KR950009018B1 - 젖소 수정 진단방법 및 진단키트 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

젖소 수정 진단방법 및 진단키트

제1도는 젖소의 발정주기에 따른 프로게스테론 농도변화를 도시한 그래프.

제2도는 본 발명의 진단키트 세트를 도시한 개략도로서, (a)는 마이크로플레이트 스트립 웰 및 웰 덮개를 도시한 것이고, (b)는 빨대를 도시한 것이며, (c)는 용액들을 담은 용기를 도시한 것이다.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : 마이크로플레이트 스트립 웰 2 : 웰 덮개

3 : 표준용액

4 : 프로게스테론-호스라디쉬 페록시다제 결합체 용액

5 : 테트라메틸 벤지딘용액 6 : 과산화수소(H₂O₂)용액

7 : 빨대 8 : 용기

본 발명은 젖소수정 진단방법 및 진단키트에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 효소면역진단 방법에서 항원과 항체의 반응결과를 확인하기 위하여 발색제(Chromogen)와 기질(substrate)을 혼합 조제하는 새로운 방법을 이용한 젖소의 수정조기진단 및 난소기능을 정확하게 판단할 수 있는 젖소수정 진단방법 및 진단키트에 관한 것이다.

일반적으로 효소면역진단 방법에서 결과 확인을 위한 한가지 방법으로 발색제로 테트라메틸 벤지딘(Tetramethyl Benzidine)과 기질로 과산화수소(H₂O₂)를 혼합조제하여 사용하여 왔다. 그러나, 발색제와 기질의 혼합용액을 제조한 후 수일간 보관하면 발색제인 테트라메틸 벤지딘이 석출되고, 용액자체가 발색되는 결점이 있었기 때문에 실험실에서만 사용할 수 있었고 산업상으로는 이용할 수 없었다.

이러한 이유 때문에 항상 효소면역진단 방법에서 결과 확인을 하기 위하여는 사용하기 바로 직전에 상기의 두 물질의 혼합용액을 조제하여 사용해야 한다. 이에 따라 상기 방법에 의한 결과 확인을 할려면 매번 두 물질을 혼합제조하여 사용함으로써 두 물질의 낭비, 시간의 손실, 계속적인 동일조건에서 결과 확인이 불가능하였을 뿐만 아니라, 제조된 효소면역 진단키트는 장기 저장성이 없기 때문에 산업적으로 제조판매할 수 없는 단점이 있었다.

현재 국내에서는 젖소의 임신여부를 감정할 수 있는 진단키트가 개발되지 않아 젖소를 수정시킨 후 50 내지 60일 이후에 수의사가 직접 직장검사로 젖소의 임신감정을 판단하는 방법에 전적으로 의존하고 있다. 그러나, 상기 방법에 의하여 수정후 50 내지 60일 이후에 임신감정을 하면 젖소의 긴 공태기 발생으로 많은 경제적인 손실을 가져왔다. 이와 관련하여 낙농의 과학화가 활발히 진행되고 있는 유럽선진국 및 구미지역의 나라들은 낙농산업 발전의 일환으로 젖소의 수정적기진단, 조기임신진단 및 번식장애 진단을 판단할 수 있는 키트를 개발, 널리 보급함으로서 양축가와 수의 및 낙농산업에 이바지하고 있다. 현재 젖소의 임신여부 진단키트와 관련한 종래의 제품으로는 신바이오틱스 코오포레이션(미국)사에서 "EstruCheck"이라는 상품명으로 시판되는 진단키트가 있는데 이 진단키트로 진단하면 임신/비임신의 색구분이 뚜렷하지 않아 임신여부 판단이 어려울 뿐만 아니라 색이 재현성이 좋지 않은 문제점이 있다.

