir vidurinį žmogaus FSH receptoriaus DNR regionus, buvo išpjautas ir išgrynintas elektroeliujuojant. 3’Sphl-Xhol fragmentas, turintis TAA stop kodoną, buvo subklonuotas į pUC18-Xhol, kuri kirpta su Xhol ir Sphl. Gauta pHFSHR1.4xs plazmidė buvo kirpta su Xhol ir Sphl. Sukarpyta DNR buvo frakcionuota 5-6% poliakrilamidiniame gelyje, o maždaug 700 bp turintis gabalas išpjautas ir išgrynintas elektroeliujuojant. Pilnas žmogaus FSH receptorių koduojantis regionas buvo surinktas, kombinuojant 5' 1400 bp Xhol-Sphl fragmentą su 3'700 bp Sphl-EcoRl fragmentu bei liguojant su pUC18-Xhol, kuri kirpta su Xhol ir EcoRI. Teisingas konstrukcijos, pavadintos pHFSHRX, surinkimas patikrintas, kerpant endonukleaze bei sekvenuojant DNR. Pilnai sukonstruotas žmogaus FSH receptoriaus 2.1 kb Xhol fragmentas, dar turintis maždaug 18 bp 5' ir 12 bp 3' nekoduojančias sekas, buvo iškirptas iš pHFSHRX su Xhol. Sukarpyta DNR buvo frakcionuota pagal dydį elektroforetiškai 0.7% agaroziniame gelyje. 2.1 kb Xhol fragmentas buvo išpjautas iš gelio, išgrynintas elektroeliujuojant Little Blue Tank™ (ISCO), panaudojus gamintojų rekomenduojamą procedūrą, ir įterptas į Xhol klonavimo saitus žinduolių ląstelių ekspresinėse vektorinėse plazmidėse. Plazmidės, turinčios tinkamos orientacijos intarpą žmogaus FSH receptoriaus iRNR transkripcijai, buvo atrinktos pagal restrikcinės endonukleazės fragmentų analizę. Prieš įvedant į žinduolių ląsteles, ekspresijos vektoriaus plazmidės DNR buvo išgiyninta arba dviem vienas po kito sekančiais centrifugavimais cezio chlorido tankio gradiente, arba panaudojus rinkinį plazmid maxi kit (Qiagen Chatsworth, CA) remiantis gamintojų protokolu.
Bet kuris tinkamas žinduolių ląstelėse besiekspresuojantis vektorius gali būti panaudotas žmogaus FSH receptoriaus ekspresijai. Vektorinės plazmidės būtini komponentai apima: eukariotinį promotorių, pavyzdžiui, pelės metalotioneino 1 (MMT-1) promotorių, Rauso Sarkomos Viruso promotorių arba SV40 ankstyvąjį ar vėlyvąjį promotorius, kuriais valdoma žmogaus FSH receptoriaus iRNR transkripcija; markerinį geną, pavyzdžiui, atsparumo neomicinui geną (Neo), dihidrofolatreduktazės (DHFR) geną arba daugybinio atsparumo (multidrug resistance) geną (MDR), kurių pagalba atrenkamos transfekuotos ląstelės; poliadenilinimo signalą (poly A), pavyzdžiui, ankstyvąjį SV40 poliadenilinimo regioną, skirtą receptoriaus RNR transkripto brandinimui; ir bakterinę replikacijos pradžią bei atsparumo antibiotikui geną, pavyzdžiui pBR322 ori ir atsparumo ampicilinui geną, įgalinančius vektorinės plazmidės augimą ir dauginimąsi tinkančiame E.coli kamiene. Keletui ląstelių linijų gali būti svarbus intronas, kuris yra regione transkribuotame į žmogaus FSH receptorių koduojančią RNR. Pageidautina, kad intronas būtų tarp promotoriaus ir žmogaus FSH receptoriaus kDNR intarpo, dėl to jis yra 5' netransliuojamame žmogaus FSH receptoriaus RNR transkripto regione. Gali būti panaudotas bet kuris tinkamas intronas. Mūsų eksperimentuose naudotas intronas buvo žmogaus glikoproteino geno a subvieneto 2 kb Xbal-Pstl introno A dalis (Fiddes, J. Mol. Appl. Genet. 1:13, 1981) Ekspresijos vektoriuose jis įterptas tarp MMT-1 promotoriaus regiono ir žmogaus FSH receptoriaus kDNR fragmento. Sutrumpintas intronas išlaikė endogeninę jungtį, bet jungties donoras buvo kompensuotas sintetiniu oligonukleotidu.
Žmogaus FSH receptoriaus ekspresinio vektoriaus, panudoto CHO ląstelėms transfekuoti pDaHFSHRx (žmogaus FSH receptorius, esantis CLH3AXSV2DHFRhaIVS), diagrama parodyta Fig. 3, o žmogaus FSH receptoriaus ekspresijos vektoriaus, panaudoto stabilizuoti transfekuotas Y1 ląsteles pNctHFSHRx (žmogaus FSH receptorius, esantis CLH3AXSV2NEOhaIVS), diagrama parodyta Fig. 4 MMT-1 geno sekos (nukleotidai 4542-7514 Fig. 3, nukleotidai 5192-8164 Fig. 4), kurios turi promotorinį regioną, yra tokios pat kaip konstrukcijos CLH3X 5' kryptimi Xhol saite (Reddy, DNA 6:461 1987). Žmogaus glikoproteino geno a subvieneto geno introno A fragmentas, aprašytas ankstesniame paragrafe, yra tarp nukleotidų 7514 bei 9514 Fig. 3 ir tarp nukleotidų 8164 bei 10164 Fig. 4 3' kryptimi. Nuo Xhol saito MM-1 intronai ir poliadenilinimo signalo sekos buvo pašalintos ir pakeistos ankstyvuoju SV40 poliadenilinimo regionu (nukleotidai 11614-11857 Fig. 3, nukleotidai 12264-12508 Fig. 4). pML regione (Lusky, Nature 293:79, 1981) yra bakterijos replikacijos pradžia ir atsparumo ampicilinui genas iš pBR322 (nukleotidai 1925-4542 Fig.3, nukleotidai 2575-5192 Fig.4. DHFR geno transkripcijos vienetas (nukleotidai nuo 1 iki 1925 Fig.3), kuris turi pelės DHFR kDNR ir SV40 ankstyvojo promotoriaus regioną, mažąjį T introną ir poliadenilinimo ankstyvojo regiono sekas, priklauso PvuII-BamHl fragmentui, kuris yra pSV2DHFR (Subramani, Mol. Geli. Biol. 1:854, 1981). PvuII saitas buvo pakeistas BamHl saitu, prieš įterpaint fragmentą į ekspresinio vektoriaus plazmidę. Neo geno transkripcijos vienetas (nukleotidai 1-2575 Fig. 4) buvo surinktas, pakeičiant DHFR kDNR (nukleotidai 342-1077 Fig. 3) 1385 bp HindlII-SmaI fragmentu iš pSV2-neo (Southern, J. Mol. Appl. Cienet. 1:327, 1982). SmaI saitas buvo pakeistas į BamHl saitą, prieš įterpiant fragmentą į ekspresijos vektoriaus plazmidę.
