KR930000053B1

KR930000053B1 - 항생물질 l 17392(데글루코테이코플라닌)의 제조 방법

Info

Publication number: KR930000053B1
Application number: KR1019860700083A
Authority: KR
Inventors: 아드리아노 말라바르바; 파올로 스트라쫄리니; 브루노 카발레리
Original assignee: 그루포 레페티트 에스. 피. 에이.; 레나토 스가르비
Priority date: 1984-06-13
Filing date: 1985-06-04
Publication date: 1993-01-06
Also published as: JPH0613555B2; WO1986000076A1; DK52986D0; DK52986A; GB8415093D0; ZA854246B; CA1250096A; KR860700123A; HUT40812A; HU197758B; ES544092A0; JPS61502400A; US4882419A; EP0185715A1; EP0185715B1; ES8609332A1; IL75474A0; DE3571991D1

Abstract

내용 없음.

Description

항생물질 L 17392(데글루코테이코플라닌)의 제조 방법

항생물질 L 17392는 글리코펩티드계 항생물질인 테이코플라닌으로부터 당성분을 모두 제거시켜서 얻은 항생물질이다.

테이코플라닌은 동화될 수 있는 탄소원, 질소원 및 무기염원을 함유시킨 배지 중에서 균주 악티노플라네스 테이코미세티쿠스 [

nov. sp. ATCC 31121(이 균주는 1983년 5월 19일자로 한국과학기술원에 기탁번호 제830519-07911호로 기탁되고, 1983년 6월 7일자 특허출원 제2517호와 관련해서 1983년 6월 21일자로 대한민국 특허청에 미생물 수탁번호 통지서를 제출한 바 있습니다)]을 배양시켜서 얻은, 전에는 테이코마이신으로 칭했던 항생물질의 국제 비독점 명칭(INN)이다(미합중국 특허 제4,239,751호 참조). 위의 특허에 기재된 방법에 의하면, 테이코마이신 A₁,A₂및 A₃를 함유하는 항생물질 복합체는 통상의 방법에 의하여 적당한 수불용성 유기 용매로 추출하고, 이 추출 용매로부터 침전시킴으로써 분리된 발효액으로부터 회수된다. 이어서, 단리된 항생물질 복합체의 주 인자인 테이코마이신 A₂는 세파덱스(Sephadex

)상에 컬럼 크로마토그라피하여 얻은 항생물질 혼합물로부터 분리시킨다.

순수한 결정형 항생물질 L 17392의 이화학적 특성

a) pH 9이상의 물과 메탄올 수용액, 에탄올 수용액 및 아세톤 수용액 중에서 가용성이고, 에틸 알코올과 디메틸포름아미드 중에서 약간 가용성임.

b) 다음과 같은 흡수 최대치를 나타내는 자외선 흡수 스펙트럼

-0.1N 염산 중에서

-0.1N 수산화나트륨 중에서

c) 뉴졸 중에서 다음과 같은 주목할만한 흡수 최대치(cm^-1)를 갖는 적외선 흡수 스펙트럼

3250(νNH와 페놀성 νOH)

1645(아미드 I)

1610(νCOO-)

1595(δNH³+)

1520(아미드 II)

d) 50℃의 DMSO-d₆(내부 표준치 TMS, δ=0.00ppm)중에서 Bruker WH-270 스펙트로미터를 사용하여, 270MHz에서 기록한¹H NMR 스펙트럼의 D₂O 교환 및 선택적인 커플링 제거 실험 후 얻은¹H NMR 데이터중 일부는 다음과 같다(δppm, 다중도) :

2.85-3.30, 2dd ; 4.12, dd ; 4.37, d ; 4.45, d ; 4.50, s ; 5.00, ddd ; 5.11, d, 5.14, d, 5.35, d ; 5.56, d ; 5.60, d ; 6.3-7.9, m ; 6.55, d ; 7.37, d ; 7.50, d ; 7.61 ; 8.26, d ; 8.5-10.2, br.

d=이중선

dd=2개의 이중선

ddd=3개의 이중선

s=단일선

m=다중선

br=넓음

e) 원소 분석 결과 다음과 같은 대략적인 백분율 조성(평균치)을 나타냄 : 탄소 58.05%, 수소 3.58%, 질소 8.23%, 염소 5.85%, (열 중량 분석에 의해 측정한 중량 손실 1%에 대한 보정후 값임)

f) 고속 원자 충격(FAB)-질량분석 시험(MS)으로 확인한 결과 분자량은 1199임.

g) 구조식(유용한 데이터를 근거로해서 계산함) : C₅₈H₄₅Cl₂N₇O₁₈

h) 체류시간(t_R)=12.2분[Perisorb RP-8(30μm, Merck)로 충전시킨 예비컬럼(5cm)를 사용하고, 이어서 Lichrosorb RP 8(10μm)로 미리 충전시킨 컬럼 Hibar RT 250-4(Merck)를 사용하고 0.2% 포름산 암모늄 수용액 중 10-30% 아세토니트릴을 사용해서 선형 구배로 용출시키고, 유속 2ml/분으로 HPLC 에 의해 분석했음](내부 표준치, 영국 특허 출원공고 제2,121,401호에 기재된 테이코플라닌 A₂성분 2는 이 시스템에서 t_R22.4분이었음).

i) 염을 형성할 수 있는 산성 기능.

l) 염을 형성할 수 있는 염기성 기능.

m) 당잔류물이 없음.

이 화학적 데이타를 근거로해서, 항생물질 L 17392를 하기 구조식(I)로 표시할 수 있다.

동일한 구조식을 갖는 물질이 유럽 특허 출원 제0098578호에 기재되어 있으며, 이 물질은 항생물질 A 41030인자 B로 칭한다. 이 물질은 적당한 배지중에서 스트랩토마이세스 비르기니애(

) NRRL 12525 또는 스트렙토마이세스 비르기니애 NRRL 15156 균주를 발효시키고, 단리 및 정제시킨 후, 항생물질 A 41030 인자 B를 그의 성분들로 분리시키는 공정을 포함하는 미생물학적 방법에 의해서 얻는다.

항생물질 L 17392는 각각 염기 또는 산과 염을 형성할 수 있는 산성 및 염기성 기능을 갖고 있다. 항생물질 L 17392의 산성 및(또는) 염기성 염류는 일반적으로 공지 방법으로 제조할 수 있다. 이 방법에는 항생물질 L 17392를 적어도 몰당량의 선택된 산 또는 염기와 반응시키는 것이 포함된다.

항생물질 L 17392와 염기와의 염을 제조하기 위한 방법중 적합한 방법에는 항생물질 L 17392 및 염기를, 편리하기로는 실온에서, 물 중에서 약 등몰량으로 반응시키고, 염화(鹽化)반응 말기에 얻어진 용액을 동결 건조시키는 것이 포함된다.

항생물질 L 17392와 산과의 염을 제조하기 위한 방법 중 적합한 방법에는 항생물질 L 17392를, 편리하기로는 실온에서 저급 알칸올 수용액 중에서 선택된 산과 반응시키는 것이 포함된다. 이어서, 물을 제거하고, 유기상에 에틸에테르와 같은 비(非)용매를 첨가해서 항생물질 L 17392의 목적염을 침전시킨다. 저급 알칸올 수용액의 적합한 예로서는 물 및 부탄올의 혼합물을 들 수 있으며, 물/부탄올의 비율은 약 30/70이 적합하다.

