KR900003881B1 - 포유동물의 콜라게나제 및 엘라스타제 억제제 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Description

포유동물의 콜라게나제 및 엘라스타제 억제제 및 이의 제조방법

본 발명은 포유 동물에 있어서 콜라게나제(Colla genase) 및 엘라스타제(Elastase) 억제제로서 작용하는 하기 일반식(I)의 신규한 화합물 및 약리학적으로 허용되는 이의 염에 관한 것이다.

상기식에서, R₁은 수소, 할로, 니트로, 아미노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트리플루오로메틸 또는 하이드록시이고 ; R₂는 할로, 저급 알킬, 저급 알콕시, 아미노, 니트로 또는 트리플루오로메틸이다.

콜라겐은 각막, 피부, 위장의 내장(Gastrointestinal viscera), 관절점막 및 그밖의 신체부위에서 발견되는 표면조직의 주된 유기 성분이다. 콜라겐 분자의 분자량은 300,000이며 코일화된 사슬을 형성하면서 하나의 공동축 주위를 감고 있는 세개의 나선형 폴리펩티드 사슬로 이루어져 있다. 액상에서, 콜라겐 분자는 약 300×15A의 긴 막대형태로 존재하지만, 37℃의 온도와 pH 7에서 이 분자들은 불용성 섬유로 중합된다. 따라서, 콜라겐은 조직내에 섬유로 존재하며 이 형태는 불변성이다. 비변성 콜라겐의 나선헝 구조는 단백질분해효소의 공격에 대해 내성이 현저하지만, 다수의 천연효소, 즉 콜라겐 분자의 나선형 골격을 가로질러 3/4과 1/4 길이의 단편들이 수득되도록 콜라겐 분자를 분리시킴으로써 콜라겐을 파괴할 수 있는 동물성 콜라게나제들이 발견되었다.

이와 유사하게 엘라스틴(Elastin)은 특히 관절부, 척추의 인대, 대동맥의 벽 및 폐의 결합 조직내에서 발견되는 결합 조직내의 탄력섬유(Elastic fiber)를 이루는 주된 성분이다. 엘라스틴의 중합성 구조는 글리신, 알라닌 및 발린 잔기를 다량 포함하며 이의 탄력성은 이의 구조의 아미노산의 가교결합에 의해 획득된다. 엘라스틴은 지방족 아미노산 잔기의 N-말단 펩티드 결합으로 단백질을 가수분해할 수 있는 프로테아제 엘라스타제(Protease elastase)에 의해 파괴된다.

콜라게나제와 콜라겐을 기본으로 하는 조직의 파괴와의 관계는 신체의 여러 부위(이들은 모두 콜라겐이 주된 유기 성분을 구성하고 있다는 점에서 기본적으로 유사하다), 즉 피부, 각막, 위장의 내장 및 관절점막 등에 영향을 미치는 많은 질병상태에서 발견된다. 예를들면, 각막 조직에 관하여 콜라게나제는 눈이 알칼리에 의해 화상을 입은 후에 나타나는 궤양의 원인임이 밝혀졌다. 유사하게, 상기 관계는 기타 각막의 궤양상태[예 : 바이러스성 궤양(예 : 단순 포진 또는 왁지니아중등), 박테리아성 궤양(예 : 슈도모나스 등), 변성궤양 및 병인이 알려져 있지 않은 궤양(예 : 류머티스성 관절염과 연관된 궤양), 모어궤양 및 구궤양 ; 및 건조되는 2차 궤양(예 : 다형성 홍진, Stevens-Johnson Syndrome)]에 존재한다.

포유동물에 있어서, 콜라게나제는 류머티스성 관절염의 연골 및 관절 파괴시에 작용하는 주효소중의 하나이다[참조 : Arthritis and Rhematism, 20(6) : 1231(1977)]. 또한, 최근 연구 결과는 문헌에 기술되어 있고 이는 엘라스타제와 콜라게나제 효소의 결합작용을 통해 인체의 관절 연골을 파괴시킨다는 결론을 지지한다[참조 : Pharmacology International, 2, p.11-16(1982)]. 엘라스타제는 콜라겐 가교결합과 함께 콜라겐위의 콜라게나제의 작용에 장벽을 제공하는 단백성 글리칸을 분해시킨다. 또한, 엘라스타제는 콜라겐을 용해시켜 콜라겐 섬유의 가교결합 부위를 제거하고 콜라겐이 엘라스타제와 콜라게나제에 의해 보다 완전히 분해되게 한다. 따라서, 엘라스타제와 콜라게나제는 류머티스성 관절염에서 발견되는 관절 연골 파괴시에 주요인으로 작용한다.