pNahFSHRX plazmidė gali būti panaudota ilgiau besidauginančių žinduolių ląstelių transfekcijai, ir buvo deponuota su ATCC lapkričio 19, 1991, su papildomu numeriu ATTC68833. Deponavimas buvo atliktas pagal visus Budapešto Sutarties reikalavimus. pDahFSHRX plazmidė labiausiai tinka transfekuoti ląstelių linijas, kurios nepasižymi dihidrofolatreduktaziniu (DHFR) aktyvumu.
DNR klonavimo ir kostravimo technikos gali būti panaudotos žmogaus FSH receptoriaus DNR ekspresinės konstrukcijos modifikavime, taip kad FSH-surišantys fragmentai yra koduojami. Šie modifikuoti DNR fragmentai gali būti įterpti į ekspresijos vektorius, pavyzdžiui, aprašytus čia ir naudotus žinduolių ląstelių trasfekcijai. Išaugusios linijos sekretuotų tirpius žmogaus FSH-surišančio receptoriaus fragmentus, tokius kaip amino-galinj ekstraląstelinį domeną arba jo FSH-surišantį fragmentą.
pavyzdys. Žinduolių ląstelių linijų išvystymas, kurios stabiliai ekspresuoja funkcionalų žmogaus rekombinantinj FSH receptorių arba jo FSH surišant!
fragmentą, kuris gali būti ir pakitęs
Tinkamos žinduolių ląstelių linijos, kurios galėtų ekspresuoti rekombinantinj žmogaus FSH ir jo darinius, apima kinietiško žiurkėno kiaušidės (CHO), pelės adenokarcinomą Yl, žiurkės hipofizę GH3, žmogaus pieno liaukos karcinomą MCF7 ir žmogaus embriono inkstą 293. Yl ir CHO ląstelių panaudojimas yra aprašytas šiame pavyzdyje.
Y1 ląstelės yra klonalinis steroidus sekretuojantis ląstelių kamienas, paimtas iš pelės antinksčio žievės auglio (Yasumura, Cancer Res. 26:529-536, 1966). Šios ląstelės buvo gautos iš ATCC ląstelių banko (ATCC CCL 79) ir panaudotos kaip kultūra, auginant Ham'o F10 terpėje, papildytoje 15 % arklio serumu (HS), 2,5% FBS ir 1% L-glutaminu (Yl auginimo terpė).
CHO-DUKX yra CHO ląstelių kloninis mutantas, neturintis dihidrofolatreduktazinio aktyvumo (Urlaub G. and Chasin, L.A. PNAS 77: 42164220, 1980). Ląstelės buvo augintos minimalioje terpėje Alpha (MEM-a), papildytoje 10% FBS ir 1% L-glutaminu (Yl auginimo terpė).
Visos ląstelės augintos 37°C, 5% CO2, sudrėkintoje atmosferoje.
Trasfekcija kalcio fosfatu
Panaudotas trasfekcijos protokolas buvo jau publikuoto metodo (Graham, Virology 52:456, 1973) modifikacija. Maždaug 24 vai. prieš transfekciją ląstelės buvo patalpintos į 100 mm diametro lėkšteles: tankis 7x10^ ląstelių/lėkštelei (CHODUKX) arba 1x10^ ląstelių/lėkštelei (Yl).
Atliekant transfekciją, 10 pg vektorinės plazmidinės DNR (pDaHFSHRX CHODUKX ląstelėms, pNaHFSHRX Yl ląstelėms) buvo pridėta į 0.5 ml. transfekcijos buferio. Transfekcijos buferis buvo paruoštas, maišant 4 g NaCl, 0.185 g Kcl 0.05 g Na2PC>4, 0.5 g dekstrozės ir 2.5 g HEPES steriliame, distiliuotame vandenyje ir pridedant tūrį iki 500 ml, o pH iki 7.5. Į DNR/transfekcijos buferio mišinį buvo pridėta 31 μΐ 2 M CaCl2. Tirpalas buvo sumaišytas ir paliktas kambario temperatūroje 45 min., tam kad susidarytų DNR nuosėdos, kurios buvo užsluoksniuotos ant ląstelių, pašalinus kultūrinę terpę. Po 20 min., esant kambario temperatūrai, buvo pridėta 5 ml atitinkamos auginimo terpės ir ląstelės kultivuotos 6 valandas. Terpė pašalinama, o ląstelės purtomos 3.5 min. 34 ml trasnsfekcijos buferio, kuriame yra 15% glicerolio. Ląstelės dukart plaunamos PBS buferiu prieš pridedant 10 ml auginimo terpės. Maždaug 48 vai. po transfekcijos CHO-DUKX ląstelės buvo kultivuotos iki 1:10 paviršiaus ploto, o po to pridedama selektyvi terpė. Y1 ląstelės augo 72 vai. po transfekcijos iki 1:5 užimamo ploto, prieš pridedant selektyvios terpės. CHO-DUKX ląstelių selektyvią terpę sudaro MEM-α be ribonukleozidų ir dezoksiribonukleozidų, papildyta 10% dializuotu FBS, 1% Lglutaminu bei 0.02 μΜ metotreksatu (ΜΤΧ). Y1 ląstelių selektyvią terpę sudaro Y1 auginimo terpė su 80 ųg/ml G418. ΜΤΧ-atsparios CHO-DUKX ląstelių kolonijos bei G-418-atsparios Y1 ląstelių kolonijos susiformavusios maždaug po 2-3 savaičių, buvo individualiai atrinktos ir kultivuotos iki tokio ląstelių kiekio, kuris buvo pakankamas konservuoti užšaldant bei testuoti hormoninį atsaką.
Žmogaus rekombinantinio FSH receptoriaus bioktyvumo stabiliose trasfekuotose CHO ląstelėse demonstravimas
Siekiant nustatyti, ar sukonstruota kDNR koduojanti receptorių gali produkuoti baltymą, kuris būtų biologiškai aktyvus stabiliose trasfekuotose CHO ląstelėse, ΜΤΧ-atsparios CHO ląstelių kolonijos buvo paveiktos žmogaus rekombinantiniu FSH ir buvo išmatuotas viduląstelinis cAMP. Tiriant cAMP, ląstelės buvo kultivuojamos CHO ląstelių selekcinėje terpėje, 12-os šulinėlių plokštelėse su 2.5x10^ ląstelių/šulinėlyje koncentracija. Po 72 kultivavimo valandų, kiekvienas šulinėlis buvo praplautas 1.5 ml šilta auginimo terpe. Į kiekvieną praplautą šulinėlį buvo pridėta 300 μΐ auginimo terpės be serumo, kurioje yra 0.1 mM 3-izobutil-l metilksantino (Sigma). Po 15 min. inkubavimo, žmogaus rekombinantinis FSH buvo pridėtas j terpę kiekviename šulinėlyje taip, kad galutinė koncentracija apytiksliai buvo 335 ng (2413 mIU/ml). po 30 min. inkubavimo, bandymas buvo nutrauktas ląsteles paveikiant keturiais greito sušaldymo-atšildymo ciklais. 