KR900007865B1 - 지방족-방향족 케톤 측쇄를 함유하는 펩티드 및 그의 제법 - Google Patents

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Description

지방족-방향족 케톤 측쇄를 함유하는 펩티드 및 그의 제법

본 발명은 포유동물에서 뇌하수체선에 의한 GH의 분비를 억제하거나 성선자극호르몬(gonadotropin)의 분비에 영향을 미치는 펩티드 및 이런 펩티드의 제법에 관한 것이다. 좀더 특히 본 발명은 성선기능 및 스테로이드호르몬, 프로게스테론 및 테스토스테론의 분비를 촉진하거나 억제하는 향상된 생물학적 역가를 갖거나 GH 분비를 억제하는 향상된 생물학적 역가를 가진 펩티드에 관한 것이다.

뇌하수체선은 시상하부로 알려진 뇌기저에 있는 부위에 경부에 의해 연결되어 있다. 특히 때로 고나도트로핀 또는 성선자극호르몬이라 불리우는 난포자극호르몬(FSH) 및 항체자극호르몬(LH)이 뇌하수체선에 의해 설비된다. 이들 호르몬들은 함께 정소에서 테스토스테론, 난소에서 프로게스테론과 에스트로겐을 생성하는 성선의 기능을 조절해주며, 또 배우자의 생성 및 숙성을 조절해준다. 성장호르몬(GH) 또한 뇌하수체선에 의해 분비된다. 뇌하수체선 전엽에 의해 호르몬이 분비되려면 일반적으로 시상하부에서 생성된 다른 부류의 호르몬이 먼저 분비되어야 한다. 시상하부호르몬 중 하나는 성선자극호르몬 특히 LH의 분비를 유발시키는 인자로 작용하며 이 호르몬은 LH-RH 및 LRF로도 불리우나 여기선 GnRH로 부르기로 한다. GnRH는 단리되어 하기 구조를 가진 데카펩티드로서 확인되었다 ; pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro -Gly-NH₂.

펩티드는 한 산의 카복실기가 다른 산의 아미노기에 연결되어 있는 2개 또는 그 이상의 아미노산을 함유하는 화합물이다. 상기 표시된 GnRH의 구조식은 아미노 또는 N-말단을 왼쪽에 카복실 또는 C-말단을 오른쪽에 나타낸 통상적인 표시법에 따른 것이다. 아미노산 잔기의 위치는 왼쪽부터 오른쪽으로 아미노산 잔기에 번호를 매겨 구별했다. GnRH의 경우는 글리신의 카복실기의 하이드록실 부분이 아미노기(NH₂)로 대치되었다. 개개 아미노산 잔기의 약호는 통상적인 것으로 아미노산의 일반명을 근거로 한 것으로 예컨대 pGlu는 피로글루타민산이며, His는 히스티딘이며, Trp는 트립토판이며, Ser은 세린이며, Tyr은 티로신이며, Gly는 글리신이며, Leu는 로이신이며, Orn은 오르니친이며, Arg는 알기닌이며, Lys은 리진이며, Cys는 시스테인이며, Asn은 아스파라긴이며, Thr은 트레오닌이며, Pro는 프롤린이며, Phe는 페닐알라닌이며, Glu는 글루타민산이며, Asp는 아스파트산이며, Ala는 알라닌이다. 글리신을 제외하고 본 발명의 펩티드의 아미노산은 따로 언급이 없는한 L-구조(configuration)이다.

GnRH 데카펩티드 또는 노나펩티드의 6-위치에 있는 Gly을 D-아미노산으로 치환해주면 실질적으로 결합친화력이 더 큰 GnRH 유사체가 생성되며, 따라서 더 높은 역가의 협동제와 길항제를 생성하는데 사용될 수 있다.

C-말단에 있는 Gly-NH₂를 에틸아미드성분 또는 그와 유사한 것으로 치환해주면 더 높은 역가를 가진 협동제가 생성된다. GnRH 데카펩티드상에 그 밖의 치환이 이루어지면 포유류의 뇌하수체선에 의한 LH 및 다른 성선자극호르몬의 분비에 대해 억제작용을 가진 길항제가 생성되는 것으로 알려져 있다. 이런 분비 또는 억제효과가 GnRH 유사체를 포유류에 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 경피내 예컨대 비강내 및 질내 투여하거나 또는 서방출형 또는 지연방출형 제제로 투여했을때 얻어진다.

자성 포유류에서 배란이 억제되는 것을 바라는 이유가 있으며 GnRH의 협동제 다량투여 또는 GnRH의 정상기능을 길항하는 GnRH 유사체의 투여는 배란을 저지하거나 지연하는데 사용되어 왔다. 이런 이유로, GnRH 유사체는 피임제로서 또는 임신기간을 조절하는데 그 잠재적인 용도가 연구되고 있다. 이런 이유로 GnRH 길항제는 또한 조발 청춘기 및 자궁내막증을 치료하는데도 사용될 수 있다. 이런 길항제들은 또한 웅성포유류에서 성선자극호르몬의 분비를 조절하는데 유용한 것으로 발견되었으며, 예컨대 웅성피임제로서 정자발생을 억제하고 전립선 비대증을 치료하는데 사용될 수 있다.

좀더 역가가 높은 GnRH 유사체인 진보된 펩티드를 얻는 것이 바람직하다.

본 발명은 그들중 일부는 GnRH에 대해 강한 길항제로서 포유류의 재생산 과정에 억제작용을 하며 나머지들은 GnRH의 강력한 협동제인 향상된 GnRH 유사체를 제공해준다.

일반적으로, 본 발명에 따라 6-위치에 지방족-방향족 케톤 측쇄를 갖고 있는 잔기를 포함하기 때문에 그 결과 더 강한 결합 효율을 가지고 있는 GnRH 펩티드가 합성되었으며, 이들은 비교적 저렴한 물질을 사용하여 경제적으로 합성될 수 있다. GnRH 길항제는 인간을 포함한 포유류의 뇌하수체선에 의한 성선자극호르몬의 분비를 강하게 억제하며/거나 성선에 의한 스테로이드 분비를 억제한다. 이들 펩티드들은 예컨대 D-GLu, D-Hg1 또는 D-Asp같이 카복실함유 측쇄를 갖고있는 D-이성체 α-아미노산이 원래 6-위치에 있는 GnRH 유사체이며, 이 잔기의 측쇄 카복실기는 이어 카복실기로부터 측쇄 아실륨이온 중간체의 형성을 경유해 혼합알킬케톤으로 전환되며 이것은 HF나 또는 적당한 루이스산 같은 등가의 산으로 처리를 받아 일어난다. 혼합 알킬케톤 측쇄는 방향족 성분으로 말단이 끝나는 것이어야 한다. 이런 목적에 사용되는 혼합 알킬케톤이란 하나의 알킬기와 하나의 비-알킬기를 함유하는 케톤을 의미한다. 이런 용도에서 방향족이란 아니솔, 인돌, 푸란, 알킬피롤 또는 티오펜같은 것으로부터 유도된 것들과 같은 공명카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭기를 의미한다. Hg1이란 알파-아미노 아디프산을 의미하며 이것은 또 호모글루타민산으로도 불리운다.

또한, GnRH 길항제에는 D-pGlu, 디하이드로-Pro, Pro, 할로겐화 D-Phe, D-Trp 또는 β-(2-나프틸)-D-알라닌(이후 β-D-2NAL)와 같은 1-위치 치환분, 2-위치에 있는 치환된(바람직하게는 할로겐화)D-Phe, 3-위치 치환분, 4-위치에 있는 임의 치환분인 C_1-5의 디아미노산, 5-위치에 있는 할로겐화 L-Phe 할로겐화 L-Tyr 또는 L-Arg 형태의 임의 치환분 및 7- 및 l0-위치에 있는 임의 치환분이 포함된다. D-pGlu을 제외한 1-위치 치환분은 그의 α 아미노기가 아실기 예컨대 포르밀(For), 아세틸(Ac), 아크릴일(Acr), 비닐아세틸(Vac) 또는 벤조일(Bz)을 함유하도록 개질시키는 것이 바람직하며 Ac 및 Acr이 바람직하다. 3-위치에 있는 개질된 D-Trp은 인돌환 중에 존재하는 특수한 개질의 결과로 증가된 길항활성을 제공한다. 수소에 대한 단일 치환은 5- 또는 6-위치에서 이루어지며 치환분은 클로로, 플루오로, 브로모, 메틸, 아미노, 메톡시 및 니트로로부터 선택되며, 클로로, 플루오로 및 니트로가 바람직하다. 인돌 질소는 또한 예컨대 포르밀(NⁱⁿFor- 또는 1For-)이나 아세틸로 아실화될 수 있다.

또 다른 3-위치 치환분은 D-PAL로서 D-알라닌의 β-원자가 피리딜에 의해 치환된 것을 나타내며 이때 피리딘환의 2-,3- 또는 4-위치는 D-알라닌에 연결되어 있으며, D-3PAL인 것이 바람직하다. 상기 언급한 바와 같이 4-,7- 및 10-위치에 있는 치환분은 일반적으로 임의적인 것으로 생각된다. 만일 치환된 경우 10-위치는 D-Ala-NH₂인 것이 바람직하다.