또한, 포유동물의 콜라게나제의 작용은 포유동물의 다른 여러 질병의 발병요인으로 포함되었다. 이러한 질환에는 치근막성 질환, 침입성 종양 및 표피 수포증이 포함된다[참조 : American Journal of Pathology, 92(2) : 509(1978) 및 The New England Journal of Medicine, 291(13) : 652(1974))].

마찬가지로, 포유동물의 엘라스타제의 작용은 기타 질병상태에서 발병요인으로 측정되었다. 따라서, 기종의 질병과정의 첫번째 단계는 폐 엘라스틴이 작은 펩티드류로 파괴되는 것으로 알려져 있다. 엘라스타제에 의해 폐 접합조직 엘라스틴이 방해받지 않고 파괴됨으로써 원심성 공극을 확대시키고 치조세포벽을 파괴시킨다. 건강한 폐는 천연적으로 생성되는 엘라스타제 억제제인 정상 농도의 α₁-안티트립신에 의해 엘라스틴의 파괴로부터 보호된다. 기종으로 고통받는 개인에게 일어나는 바와같이 α₁-안티트립신의 농도가 약 80mg/dL 이하로 떨어지는 경우, 엘라스타제는 폐를 파괴하기 시작한다. 따라서, 기종의 치료시에 내생 α₁-안티트립신의 저농도를 보충하기 위하여 엘라스타제 억제제를 외생 투여하는 것이 지적되어 있다[참조 : Journal of the American Medical Association 249(22), 3007(1983) ].

따라서, 콜라게나제/엘라스타제 억제제는 주로 콜라겐-및 엘라스틴-함유 접합조직을 파괴하는 질환(예 : 치근막성 질환, 류머티스성 관절염, 기종 및 각막궤양 등)을 예방하기 위하여 바람직하게 사용될 수 있다. 또한, 본원에는 콜라겐이나 엘라스틴-함유 조직이 엘라스타제 및 콜라게나제에 의해 파괴되는 질환상태로 고통받는 포유동물에게 하기 일반식(I)의 엘라스타제/콜라게나제 억제제 및 약리학적으로 허용되는이의 염을 엘라스타제/콜라게나제로 유발된 콜라겐의 파괴를 억제시키기에 충분한 양으로 투여함을 특징으로 하여, 포유동물의 콜라게나제/엘라스타제를 억제하는 방법이 기술되어 있다.

상기식에서, R₁는 수소, 할로, 니트로, 아미노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트리플루오로메틸 또는 하이드록시이고 ; R₂는 할로, 저급 알킬, 저급 알콕시, 아미노, 니트로 또는 트리플루오로메틸이다.

본원에서 사용하는 "저급 알킬"이란 용어는 탄소수 1 내지 약 6의 직쇄 또는 측쇄 탄화수소 라디칼을 의미하여, "저급 알콕시"란 용어는 탄화수소 부위가 탄소원자를 1 내지 약 6개 갖는 라디칼을 나타낸다.

본원에서 사용하는 "할로"라는 용어는 불소, 염소 및 브롬 라디칼을 의미한다.

"약리학적으로 허용되는 염"이란 용어에는 약리학적으로 허용되는 유기 및 무기산(예 : 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 메탄설폰산 및 벤젠설폰산 등)의 염, 알칼리 금속 카복실레이트, 및 암모니아 또는 염기성아민으로부터 유도된 약리학적으로 허용되는 양이온의 카복실레이트가 포함된다.

본 발명의 화합물은 가장 통상적으로 미합중국 특허 제 4,275,065호에 기술되어 있는 하기 일반식(II)의 트리사이클릭 메소이온성 디데히드로 화합물을 적합한 친핵성 반응물과 반응시켜 제조한다. 말단 트리아졸환의 개환을 포함하는 본 반응은 하기와 같다 :

상기식에서, R₁및 R₂는 상기에서 정의한 바와같다. 상기 반응은 적합한 유기용매(예 : 메틸렌 클로라이드)의 존재하에 실온 및 환류조건하의 온도범위내에서 수행한다.