항생물질 L 17392와 염기와의 염류의 대표적인 예로서는 나트륨염 또는 칼륨염과 같은 알칼리 금속염, 암모늄염 및 알킬암모늄 염이 있다. 이러한 염기와의 염류는 리신 및 아르기닌과 같은 염기성 아미노산과의 염도 포함된다. 산과 항생물질 L 17392의 염류는 대표적인 예로서는 염산, 브롬산, 황산, 인산, 글리콜산, 락트산, 피브르산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레인산, 히드록시말레인산, 벤조산, 히드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 2-페녹시벤조산, 메탄술폰산 및 2-히드록시에탄술폰산 부가염류를 들 수 있다.

시험관내에서 L 17392의 항세균성 활성은 마이크로티터 시스템에서 2배 희석법으로 측정하였다. 토드-휘위트 발효액(Todd-Hewitt broth, Difco 제품)은 연쇄상 구균에 사용하였고, 이소센시테스트 발효액(Isosensitest broth, Oxoid 제품)은 포도상 구균과 그람-음성 세균에 사용하였다. 배양액을 철야 희석시켜서, 최종 접종체가 ml당 약 10⁴콜로니 형성 단위(cfu/ml)가 되도록 하였다. 최소 억제 농도(MIC)는 37℃에서 18-24시간 동안 배양시킨 후, 가시성 증식이 전혀 나타나지 않는 최저 농도로서 판독되었다. 이와 같이 하여 얻어진 결과는 다음 표 I에 나타냈다.

[표 1]

a) 접종체 : 10⁶cfu/ml

b) 30% 소혈청 존재 하에서 측정했음.

항생물질 L 17392는 포도상구균(황색포도상구균, 표피포도상구군)에 대하여 극히 유효한 것으로 발견되었다. 항생물질 L 17392는 특히 각종 임상 단리물인 메티실린-내성 포도상구균(황색포도상구균, 표피포도상 구균)에 대하여 극히 유효하다. 이 실험 결과를 다음 표 II에 나타냈다.

[표 2]

클리코펩티드계 항생물질과 같은 복합 분자로부터 당 성분들을 모두 제거시킴에 있어서는 항시 많은 어려움이 있는 것은 알려진 사실이다. 실제로, 온화한 산 가수분해 조건은 통상적으로 당 성분들을 일부분만 제거시켜주는 한편, 강산 가수분해 조건은 기질의 부분적 분해를 촉진시키거나, 또는 키랄 중심들의 입체 화학적 배열에 있어서 변화를 촉진시킬 수 있다. 예를들면, 아보파르신으로 칭하는 글리코펨티드 항생물질에 있어서 순수한 아글리콘은 결코 단리되지 않고 있는데, 그 이유는, 유사한 물질에서와 같이, “코어(core)펩티드”구조를 변형시키지 않고 당 성분을 모두 제거시킬 수 있는 선택적인 가수분해 조건을 고안해내는 것이 아직까지 불가능하기 때문이다. 상기의 사실들은 다음과 같은 과학 문헌에 의해 뒷받침되고 있다. 즉, 지. 에이. 엘레스타드(G.A Elle stad) 등의 J. Antibiotics, 제36호, 제1683페이지(1983), 씨.엠.히래스 (C.M .Harri s) 등의 J.Am.Chem.Soc., 제105호, 제6915페이지(1983), 더블유. 제이.맥가렌 (W.J.Mcgahren) 등의 J. Antibiotics, 제36호, 제1671페이지(1983).

상기 문헌 중 어느 것에서도 테이코플라닌 화합물 또는 테이코플라닌 유사 화합물을 대응하는 테이코플라닌 아글리콘(항생물질 L 17392 또는 데글루코테이코플라닌)으로 변형시키는 구체적인 가수분해 조건을 사용하는 방법에 관해서 전혀 기재된 것이 없다. 또한, 테이코플라닌 유사 화합물(본 명세서에서 하기에 정의하였음)로부터 당 성분을 제거시켜서 항생물질 L 17392를 얻는 것은 기질의 화학적 구조 또는 키랄 중심들의 변형 또는 변경을 동시에 일으키지 아니하고 행해야 하는데, 그 이유는 이러한 변형이 생성되는 물질의 생물학적 활성에 바람직하지 않게 영향을 미치기 때문이다.

본 발명의 방법은 적합한 데글루코테이코플라닌 에스테르를 접촉 수소첨가분해 반응시켜서 항생물질 L 17392를 제조하는 것이다.

이러한 데글루코테이코플라닌 에스테르는 접속 수소첨가 반응에 의해서 분해시킬 수 있는 에스테르 결합을 가짐을 특징으로 하는 테이코플라닌의 아글리콘 성분의 카르복시 기능기에서 에스테르 유도체 중 한가지 일 수 있다.

본 발명의 방법에서 적당안 출발 물질인 데글루코테이코플라닌 에스테르의 대표적인 예로서는 벤질, 치환벤질, 벤즈히드릴, 4-피콜릴 에스테르 등이 있다. “치환 벤질”이란 용어는 페닐 고리에서 적어도 1개 이상의 치환체, 적합하기로는 1 내지 3치환체[이 치환체는 클로로, 브로모, 플루오로, 니트로, (C₁-C₃)알킬, (C₁-C₃)알콕시등으로부터 선택됨]로 치환된 페닐메틸기를 나타내며, 단 트리-니트로 페닐기는 제외된다. 이 치환 벤질기의 예로서는 3-클로로벤질, 4-클로로벤질, 2,3-디클로로벤질, 2,4-디클로로벤질, 2,4,6-트리클로로벤질, 3-플루오로벤질, 4-플루오로벤질, 3-메틸벤질, 3-메톡시벤질, 2-에톡시벤질등이 있다.

본 발명의 수소첨가분해 반응에서 사용된 촉매는 원자자가 0인 상태이거나(또는) 당 업계에 공지된 적당한 지지체 기재 상의 다수의 공지된 촉매(예, 팔라듐, 니켈, 구리, 코발트)중 한가지 일 수 있는데, 단 이 촉매는 독성이 있는 촉매로서 사용된다.

금속 촉매중 적합한 것으로는 탄소, 탄산바륨, 황산바륨 및 황산 칼슘으로부터 선택된 지지체 상의 팔라듐이 있다. 본 발명의 방법에서 양호한 결과는 황산바륨 기재 5-10% 팔라듐을 사용해서 얻었다. 이 촉매가 가장 적합한 촉매이다. 반응은 일반적으로 불활성 유기 용매, 즉 반응 경로중 바람직하지 않은 방해를 하지 않는 유기 용매 중에서 행한다.

적당한 불활성 용매의 대표적인 예로서는 반응 온도에서 액체이며, 적합하기로는 실온에서 액체인 메탄올, 에탄올, 디옥산, 글리콜 및 글리콜 모노알킬 에테르(예, 에틸렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르)와 같은 저급 알칸올이 있다. 일반적으로, 반응은 산성 매질 중에서 행한다.