이에 본 발명자는 상기 문제점을 예외 검토한 결과, 발색제와 기질을 따로 분리 제조하여 보존기간을 연장시킴으로써 진단키트의 정확도와 예민도를 크게 높인 젖소 수정 진단키트 및 진단방법을 발견하였고, 본 발명은 상기 발견에 기초하여 완성되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 젖소의 수정여부를 신속, 정확하게 조기 진단할 수 있는 젖고 수정 진단키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 진단키트를 사용하여 젖소원유에 들어있는 프로게스테론 농도의 차이에 따른 발현색으로서 임신여부를 신속, 정확하게 측정하는 젖소 수정 진단방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인산염 완충용액(PBS)이 내장된 마이크로플레이트 스트립 웰 및 웰 덮개, 표준용액이 담긴 용기, 프로게스테론-호스라디쉬 페록시다제 결합체용액이 담긴 용기, 테트라메틸 벤지딘 용액이 담긴 용기, 과산화수소용액이 담긴 용기, 및 빨대로 구성된다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구성을 좀 더 구제적으로 설명하면, 제1도에 도시한 바와 같이, 정상적인 젖소의 발정주기는 19∼22일이고 발정일에는 원유의 프로게스테론 농도가 0에 가깝고, 미수정되었을 때에는 19일째에 프로게스테론 농도가 다시 0에 가깝게 낮아지며 임신이 되었을 경우에는 계속 높은 농도를 유지하게 된다. 따라서, 19일째에 원유를 채취하여 본 발명의 진단키트를 사용하여 진단방법에 따라 처리하면 수정시킨 젖소가 비임신 또는 임신인지를 쉽게 판단할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단키트를 사용하면 20일 내에 미수정된 젖소를 판독할 수 있어, 즉시 재수정이 가능하므로, 공태기를 최소한으로 줄일 수 있으며, 또한, 일정기간에 본 발명의 진단키트를 사용하여 프로게스테론 농도로서 번식장애에 관여하는 난소기능 상태를 알아내어 빠른 시일안에 필요한 치료조치를 취할 수 있다. 이하, 본 발명의 진단키트 및 진단방법에 대하여 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 발명에 사용되는 진단키트는 제2도에 도시한 바와 같이 인산염 완충용액(PBS)이 내장된 마이크로플레이트 스트립 웰(Microplate strip well)(1), 웰 덮개(2), 표준용액이 담긴 용기(3), 프로게스테론-호스라디쉬 페록시다제 결합체(Progesterone-horseradish peroxidase conjugate) 용액이 담긴 용기(4), 테트라메틸 벤지딘(Tetramethyl benzidine) 용액이 담긴 용기(5), 및 과산화수소(H₂O₂) 용액이 담긴 용기(6) 및 빨대(7)로 구성되며, 상기 진단키트를 사용하여 젖소의 수정 적기 판단, 임신(비임신) 여부 판단 및 난소 및 자궁상태를 정확하게 판단할 수 있는 젖소의 표준 진단방법을 기술하면 다음과 같다.

[진단방법]

(1) 젖소를 피검체로 하여 저녁에 착유시 처음 젖을 3-4번 짜버린 뒤 채취한 원유를 가검시료로 사용한다.

(2) 제2도의 마이크로플레이트 스트립 웰의 덮개막을 벗겨내고 웰안의 용액을 완전히 제거한다.

(3) 상기 웰을 꺼꾸로 하여 웰 안에 남아있는 물기를 털어낸다.

(4) 표준색을 만들기 위하여 빨대를 사용하여 표준용기의 용액 1방울(약 50㎕)을 첫번째 원통에 넣고 나머지 원통에는 다른 빨대를 사용하여 가검시료인 젖소원유를 1방울씩 떨어뜨린다.

(5) 곧바로 프로게스테론-호스라디쉬 페록시다제 결합체 용액을 각각의 원통에 3방울씩(150㎕) 첨가한 후 10 내지 20분간 방치하고 항체와 결합되지 않은 프로게스테론-호스라디쉬 페록시다제 결합체를 제거하기 위하여 웰 안의 용액을 버리고 수도물로 4회 씻는다.

(6) (3)번의 과정을 반복실시한다.

(7) TMB용액을 각 원통에 2방울(약 50㎕)씩 떨어뜨린 후 과산화수소용액 3방울씩(100㎕)을 각 원통에 떨어뜨린다.

(8) 3분 경과후부터 10분 사이에 발현되는 색을 보고 푸른색의 표준 용액과 비교하면서 판단을 한다.