"약리학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 약리학적 목적용 경구 단위 용량의 고체를 제형화하는데 사용되는 통상적인 물질이 포함되며 가장 광범위하게는 동물사료가 포함된다. 또한 여기에는 투여하기 전에 재생시키거나 직접 투여하는 경구 및 주입용 현탁액 및 용액을 단위 용량이나 다중 용량 형태로 제형화하는데 사용되는 것이 포함된다.

본 발명에 따라 투여하기 위한 용량을 제형화하기 위하여, 일반식(I)의 화합물을 정제 및 캅셀 등의 경구투여 형태로 합성할 수도 있다. 이는 본 화합물을 통상적인 담체(예 : 탄산마그네슘, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당, 락토오즈, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸 셀룰로오즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로오즈, 저용융왁스 및 코코아 버터 등)와 혼합하여 수행한다. 희석제, 풍미제, 안정화제, 윤화제,현탁제, 결합제 및 정제-붕해제 등을 사용할 수 있다. 활성 성분은 담체를 사용하거나 사용하지 않으면서 봉입할 수 있다. 또한, 화합물은, 예를들면, 등장용액으로 만들기에 충분한 양의 식염수 또는 글루코오즈 등의 다른 용질을 함유하는 멸균용액의 형태로 사용할 경우에 비경구적 주입할 수도 있다. 모든 경우에 있어서, 고체 및 액체 조성물중의 활성 성분의 비율은 적어도 경구 또는 비경구 투여시에 콜라게나제 억제활성을 나타내기에 충분한 양이다.

본 발명의 방법을 수행함에 있어서, 본 발명의 조성물은 각종 용량 형태로, 단독으로 또는 약리학적으로 유효한 담체와의 혼합물 형태로, 바람직하게는 온혈동물에게 경구 또는 주사 투여할 수 있다. 필요한 투여량은 사용한 특정 조성물, 투여경로, 증상의 중중도 및 치료받는 특정 대상에 따라 변한다. 치료는 일반적으로 화합물의 최적 용량 미만의 적은 용량으르 개시한다. 그후, 투여용량을 이러한 상황하에 최적 효과를 도달할 때까지 증가시킨다. 일반적으로, 본 발명의 화합물은 유해하거나 해로운 부작용이 일어나지 않고 일반적으로 유효한 결과를 제공하는 농도 수준으로 투여하는 것이 가장 바람직하다. 큰 동물(체중 약 70kg)의 경우, 1일 주사 투여용량은 약 25 내지 약 50mg이고, 1일 경구 투여용량은 약 50 내지 200mg, 바람직하게는 약 50 내지 100mg이며, 이 용량은 1회 단위 용량으로 투여하거나 필요한 경우, 하루를 편리한 시간간격으로 나누어 편리한 횟수로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물의 활성은 배양액내에서 정상 인체의 류코사이트나 정상 인체의 결합조직형성 세포에 의해 생성되는 콜라게나제를 사용하는 효소분석법과 인체의 류코사이트 엘라스타제를 사용하는 효소분석법으로 시험함으로써 입증된다.

하기 실시예는 본 발명에서 사용되는 화합물의 제조방법과 시험에 관해 기술한 것이다.

[실시예 1]

N-[[(5-클로로-2-벤조티아졸일)티오]페닐아세틸]-L-시스테인

A. α-(5-클로로벤조티아졸-2-일티오)벤젠 아세트산

5-클로로-2-머캅토벤조티아졸 50.0g(0.248몰)과α-브로모페닐아세트산 53.0g(0.248몰)을 아세톤 1.5ℓ에 용해시키고, 당해 용액을 빙초산 50ml의 존재하에 4시간동안 가열한다. 당해 용액을 농축시켜 더 적은 용적(약 200ml)으로 만들고 잔류 고체(90g)를 모은다.