반응 혼합물에 첨가시킬 적합한 산은 할로겐산(예, 염산)과 같은 다소 강한 무기산이 있다.

반응 매질의 압력은 일반적으로 중요한 파라미터이며, 사용된 촉매의 유형에 주로 의존한다. 일반적으로, 반응 매질의 압력은 상압 내지 약 5기압이 좋다.

반응 온도는 선택된 촉매 및 압력에 의존한다. 적합한 온도는 실온이나 필요에 따라서 최대로 30°-40℃의 온도를 사용할 수 있다.

촉매가 무기산 존재 하에 황산바륨 기재 5-10% 팔라듐일 경우에, 본 발명의 방법은 실온 및 상압에서 행하는 것이 유리하다. 이 경우에 있어서, 실제로, 온도를 증가시키거나 또는 압력을 증압시키는 것이 필요하지 않은데, 그 이유는 반응이 적당한 시간(0.5-3시간)내에 매우 놓은 수율(80-90%)로 완료되기 때문이다.

본 발명의 방법을 본질적으로 순수한 데글루코테이코플라닌 에스테르 또는 그의 산부가염에 대해서 행할 경우, 본질적으로 순수한 항생물질 L 17392를 얻었다.

반응 경로는 예를들면, UV 또는 오토바이오그라피 검출법을 사용해서 TLC 또는 HPLC 방법에 의해 당업계에 공지된 방법으로 쉽게 모니터할 수 있다. UV 검출은 254nm에서 행하는 한편, 오토바이오그라피 검출은 테이코플라닌 항생물질에 대해서 민감한 미생물을 사용해서 행할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용된 소수의 이론적인 양은 에스테르 기질 1몰당 약 1몰이다. 일반적으로, 당 업계에 공지된 바와 같이, 약간 과량의 수소를 사용하여 반응을 완료시키는 것이 필요하다.

이어서, 반응 생성물을 회수해서 비용매에 의한 침전, 용매를 이용하는 추출, 용매를 사용하는 결정화, 크로마토그라피(예, 컬럼 크로마토그라피 및 역상 컬럼 크로마토그라피)와 같은 공지의 방법으로 정제시킨다.

상기한 바와 같이, 다소 정제된 출발 물질을 사용할 경우에, 생성되는 항생물질 L 17392는 적당한 순도를 갖는다. 항생물질 L 17392를 더 정제시키는 것이 필요하거나 또는 바람직할 경우에는, 통상의 정제 방법 및 특히, 역상 고속 액체 크로마토그라피 (HPLC) 및 컬럼 크로마토그라피와 같은 크로마토그라피에 의해 얻을 수 있다.

정제 방법 중 적합한 방법에는 역상 컬럼 크로마토그라피를 사용하는 것이 포함된다. 이 경우에 적합한 흡착제는 0.06 내지 0.2mm의 입도 분포를 갖는 실란화실리카겔이다. 용출제는 이러한 정제 방법에서 사용되는 친수성 혼합물 중 한가지일 수 있다. 이러한 친수성 용출제의 대표적인 예로서는 유기산의 암모늄 염의 묽은 수용액, 아세토니트릴 또는 수용성 저급 알칸올의 혼합물을 들 수 있다. 유기산의 암모늄염의 묽은 수용액의 대표적인 에로서는 0.1-6% 포름산 암모늄 수용액을 들 수 있는 한편, 적당한 알칸올의 에로서는 메탄올, 에탄올, 프로판올 등을 들 수 있다. 용출제로서 적합한 것은 pH 6 내지 8의 포름산 암모늄 수용액 및 아세토니트릴의 혼합물이거나 또는 포름산암모늄 수용액 및 메탄올의 화합물을 들 수 있다. 적합한 방법에는 0.2% 포름산암모늄 수용액 중에 5 내지 21%의 아세토니트릴을 선형 단계 구배로 전개시키는 실란화 실리카겔(0.06-0.2mm) 상에서 제1역상 크로마토그라피와 용출제로서 아세토니트릴/물(1 : 1)의 혼합물을 사용하는 제2컬럼 크로마토그라피를 포함한다.

기타 적합한 방법으로는 a) 0.2% 포름산암모늄 수용액/메탄올/n-부탄올(1 : 2 : 3)중에 용해시킨 조 항생물질의 용액을 실란화 실리카겔로 혼합시킨 후, 용매를 제거시키고, b) 잔류물을 실란화 실리카겔(0.06-0.2mm) 컬럼의 정부에 충전시켜서, 0.6% 포름산암모늄 수용액 및 아세토니트릴(9 : 1)로 전개시키고, 용출물을 폐기시킨 후, 물 중의 아세토니트릴(1 : 9 내지 4 : 6)을 선형구배로 계속해서 용출시키는 것이다.

본 발명의 반응 공정의 경로를 모니터할 수 있거나 또는 반응 생성물을 HPLC에 의해 적정시키는 방법의 예는 다음과 같다.

샘플을 예정한 시간에 반응 혼합물로부터 채취해서, 0.2% 포름산암모늄 수용액/ 아세토니트릴(50 : 50)(v/v)의 혼합물 중에서 최종 농도 약 2mg/ml로 희석시키고, HPLC 시스템으로 주입(20μl)시킨다. HPLC 시스템은 20μl 루우프 주입기 리오다인(Rheodyne) 7125, 254nm에서 UV 검출기가 장치되고, 페리소브(Perisorb) PR-8 Merck(30-40μm)로 예비 컬럼을 채우고, 이어서 리크로소브(Lichrosorb) RP8(10μm)로 하이바 메르크(Hibar Merck) 컬럼(25cm)을 미리 채운 크로마토그라피 배리언(Varian) 5000이다.

용출제 : 약 3ml/min의 유속에서, 30분 내에 A중의 B는 5% 내지 60% 선형 구배.

용액 A : 0.2% 포름산 암모늄 수용액

용액 B : 아세토니트릴

상기 방법에 의해 얻은 생성물은 본 발명에 사용하기에 만족할만한 이화학적 및 생물학적 특성을 갖는 본질적으로 순수한 항생물질 L 17392이다.

항생물질 L 17392는 또한 조 반응 생성물로부터 직접적으로 또는 실질적으로 순수한 항생물질 L 17392의 처리에 의하여, 순수한 결정형 물질로서 얻을 수 있다.

순수한 결정형 항생물질 L 17392는 실제로 pH 약 1.7에서 물 및 아세토니트릴 (9 : 1)의 혼합물 중에 실질적으로 순수한 무정형 항생물질을 현탁시켜서 얻을 수 있다. pH는 1N 염산을 첨가하여 조절시키는 것이 편리하다. 생성된 용액을 컬럼 크로마토그라피에 의해 정제시키고, 이어서 항생물질 L 17392를 함유하는 분류물을 합하여 24시간 동안 방치시켜서 결정형 항생물질 L 17392를 석출시킨다. 이 경우에 있어서 컬럼 크로마토그라피 방법으로 적합한 것은 묽은 포름산 암모늄 수용액으로 평형시킨 실란화 실리카겔 컬럼에 산성 용액을 충전시키고, 물로 세척한 후, 70ml/h의 유속에서, 30시간 동안, 물 중의 아세토니트릴 10 내지 40%의 선형 구배로 전개시키는 것으로 된다.

