KR900008957B1 - 액체 크로마토그라피 시스템용 장치 - Google Patents

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KR900008957B1
KR900008957B1 KR1019830001744A KR830001744A KR900008957B1 KR 900008957 B1 KR900008957 B1 KR 900008957B1 KR 1019830001744 A KR1019830001744 A KR 1019830001744A KR 830001744 A KR830001744 A KR 830001744A KR 900008957 B1 KR900008957 B1 KR 900008957B1
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엠. 루이텐 헨리
드 브리 한스
에이치. 반 암스테르담 피터
위겔스 엘버트
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듀파 인터내쇼날 리서취 비. 브이.
이. 제이. 메비우스
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Abstract

내용 없음.

Description

액체 크로마토그라피 시스템용 장치
제1도 및 제2, 3도는 본 발명에 의한 예비컬럼(pre-columns)의 종단면도.
제2도는 액체 크로마토그라피 시스템용 커플링 부재의 평면도.
제5도는 제4도의 선(V-V)에 의한 상기 커플링 부재의 단면도.
제6도는 제4도의 선(Ⅵ-Ⅵ)에 의한 상기 커플링 부재의 단면도.
제7도는 본 발명에 의한 커플링 부재와 예비컬럼을 갖고 있는 액체 크로마토그라피 시스템용 장치의 단면도.
제8도는 제7도의 평면도.
제9도는 본 발명의 예비컬럼을 사용한 이속 슈프린 및 그의 대사산물의 크로마토그라피에서 측정한 분당방사능을 나타낸 그래프.
제10도는 통상적인 직선 예비컬럼을 사용한 제9도의 대조 그래프.
제11도는 제2도에 도시한 예비컬럼을 사용한 [2-〔4-(3-트리플루오로메틸페닐)-1-피페라지닐〕에틸] 우레아 및 그의 대사산물의 크로마토그라피에서 측정한 분당 방사능을 나타낸 그래프.
제12도는 제3도에 도시한 예비컬럼을 사용한 [2-〔4-(3-트리플루오로메틸페닐)-1-피페라지닐〕에틸] 우레아 및 그의 대사산물의 크로마토그라피에서 측정한 분당 방사능을 나타낸 그래프.
제13도는 본 발명의 예비컬럼을 사용하여 DES 0.5ppb를 함유한 뇨의 크로마토그라피에서 측정한 분당방사능을 나타낸 그래프.
제14도는 제3도에 도시한 예비컬럼을 사용한 미량의 N-(2,6-디플루오로벤조일)-N'-(4-트리플루오로-메틸페닐)우레아 및 그의 대사산물을 함유한 뇨의 크로마토그라피에서 측정한 분당 방사능을 나타낸 그래프.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
1 : 원통형 중앙부 3 : 상류단부(upstream end)
4 : 하류단부(downstream end) 6, 77 : 리지부(ridge)
7, 8, 24, 28 : 디스크 9 : 보스(boss)
10, 11, 12, 53, 75, 81, 82 : 가스켓(gasket)
19, 27, 27a, 71 : 니플(nipple) 22 : 커플링부재
23 : 중심축 40 : 로드
45, 46, 47 : 컬럼(column) 50, 51, 52, 90 : 필터
본 발명은 승압하에서 크로마토그라피할 물질을 전농축시키기 위한 내압(pressure-resistant)물질의 예비컬럼(pre-column)에 관한 것이다. 또한 본 발명은 액체 크로마토그라피 시스템용 장치 및 상기 장치의 커플링 부재(coupling member)에 관한 것이다.
액체 크로마토그라피법은 액체에 용해시키거나 분산시킨 물질을 추적하고, 이어서 확인하며 물질의 농도를 측정할 경우 및 제조용 스케일상에서 액체로부터 이들 물질을 분리할 경우에 아주 많이 사용되는 분리기술이다. 전자의 경우 분석용, 후자의 경우 제조용 액체 크로마토그라피이다. 액체 크로마토그라피(LC), 특히 소위 "고성능 액체 크로마토그라피"(HPLC)는 액체-고체 크로마토그라피(LSC), 액체-액체 크로마토그라피(LLC) 및 고정상 크로마토그라피(BPC)와 같은 분별 크로마토그라피, 이온교환 크로마토그라피, 친화성 크로마토그라피 및 겔투와 크로마토그라피(GPC) 및 겔여과 크로마토그라피와 같은 배제 크로마토그라피로 분리할 수 있다.
대부분의 이들 크로마토그라피 기술에 있어서 통상 과립상의 담체로 충진시켜 하나이상의 컬럼을 사용한다. 이들 담체물질은 크로마토그라피할 물질, 상기 물질이 존재하는 액체 및 크로마토그라피 공정에서 사용하는 용매에 따라 선택한다. 따라서 사용할 용매 및 담체의 선택은 해결해야할 분리문제로 결정된다.
분리하거나 검출할 물질이 미량으로 예를 들면 매우 작은 농도로 액체중에 존재할 경우, 통상 전농축(pre-concentration)을 사용한다. 이 경우 사실상의 크로마토그라피 컬럼 또는 분리컬럼전에 연결시킬 수 있는 전농축컬럼 또는 예비컬럼을 통상 사용한다.
