KR960701200A - Dna의 예정-결실 방법(method for defined deletions of dna) - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대량의 포유동물 염색체 DNA 를 결실시키는 단순화된 수단을 제공할 수 있는 방법 및 DNA 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 벡터는 선택가능한 양성 마커, 선택가능한 음성 마커, 표적화용 상동영역, 그리고 결실을 중개하는 제2상동 영역으로 이루어진다.
Description
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 아래예에 묘사된 바와 같이 표적화 구성물과 표적 염색체의 모식도이다. 제2도는 하기 실시예에 묘사된 바와 같이 양방향의 표적화 구조물과 표적 염색체의 모식도이다. 제3도는 아래 묘사된 바와 같이 결실의 연속적인 단계를 나타낸 모식도이다.
Claims (29)
- 숙주세포내의 염색체상에 있는 표적 부위에 예정된 결실부를 유도하는 방법으로서, (1) 다음의 요소로 이루어진 DNA 표적화 구성물 구성체로 생존 세포를 형질전환시키는 단계:(A) 상기 표적 부위를 정하는 DNA 서열과 동종구조이고 추가의 DNA 상동 서열(V-ADH)에 의해 분리되어 있는 2개의 표적 DNA서열:(B) 동일 염색체상에서 상기 표적부위로부터 일정한 거리에 위치하는 부위에 있는 제1염색체 ADH 서열(c-ADH)과 상동성을 가지는 추가의 제1DAN상동(v-ADH) 서열;(C)1개 이상의 선택가능한 마커;(2) 상기 선택가능한 마커를 발현하는 형질전환 세포를 선택하는 단계; 및 (3) 상기 선택가능한 마커가 결여된 형질전환 세포를 선택하는 단계를 수행하여 상기 표적부위에서 동종 재조합이 발생되도록 하여 상기 DNA 구성체를 통합시키고, 상기 v-ADH 서열과 상기 c-ADH 서열간에 분자내 재조합을 발생시켜 상기 표적부위와 상기 제1c-ADH부위간의 염색체 결실을 발생시키는, 염색체상에 있는 표적 부위에 예정된 결실을 도입시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 1개 이상의 선택가능한 마커가 1개의 양성 선별용 커와 다른 1개의 음성 선별용 마커로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 염색체상에 있는 표적 부위에 예정된 결실을 도입하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 양성 선별용 마커가 상기 음성 선별용 마커와 상기 v-ADH 서열 사이의 상기 DNA구성체상에 위치하는 것을 특징으로 하는, 염색체상에 있는 표적 부위에 예정된 결실을 도입하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 ADH 서열이 포유동물의 반복적 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 염색체상에 있는 표적 부위에 예정된 결실을 도입하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 구성체가, 동일한 염색체상에 상기 표적 부위로서 위치하는 제2의 c-ADH부위에 있는 c-ADH서열과 상동성인 v-ADH서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 염색체상에 있는 표적 부위에 예정된 결실을 도입하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 DNA 구성체가, 추가로 (1+X)v-ADH VADH 서열, 및 네거티브 선별용 (1+X)마커를 더 포함하고 있으며, 이때 상기 (1+X)v-ADH 서열은 일련적으로 위치한 추가의 (1+X)c-ADH부위에 있는 추가의 (1+X)c-ADH서열과 상동이고, 각각의 c-ADH 서열은 동일한 염색체상의 상기 표적부위의 한쪽에서 서로 일련적으로 인접한 상태로 있게 됨으로써 표적부위에 인접한 염색체 DNA의 연속적인 결실을 달성하며, 상기 "X"가 추가의 DNA 상동서열의 수인 것을 특징으로 하는, 염색체상에 있는 표적 부위에 예정된 결실을 도입하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 표적부위와 상기 v-ADH간의 거리가 500bp 내지 4000kb인 것을 특징으로 하는, 염색체상에 있는 표적 부위에 예정된 결실을 도입하는 방법.
