LT3149B

LT3149B - Hybridoma which produces murine monoclonal antibodies to human angiogenin

Info

Publication number: LT3149B
Application number: LTIP137A
Authority: LT
Inventors: Aurelija Zvirbliene; Mykolas Mauricas; Eugenijus Zdanevicius; Vladas-Algirdas Bumelis
Original assignee: Fermentas Biotech Inst
Priority date: 1992-10-16
Filing date: 1992-10-16
Publication date: 1995-01-31
Also published as: LTIP137A

Abstract

This invention is in the area of immune biotechnology. It is to create a new hybridoma and to obtain monoclonic antibodies for human angiogenin.Hybridoma differs from previously described analogues according to the origin of the mother cell and to the immunization method. Monoclonic antibodies can be used for angiogenin analysis and the cleaning and exploration of biologic functions.

Description

Išradimas yra iš imuninės biotechnologijos srities. Jo esmė - naujos hibridomos sukūrimas ir monokloninių antikūnų (MA) prieš angiogeniną gavimas.The invention is in the field of immune biotechnology. Its essence is the generation of a new hybridoma and the production of monoclonal antibodies (MA) against angiogenin.

Hibridinių ląstelių linija (hibridoma AG-1) - tai MA prieš žmogaus angiogeniną producentas.The Hybrid Cell Line (Hybridoma AG-1) is a producer of MA against human angiogenin.

Yra žinomos ląstelių linijos (26-2F ir 51C9), produkuojančios MA prieš žmogaus angiogeniną (WO 89/00862, A61K39/395, 1989). Kadangi kitų analogų nėra, šios hibridomos laikomos prototipais. Nurodytos hibridomos yra gautos kitų mielominių ląstelių pagrindu - Sp 2/0 ir Ρ3Χ63, o ascitai išauginti nu/nu pelėse, reikalaujančiose ypatingų sąlygų. Be to, hibridomos 51C9 atveju imunizacijai buvo panaudotas sintetinis peptidas 36-46, kas labai apsunkino hibridomos gavimo procesą.There are known cell lines (26-2F and 51C9) which produce MA against human angiogenin (WO 89/00862, A61K39 / 395, 1989). In the absence of other analogs, these hybridomas are considered prototypes. The indicated hybridomas are derived from other myeloma cells, Sp 2/0 and Ρ3Χ63, and ascites were grown in nu / nu mice requiring special conditions. In addition, in the case of hybridoma 51C9, synthetic peptide 36-46 was used for immunization, which greatly complicated the process of obtaining the hybridoma.

Šio išradimo tikslas - sukurti hibridomą, kuri produkuoja didelius kiekius specifinių atikūnų prieš žmogaus angiogeniną. Šio tikslo įgyvendinimui pelės buvo imunizuotos rekombinantiniu konjuguotu žmogaus angiogeninu, po to imunizuotų pelių blužnies limfocitai sukryžminti su pelių mieloma NSO/1 pagal Kiolerio ir Milšteino metodą [ Kohler, Milstein, Eur. J. Immunol·., 1976, 6, 511-919] . Atlikus hibridinių ląstelių tikrinimą ir klonavimą, buvo gauta hibridoma AG-1.The object of the present invention is to provide a hybridoma which produces large amounts of specific antibodies against human angiogenin. To accomplish this goal, mice were immunized with recombinant conjugated human angiogenin, followed by crossing of spleen lymphocytes of immunized mice with murine myeloma UFO / 1 according to the Koller and Milstein method [Kohler, Milstein, Eur. J. Immunol., 6, 511-919 (1976)]. After screening and cloning the hybrid cells, hybridoma AG-1 was obtained.

Hibridoma AG-1 deponuota Biotechnologijos institute Fermentas, deponavimo numeris H 0201.Hybridoma AG-1 is deposited at the Institute of Biotechnology with Enzyme, accession number H 0201.

Hibridomą AG-1 apibūdina šie požymiai.AG-1 hybridoma is characterized by the following features.

Morfologiniai požymiai. Hibridinės ląstelės yra sferinės formos, su lygiais kraštais, turi stambų branduolį. Dauginasi suspensijoje, pasižymi silpna adhezija ant stiklo arba plastiko paviršiaus.Morphological features. Hybrid cells are spherical in shape with smooth edges and a large nucleus. Multiplies in suspension and exhibits weak adhesion to glass or plastic surfaces.

Ląstelių kultūros požymiai. Kultivavimo sąlygos standartinės: terpė DMEM su 10 % embrioninio karvių serumo, 2 mM L-gliutamino, 20 mM HEPES buferio, 200 ųg/ml gentamicino, auginama 37^UC temperatūroje, 5 % CO₂atmosferoje. Ląstelių auginimui naudojami stiklo arba plastiko indai, persėjama kas 3-4 dienos, peršėjimo dozė - 100 tūkst. ląst./ml.Signs of cell culture. Culture conditions are standard: DMEM medium with 10% embryonic cow serum, 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES buffer, 200 µg / ml gentamicin, grown at 37 ^U , 5% CO ₂ . Glass or plastic containers are used for growing the cells, transplanted every 3-4 days, the grafting dose is 100 thousand. cells / ml.