이 방법은 또한, 조 항생물질 L 17392 또는 본 명세서에 기재한 수소첨가분해 반응의 종기에 촉매를 제거시킨 후, 얻은 조 항생물질 L 17392의 용액에도 적용시킬 수 있다. 항생물질 L 17392 결정은 무색 침상점이다.

본 명세서의 항생물질에 관하여 “본질적으로 순수”하다는 용어는 HPLC 역가가 95% 이상(예정된 UV파장, 즉 일반적으로 254nm에서의 피이크 면적의 백분율) 이고, 물 및 용매 함량이 10 내지 15중량%이며, 무기 잔류물이 0.5중량% 미만인 물질을 의미한다.

본 발명의 방법의 출발 물질인 데글루코테이코플라닌 에스테르 유도체는 하기 구조식(II)으로 표시할 수 있다.

상기 식중, R는 상기 정의한 바와같이 접촉 수소첨가분해 반응에 의하여 분해될 수 있는, 인접 카르복시기와 에스테르 결합을 형성하는 알코올의 알킬 잔기이고, A,B 및 Z는 수소 원자이다.

이 데글루코테이코플라닌 에스테르는 적당한 테이코플라닌 유사 물질을 조절된 조건 하에서 에스테르화 반응시켜서 제조할 수 있다.

본 명세서에서, “테이코플라닌 유사”물질 또는 기질이란 용어는 테이코플라신, 테이코플라닌 인자, 항생물질 L 17054, 항생물질 L 17046 및 이들의 임의 비율의 혼합물로부터 선택된 화합물을 나타낸다.

이러한 테이코플라닌 유사 물질 중 일부는 상기 구조식(II [여기에서, R 및 R¹은 수소이고, A는 수소 또는 N-[(C₁₀-C₁₁) 지방족 아실]-β-D-글루코사민이며, B는 수소 또는 N-아세틸-β-D-글루코사민이고, Z는 수소 또는 α-D-만노오스임]로 나타낼 수 있다. 상기한 바와 같이, 테이코플라닌은 악티노플라네스 테이코미세티쿠스 ATCC 31121에 의해 얻으며, 이것은 미합중국 특허 제4,239,751호에 기재되어 있다.

영국 특허 출원 공고 제2121401호에는 항생물질 테이코플라닌(구명칭 테이코마이신) 인자 A₂가 밀접한 관게를 갖는 함께 생성된 5개 성분들의 혼합물인 것으로 기재되어 있다. 최근에 구조 연구에 의하면, 테이코플라닌 A₂성분 1,2,3,4 및 5는 상기 구조식(I)[여기에서, R 및 R¹은 모두 수소이고, A는 N[(C₁₀-C₁₁) 지방족 아실]-β-D-글루코사민기이며, B는 N-아세틸-β-D-글루코사민기이고, Z는 α-D-만노오스기임]로 나타낼 수 있다. 이러한 당 성분들은, 존재시에 모두 O-글리코시드 결합을 통해서 테이코플라닌 핵에 결합되어 있다. (C₁₀-C₁₁)지방족 아실기의 대표적이고도 적합한 예로서는 n-데카노일, 8-메틸노나노일, Z-4-데세노일, 8-메틸데카노일 및 9-메틸데카노일이 있다.

항생물질 L 17054 및 항생물질 L 17046은 테이코플라닌 가수분해 생성물이다. 이 항생물질들은 각각 유럽 특허 출원 제84102666.9호 및 제84102665.1호에 기재되어 있다. 이 항생물질들은 테이코플라닌, 그의 순수한 인자 또는 임의 비율의 상기 인자들의 혼합물을 선택적으로 가수분해시켜서 출발 물질의 1 또는 2개의 당 성분들을 제거시킴으로써 얻을 수 있다. 더욱 구체적으로, N-[(C₁₀-C₁₁)지방족 아실]-β-D-글루코사민의 선택적인 제거로 항생물질 L 17054를 얻을 수 있는 한편, N-[(C₁₀-C₁₁)지방족 아실]-β-D-글루코사민 및 α-D-만노오스기를 선택적으로 제거하여 항생물질 L 17046을 얻는다.

항생물질 L 17054를 제조하기 위한 가수분해 조건중 적합한 것은 약 0.5N 염산을 70°내지 90℃에서, 일반적으로 15내지 90분 동안 가수분해시키는 것이다.

항생물질 L 17054는 상기 구조식(II)[여기에서, R 및 R¹은 수소원자이고, A는 히드록시이며, B는 N-아세틸-β-D-글루코사민이고, Z는 α-D-만노오스임]로 나타낼 수 있다.

항생물질 L 17046을 제조하기 위한 가수분해 조건 중 적합한 것은 약 1-3N 염산을 50°내지 90℃에서, 일반적으로 30 내지 60분 동안 가수분해시키는 것이다.

항생물질 L 17046은 상기 구조식(II)[여기에서, R 및 R¹은 수소 원자이고, A 및 Z는 히드록시기이며, B는 N-아세틸-β-D-글루코사민임]로 나타낼 수 있다.

상기한 바와 같이, 구조식(II)의 데글루코테이코플라닌 에스테르는 적당한 테이코플라닌 유사물질을 조절된 조건 하에서 에스테르와 반응시켜서 제조한다. 이 에스테르화 반응 조건은 “테이코플라닌 핵”이 변경되지 않고 에스테르화 반응이 완료되기 전에 출발 물질의 당 성분을 모두 가수분해시키는 조건이다. 본 발명의 데글루코테이코플라닌 에스테르 중간체를 제조하기 위한 편리한 방법에는 테이코플라닌 유사 화합물을 산 촉매(예, 37% 염산)존재 하에서, 구조식 ROH(여기에서, R은 상기 정의한 바와 같음)의 적합한 알코올 과량과 반응시키는 것이 포함된다. 적합하기로는, 구조식 ROH의 알코올은 반응 온도에서 액체이므로 알코올에 기타 적당한 용매를 첨가할 필요없이, 반응 매질로서도 사용할 수 있는 것이다. 반응은 감압 하에서 행하는 것이 적합하다. 반응 압력이 약 20mmHg인 경우에, 반응 온도는 일반적으로 50° 내지 80℃이다. 필요에 따라서, 37% 염산과 적당한 알코올과의 혼합물의 일부분을 때때로 첨가하여 증발되는 반응 매질의 분향을 채워준다.

또한, 물과 최소 공비 혼합물을 형성할 수 있는 적당한 불활성 용매의 분량을 첨가하고, 이어서 형성되는 공비물을 진공 하에서 증류시켜 제거한다. 물과 최소 공비 혼합물을 형성할 수 있는 용매의 대표적인 예로서는, 벤젠, 톨루엔, 부틸 에테르, 사염화탄소, 클로로포름, 시클로헥산, 2,5-디메틸푸란, 헥산, 노난, m-크실렌등이 있다. 알코올성 염산을 첨가한 후, 이어서 최소 공비물을 형성할 수 있는 용매를 첨가시키고, 형성되는 수용성 공비물을 증류시키는 다른 조작을 반응이 완결될 때(즉, 목적 에스테르 유도체가 허용치 또는 최적 수율로 얻어질 때)까지 수회 반복해서 실시한다.