(9) 이때 가검시료를 넣은 원통의 색이 무색을 띠면 양성(+)으로서 임신이 된 것이고, 푸른색을 띠면 음성(-)으로서 발정 또는 비임신상태를 나타내는 것이며, 옅은 푸른색을 띠면 의양성(+/-)으로서 3 내지 4일 후에 다시 시험하여 판단하면 된다.

이하 제조예 및 실시예를 통하여 상기 용액의 제조방법과 상기 제조방법에 의해 제조된 젖소의 수정 진단 키트의 진단방법에 대하여 좀더 구체적으로 기술하지만, 본 발명을 이에 한정하는 것은 아니다.

[제조예]

(1) 마이크로플레이트 스트립 웰의 제조

제2도에서 도시한 바와 같이 마이크로플레이트 스트립 웰(1)의 내부표면에 프로게스테론에 대한 항체를 20∼200pg 피복시킨 후 1%BSA(Bovine Serum Albumin)을 피복되지 않은 표면에 부착시켰다. 이어서, 증류수에 8.1mM의 Na₂HPO₄, 1.5mM의 KH₂PO₄, 0.15M의 NaCl 및 2.7mM의 KCl을 혼합하여 제조한 후, 상기 용액을 상기 웰에 가득 채운 뒤 접착필름으로 윗면을 밀봉하여 마이크로플레이트 스트립 제조한다.

(2) 표준용액의 제조

프로게스테론이 거의 들어있지 않은 발정상태의 젖소원유를 채취한 뒤, 원유 1㎖당 프로게스테론 2ng을 가하고 중크롬산칼륨을 전체 용액의 0.05%함량으로 첨가한 뒤, 균질하게 혼합하여 황색의 표준용액을 제조하여 용기(3)에 담는다.

(3) 프로게스테론-호스라디쉬 페록시다제 결합체 용액의 제조

먼저, 증류수에 40mM의 Na₂HPO₄, 0.15M의 NaCl 및 BSA를 전체 용액의 0.1중량%의 함량으로 첨가한 뒤, 1N HCl을 가하여 용액의 pH를 7.4로 조절하여 용액 1㎖당 프로게스테론-호스라디쉬 페록시다제 결합체를 40ng 가하여 균질하게 혼합한 뒤, 무색의 페록시다제 결합제 용액을 제조하여 용기(4)에 담는다.

(4) TMB 용액의 제조

무수 에틸알콜 100㎖에 TMB(Tetramethyl benzidine) 6g을 첨가하여 TMB가 6%가 되도록 TMB 원액을 제조한 뒤 균질하게 혼합한다. 이어서, 하기 조성비율로 각 성분을 균질하게 혼합하여 TMB 용액을 제조하여 용기(5)에 담아 차광된 상태로 보관한다.

[100㎖ TMB용액 제조시 각 성분의 조성비]

- TMB 원액 : 4∼7%(v/v)

- 무수에틸알콜 : 40∼60%(v/v)

- 증류수 : 33∼56%(v/v)

이때, 상기 성분의 최적 비율은 TMB 원액이 4.5%(v/v)이고, 무수 에틸알콜이 55.5%(v/v)이며, 증류수가 40%(v/v)이다.

(5) 과산화수소(H₂O₂) 용액의 제조

1L의 증류수에 초산나트륨(CH₃COONa 3H₂O) 22.6g을 가하여 완전히 용해시킨 후 포화구연산을 사용하여 용액의 pH를 5.5로 조절하여 무색의 용액을 얻었으며, 여기서 얻은 용액 100㎖에 1% H₂O₂60㎕을 첨가하여 무색의 과산화수소 용액을 제조한 뒤 용기(6)에 담는다.

본 발명에서 제조한 모든 용액은 항체의 변성을 방지하고, 장기간 사용할 수 있도록 냉장보관하여 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 진단키트는 실온 바람직하게는 20 내지 28℃의 온도에서 검사하는 것이 바람직하다.