이들 펩티드들은 LH 분비를 억제하는데 아주 역가가 높기 때문에 GnRH 길항제로 이들을 부른다. 이펩티드들은 발정전기에 아주 낮은 용량치로 투여했을때 여성포유류의 배란을 억제하며 만일 임신직후 투여한 경우 수정란의 흡착을 야기하는데 유효하다. 이들 펩티드들은 또한 남성포유류의 피임처리에도 유효하다.

향상된 GnRH 협동제는 6-위치에 유사한 잔기를 가지며, 1-위치에 임의 치환분 바람직하게는 포르밀 Pro 및 10-위치에 임의의 치환분 바람직하게는 -NHCH₂CH₃(-NHEt)를 가질 수 있다.

중앙위치에 지방족-방향족 케톤 측쇄를 갖고있는 잔기와 같은것을 포함하고 있어 이 호르몬의 수용체에 대해 증가된 결합친화력을 갖는 다른 펩티드 호르몬들이 합성될 수 있다.

좀더 특히 GnRH 길항제로서의 본 발명의 펩티드는 하기 구조식(I)으로 표시된다 ; X-R₁-(W)D-Phe-R₃-R₄-R₅-R₆(V)-R₇-Arg-Pro-R₁₀. 여기서 X는 수소 또는 C_1-7의 아실기이며 ; R₁은 디하이드로-Pro, Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp, 또는 β-D-NAL이며 ; W는 F, C1, Cl₂Br, NO₂또는 cMe/C1이며 ; R₃는 D-PAL, D-Trp, (NⁱⁿFor) D-Trp 또는 5- 또는 6-위치가 NO₂, NH₂, OCH₃, F, C1, Br 또는 CH₃로 치환된 D-Trp이며 ; R₄는 Ser, Om, AAL 또는 aBu이며 ; R₅는 Tyr, Arg, (3F)Phe, (2F)Phe, (3I)Tyr, (3CH₃)Phe, (2CH₃)Phe, (3Cl)Phe 또는 (2Cl)Phe이며 ; R₆는 D-Glu, D-Hgl 또는 D-Asp이며 ; R₇은 Leu, NML, Nle 또는 Nva이며, R_l0은 Gly-NH₂, D-Ala-NH₂또는 NH-Y이며 이때 Y는 저급알킬, 사이클로알킬, 플루오로 저급알킬 또는 NHCONHQ이며 여기서 Q는 H또는 저급-알킬이며 ; V는 R₆의 카복실기 측쇄와 하기 화합물들로 구성된 Z' 부류로부터 선택된 화합물로부터 형성된 케톤의 방향족 성분이다 ; 에틸벤젠, 프로필벤젠, 이소프로필벤젠, 부틸벤젠, s-부틸벤젠, 이소부틸벤젠, t-부틸벤젠, 아일벤젠, 1-메틸부틸벤젠, 1-에틸프로필벤젠, 3-메틸부틸벤젠, 1,1-디메틸프로필벤젠, 헥실벤젠, 헵틸벤젠, 2-에틸헥실벤젠, 옥틸벤젠, 노닐벤젠, 데실벤젠, 도데실벤젠, 테트라데실벤젠, 헥사데실벤젠, 옥타데실벤젠, 사이클로프로필벤젠, 사이클로펜틸벤젠, 사이클로헥실벤젠, (4-아실옥시사이클로헥실)-벤젠, 3 -메틸-5-페닐-사이클로헥스-2-에논, o-크실렌, m-크실렌, p-크실렌, m-에틸톨루엔, p-에틸톨루엔, o-프로필톨루엔, m-프로필톨루엔, m-시멘, p-프로필톨루엔, p-시멘, m-s-부틸톨루엔, p-s-부틸톨루엔, m-t-부틸톨루엔, p-도데실톨루엔, p-디에틸벤젠, m-t-부틸에틸벤젠, p-t-부틸에틸벤젠, m-디이소프로필벤젠, p-디 이소프로필벤젠, p-디부틸벤젠, p-디-s-부틸벤젠, p-디-t-부틸벤젠, p-디-(1-메틸 부틸)벤젠, 인단(인단 또는 히드린덴), 5-메틸인단, 6-t-부틸인단, 2-벤질인 단, 디알킬인단, 트리알킬인단, 테트라알킬인단, 펜타알킬인단, 헥사알킬인단, 헵타알킬인단, 1-카보에톡시인단, 테트랄린, 6-메틸테트랄린, 6-에틸테트렐린, 6-부틸테트랄린, 6-헥실테트랄린, 6-사이클로헥실테트랄린, 디알킬테트랄린, 테트라알킬테트랄린, 펜타알킬테트랄린, 7-에틸-1-카보에톡시메틸테트랄린, 2-페닐테트랄린, 헤미멜리텐, 슈도쿠멘, 메시틸렌, 프레흐니텐, 이소듀렌, 듀렌, 펜타메틸벤젠, 에틸-1,4-크실 렌, 4-에틸-1,3-크실렌, 2-프로필-1,4-크실렌, 2-이소프로필-1,4-크실렌, 4-프로필-1,2-크실렌, 4-프로필-1,3-크실렌, 2-이소부틸-1,4-크실렌, 5-6-부틸-1,3-크실렌, 2-t-아밀-4-이소프로필톨루엔, 트리알킬벤젠, 4-벤질-1,3-크실렌, 3,4,5,11-테트라하이드로아세나프텐, 에틸메시틸렌, 히드린다센, 하이드로페난트렌, 펜타알킬벤젠, 하이드로피렌, 하이드로안트라센, 디페닐메탄, 디페닐프로판, 비벤질, 3,4-디페닐헥산, α,ω-디페닐알칸, 트리페닐메탄, 파라사이클로판, 페닐에틸렌, 찰콘, 포름아미도톨루엔, 페닐아세트산, 알킬페닐아세테이트, 페닐아세토니트릴, 데스옥시벤조인, 1-페닐-2-니트로에탄, 1-페닐-2-아세트아미도에탄, 알킬 3-페닐프로피오네이트, 3-페닐프로피오니트릴, 페닐벤조일알칸, 페닐클로로알칸, 페닐니트로알칸, 알킬페닐부티레이트, 할로알킬벤젠, 페놀, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐벤조에이트, 알킬 페놀, 할로페놀, 카테콜, 레소르시놀, 알킬 레소르시놀, 피로갈롤, 프롤로글루시놀, 트리하이드록시톨루엔, 트리하이드록시이소아밀벤젠, 아니솔, 페네톨, 알 킬페닐에테르, 알킬톨릴에테르, 에틸아니솔, p-t-부틸아니솔, m-헵틸아니솔, p-사 이클로헥실 아니솔, 아니실헥산, 디메틸아니솔, 2-에틸-4-메틸아니솔, 5-메톡시테트랄린, 이소프로필메틸아니솔, 하이드로페난트렌, 트리알킬아니솔, 플루오로아니솔, 클로로아니솔, 클로로페네톨, 브로모아니솔, 브로모페네톨, 요도아니솔, 알킬할로아니솔, 디알킬할로아니솔, 디할로아니솔, 디알콕시할로아니솔, 구아이아콜, 레소르시놀모노메틸에테르, 하이드로퀴논모노메틸에테르, 알킬하이드록시아니솔, 2가페놀성디메틸 에테르, 다가페놀성메틸에테르, 디페닐에테르, 알킬디페닐에테르, 클로로디페닐에테르, 알콕시디페닐에테르, 디알킬디페닐에테르, 니트로페닐에테르, 티오아니솔, 티오페네톨, 알킬페닐설파이드, o-톨릴티오에테르, 알킬티오아니솔, 클로로티오아니솔, 디페닐설 파이드, 니트로디페닐설파이드, 2-티오크레졸, 3-메톡시티오페놀, 3-에톡시티오페놀, 디페닐디설파이드, 아세트아닐리드(AA), 알킬 AA, 디알킬 AA, 아세트아미도인단, 아세트아미도테트랄린, 트리메틸 AA, 클로로 AA, 클로로-4-메틸 AA, 알콕시 AA, N,N-디아실아닐리드, 니트로브로모벤젠, 니트로페놀, 니트로아니솔, 니트로페네톨, 하이드록시-3-니트로톨루엔, 니트로레소르시놀, 니트로아니솔, 하이드록시-4-니트로아니솔, 벤조산, m-톨루산, 살리실산, 알킬살리실레이트, 알킬알콕시벤조에이트, 알킬하이드록시벤조에이트, 디메틸아세토페논, 트리메틸아세토페논, 트리메틸프로피오페논, 메톡시아세토페논, 디하이드록시아세토페논, 디하이드록시프로피오페논, 벤조페논, 디메틸벤조페논, 디하이드록시벤조페논, 비페닐(BP), 알킬 BPs, 디알킬 BPs, 9-10-디하이드로페난트렌, 클로로 BP, 브로모 BP, 하이드록시 BP, 메톡시 BP, 메톡시-클로로 BP, 아세틸 BP, 니트로 BP, 클로로아세틸 BP, 디페닐벤젠, 1,4-터페닐, 1,3,5-트리페닐벤젠, 플루오렌(F), 벤질 F, 메톡시 F, 카보메톡시 F, 벤조일 F, 나프탈렌, 알킬나프탈렌, 할로나프탈렌, 나프톨, 알킬나프톨에테르, 2-나프틸메틸설파이드, 나프토설톤, 1,8-나프토-설탐, 나프탈렌카복실산, 안트라센, 알킬안트라센, 할로안트라센, 알킬할로안트라센, 알킬알콕시안트라센, 안트로페논, 9,9'-비안트릴, 페난트렌(P), 알킬 P, 할로 P, 알콕시 P, 아세톡시 P, 하이드록시 P, 3-아세트아미도 P, 피렌, 2-메틸피렌, 1-벤조일피렌, 크리센, 2-에틸크리센, 6-벤질크리센, 트리페닐렌, 퍼릴렌, 플루오르안텐, 비페닐렌, 푸란, 알킬푸란, 벤조푸란(BF), 메틸 BF, 에틸 BF, 프로필 BF, 벤질 BF, 페닐 BF, 아니실 BF, 디하이드로벤조푸란, 디벤조푸란(DBF), 에틸 DBF, 프로필 DBF, 브로모 DBF, 메톡시 DBF, 니트로 DBF, 크산텐, 1-하이드록시-9-옥소크산텐, 티오펜, 알킬티오펜, 디알킬티오펜, 트리알킬티오펜, 2-벤질티오펜, 할로티오펜, 디할로티오펜, 트리할로티오펜, 알킬할로티오펜, 할로페닐티오펜, 메틸페닐티오펜, 디티에닐, 디메틸디티에닐, 터티에닐, 벤조[b]티오펜(BT), 메틸 BT, 메톡시 BT, 디벤조티오펜, 알킬피롤, 디알킬피롤, 트리알킬피롤, 디알킬-카보메톡시피롤, 인돌, 2-메틸인돌, 3-메틸인돌, 1,2-디메틸인돌, 1,2,3-트리메틸인돌, 2,3,4,6-테트라메틸인돌, 2-페닐인돌, 2,3-디메틸-1-아세틸인돌, 테트라하이드로카바졸(THC), 9-아세틸 THC, 9-벤조일 THC, 6-할로-9-아세틸 THC, 카바졸, 아세틸카바졸, 알킬카바졸, 할로알킬카바졸, 벤조일카바졸, 아세틸인돌린, 1-아실-2,3-디메틸-인돌린, 헥사하이드로카바졸, 페닐피라졸, 페닐알킬피라졸, 1-페닐-3-피라졸린-5-온(PP), 알킬 PP, 디알킬 PP, 2-아미다졸론(IA), 4-메틸 IA, 2-옥소-2,3-디하이드로벤즈이미다졸, 이미다조[1,5-a]피리딘(IP), 메틸 IP, 5,7-디메틸퀴놀린, 하이드록시퀴놀린, 메톡시퀴놀린, 2-메틸하이드록시퀴놀린, 아실테트라하이드로퀴놀린, 아크리단, 10-아세틸아크리단, 2-하이드록시-4-메틸티아졸, 10-에틸펜옥사진, 10-아세틸펜옥사진, 페노티아진(PT), 10-알킬 PT, 3,10-디메틸 PT, l0-아실 PT, l,2-벤즈이속사졸(BIO), 3-메틸 BIO, 7-메톡시 BIO 및 3-페닐-7-메톡시 BIO.