데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르, 염산염의 이화학적 특성

a) Perkin-Elmer 850 기구를 사용하여 뉴졸 중에서 기록한 IR : νCO 에스테르=1730cm^-1

b) 상기 HPLC 시스템 중에서의 상태 체류시간

=1.69 (데글루코테이코플라닌의 t_R·11.4분)

c) 메틸셀로솔브

물(4 : 1)중에 용해시킨 샘플의 pKa=6.67.

d) UV 흡수 최대치(nm) : 280(메탄올 중에서), 279(0.1N 염산 중에서), 279(pH 7.4의 인산염 완충액 중에서), 298(0.1N 수산화나트륨 중에서).

e) 원소 분석 결과 (140℃에서, 질소 분위기 하에서 미리 건조시킨 샘플에 대해서 측정) :

a) 실측치(%)=C 58.57, H 4.14, N 7.28, Cl(총량)^b)7.90, Cl(이온성)^b) 2.66.

무기잔류물^c)0.2, 중량 손실율^d)10.1.

C₆₅H₅₁Cl₂N₇O₁₈에 대한 이론치(%) : C 58.90, H 3.95, N 7.40, Cl(총량)^b) 0.82, Cl(이온성)b) 2.67.

b) 중량 손실 및 무기 잔류물에 대한 보정을 행함.

c) 900℃, 산소 분위기 중에서 샘플을 가열시킨 후 측정했음.

d) 140℃에서 열중량 분석에 의해 측정했음.

항생물질 L 17046의 이화학적 특성

항생물질 L 17046은 다음과 같은 특성을 갖는다.

a) 비손광도

=-44°(c=1%, DMF)

b) pH〉8.0의 물 및 디메틸포름아미드, 디메틸술폭사이드, 프로필렌글리콜 및 메틸셀로솔브 중에서 잘 용해되고, 메탄올 중에서는 약간 용해되고, n-헥산, 에틸에테르 및 아세톤 중에서는 거의 불용성임.

c) 다음과 같은 흡수 최대치를 나타내는 자외선 흡수 스펜트럼.

-0.1N 염산중에서

-0.1N 수산화나트륨중에서

-pH 7.4의 인산염 완충액중에서

d) 뉴졸중에서 다음과 같은 주목할만한 흡수 최대치(cm^-1)를 갖는 적외선 흡수 스펙트럼

3700-2000,2970-2850(뉴졸), 1655,1610,1595,1515,1490,1460(뉴졸), 1375(뉴졸), 1300,1230,1145,1060,1010,890,850,820,720(뉴졸)

e) 샘플을 불활성 분위기하에서 약 140°에서 미리 건조시킨 후(중량 손실=8.0%), 원소분석 결과, 다음과 같은 대략적인 백분율 조성(평균치)를 나타냈다. 탄소 56.47%, 수소 4.27%, 질소 7.99%, 염소 5.11%, 회분 0.6%.

f) TLC 시스템에서, 다음과 같은 R_f치를 나타냈다.

용출계(v/v) R_f치

I) 아세토니트릴/물(72 : 25) 0.53

(실리카겔 Merck 60F₂₅₄)

II) 아세토니트릴/5% 황산나트륨 수용액(30 : 70) 0.54

(실리카겔 실란화 Merck 60F₂₅₄)

가시화 : 254nm에서 자외선 광, 3% 에탄올성 닌히드린, 1% 메탄올성 플루오레스카민

g) 체류시간(t_R)=10.8분[150×4.0mm Zorbax

ODS(5-6μm) 컬럼 (Zor bax는 옥타데실실란 실리카 매트릭스에 사용되는 듀퐁 회사의 상표임)을 사용하고, 하기 용액 A중에서 0-50%의 하기 용액 B를 사용해서 선형 구배로 40분 이내에 분당 2ml의 유속으로 용출을 행하는 역상 HPLC로 분석했음].

용액 A : 0.1 N NaOH로 pH 6.0에서 완충시킨 25밀리몰 NaH₂PO₄/아세토니트릴(9/1)

용액 B : 0.1 N NaOH로 pH 6.0에서 완충시킨 25밀리몰 NaH₂PO₄/아세토니트릴(3/7)

(내부 표준치 : 3,5-디히드록시톨루엔 t_R=5.60분)

h) D₂O 교환 및 선택적인 커플링 재거 실험 후 얻는¹H NMR 데이터중 일부는 다음과 같다 :

¹H NMR 스펙트럼은 60℃의 DMSO-d₆중에서, 샘플농도 20mg/ml를 사용하여 270MHz에서 기록하였음

(내부표준치 TMS, δ=0.00ppm), (δppm, 다중도)

1.86,s ; 2.81,d; 3.5,dd ; ~3-4 : 4.12,d ; 4.32,d ; 4.37,d ; 4.56,s ; 4.95, ddd ; 5.07s ; 5.31, d ; 5.39, s ; 5.51, s ; 5.66, d ; 6.12. d ; 6.29,s ; 6.32, s ; 6.37,s ; 6.42,s ; 6.60,d ; 6.62,s ; 6.64,d ; 6.92,d ; 7.09,s ; 7.12,d ; 7.21,d ; 7.25,d ; 7.43,d ; 7.64,d ; 7.66,d ; 7.70,d ; 7.85,s ; 8.12,d ; 8.46,d ; ~9.5s.

i) 전위차 적정 프로필은 동일 용매 혼합물중에서 과량의 0.01N HCl을 함유하는 피시험 화합물의 용액을 0.01N NaOH로 적정시킨 후, 메틸셀로솔브 : 물(4 : 1)의 5.0(1당량) 7.0(1당량) 11(5당량)에 해당하는 pH 1/2치를 갖는 3개의 적정 구배를 나타냈음.

l) 염을 형성할 수 있는 산성 기능.

m) 염을 형성할 수 있는 염기성 기능.

n) 당 잔류물이 N-아세틸-β-D-글루코사민임.

항생물질 L 17054의 이화학적 특성

항생물질 L 17054는 다음과 같은 특성을 갖는다.

a) 비선광도

=-34°(c=1%, DMF)

b) pH〉8.0의 물, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭사이드, 프로필렌글리콜 및 메틸셀로솔브 중에서 잘 용해되고, 메탄올중에서는 약간 용해되고, 에틸에테르 및 아세톤 중에서는 거의 불용성임.

c) 다음과 같은 흡수 최대치를 나타내는 자외선 흡수 스펙트럼.

-0.1N 염산중에서

-0.1N 수산화나트륨중에서

-pH 7.4의 인산염 완충액 중에서

d) 뉴졸 중에서 다음과 같은 주목할 만한 흡수 최대치(cm^-1)를 갖는 적외선 흡수 스펙트럼

3700-2000,2970-2850(뉴졸), 1655,1610,1595,1515,1490,1460(뉴졸), 1375(뉴졸), 1300,1230,1145,1060,1020,970,890,850,820,720(뉴졸)

e) 샘플을 불활성 분위기하에 약 140℃에서 미리 건조시킨 후(중량손실 =7.8%), 원소분석 결과, 다음과 같은 대략적인 백분율 조성(평균치)을 나타냈다.