액체 크로마토그라피에서 사용되는 이처럼 예비컬럼("농축컬럼")은 미합중국 특허 제4,070,284호에 기술되어 있다. 기술한 실린더형 컬럼은 최대 크기가 직경 0.4인치이며 길이 0.6인치이고 최대 내압이 3MPa이다. 그러나, 이러한 컬럼은 상술한 대부분의 목적으로, 예를 들면 용량 및 분해능이 너무 낮으므로 체액중의 약제 및/또는 그의 대사물을 HPLC를 사용하여 전농축시키기에는 적당하지 못하다. 전농축 공정시 허용할 수 없는 압력 증가를 피하기 위하여 특허에서 추천한 바와 같이 비교적 큰 입자도의 컬럼 충진물을 사용하는 것은 분해능에 대하여 바람직하지 못한 영향을 마친다. HPLC 기술에 있어서 예비컬럼의 사용은 예들들면 시.에스.에 의한 문헌(J. Chrom. 222, (1981), pp. 13-12)에 기술되어 있다. 이 문헌은 체액중에서 약제 또는 그의 대사산물을 추적하는 것에 관한 것이다. 체액중의 이들 미량성분의 농도는 매우 낮으며, 예를 들면 ml당 나노그람정도이므로, 전농축이 필요하다. 로트 시.에스.에 의하여 사용된 예비컬럼은 직선컬럼으로 길이가 25mm이며 목적하는데 적용시 적당한 담체로 무수 상태하에서 충진시킨다. 시험할 체액 샘플을 여기에 공급하면, 검출할 미량 성분이 담체물질에 흡수된다. 미량성분을 예비컬럼 또는 분리컬럼에서 이와같은 목적으로 선택한 용매로 용출시킨다. 크로마토그라피용 컬럼 또는 분리컬럼을 많은 성분중에서 미량성분을 분리하기에 적당한 담체물질로 충진시킨다. 다소간 순수한 조건에서 분리컬럼으로 용출시켜서 성분을 모아 검출할 수 있다.
그러나, 직선의 예비컬럼을 사용할 경우 예를 들어 로트 시.에스.가 상기 문헌에서 기술한 바와 같이, 예비컬럼중에서 흡수된 물질을 하나이상의 분리컬럼을 사용하여 실질적으로 여러가지 성분으로 분리하는 것은 방해됨을 발견하였다. 실제로, 연속적 용출에서, 밀폐 및 고우스트(ghost) 효과가 방해인자로 나타나는 한편, 분해능은 통상적으로 나쁘다. 특히 많은 용량을 크로마토그라피할 때 일어나는 유사한 현상도 또한 샤우벡커 시.에스의 문헌(J. Chrom. 136, (1977), 65)에 기술되어 있다.
그러나, 예비컬럼의 양단부에 밀접연결장치 : 전농축할 액체 유입튜브에 관하여 상류단부 : 및 분리용컬럼에 관하여 하류단부를 가지며, 또한, 내부적으로 전농축할 액체를 몸체의 내부단면상에 분포시키기 위한 유입튜브를 향해 수렴하는 상류단면 : 및 필터(filter)의 주위부분이 예비컬럼내에서, 밀접연결된 2개의 필터 즉 하나의 필터는 용기의 상류 단부상 - 예비컬럼의 수렴단면 하부에, 다른 하나의 필터는 용기의 하류단부에 상응하는 담체물질의 하부에 위치하는 2개의 필터에 의해 한계가 정해진, 전농축목적으로 적합한 담체물질을 함유하도록 취부된 용기를 포함하는, 크로마토그라피시킬 물질을 승압하에 전농축시키며 : 용기가 원통형의 제1중앙부분 및 제1부분과 공통축을 갖는 회전고체상태의 제2부분으로 이루어진 기하학적인 복합형태를 가지며, 이 용기는 최초에 부분과 동일한 기재반경을 가지지만 예비컬럼의 하류단부를 향하여 내부적으로 협소해짐을 특징으로 하는 상기 내압재료의 예비컬럼을 사용할 경우에는 전술한 문제점들이 나타나지 않았다. 이러한 예비컬럼을 사용하는 경우, 체액중에 존재하는 미량의 대사산물 등을 이러한 방법으로 전농축시키고, 이어서 크로마토그라피 컬럼상에서 연이어 분리할 때, 방해 고우스트 효과 및 낮은 분해는 일어나지 않도록함이 가능하다는 것이 판명되었다.
본 발명에 따른 예비컬럼은 뇨, 요추액, 타액 및 혈장과 같은 여러 체액과 또한 기관 및 배설물의 균일물질을 전농축시킬 수 있다. 이와같은 결과로서, 체액 및 배설물중의 미량의 약제 및 미량의 대사산물을 검출하고 측정할 수 있으며 또한 이들을 분리할 수 있다. 본 발명에 따른 예비컬럼은 약제학적 또는 임상적 용도로 사용될 뿐아니라 그밖의 미량분석을 실시해야 하는 모든 분야에서 사용될 수 있는데 예를 들면 폐수, 음료수, 빗물, 지하수 및 지표수를 정량 및 정성적으로 분석할 때, 농작물, 토양, 지하수 및지표수에서의 살충제의 대사산물을 검출, 측정 및 분리할 때 사용할 수 있다.
이론적 기초에서 세드는 문헌(J. High Res. Chrom. Commun. Feb. 1979, pp. 63-67)에서 크로마토그라피용 컬럼 또는 분리컬럼용으로 원추형 형태는 단계적으로 혼합된 형태가 바람직함을 인식하였다. 그러나, 분리문제와 관계가 있고 전농축 문제와는 관계가 없는 이론적 고찰은 어떠한 실질적인 실시예로도 구체화되지 않았다. 크로마토그라피 컬럼의 규모는 컬럼을 전개시킬 대상에 의해 측정되기 때문에 크로마토그라피용 컬럼의 규모로는 전농축 컬럼용으로 그대로 사용할 수 없다. 이는 또한 길이 1m에 대하여 직경을 3cm 내지 1cm 만큼 원추형으로 변화시킨 세드가 도안한 분리컬럼의 이론적으로 바람직한 모델로부터 알 수 있다. 이러한 규모는 예비-컬럼으로는 적당하지 않다. 사실상 예비-컬럼의 용량으로는 효과적으로 전농축 시키기에 충분히 크지 못하다. 그렇지 않으면 분리하는 동안 용출물중의 미량성분 농도는 너무 낮아서 정확한 검출 및 측정이 어렵다. 또한 예비컬럼의 길이는 길어야 약 10cm가 바람직하나 유입구 및 유출구의 구멍은 컬럼에서 지나치게 높은 압력강화를 피하기 위해서 충분히 넓어야만 한다. 또한 본 발명에 따른 예비컬럼은 승압, 예를 들면 통상 사용시 100KPa에서 10MPa의 압력에서 전농축용으로 이용된다. 세드의 고찰에서는 이러한 압력은 고려하지 않았다. 분리제조공정시, 예비컬럼을 분리컬럼에 연결시킬 경우 예비컬럼에서의 압력은 약 40MPa까지 증가할 수 있다. 컬럼을 도안하는데 있어서 이러한 고압을 고려해야만 한다. 따라서 컬럼의 형태는 용출시 일어나는 상술한 현상을 피하면서 크로마토그라피할 물질을 전농축시킬 수 있고 약 40MPa까지의 압력을 견디기에 적당하여야 한다.