GnRH 협동체로서의 펩티드는 하기 구조식(IA)으로 표시된다 ; R_l-His-Trp-Ser-Tyr-R₆(V)-Leu-Arg-Pro-R₁₀; 여기서 R₆및 V는 상기 정의한 바와 같으며 ; R₁은 pGlu 또는 For-Pro이며, R₁₀은 Gly-NH₂, D-Ala-NH₂또는 치환아미드이다.

β-D-NAL은 β-탄소원자상이 나프틸에 의해 치환된 알라닌의 D-이성체를 의미하며 3-D-NAL로도 표시할 수 있다.

β-탄소원자가 나프탈렌의 환구조상의 2-위치에 부착되어 있는 β-D-2NAL을 사용하는 것이 바람직하나 β-D-NAL을 사용할 수도 있다. Dap는 α,β-디아미노프로피온산을 나타내며, 이것은 β-아미노알라닌으로 표시할 수 있으며 ; NML은 N^αCH₃-L-Leu을 의미한다. AAL은 또한 β-아미노-Ala을 의미하며, aBu는 α,γ 디아미노부티르산을 의미하며, 이들중 어떤 것이나 또는 Orn이 4-위치에 존재할 수 있다. Ser이 4-위치에 존재하는 경우 디하이드로 Pro이 1-위치에 존재하는 것이 바람직하다. C^αMe/Cl-D-Phe는 그의 α-탄소가 메틸화 되었으며, 파라-위치가 Cl에 의해 치환된 D-Phe을 의미한다.

구조식(I) 및 (IA)에서 R₆(V)는 변형되어 혼합 알킬케톤을 형성하는 측쇄 카복실기를 갖고있는 기본펩티드 쇄에 있는 D-아미노산 잔기를 정의하는데 사용한다. 기본쇄중 잔기는 D-Glu인 것이 바람직하다. 대신 D-Hgl 또는 D-Asp일 수도 있다.

본 발명의 펩티드는 전통적인 용액합성법에 의해서나 또는 클로로메틸화수지, 벤즈히드릴아민(BHA)수지, 메틸벤즈히드릴아민수지(MBHA), N-알킬아미노메틸수지(NAAM) 또는 기타 이 분야에 알려진 다른 적당한 수지를 사용하는 고상법(solid phase technique)에 의해서 합성될 수 있다. 전통적인 합성법을 사용하는 경우 펩티드쇄에 있는 인접잔기에 아미노산을 결합시키기 전에 케톤측쇄를 독립적으로 생성시키는 것이 유리할 수 있다. 고상합성법은 미국특허번호 4,211,693에 설명된 방법으로 쇄중에 아미노산을 단계적으로 첨가해가는 방법으로 수행된다. 이 분야에 잘 알려진 바와 같이 몇몇 치환기는 물론, 존재하는 경우 Ser, Tyr 및 Arg에 측쇄보호기를 첨가해주는 것이 바람직하고 이들 아미노산이 수지상에 붙게되는 쇄에 결합되기 전에 임의로 Trp(아실화되지 않은경우)에 첨가시킬 수 있다. 고상법이 사용되는 경우 6-위치에 있는 D-Glu, D-Hg1 또는 D-Asp 잔기를 Bzl(벤질에스테르), 2,6-디클로로벤질(DCB), 디 니트로페닐(Dnp), 1-하이드록시-벤조트리아졸벤질에스테르(OHbt), 8-하이드록시퀴놀린에스테르(OHq), p-니트로벤질옥시(ONBzl), 페닐아조페닐 또는 3급 부톡시 같은 것으로 보호해주는 것이 바람직하며 이런 합성은 완전히 보호된 중간체인 펩티도수지를 제공해준다.

GnRH 길항제로서의 본 발명의 중간체는 하기 구조식(II)으로 표시된다 ; X¹-R₁-(W)D-Phe-R₃(X²)-R₄(X³)-R₅(X⁴또는 X⁶)-R₆(X⁵)-R₇-Arg(X⁶)-Pro-X⁷.

상기 구조에서, X¹는 폴리펩티드의 단계적 합성에서 이 분야에 유용한 것으로 알려진 형태의 α-아미노보호기이며 바라는 펩티드 조성에서 X가 특정 아실기인 경우 이 기는 보호기로 사용될 수 있다. X¹으로 표시된 α-아미노보호기 부류중에는 (1) 포르밀(For), 트리플루오로아세틸, 프탈릴, p-톨루엔설포닐(Tos), 벤조일(Bz), 벤젠설포닐, o-니트로페닐설페닐(Nps), 트리틸설페닐, o-니트로펜옥시아세틸, 아크릴릴(Acr), 클로로아세틸, 아세틸(Ac) 및 γ-클로로부티릴 같은 아실형 보호기 ; (2) 벤질옥시카보닐(Z), 플루오레닐메틸옥시카보닐(FMOC) 및 치환 벤질옥시카보닐 예컨대 p-클로로벤질옥시카보닐(Clz), p-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐 및 p-메톡시벤질옥시카보닐 같은 방향족 우레탄형 보호기 ; (3) t-부틸옥시카보닐(Boc), 디이소프로필메톡시카보닐, 이소프로필옥시카보닐, 에톡시카보닐 및 알릴옥시카보닐 같은 지방족 우레탄 보호기 ; (4) 사이클로펜틸옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐 및 사이클로헥실옥시카보닐 같은 사이클로알킬 우레탄형 보호기 ; (5) 페닐티오카보닐 같은 티오우레탄형 보호기 ; (6) 알릴(Aly), 트리페닐메틸(trityl) 및 벤질(Bzl) 같은 알킬형 보호기 ; (7) 트리메틸실란 같은 트리알킬실란기 같은 것이 있다. 바람직한 α-아미노보호기는 X가 수소인 경우 Boc이다.

