KR950013563B1

KR950013563B1 - 10-히드록시 페오피틴 에이(Pheophytin a)

Info

Publication number: KR950013563B1
Application number: KR1019920024123A
Authority: KR
Inventors: 송필순; 한보섭; 이원영
Original assignee: 제일제당주식회사; 김정순; 삼성물산주식회사; 이필곤
Priority date: 1991-12-17
Filing date: 1992-12-14
Publication date: 1995-11-09
Also published as: MX9207313A; AU2956992A; WO1993012114A1; CN1074219A; KR930012781A

Abstract

내용 없음.

Description

10-히드록시 페오피틴 에이(Pheophytin α)

제 1a 도 및 b는 각각 잠분 : 시금치 잎, 및 잠분 : 뽕나무 잎의 박층 크로마토그램(TLC).

제 2a, 2b 도 및 제 2c 도는 제 1a 도 및 b에 나타낸 밴드 2의 역상 고속 액체 크로마트그램(HPLC)을 도시한 것으로서,

제 2a 도는 형광에 수시간 동안 노출시킨 밴드 2의 역상 HPLC.

제 2b 도는 빛에 5분간 노출시킨 밴드 2의 역상 HPLC.

제 2c 도는 빛에 노출시키지 않은 밴드의 2의 역상 HPLC.

제 3a 도는 10-히드록시 페오피틴 α(이하, "CpD-1"라고 부르기도 함)와 클로로필 α의¹H-NMR 스펙트럼(화살표는 C₁₀-OH의 위치를 나타냄).

제 3b 도는 C₁₀』OH의¹H 공명을 측정하기 위하여 증수(D₂O)와 혼합한 CpD-1과 중수와 혼합하지 않은 CpD-1 단독, 및 글로로필 α의¹H-NMR 스펙트럼.

제 3c 도는 CpD-1의¹³C-NMR 스펙트럼.

제 3d 도는 CpD-1의¹H 이차원 코지(COZY) NMR 스펙트럼.

제 4 도는 CpD-1의 프리에 변환 적외선 분광(FT-1R) 스펙트럼.

제 5 도는 295°K에서 1,3-디페닐이소벤조푸란 (DPBF)의 최대 초기 광산화 속도에서 일중항 산소의 발생량을 나타낸 그래프,

제 6 도는 CpD-1과 헤마토포르피린 유도체(이하, "HpD"라고 부르기도 함)의 종양 세포와 정상 세포에 대한 흡수도를 나타낸 그래프.

제 7a 및 7b 도는 인체 T-4 림포마 셀 라인(MOLT-4)과 사람의 말초 혈액 임파구(PBL)을 CpD-1과 HpD로 처리한 후 각각 적색 광과 황색 광에 노출시켰을 때의 생존 백분률을 나타낸 그래프.

본 발명은 신규의 10-히드록시 페오피틴 α와 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 이들 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 광증감제 조성물 및 이들 화함물을 사용하는 광활성 암치료법에 관한 것이다.

최근, 의료계에서는 광학적 작용이 있는 빛을 쬐어 종양 세포를 파괴하는 이른 바 "광활성 치료법(photodynamic therapy : PDT)"에 흥미와 관심이 집중되고 있다. 이와 같은 광활성 치료법의 대표적인 예로는 도헤르티(T.J.Dougherty) 등이 발표한 논문[T,J,Dougherty et αl., Cancer Res, 38, pp.2628∼2635,(1978)]에 기재된 것을 들 수 있다. 이 광활성 치료법은 종양 세포가 급속히 성장하는 조직 부위에 선택적으로 흡수되는 광증감제를 주입하는 것으로 이루어진다. 주입된 광증감제는 종양 부위에 집중되는데, 이때 그 광증감제에 고유한 최대 흡광 파장에 해당하는 파장의 빛을 조사함으로써 종양 세포 주위의 정상 세포에는 손상을 입히지 않고 종양 세포만을 선택적으로 파괴하게 된다.

이러한 광할성 치료법에 의한 암치료법에 있어서의 요체는 광증감제의 선택에 있다. 광증감제는 종양 세포에 선택적으로 부착되어 형광을 발하는 특성을 지니고 있다. 이러한 광증감제의 특성을 이용하면 암세포를 찾아낼 수 있다.

즉, 광증감제를 피검자의 체내에 주사하고 내시경을 통해 관찰하면, 형광을 발하는 부위, 즉 종양 세포가 성장하는 부위를 쉽게 발견할 수 있다.

여기 상태가 있는 광증감제는 광을 조사하면 빛을 흡수한다. 빛에 의하여 들뜬 상태로 된 광증감제는 체내에 존재하는 분자 산소에 에너지를 전달하여 일중항 산소(singlet oxygen)를 발생시킨다. 일중항 산소는 세포의 구성 성분인 스테로이드, 불포화 아실쇄를 지닌 포스포리피드, 트립토판, 히스티딘, 시스테인 및 메티오닌과 같은 아미노산 ; 및 구아미노산과 시이티딘 같은 헥산의 성분 등의 여러 생체 화합물들을 산화시킨다. 따라서, 일중항 산소는 일단 종양 세포와 접촉하면, 종양 조직의 세포 성분을 산화시킴으로써 종양세포를 파괴한다.

상술한 바와 같이, 광활성 치료법은 암의 진단 및 치료 분야에서 이용될 수 있다. 광활성 치료법은 다른 형태의 치료 방법에 비하여 유리하다, 즉, 광활성 치료법은 내시경을 통하여 광을 조사할 수 있는 부위의 암이라면 그 종류에 상관 없이 어느 것이나 성공적으로 치료할 수 있기 때문에 응용 범위가 넓고, 치료 효과도 크다, 또한, 광활성 치료법은 정상 세포에 대해서 부작용을 거의 일으키지 않으며, 따라서 반복 시술이 가능하다는 장점을 지니고 있다.