예비컬럼은 컬럼을 필요로 하는 상술한 크로마토그라피 분리 제조공정 예를 들면, 액체-액체 크로마토그라피(LLC), 액체-고체 크로마토그라피(LSC), 이온교환크로마토그라피, 친화성 크로마토그라피 및 겔투과 크로마토그라피(GPC)중의 어느 하나를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 예비컬럼은 용기 형태의 몸체의 내벽이 단부쪽으로 원추형으로 좁아지는 형태가 바람직하다. 상류에는 전농축시킬 액체의 유입구관을 하류에는 분리컬럼을 연결시키는 바람직한 장치는 용기 형태의 몸체의 양쪽 단부에서 서로 반대로 존재한다. 이들 연결은 최소한 40MPa의 압력을 유지할 수 있는 나사연결 또는 클램프 연결일 수 있다. 더 바람직하게는 용기 형태의 몸체 내벽을 하류단부 방향에서 보다 상류단부 방향에서 더 강하게 좁힌다. 이 결과로서 공급액의 경우 신속하게 최대 직경에 이르는 반면에 최대컬럼 직경의 하류 구멍 직경으로의 감소는 보다 점착적이다. 용기형태의 하류구멍의 직경이 예비컬럼과 연결되는 분리컬럼의 직경과 거의 일치하는 것이 더 바람직하며, 크로마토그라피 분리공정에서 예비컬럼을 분리컬럼에 연결할 경우 소위 "층류(laminar flow)"형태는 가능한한 적게 방해를 받는다.
스테인레스강으로 바람직하게 제조된 컬럼은 완전한 형태이지만 또한 내압방법에서 함께 안정한 2개 이상의 부분으로 구성된다. 외부 부속을 플랜지로 하고 이 플랜지를 클램핑환(clamping ring) 또는 클램핑밴드를 사용하거나 또는 이 플랜지를 통해 나사볼트를 사용하여 클램핑하여 적당히 연결할 수 있다. 원한다면 적당한 물질의 가스켓(gasker)을 사용하여 우수한 내압밀폐를 시킬 수 있다. 이 생산기술적 관점에서 몇가지 부분의 예비컬럼은 완전히 형성시 유리하며, 이는 특히 거대 규모의 컬럼에 적용한다. 이미 상기에서 기술한 바와 같이 예비컬럼은 최소한 40MPa의 압력을 견딜 수 있다. 몇 개의 부품의 컬럼을 구성하여 더욱 쉽게 내압성을 나타낸다.
예비컬럼을 사용하기 전에 컬럼을 적당한 담체물질 또는 흡착제로 충진시킨다. HPLC용으로는 예를들면 체액시험이 적당하며 실리카겔을 소수성으로 만든 전처리 실리카겔이 적당하다. 그밖의 적용시 액체 크로마토그라피 기술에서 통상 사용되는 담체물질로서 산화 알미늄 또는 이온 교환 수지 등이 또한 사용될 수 있다. 컬럼을 담체물질로 무수상태로 충진시킬 수 있으며 담체는 슬러리로서 컬럼안에 준비한다. 끝이 뾰족한 컬럼의 상류 부분에서 내부 충진물은 담체물질상에 준비하는 것이 바람직하며, 만일 담체물질로서 소수성 실리카겔이 사용된다면, 유리비드(bead) 또는 실리카겔이 내부 충진물로서 사용될 수 있다. 크로마토그라피할 물질을 내부 충진물을 사용하여 예비-컬럼상에 준비하고 컬럼을 통하여 더욱 균일하게 할 수 있다. 이러한 충진은 또한 드종 시.에스에 의해서 문헌(J. Chrom. 148(1978), pp. 127-141)에 추천되었다. 담체물질을 컬럼안의 초경금속의 두 필터 사이에 넣는다. 통상 예비-컬럼을 조절한 후에 피검액 샘플을 주사기가 연결된 튜브로 또는 만일 양이 많다면, 펌프를 사용하여 컬럼에 적용한다. 액체는 컬럼을 통하여 비흡수된 물질에 용출되는 동안 흡수된 성분은 담체에 남아있다 : 용출액은 유출튜브를 통하여 컬럼에서 용출된다.