X²는 수소 또는 Trp의 인돌질소보호기 예컨대 포르밀 또는 벤질이다. 많은 합성에서 Trp의 인돌 NH를 보호할 필요는 없으나 R₃가 (NⁱⁿFor)D-Trp인 경우 X²는 포르밀이다. D-3PAL은 보호할 필요가 없다.

X³는 수소 또는 Ser의 알콜성 하이드록실기의 보호기 예컨대 아세틸, 벤조일, 테트라하이드로피라닐, t-부틸, 트리틸, 벤질 및 2,6-디클로로벤질로 구성된 군으로부터 선택된 것으로 벤질이 바람직하다. 또한 Ser에 대해 치환이 이루어진 경우, X³는 Tos, Z 또는 Clz 같은 측쇄아미노기의 보호기일 수 있다.

X⁴는 수소 또는 Tyr이 존재하는 경우 Tyr의 페놀성 하이드록실기의 보호기로서 테트라하이드로피라닐, t-부틸, 트리틸, 벤질, Z, 4-브로모벤질옥시카보닐 및 2,6-디클로로벤질로 구성된 군으로부터 선택된다. 2,6-디클로로벤질이 바람직하다.

X⁵는 D-Glu, D-Hgl 또는 D-Asp의 측쇄 카복실기의 보호기로서 Bzl(벤질에스테르), 2,6-디클로로벤질(DCB), 디니트로페닐(Dnp), 1-하이드록시-벤조트리아졸 벤질에스테르(OHbt), 8-하이드록시퀴놀린에스테르(OHq), p-니트로벤질옥시(ONBzl), 페닐아조페닐 및 t-부톡시로 구성된 군으로부터 선택되며 Bzl인 것이 바람직하다.

X⁶는 니트로, Tos, 트리틸, 벤질옥시카보닐 아다만틸옥시카보닐, Z 및 Boc와 같은 Arg의 측쇄 구아니디노기의 보호기이거나 또는 X⁶는 수소원자일수 있으며 이것은 측쇄기 원자상이 보호되지 않았음을 의미한다. Tos가 일반적으로 바람직하다.

X⁷는 Gly-NH-[수지 지지체], D-Ala-NH[수지 지지체] 또는 N(A)-[수지 지지체]일 수 있으며 또는 이것은 Gly 또는 D-Ala의 아미드이거나 또는 Pro에 직접 부착된 치환아미드일 수 있다.

X²-X⁶의 측쇄 보호기를 선택하는 기준은 보호기가 합성각 단계에서 α-아미노보호기를 제거하기 위해 선택된 반응조건하에서 시약에 안정해야 한다는 것이다. 보호기는 커플링조건하에서 이탈되지 않아야 하며, 보호기는 펩티드쇄를 변경시키지 않는 반응조건하에서 원하는 아미노산 서열의 합성이 완결되었을 때 제거될 수 있어야 한다.

X⁷기가 G1y-NH-[수지 지지체] 또는 D-Ala-NH-[수지 지지체]인 경우 아미드 결합이 Gly 또는 D-Ala을 BHA 수지 또는 MBHA 수지에 연결시켜 준다. X⁷기가 N(A)-[수지 지지체]인 경우 치환아미드 결합이 Pro을 N-알킬아미노메틸수지(NAAM)에 연결시켜 준다.

X가 예컨대 최종구조의 N-말단에 있는 아세틸인 경우, 이것을 이 마지막 아미노산이 펩티드쇄에 커플링되기전에 첨가해줌으로써 1-위치에서 사용되는 어떤 아미노산이나 D-NAL의 α-아미노기의 X¹보호기로서 사용할 수 있다. 그러나 반응은 예컨대 디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 존재하에 초산과 반응시키거나 또는 무수초산과 반응시키거나 또는 이 분야에 공지된 다른 적당한 방법에 의해 수지상 펩티드와 함께 수행되는 것이 바람직하다(측쇄기가 보호된 채 남아있는 경우 α-아미노기를 탈보호시킨 후 한다).

완전히 보호된 펩티드 중간체가 전통적인 용액 합성법으로부터 얻어지며 이어 이 분야에 공지된 바와 같이 탈보호된다. BHA, MBHA 또는 NAAM 수지로부터 펩티드를 분리하는것 및 펩티드의 탈보호는 측쇄 카복실기에 아실륨 이온의 형성을 촉진시키는 온도 바람직하게는 약 20-25℃에서 적당한 시간 예컨대 약 2-3시간 동안 불화수소산(HF) 또는 그 등가물로 처리해주어 수행한다. HF로 처리하기에 앞서 펩티드에 스캐빈져 역할을 하는 아니솔과 같은 Z' 부류로부터 선택된 바라는 방향족 화합물을 충분히 과량 첨가해준다. 일반적으로 펩티드양의 적어도 20배 몰수에 해당하는 양이 사용된다. 아실륨 이온 존재하에, Z' 부류로부터 선택된 이 첨가된 화합물은 반응하여 지방족-방향족 케톤 측쇄를 생성해내며 그 기전이 문헌에 나타나 있다(solid-Phase Peptide Synthesis, G. Barany ＆ R. Merrifield, p. 192-197). 진공하에 HF를 제거한후, 분리되고 탈보호된 펩티드를 에테르로 편리하게 처리하고 경사분리시키고, 묽은 초산에서 취한후 동결건조시킨다.

이 지점에서 소akd에 따라 펩티드를 예컨대 1N 초산으로 처리하는 등으로 그 무독성염으로 전환시킬 수 있다.

광범위하게, 본 발명은 그 기본쇄의 비말단부분에 글루타민산, 호모글루타민산 또는 아스파트산 잔기를 갖고 있는 약 50개 이하의 잔기로된 펩티드호르몬의 제법을 제공하며 이 잔기의 측쇄는 방향족기로 끝나는 혼합알킬케톤으로 구성되어 있으며 이 방법은 상기한 기본 펩티드쇄가 바라는 위치에 글루타민산, 호모글루타민산 또는 아스파트산 잔기를 함유하며 그 측쇄 카복실기가 Bzl(벤질에스테르), 2,6-디클로로벤질(DCB), 디니트로페닐(Dnp), 1-하이드록시-벤조트리아졸벤질에스테르(OHbt), 8-하이드록시-퀴놀린에스테르(OHq), p-니트로벤질옥시(ONBzl), 페닐아조페닐 및 t-부톡시로 구성된 부류로부터 선택된 보호기에 의해 보호된 펩티드 중간체를 형성한후 ; 이어 상기한 펩티드 중간체를 HF 및 Z'(상기 정의한 바와같음)부류로 부터 선택된 방향족 화합물로, 상기 보호기가 제거되고 방향족 화합물과 반응하는 아실륨이온중간체가 형성되어 혼합알킬 케톤을 형성할 수 있는 조건하에서 처리하고 ; 상기 HF를 제거하고; 상기방향족 케톤측쇄를 포함한 결과로서 문제의 수용기에 대한 결합친화력이 증가된 상기한 바라는 펩티드호르몬을 회수하는 것으로 구성된다.

GnRH 노나펩티드 또는 데카펩티드를 만드는 경우, 잔기는 6-위치에 있게 된다. 좀더 특히, 본 발명은 구조식(I)의 GnRH 길항제 또는 그의 무독성염을 만드는 방법을 제공하며 이 방법은(a) 하기 일반식(II)의 중간체화합물을 생성하고 ; X¹-R₁(W)D-Phe-R₃(X²)-R₄(X³)-R₅(X⁴또는 X⁶)-R₆(X⁵)-R₇-Arg(X⁶)-PrO-X⁷.

상기 식에서 X¹는 수소 또는 α-아미노보호기이며 ; X²는 수소 또는 인돌질소의 보호기이며 ; X³는 수소 또는 Ser의 알콜성 하이드록실기나 측쇄아미노기의 보호기이며 ; X⁴는 수소 또는 Tyr의 페놀성하이드록실기의 보호기이며 ; X⁵는 측쇄 카복실기의 보호기이며 ; X⁶는 수소 또는 측쇄아미노기의 보호기이며 ; X⁷은 Gly-NH-(수지 지지체), D-Ala-NH-(수지 지지체), -N(A)-(수지 지지체), Gly-NH₂, D-Ala-NH₂및 치환아미드(여기서 A는 알킬기를 나타낸다)로 구성된 군으로 부터 선택된다 ; (b)기 X¹-X⁶중 하나 또는 그 이상을 분리시키고/거나 상기 정의한 바와 같은 Z' 부류로 부터 선택된 바라는 화합물과 수지중량의 약 5-15배에 해당하는 양의 HF 또는 그의 등가물로 치리해 줌으로써 X⁷내에 포함된 모든 수지 지지체로 부터 분리한 후, 소망에 따라(c)결과 생성된 펩티드를 그의 무독성염으로 전환시키는 것으로 구성된다. 사용되는 Z'부류로 부터 선택된 화합물의 몰량은 존재하는 합성펩티드 몰량의 적어도 약50배인 것이 바람직하다.