[실시예 1]

수정적기 진단(발정진단)

젖소를 대상으로 하여 발정이 올 때쯤 되거나 왔다고 추정되는 젖소 100두를 피검체로 하여 저녁에 착유시 젖을 3-4번 짜버린 뒤 각 젖소로부터 원유 10㎖을 채유하여 가검시료로 하였다. 먼저, 키트의 마이크로플레이트 스트립 웰의 덮개막을 제거하고 웰 안의 용액을 버리고, 웰 안에 남아있는 물기를 털어낸다. 표준색을 만들기 위해 표준용액 1방울을 빨대를 사용하여 첫번째 원통안에 넣고, 나머지 원통에는 가검시료를 1방울씩 떨어뜨린다. 그 다음 프로게스테론-호스라디쉬 페록시다제 결합제 용액을 각 원통에 3방울씩 떨어뜨린 후, 10분간 방치 후 웰안의 용액을 버리고 수도물로 4회 씻는다. 이어서, 웰안에 남아있는 물기를 털어낸 뒤 웰안에 TMB용액 및 과산화수소 용액을 각각 2방울 및 3방울을 계속해서 떨어뜨린다. 5분이 경과하자 가검시료가 담긴 원통에서 색이 나타나기 시작했으며 표준색과 비교하였다. 상기 진단방법에 의한 판정결과 젖소 80두는 발정상태이고, 20두는 비발정 상태로 판정되었다. 본 키트의 효능을 입증하기 위하여 본 시험에 사용된 젖소 100두는 수의사에게 의뢰하여 발정여부를 정밀의뢰한 결과 본 키트와 동일한 판정결과를 내렸다. 따라서, 본 키트의 수정적기(발정)진단 정확도는 100%임이 입증되었다.

[실시예 2]

[임신(비임신) 진단]

수정시킨 후 20일째 된 젖소 100두를 피검체로 하여 저녁 착유시 처음 젖을 3 내지 4번 짜버린 후 각 젖소로부터 10㎖을 채유하여 가검시료로 하는 것을 제외하고는 실시에 1과 동일한 방법으로 검사를 실시하였다. 검사결과 젖소 50두는 비임신으로 판정되었으며, 나머지 50두는 임신을 한것으로 판정되었다. 진단결과의 정확성 여부를 확인하기 위해 수의사에게 정밀의뢰한 결과 비임신으로 진단된 젖소는 본 시험과 동일한 결과를 얻었으나, 임신으로 진단된 젖소 50두중 7두는 비임신으로 진단되었다. 따라서, 비임신 진단율은 100%이고, 임신 진단율은 86%로 나타났다. 이러한 현상이 발생된 주된 이유는 임신은 되지 않았으나 영구 황체가 되어서 임신으로 판정되는 경우 및 태아가 조기에 사망하는 경우가 있기 때문이다. 더욱이, 수정후 50일 미만에서 능숙한 수의사라 할지라도 직장검사로 임신감정을 하게되면 8∼15%의 유산율이 있다는 것을 감안한다면 본 발명의 키트를 사용하는 것이 유산방지 및, 경제적인 면에서 유리하다.

[실시예 3]

[난소 기능 진단(발정이 오지 않는 젖소)]

평상시 건강상태가 양호하지 않고, 임신이 잘 되지 않았던 젖소중 계속해서 발정이 오지 않는 젖소 140두를 피검체로 하여 이상을 발견한날 및 그 후 10일째 되는날 2회에 걸쳐서 저녁 착유시 채유한 원유를 가검시료로 하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 반복실시하였다. 검사결과, 2번 모두 가검시료가 음성(-)으로 나타나면 난소 기능(난종, 기능약화)에 문제가 있는 것이다. 본 발명의 키트에 의해 난소 기능에 문제가 있는 것으로 판명된 젖소 100두를 대상으로 수의사에게 정밀의뢰한 결과 난소 기능(난종, 기능약화)에 문제가 있는 것으로 판명되었다. 따라서, 난소 기능 판단에 관해 본 키트를 활용할 수 있다.

본 발명의 진단키트를 사용하지 않았을 때 발생되는 경제적 손실을 하기 표 1에 나타내었고, 하기 표 2에는 TMB 용액과 H₂O₂용액의 분리형과 혼합형의 보존실험 결과를 기재하였다.

