KR910004952B1

KR910004952B1 - 수분 활성도 억제 방법에 의한 세팔렉신 제조 방법

Info

Publication number: KR910004952B1
Application number: KR1019890015105A
Authority: KR
Inventors: 김정희; 현창기
Original assignee: 한국과학기술원; 이상수
Priority date: 1986-12-26
Filing date: 1989-10-20
Publication date: 1991-07-18
Also published as: KR910008143A

Abstract

내용 없음.

Description

수분 활성도 억제 방법에 의한 세팔렉신 제조 방법

첨부 도면은 수분 활성도 억제제로서 글리세롤(glycerol), 자당(sucrose) 및 소르비톨(sorbitol)을 첨가하였을 경우와 첨가하지 않은 경우의 반응 시간에 따른 세팔렉신의 합성 수율을 나타낸 도면이다.

본 발명은 반합성 항생제인 세팔렉신의 효소적 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세히 설명하자면, 본 발명은 크산토모나스 시트리(Xanthonomonas citri; IFO 3835) 균주를 배양하여 얻은 균체로부터 부분 정제한 반합성 효소를 사용하여 2개의 기질인 7-아미노-3-데아세톡시세파로스포란산 (7-ADCA)과 페닐글라이신 메틸에스테르(PGM)로부터 세팔렉신을 합성해 내는 효소적 합성 반응에 있어서, 반응계의 수분 활성도를 감소시킴으로써 세팔렉신의 합성 수율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

세팔렉신의 효소적 합성법은 예컨대 대한민국 특허공고 제 81048호에 기재되어 있는데, 그 반응식과 반응 모델을 보면 다음과 같다.

[반응식]

위의 반응 모델에서 볼 수 있는 바와같이, 본 효소 반응에서는 세팔렉신 합성 반응 외에도 기질인 PGM이 가수 분해되는 반응과 합성된 세팔렉신이 분해되는 반응도 함께 일어나게 된다. 그런데, PGM이 가수분해되어 피닐글라이신(α-D-phenylglycine, PG)이 생성되는 반응에서는 물분자가 개입함으로써 반응이 진행되는데, 이러한 반응으로 인하여 세팔렉신 합성시 PGM의 소모량이 의외로 많아지므로 효소 반응시 가해 주어야 하는 PGM은 7-ADCA에 대해 3:1의 중량비로 과량을 사용하여야 하는 문제점이 있다. 또한, 효소의 세팔렉신 합성 역가도 비교적 낮기 때문에 기질 7-ADCA와 PGM이 모두 고가임을 감안할 때 세팔렉신 합성 수율의 증대는 반드시 해결되어야 할 문제로 지적된다.

본 발명은 이와같은 기존 효소 반응계의 문제점을 해결하기 위하여 반응계의 수분 활성도를 낮추어 줌으로써 PGM 가수 분해 반응을 저지시키고, 따라서 세팔렉신의 합성 수율을 증가시키는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 이러한 목적은 전술한 크산토모나스 시트리균주의 세팔렉신 반합성 효소를 이용하여 7-아미노-3-데아세톡시 세팔로스포란산페닐글리이신 메틸에스테르로부터 세팔렉신을 합성하는 반응계에 수분 활성도 억제제를 첨가하는 것이 특징인 본 발명의 방법에 의하여 달성된다.

크산토모나스 시트리 균주를 배양하여 얻은 배양액으로부터 소니케이션(sonication), 황산스트렙토마이신(streptomycin sulfate)처리, 황산암모늄(ammonium sulfate)분획, DEAE-세파로스 크로마토그라피(DEAE-sepharose chromatography)의 순서로 처리하여 부분정제된 효소를 얻는다. 효소반응의 기질 용액은 기질인 7-ADCA와 PGM을 녹인 인산 완충 용액에 20-30%의 수분 활성도 억제제를 함께 녹여 마련한다.

수분 활성도 억제제로서는 글리세롤(glycerol), 자당(sucrose) 또는 소르비톨(sorbitol)을 사용한다.

효소 반응은 반응기 내에서 pH 6.5, 반응 온도 37℃에서 효소액을 가하여 진행시키고 합성된 세팔렉신의 양은 일정 시간 간격을 두어 채취한 시료를 고속 액체 크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 정량한다. 이러한 방법으로 얻어지는 세팔렉신의 합성 수율은 수분 활성도 억제제를 첨가하지 않은 종래의 효소 반응과 비교할 때 2.3 내지 2.7배 증가하게 된다.

따라서, 본 발명을 적용하면, 종전의 25% 정도의 반응 수율이 60 내지 70%로 증가하게 되어 경제적인 측면에서 기질에 대해 상당한 비용 절감이 가능하고, 또한 효소 사용량을 줄일 수 있으므로, 효소 정제 등의 비용도 크게 감소하게 된다.

본 발명을 실시예에 따라 상술하면 다음과 같다.