탄소 55.46%, 수소 4.50%, 질소 7.20%, 염소 4.67%, 회분 0.2%.

f) TLC 시스템에서, 다음과 같은 R_f치를 나타냈다.

용출계(v/v) R_f치

1) 아세토니트릴/물(75 : 25) 0.32

(실리카겔 Merck 60F₂₅₄)

2) 아세토니트릴/5% 황산나트륨 수용액(30 : 70) 0.61

(실리카겔 실란화 Merck 60F₂₅₄)

가시화 : 254nm에서 자외선광, 3%에탄올성 닌히드린, 1% 메탄올성 플루오레스카민.

g) 체류시간(t_R)=8.3분[150×4.0mm Zorbax

ODS(5-6μm) 컬럼(Zorba x 는 옥타데실실란 실리카겔 매트릭스에 사용되는 듀퐁 회사의 상표임)을 사용하고, 하기 용액 A중에서 0-50%의 하기 용액 B를 사용해서 선형 구비로 40분 이내에 분당 2ml의 유속으로 용출을 행하는 HPLC로 분석했음].

용액 A : 0.1N NaOH로 pH 6.0에서 완충화시킨 25밀리몰 NaH₂PO₄/아세토니트릴(9 : 1)

용액 B : 0.1N NaOH로 pH 6.0에서 완충화시킨 25밀리몰 NaH₂PO₄/아세토니트릴(3 : 7)

(내부표준치 : 3,5-디히드록시톨루엔 t_R5.60분).

h) D₂O 교환 및 선택적인 커플링 제거 실험 후 얻은¹H NMR 데이터중 일부는 다음과 같다(¹H NMR 스펙트럼은 60℃의 DOSO-d₆중에서, 샘플농도 20mg/ml를 사용하여 270MHz에서 기록하였음. 내부표준치 TMSδ=0.00ppm).(δppm 다중도)

1.88,s ; 2.85,d ; 3.5,dd ; ~3-4,4.20, d ; 4.48,d ; 4.50,d ; 4.62,s ; 4.96,ddd ; 5.18,d ; 5.31,s ; 5.35,d ; 5.39,s ; 5.68,d ; 5.71,s ; 6.20,d ; 6.41,s ; 6.51,s ; 6.56,s ; 6.74,d ; 6.77,s ; 6.81,s ; 6.80,d ; 6.98,d ; 7.08,s ; 7.15,d ; 7.21,d ; 7.28,d ; 7.35,d ; 7.50,d ; 7.56,d ; 7.64,d ; 7.73,d ; 7.86,s ; 8.42d.

i) 전위차 적정 프로필은 동일 용매 혼합물중에서 과량의 0.01N HCl를 합유하는 피시험 화합물의 용액을 0.01N NaOH로 적정시킨 후, 메틸셀로솔브/물(4 : 1)중에서 5.0(1당량), 7.0(1당량) 11(5당량)에 해당하는 Ph 1/2를 갖는 3개의 적정 구배를 나타냈음.

l) 염을 형성할 수 있는 산성 기능.

m) 염을 형성할 수 있는 염기성 기능.

n) 2개의 당 잔류물이 α-D-만노오스 및 N-아세틸-β-D-글루코사민임.

이하, 본 발명을 다음의 비제한적 실시예에 의해서 더욱 구체적으로 기술한다.

데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르, 염산염의 수소첨가분해 반응에 의한 항생물질 L 17392(데글루코테이코플라닌)의 제조

CH₃OH/0.1N HCl(7 : 3)(v/v) 용액 500ml중에 용해시킨 본질적으로 순수한 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르 염산염 4.9g의 용액을 실온 및 상압에서, 5% Pd/BaSO₄3.5g 존재하에 수소첨가 반응시켰다. 30분 이내에 약 145ml의 H₂가 흡수되었다. 이어서, 현탁액을 여과시키고, 촉매를 CH₃OH/H₂O(1 : 1)(v/v) 용액 200ml를 사용해서 완전히 세척한 후, 이를 폐기시켰다. 여액을 합치고, 여기에 n-부탄올 600 ml를 첨가하고, 생성되는 용액을 농축시켜서 소량으로 감량시켰다. 이어서, 아세톤을 첨가해서 고형물을 분리시키고, 이를 모아서 아세톤, 이어서 에테르로 세척한 후, 실온에서 철야 진공하여 건조시켜서 본질적으로 순수한 항생물질 L 17392, 염산염 4.0g을 얻었다.

[실시예 2]

조 항생물질 L 17392의 정제

조 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예와 같은 방법으로 행하여 출발물질로서 조 항생물질 L 17392를 실질적으로 동일한 순도로 얻었다.

조 항생물질 L 17392가 얻어질 경우, 다음과 같은 방법에 의해 정제할 수 있다. 조 항생물질 L 17392(역가 60%) 5.3g을 0.2% 포름산암모늄 수용액/메틴올/n-부탄올(1 : 2 : 3)(v/v/v)의 혼합물 1ι중에 용해시키고, 여기에 실란화 실리카겔(0.06 -0.2mm, Merck60) 20g을 첨가했다. 적당히 교반시킨 후, 용매를 진공하에 제거시키고, 잔류물을 물중의 실란화 실리카겔(0.06-0.2mm, Merck) 750g을 크로마토그라피 컬럼의 정부에 충전시켰다. 이 컬럼을 0.6% 포름산 암모늄 수용액 및 CH₃CN(9 : 1)(v/v) 혼합물 1ι로 전개시켰다. 용출물을 폐기시키고, 이어서 200ml/hr.의 유속으로 약 30시간 동안, 아세토니트릴 대 물 1 : 9 내지 4 : 6을 선형구배로 계속해서 용출시켰다.

각 분류물을 25ml씩 모으고, HPLC로 모티너했다. 이어서, 데글루코테이코플라닌을 함유하는 분류물(200 내지 250)을 합하고, 여기에 n-부탄올을 첨가했다. 교반 후 혼합물을 감압하에서 농축시켜서 소량으로 감량시키고, 여기에 에틸 에테르를 첨가하고, 분리된 고형물을 여과시켜 모으고, 에틸에테르로 세척한 후, 40℃ 감압하에서 건조시켜서 본질적으로 순수한 항생물질 L 17392 0.9g을 얻었다.