지금까지, 천연 물질 및 합성 물질로부터 얻을 수 있는 다수의 광증감제가 개발되었다. 이러한 광증감제로는 소라렌(psoralens), 플라빈, 포르피린, 아크리딘, 페노티아진, 잔텐, 퀴논, 폴리엔. 할로겐화 방향족 화합물(haloaromatics) 및 무기 이온이 알려져 있다[문헌 J.D. Spikes and R, Livingstion, Advances in Radiation Bilology, Vol. II, pp 29∼121(1961)참조]. 이들 광증감제 중에서 많은 화합물이 현재 광활성함암제(photodynamic anti-tumor agent)로 사용하기 위하여 임상 시험을 받고 있다. 그중 일부 광증감제는 광활성 항암제로 시판되고 있다. 대표적인 예로는 헤마토포르피린 유도체(HpD)가 있는데, 이들 화합물은 캐나다 뱅쿠버 소재의 쿼드라 로직 테크널로지 인코포레이티드(The Quadra Logic Technology Inc.)에 의하여 폴리헤마토포르피린의 에테르와 에스테르의 혼합물이 상품명 "포토프린-I"("Photofrin-I")으로, 그리고 보다 정제된 제품이 상품명 "포르피린-II"로 시판되고 있다.

본 발명자들은 높은 암 치료 효과를 지닌 강력한 광증감제를 개발하기 위하여 광범위한 실험을 거듭한 결과, 잠분(silkworm excreta)으로부터 분리한 신규의 페오피틴 유도체가 현저하게 향상된 광증감성을 갖고 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 광활성 암치료용 광증감제로서 유용한 신규의 페오피틴 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 신규의 페오피틴 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 담체, 부형제, 증량제 등의 통상의 성분과 배합된 상기의 신규 페오피틴 유도체를 유효 성분으로 함유하는 광증감제를 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 본 발명의 목적은 상기의 신규 페오피틴 유도체를 사용하는 것으로 이루어진 광활성 암치료 방법을 제공하는 것이다.

이와 같은 본 발명의 목적들은 하기의 구조식(I)으로 나타내는 신규의 10-히드록시 페오피틴 α 또는약학적으로 허용되는 그의 염에 의하여 성취될 수 있다.

본 발명에 따른 페오피틴 유도체는 종래의 다른 광증감제에 비하여 광활성 일증항 산소를 높은 수율로 생성시키기에 보다 적합하며, 종양 조직에 대하여 더욱 선택적인 흡수성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 광증감제는 피검 동물에 있어서 암세포의 선택적 파괴 및 종양 치유율 면에서 종래의 다른 광증감제보다 우수하다.

본 발명의 화합물은 클로로필 a와 구조적으로 유사하기는 하지만, 클로로필 α의 C₁₀위치에서 Mg⁺⁺와 수소 원자가 각각 2개의 수소원자 및 히드록시기로 교체된 구조적 특징을 갖고 있다.

본 발명에 따른 10-히드록시 페오피틴 α는 구조적으로 밝혀진 바 없는 신규의 화합물이며, 특히 생체내 및 생체외 실험에서 광증감제로 사용된 바 없는 화합물이다.

구조식(I)의 화합물을 통상의 방법에 따라 그의 무독성 염, 주 무독성의 약학적으로 허용되는 염으로 전환시킬 수 있다. 무독성 염으로는 금속염과 같은 무기염, 무기산염 및 유기염을 예로 들 수 있다. 금속염으로는 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 및 칼슘염, 마그네슘 등의 알칼리토금속염을 들 수 있다. 무기산염으로는 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 인산염 등이 있다. 유기염으로는 유기 아민염, 예를 들어 트리메틸아민염, 트리에틸아민염, 피리딘염, 프로카인염, 피콜린염, 데사이클로헥실아민염, N,N-디벤질에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 디에탄올아민염, 트리에탄올아민염, 트리스-(히드록시메탈아미노) 메탄염, 페닐에틸벤질아민염, 디벤질에틸렌디아민염 등이 있다. 또한, 무독성 염에는 포름산염, 아세트산염, 밀레인산염, 타르타르산염, 메탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 톨루엔술폰산염 등의 유기 카르복실산염 또는 술폰산염, 및 아르기닌, 아스파르트산, 글루타민산, 라이신 등의 염기성 또는 산성 아미노산과의 염이 포함될수 있다.

본 발명은 또한, (a) 잠분으로부터 적절한 용매를 사용하여 클로로필 대사산물을 추출하는 단계, (b) 추출물을 적절한 용매 중에 과포화 상태에 이를 때까지 용해시키는 단계. (c) 생성된 용액을 크로마토그래프하여 광증감제 성분을 분리하는 단계, 및 (d) 강력한 광증감 작용을 나타내는 분획을 수집하여 통상의 방법에 따라 정제하는 단계로 이루어진 본 발명에 따른 신규의 페오피틴 유도체의 제조 방법을 제공한다.

잠분 추출 단계(단계 a)는 통상의 용매 추출법에 의하여 수행할 수 있다, 용매로는 케톤, 알코올, 및 그의 혼합 용매와 같이 당업계에 알려져 있는 공지의 용매를 사용할 수 있다. 이어서 추출물을 적절한 용매에 용해시켜 과포화 용액을 제조한다(단계 b). 이때 용매로는 고상의 추출물을 용해시킬 수 있는 용매이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 그러나, 효과적인 용해를 위해서는 t-부탄올, 아세톤 및 펜탄의 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하다, 이어서, 생성 용액을 크로마토그래피하여 추출물 중에 포함된 고체 성분을 분리한다.(단계 c). 당업계에 알려져 있는 모든 정제 크로마토그래피를 이용할 수 있는데, 예를 들면 액체 크로마토그래피(LC). 박층 크로마토그래피(TLC)등을 이용할 수 있다. 분리 조작이 끝난 후에, 높은 광증감 작용을 지닌 분획을 모아서 통상의 정제 방법에 의하여 정제한다(단계 d). 바람직하게는 고압 액체크로마코그래피(HPLC)를 사용할 수 있다.