잔기가 약 50개 보다 길지않으며, 비말단 잔기상에 이런 지방족-방향족 케톤측쇄를 함유함으로써 그 결과 문제의 수용체에 대해 증가된 결합친화력을 가진 GnRH 협동제 및 기타 관심의 펩티드호르몬을 만드는데 유사한 방법이 사용될 수 있다.

펩티드의 정제는 CMC 컬럼상 이온교환 크로마토그라피를 한후 뒤이어 세파덱스 G-25로 충전된 컬럼상에서 n-부탄올 ; 0.1N초산(1:1부피비)용출계를 사용하여 qns배 크로마토그라피하거나 HPLC를 사용하여 문헌에 보고된 공지된 방법으로 수행한다(Rivier, J.et al., J.Chromatography, 288(1984) 303-328).

본 발명의 GnRH 길항제는 자성 쥐의 배란을 억제하기 위해 발정전기 정오경에 투여했을 때 체중 kg당 l00μg이하 용량에서 유효하다. 배란을 지속적으로 억제하기 위해선 체중 kge당 약 0.1-2.5mg 범위의 용량을 사용하는 것이 필요할 수 있다. 이들 길항제는 또한 정상 상태에서 웅성 포유류에 투여했을 때 정자 생성을 억제하는데도 효과적이며 따라서 피임제로 사용할 수 있다. 이들 화합물들은 테스트로테론치를 저하시키기 때문에(정상적인 성적으로 활성인 남성에서 바람직하지 못한 결과임), GnRH 길항제와 함께 대체용량의 테스토스테론을 투여하는 것이 타당하다. 이들 길항제는 또한 상기 지적한 바와 같은 다른 목적들을 위해 성선자극호르몬 및 성스테로이드 호르몬 생성을 조절하는 데도 사용될 수 있다.

실시예 Ⅰ

표 1에 표시된 바와 같은 하기 구조식을 갖는 GnRH 길항제는 상기 언급된 고상법에 의해 제조되며 여기서 Z'는 결국 케토측쇄의 바람직한 방향족성분 V가 되는 그런 화합물이다 :

Ac-R₁-(4Cl)D-Phe-R₃-Ser-Tyr-D-Glu(V)-Leu-Arg-Pro-R₁₀.

[표 1]

예시를 목적으로 [Ac-β-D-2NAL¹, (4Cl)D-Phe², D-3PAL³, Arg⁵, D-Glu⁶(C₆H₄OCH₃), D-Ala¹⁰]-GnRH로 표시되는 상기 펩티드 No1 의 대표적인 고상합성법을 이후에 나타냈다. 이 펩티드는 하기 구조식을 갖는다 ;

Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-Arg-D-Glu(C₆H₄OCH₃)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂그밖의 다른 펩티드들이 유사하게 합성되고 정제되었다.

BHA 수지를 사용하고 3배 과량의 Boc 유도체와 DCC를 활성화제로 사용하여 CH₂Cl₂중에서 2시간에 걸쳐 수지에 Boc-보호 D-Ala을 커플링시켰다.

D-알라닌 잔기가 아미드결합에 의해 BHA 수지에 결합된다. 각 아미노산 잔기를 커플링하고, 세척하고, 탈보호한 후, 다음 아미노산 잔기의 커플링을 수지 약 5g을 사용하고 자동기계를 사용하여 하기 스케줄에 따라 수행했다.

단계 13후 만일 합성이 수동적인 것이라면 시료일부를 취해 닌히드린시험을 하여 결과가 음성이면 다음 아미노산의 커플링을 위해 단계 1로 다시 가며 ; 만일 시험결과가 양성 또는 약간 양성이면 단계 9-13과정을 다시 반복해준다.

상기 스케줄은 일반적으로 제1아미노산이 부착된후 본 발명의 펩티드의 각 아미노산을 커플링하는데 사용된다. 합성과정을 통해 나머지 아미노산 각각에 N^αBoc 보호가 사용된다. N^αBoc-β-D-2NAL은 미국특허번호 4,234,571(1980.11.18)에 언급된 바와 같이 이 분야에 공지된 방법에 의해 제조된다. Arg의 측쇄는 Tos로 보호된다. OBzl은 Ser의 하이드록실기의 측쇄 보호기로서 사용되며, Bzl은 D-Glu을 보호하는데 사용된다. D-3PAL온 보호되지 않은채 남는다. N^αBoc-β-D-2NAL은 최종 아미노산으로 도입된다. CH₂Cl₂에 대해 낮은 용해도를 갖는 Boc-Arg(Tos)는 DMF : CH₂Cl₂혼합물을 사용하여 커플링 시킨다.

N-말단에 있는 α-아미노기를 탈보호한후 디클로로메탄중 무수초산 초과량을 사용하여 아세틸화를 수행한다. 수지로 부터 펩티드의 분리 및 측쇄의 완전한 탈보호는 24℃에서 HF를 사용하여 약 2-1/2 시간동안 수행된다. 혼합알킬 케톤을 생성하기 위해 HF로 처리하기 전에 표에 열거된 바와 같은 스캐빈져를 첨가한다. 진공하에서 HF를 제거한 후 수지를 50% 초산으로 추출하고 세액을 동결건조시켜 조제의 펩티드 분말을 얻는다.

CMC 상에서 이온교환 크로마토그라피를 한후(와트만 CM32,50/50 메탄올/물 중 0.05-0.3M NH₄OAc를 사용), 용출계 : n-부탄올 : 0.1N 초산(1:1-부피비)를 사용하여 겔여과 컬럼 중에서 분배 크로마토그라피하여 펩티드의 정제를 수행했다.

펩티드는 역상 고압액체 크로마토그라피와 수성 트리에틸암모늄 포스페이트용액 및 아세토니트릴을 사용하는 것은 물론 T. L.C와 여러 다른 용매계를 사용하여 균일한가 판단한다. 결과 얻어진 정제된 펩티드의 아미노산 분석결과는 준비된 구조의 구조식과 일치했으며 쇄에 있는 각 아미노산은 거의 정수치를 나타낸다.

광전 편광계상에서 측정된 선광도는[α]_D ²²=-28.77°±1(c=1, 50%초산)이었다.

표 1에 열거된 나머지 GnRH 길항제는 상기 언급된 방법 및 적당한 수지를 사용하여 합성했다.

펩티드 각각의 암컷 쥐에서의 배란억제 효과를 결정하기 위해 이를 생체내에서 검사했다. 이 시험에서 숙성한 암컷 스프라기-다우리 쥐 특정수 예컨대 체중 225-250g인 쥐 7마리에 발정전기 정오경에 옥수수유중 펩티드를 일정 μg 피하주사했다. 발정전기는 배란일 오후이다. 펩티드를 투여하지 않는 대조군으로 별도의 암쥐군을 사용했다. 각 대조 암쥐들은 발정전기 저녁에 배란되었으며, 처리된 쥐중 배란된 수를 기록했다. 표 1에 열거된 각 펩티드들은 아주 낮은 용량에서 암쥐의 배란을 억제하는데 아주 효과가 있는 것으로 생각되며, 각 펩티드들은 약 5μg 용량에서 효과가 있는 것으로 생각된다.

실시예 II

하기 구조식을 가진 표 2에 열거된 바와 같은 펩티드를 상기 언급한 고상법으로 제조했으며 이때 V를 얻기 위해 Z'를 사용했다.

Ac-β-D-2NAL-(W)D-Phe-D-Trp-R₄-R₅-R₆(V)-R₇-Arg-Pro-Gly-NH₂

[표 2]

표 2에 명시된 펩티드를 시험관내 및/또는 생체내 시험한 결과 표 2에 열거된 펩티드들은 적당한 농도에서 시험관내에서 GnRH-유발성 LH분비를 억제하는데 효과가 있는 것으로 나타났다. 많은 펩티드들이 본 표준보다 생체내에서 더 역가가 높았다. 모든 펩티드들은 아주 낮은 용량에서 여성포유류의 배란을 억제하는데 유효한 것으로 생각된다.

실시예 III

하기 구조식을 가진 표 3에 열거된 바와 같은 펩티드를 적당한 수지를 사용하여 상기 언급한 고상법으로 제조했으며 이때 V를 얻기 위해 Z'가 사용되었다.

X-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-(1For)D-Trp-Ser-R₅-D-Glu(V)-NML-Arg-Pro-R₁₀

[표 3]

표 3에 명시된 펩티드를 시험관내 및/또는 생체내 시험한 결과 표 3에 열거된 펩티드들은 적당한 농도에서 시험관내에서 GnRH-유발성 LH 분비를 억제하는데 효과가 있는 것으로 나타났다. 많은 펩티드들이 본 표준보다 생체내에서 더 역가가 높았다. 모든 펩티드들이 아주 낮은 용량에서 여성 포유류의 배란을 억제하는데 유효한 것으로 생각된다.