[실시예 1]

부분 정제 효소의 제조 방법

표 1의 조성으로 된 배지가 들어 있는 30발효조에서 크산토모나스 시트리(Xanthomonas cirt; IFO 3835) 균주를 28℃, pH 7.2, 300rpm 및 0.45vvm의 조건으로 14시간 배양하여 얻은 균체를 100g씩 나누어 급속 냉동시켜 보관하면서 필요할 때마다 정제하여 사용하였다.

[표 1]

배지조성

효모 추출액(yeast extract) 0.2%

글루탐산소다(monosodium glutamate) 0.2%

펩톤 0.5%

염화마그네슘 0.1%

자당 2.0%

인산제어칼슘 0.2%

염화철 0.01%

균체 100g을 0.1 M 인산 완충 용액(pH 6.0) 150ml에 녹이고, 여기에 라이소자임(lysozyme)을 200㎍/ml의 농도로 첨가하여 교반한 후 얼음 용기 내에서 소니케이션 하여 세포를 80% 이상 파쇄시켰다. 4℃에서 20분간 12,000rpm으로 1차 원심 분리하여 얻은 상징액을 35,000rpm, 4℃, 90분 조건하에서 초원심 분리하여 다시 상징액을 취하고, 여기에 황산스트렙토마이신을 최종 농도 2% (W/W)가 되도록 가한 후 다시 12,000rpm, 4℃, 20분간의 원심 분리에 의해 상징액을 얻는다. 이 상징액으로 20-70%의 황산암모늄 분획을 거쳐 침전 단백질을 얻어 내고 80ml의 0.01 M 인산 완충 용액(pH 6.0)에 녹인 후 동일 완충 용액 2에서 투석시켰다. 투석 후의 단백질 용액은 0.01 M 인산 완충 용액으로 평형화시킨 DEAE-세파로스 크로마토그라피관을 통과시켜 효소 활성을 보이는 분획을 모아 한외 여과로 농축시켰다. 상기 방법에 의해 부분 정제된 용액은 28.2 단위 mg/- 단백질 (units/mg - protein)의 비활성(specific activity)을 보였다. 이를 효소액으로 사용하였다.

[실시예 2]

기질 용액의 제조 방법

7-ADCA 0.451g(20mM)을 0.1 M 인산 완충 용액(pH 6.5) 약 70ml에 혼합하고 3N 수산화나트륨 용액 0.5ml 가량을 가하며 용해시켰다. 이 용액에 PGM 1.344g(60mM)을 함께 용해시킨 후 수분 활성도 억제제를 일정량[10-40% (w/w)]가하여 용해시키고 최종 pH를 6.5로 맞춘 다음 0.1 M 인산 완충 용액(pH 6.5)을 가하여 최종 부피를 100ml로 맞추었다. 수분 활성도 억제제로서 글리세롤(15%), 자당(30%)과 소르비톨(20%)을 각각 사용하였다.

상기 방법에 따라 제조된 기질 용액의 수분 활성도는 평형 상대 습도 측정 장치(Thermoconstanter-HUMIDAT-TH2/RTD-33, Novasina, Swiss)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 상기 각 수분 활성도 억제제를 첨가하였을 때의 수분 활성도는 각각 0.955, 0.975 및 0.972이었다.

[실시예 3]

효소 반응 및 세팔렉신 정량

실시예 2에서 제조한 기질 용액 250ml를 교반식 반응기(stirred-tank reactor)에 넣고 250rpm의 속도로 교반하면서 온도 조절을 위해 37℃로 일정하게 유지되는 수조에서 반응시켰다. 기질 용액이 37℃로 평형이 되면 실시예 1에서 제조한 부분 정제 효소액을 0.5 단위/ml(unit/ml)의 농도로 가하여 120분간 반응시켰다. 20분 간격으로 시료를 채취하여 고속 액체 크로마토그라피를 이용, 합성된 세팔렉신을 정량하였다. 고속 액체 크로마토그라피(Waters model 440 LC를 사용)는 0.2 M 인산 완충 용액(pH 7.0)과 메탄올을 7.3(v/v)의 비율로 혼합한 용매를 1.0ml/분의 유속으로 흘려 주면서 15㎕의 시료를 리크로소브(Lichrosorb) RP-18(Merck) 관에 주사하고 254nm의 자외선 흡광도를 측정하였다.

이상과 같은 효소 반응 방법에 의하여 세팔렉신을 합성시키면 수분 활성도 억제제를 첨가하지 않은 실험구와 비교할 때, 합성 수율이 15% 글리세롤을 첨가한 경우는 1.7배, 30% 자당을 첨가한 경우는 2.3배, 20% 소르비톨을 첨가한 경우는 2.7배 증가하였다.

Claims

크산토모나스 시트리 균주의 세팔렉신 반합성 효소를 이용하여 7-아미노-3-데아세톡시 세파로스포란산과 페닐글라이신 메틸에스테르로부터 세팔렉신을 합성하는 효소적 합성반응에 있어서, 글리세롤, 자당 및 소르비톨 중에서 선택된 수분 활성도 억제제를 10-40% (w/w)의 농도로 첨가하는 것이 특징인 세팔렉신 제조 방법.