생성물은 그의 화학 구조를 동정하기 위하여 분석한다. 이를 위하여, 당업계에 알려져 있는 모든 분석 방법, 예를 들어 적외선 분광법(IR), 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR), 자외선 분광법(UV), 선광 분산 분광법, 형광 분광법, 염광 분광법, 질량 분광법, 핵자기 공명 분광법 등을 이용할 수 있다.

별법으로는, 구조식 (I)의 화합물은 클로로필 α를 출발 물질로 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 즉, 구조식(I)의 화합물은, (a) 클로로필 α를 에튼올 또는 클로로포름 중에서 실온에서 HCI과 반응시켜 마그네슘 이온을 제거하는 단계, (b) 희미한 보안등 하에 또는 암소에서 1일 이상 동안 실온에서 생성 용액에 공기를 완화하게 버블링하여 C₁₀위치의 수소 원자를 히드록시기로 교체시키는 단계, 및 (c) 생성물을 통상의 정제 방법에 의하여 정제시키는 단계로 이루어진 방법에 의하여 제조할 수도 있다.

출발 물질인 클로로필 α는 모든 적절한 원료로부터 통상의 방법에 따라 수득할 수 있다. 그러나, 클로롤필 α공급원으로서는 클로로필이 풍부한 해조류(예 : Spirulina platensis)를 사용하는 것이 바람직하다. 이 합성 방법은 공업적 규모의 CpD 대량 생산에 적합하다.

본 발명을 위해서 구조식 (I)의 단일 화합물에 국한하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되지 아니하고, 문현[G.N.La Mar, "Model Compounds As Aids In Interpreting NMR Spectra Of Hemoproteins" in Biological Applications of Magnetic Resonance, R.G Shulman Ed, m pp, 305∼343(1979). Academic Press, New York ; 및 J.D. Satterlee. "NMR Spectroscopy Of Paramagnetic Haem Proteins"in Annual Reports On NMR Spectroscopy, G,A. Webb Ed., pp 84∼85(1986). Academic Press New York]의 기재 내용에 따라 본 발명 화합물의 치환기를 다른 것으로 교체함으로써 많은 변형을 가하는 것도 가능함을 알아야 한다. 이들 문헌에 기재된 내용으로부터, 본 분야의 숙련가라면 구조식(I) 화합물의 치환기와는 다른 치환기들을 지닌 다수의 동족체를 본 분야에서 잘 알려져 있는 통상의 방법에 따라 설계하고 합성해 낼 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 일반식(I')으로 나타내는 10-히드록시페오피틴 α의 동족체들도 포함하는 것으로 보아야 한다.

상기식에서, R₁, R₃, R₄, R₅, R₆및 R₈은 C₁-C₃알킬 알데히드 또는 C₃-C₅사이클로 알킬기이고 : R₂는 C₁-C₃알케닐기이며 :

(여기에서, ℓ, m 및 n은 1 내지 3의 정수이다)이다.

다른 측면에서, 본 발명은 구조식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 분으로 하여 이를 담체, 부형제, 증량제 및 다른 첨가제와 같은 통상의 성분과 배합한 종양 세포 치료용 광증감제 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 구조식(I)의 신규 페오피틴 유도체 또는 그의 약삭적으로 허용되는 염을 체내에 투여하는 것을 특징으로 하는 광활성 암치료 방법이 제공된다.

구조식(I)의 페오피틴 유도체들은 여러 형태의 주사, 예를 들어 정맥 주사, 근육 주사, 피하 주사 및 복강내 주사에 의하여 5 내지 10㎎/㎏ 체중의 1일 투여량으로 인체내에 투여할 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 이것으로 한정하려는 것은 아니다.

[실시예 1]

잠분으로부터의 CpD-1의 분리 및 그의 구조 동정

통상의 용매 추출법에 따라 아세톤을 사용하여 잠분으로부터 클로로필 대사산물을 추출하였다. 별도로, 동일한 추출 공정을 시금치 잎 및 뽕나무 잎에 실시하여 추출물을 얻고, 이것을 대조용으로 사용하였다.

0.1g의 조추출물을 건조시킨 후, t-부탄올, 아세톤, 펜탄의 혼합 용매(부피 비율 5 : 60 : 235) 1ml에 용해시켜 과포화 용액을 얻었다. 생성 용액 실리카겔 플라스틱 박층 크로마토그래피 판(20×20㎝)(TLC plastic silica gel Art. 5735, EM Science)에 통상의 방법에 따라 점적하였다. 점적 후, 샘플 밴드를 질소 기류하에 건조시켰다. 여과지(높이 25㎝)를 TLC 챔버(30×28×10㎝)에 넣고, 상기 용매를 크로마토그래피 전개 직전에 20분 동안 챔버를 부었다. 덮개 유리를 챔버에 덮은 후 진공 그리스로 챔버를 밀봉하였다. 크로마토그래피 전개 공정을 40분동안 실시하였다. 모든 조작은 암소에서 또는 희미한 녹색 광하에서 실시하였다.