[실시예 3]

순수한 결정형 항생물질 L 17392의 제조

물/아세토니트릴(90 : 10)(v/v) 100ml중에 현탁시킨 본질적으로 순수한 항생물질 L 17392 0.9g의 현탁액의 pH는 실온에서 1N 염산을 첨가해서 1.7로 조절하였다. 생성되는 용액을 20ml/hr의 유속에서, 1% 포름산암모늄 수용액으로 평형화시킨 실란화 실리카겔 컬럼 200g(0.06-0.2mm, Merck60)에 충전시켰다. 이어서, 물 300ml로 컬럼을 통과시키고, 용출물을 폐기시켰다. 이어서, 컬럼을 70ml/hr. 유속에서, 30시간동안 물중의 아세토니트릴의 10 내지 40% 선형구배로 전개시켰다. 각각 7ml의 분류믈을 모아서, HPLC에 의해 모니터했다. 항생물질 L 17392가 풍부한 분류물(221-239)을 합하고, 이를 실온에서 24시간 동안 방치시켰다. 이어서, 침전된 고형물을 여과시켜서 모으고, 아세토니트릴 소량(10ml)으로 세척하고, 이어서 에틸에테르 100ml로 세척한 후, 물/아세토니트릴(80 : 20)(v/v) 혼합물로부터 재결정시켰다. 이와 같이 하여 얻은 결정형 고형물을 여과시켜서 모으고, 에틸에테르로 세척한 후, 최종적으로 3일동안 진공(2mmHg)하에 건조시켜서 순수한 결정형 항생물질 L 17392 0.55g(무색 침상)을 얻었다.

[실시예 4]

항생물질 L 17392 염산염의 제조

상기 실시예에서 얻은 순수한 결정한 항생물질 L 17392 130mg을 아세토니트릴/물(2 : 3)(v/v)의 혼합물 121ml중에 현탁시키고, 여기에 1N 염산 0.2ml를 첨가했다. 이어서, 여기에 n-부탄올 15ml를 첨가한 후, 생성 용액을 40℃, 감압(약 20 mmHg)하에서 농축시켜서 2ml로 감량시켰다. 여기에, 에틸에테르 10ml를 첨가하여 형성된 침전물을 여과시켜서 모으로, 에틸에테르로 세척한 후, 약 50℃, 감압하에서 철야 건조시켜서 항생물질 L 17392 염산염 107mg을 얻었다.

출발물질의 제조

항생물질 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르, 염산염의 제조

a) 항생물질 L 17046을 벤질 알코올중의 1M 염화수소 용액으로 처리하여 벤질알코올 중의 1M 염화수소용액 600ml중에 현탁시킨 본질적으로 순수한 항생물질 L 17046 18g(10밀리몰)의 현탁액을 60℃에서 교반시켰다. 15분후,형성된 맑은 용액을 동일한 온도에서 3시간 동안 더 교반하고, 이어서 이 용액을 15℃로 냉각 시킨 후, 실온에서 12시간 동안 더 계속해서 교반시켰다. 여기에 n-헥산/에테르(4 : 3)(v/v) 혼합물 4ι를 첨가해서 교형물을 분리시키고, 이를 모아서 에테르 1ι로 세척시키고, 메탄올 150ml중에 재용해시켰다. 이 용액을 H₂O 1ι로 희석하고, 에틸 아세테이트 2ι로 2회 추출하였다(pH2.5)

유기층을 합하고, n-부탄올 200ml중의 1N HCl 10ml의 혼합물을 첨가한 후, 이어서 용액을 농축시켜서 소량으로 감량시켰다. 이어서, n-헥산/에테르(3 : 2)(v/v) 혼합물 1ι를 첨가해서, 고형물을 분리시키고, 이를 모아서 에테르로 세척하고, 40℃에서 8시간 동안 진공하에 건조시켜서 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르, 염산염 8.5g(분석결과 : 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르, 염산염 70%, 물 및 용매 15%, 미확인 불순물 15%)을 얻었다.

b) 항생물질 L 17054를 90% 벤질알코올 수용액중의 1M 염화수소 용액으로 처리시켜서 제조.

벤질 알코올 90ml중에 현탁시킨 본질적으로 순수한 항생물질 L 17054의 교반 현탁액에 40℃에서 37% 염산 10ml를 첨가했다. 이 반응 혼합물을 70℃호 가열하고, 30분동안 계속해서 교만한 후, 70℃(욕조 온도)에서 진공(약 20mmHg)하에서 물을 완전히 제거시켰다. 여기에 벤젠을 첨가하고, 이어서 혼합물을 감압하에서 증발시켜서 공비 증류에 의해 수용성 잔류물을 제거했다. 이어서, 혼합물을 벤질 알코올 수용액중의 1M 염화수소 용액 100ml(상기와 같은 방법으로 제조했음)로 희석시켰다. 이와 같이 하여 얻은 맑은 용액을 65℃에서 6시간동안 교반시킨 후, 이어서 15℃로 냉각시키고, 상기 단계 a)에서와 같은 방법으로 처리해서, 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르 염산염 4.85g(분석결과 : 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르, 염산염 75%, 물 및 용매 15%, 미확인 불순물 10%)을 얻었다.

c) 테이코플라닌을 진공하에서 80% 벤질알코올 수용액중의 2M 염산 용액으로 처리하고, 벤젠 및 37% 염산을 반복 첨가시켜서 제조.

벤질 알코올 80ml중에 현탁시킨 테이코플라닌 10g(테이코플라닌 성분중의 함량 : 85%)의 교반 현탁액에 40℃에서 37% 염산 20ml를 첨가했다. 이 혼합물을 진공(약 20mmHg)하에서 약 60분동안 유지시키고, 한편 약 65℃(욕조온도)로 가열시키고, 이어서 여기에 벤젠 50ml를 첨가하고, 이 혼합물을 약 65℃에서 진공하에 증발시켰다. 30분 후, 반응 혼합물에 벤질알코올 25ml중의 37% 염산5ml의 혼합물을 첨가하고, 이어서 30분동안 진공하의 방법(약 20mmHg, 약 65℃)으로 다시 처리하였다. 이어서, 여기에 벤젠50ml를 첨가하고, 상기한 바와 같이 증발시켰다. 벤질 알코올 15ml중의 37% 염산 5ml와 진공하의 방법에 의해 분리시킨 벤젠 50ml의 혼합물을 8시간동안 매 30분마다 반복 첨가했다. 이어서, 이 혼합물에 37% 염산 20ml 및 벤젠 100ml를 첨가하고, 한편 물 및 벤젠을 진공하에서 증발시키고, 생성되는 맑은 용액을 실온 및 상압에서 아르곤 분위기하에 12시간동안 교반시키고, 이어서 반응 혼합물을 에테르 1.5ι에 부었다. 분리된 고형물을 모으고, 이를 에테르로 세척하고, 실온에서 철야진공하에 건조시켜서 표제 화합물의 조 에스테르 10g을 얻었다. 이 생성물을 메탄올 150ml중에 용해시키고, 여기에 물 300ml 및 에틸아세테이트 300ml를 격렬히 교반시키면서 첨가했다. 수분후, 물 300ml, 에틸아세테이트 300ml 및 n-부탄올/물(1 : 2)(v/v) 300ml의 혼합물을 더 첨가했다. 수용액층의 pH를 3.5로 조절하고, 유기상을 분리시켰다. 수용액층을 매회 에틸아세테이트 600ml를 사용해서 2회 추출시켰다 유기층을 합하고, 물 400ml로 세척한 후, 진공하에 농축시켜서 소량으로 감량시켰다. 에테르를 첨가해서 고형물을 분리시키고, 이를 모아서 에테르로 세척하고, 실온에서 철야 진공하에 건조시켜서 조 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르, 염산염 6.1g(분석결과 : 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르, 염산염 65%, 물 및 용매 15%, 미확인 불순물 20%)을 얻었다.