실시예 Ⅳ

하기 구조식을 가진 표 4에 열거된 바와 같은 펩티드를 상기 언급한 고상법으로 제조했으며 이때 Ⅴ를 얻기 위해 Z'을 사용했다.

Ac-R₁-(4F)D-Phe-R₃-Ser-Tyr-R₆(V)-Leu-Arg-Pro-NHCH₂CH₃

[표 4]

표 4에 명시된 펩티드를 시험관내 및/또는 생체내 시험한 결과 표 4에 열거된 펩티드들은 적당한 농도에서 시험관내에서 GnRH-유발성 LH 분비를 억제하는데 효과가 있는 것으로 나타났다. 많은 펩티드들이 본 표준보다 생체내에서 더 역가가 높았다. 모든 펩티드들이 아주 낮은 용량에서 여성포유류의 배란을 억제하는데 유효한 것으로 생각된다.

실시예 Ⅴ

하기 구조식을 가진 표 5에 열거된 바와 같은 펩티드를 상기 언급된 고상법으로 제조했으며 이때 Ⅴ를 생성하기 의해 Z'를 사용했다.

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-R₆(V)-Leu-Arg-Pro-R₁₀

[표 5]

No. 57 펩티드를 합성하기 위해 가교결합된 클로로메틸화 폴리스티렌수지를 4℃에서 2일간 에틸아민과 반응시켜 제조한 N-에틸아민수지를 사용했으며 Boc-보호 Pro를 3배과량의 Boc 유도체와 DCC를 활성화제로 사용하여 CH₂Cl₂중에서 2시간에 걸쳐 수지에 커플링시켰다. 프롤린 잔기는 치환아미드 결합에 의해 NEAM 수지에 부착된다.

각 아미노산잔기를 커플링하고 세척하고 탈보호한 후 다음 아미노산 잔기의 커플링을 약 5g의 수지를 출발물질로 하고 자동화 기계를 사용하여 하기 스케쥴에 따라 수행했다.

보호되지 않은채 남아있는 pGlu를 제외하곤 합성과정에서 나머지 각 아미노산에 N^αBoc 보호를 사용했으며 임의로 Z으로 보호할 수도 있다. Arg의 측쇄는 Tos로 보호했다. Ser의 하이드록실기의 측쇄보호기로는 OBzl을 사용했으며, D-Glu를 보호하기 위해선 Bzl을 사용했다. Trp은 보호되지 않은 채 두었으며 최종 아미노산으로서 pGlu을 도입시켰다. CH₂Cl₂에 대해 낮은 용해도를 갖는 Boc-Arg(Tos)과 Boc-Trp는 DMF : CH₂Cl₂혼합물을 사용하여 커플링시켰다.

N-말단에 있는 α-아미노기를 탈보호한 후 디클로로메탄 중 무수초산 초과량을 사용하여 아세틸화를 수행했다. 수지로 부터 펩티드를 분리시키는 것 및 측쇄의 완전한 탈보호는 24℃에서 HF를 사용하여 약2-1/2 시간동안 수행했다. 표 5에 열거된 바와 같은 화합물 Z'는 혼합 알킬 케톤을 생성하기 위해 대부분의 경우 스캐빈져로 작용하는 HF 처리에 앞서 첨가한다. 감압하에 HF를 제거한 후, 수지를 50% 초산으로 추출하고, 세액을 동결건조시켜 조제의 펩티드 분말을 얻는다.

이어 CMC 상에서 이온 교환 크로마토그라피한 후(왓트만 CM32, 메탄올/물 50/50중 0.05-0.3M NH₄OAc를 사용하여 함) n-부탄올 : 0.1N 초산 용출계(1:1부피비)를 사용하여 겔여과 컬럼중에서 분배 크로마토그라피를 수행한다.

TLC와 각종 다른 용매계를 사용하는 것은 물론 역상고압액체 크로마토그라피와 수성 트리에틸 암모늄 포스페이트 용액 및 아세토니트릴을 사용하여 펩티드가 균질인가 판단한다.

결과 얻어진 정제된 펩티드의 아미노산 분석 결과는 준비된 구조의 구조식과 일치했으며 쇄중에 있는 각 아미노산은 실질적으로 거의 정수치를 나타냈다.

표 5에 열거된 나머지 GnRH 길항제는 상기한 방법 및 적당한 수지를 사용하여 합성했다.

각 펩티드들은 미국 특허번호 제4,382,922호에 언급된 과정을 사용하여 분리된 쥐 뇌하수체 세포의 1차배양액으로 부터 LH 분비를 야기하는 그 효과를 측정하기 위해 시험관내에서 검정했다. 표 5에 열거된 각 펩티드들은 천연 GnRH 보다 아주 유의하게 더 효과가 높은 것으로 생각되며, 각 펩티드들은 조발청춘기, 자궁내막증 또는 월경곤란증을 가진 환자를 처리하고 수태를 조절하는데 적당한 용량에서 아주 효과가있는 것으로 나타났다.

본 발명의 펩티드들은 산부가염 또는 예컨대 아연, 바륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄과의 금속 착염(본 출원에서는 산부가염으로 간주함) 또는 이들 둘의 혼합물과 같은 제약상 허용되는 무독성염 형태로 자주 투여된다. 이런 산부가염에는 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 인산염, 질산염, 옥살산염, 후말산염, 글루콘산염, 탄닌산염, 말레인산염, 초산염, 구연산염, 벤조산염, 석신산염, 알긴산염, 말산염, 아스코르빈산염, 주석산염 같은 것이 있다. 펩티드의 수용액을 예컨대 1N 초산으로 반복처리한 후 동결건조시켜 그 초산염을 얻는다. 만일 활성성분이 정제형태로 투여되는 경우, 정제는 트리가칸트, 옥수수전분 또는 젤라틴 같은 결합제 : 알긴산 같은 붕해제 : 스테아린산마그네슘 같은 윤활제를 포함한 제약상 허용되는 희석제를 함유할 수 있다. 만일 액체 형태 투여가 바람직한 경우, 제약상 허용되는 희석제 일부로서 감미제 및/또는 방향제를 사용할 수 있으며 등장식염수, 인산염 완충용액중에서 정맥내투여가 수행될 수 있다.

약제 조성물은 일반적으로 펩티드와 함께 통상적인 제약상 허용되는 단계를 함유한다. 일반적으로 용량은 정맥내로 투여받는 환자 체중 kg당 펩티드 약 1-100μg이며 ; 경구 용량은 더 높다. 이들 펩티드로 환자를 처리하는 방법은 일반적으로 다른 GnRH 길항제를 사용한 임상처리에서와 같다.

이들 펩티드들은 수정 억제 및/또는 조절을 위해 또 조발청춘기를 치료하기 위해서나 방사선요법 또는 화학요법도중 성선활동을 가역적으로 억제하는 것이 필요한 경우 포유동물에 정맥내, 피하내, 근육내, 경구,경피내 예컨대 비내 또는 질내 투여할 수 있다. 유효용량은 투여형태 및 치료받는 포유류 종류에 따라 달라진다. 대표적인 한 제형의 예는 펩티드를 함유하는 정균수용액으로 이 용액은 체중 kg당 약 0.1-2.5mg 용량으로 투여받는다. 펩티드의 경구투여는 고체 또는 액체 형태로 이루어질 수 있다.

비록 본 발명은 그 바람직한 구체예에 대해 설명하였으나, 이 분야의 보통 기술을 가진자에게 명백한 변경 및 수정이 첨부된 청구범위에 열거된 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 예컨대 펩티드의 유효성을 유의하게 감소시키지 않는 이 분야에 공지된 다른 치환이 본 발명의 펩티드에서 사용될 수 있다. 예컨대 R₁₀으로 명시된 잔기 대신 Sar-NH₂(Sar=살코신)을 사용할 수 있으며, 또 NH-Y가 존재할 수 있으며 이때 Y는 저급알킬, 사이클로알킬, 플루오로 저급알킬 또는 NHCONHQ(여기서 Q는 H 또는 저급알킬임)이며, 상기한 모든 것은 등가인 것으로 생각된다. 1-위치에 있는 D-Phe는 2-위치 치환에서 명시한 바와 같이 임의로 할로겐화될 수 있다. 부류 Z'을 구성하는 것으로 열거된 화합물외에 또 다른 등가의 방향족 화합물이 문헌에 나타나 있다(Vo1 3, Aromatic Ketone Synthesis, Peter H.Gore, 1963) Met, Cys, Phe, Tyr 및 Trp 같은 다른 등가의 잔기가 앞서 7-위치에서 명시되었던 것들대신 사용될 수 있다.

본 발명의 특징적인 면들을 하기 청구범위에 강조해 놓았다.