그 결과를 제 1 도에 나타낸다, 제 1 도에 있어서, 두 번째 밴드("밴드 2")는 시금치 잎과 뽕나무 잎 추출물을 전개시킨 크로마토그램에는 존재하지 않는다. 생체내 실험에서 밴드 2는 뛰어난 광증감 작용을 나타내는 것으로 판명되었다.

밴드 2를 조심스럽게 TLC판에서 긁어 내어 아세톤으로 추출하였다. 용리액을 질소 기류하에 증발시킨 다음, 잔류물을 추가의 정제를 위하여 저장하였다.

ISCO 모델 2350 HPLC, 모델 2360 농도 구배 프로그래머, UV-5 흡광/형광 검출기(ISCO, Inc.), 및 C-18 다이나맥스-300Å(Dynamax-300Å) 컬럼(1×25㎝)(Rainin Instrument Company, Inc.)을 사용하여 통상의 방법에 따라 역상 HPLC에 의하여 정제 단계를 수행하였다. HPLC의 조건은 다음과 같다 ; 유속 : 1.7ml/min, 이동상 : 35%메탄올 및 65% 아세토니트릴, 농도구배 : 80% 이동상과 20% 물에서 시작하여 100% 이동상으로 종결, 25분간.

660nm에서 약 7.0의 흡광도를 지닌 샘플을 200㎕(대략 25μg)의 양으로 주입하였다. 각 조작 시간은 대략 80분간으로 설정하고, 660nm에서 흡광도를 모니터링하여 마이크로 컴퓨터에 저장하였다. 각 피크를 자동적으로 수집하였다. 그 결과, 제 2a 도 내지 제 2c 도에 나타낸 바와 같은 4개의 다른 피크, P1,P2,P3 및 P4가 얻어졌다.

제 2a 도 내지 제 2c 도에 있어서, 제 2a 도는 형광에 수시간 동안 노출시킨 밴드 2의 역상 HPLC 곡선을 나타낸 것이고 : 2b 도는 빛에 5분간 노출시킨 밴드 2의 역상 HPLC 곡선이며 ; 제 2c 도는 빛에 노출시키지 않은 밴드 2의 역상 HPLC 곡선이다. 주성분은 세 번째 피크, P3에 해당하는 CpD-1이었다. 빛에 노출되었을 때 CpD-1은 산화되어 그의 이성질체인 CpD-2로 전환되는데, 이는 두 번째 피크, P2에 해당한다.

이와 같이 하여 얻은 고순도 CpD-1을 FAB/MS,¹H일차원 및 이차원 코지 NMR,¹³C NMR과 FT-IR을 이용하여 그의 구조를 동정하였다.

제 3a 도는 CpD-1과 클로로필 α의¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로서, 화살표는 각각 CpD-1과 클 로로필 a에 포함되어 있는 C₁₀-H의 위치를 표시한 것이다. CpD-1과 클로로필 α의 화학적 이동을 하기 표 1에 나타낸다. 제 3b 도는 증수(D₂O)와 혼합한 CpD-1, 증수와 혼합하지 않은 CpD-1 단독, 그리고 클로로필 α의¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 제 3c 도 및 제 3d 도는 각각 CpD-1의¹³C-NMR 스펙트럼과¹H 이차원 코지 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 제 4 도는 CpD-1의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

상기 도면들로부터, CpD-1는 클로로필 α에서 Mg⁺⁺가 두 개의 수소원자로 대체되고 C₁₀위치에 수소 원자 대신 OH가 대체된 구조를 가짐을 확일 할 수 있다.

[표 1]

주: * 사용 용매 : CDCL₃

** 피셔(Fischer)의 번호 붙이기 시스템에 따라 지정한 위치

[실시예 2]

CpD-1의 합성

멕시코 시티에서 구입한 건조 조류(dry algae : Spirulina platensis) 약 40g을 1ℓ들이 플라스크내의 메탄올 500ml에 담그고, 0.01M KOH 5ml을 가하였다. 생성된 용액을 통하여 공기를 암소에서 2 내지 6일 동안 완화하게 버블링한 다음, 약 50℃에서 15분 동안 환류하였다. 이 용액을 깔때기 내의 여과지로 여과시키고, 100ml의 메탄올을 부어 잔류물을 헹구었다. 여액을 1ml의 진한 HCI로 3분 동안 처리하였다. 생성 용액을 회전식 증발기(Buchi, Switzerland) 내에서 증발시켜 30ml 미만으로 만들었다. 이어서, 생성물에 ddH₂O 200ml과 CCI₄200ml을 가하였다. 상분리 후, 유기 상을 ddH₂O 200ml로 2회 세척하고, 수상은 폐기하였다. 유기 용매를 증발 제거하고, 생성물을 약 20ml의 CCI₄에 용해시켜 조추추물을 수득하였다.

약 60g의 230 내지 400메시 실리카겔(Sigma Chemical Co.)을 CCl₄에 담근 다음 5분 동안 음파 분쇄하였다. 컬럼을 내경 2.5㎝의 유리관에 넣고 CCl₄로 예비 평형화하였다. 동일 조건으로 제 2 및 제 3 의 실리카겔 컬럼을 충전시켰다. 조추출물을 넣은 후, 약 50ml의 CCl₄를 주입하여 분홍색 및 황색 물질을 용리시켰다. 이어서, CCl₄중의 20% 아세톤 용액을 주입하여, 10-OH 페오피틴 α/페오피틴 α를 함유하는 CpD 분획을 용리시켰다. 컬럼내의 잔류물을 제거하였다.