Auginimas gyvūnų organizme. Singeninių pelių BALB/c organizme hibridoma AG-1 100 % atvejų sukelia ascitą, suleidus i pilvo ertmę 1-2 min. ląstelių. Likus 7-10 dienų iki ląstelių injekcijos, pelės sensibilizuojamos 0,5 ml pristano. Ascitas formuojasi, praėjus 8-12 dienų po hibridinių ląstelių injekcijos.Rearing of animals. In BALB / c singlet mice, hybridoma AG-1 induces ascites in 100% of cases in the abdominal cavity for 1-2 minutes. cells. Mice are sensitized with 0.5 ml pristan 7-10 days before cell injection. Ascites develops 8 to 12 days after injection of hybrid cells.

Kriokonservavimas. Ilgalaikiam saugojimui ląstelės užšaldomos embrioniniame karvių serume su 10 % dimetilsulfoksido. Užšaldymo režimas - l^uC/min. iki 70°C, po to ląstelės perkeliamos į skystą azotą. Atšildymas - vandens vonioje 37°C. Ląstelių gyvybingumas po atšildymo - 70-80 %.Cryopreservation. For long-term storage, cells are frozen in embryonic cow serum containing 10% dimethylsulfoxide. Freezing mode - l ^u C / min. up to 70 ° C, after which the cells are transferred to liquid nitrogen. Thawing - water bath 37 ° C. Cell viability after thawing - 70-80%.

Kontaminacija. Bakterijų ir grybų kultūroje nerasta, mikoplazmos testas neigiamas.Contamination. Not found in bacterial and fungal culture, mycoplasma test negative.

Ląstelių produktyvumas. 3-4 kultivavimo dieną MA sekrecijos lygis terpėje - 15-20 ųg/ml, ascite - 7-10 mg/ml. MA produkcija išlieka iki 20 pasažų kultūroje ir iki 5 pasažų ascite.Cell productivity. At 3-4 cultivation days, MA secretion in the medium is 15-20 µg / ml, and in ascites 7-10 mg / ml. MA production remains up to 20 passages in culture and up to 5 passes in ascites.

Produkto charakteristika. Hibridoma AG-1 produkuoja IgG klasės MA, specifiškus žmogaus angiogeninui.Product characteristic. Hybridoma AG-1 produces IgG class MA specific for human angiogenin.

Išradimą iliustruoja šie pavyzdžiai.The following examples illustrate the invention.

pavyzdys. Linijos BALB/c pelės imunizuojamos rekombinantiniu žmogaus angiogeninu, konjuguotu su pelės IgG dviejų stadijų gliutaraldehidiniu metodu [ Avrameas, Ternyck, Immunochem., 1969, 6, 53-66] . Imunizacija susideda iš 3 injekcijų į pilvo ertmę: pirmų dviejų imunizacijų- metu kas 10 dienų suleidžiama po 100 ųg konjuguoto angiogenino su pilnu Froindo adjuvantu, paskutinės imunizacijos metu - 50 ųg natyvaus angiogenino fiziologiniame tirpale likus 3 dienoms iki hibridizacijos. Hibridizacijai naudojama pelės mieloma NSO/1 logaritminėje augimo fazėje ir imunizuotos pelės blužnies limfocitai. Hibridizacijos agentas - 50 % polietilenglikolio tirpalas DMEM terpėje su 15 % dimetilsulfoksido. Mielomos ir limfocitų ląstelių santykis hibridizacijos metu - 1:5. Hibridinių ląstelių selekcija atliekama HAT terpėje (0,1 mM hipoksantino, 0,4 μΜ aminopterino, 16 μΜ timidino). 7tą parą HAT terpė palaipsniui pakeičiama HT terpe (hipoksantinas, timidinas), o po to - normalia auginimo terpe. Klonai, produkuojantys MA prieš angiogeniną, atrenkami netiesioginės imunofermentinės analizės (IFA) metodu. Teigiami hibridai klonuojami didelių praskiedimų metodu, po to padauginami ir injekuojami BALB/c linijos pelėms ascitui sukelti.example. BALB / c mice are immunized with recombinant human angiogenin conjugated to the murine IgG two-step glutaraldehyde method [Avrameas, Ternyck, Immunochem., 6, 53-66 (1969)]. Immunization consists of 3 intraperitoneal injections: 100 µg conjugated angiogenin with Froind's complete adjuvant every 10 days for the first two immunizations, 50 µg native angiogenin in saline for the last immunization 3 days prior to hybridization. Mouse myeloma UFO / 1 in logarithmic growth phase and immunized mouse spleen lymphocytes are used for hybridization. Hybridization agent - 50% polyethylene glycol solution in DMEM with 15% dimethylsulfoxide. Myeloma to lymphocyte cell ratio during hybridization - 1: 5. Hybrid cells are selected in HAT medium (0.1 mM hypoxanthine, 0.4 μΜ aminopterin, 16 μΜ thymidine). At day 7, HAT medium is gradually replaced with HT medium (hypoxanthine, thymidine), followed by normal growth medium. Clones producing MA against angiogenin are selected by indirect immunoenzyme assay (IFA). Positive hybrids are cloned by high dilution, then propagated and injected into BALB / c line mice to induce ascites.