생성된 염을 물 1ℓ에 현탁시키고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반한다. 수집된 고체를 아세토니트릴 2.5ℓ로부터 재결정화하여 융점이 190 내지 192℃인 표제 화합물을 총 64g(수율 : 85%) 수득한다.

C₁₅H₁₀ClNO₂S₂에 대한 원소분석 :

계산치 : C ; 53, 64, H ; 3.00 ; H ; 4.17

실측치 : C ; 53.83 ; H ; 3.13, N ; 4.13

B. 6-클로로-2-페닐티아졸로[2,3-벤조티아졸-3(2H)-온 메소이온성 디데히드로 유도체

상기 A화합물 31g(0.092몰)을 메틸렌 클로라이드에 3.5ℓ에 현탁시키고, 당해 혼합물을 아세트산 무수물25ml의 존재하에 서서히 환류가열시킨다. 고체가 점차로 용해되면서 용액이 적색으로 변한다. 밤새 가열한다음, 용액을 여과하고 200ml로 농축시킨다. 그 결과, 융점이 215 내지 216℃인 잔류 오렌지색 고체를 29.5g(정량적 수득량) 수득한다.

C. N-[[(5-클로로-2-벤조티아졸일)티오]페닐-아세틸-L-시스테인

상기 B화합물 6.36g(0.02몰), L-(-)-시스테인 2.4g(0.02몰) 및 트리에틸아민 2.5g(0.025몰)을 메틸렌 클로라이드 800ml에 현탁시키고, 당해 혼합물을 56시간 동안 가열한다. 약간의 불용성 물질을 여과하고, 여액을 묽은 염산 용액으로 세척한 다음, 무수 황산 마그네슘으로 건조시킨다. 용매를 제거한 후, 오일상 잔류물을 에테르로 연마하고, 고체를 수집한다. 에테르 용액을 방치시키면 고체가 추가로 수득된다. 혼합된 고체상을 아세토니트릴로 부터 재결정화하여 융점이 155 내지 158℃인 표제 화합물을 1.5g(수율 : 17%)을 수득한다.

C₁₈H₁₅CIN₂O₃S₃에 대한 원소분석 :

계산치 : C ; 49.25, H ; 3.44, H ; 6.38

실측치 : C ; 49,36, H ; 3.45, N ; 6.0

[실시예 2]

화합물 N-[[(5-클로로-2-벤조티아졸일)티오-페닐아세틸-L-시스테인을 문헌에 기술되어 있는 방법으로 시험관내 분석법으로 콜라게나제 억제시험을 수행한다 [참조 : A.Sellers와 J.J.Reynolds, Biochem.J., 167(1977) pp.353-60].

세포배양으로 정상 인체의 류코사이트 또는 정상 인체의 피부 결합조직형성 세포에 의해 생성된 콜라게나제를 콜라겐 세파로즈 4B 컬럼 위에 흡수시킴으로써 정제한다. 분석에 사용하기 전에 효소원을 트립신으로 활성화시키는 한편, 트립신을 차례로 과량의 대두 트립신 억제제를 사용하여 불활성화시킨다.

분석방법에 따라, 콜라겐(¹⁴C-아세틸화 콜라겐-0.01% 아세트산중 2mg/ml) 25μ, 0.15M 트리스/0.015M CaCl₂(pH 7.4)25㎕, 트리스 완충액(0.05M 트리스/0.005M CaCl₂, pH 7.4)중의 콜라게나제 75㎕ 및 당해 트리스 완충액중의 콜라게나제 억제제 25㎕를 함유하고 총 용적이 약 150㎕인 용액을 함유하는 마이크로퓨즈 튜브(Microfuge tube)를 제조한다. 샘플과 대조물질을 효소의 효능에 따라 35℃에서 1시간 내지 5시간동안 배양시킨다. 반응이 끝날 무렵, 튜브를 벡크만 마이크로퓨즈(Beckman Microfuge)내에서 회전시킨다. 각 튜브의 25㎕ 분취액을 실틸레이션 계수기내에서 분석한다. 이러한 상태하에서 천연 콜라겐은 불용성 섬유를 형성하기 때문에, 상등액중에서 검출되는 방사능으로 콜라겐의 가수분해도를 측정한다.