- 제7항에 있어서, 전사 인핸서 및/또는 사일렌서를 코드화하는 DNA 서열이 상기 표적부위와 상기 v-ADH서열 사이의 염색체 서열내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 염색체상에 있는 표적 부위에 예정된 결실을 도입하는 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 v-ADH서열이 상기 표적서열과 상동구조이고, 1bp 이상 차이가 나는 것을 특징으로 하는, 염색체상에 있는 표적 부위에 예정된 결실을 도입하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 마커가 HPRT 미니 유전자,neo유전자, HSV 티미딘 키나아게 유전자, 히그로마이신 내성 및 HPRT로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 염색체상에 있는 표적 부위에 예정된 결실을 도입하는 방법.
- 숙주세포내의 포유동물 면역글로불린 좌에 결실을 도입하는 방법으로서, (1) 다음의 요소로 이루어진 DNA 표적화 구성물 구성체로 생존상태의 포유동물 세포를 형질전환시키는 단계: (A) 상기 포유동물 면역글로불린 좌의 불변영역에 있는 DNA 서열과 상동구조인 2개의 표적 DNA 서열; (B) 동일 염색체상에서 5' 또는 3'으로부터 상기 표적부위로 일정한 거리에 위치하는 부위에 있는 c-ADH DNA 서열과 상동성을 가지는 v-ADH서열에 의해 분리되어 있는 상기 표적서열; (C) 1개의 선택가능한 양성 마커; 및 (D) 선택가능한 음성마커; (2) 상기 선택가능한 양성마커를 발현하는 형질전환 세포를 선택하는 단계; 및 (3) 상기 선택가능한 음성 마커가 결여된 형질전환 세포를 선택하는 단계를 수행하여 상기 포유동물 면역글로불린 좌에서 동종 재조합이 발생되도록 하여 상가 DNA 구성체를 통합시키고, 상기 염색체내의 v-ADH 서열과 상가 c-ADH 서열간에 분자내 재조합을 발생시켜 상기 표적부위와 상기 c-ADH부위간의 염색체 결실을 발생시키는, 숙주세포 내의 포유동물 면역글로불린 좌에 결실을 도입하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 면역글로불린 좌를 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 좌로 이루어진 군으로부터 선택하는 것을 특징으로 하는, 숙주세포내의 포유동물 면역글로불린 좌에 결실을 도입하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 면역글로불린 좌가 경쇄 좌인 것을 특징으로 하는, 숙주세포내의 포유동물 면역 글로불린 좌에 결실을 도입하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 면역글로불린 좌가 카파 사슬 좌인 것을 특징으로 하는, 숙주세포내의 포유동물 면역글로불리 좌에 결실을 도입하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 면역글로불린 좌가 카파 사슬 좌인 것을 특징으로 하는, 숙주세포내의 포유동물 면역글로불린 좌에 결실을 도입하는 방법.
- DNA 구성체로서, (A) 염색체의 표적 부위에 있는 근위의 DNA 서열과 상동성이고 다음의 v-ADH서열에 의해 분리되어 있는 2개의 표적 DNA서열:(B) 동일 염색체상의 상기 상동성 표적 DNA 서열위로부터 원위에 위치하는 염색체 부위에 있는 c-ADH서열과 상동성을 가지는 v-ADH서열;(C) 양성의 선택가능한 마커; 및 (D) 음성의 선택가능한 마커로 이루어지는 DNA 구성체.
- 제16항에 있어서, 상기 v-ADH서열이 포유동물의 반복적 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA구성체.
- 제16항에 있어서, 상기 DNA구성체가, 동일한 염색체상에 상기 표적부위로서 위치하는 제2의 c-ADH서열과 상동성인 제2의 DNA v-ADH 서열 및 음성 선택용 제2마커를 더 포함하고 있으며, 상기 표적부위는 상기 염색체상에 있는 제1의 c-ADH 부위와 상기 제2c-ADH 부위 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 DNA 구성체.
- 제16항에 있어서, 상기 표적 부위와 상기 v-ADH 간의 염색체 서열이 500bp 내지 4000kb 인 것을 특징으로 하는 DNA 구성체.
- 제16항에 있어서, 전사 인핸서 및/또는 사일렌서를 코드화하는 DNA서열이 상기 표적부위와 상기 제1의 v-ADH 서열 사이의 염색체 서열내에 더 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 구성체.