실리카겔 컬럼 크로마토그라피에 의한 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르의 정제

90% 메탄올 수용액 100ml에 중에 용해시킨 조 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르(역가 65%) 2.5g의 용액에 실리카겔(0.06-0.2mm, Merck60) 10g을 첨가했다. 이어서, 진공하에 용매를 완전히 증발시키고, 잔류물을 아세토니트릴 중에 슬러리시킨 실리카겔 250g을 함유하는 크로마토그라피 컬럼에 충전시켰다. 이어서, 이 컬럼을 다음의 용매 혼합물을 사용해서 전개시켰다.

CH₃CN 250ml

CH₃CN/H₂O(97 : 3)(v/v) 500ml

CH₃CN/H₂O(94 : 6)(v/v) 500ml

용출물을 폐기시키고, 이어서 컬럼을 CH₃CN/H₂O(94 : 6)(v/v) 및 CH₃CN/ H₂O (70 : 30)(v/v)의 용매 혼합물을 각각 1.5ι씩 혼합시켜서 얻은 물중의 아세토니트릴 수용액으로 200ml/hr.의 유속에서 선형구배로 용출시켰다. 분류물을 25ml 씩 모으고, HPLC 에 의해 분석했다. 이어서, 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르를 함유하는 분류물을 합하고(700ml), 여기에 n-부탄올성 0.05M 염화수소 용액 250ml를 첨가하고, 용매를 증발시켜서 최종 용적을 약 30ml로 만들었다. 여기에, 에테르 300ml를 첨가해서 고형물을 분리시키고, 이를 모아서 에테르로 세척하고, 40℃에서 48시간동안 진공하에 건조시켜서 본질적으로 순수한 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르, 염산염 1.6g을 얻었다.

반드시 상기 실시예의 방법으로 행하되, 적당한 시약을 사용하여 다음의 출발 물질을 얻을 수 있었다.

데글루코테이코플라닌 4-클로로벤질 에스테르,

데글루코테이코플라닌 2,4-클로로벤질 에스테르,

데글루코테이코플라닌 4-니트로벤질 에스테르,

데글루코테이코플라닌 3,4-니트로벤질 에스테르 및 그의 산부가염류.

Claims

하기 구조식(II)의 데글루코테이코플라닌 에스테르 또는 그의 산 부가염류

[상기 식중, A,B 및 Z는 수소 원자이고, R은 벤질 또는 치환벤질[여기에서, 페닐기는 클로로, 브로모, 플루오로, 니트로, (C₁-C₃)알킬, (C₁-C₃)알콕시등으로부터 선택된 적어도 1개 이상의 치환제(단, 트리-니트로 페닐기는 제외됨)로 치환됨]임]를 10℃ 내지 40℃ 및 상압 내지 5기압에서, 무기산 존재 또는 부재하의 불활성 유기용매중에서, 유독성 수소첨가 반응촉매 존재하에 접촉 수소첨가 분해반응시킴을 특징으로 하는 다음과 같은 특성을 갖는 항생물질 L 17392의 제조방법.

a) pH 9이상의 물과 메탄올 수용액, 에탄올 수용액 및 아세톤 수용액중에서 가용성이고, 에틸 알코올과 디메틸포름아미드중에서 약간 가용성임,

b) 다음과 같은 자외선 흡수 최대치를 나타냄 :

-0.1N 염산중에서

-0.1N 수산화나트륨중에서

c) 뉴졸중에서 다음과 같은 주목할 만한 흡수 최대치(cm^-1)를 갖는 적외선 흡수 스펙트럼 :

3250(νNH 및 페놀성 νOH)

1645(아미드 I)

1610(νCOO^-)

1595(δNH₃)

1520(아미드 II)

d) 50℃의 DMSO-d₆(내부 표준치 TMS, δ=0.00ppm)중에서 Bruker WH-2 70 스펙트로미터를 사용하여, 270MHz에서 기록한¹H NMR 스펙트럼의 D₂O 교환 및 선택적인 커플링 제거 실험 후 얻은¹H NMR 데이터중 일부는 다음과 같음(δppm, 다중도) :

2.85-3.30, 2dd ; 4.12,dd ; 4.37,d ; 4.45,d ; 4.50,s ; 5.00,ddd ; 5.11d ; 5.14,d ; 5.35,d ; 5.56,d ; 5.60,d ; 6.3-7.9,m ; 6.55,d ; 7.37,d ; 7.50,d ; 7.61,d ; 8.26,d ; 8.28,d ; 8.5-10.2,br ;

(d=이중선, dd=2개의 이중선, ddd=3개의 이중선, s=단일선, m=다중선, br=넓음),

e) 원소분석 결과, 다음과 같은 대략적인 백분율 조성(평균치)을 나타냄, 탄소 58.05%, 수소 3.58%, 질소 8.23%, 염소 5.85%, (열중량 분석에 의해 측정한 중량 손실 11%에 대한 보정후),

f) 고속원자충적(FAB)-질량분석시험(MS)으로 확인한 결과 분자량은 1199임,

g) 구조식(유용한 데이터를 근거로 해서 계산함) : C₅₈H₄₅Cl₂N₇O₁₈,

h) 체류시간(t_R)=12.2분[Perisorb RP-8(30μm, Merck)로 충전시킨 예비 컬럼(5cm)를 사용하고, 이어서 LiChrosorb RP-8(10μm)로 미리 충전시킨 컬럼 Hiber RT 250-4(Merck)를 사용하고, 0.2% 포름산 암모늄 수용액중 10-30% 아세토니트릴을 사용해서 선형구배로 용출시키고, 유속 2ml/분으로 HPLC 에 의해 분석했음](내부표준치, 영국 특허출원 공고 제2,121,401호에 기재된 테이코플라닌 A₂성분 2는 이 시스템에서 t_R22.4분이었음),

i) 염을 형성할 수 있는 산성 기능,

l) 염을 형성할 수 있는 염기성 기능,

m) 당잔류물이 없음,

n) 다음과 같은 추정 화학 구조식.
제1항에 있어서, 촉매가 원자가 0인 상태이거나 또는 적당한 지지체 상에서의 양(+)의 산화수를 갖는 팔라듐, 니켈, 구리 및 코발트로부터 선택된 유독성 촉매인 방법.
제1항에 있어서, 유독성 촉매가 탄소, 탄산바륨 또는 황산칼슘 기재 팔라듐인 방법.
제1항에 있어서, 유독성 촉매가 황산바륨 기재 5-10% 팔라듐인 방법.
제1항에 있어서, 유독성 촉매가 황산바륨 기재 5% 팔라듐인 방법.
제1항에 있어서, 불활성 유기용매가 메탄올, 에탄올, 디옥산, 에틸렌글리콜 및 에틸렌글리콜 모노메틸 에테르로부터 선택된 방법.
제1항에 있어서, 무기산이 염산인 방법.
제1항에 있어서, 온도가 실온인 방법.
제1항에 있어서, 압력이 상압인 방법.
제1항에 있어서, 구조식(II)의 출발 물질이 데글루코테이코플라닌 벤질 에스테르 또는 그의 산부가염인 방법.
제1항에 있어서, 결정형 항생물질 L 17392를 제조하기 위한 방법.