Claims (19)

1. GnRH 유사체 펩티드의 기본쇄중 6-위치에 D-글루타민산, D-호모글루타민산 또는 D-아스파트산을 갖으며, 상기 GnRH 유사체 펩티드의 측쇄 잔기가 방향족기에서 끝나는 혼합 알킬 케톤으로 구성되어 있는 GnRH 유사체 펩티드의 제조 방법에 있어서, 그 방법이 상기 펩티드 기본쇄가 6-위치에 D-글루타민산, D-호모글루타민산 또는 D-아스파트산을 포함하고 측쇄 카르복실기가 벤질 에스테르, 2,6-디클로로벤질, 디니트로페닐, 1-하이드록시-벤조트리아졸 벤질에스테르, 8-하이드록시-퀴놀린에스테르, p-니트로벤질옥시, 페닐아조페닐 및 3급 부톡시로 이루어진 군으로부터 선택된 보호기로 보호된 노나펩티드 또는 데카펩티드 중간체를 형성하고 ; 상기 펩티드 중간체를 HF 및 하기정의된 Z' 부류로부터 선택된 방향족 화합물로, 상기 보호기가 제거되고 상기 방향족 화합물과 반응하여 그와 함께 혼합 알킬 케톤을 형성하는 아실륨 이온 중간체가 형성될 수 있는 조건하에서 처리시키고 ; 상기 HF를 제거하고 상기 바라는GnRH 유사체 펩티드를 회수하는 것으로 구성된 GnRH 유사체 펩티드의 제조방법 : 여기서 Z'부류는 에틸벤젠, 프로필벤젠, 이소프로필벤젠, 부틸벤젠, s-부틸벤젠, 이소부틸벤젠, t-부틸벤젠, 아밀벤젠, 1-메틸부틸벤젠, 1-에틸프로필벤젠, 3-메틸부틸벤젠, 1,1-디메틸프로필벤젠, 헥실벤젠, 헵틸벤젠, 2-에틸헥실벤젠, 옥틸벤젠, 노닐벤젠, 데실벤젠, 도데실벤젠, 테트라데실벤젠, 헥사데실벤젠, 옥타데실벤젠, 사이클로프로필벤젠, 사이클로펜틸벤젠, 사이클로헥실벤젠, (4-아실옥시사이클로헥실)-벤젠, 3-메틸-5-페닐-사이클로헥스-2-에논, o-크실렌, m-크실렌, p-크실렌, m-에틸톨루엔, p-에틸톨루엔, o-프로필톨루엔, m-프로필톨루엔, m-시멘, p-프로필톨루엔, p-시멘, m-s-부틸톨루엔, p-s-부틸톨루엔, m-t-부틸톨루엔, p-도데실톨루엔, p-디에틸벤젠, m-t-부틸에틸벤젠, p-t-부틸에틸벤젠, m-디이소프로필벤젠, p-디이소프로필벤젠, p-디부틸벤젠, p-디-s-부틸벤젠, p-디-t-부틸벤젠, p-디-(1-메틸부틸)벤젠, 인단(인단 또는 히드린덴), 5-메틸인단, 6-t-부틸인단, 2-벤질인단, 디알킬인단, 트리알킬인단, 테트라알킬인단, 펜타알킬인단, 헥사알킬인단, 헵타알킬인단, 1 -카보에톡시인단, 테트랄린, 6-메틸테르랄린, 6-에틸테르랄린, 6-부틸테트랄린, 6-헥실테트랄린, 6-사이클로헥실테트랄린, 디알킬테트랄린, 테트라알킬테트랄린, 펜타알킬 테트랄린, 7-에틸-1-카보에톡시메틸테트랄린, 2-페닐테트랄린, 헤미멜리텐, 슈도쿠멘, 메시틸렌, 프레흐니텐, 이소듀렌, 듀렌, 펜타메틸벤젠, 에틸-1,4-크실렌, 4-에틸-1,3-크실렌, 2-프로필-1,4-크실렌, 2-이소프로필-1,4-크실렌, 4-프로필-1,2,-크실렌, 4-프로필-1,3-크실렌, 2-이소부틸-1,4-크실렌, 5-6-부틸-1,3-크실렌, 2-t-아밀-4-이소프로필톨루엔, 트리알킬벤젠, 4-벤젠-1,3-크실렌, 3,4,5,11-테트라하이드로아세나프텐, 에틸메시틸렌, 히드린다센, 하이드로페난트렌, 펜타알킬벤젠, 하이드로피렌, 하이드로안트라센, 디페닐메탄, 디페닐프로판, 비벤질, 3,4-디페닐헥산, α,W-디페닐알칸, 트리페닐메탄, 파라사이클로판, 페닐에틸렌, 찰콘, 포름아미도톨루엔, 페닐아세트산, 알킬페닐아세테이트, 페닐아세토니트릴, 데스옥시벤조인, 1-페닐-2-니트로에탄, 1-페닐-2-아세트아미도 에탄, 알킬 3-페닐프로피오네이트, 3-페닐프로피오니트릴, 페닐벤조일알칸, 페닐클로로알칸, 페닐니트로알칸, 알킬페닐부티레이트, 할로알킬벤젠, 페놀, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐벤조에이트, 알킬페놀, 할로페놀. 카테콜, 레소르시놀, 알킬 레소르시놀, 피로갈롤, 프롤로 글루시놀, 트리하이드록시톨루엔, 트리하이드록시이소아밀벤젠, 이니솔, 페네톨, 알킬페닐에테르, 알킬톨릴에테르, 에틸아니솔, p-t-부틸아니솔, m-헵틸아니솔, p-사이 클로헥실아니솔, 아니실헥산, 디메틸아니솔, 2-에틸-4-메틸아니솔, 5-메톡시테트 랄린, 이소프로필메틸아니솔, 하이드로페난트렌, 트리알킬아니솔, 플루오로아니솔, 클로로아니솔, 클로로페네톨, 브로모아니솔, 브로모페네톨, 요도아니솔, 알킬할로아니솔,디알킬할로 아니솔, 디할로 아니솔, 디알콕시할로 아니솔, 구아이아콜, 레소르시놀모노메틸에테르, 하이드로퀴논모노메틸에테르, 알킬하이드록시아니솔, 2가 페놀성디메틸에테르, 다가페놀성메틸 에테르, 디페닐에테르, 알킬디페닐에테르, 클로로디페닐에테르, 알콕시디페닐에테르, 디알킬디페닐에테르, 니트로페닐에테르, 티오아니솔, 티오페네톨, 알킬페닐설파이드, o-톨릴티오에테르, 알킬티오아니솔, 클로로티오아니솔, 디페닐설파이드, 니트로디페닐설파이드, 2-티오클레졸, 3-메톡시티오페놀, 3-에톡시티오페놀, 디페닐디설파이드, 아세트아닐리드(AA), 알킬 AA, 디알킬 AA, 아세트아미도인단, 아세트아미도테트랄린, 트리메틸 AA, 클로로 AA, 클로로-4-메틸 AA, 알콕시 AA, N, N-디아실아닐린, 니트로브로모벤젠, 니트로페놀, 니트로아니솔, 니트로페네톨, 하이드록시-3-니트로톨루엔, 니트로레소르시놀, 니트로아니솔, 하이드록시-4-니트로아니솔, 벤조산, m-톨루산, 살리실산, 알킬살리실레이트, 알킬알콕시벤조에이트, 알킬하이드록시벤조에이트, 디메틸아세토페논, 트리메틸아세토페논, 트리메틸프로피오페논, 메톡시아세토페논, 디하이드록시아세토페논, 디하이드록시프로피오페논, 벤조페논, 디메틸벤조페논, 디하이드록시벤조페논, 비페닐(BP), 알킬 BPs, 디알킬 BPs, 9,10-디하이드로 페난트렌, 클로로 BP, 브로모 BP, 하이드록시 BP, 메톡시 BP, 메톡시-클로로 BP, 아세틸 BP, 니트로 BP, 클로로아세틸 BP, 디페닐벤젠, 1,4-터펜일, 1,3,5-트리페닐벤젠, 플루오렌(F), 벤젠 F, 메톡시 F, 카보메톡시 F, 벤조일 F, 나프탈렌, 알킬나프탈렌, 할로나프탈렌, 나프톨, 알킬나프톨에테르, 2-나프틸메틸설파이드, 나프토설톤, 1,8-나프토설탐, 나프탈렌카복실산, 안트라센, 알킬안트라센, 할로안트라센, 알킬할로안트라센, 알킬알콕시안트라센, 안트로페논, 9,9-비안트릴, 페난트렌(P), 알킬 P, 할로 P, 알콕시 P, 아세톡시 P, 하이드록시 P, 3-아세트 아미노 P, 피렌, 2-메틸피렌, 1-벤조일피렌 크리센, 2-에틸크리센, 6-벤질크리센, 트리페닐렌, 페릴렌, 플루오로안텐, 비페닐렌, 푸란, 알킬푸란, 벤조푸란(BF), 메틸 BF, 에틸 BF, 프로필 BF, 벤질 BF, 페닐 BF, 아니실 BF, 디하이드로 벤조푸란, 디벤조푸란(DBF), 에틸 DBF, 프로필 DBF, 브로모 DBF, 메톡시 DBF, 니트로 DBF, 크산텐, 1-하이드록시-9-옥소크산텐, 티오펜, 알킬티오펜, 디알킬티오펜, 트리알킬티오펜, 2-벤질티오펜, 할로티오펜, 디할로티오펜, 트리할로티오펜, 알킬할로티오펜, 할로페닐티오펜, 메틸페닐티오펜, 디티에닐, 디메틸디티에닐, 터티에닐, 벤조[b] 티오펜(BT), 메틸 BT, 메톡시 BT, 디벤조티오펜, 알킬피롤, 디알킬피롤, 트리알킬피롤, 디알킬-카보메톡시피롤, 인돌, 2-메틸인돌,3-메틸인돌, 1,2-디메틸인돌, 1,2,3-트리메틸인돌, 2,3,4,6-테트라메틸인돌, 2-페닐인돌, 2,3-디메틸-1-아세틸인돌, 테트라하이드로카바졸(THC), 9-아세틸 THC, 9-벤조일 THC, 6-할로-9-아세틸 THC, 카바졸, 아세틸카바졸, 알킬카바졸, 할로알킬카바졸, 벤조일카바졸, 아세틸인돌린, 1-아실-2,3-디메틸-인돌린, 헥사하이드로카바졸, 페닐피라졸, 페닐알킬피라졸, 1-페닐-3-피라졸린-5-온(PP), 알킬 PP, 디알킬 PP, 2-아미다졸론(IA), 4-메틸 IA, 2-옥소-2,3-디하이드로벤즈이미다졸, 이미다조[1,5-a] 피리딘(IP), 메틸 IP, 5,7-디메틸퀴놀린, 하이드록시퀴놀린, 메톡시퀴놀린, 2-메틸하이드록시퀴놀린, 아실테트라하이드로퀴놀린, 아크리단, l0-아세틸아크리단, 2-하이드록시-4-메틸티아졸, 10-에틸펜옥사진, 10-아세틸펜옥사진, 페노피아진(PT), 10-알킬 PT, 3,10-디메틸 PT, 10-아실 PT, 1,2-벤즈이속사졸(BIO), 3-메틸 BIO, 7-메톡시 BIO 및 3-페닐-7-메톡시 BIO이다.
2. 제1항에 있어서, 하기 구조를 가진 GnRH 길항제 펩티드를 제조하는 방법.