- 제16항에 있어서, 마커가 상기 HPRT 미니 유전자,neo유전자, HSV 티미딘 키나아게 유전자, 히그로마이신 내성 및 HPRT로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 구성체.
- 동일한 염색체상에서 표적부위로부터 일정한 거리에 있는 염색체 c-ADH DNA서열과 상기 표적부위간에 위치하는 표적 좌를 불활성화시키는 방법으로서, (1) 다음의 요소로 이루어진 DNA구성체로 생존상태의 포유동물 세포를 형질전환시키는 단계: (A) 염색체상의 표적부위에 있는 DNA 서열과 상동구조이고 다음의 v-ADH서열에 의해 분리된 2개의 표적 DNA 서열: (B) 동일 염색체상의 상기 표적부위로부터 원위에 위치하는 염색체 부위에 있는 c-ADH 서열과 상동성을 가지는 v-ADH서열; (C) 1개의 선택가능한 양성 마커; 및 (D)선택가능한 음성 마커;(2) 상기 양성 마커를 발현하는 형질전환 세포를 선택하는 단계; 및 (3) 상기 음성 마커가 결여된 형질전환 세포를 선택하는 단계를 수행하여 상기 표적부위에서 동종 재조합이 발생되도록 하여 상기 DNA 구성체를 통합시키고, v-ADH서열과 상기 c-ADH 서열간에 분자내 재조합을 발생시켜 상기 표적부위와 상기 c-ADH 부위간의 상기 불활성화된 표적 좌의 일부 이상에서 염색체의 결실을 수행하는, 염색체상에서 표적 좌를 불활성화시키는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 표적 좌가 MHC인 것을 특징으로 하는 염색체상에서 표적 좌를 불활성화시키는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 표적 좌가 β2-마이크로불린 하위단위 좌인 것을 특징으로 하는, 염색체상에서 표적 좌를 불활성화시키는 방법.
- MHC클래스 Ⅰ 및/또는 클래스Ⅱ 항원이 결여된 이식용의 포유동물 공여세포를 제조하는 방법으로서, (1)클래스Ⅰ및/ 또는 클래스Ⅱ항원을 불활성화시키는 위한 다음의 요소로 이루어진 DNA 구성체로 생존상태의 포유동물 세포를 형질전환시키는 단계; (A) MHC 내의 DNA 서열과 상동구조인 2개의 표적 DNA서열; (B)동일 염색체상에서 5' 또는 3'으로부터 상기 MHC로 일정한 거리에 위치하는 부위에 있는 c-ADH DNA서열과 상동성을 가지는 v-ADH 서열에 의해 분리되어 있는 상기 표적서열; (C) 1개의 선택가능한 양성 마커; 및 (D) 선택가능한 음성 마커; (2) 상기 선택가능한 양성마커를 발현하는 형질전환 세포를 선택하는 단계; 및(3) 상기 선택가능한 음성 마커가 결여된 형질전환 세포를 선택하는 단계를 수행하여 상기 MHC에서 동종재조합이 발생되도록 하여 상기 DNA 구성체를 통합시키고, 상기 염색체내의 v-ADH 서열과 상기 c- ADH서열간에 분자내 재조합을 발생시켜 상기 표적부위와, 상기 MHC 클래스 Ⅰ및/또는 클래스Ⅱ항원을 불활성화시키는 c-ADH부위간의 염색체 결실을 발생시키는, MHC클래스 Ⅰ및/또는 클래스Ⅱ항원이 결여된 이식용의 포유동물 공여세포를 제조하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 염색체의 결실이 β2-마이크로글로불린 좌를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물 공여세포를 제조하는 방법.
- 제25항에 따른 방법으로 제조된, 표면 MHC 항원을 발현시키지 않는 포유동물 세포.
- 제27항에 있어서, 상기 세포가 쥐의 세포인 것을 특징으로 하는 포유동물 세포.
- 제27항에 있어서, 상기 세포가 사람의 세포인 것을 특징으로 하는 포유동물 세포.※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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