용매를 증발 제거하고, 제2의 실리카겔 크로마토그래피를 수행하기 위하여 잔류물을 15ml의 CCl₄에 다시 용해시켰다. 시료운 실리카겔 컬럼에 샘플을 넣은 후, 약 50ml의 CCl₄를 사용하여 분홍색 및 황색 물질을 용리시켜서. 이어서, CCl₄중의 10% 아세톤 용액을 사용하여 목적한 CpD 분획을 용리시켰다. 마찬가지로, CCl₄중의 10% 아세톤 용액으로 용리되지 아니한 잔류물을 폐기하였다. 계속해서 수집된 분획으로분터 용매를 증발 제거한 다음, 잔류물을 15ml의 CCl₄에 용해시켰다. 제2의 실리카겔 컬럼으로부터 취출한 샘플을 제3의 실리카겔 컬럼에 넣은 후, 먼저 약 150ml(충분량으로)의 CCl₄중 2% 아세톤 용액을 주입하여 목적하지 않은 CpD(흡수 스펙트럼을 측정하여 확인)을 용리시켰다. 이어서, CCl₄중의 5% 이하 아세톤 용액을 이동상의 조금씩 부어서 10-OH 페오피틴 α를 함유하는 분획을 용리시켰다. 수집된 분획을 암소에서 질소 대기하에 건조시킨 후 추가의 역상 컬럼 크로마토그래피 정제를 위하여 저장하였다. 상기 공정은 통풍실에서 행하였다.

분리용 C-18 역상 컬럼(Chromosorb LC-7, Sigma Chemical Co.)을 가변형의 유리관(Amicon 내경 2.2㎝×길이 12㎝)에 넣었다. 용리 프로그램은 다음과 같다 ; 이동상 : 50% 에탄올 40% 아세토니트릴, 및 10% CCl₄. 샘플주입량 : 약 250μg CpD 1ml, 유속 : 2ml/min, 검출 : 660nm 흡광도, 용리 : (1) 99% M.P 및 1% 물로부터 100% M.P까지의 농도 구배, 15분간 (2) 100% M.P. 13분간 (3) 이소프로판올중의 20% CCI4, 7분간 (4) 99% M.P. 및 1% 물 20분간, 10-OH 페오피틴 a의 분획을 투입 후 28분경과 시에 용리시켰다. 생성물의 순도는 TLC 분석법에 의해 측정했을 때 95% 이상이었다. TLC에서, 생성물은 잠분으로부터 얻은 조추출물의 두 번째 밴드의 동일한 Rf값으로 이동하였다. TLC 분석에 사용된 조건은 실시예 1에서 기술한 것과 동이하게 하였다.

본 발명자들은 또한 10-OH 페오피틴 α 및 클로로필 α와 비교하여 NMR 양성자/탄소 공명을 할당함으로써 TLC 크로마토그램상의 밴드 1이 페오피틴 α인 것을 확인하였다. 페오피틴 α의 C-18 컬럼에서의 체류 시간은 10-OH 페오피틴 α에 있어서보다 길었고, 이들은 상기 용리 조건하에서 분리될 수 있었다. 생성물인 10-OH 페오피틴 α를 암소에서 질소 대기하에 건조시켜 저장하였다. 수율은 크로필 α가 100% 추출된 것으로 가정할 때(클로로필α의 실제 추출 백분율은 배치마다 다르다). 조류 분말의 건조 중량을 기중으로 하여 0.4% 이상이었다. 이값은 잠분의 조추출물로부터 얻어낸 CpD 수율(0.04%)에 비하여 10배 이상 더 높은 값이다.

[실시예 3]

[일중항 산소의 생성 능력]

광활성 광증감제로서의 궁극적인 효능을 가늠하는 가장 중요한 요소의 하나는 삼중항 상태의 광증감제가 분자상의 산소에 에너지를 전달하여 일중항의 산소를 발생시키는 능력이 있다. 이를 측정하기 위하여, 본 실시예에서는 아래에서 설명하려는 방법 I 및 II에 기술한 바와 같은 일중항의 산소의 양자 수율을 측정하는 두가지 방법을 사용하였다. 광산화법(방법 I)에서는 일중항 산소 포착제로서 1,3-디페닐이소벤조푸란(DPBF)을 사용하였다. 광산화 속도의 측정은 DPBF 형광도 또는 흡광도의 감소에 따름을 감안하여 각 증감제 존재하에 DPBF의 초기 광산화 속도를 측정하는 방식으로 행하였다. 초기 DPBF 광산화 속도는 초기 일중항 산소 생산 속도에 반비례한다.

[방법 I : DPBF의 간접 광산화법]

632.8nm의 헬륨-네온 레이저(최대 출력 20mW, Metrologic Instruments, Inc.)를 조사광으로 사용하여 샘플 용액을 활성화시켰다. DPBF(암소에서 질소하에 재결정)의 에탄올 용액을 사용 직전에 조제하여, 420nm에서 ε=22.500㎝^-1M^-1으로 농도를 점검하였다. 총 2ml의 용액을 함유하는 밀폐 큐벳 중에서, 각 증감제는 632nm에서 거의 동일한 흡광도를 나타내었다. 용매로 미리 포화시킨 산소 가스를 사용하여 용액 20분 동안 완화하게 버블링시킨 다음, 서로 다른 농도의 DPBF를 소량씩 상기 용액과 혼합하였다. 에탄올 중 455nm에서 DPBF 형광도 감소와 CCl₄중 465nm에서의 DPBF 형광도 감소를 조사 시간의 함수로 측정하여 DPBF의 초기 광산화 속도를 결정하였다.

[방법 II : 직접 영광법(Luminescence Method)]

일중항 산소를 직접 검출하기 위하여 근적외적 인광도를 측정하였다. Q-스위치 Nd : YAG 레이저(Quantel, YG-571-C)를 사용하여 355nm에서 작동시켰다. 잠분 CpD 및 클로로 α의 샘플을 공기-포화 에탄올-OD에 용해시키고, 흡광도를 355nm에서 약 0.55로 조정함으로써 샘플 농도를 거의 동일하게 유지시켰다.