   X-R₂-(W)D-Phe-R₃-R₄-R₅-R₆(V)-R₇-Arg-Pro-R₁₀

   상기 구조에서, X는 수소 또는 C_1-7의 아실기이며 ; R₁은 디하이드로 -Pro, Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp 또는 β-D-NAL이며 ; W는 F, Cl,Cl₂, Br, N0₂또는 C^αMe/Cl이며 ; R₃는 D-Trp, D-3PAL, (NⁱⁿFor) D-Trp 또는 5- 또는 6-위치가 NO₂; NH₂, OCH₃, F, Cl, Br 또는 CH₃에 의해 치환된 D-Trp이며 ; R₄는 Ser, Orn, AAL 또는 aBu이며 ; R₅는 Tyr, Arg, (3F)Phe, (2F)Phe, (3I)Tyr, (3CH₃)Phe, (2CH₃)Phe, (3C1)Phe 또는 (2Cl)Phe이며 ; R₆는 D-Clu, D-Hgl 또는 D-Asp이며 ; R₇은 Leu, NML, Nle 또는 Nva이며 ; R₁₀은 Gly-NH₂, D-Ala-NH₂또는 NH-Y이며 여기서 Y는 저급알킬, 사이클로알킬, 플루오로저급알킬 또는 NHCONHQ이며 (Q는 H 또는 저급알킬임) ; V는 R₆의 카복실기측쇄와 제1항에 정의된 Z' 부류로부터 선택된 화합물로부터 생성된 케톤의 방향족 부분이다.
3. 제2항에 있어서, R₆가 D-Glu인 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, V가 C₆H₄OCH₃인 방법.
5. 제2항에 있어서 R₆가 D-Hgl이며 V가 C₆H₄OCH₃인 방법.
6. 제2항에 있어서 하기 구조를 가진 펩티드를 제조하는 방법.

   Ac-β-D-2NAL-(4C1)D-Phe-D-3PAL-Ser-Arg-D-Glu(C₆H₄OCH₃)-Leu-Arg-Pro-D-Ala- NH₂.
7. 제2항에 있어서 하기 구조를 가진 펩티드를 제조하는 방법.

   Ac-디하이드로 Pro-(4F)D-Phe-β-D-2NAL-Ser-Tyr-D-Glu(C₆H₄OCH₃)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_{2 .}
8. 제1항에 있어서 하기 구조를 가진 GnRH 길항제 헵티드를 제조하는 방법.

   R₁His-Trp-Ser-Tyr-R₆(V)-Leu-Arg-Pro-R₁₀

   상기 구조에서, R₁은 pGlu 또는 포르밀 Pro이며, R₆는 D-Glu, D-Hgl 또는 D-Asp이며 ; R₁₀은 Gly-NH₂, D-Ala-NH₂또는 NH-Y이며, 여기서 Y는 저급알킬 또는 플루오로저급알킬이며 ; V는 상기 제l항에서 정의된 Z' 부류로부터 선택된 화합물로부터 생성된 화합물로부터 생성된 케톤의 방향족 부분이다.
9. 제1항에 있어서 상기 펩티드가 하기 구조식을 갖는 방법.

   pGlu-Hls-Trp-Ser-Tyr-D-Glu(C₆H₄OCH₃)-Leu-Arg-Pro-Gly-NHCH₂CH₃.
10. 제1항에 있어서 상기 처리가 약 20℃ 또는 그 이상의 온도에서 수행되는 방법.
11. 하기 구조를 가진 펩티드 또는 그의 무독성염.

    X -R₁-R₂-R₃-R₄-R₅-R₆(V)-R₇-Arg-Pro-R₁₀

    상기 구조에서, X는 수소 또는 C_1-7의 아실기이며 ; R₁은 pGlu, 디하이드로-Pro, Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp 또는 β-D-NAL이며 ; R₂는 (W)D-Phe 또는 His이며 ; W는 F,Cl,Cl₂,Br,NO₂또는 C^αMe/Cl이며 ; R₃는 Trp, D-Trp, D-PAL, (NⁱⁿFor)D-Trp 또는 5- 또는 6-위치가 NO₂, NH₂, OCH₃, F, Cl, Br 또는 CH₃에 의해 치환된 D-Trp이며 ; R₄는 Ser, Orn, AAL 또는 aBu이며 ; R₅는 Tyr, Arg, (3F)Phe, (2F)Phe, (3I)Tyr, (3CH₃)Phe, (2CH₃)Phe, (3Cl)Ph 또는 (2Cl)Phe이며 ; R₆는 D-Glu, D-Hgl 또는 D-Asp이며 ; R₇는 Leu, NML, Nle 또는 Nva이며 ; R₁₀은 Gly-NH₂, D-Ala-NH₂또는 NH-Y이며 여기서 Y는 저급알킬, 사이클로알킬, 플루오로저급알킬 또는 NHCONHQ이며(Q는 H 또는 저급알킬임) ; V는 R₆의 카복실기측쇄와 제1항에 정의된 Z' 부류로부터 선택된 화합물로부터 생성된 케톤의 방향족잔기 부분이다.
12. 제11항에 있어서, R₁이 디하이드로-Pro, Pro, D-pGlu, D-Phe, D-Trp 또는 β-D-NAL이며 ; R₂는 (W)D-Phe이며 R₃는 D-Trp, D-3PAL, (NⁱⁿFor)D-Trp 또는 5- 또는 6-위치가 NO₂, NH₂, OCH₃, F, Cl, Br 또는 CH₃에 의해 치환된 D-Trp인 GnRH 길항제펩티드 또는 그의 무독성염.
13. 제12항에 있어서, R₆가 D-Glu인 펩티드.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, V가 C₆H₄OCH₃인 펩티드.
15. 제12항에 있어서, R₆가 D-Hgl이며 V가 C₆H₄OCH₃인 펩티드.
16. 제12항에 있어서, 하기 구조를 가진 펩티드.

    Ac-β-D-2NAL-(4Cl)D-Phe-D-3PAL-Ser-Arg-D-Glu(C₆H₄OCH₃)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂.
17. 제12항에 있어서, 하기 구조를 가진 펩티드.

    Ac-디하이드로 Pro-(4F)D-Phe-β-D-2NAL-Ser-Tyr-D-Glu(C₆H₄OCH₃)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂.
18. 제11항에 있어서, 하기 구조를 가진 GnRH 길항제 펩티드 또는 그의 무독성염.

    R₁-His-Trp-Ser-Tyr-R₆(V)-Leu-Arg-Pro-R₁₀

    상기 구조에서, R₁은 pGlu 또는 포르밀 Pro이며 R₆및 R₁₀은 제l1항에서 정의한 바와 같다.
19. 제11항에 있어서 하기 구조식을 갖는 펩티드.

    pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu(C₆H₄OCH₃)-Leu-Arg-Pro-Gly-NHCH₂CH₃.