50 μΐ alikvoto iš kiekvienų ląstelių lizato pernešta į 1,5 ml mėgintuvėlius norint nustatyti baltymo kiekį. Šaltas etanolis (300 μΐ) buvo pridėtas į kiekvieno lizato pavyzdį prieš pernešant į 1.5 ml centrifugavimo mėgintuvėlius. Visi lizatų pavyzdžiai buvo centrifuguoti 13,000xg 15 min. tam, kad atskirti ląstelių nuolaužas. Bendras ištirpusių baltymų kiekis buvo nustatomas naudojant baltymų nustatymo rinkinį Bio-Rad (katalogo Nr 500-0002) pagal gamintojo metodiką. Etanoliu apdoroti lizato pavyzdžiai buvo liofilizuoti alikvotomis po 5-100 μΐ, ir suspenduojami 100 μΐ matavimo buferinio tirpalo iš Dupont/NEN Medical Products cAMP matavimo rinkinio (katalogo Nr. NEK-033). cAMP kiekis suspenduoto lizato pavyzdžiuose buvo nustatytas naudojant radioimuninę metodiką pateiktą kartu su rinkiniu. Pavyzdžiai tyrimui nebuvo praskiesti. Daugumoje žmogaus FSH receptoriaus-transfekuotų CHO ląstelių linijų, aukšti viduląstelinio cAMP lygiai buvo išmatuoti po FSH stimuliacijos, lyginant su kontrole (netransfekuotos CHODUKX ląstelės transfekuotos su CLH3AXSV2DHFRhaIVS). Vidutinis atsakas buvo apie 16-kartų didesnis, negu kontrolėse.
Viena neklonuota ląstelių linija CHOHFSHR4Q-13, buvo parinkta hormono atsako, priklausomai nuo dozės, analizei. Procedūra buvo panaudota ta pati, kaip ankstesniame paragrafe, išskyrus tai, kad ląstelės buvo apdorotos žmogaus rekombinantiniu FSH ar LH, 0-10,000 mIU/ml koncentracija. Kiekviena dozė buvo analizuojama po tris pakartojimus. Produkuojamo viduląstelinio cAMP kiekis buvo išreikštas nanomoliais/miligrame (n mol/mg) tirpaus baltymo ir nubraižytas grafikas prieš FSH ar LH kocentraciją, norint gauti atsako priklausomybės nuo dozės, kreivę. Atsako nuo FSH ir LH dozės kreivės parodytos Fig. 5. Pagal rezultatus matyti, kad CHOHFSHR4Q-131ąstelių linija demonstruoja didžiulį išaugimą viduląstelinio cAMP, kaip atsako į stimuliaciją FSH, bet ne į LH. Pusiau maksimali stimuliacija FSH (ED5q) vyksta esant FSH dozei 144 mIU/ml. Žmogaus FSH receptoriaus kDNR gali būti naudojama produkuoti biologinį funkcionalų žmogaus FSH receptoriaus baltymą CHO ląstelėse, įgalinantį ląsteles tarpininkauti specifiniam cAMP atsakui į FSH, bet ne į LH.
Žmogaus FSH receptoriaus kiekis CHOHFSHR4Q-13 linijoje, ar panašioje linijoje, kuri produkuoja žmogaus rekombinantinį FSH receptorių ar FSHsurišančius fragmentus ar mutantus, gali didėti, veikiant ląsteles palaipsniui didėjančia ΜΤΧ koncentracija. Tas įtakoja amplifikaciją DHFR kDNR kopijų skaičiaus išilgai prisijungimo sekos, kuri turi žmogaus FSH receptoriaus kDNR ir tiesiogiai didina koduojamo baltymo sintezę. Tai galima atlikti, jeigu reikalinga, norint padidinti tyrimo jautrumą. Taip pat žinduolių ląstelės, kurios ekspresuoja aukštą žmogaus FSH receptoriaus, FSH-surišančių fragmentų ar mutantų lygį, gali būti naudojamos žmogaus FSH receptoriaus baltymo gamybai, terapiniams ar radioimuniniams tyrimams.
CHOHFSHR4Q-13, ar panaši linija, gali taip pat būti panaudojama tyrimuose įvertinant in vitro farmacinių preparatų, turinčių FSH, ar į FSH panašias substancijas, bioaktyvumą. Minėtas genas toks kaip liuciferazė, gali būti efektyviai surištas su cAMP ir cAMP lygio padidėjimas gali būti tiesiogiai išmatuojamas neradioaktyviu metodu, tokiu kaip bioliuminescencija, kuri suteikia galimybę išmatuoti FSH bioaktyvumą.
CHOHFSHR4Q-13 linija buvo deponuota su ATCC 1991 lapkričio 19, kaip papildomas numeris ATCC CRL 10921. Deponavimas buvo atliktas pagal visus Budapešto Sutarties reikalavimus.
Rekombinantinio žmogaus FSH receptoriaus bioaktyvumo stabiliose transfekuotose pelės antinksčiu Y1 ląstelėse demonstravimas
Norint nustatyti, ar sukonstruota žmogaus FSH receptoriaus kDNR konstrukcija gali produkuoti baltymą, kuris būtų biologiškai aktyvus stabiliose transfekuotose Y1 ląstelėse, G418-atsparios Y1 ląstelių kolonijos buvo paveiktos žmogaus rekombinantiniu FSH ir kultivuotos kultūrinėje terpėje, siekiant nustatyti progesterono kiekį. Progesterono nustatymui, ląstelės buvo kultivuojamos 6 šulinėlių plokštelėse (35 mm diametro šulinėlis), esant 4x10^ ląst/šulinėlyje tankiui, Y1 selekcinėje terpėje. Po dviejų dienų kultivavimo, Y1 ląstelių terpė buvo pašalinta ir pakeista 3 ml Ham'o F10 terpe, kurioje yra 5% arklio serumo, 0.8% jaučio serumo, 1% L-glutamino ir 80ųg/ml G418. Po vienos dienos inkubacijos, terpė buvo pašalinta ir ląstelės du kartus praplautos 2ml Ham'o F10 terpe su 1 mg/ml BSA (V frakcija), 1% L-glutamino ir 80ųg/ml G418 (tyrimo terpe). Siame etape vidutinis ląstelių skaičius šulinėlyje buvo nustatomas kiekvienai ląstelių linijai, pašalinant ir suskaičiuojant ląsteles iš trijų testuojamų šulinėlių. Ląstelės po to buvo kultivuojamos 4 vai. su 1 ml tiriamosios terpės, turinčios 100 IU/ml žmogaus rekombinantinio FSH. Po inkubacijos, kultivavimo lėkštelės patalpinamos j ledą, iki to laiko, kol kultūrinė terpė iš kiekvieno šulinėlio buvo pernešta į stiklinius 12x75 centrifugavimo mėgintuvėlius. Mėgintuvėliai su kultūrine terpe buvo patalpinti j verdančio vandens vonią 10 min., po to