1/[속도]대 1/[DPBF]의 이중 반비례 도표를 그려 반비례 절편으로부터 최대 초기 속도를 구하였다(제 5 도). 최대 초기 속도로부터, 클로로필 α의 에탄올 중 일중항 산호 양자 수율 (ψ_Δχin C₂H₅OH)을 하기 식(1)에 의하여 공지의 클로로필 α의 일중항 산소 수율 (ψ_Δch1=0.57 in CCl₄) 상대치로서 계산하였다.

또한, 식(1)을 사용하여 각 증감제의 에탄올 중 양자 수율을 계산하였다. 그 결과를 하기 표 2 및 제 5 도에 나타낸다. 이들 결과로부터 CpD-1이 일중항 산소 생성능 면에서 클로로필 α보다 뛰어남을 알 수 있다. CpD-1은 HpD에 비하여 20% 이상의 더 높은 생성능을 나타낸다.

[표 2]

DPB의 간접 광산화법(방법Ⅰ) 및 직접 영광법(방법Ⅱ)에 의하여 측정한 일중항 산소수율(ψ_Δ)

[실시예 4]

[암세포 및 정상 세포에 대한 CpD-1의 흡수성]

사람의 T-4 림포마 셀 라인(MOLT-4)을 대조용 표준 종양 세포로 하고 세로이 조제한 사람의 말초혈액 임파구(PBL)를 대조용 표준 정상 세포로 하여 CpD-1과 HpD의 세포 흡수도를 비교하였다.

1×10⁶개의 시험 세포에, 각각 10μ/ml의 CpD-1 및 HpD를 함유하는 광증감제 용액 1ml을 가하고, 회전 드럼에서 30 내지 210분 동안 배양하였다. 배양물은 0℃, 2,000rpm에서 5분 동안 원침시켰다. 침전된 세포 펠렛을 냉각 생리 식염수로 세척한 다음, 재차 원침시켰다. 침전물에 400μl의 DMF를 가하였다. 생성 혼합물을 실온에서 진탕한 후 4℃에서 원침시켰다. 상층액 300μl를 취하여 이를 세포 추출액으로 사용하였다.

300μl의 세포 추출액에 200μl의 증류수 및 500μl의 1N염산을 가하여 최종 부피가 1ml이 되도록 하였다. CpD-1과 HpD를 각각 660nm 및 550nm에서 그의 흡광도에 관하여 측정하였다. 이와 같이 얻은 측정 결과를 사전에 미리 파장을 측정해 놓은 표준 용액의 흡광도와 비교하여 세포에 흡수된 시험 증감제의 양을 측정하였다.

그 결과는 제 6 도에 나타낸 바와 같다. 제 6 도에서, 포르피린의 종류 및 시험 세포의 종류에 관계 없이 배양시간이 길어질수록 세포내 흡수량이 많아짐을 알 수 있다. 대조 표준 정상 세포인 사람의 말초 혈액 암파구(PBL)에 비하여 MOLT-4의 흡수광이 더 많게 나타난다. 동일한 시험 세포의 경우에 있어서, CpD가 HpD에 비하여 흡수량이 더 많게 나타난다. 이들 결과로부터, CpD-1이 종양 세포부위에 선택적으로흡수됨을 알수 있다. 그 집중 정도는 HpD에 비하여 2배 이상 더 높은 것으로 밝혀졌다.

[실시예 5]

[암세포에 대한 선택적 파괴(생체외 시험)]

상기 실시예 4에 사용한 것과 같은 종양 세포 및 정상 세포를 사용하여 CpD-1의 선택적 파괴능을 평가하였다.

CpD-1을 1×10⁶개의 종양 세포 및 정상 세포에 각각 주입하였다. 이와 같이 처리한 세포를 적색 광에 10분간 노출시켰다. CpD-1 대신에 HpD를 대조용 광증감제로서 주입한 것외에는 동일한 과정을 반복하였다, 광노출 8시간 동안 1시간 간격으로 세포의 생존 백분률을 구하였다. 그 결과를 제 7a 도에 나타낸다.

CpD-1으로 처리하고 적색 광에 노출시킨 MOLT-4는 광 노출 후 2시간 이내에 모두 사멸된 반면, CpD-1으로 처리하고 적색 광에 노출시킨 PBL은 시간 경과에 따라 생존율을 감소하여 광 노출 후 8시간 경과 시에 그 생존율이 68.4%에 이르렀다. HpD로 처리하고 적색 광에 노출시킨 MOTL-4는 광 노출 후 8시간 경과 시에 그 생존율이 83.4%로 나타난 반면, HpD로 처리하고 적색 광에 노출시킨 PBL은 광 노출 후 8시간 경과 시에 그 생존율이 91.4%로 나타났다.

MOLT-4 및 PBL을 적색 광 대신에 황색 광에 노출시킨 것 외에는 상기와 같은 과정을 반복 실시하였다. 그 결과를 제 7b도에 나타낸다.

CpD-1으로 처리한 MOTL-4는 시간 경과에 따라 생존율이 감소하여 황색 광 노출 후 8시간 경과 시에 2.7%에 이르른 반면, CpD-1으로 처리한 PBL은 황색 광 노출 후 8시간 경과 시에 생존율이 58.2%로 나타난 반면, HpD로 처리한 PBL은 황색 광 노출 후 8시간 경과 시에 생존율이 83.3%로 나타났다.