[표 1]

[ 젖소의 분만간격 연장에 따른 경제적 손실]

주) 1) 12개월을 정상적인 분만간격으로 봄

2) 젖소원유 : 405원/㎏

3) 송아지 암·수 평균가격 : 900,000원

4) 비유능력 6,000㎏/년

[표 2]

주) 비임신 젖소의 원유와 임신한 젖소의 원유를 대상을 흡광도(Optical Density, 0·D)값을 측정하여 비교한 값임.

상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, TMB용액과 H₂O₂용액의 혼합형은 시간이 갈수록 0·D값이 현저하게 떨어져 젖소 임신 진단 여부 측정시 시각을 통해 판독이 불가능해져 비임신과 임신을 구별하기가 매우 어렵다. 임신(비임신)여부 판독에 정확성을 기하려면 0·D 차이값은 0.50 이상이어야 한다. 상기 표 2의 0·D값의 기준일은 시험 개시일이다.

전술한 바와 같이, TBM용액과 H₂O₂용액의 혼합형은 4일 이후부터 0·D값이 작아지고 있기 때문에 혼합 제조후 즉시 사용해야 하고, 본 발명에 따른 TMB용액과 H2O2 용액의 분리형은 1년까지 사용이 가능하다. 더불어 본 발명에 따른 발색제와 기질의 새로운 제조방법은 본 발명에 한정되는 것이 아니라 모든 효소 면역진단 방법에 적용이 가능한 것이다.

Claims (6)

1. 인산염 완충용액이 내장된 마이크로플레이트 스트립 웰 및 웰 덮개, 표준용액이 담긴 용기, 프로게스테론-호스라디쉬 페록시다제 결합체용액이 담긴 용기, 테트라메틸 벤지딘 용액이 담긴 용기, 과산화수소 용액이 담긴 용기 및 빨대로 구성된 것을 특징으로 하는 젖소 수정 진단키트.
2. 제1항에 있어서, 상기 마이크로플레이트 스트립 웰의 내부 표면에 프로게스테론에 대한 항체 20∼200pg이 피복됨을 특징으로 하는 젖소 수정 진단키트.
3. 제1항에 있어서, 상기 테트라메틸 벤지딘 용액이 TMB원액 4∼7%(v/v), 무수 에틸알콜 40∼60%(v/v) 및 증류수 35∼56%(v/v)로 구성됨을 특징으로 하는 젖소 수정 진단키트.
4. (가) 가검시료로서 젖소에서 원유를 채취하는 단계, (나) 마이크로플레이트 스트립 웰의 덮개막을 벗겨내고 웰안의 용액을 완전히 제거하는 단계, (다) 상기 웰을 꺼꾸로 하여 웰안에 남아있는 물기를 털어내는 단계, (라) 표준색을 만들기 위하여 빨대를 사용하여 표준용기의 용액 1방울을 첫번째 원통에 넣고 나머지 원통에는 다른 빨대를 사용하여 가검시료인 젖소원유를 1방울씩 첨가하는 단계, (마) 즉시 프로게스테론-호스라디쉬 페록시다제 결합체 용액을 각각의 원통에 3방울씩 첨가한 후 10 내지 20분간 방치하고 항체와 결합되지 않은 프로게스테론-호스라디쉬 페록시다제 결합체를 제거하기 위하여 웰안의 용액을 버리고 수도물로 4회 정도 세척하는 단계, (바) (다)번의 과정을 반복실시하는 단계, (사) TMB용액을 각 원통에 2방울씩 떨어뜨린 후 과산화수소 용액 3방울씩을 각 원통에 첨가하는 단계 및 (아) 3분 경과 후부터 10분 사이에 발현되는 색을 보고 푸른색의 표준용액과 비교하면서 판단하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 젖소의 수정 진단방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 가검시료를 넣은 원통의 색이 무색을 띠면 양성(+)으로서 임신이 된 것이고, 푸른색을 띠면 음성(-)으로서 발정 또는 비임신상태를 나타내는 것을 특징으로 하는 젖소의 수정 진단방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 가검시료를 넣은 원통의 색이 옅은 청색을 띠면 의양성(+/-)으로서 3 내지 4일 후에 다시 시험하여 판단하는 것을 특징으로 하는 젖소의 수정 진단방법.