centrifuguoti 1100xg, 4°C temperatūroje. Supernatantai pernešti į švarius 12x75 stiklinius mėgintuvėlius ir laikomi -20°C per naktį. Progesterono lygis išmatuotas naudojant Serono Diagnostics Progesterone ΜΑΙΑ, produkto Nrl2274, platinamas Ciba Corning, Medfield, MA. Tyrimai buvo atlikti pagal gamintojo pateiktas instrukcijas, išskyrus tai, kad kultūrinės terpės pavyzdžiai ir progesteronas standartinei kreivei buvo skiedžiami PBS, turinčiu 0.1% BSA ir 0.6% natrio azido, vietoje skiesto buferio, kuris būna rinkinyje. Progesteronas standartinei kreivei buvo gautas iš CalBiochem (kat Nr 5341) ir prieš naudojimą buvo skiestas 100% etanoliu iki 15 ųg/ml koncentracijos. Išeiginis tirpalas buvo laikomas -70°C temp. Progesterono standartinės kreivės praskiedimų galutinės koncentracijos buvo tokios pačios, kokios rekomenduojamos rinkinyje. Po praskiedimo progesterono standartiniai tirpalai išliko stabilūs, laikant vieną savaitę 4°C.
Keletas FSH apdorotų Y1 linijų, stabiliai trasfekuotų žmogaus FSH receptoriumi, sekretavo padidintą progesterono kiekį, lyginant su kontrole (ta pati linija neapdorota FSH, netransfekuotos Y1 ląstelės bei Y1 ląstelės transfekuotos su CLH3AXSV2NEOhaIVS). Viena neklonuota linija Y1HFSHR4-38 buvo parinkta hormono dozės atsako analizei. Naudojama procedūra buvo tokia pati, kaip aprašyta ankstesniame paragrafe, išskyrus tai, kad ląstelės buvo apdorotos FSH, kurio koncentracijos buvo nuo 0-100 mIU/ml. Kiekvienos dozės tyrimas buvo atliktas su pakartojimu. Progresterono kiekis, kurį produkavo FSH stimuliuotos Y1 ląstelės buvo normalizuotas iki 1x10^ ląstelių ir nubraižytas priklausomybės nuo FSH koncentracijos grafikas, norint gauti atsako pagal dozę kreivę. Atsako pagal dozę kreivė parodyta Fig. 6. Siame daliniame eksperimente 25 kartus išaugęs progesterono aktyvumas buvo stebimas esant 20mIU/ml žmogaus rekombinantinio FSH dozės. Ribos buvo nuo 2.5 iki 20mIU/ml ir ED50 buvo 6.4mIU/ml FSH. Šie rezultatai, rodantys kad nuo FSH dozės priklauso progesterono sekrecijos išaugimas, buvo stebimi stabiliose Y1 ląstelėse transfekuotose žmogaus rekombinantiniu FSH receptoriumi. Žmogaus FSH receptorius yra funkciškai aktyvus, kai išskirtas pelių antinksčių Y1 ląstelėse.
Ląstelių populiacijos gautos iš CHOHFSHR4Q-13 arba Y1HFSHR4-38 ląstelių linijų, ar panašių ląstelių linijų, gali būti naudojamos FSH ar panašioms medžiagoms į FSH, biotyrimų in vitro jautrumo nustatymui. Kiti FSH in vitro tyrimai, kurie yra šiuo metu naudojami, tokie kaip granuliacinių ląstelių biotyrimai ir Sertoli ląstelių biotyrimai reikalauja žiurkių pirminės ląstelių kultūros padarymo kiekvieną kartą, kai tyrimai yra atliekami. Naujiems Y1 ląstelių ir CHO ląstelių biotyrimams yra naudojama stabilių transformuotų nepertraukiamų ląstelių linija. Tai įgalina biotyrimų in vitro metodų pranašumą praktikoje, lyginant su dabartiniais metodais, nes jie yra paprasti, tikslūs ir pastovūs.
Protokolas
SEKA ID Nr:l
Sekos charakteristikos (Λ) Ilgis: 2179 (B) Tipas: nukleino rūgštis (C) Grandiškumas: Dviguba (D) Topologija: Linijinė
Molekulės tipas: kDNR - mRNR
Kilmės šaltinis:
(A) Organizmas: Ilomo sapiens (F) Audinių tipas: Sėklidės (A) Biblioteka: Xgtl 1 kDNR biblioteka, Čion Tech #HL1010b (B) Klonas: pHFSHRll-ll,pHFSHR15-6
Savybė:
(A) Vardinis raktas:baltymą koduojantis regionas (B) Lokacija: 75-2159
Sekos aprašymas: SEKA ID Nr:l
TGTGGAGCTT CTGAGATCTG TGGAGGTTTT TCTCTGCAAA TGCAGGAAGA AATCAGGTGG 60
ATGGATGCAT AATT ATG GCC CTG CTC CTG GTC TCT TTG CTG Leu GCA TTC Ala Phe CTG Leu 110
Met Ala Leu Leu -15 Leu Vai Ser Leu -10
AGC TTG GGC TCA GGA TGT CAT CAT CGG ATC TGT CAC TGC TCT AAC AGG 158
Ser Leu Gly Ser Gly Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg
-5 1 5 10
GTT TTT CTC TGC CAA GAG AGC AAG GTG ACA GAG ATT CCT TCT GAC CTC 206
Vai Phe Leu Cys Gln Glu Ser Lys Vai Thr Glu Ile Pro Ser Asp Leu
15 20 25
CCG AGG AAT GCC ATT GAA CTG AGG TTT GTC CTC ACC AAG CTT CGA GTC 254
Pro Arg Asn 30 Ala Ile Glu Leu Arg 35 Phe Vai Leu Thr Lys 40 Leu Arg Vai
ATC CAA AAA GGT GCA TTT TCA GGA TTT GGG GAC CTG GAG AAA ATA GAG 302
Ile Gln Lys Gly Ala Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu
45 50 55
ATC TCT CAG AAT GAT GTC TTG GAG GTG ATA GAG GCA GAT GTG TTC TCC 350
Ile Ser Gln Asn Asp Vai Leu Glu Vai Ile Glu Ala ASp Vai Phe Ser
60 65 70 75
AAC CTT CCC AAA TTA CAT GAA ATT AGA ATT GAA AAG GCC AAC AAC CTG 398
Asn Leu Pro Lys Leu His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu
80 85 90
CTC TAC ATC AAC CCT GAG GCC TTC CAG AAC CTT CCC ACC CTT CAA TAT 446
Leu Tyr Ile Asn Pro Glu Ala Phe Gln Asn Leu Pro Asn Leu Gln Tyr
95 100 105
CTG TTA ATA TCC AAC ACA GGT ATT AAG CAC CTT CCA GAT GTT CAC AAG 494
Leu Leu Ile Ser Asn Thr Gly Ile Lys His Leu Pro Asp Vai His Lys
110 115 120
ATT CAT TCT CTC CAA AAA GTT TTA CTT GAC ATT CAA GAT AAC ATA AAC 542
Ile His Ser Leu Gln Lys Vai Leu Leu Asp Ile Gln Asp Asn Ile Asn
125 130 135
ATC CAC ACA ATT GAA AGA AAT TCT TTC GTG GGG CTG AGC TTT GAA AGT 590
Ile His Thr Ile Glu Arg Asn Ser Phe Vai Gly Leu Ser Phe Glu Ser
140 145 150 155
GTG ATT CTA TGG CTG AAT AAG AAT GGG ATT CAA GAA ATA CAC AAC TGT 638