이들 결과로부터, CpD-1은 단파장(황색 광)에서 보다 장파장(적색 광)에서 더 높은 세포독성능을 나타냄을 알수 있다. 반대로, HpD는 적색 광에서 보다 황색 광에서 더 높은 세포독성능을 나타냈다. 이 경우에 있어서도, HpD의 세포 독성능은 CpD-1보다 훨씬 더 낮았다. 결론적으로, HpD는 CpD-1에 비해서 크게 효과적이지 않았다.

이상의 결과로 볼 때 CpD-1은 종양 세포에 대한 선택적 파괴능 면에서 HpD에 비하여 우수하다는 것을 알 수 있다.

[실시예 6]

[마우스 피부암 치료 효과(생체내 시험)]

C3H/HeJ 암컷 마우스(체중 : 약20g) 및 BA 악성 유방암을 사용하여 본 시험을 실시하였다. 피검 마우스의 후측복부에 1μl의 BA 악성유방암을 주사하여 피하 종양을 유방시켰다. 종양이 직경 6 내지 7mm로 성장하였을 때(이식 후 약 10일 경과 시)광활성 치료를 수행하였다.

광활성 치료를 수행함에 있어서, 12마리 마우스로 구성된 제 1 군은 CpD-1을 두가지의 서로 다른 용량으로 주사하고 주사 후 24시간 경과 시에 두가지의 서로 다른 광조사량으로 광에 노출시켰따.

12마리 마우스로 구성된 제 1 군으로부터. 6마리 마우스를 취하여 0.2ml의 스톡 솔루션(stock solution) 2로 처리(5㎎/㎏)한 후, 24시간 후에 파장 670nm의 광에 노출시켰다. 이들 6마리 마우스 중에서, 3마리는 총 100J/㎠의 광조사량으로 광에 노출시켰고, 다른 3마리는 총 300J/㎤의 광조사량으로 광에 노출시켰다. 다른 6마리 마우스에 스톡 솔루션 2를 0.4ml의 보다 높은 투여량으로 주사(10㎎/㎏)한 다음, CpD-1주사 후 24시간 경과 시에 광에 노출시켰다. 마찬가지로, 3마리는 총 100J/㎠과 광조사량으로 광에 노출시켰고, 다른 3마리는 총 300J/㎠의 광조사량으로 광에 노출시켰다. 따라서, 아군을 형성하는 3마리 마우스는 동일한 조건으로 과활성 치룔르 받은 것이다.

12마리 마우스로 구성된 제 2군에 대한 별도의 광활성 치료에 있어서, 광노출을 CpD-1 주사 후 4시간 경과 시에 시작한 것 외에는 동일한 광활성 치료 조건을 채택하였다. 그 결과를 표 3 및 표 4에 각각 나타낸다.

[표 3]

CpD-1 주사 후 24시간 경과 시의 광활성 치료

[표 4]

CpD-1 주사 후 4시간 경과 시의 광활성 치료

[실시예 7]

[고형암 치료 효과(생체내 시험)]

S-180 세포를 ICR 마우스에 복부 피하 주사로 주입하여 5 내지 10nm 정도의 고형 종양을 유발시켰다. S-180 세포는 육종-유발 세포주인 사르코마(Sarcoma) 180을 ICR 마우스에 장시간 패시징하여 얻었다.

피검 마우스를 두 군으로 나누어 각군에 CpD-1과 HpD를 각각 투여하였다.

이와 같이 처리한 각군을 다시 두 군으로 나누어 총 4군으로 만들었다. 4군 중 두군은 최대 포르피린 흡광도로 광에 각 10분간 2회 노출시켰다. 광노출은 광증감제 처리 후 1시간 및 24시간 경과시에 실시하였다. 다른 두 군은 광증감제로 처리한 후 동일한 마우스 군에 24시간 및 48시간 경과시에 각 10분씩 동일한 광에 2회 노출시켰다.

CpD-1 주사 후 1시간 및 24시간 경과시에 2회 광에 노출된 군은 치유율이 100%(치유 개체수/전체 개체수=20/20)이었고, HpD로 처리한 군은 치유율이 80%(16/20)이었다. 이들 결과로부터 CpD-1에 HpD에 비하여 뛰어난 광증감 작용(P〈0.025)을 발휘한다는 것을 알 수 있다.

또한, 24시간 및 48시간 후에 2회 광에 노출한 경우 CpD-1 처리군은 치유율이 60%(12/20)이었고, HpD처리군은 80%(16/20)이었다. 이들 결과(P〉0.1)로부터, CpD-1이 종양 세포에서의 잔류 시간이 매우 짧으므로 환자가 CpD-1으로 치료를 받은 다음 비교적 단시간내에 밝은 곳으로 나와도 이차적인 광의 작용을 받을 염려가 적다는 것을 알 수 있다. HpD의 경우는 피부의 발적, 부종 및 통증과 같은 HpD의 이차적인 독성과 효과가 나타날 염려가 있기 때문에, 광활성 종양 치료를 받은 다음 적어도 24시간 동안 광이 차단되 곳에 환자가 수용되어 있어야 한다[문헌 Photobiology of porphyrins, In Doiron DR, Gomer CJ eds., Porphyrin localization and treastment of trumors, New Yokr, Alan R liss, Inc., 1984, 0019∼39 참조].

이상의 실험 결과를 비교할 때 CpD-1이 여러면에서 HpD보다 우수하며 종양 세포 치료용 광증감제로유효하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 8]

[복수암 치료 효과{생체내 시험)]

S-180 세포를 ICR 마우스에 복부 피하 주사로 주입하여 복수암을 유발한 후 마우스를 다섯군으로 나누었다. 각 군은 10마리 마우스로 구성하였다. CpD-1의 복수암에 대한 치료 효과는 치료 시간에 따라 마우스 체중의 증가 양상을 기준으로 평가하였다.