예비컬럼은 하류에 분리컬럼 또는 크로마토그라피컬럼을 연결하고 또한 통상의 방법으로 조절한다. 흡수된 물질을 분리컬럼에서 적당한 용매 또는 용매혼합물로 용출시킨 후에 분리컬럼을 동일한 용매 또는 용매 혼합물로 용출시키는 것이 바람직하다. 일정한 성분의 용출액 대신에 계속 변화하는 조성물의 용매혼합물을 통상 사용한다 : 구배용출 : 또한 연속적인 구배용출 대신에 단계적 구배용출로 사용될 수 있다. 크로마토그라피 공정에서 요구되는 압력은 하나이상의 펌프를 사용하여 수득한다. 또한 액체 크로마토그라피는 통상의 조절기구, 자동분별 수집기 및 피검성분을 검출하기 적당한 검출기로 구성되어 있다. 상술한 바와 같은 액체 크로마토그라피 시스템을 사용하면 자주 연결을 전환시켜야 한다. 사실 예비컬럼은 우선 조절되어야 하고 크로마토그라피할 액체로 처리되어야 한다. 컬럼을 조절하는데 필요한 용액 및 미량의 성분을 담체에 흡착시켜 제거할때 나온 용출액 둘다는 컬럼으로부터 용출되어야 한다. 따라서 출구관의 연결은 하류단부에서 가능하다. 실질적인 분리공정(용출)용 예비컬럼은 하류단부에서 분리컬럼으로 연결시켜야 한다. 조절하기 위해서 분리컬럼을 또한 액체용 유입 튜브에 편리하게 상류 연결한다. 여러 목적용으로 예를 들면 많은 액체 샘플을 동시에 크로마토그라피할 경우, 컬럼 용출물의 전농축을 반복할 경우 또는 고순도로 수득하기 위하여 크로마토그라피할 경우에 임의로 몇 개의 예비컬럼을 몇 개의 분리컬럼에 연결시키는 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 또한 하나이상의 예비컬럼을 뜻대로 용출액용 유출 튜브 또는 하나이상의 분리컬럼에 동일한 방법으로 연결이 가능하게 만들어진 연결 시스템에 관한 것이다. 이러한 목적으로 액체 크로마토그라피 시스템용 장치는 (1) 하나 또는 그 이상의 예비컬럼, (2) 컬럼 및 액체의 유입 튜브를 하나 이상의 분리컬럼 및 용출액의 유출 튜브에 커플링하는 부재 및 (3) 원한다면 하나이상의 분리컬럼을 함유하도록 고안되었다. 예비컬럼은 상술한 바와 같은 형태일 수 있다.
액체 크로마토그라피 시스템 장치는 전술한 미합중국 특허 제4,070,284호에 기술되어 있고, 예비컬럼을 분리컬럼에 연결하기 위한 여러방식의 발브가 장치되어 있다. 그러나 이 여러방식의 발브는 약간의 메가파스칼 보다 더 높은 압력에서 저항이 없다.
본 발명의 특이할 점은 상술한 장치의 커플링 부재가 최소한 20MPa에서 압력 저항을 나타낸다는 점이다. 본 발명에 따른 커플링 부재는 실링연결부위에서 각각에 대하여 서로 회전하는 2개의 동심 디스크로 구성되어 있으며, 예비컬럼 또는 컬럼 및 하나의 디스크에 있는 액체의 유입튜브의 실링연결을 위한 구멍과 분리컬럼 또는 컬럼 및 다른 하나의 디스크상에 있는 용출물의 유출튜브의 실링연결을 위한 구멍이며, 이 두 디스크에 있는 구멍은 서로가 임의로 각각의 상대에 대하여 한 디스크를 회전하게 만들어졌다.
스테인레스강으로 바람직하게 만들어진 커플링 부재의 디스크는 예를 들어 테플론 가스켓(teflon gasket)을 사용하여 서로 실링연결시킨다. 종-단면이 원형이며, 디스크의 원주홈에 지지된 가스켓을 사용하여 디스크는 서로 각각에 대하여 회전시킬 수 있다. 커플링 부재는 약 40MPa까지의 압력에 견딜 수 있다. 디스크의 구멍 연결은 또한 스테인레스강으로 만다는 것이 바람직하며 원한다면 테플론으로 실링한다.
예비컬럼들, 분리컬럼 및 유입튜브와 유출튜브를 디스크에 있는 구멍에 연결시키기 위하여 나사연결 또는 클램핑 커플링 형태로 연결한다. 그밖의 적당한 커플링 부재는 중앙에 구멍이 있는 삽입부재로 형성되는데, 이 삽입부재는 하나의 디스크상에 있는 구멍에 여기에 연결할 입구관 또는 출구관의 컬럼 또는 니플에 실링하기 적합하고 삽입부재는 외부에 디스크에 있는 구멍으로 형성된 견부에 부착된 플랜지가 있다. 삽입부재의 중앙구멍은 외부에서 컬럼 또는 니플에 연결되는데 예를 들면 삽입 부재에 밀착시키거나 나사결합으로 삽입부재에 연결하고, 내부에서는 디스크에 있는 좁은 구멍과 연결한다. 삽입부재에 있는 중앙구멍의 직경은 컬럼 또는 니플의 내부직경과 대략 일치하는 것이 바람직하다. 동일한 외부직경 및 외부형태의 삽입부재를 가진 컬럼을 사용하여, 어느 컬럼이든 쉽게 뜻대로 커플링 부재의 디스크중 하나에 있는 구멍에 쉽게 연결할 수 있다. 각각의 디스크가 서로 상대적으로 또는 자동적으로 쉽게 회전시키기 위하여 하나의 디스크를 고정시킬 수 있는데, 예를 들면 다른 디스크를 보조장치로 바람직한 회전을 시키는 동안에 정지한 디스크에 연결된 핸들을 클램핑힌다. 후자 디스크의 상호작용용으로 핸들 또는 핸들의 연결장치는 외부 모서리에 하는 것이 바람직하다. 또한 디스크는 디스크의 구멍을 서로 연동시키기 위하여 고정된 접합핀(abutment pin) 또는 플레이트, 홈에 있는 접합핀 또는 고정 캣치 또는 나사와 같은 자물쇠 장치를 포함한다.
본 발명은 하기에서 첨부된 도면과 함께 양호한 실시예에 의해 상세히 설명한다.