일련의 실험에 있어서, 실시예 1의 화합물을 이의 콜라게나제 억제 활성을 측정하기 위한 분석방법으로 시험한다. 첫번째 실험에서 콜라겐 I (피부에서 발견되는 콜라겐의 가장 주된 형태)을 기질로 사용한다. 두번째 실험에서는 콜라겐 Ⅱ (연골내에서 발견된다)를 기질로 사용한다. 그 결과를 요약하면 하기와 같다.

실험번호 IC₅₀μM

1 5.7

2 12.5

상기 결과는 시험한 화합물이 콜라게나제의 효능 억제제이며 이의 억제 활성을 상이한 콜라겐 기질로 시험한 경우에도 중요한 차이가 없음을 나타낸다.

[실시예 3]

화합물 N-[[(5-클로로-2-벤조티아졸일)티오]-페닐아세틸]-L-시스테인을 하기와 같이 수행하는 시험관내 분석방법으로 인체의 엘라스타제 억제에 대해 시험한다.

조 엘라스타제 제제는 인체의 류코사이트 과립 [참조 : R.J.Baryk and J.Travis, Biochemistry, 15, (4), 837(1967)의 방법으로 제조]을 균질화시킨 후 회전분리하여 수득한 냉각된 pH 8.0의 0.05M 트리스-HCl/0.05M NaCl에 대한 상등액을 투석한다.

이러한 엘라스타제 제제를 엘라스타제 억제를 시험하는 두가지 분석방법에 사용된다.

[방법 1]

엘라스타제 제제 400㎕, 석시닐-L-알라닐-L-알라닐-L-알라닐-p-니트로아닐리드(효소기질) 10㎕(0.0625mg), 완충액 207㎕ 및 시험 조건하에서 다양한 양의 엘라스타제 억제제를 37℃에서 19시간동안 배양시킨다. 가수분해도는 410nm의 파장에서 p-니트로 아닐리드의 방출을 분광광도측정으로 또는 고성능액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 측정한다. 이러한 방법에서 실시예 1의 화합물은 2.1μg/ml의 IC₅₀을 나타낸다.

[방법2]

당해 방법에서 사용하는 기질은 엘라스틴-콩고레드 복합체(Elastin-Congo red complex)이다. 엘라스타제에 의한 상기 기질의 가수분해로 콩고 레드가 방출되며, 그 정도는 HPLC로 분석한다. 이 분석계는 완충액이 함유되어 있으며, 실시예 1의 화합물 20μg이 함유되어 있거나 이 화합물이 전혀 함유되어 있지 않다. 이 계를 37℃에서 18시간동안 배양한다. 그 결과, 표준 샘플은 돼지의 췌장 엘라스타제에 의해 엘라스틴-콩고 레드 복합체가 완전히 가수분해된 것으로 나타났다.

샘플 함량 콩고 레드의 상대 방출비

표준 1.0

억제제가 첨가되지 않음 0.104

실시예 1의 화합물 0.000

이들을 분석한 결과, 인체의 류코사이트 엘라스타제의 효소 활성에 실시예 1의 화합물이 강한 억제효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.

Claims (5)

1. 하기 일반식(II)의 트리사이클릭 메소이온성 디데히드로 화합물을 유기용매중에서 시스테인과 반응시켜 하기 일반식(I)의 화합물 및 약리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법.

   

   상기식에서, R₁은 수소, 할로, 니트로, 아미노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트리플루오로메틸 또는 하이드록시이고, R₂는 할로, 저급 알킬, 저급 알콕시, 아미노, 니트로 또는 트리플루오로메틸이다.
2. 하기 일반식(I)의 화합물 및 약리학적으로 허용되는 이의 염.

   

   상기식에서, R₁은 수소, 할로, 니트로, 아미노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트리플루오로메틸 또는 하이드록시이고, R₂는 할로, 저급 알킬, 저급 알콕시, 아미노, 니트로 또는 트리플루오로메틸이다.
3. 제 2 항에 있어서, N-[[(5-클로로-2-벤조티아졸일)티오]페닐아세틸]-L-시스테인인 화합물.
4. 제 2 항의 화합물 및 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 포유동물의 콜라게나제 및 엘라스타제 억제 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, N-[[(5-클로로-2-벤조티아졸일)티오]페닐아세틸]-L-시스테인과 약리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.