Vai Ile Leu Trp Leu Asn Lys Asn Gly Ile Gln Glu Ile His Asn Cys
160 165 170
GCA TTC AAT GGA ACC CAA CTA GAT GAG CTG AAT CTA AGC GAT AAT AAT 686
Ala Phe Asn Gly Thr Gln Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Asp Asn Asn
175 180 185
AAT TTA GAA GAA TTG CCT AAT GAT GTT TTC CAC GGA GCC TCT GGA CCA 734
Asn Leu Glu Glu Leu Pro Asn Asp Vai Phe His Gly Ala Ser Gly Pro
190 195 200
GTC ATT CTA GAT ATT TCA AGA ACA AGG ATC CAT TCC CTG CCT AGC TAT 782
Vai Ile Leu Asp Ile . Ser Arg Thr Arg Ile His Ser Leu Pro Ser Tyr
205 210 215
GGC TTA GAA AAT CTT AAG AAG CTG AGG GCC AGG TCG ACT TAC AAC TTA 830
Gly Leu Glu Asn Leu Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Asn Leu
220 225. 230 235
AAA AAG CTG CCT ACT CTG GAA AAG CTT GTC GCC CTC ATG GAA GCC AGC 878
Lys Lys Leu Pro Thr Leu Glu Lys Leu Vai Ala Leu Met Glu Ala Ser
240 245 250
CTC ACC TAT CCC AGC CAT TGC TGT GCC TTT GCA AAC TGG AGA CGG CAA 926
Leu Thr Tyr Pro 255 Ser His Cys Cys Ala 260 Phe Ala Asn Trp Arg 265 Arg Gln
ATC TCT GAG CTT CAT CCA ATT TGC AAC AAA TCT ATT TTA AGG CAA GAA 974
Ile Ser Glu 270 Leu His Pro Ile Cys 275 Asn Lys Ser Ile 280 Leu Arg Gln Glu
GTT GAT TAT ATG ACT CAG ACT AGG GGT CAG AGA TCC TCT CTG GCA GAA 1022
Vai Asp 285 Tyr Met Thr Gln Thr 290 Arg Gly Gln Arg Ser 295 Ser Leu Ala Glu
GAC AAT GAG TCC AGC TAC AGC AGA GGA TTT GAC ATG ACG TAC ACT GAG 1070
Asp 300 Asn Glu Ser Ser Tyr 305 Ser Arg Gly Phe Asp 310 Met Thr Tyr Thr Glu 315
TTT GAC TAT GAC TTA TGC AAT GAA GTG GTT GAC GTG ACC TGC TCC CCT 1118
Phe Asp Tyr Asp Leu 320 Cys Asn Glu Vai Vai 325 Asp Vai Thr Cys Ser 330 Pro
AAG CCA GAT GCA TTC AAC CCA TGT GAA GAT ATC ATG GGG TAC AAC ATC 1166
Lys Pro Asp Ala 335 Phe Asn Pro Cys Glu 340 Asp Ile Met Gly Tyr 345 Asn Ile
CTC AGA GTC CTG ATA TGG TTT ATC AGC ATC CTG GCC ATC ACT GGG AAC 1214
Leu Arg Vai 350 Leu Ile Trp Phe Ile 355 Ser Ile Leu Ala Ile 360 Thr Gly Asn
ATC ATA GTG CTA GTG ATC CTA ACT ACC AGC CAA TAT AAA CTC ACA gtc! 1262
Ile Ile 365 Vai Leu Vai Ile Leu 370 Thr Thr Ser Gln Tyr 375 Lys Leu Thr Vai
CCC AGG TTC CTT ATG TGC AAC CTG GCC TTT GCT GAT CTC TGC ATT GGA 1310
Pro 380 Arg Phe Leu Met Cys 385 Asn Leu Ala Phe Ala 390 Asp Leu Cys Ile Gly 395
ATC TAC CTG CTG CTC ATT GCA TCA GTT GAT ATC CAT ACC AAG AGC CAA 1358
Ile Tyr Leu Leu Leu 400 Ile Ala Ser Vai Asp 405 Ile His Thr Lys Ser 410 Gln
TAT CAC AAC TAT GCC ATT GAC TGG CAA ACT GGG GCA GGC TGT GAT GCT 1406
Tyr His Asn Tyr 415 Ala Ile Asp Trp Gln 420 Thr Gly Ala Gly Cys 425 Asp Ala
GCT GGC TTT TTC ACT GTC TTT GCC AGT GAG CTG TCA GTC TAC ACT CTG 1454
Ala Gly Phe 430 Phe Thr Vai Phe Ala 435 Ser Glu Leu Ser Vai 440 Tyr Thr Leu
ACA GCT ATC ACC TTG GAA AGA TGG CAT ACC ATC ACG CAT GCC ATG CAG 1502
Thr Ala 445 Ile Thr Leu Glu Arg 450 Trp His Thr Ile Thr 455 His Ala Met Gln
CTG GAC TGC AAG GTG CAG CTC CGC CAT GCT GCC AGT GTC ATG GTG ATG 1550
Leu 460 Asp Cys Lys Vai Gln 465 Leu Arg His Ala Ala 470 Ser Vai Met Vai Met 475
GGC TGG ATT TTT GCT TTT GCA GCT GCC CTC TTT CCC ATC TTT GGC ATC 1598
Gly Trp Ile Phe Ala 480 Phe Ala Ala Ala Leu 485 Phe Pro Ile Phe Gly 490 Ile
AGC AGC TAC ATG AAG GTG AGC ATC TGC CTG CCC ATG GAT ATT GAC AGC 1646
Ser Ser Tyr Met 495 Lys Vai Ser Ile Cys 500 Leu Pro Met Asp Ile 505 Asp Ser
CCT TTG TCA CAG CTG TAT GTC ATG TCC CTC CTT GTG CTC AAT GTC CTG 1694
Pro Leu Ser 510 Gln Leu Tyr Vai Met 515 Ser Leu Leu Vai Leu 520 Asn Vai Leu
GCC TTT GTG GTC ATC TGT GGC TGC TAT ATC CAC ATC TAC CTC ACA GTG 1742
Ala Phe 525 Vai Vai Ile Cys Gly 530 Cys Tyr Ile His Ile 535 Tyr Leu Thr Vai
CGG AAC CCC AAC ATC GTG TCC TCC TCT AGT GAC ACC AGG ATC GCC AAG 1790
Arg 540 Asn Pro Asn Ile Vai 545 Ser Ser Ser Ser Asp 550 Thr Arg Ile Ala Lys 555
CGC ATG GCC ATG CTC ATC TTC ACT GAC TTC CTC TGC ATG GCA CCC ATT 1838
Arg Met Ala Met Leu 560 Ile Phe Thr Asp Phe 565 Leu Cys Met Ala Pro 570 Ile
TCT TTC TTT GCC ATT TCT GCC TCC CTC AAG GTG CCC CTC ATC ACT GTG 1886
Ser Phe Phe Ala 575 Ile Ser Ala Ser Leu 580 Lys Vai Pro Leu Ile 585 Thr Vai
TCC AAA GCA AAG ATT CTG CTG GTT CTG TTT CAC CCC ATC AAC TCC TGT 1934
Ser Lys Ala 590 Lys Ile Leu Leu Vai 595 Leu Phe His Pro Ile 600 Asn Ser Cys
GCC AAC CCC TTC CTC TAT GCC ATC TTT ACC AAA AAC TTT CGC AGA GAT 1982
Ala Asn 605 Pro Phe Leu Tyr Ala 610 Ile Phe Thr Lys Asn 615 Phe Arg Arg Asp
TTC TTC ATT CTG CTG AGC AAG TGT GGC TGC TAT GAA ATG CAA GCC CAA 2030
Phe 620 Phe Ile Leu Leu Ser 625 Lys Cys Gly Cys Tyr 630 Glu Met Gln Ala Gln 635
ATT TAT AGG ACA GAA ACT TCA TCC ACT GTC CAC AAC ACC CAT CCA AGG 2078
Ile Tyr Arg Thr Glu 640 Thr Ser Ser Thr Vai 645 His Asn Thr His Pro 650 Arg
AAT GGC CAC TGC TCT TCA GCT CCC AGA GTC ACC AAT GGT TCC ACT TAC 2126
Asn Gly His Cys 655 Ser Ser Ala Pro Arg 660 Vai Thr Asn Gly Ser 665 Thr Tyr
ATA Ile CTT Leu GTC Vai CCT Pro CTA Leu AGT Ser CAT His TTA Leu GCC Ala CAA Gln AAC Asn TAAAACACAA TGTGAAAATG 2179
670 675
Savybė:
(A) Vardinis raktas: transmembraninis domenas (B) Lokacija: 350-613 (C) Indentifikacinis metodas: panašumas į kitus G baltymus surišančius receptoriaus transmembraninius domenus
Savybė:
(A) Vardinis raktas: tikėtinas transmembraninis domenas I (B) Lokacija: 350-370 (C) Indentifikacinis metodas: panašumas į kitus G baltymus surišančius receptoriaus transmembraninius domenus, hidrofobiškas, apie 20-23 amino rūgščių ilgio Savybė:
(A) Vardinis raktas: tikėtinas transmembraninis domenas II (B) Lokacija: 382-404 (C) Indentifikacinis metodas: panašumas į kitus G baltymus surišančius receptoriaus transmembraninius domenus, hidrofobiškas, apie 20-23 amino rūgščių ilgio Savybė:
(A) Vardinis raktas: tikėtinas transmembraninis domenas III (B) Lokacija: 427-448 (C) Indentifikacinis metodas: panašumas j kitus G baltymus surišančius receptoriaus transmembraninius domenus, hidrofobiškas, apie 20-23 amino rūgščių ilgio Savybė:
(A) Vardinis raktas: tikėtinas transmembraninis domenas IV (B) Lokacija: 469-491 (C) Indentifikacinis metodas: panašumas j kitus G baltymus surišančius receptoriaus transmembraninius domenus, hidrofobiškas, apie 20-23 amino rūgščių ilgio Savybė:
(A) Vardinis raktas: tikėtinas transmembraninis domenas V (B) Lokacija: 512-533 (C) Indentifikacinis metodas: panašumas į kitus G baltymus surišančius receptoriaus transmembraninius domenus, hidrofobiškas, apie 20-23 amino rūgščių ilgio Savybė:
(A) Vardinis raktas: tikėtinas transmembraninis domenas VI (B) Lokacija: 557-580 (C) Indentifikacinis metodas: panašumas į kitus G baltymus surišančius receptoriaus transmembraninius domenus, hidrofobiškas, apie 20-23 amino rūgščių ilgio Savybė:
(A) Vardinis raktas: tikėtinas transmembraninis domenas VII (B) Lokacija: 592-613 (C) Indentifikacinis metodas: panašumas į kitus G baltymus surišančius receptoriaus transmembraninius domenus, hidrofobiškas, apie 20-23 amino rūgščių ilgio Savybė:
(A) Vardinis raktas: tikėtinas C galo viduląstelinis domenas (B) Lokacija: 614-678
Sekos aprašymas: SEKA ID Nr.2:
Met Ala Leu Leu -15 Leu Vai Ser Leu -10 Leu Ala Phe Leu Ser -5 Leu Gly Ser
Gly Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg Vai Phe Leu Cys
1 5 10 15
Gln Glu Ser Lys Vai 20 Thr Glu Ile Pro Ser Asp 25 Leu Pro Arg Asn 30 Ala
Ile Glu Leu Arg Phe Vai Leu Thr Lys Leu Arg Vai Ile Gln Lys Gly
35 40 45
Ala Phe Ser Gly Phe Gly Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Gln Asn
50 55 60
Asp Vai Leu Glu Vai Ile Glu Ala Asp Vai Phe Ser Asn Leu Pro Lys
65 70 75
Leu His Glu Ile Arg Ile Glu Lys Ala Asn Asn Leu Leu Tyr Ile Asn
80 85 90 95
Pro Glu Ala Phe Gln Asn Leu Pro Asn Leu Gln Tyr Leu Leu Ile Ser
100 105 110
Asn Thr Gly Ile Lys His Leu Pro Asp Vai His Lys Ile His Ser Leu
115 120 125
Gln Lys Vai Leu Leu Asp Ile Gln Asp Asn Ile Asn Ile His Thr Ile
130 135 140
Glu Arg Asn Ser Phe Vai Gly Leu Ser Phe Glu Ser Vai Ile Leu Trp
145 150 155
Leu Asn Lys Asn Gly Ile Gln Glu Ile His Asn Cys Ala Phe Asn Gly
160 165 170 175
Thr Gln Leu Asp Glu Leu Asn Leu Ser Asp Asn Asn Asn Leu Glu Glu
180 185 190
Leu Pro Asn Asp Vai Phe His Gly Ala Ser Gly Pro Vai Ile Leu Asp
195 200 205
Ile Ser Arg Thr Arg Ile His Ser Leu Pro Ser Tyr Gly Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Lys Lys Leu Arg Ala Arg Ser Thr Tyr Asn Leu Lys Lys Leu Pro
225 230 235
Thr Leu Glu Lys Leu Vai Ala Leu Met Glu Ala Ser Leu Thr Tyr Pro
240 245 250 255
Ser His Cys Cys Ala Phe Ala Asn Trp Arg Arg Gln Ile Ser Glu Leu
260 265 270
His Pro Ile Cys Asn Lys Ser Ile Leu Arg Gln Glu Vai Asp Tyr Met
275 280 285
Thr Gln Thr Arg Gly Gln Arg Ser Ser Leu Ala Glu Asp Asn Glu Ser
290 295 300
Ser Tyr Ser Arg Gly Phe Asp Met Thr Tyr Thr Glu Phe Asp Tyr Asp
305 310 315
Leu Cys Asn Glu Vai Vai Asp Vai Thr Cys Ser 330 Pro Lys Pro Asp Ala 335
320 325
Phe Asn Pro Cys Glu Asp Ile Met Gly Tyr Asn Ile Leu Arg Vai Leu
340 345 350
Ile Trp Phe Ile Ser Ile Leu Ala Ile Thr Gly Asn Ile Ile Vai Leu
355 360 365
Vai Ile Leu Thr Thr Ser Gln Tyr Lys Leu Thr Vai Pro Arg Phe Leu
370 375 380
Met Cys Asn Leu Ala Phe Ala Asp Leu Cys Ile Gly Ile Tyr Leu Leu
385 390 395
Leu Ile Ala Ser Vai Asp Ile His Thr Lys Ser Gln Tyr His Asn Tyr
400 405 410 415
Ala Ile Asp Trp Gln Thr Gly Ala Gly Cys Asp Ala Ala Gly Phe Phe
420 425 430
Thr Vai Phe Ala Ser Glu Leu Ser Vai Tyr Thr Leu Thr Ala Ile Thr
435 440 445
Leu Glu Arg Trp His Thr Ile Thr His Ala Met Gln Leu Asp Cys Lys
450 455 460
Vai Gln Leu Arg His Ala Ala Ser Vai Met Vai Met Gly Trp Ile Phe
465 470 475
Ala Phe Ala Ala Ala Leu Phe Pro Ile Phe Gly Ile Ser Ser Tyr Met
480 485 490 495
Lys Vai Ser Ile Cys Leu Pro Met Asp Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gln
500 505 510
Leu Tyr Vai Met Ser Leu Leu Vai Leu Asn Vai Leu Ala Phe Vai Vai
515 520 525
Ile Cys Gly Cys Tyr Ile His Ile Tyr Leu Thr Vai Arg Asn Pro Asn
530 535 540
Ile Vai Ser Ser Ser Ser Asp Thr Arg Ile Ala Lys Arg Met Ala Met
545 550 555
Leu Ile Phe Thr Asp Phe Leu Cys Met Ala Pro Ile Ser Phe Phe Ala
560 565 570 575
Ile Ser Ala Ser Leu Lys Vai Pro Leu Ile Thr Vai Ser Lys Ala Lys
580 585 590
Ile Leu Leu Vai Leu Phe His Pro Ile Asn Ser Cys Ala Asn Pro Phe 595 600 605
Leu Tyr Ala 610 Ile Phe Thr Lys Asn 615 Phe Arg Arg Asp Phe 620 Phe Ile Leu
Leu Ser 625 Lys Cys Gly Cys Tyr 630 Glu Met Gln Ala Gln 635 Ile Tyr Arg Thr
Glu 640 Thr Ser Ser Thr Vai 645 His Asn Thr His Pro 650 Arg Asn Gly His Cys 655
Ser Ser Ala Pro Arg 660 Vai Thr Asn Gly Ser 665 Thr Tyr Ile Leu Vai 670 Pro
Leu Ser His Leu Ala Gln Asn 675