제1도의 종단면도에서, 예비컬럼은 하나의 조립체로 구성되며 스테인레스강으로 만들어진다. 원통형 중앙부(1)는 두 단부쪽으로 원추형으로 좁아져서 두부분(2, 4)를 형성하는데, 부분(2)는 하류단부(downstream end, 5) 방향의 부분(4)보다 상류단부(upstream end, 3)방향으로 급경사로 좁아진다. 상류단부(3)에는 암나사가 형성되어 수나사가 형성된 니플(nipple)이 끼워질 수 있다. 크로마토그라피할 액체의 입구관은 상기 니플에 연결된다. 하류단부(5)는 예비컬럼이 커플링 부재에 나사결합되도록 수나사가 형성되고 제6도에서 보여주는 바와 같이 가스켓의 지지부를 형성하는 원주의 돌출 모서리 또는 리지부(ridge, 6)를 갖고 있다.
제2도 및 제3도의 종단면도에서, 본 발명에 의한 예비컬럼은 각각 용기형 부품(70, 54)과 덮개부(48, 55)로 형성된 두부품으로 구성되어 있다. 제2도의 예비컬럼의 덮개부(43)는 니플(71)을 갖고 있고, 여기에 입구관이 연결되어 중앙구멍(72)을 통해 컬럼의 내부로 액체가 유입되어진다. 덮개부(48)는 용기형 부품(70)에 나사결합될 수 있도록 수나사산부(73)을 가지며, 용기형 부품의 암나사부(74)에 의하여 용기형 부품의 지지부(76)안에 설치되는 가스켓(75)위로 용기형 부품과 나사결합되어진다. 초경금속(sintered meter)의 필터(50)이 지지된 가스켓(75)는 도면에서 확대되어 있다. 하류단부에 용기형 부품(70)은 가스켓의 지지부를 형성하는 외향 원주 리지부(77)를 갖고, 수나사부(78)을 갖고 있어서 제7도 및 제8도에 도시된 바와 같이 커플링 부재안으로 나사결합되어질 수 있다.
제3도의 두 부품으로된 컬럼은 덮개부(55)안 홈(79, 79a)과, 암나사를 형성한 용기형 부품안의 탭형구멍(80, 80a)를 통하여 볼트 등의 수단에 의해 결합된다. 가스켓(81, 82)은 각각 덮개부와 용기형 부품에 형성된 원주 홈(83, 84)에 끼워지고 필터 홀더(filter holder, 85)안의 필터는 가스켓 사이에 지지된다. 덮개부는 용기형 부품의 외부 모서리와 접촉하는 원주 모서리(86)를 갖고 있다. 내부관과의 연결을 위한 니플과 연결되는 암나사를 형성한 연결구멍(60)을 덮개부(55)에 형성한다. 컬럼은 두단부 즉 상류단부쪽으로 75˚, 하류단부쪽으로 27˚의 각으로 안쪽으로 원추형으로 경사져 있다. 컬럼의 용기형 부품은 그 하류단부에 수나사부(88)과 외향 원주리지부(87)을 갖고 있다.
제4도는 액체 크로마토그라피 시스템용 장치의 커플링 부재의 평면도이며 제5도 및 제6도는 각각 제4도의 선(Ⅴ-Ⅴ 및 Ⅵ-Ⅵ)을 따라 절취한 단면도로써, 예비컬럼은 96에 연결된다. 커플링 부재는 스테인레스강인 두 개의 동심의 디스크(7, 8)로 구성되고 디스크(7)는 베어링 보스(bearing boss, 9)에 대하여 회전 가능하게 설치한다. 디스크는 볼트로써 조립되고 디스크(7)을 통해 나사결합되는 같은 보스(9)에 의해 서로 죄여진다. 테프론(teflon)의 원형 가스켓(10, 11)은 그 단면이 거의 원형이고 디스크의 하나에 형성된 홈안에서 두 디스크 사이에 설치된다. 원형 가스켓은 디스크사이에 그리고 보스 주위에 마련된다. 예비컬럼을 위한 연결구멍(96)은 컬럼이 보강 테프론의 시일 가스켓(12)위로 나사결합할 수 있도록 암나사를 형성하고 있다. 가스켓의 다른 측면에서 구멍(96)은 적은 직경의 구멍을 형성하기 위해서 좁아져 있고 디스크형의 초경금속의 필터(90)이 연결구멍과 상기 구멍사이에 위치한다. 예비컬럼을 위한 연결구멍이 형성된 디스크의 외부 모서리에는 핸들(13)이 마련되어 있다. 상기 디스크(7)는 또한 액체를 조절하기 위한 유입튜브에 연결하기 위한 니플(14)로 구성되어진다. 조절된 액체는 크로마토그라피 공정전에 분리컬럼 또는 컬럼을 조절하도록 사용된다.
커플링 부재의 다른 디스크는 두 개의 볼트에 의해서 연결된 핸들(15)과 연결되고 핸들은 고정부안의 디스크로부터 떨어진 그단부(16)에 고정될 수 있다. 중앙구멍을 갖고 분리컬럼에 대한 연결을 위한 삽입부재(18)은 디스크(8)의 지지부(17)에 설치된다. 제5도에 의하면 디스크(8)은 용출액의 출구관에 연결하기 위한 니플(19)로 구성된다. 또한 디스크는 접촉판과 핀(20, 21)으로 구성되고, 이에 의해 디스크안의 구멍이 서로, 연동되도록 필요한 서보로부터의 상대적인 디스크의 회전거리는 쉽게 결정될 수 있다.