첫째 군은 S-180을 주사한 후 6일째, 둘째군은 13일째, 그리고 셋째군은 20일째에 각각 CpD-1으로 처리한 다음, CpD-1 주사 후 24시간, 48시간, 72시간 경과시에 각각 10분 동안 3회 광에 노출시쳤다. 넷째군은 CpD-1으로 처리하였지만, 광에 노출시키지 않았다. 다섯째 군은 CpD-1으로 처리하지 않았다.

피검 마우스의 체중 증가가 다섯째 군과 실질적으로 동이하고 상기 처리 후 50일 이상 생존하는 경우를 그 마우스는 완전히 치유되었다고 규정하였다. 첫째 군의 마우스는 10마리 중 8마리가 완전히 치유되었다. 둘째 군은 3마리만 치유되고 나무지 7마리는 지속적으로 체중이 증가하여 35일내에 모두 죽었다. 셋째 군은 지속적으로 체중이 증가하여 35일내에 모두 죽었다. 넷째 군도 빠른 속도로 체중이 증가하여 35일내에 처음 체중의 약 2배 정도로 증가하여 모든 마우스가 죽었다.

이상의 결과를 요약해 볼 때 종양의 부위가 적을수록 치유율이 높게 나타나며, 복수암을 광활성 종양 치료법으로 치유하는 데에 CpD-1을 사용할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 9]

[퇴행성 바이러스(retrovirus)의 역전사 효소 저해 효소]

먼저 전염성 그로스 류케미아 바이러스(Gross Leukemia Virus : GLV) 용액을 5배 비율로 희석한 용액을 조제하였다. GLV는 류케믹(Leukemic C3HeB/Fe 마우스로부터 얻은 TGV 셀 라인을 배지에 배양시켜 얻었다[문헌 Machala O, Bodyd R. Youn Jk, and Barski G : Long-term in vitro culture of pathogenic Gross leukemia virus in mouse thymus cells, Eur. J . Cancer 10. pp. 467∼472, 1974 참조]. 생성 용액을 CpD-1으로 처리한 후 광에 노출시켰다. 그 후 역전사 효소의 생성량을 조사하여 바이러스에 대한 독성능을 평가하였다.

GLV를 1×10⁵개의 정상 마우스 태아 세포에 접종하여, 페니실린(100units/ml), 스트렙토마신(100μg/ml) 및 우태아 혈청이 10% 함유된 이들 최소 필수 배지에서 24시간 동안 배양하였다. CpD-1을 가한 다음 광에 노출시킨 후, 배양물을 트립신으로 처리하고 트립판 블루로 염색하여 생존하는 세포를 계수하였다. 초고속 원침으로 얻은 바이러스 펠렛을 세정제로 분쇄하고, 역전사 효소에 의한³H dTTP의 혼입 정도를 측정할 수 있는 반응 혼합액과 반응시켰다. 생성 혼합물을 유리 섬유 필터에 점적하고, 세척, 건조하고, 신틸레이션 카운터를 사용하여 고유 방사능 값을 측정하였다.

CpD-1으로 처리하고 광에 노출시킨 바이러스는 5.000cpm 이하의 방사능 값을 나타내어 효소 생산(즉, 환원)이나 효소에 대한 광활성 작용(역전사)에 있어서 큰 효과가 있음에 반하여, CpD-1으로 처리하지 않고 광에 노출시킨 대조군은 40,000cpm 이상의 방사능 값을 나타낸다. 또한, CpD-1으로처리하고 광에 노출시킨 동일 바이러스는 마우스 태아 세포에 대한 감염성도 감소되었다.

이상의 결과를 비추어볼 때 CpD-1는 항바이러스 효과가 있음을 알 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명에 따른 10-OH 페오피틴 α 및 그의 약학적을 허용되는 염은 향상된 광증감성 및 종양 세포에 대한 뛰어난 흡수성을 나타낸다.

더욱이, 본 발명에 따른 화합물들은 암세포의 선택적 파괴 및 일중항 산소의 생성능 면에서, 다른 종래의 광증감제, 특히 HpD에 바하여 우수하다, 그러므로, 본 발명의 화합물들은 광활성 치료법에 있어서 광증감제로서 사용하기에 적합할 것으로 기대된다.

Claims

하기 구조식(I)로 나타내는 10-히드록시 페어피틴 α 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
(a) 잠분으로부터 적절한 용매를 사용하여 클로로필 대사산물을 추출하는 단계, (b) 추출물을 적절한 용매 중에 과포화 상태에 이를 때까지 용해시키는 단계, (c) 생성된 용액을 크로마토그래피하여 광증감제 성분을 분리하는 단계, 및 (d) 강력한 광증감 작용을 나타내는 분획을 수집하여 통상의 방법에 따라 정제하는 단계로 이루어진 것이 특징인, 하기 구조식(I)으로 나타내는 10-히드록시 페오피틴 α 또는 그의 약학적으로허용되는 염의 제조 방법.
(a) 클로로필 α를 에탄올 또는 클로로포름 중에서 실온에서 HCl과 반응시켜 마그네슘 이온을 제거하는 단계, (b) 희미한 보안등 하에 또는 암소에서 1일 이상 동안 실온에서 생성 용액에 공기를 완화하게 버블링하여 C₁₀위치의 수소 원자를 히드록시기로 교체시키는 단계 및 (c) 생성물을 통상의 정제 방법에 의하여 정제시키는 단계로 이루어진 것이 특징인, 하기 구조식(I)로 나타내는 10-히드록시 페오피틴 α 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 제조 방법.
하기 구조식(I)로 나타내는 10-히드록시 페오피틴 a 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 하는 광활서 암츠료용 광증감제 조성물.