Claims (24)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Išgrynintas žmogaus folikulą stimuliuojančio hormono (FSH) receptorius, jo fragmentas ar mutantas, kuris susiriša su FSH.
  2. 2. FSH receptorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi aminorūgščių seką nuo 1 iki 678, parodytą ID Nr:2, o seka ID Nr2 yra šios apibrėžties dalis.
  3. 3. FSH receptorius pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad FSH receptoriaus citoplazminis domenas yra pašalintas.
  4. 4. FSH receptorius pagal 3 punktą, besiskiriantis tuo, kad FSH receptoriaus tansmembraninis domenas yra pašalintas.
  5. 5. FSH receptorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad FSH receptorius turi aminorūgščių seką nuo 1 iki 678, parodytą sekoje ID Nr:2, ar jos esminę dalį su iš esmės tokiomis pačiomis FSH surišančiomis savybėmis, o seka ED Nr.2. yra šios apibrėžties dalis.
  6. 6. Išskirta DNR, koduojanti žmogaus FSH receptorių, jo fragmentą ar mutantą, surišantj FSH.
  7. 7. Išskirta DNR pagal 6 punktą, besiskirianti tuo, kad išskirta DNR turi nukleotidų seką, atvaizduotą sekoje ED Nr.l, o seka ED Nr.l yra šios apibrėžties dalis.
  8. 8. DNR seka pagal 7 punktą, besiskirianti tuo, kad išskirtos DNR nukleotidų seka, koduojanti FSH receptoriaus citoplazminį domeną, yra pašalinta.
  9. 9. DNR seka pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad išskirtos DNR nukleotidų seka, koduojanti FSH receptoriaus transmembraninį domeną, yra pašalinta.
  10. 10. Išskirta DNR pagal 6 punktą, besiskirianti tuo, kad jos nukleotidų seka, koduoja aminorūgščių seką nuo 1 iki 349, parodytą sekoje ID Nr.2, ar jos esminę dalį su iš esmės tokiomis pačiomis FSH surišančiomis savybėmis, o seka ID Nr.2 yra šios apibrėžties dalis.
  11. 11. Rekombinantinis ekspresijos vektorius, apimantis DNR pagal 6, 7, 8, 9 ir 10 punktus.
  12. 12. Ląstelės, besiskiriančios tuo, kad yra transfekuotos ekspresijos vektoriumi pagal 11 punktą.
  13. 13. Ląstelės pagal 12 punktą, besiskiriančios tuo, kad yra žinduolių ląstelės.
  14. 14. Žmogaus FSH receptoriaus, jo fragmento ar mutanto, kurie suriša FSH, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad apima ląstelių pagal 12 punktą kultivavimą mitybinėje terpėje it receptoriaus išgavimą.
  15. 15. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad ląstelės yra žinduolių ląstelės.
  16. 16. Farmacinė kompozicija, besiskirianti tuo, kad apima žmogaus FSH receptorių, jo fragmentą ar mutantą, kurie suriša FSH, bei farmakologiškai priimtiną nešiklį.
  17. 17. Kompozicija pagal 16 punktą, turinti žmogaus FSH fragmentą, besiskirianti tuo, kad minėtas fragmentas apima žmogaus FSH receptoriaus N-galo ekstraląstelinį domeną ar jo esminę dalį su iš esmės tokiomis pačiomis FSH surišančiomis savybėmis.
  18. 18. Žmogaus FSH nustatymo, naudojant FSH receptorių, pagerintas būdas, besiskiriantis tuo, kad minėtas FSH receptorius yra išgrynintas žmogaus FSH receptorius, jo fragmentas ar mutantas, surišantis FSH.
  19. 19. Būdas pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad yra naudojamas žmogaus FSH receptoriaus fragmentas, ir šis fragmentas apima žmogaus FSH receptoriaus N-galo ekstraląstelinį domeną ar jo esminę dalį su iš esmės tokiomis pačiomis FSH surišančiomis savybėmis.
  20. 20. Išgrynintas žmogaus FSH receptorius, jo fragmentas ar mutantas, skirtas endogeninio FSH bioaktyvumo paciento organizme sumažinimui.
  21. 21. Išgryninto žmogaus FSH receptoriaus, jo fragmento ar mutanto, surišančių FSH, panaudojimas medikamentų, skirtų folikulo augimo ir subrendimo moters organizme sustabdymui, gamyboje.
  22. 22.Išgryninto žmogaus FSH receptoriaus, jo fragmento ar mutanto, surišančių FSH, panaudojimas medikamentų, skirtų spermatogenezės vyro organizme sutrukdymui, gamyboje.
  23. 23. Panaudojimas pagal 21 ir 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad kaip FSH receptoriaus fragmentą minėtų medikamentų gamyboje naudoja žmogaus FSH receptoriaus N-galo ekstraląstelinį domeną ar jo esminę dalį su iš esmės tokiomis pačiomis FSH surišančiomis savybėmis.
  24. 24. Substancijų, turinčių FSH bioaktyvumą, pavyzdžio tyrimo būdas, besiskiriantis tuo, kad įjungia rekombinantinių ląstelių linijos, esant minėtam pavyzdžiui, kultivavimą, kai minėta rekombinantinių ląstelių linija yra pritaikyta išskirti žmogaus FSH receptorių bei produkuoti nustatomą biologinį atsaką, esant FSH, o taip pat apima bet kokio biologinio atsako išmatavimą.
LTIP1631A 1991-03-15 1993-12-20 Human follicle stimulating hormone receptor LT3973B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67008591A 1991-03-15 1991-03-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LTIP1631A LTIP1631A (en) 1995-07-25
LT3973B true LT3973B (en) 1996-05-27