제7도 및 제8도의 액체 크로마토그라피 시스템을 위한 장치는 축(23)에 대하여 회전 가능한 두 개의 동심의 스테인레스강 디스크로 구성된 커플링 부재(22)로 구성되고 축은 각 단부에 베어링을 갖고 있고 커플링 부재는 디스크 구멍을 형성하고 있다. 또한 같은 테프론 가스켓이 제4내지 6도의 실시예에 도시된 것과 같이 설치된다. 상부 디스크(24)는 볼트(25)에 의해서 중심축(23)의 플랜지(26)에 연결된다. 상부 디스크는 하부디스크에 대하여 상대회전 가능하고 축 또한 회전한다. 상부 디스크안에는 6개의 구멍이 형성되고 (29, 30 그리고 31에서) 예비컬럼이나 32에서 중앙구멍을 갖고 니플로 구성되거나 니플이 연결될 수 있도록 된 삽입부재(33)이 구멍에 나사결합될 수 있도록 나사산부가 형성되어 있다. 모든 구멍은 감소된 직경의 중앙구멍으로 내부가 연결되었다. 구멍(34)는 또한 최하단 디스크에 형성되며 니플 또는 분리컬럼이 연결될 수 있는 중앙구멍을 갖는 삽입부재(35)의 지지대를 형성한다. 디스크안의 지지부는 제4도 내지 제6도에 도시된 것과 같은 형상이다. 상부 디스크는 핸들(36)에 의하여 하부디스크에 대하여 회전할 수 있다. 하부디스크(28)는 또한 상부디스크(24)를 위한 자물쇠장치를 가지며 상부디스크의 외부 모서리에 형성된 구멍안으로 끼워지는 폴부재(pawl, 61)를 갖는 탄성아암(37)을 갖고 있다. 이에 의하여 상부디스크는 하부디스크에 대하여 주어진 위치에 고정시킬 수 있다. 이렇게 고정시킨 것은 상부디스크의 외부모서리 안의 구멍밖으로 스프링력에 대하여 노브(knob, 38)로써 폴부재를 당기므로써 해제시킬 수 있다.
하부디스크는 그 외부 모서리에서 고정부(39)안에 나사결합되고 고정부는 중심축(23)에 대하여 평행하게 연장되고 반대방향에 위치한 두 로드(40)으로 구성된다.
커플링 부재(22)의 상방에는 두 개의 원형 스테인레스강판(41, 42)이 중심축(23)에 연결되어 있고 상부판(41)은 연결바아 또는 스포우크(bars or spokes, 43)에 의하여 고정부의 로드(40)에 연결된다. 판은 서로 시일되도록 죄여지고 원형 테프론 가스켓은 커플링 부재의 디스크와 마찬가지로 두판사이에 마련된다. 하부판(42)은 볼트(44)에 의하여 베어링 축(23)에 단단히 고정되고 커플링 부재(22)의 상부디스크(24)와 함께 회전한다. 두판(41, 42)는 판안에 형성된 구멍에 연결된 니플(27, 27a)를 갖고 있다. 하부판(42)의 니플은 커플링 부재(22)의 상부디스크(24)안의 예비컬럼 또는 니플에 유체관에 의하여 연결된다. 상부판(41)의 니플은 조절된 액체, 크로마토그라피할 액체, 또는 여러 용출액 등의 다른 액체를 저장하는 저장조에 연결된다. 제7도 및 제8도에 도시된 장치는 예비컬럼 또는 컬럼이 분리할 미량성분 및 여러 용출물로 조절되므로 입구관이 필요없기 때문에 자동 크로마토그라피 공정에 매우 적당하다. 바람직한 액체는 상부 커플링 디스크를 단지 회전시켜서 예비컬럼 또는 분리컬럼중의 하나에 넣을 수 있다.
제7도 및 제8도에 도시된 장치에 있어서, 본 발명에 의한 3개의 스테인레스강 예비컬럼은 커플링 부재(22)의 상부디스크(24)에 나사결합된다. 상기 디스크의 구멍(29)의 나사결합된 컬럼(45)는 제2도에 도시된 형태의 컬럼이다. 디스크(24)의 구멍(30, 31)에 나사결합된 컬럼(46, 47)은 제3도에서 도시된 형태의 컬럼이다. 컬럼(45)는 나사연결부와 연결용 니플을 갖는 덮개부(48)를 갖고 있다. 담체물질은 초경금속의 두필터(50, 51)사이의 컬럼안에 밀폐된다. 상류단부쪽의 컬럼의 원추 부분안에 불활성 필터(52)가 필터(50)위에 설치된다. 컬럼은 테프론 가스켓(53)에 의해서 커플링 부재의 상부디스크(24)안에 형성된 구멍(29)의 좁은구멍(62)에 시일되도록 연결된다. 컬럼(46)은 볼트(56)에 의해 함께 연결된 두 부품(54, 55)로 구성된다. 컬럼(45)에서와 같이 초경금속의 필터(57, 58)가 컬럼(46)안에도 설치되고 커플링 부재의 상부디스트(24)에 대한 시일작용은 테프론 가스켓(59)에 의해 이루어진다. 컬럼(46)은 상부디스크(24)안의 구멍(63)과 하류단부에서 연동된다.
물론 상술한 장치의 여러 변화가 가능하다. 예를들어 커플링 부재의 디스크 및 원형 플레이트에 있는 구멍의 수는 뜻대로 변화시킬 수 있고 적당히 여러 가지로 연결할 수 있다. 본 분야에서 숙련된 사람에게는 명백한 그밖의 많은 변형이 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 가능하다.