Polistirolinės antigenas (10 buferio, pH pavyzdys. Hibridomos AG-1 produkuojamų antikūnų specifiškumas nustatomas netiesioginės imunofermentinės analizės (IFA) metodu. Analizė atliekama šiuo būdu.Polystyrene antigen (Buffer 10, pH Example: The specificity of antibodies produced by hybridoma AG-1 is determined by indirect immunoenzyme assay (IFA). The assay is performed as follows).

plokštelės šulinėliuose sorbuojamas ųg/ml antigeno 100 μΐplate wells are sorbed with sorg / ml antigen at 100 μΐ

9,5), inkubuojant per temperatūroje, po to šulinėliai blokuojami 1 % jaučio serumo albumino tirpalu ir atplaunami distiliuotu vandeniu. Testuojamoji terpė arba ascitinis skystis buferiu (pH 7,5) su 0,05 % šis tirpalas inkubuojamas plokštelėje 1 vai. kambario temperatūroje. Paskutinėje stadijoje į kiekvieną plokštelės šulinėlį įpilama triušio antikūnų prieš pelės Ig, konjuguotų su krienų karbonatinio naktį 4°C skiedžiami detergento fosfatiniu Tween-20, peroksidaze. Po inkubacijos (1 vai. kamb. temp.) ir atplovimo išryškinama fermentinė reakcija: į šulinėlius įpilama po 100 μΐ substrato - 5 mg/ml o-fenilendiamino ir 0,03 % vandenilio peroksido Na-acetatiniame buferyje, pH 5,5. Išryškėjus spalvai (po 10-15 min.) reakcija sustabdoma, pridedant po 50 μΐ 10 % sieros rūgšties tirpalo. Optinis tankis matuojamas fotometru Titertek Multiscan (Flow), esant bangos ilgiui 492 nm. Netiesioginės IFA rezultatai pateikiami 1 lentelėje. Jie parodo, kad tiriamieji MA reaguoja tik su žmogaus angiogeninu.9.5) after incubation at temperature, the wells are then blocked with 1% bovine serum albumin solution and washed with distilled water. Test medium or ascitic fluid in buffer (pH 7.5) with 0.05% incubated in plate for 1 h. at room temperature. In the final step, rabbit anti-mouse Ig conjugated with horseradish carbonate overnight at 4 ° C in detergent phosphate Tween-20 peroxidase is added to each well of the plate. After incubation (1 h at room temperature) and rinsing, the enzymatic reaction is developed by adding 100 μΐ of 5 mg / ml o-phenylenediamine and 0.03% hydrogen peroxide in Na-acetate buffer, pH 5.5, to the wells. When the color develops (after 10-15 minutes), stop the reaction by adding 50 μΐ of 10% sulfuric acid solution. The optical density is measured on a Titertek Multiscan (Flow) photometer at 492 nm. The indirect IFA results are presented in Table 1. They show that test MAs react only with human angiogenin.

lentelė. Hibridomos AG-1 produkuojamų antikūnų specifiškumas.table. Specificity of antibodies produced by hybridoma AG-1.

Antigenai: įvairūs žmogaus baltymai Antigens: various human proteins Hibridomos AG-1 aug. terpė Hybridoma AG-1 Aug medium Ascito titras Titer of Ascites Albuminas Album - - 500 500 Angiogeninas Angiogenin + + 80000 80,000 α-Auglių nekrozės α-Tumor necrosis - - 500 500 faktorius factor • • γ-Interferonas γ-Interferon - - 500 500 Ribonukleazė A Ribonuclease A - - 500 500

Hibridoma AG-1 skiriasi nuo ląstelių linijų 26-2F ir 51C9 pagal šiuos požymius: 1) ji gauta kitų motininių ląstelių - mielomos NSO/1 - pagrindu, 2) auginama BALB/c linijos pelėse, atsparesnėse negu pelės nu/nu, todėl gaunamas didelis kiekis MA, 3) hibridomos gavimui panaudota paprasta ir efektyvi imunizacijos schema konjuguotas su pelės Ig angiogeninas, o tai leido išvengti angiogenino biologinio poveikio ir sustiprinti jo imunogenines savybes.Hybridoma AG-1 differs from cell lines 26-2F and 51C9 by the following features: 1) It is derived from other parent cells, myeloma UFOs / 1, 2) is grown in BALB / c line mice, which are more resistant than mouse nu / nu. a large amount of MA, 3) a simple and efficient immunization scheme for conjugation to murine Ig angiogenin was used to obtain the hybridoma, which prevented the biological action of angiogenin and enhanced its immunogenic properties.

Hibridomos AG-1 produkuojami MA gali būti panaudojami žmogaus angiogenino analizei, valymui ir biologinių funkcijų tyrinėjimui.MA produced by hybridoma AG-1 can be used for human angiogenin analysis, purification and biological function studies.

Claims

DEFINITION OF INVENTION

A hybridoma that produces murine monoclonal antibodies to human angiogenin.