Family

ID=24688922

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LTIP1631A LT3973B (en) 1991-03-15 1993-12-20 Human follicle stimulating hormone receptor

Country Status (19)

Country Link
US (3) US6121016A (lt)
EP (2) EP0575357B1 (lt)
JP (1) JP3581148B2 (lt)
KR (1) KR100245250B1 (lt)
AT (2) ATE224446T1 (lt)
AU (1) AU671417B2 (lt)
CA (1) CA2106061C (lt)
DE (2) DE69232779T2 (lt)
DK (1) DK0575357T3 (lt)
ES (1) ES2183806T3 (lt)
FI (1) FI109360B (lt)
GE (1) GEP19991604B (lt)
LT (1) LT3973B (lt)
LV (1) LV10724B (lt)
MX (1) MX9203350A (lt)
NO (1) NO315517B1 (lt)
RU (1) RU2193599C2 (lt)
UA (1) UA43826C2 (lt)
WO (1) WO1992016620A1 (lt)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3949893A (en) * 1992-03-30 1993-11-08 Akzo Nobel N.V. Human gonadotropin receptor (FSH receptor)
SI0894141T1 (en) 1996-02-20 2005-10-31 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Hybrid proteins which form heterodimers
US5925549A (en) * 1996-04-15 1999-07-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Soluble 7-transmembrane domain G-protein-coupled receptor compositions and methods
US6521641B1 (en) 1998-10-08 2003-02-18 Allergan, Inc. Male anti-fertility agents
AU5137900A (en) * 1999-05-28 2000-12-18 University Of Cincinnati, The Antisense oligonucleotides for fertility and menstrual cycle regulation and for chemopreventive and chemotherapeutic use
EP1287135A2 (en) * 2000-05-18 2003-03-05 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human follicle stimulating hormone-like g protein-coupled receptor
WO2003062396A2 (en) * 2002-01-23 2003-07-31 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous versions of human g protein-coupled receptor: fshr
EP1466620A1 (en) * 2003-04-11 2004-10-13 AXXAM S.r.l. Compounds modulating FSHR and therapeutic uses thereof
US20100061976A1 (en) * 2008-07-24 2010-03-11 Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware Method for treating or preventing osteoporosis by reducing follicle stimulating hormone to cyclic physiological levels in a mammalian subject

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4761371A (en) 1985-02-12 1988-08-02 Genentech, Inc. Insulin receptor
WO1988009818A2 (en) 1987-06-12 1988-12-15 Genentech Inc Growth hormone receptor

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4652450A (en) 1984-08-31 1987-03-24 Research Corporation Bacterial FSH binding inhibitor
US4859609A (en) * 1986-04-30 1989-08-22 Genentech, Inc. Novel receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists
US4921808A (en) * 1986-06-25 1990-05-01 The Albany Medical College Of Union University Method for determining follicle stimulating hormone
US4960700A (en) * 1986-12-24 1990-10-02 Genentech, Inc. Compositions and methods for the synthesis and assay of a mammalian enkephalinase
EP1199361A3 (en) * 1989-05-05 2004-03-10 Genentech Inc. Glycoprotein hormone receptor molecules. Their uses
US5155218A (en) * 1990-05-08 1992-10-13 Neurogenetic Corporation Dna encoding human 5-ht1d receptors

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4761371A (en) 1985-02-12 1988-08-02 Genentech, Inc. Insulin receptor
WO1988009818A2 (en) 1987-06-12 1988-12-15 Genentech Inc Growth hormone receptor

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BENTON WD, DAVIS RW: "Screening lambdagt recombinant clones by hybridization to single plaques in situ", SCIENCE, 1977, pages 180
FRAZIER A. L. ET AL.: "Isolation of TSH and LH/CG receptor cDNAs from human thyroid: regulation by tissue specific splicing", MOL ENDOCRINOL., 1990, pages 1264 - 1276, XP002915460
PARMENTIER M. ET AL.: "Molecular cloning of the thyrotropin receptor", SCIENCE, 1989, pages 1620, XP002915463, DOI: doi:10.1126/science.2556796
SAMBROOK: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"
SPRENGEL R. ET AL.: "The testicular receptor for follicle stimulating hormone: structure and functional expression of cloned cDNA", MOL ENDOCRINOL., 1990, pages 525, XP002915461

Also Published As

Publication number Publication date
CA2106061C (en) 2008-10-07
EP1167385A3 (en) 2003-04-16
GEP19991604B (en) 1999-04-29
DK0575357T3 (da) 2002-11-25
US6121016A (en) 2000-09-19
LTIP1631A (en) 1995-07-25
WO1992016620A1 (en) 1992-10-01
JPH06505157A (ja) 1994-06-16
RU2193599C2 (ru) 2002-11-27
FI934023L (fi) 1993-09-14
LV10724B (en) 1995-12-20
CA2106061A1 (en) 1992-09-16
KR100245250B1 (en) 2000-02-15
LV10724A (lv) 1995-06-20
ES2183806T3 (es) 2003-04-01
EP0575357A1 (en) 1993-12-29
FI934023A0 (fi) 1993-09-14
AU671417B2 (en) 1996-08-29
EP1167385B1 (en) 2011-04-13
ATE505486T1 (de) 2011-04-15
ATE224446T1 (de) 2002-10-15
DE69232779D1 (de) 2002-10-24
JP3581148B2 (ja) 2004-10-27
DE69232779T2 (de) 2003-01-30
UA43826C2 (uk) 2002-01-15
US5744448A (en) 1998-04-28
AU1251492A (en) 1992-10-21
DE69233805D1 (de) 2011-05-26
EP1167385A2 (en) 2002-01-02
FI109360B (fi) 2002-07-15
EP0575357B1 (en) 2002-09-18
NO933272D0 (no) 1993-09-14
NO315517B1 (no) 2003-09-15
NO933272L (no) 1993-09-14
US6372711B1 (en) 2002-04-16
MX9203350A (es) 1992-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0723555B1 (en) Chimeric proteins which block complement activation
US7070788B2 (en) Follicle stimulating hormone superagonists
US5319071A (en) Soluble interleukin-1 receptors
CA1341611C (en) Interleukin-1 receptors
IE883523L (en) Interleukin-1 Receptors
US6261800B1 (en) Luteinizing hormone/choriogonadotropin (LH/CG) receptor
JP2002514079A (ja) キメラｏｐｇポリペプチド
WO1992018641A1 (en) Interleukin-8 receptors and related molecules and methods
LT3973B (en) Human follicle stimulating hormone receptor
EP0614975B1 (en) Glycoprotein hormone receptor molecules
EP1947117B1 (en) Glycoprotein hormone superagonists
AU625534B2 (en) Interleukin-1 receptors
US20050042205A1 (en) Glycoprotein hormone receptor molecules
Chen Cloning and characterization of the pigeon prolactin receptor
KR20000010866A (ko) 당단백질 호르몬 초활성 효능약

Legal Events

Date Code Title Description
PC9A Transfer of patents

Owner name: LABORATOIRES SERONO SA, CH

Effective date: 20070925

MK9A Expiry of a patent

Effective date: 20131220