본 발명에 따른 예비컬럼을 사용시 첫째로 담체물질, 예를 들면 코라실(corasil), 뉴클레오실(Nucleosil), 조박스(Zorbax) 또는 리코로프랩(Lichroprep)의 소수성 실리카겔을 칼럼중의 초경금속의 두 필터 사이에 놓는다. 유리비드인 경우 내부 충진물은 칼럼의 상류단부상의 원추부분에 있는 필터상에 놓인다. 예비컬럼을 제5 내지 6도 또는 제7 내지 8도에서 도시한 커플링 장치에 연결한다. 제7 내지 8도에 도시한 장치에서 본 발명에 따른 더 많은 예비컬럼을 사용한다. 또한 장치는 동일한 형태의 담체물질로 바람직하게 충진된 하나이상의 분리컬럼을 포함한다. 예비컬럼 및 분리컬럼을 조절하기 위해서 조절액체를 칼럼을 통과시켜 씻어내고 용출액 수집기에 모은다. 다음에 예비컬럼에 크로마토그라피할 물질 예를 들면 뇨 샘플을 출구관에 연결된 예비컬럼을 통하여 흐르게 하여 부가시킨다. 부가한 후에, 예비컬럼을 분리컬럼에 연결시킨후 컬럼을 용출시킨다. 용출공정시 용출물의 조성을 변화시키는 소위 구배용출이 바람직하다. 용출속도 즉 컬럼을 통하여 용출물이 유출되는 속도는 예비컬럼 및 분리컬럼의 용량, 크로마토그라피할 물질, 담체물질 및 용출액에 따른다. 실온에서 용출시키는 것이 바람직하며, 용출하는 동안 칼럼 및 커플링 장치 내의 압력은 20 내지 30MPa, 40MPa까지로 증가할 수 있다. 미량성분은 예를 들면 UV-스펙트로스코피와 같은 스펙트로스코피방법 등의 여러 방법으로 검출한다. 그러나 대부분의 경우에 있어서, 용출물에 발색하는 "불순물"이 너무 많이 존재하므로 바람직하게 UV-측정을 사용할 수 있다. 그러므로 바람직하게는 방사능 측정을 사용한다. 이 경우 대사산물 시험에 있어서 시험할 화학적 화합물, 통상 약제를 방사능 표시한 탄소 또는 수소14C 또는3H로 표시한다. 방사된 방사능을 측정하여 표시된 부분을 포함한 화학적 화합물 자체 및 가능한 그의 대사산물을 검출할 수 있다. 용출물 흐름에서의 "온-라인(on-line)" 또는 수집된 용출물 분획에서의 "오프-라인(off-line)"에서 검출할 수 있다. 전자방법이 더 빠르고, "오프-라인"검출법은 통상 더 정확하다.
뇨증의 이속슈프린(isoxsuprine) 및 그의 대사산물을 검출하기 위하여 뇨 200ml를 상기 기술한 크로마토그라피 공정에 사용한다. 이속슈프린 또는 p-하이드록시-α-[1-〔[1-메틸-2-펜옥시에틸)아미노〕에틸] 벤진 알콜은 혈관확장작용을 갖는 물질이다. 약제 및 그의 대사산물은 크로마토그라피할 샘플중의 미량 즉 수마이크로그람으로 존재한다.
예비농축하기 위하여 본 발명에 따른 스테인레스강 칼럼은 용량 27ml인 제3도에 나타난 형태를 사용한다. 예비컬럼용충진제로서 뉴클레오실30c8인 소수성 실리카겔을 사용한다. 분리컬럼은 내부직경이 9mm이고 길이가 50cm이며, 소수성 실리카겔인 조박스 7c8로 충진시킨다. 이속슈프린을3H로 표시한다. 물 및 메탄올 혼합물로 메탄올 함량을 0에서 100%로 증가시키면서 구배용출시킨다. 용출속도는 분당 약 5ml이다. 미량성분이 오프-라인으로 검출되며 제9도에 도시한 크로마토그람이 수득된다. 이 크로마토그람에서 분당 계산하여 측정한 방사능 RA을 시간(분)에 대하여 플롯한다. I 에 의해 크로마토그람에 표시된 피크는 이속슈프린이며 나머지 피크는 이속슈프린의 대사산물을 나타낸다.
상기 실험을 비교하기 위하여 본 발명에 따른 예비컬럼 대신에 이러한 목적용으로 통상 사용되는 직경 예비컬럼으로 반복한다. 직경 예비컬럼은 내부 직경이 같은 9mm이고 길이가 15cm이다. 사실상 더 긴 컬럼은 이 경우에 컬럼내에서 생성되는 압력이 너무 크기 때문에 사용할 수가 없다. 또한 실험은 동일한 장치, 동일한 형태의 물질 및 본 발명에 따른 예비컬럼에 대하여 상술한 것과 동일한 조건에서 수행한다. 새엉된 크로마토그람은 제10도에 나타나 있다. 크로마토그람에서 소위 "방해 효과가 GE에서 일어났음은 명확하다.
본 발명에 따른 예비컬럼은 또한 제11,12,13도 및 제14도에서 보여준 크로마토그람에서 일어날 수 있는 그밖의 여러 분리문제를 해결하는데 사용한다. 제4도 내지 제6도에서 도시한 바와 같은 단일 커플링장치 또는 제7도 및 제8도에서 도시한 바와 같은 6-중(six-fold)장치가 사용된다.
제11도 및 제12도의 크로마토그람은 공격성 억제작용을 갖는 [2-〔4-[3-트리플루오로메틸페닐)-1-피페라지닐]에틸]우레아 및 그의 대사산물을 함유한 샘플의 컬럼크로마토그라피로 수득된 것이다.
제11도 : 제2도에서 도시한 바와 같은 스테인레스강 예비컬럼 : 용량 1.5ml : 충진제 뉴클레오실 30c8
분리컬럼 : 스테인레스강 : 길이 500mm : 내부직경 9mm : 충진제 뉴클레오실 7c8
준비할 샘플 : 개의 혈장 22ml
용출 : 물 및 메탄올 혼합물로 메탄올 함량을 0에서 100%로 증가시키는 구배용출
화합물을14c로 표시한다 : 검출 :오프-라인 : 분당 계산하여 방사능 RA를 측정한다. T에서 피크는 활성화합물이다 : 나머지는 대사산물이다.
제12도 : 제3도에서 도시한 바와 같은 스테인레스강 예비컬럼 : 용량 27ml : 충진제 뉴클레오실 7c8
분리컬럼 : 스테인레스강 : 길이 500mm : 내부 직경 9mm : 충진제 뉴클레오실 7c8
준비할 샘플 : 개의 뇨 620ml
용출 : 물 및 메탄올 혼합물로 메탄올 함량을 0에서 100%로 증가시키는 구배용출
화합물을14c로 표시한다 : 용출 : 온-라인 T에서의 피크는 활성화합물이다 : 나머지는 대사산물이다. 메탄올 %중의 용출물의 구배양상은 GP로 나타낸다.
계내의 압력은 P로 표시한다. 이 압력은 최대 약 5400psi, 즉 35MPa에 달한다.
제13도는 DES 0.5ppb를 가한 뇨샘플을 크로마토그라피하여 수득한 크로마토그람이다. DES 또는 디에틸스틸베스트롤은 에스토로겐 작용을 갖는 물질이다. 본 발명에 따른 스테인레스강 예비컬럼은 용량이 13ml이다 : 충진제 리크로프렙 RP2, 소수성 실리카겔
분리컬럼 : 스테인레스강 : 길이 250mm : 내부 직경 9mm : 충진제 뉴클레오실 7c8
준비할 샘플 : 50ml
용출 : 물-메탄올 혼합물로 메탄올 함량은 0에서 100%로 증가시키는 구배용출
검출 : 오프-라인
DES는3H으로 표시한다. D에서의 피크는 DES이다.
제14도의 크로마토그람은 미량의 N-(2,6-디플루오로벤조일)-N'-(4-트리플루우로메틸페닐)우레아 및 그의 대사산물을 함유한 레트의 뇨샘플을 컬럼크로마토그라피하여 수득한다 : 이 뇨 화합물은 농업, 원예 및 임업에서 살충제로 사용할 수 있다. 제3도에서 도시한 바와 같은 스테인레스강 예비-컬럼 : 용량 27ml : 충진제 뉴클레오실 30c8
분리컬럼 : 스테인레스강 : 길이 500mm, 내부직경 9mm : 충진제 조박스 7c8
준비할 샘플 : 121ml
용출 : 물 및 메탄올 혼합물로서 메탄올 함량을 0에서 100%로 증가시키는 구배용출 화합물을14c로 표시한다.
검출 : 온-라인
P에서의 피크는 활성 화합물이며 그밖의 것은 대사산물이다. 메탄올 %중의 용출물의 구배양상은 GP로 나타낸다.

Claims (7)

  1. 예비컬럼의 양단부에 밀접연결장치 : 전농축할 액체 유입튜브에 관하여 상류단부(3) : 및 분리용 컬럼에 관하여 하류단부(5)를 가지며 : 또한, 내부적으로, 전농축할 액체를 몸체의 내부단면상에 분포시키기 위한 유입튜브를 향해 수렴하는 상류단면(2) : 필터의 주위부분이 예비컬럼내에서 밀접연결된 2개의 필터, 즉 하나의 필터는 용기의 상류 단부상(50, 85) -예비컬럼의 수렴단면(2) 하부에, 다른 하나의 필터는 용기의 하류단부에 상응하는 담체물질의 하부(77, 88)에 위치하는 2개의 필터에 의해 한계가 정해진, 전농축 목적으로 적합한 담체물질을 함유하도록 취부된 용기(1, 4)를 포함하는, 크로마토그라피시킬 물질을 승압하에 전농축시키는 내압재료의 예비컬럼에 있어서, 용기(1, 4)가 원통형의 제1중앙부분(1) 및 제1부분과 공통축을 갖는 회전 고체상태의 제2부분(4)으로 이루어진 기하학적인 복합형태를 가지며, 당해 용기는 최초에 부분(1)과 동일한 기재반경을 가지지만 예비컬럼의 하류단부(5)를 향하여 내부적으로 협소해짐을 특징으로 하는 내압재료의 예비컬럼.
  2. 제1항에 있어서, 용기의 제2부분(4)이 하류단부 방향으로 원추형으로 수렴하거나 점점 구부러지는 예비컬럼.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 내압식으로 함께 연결된 2개 이상의 단편(70-48, 54-55)을 포함하는 예비컬럼.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 약 40MPa의 압력에 대하여 내성을 나타내는 예비컬럼.
  5. (a) 하나 이상의 예비컬럼, (b) 예비컬럼 및 액체 유입 튜브를 하나 이상의 분리용 컬럼 및 폐액 유출튜브에 커플링시키는 부재 및 (c) 임의의 하나 이상의 분리용 컬럼을 포함하는 액체 크로마토그라피 시스템용 장치에 있어서, 제1항 내지 제4항중의 어느 한 항에 기술된 하나 이상의 예비컬럼을 포함함을 특징으로 하는 장치.
  6. 상호밀접 연결된 상태로 서로에 대하여 회전할 수 있는 2개의 동축 디스크(24, 28), 예비컬럼 및 액체유입 튜브가 밀접 연결될 수 있는 디스크중 하나(24)에 우묵들어간 구멍(29-32), 분리용 컬럼 및 폐액 유출 튜브가 연결될 수 있는 다른 디스크(28)에 우묵들어간 구멍(34) 및 하나의 디스크를 다른 디스크에 대하여 회전시킴으로써 원하는 대로 서로와 연결되도록 취부된 2개의 디스크중의 구멍을 포함하는 액체 크로마토그라피 시스템용 커플링 부재.
  7. 제5항에 있어서, 커플링 부재(22)가 제6항의 커플링 부재인 장치.
KR1019830001744A 1982-04-28 1983-04-25 액체 크로마토그라피 시스템용 장치 KR900008957B1 (ko)

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