KR890003949B1 - 역상 크로마토그래피를 이용한 올리고뉴클레오타이드의 서열 결정방법 - Google Patents

역상 크로마토그래피를 이용한 올리고뉴클레오타이드의 서열 결정방법 Download PDF

Info

Publication number
KR890003949B1
KR890003949B1 KR1019860004816A KR860004816A KR890003949B1 KR 890003949 B1 KR890003949 B1 KR 890003949B1 KR 1019860004816 A KR1019860004816 A KR 1019860004816A KR 860004816 A KR860004816 A KR 860004816A KR 890003949 B1 KR890003949 B1 KR 890003949B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna
sequencing
reverse phase
oligonucleotide
sequence
Prior art date
Application number
KR1019860004816A
Other languages
English (en)
Other versions
KR870000429A (ko
Inventor
자가디스 와렌 푸두르
Original Assignee
일리노이즈 주립대학 이사회
크레이그 에스．바자니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 일리노이즈 주립대학 이사회, 크레이그 에스．바자니 filed Critical 일리노이즈 주립대학 이사회
Publication of KR870000429A publication Critical patent/KR870000429A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR890003949B1 publication Critical patent/KR890003949B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

내용 없음.

Description

역상 크로마토그래피를 이용한 올리고뉴클레오타이드의 서열 결정방법
제1도는 올리고뉴클레오타이드의 서열을 결정하는데 사용한 본발명에 의한 자동화장치의 개략도이다.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명
PG : 압력계 R : 시약 저장조
V : 밸브장치 W : 라피네이트 폿트
FC : 단편 포집장치 RV : 반응용기
본 발명은 DNA같은 올리고뉴클레오타이드 내의 핵산 염기서열을 결정하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다.
올리고뉴클레오타이드 특히, 데옥시리보핵산 또는 DNA서열의 결정은 유전인자의 기본물질인 DNA분자의 구조와 기능을 이해하는데 있어서 매우 중요한 수단으로 DNA분자는 포스포디에스테르 결합에 의하여 서로 연결된 4개의 독립적인 뉴클레오사이드가 수소결합에 의하여 "이중나선"의 형태로 결합됨으로서, 2개의 상보적인 올리고뉴클레오타이드 가닥으로 구성된 것임이 왓슨과 크릭에 의하여 처음으로 밝혀졌다.
Figure kpo00001
DNA분자내 각각의 뉴클레오사이드는 데옥시리보오즈 당분자로 구성되어 있는데, 이는 포스포디에스테르 결합에 의하여 제3'와 5'위치에서 서로 연결되어 있으며, 제1'위치에는 가능한 4가지의 핵산 염기중의 하나 즉 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T) 또는 시토신(C)등이 연결되어 진다.
Figure kpo00002
이와같이 데옥시리보오즈 당분자와 포스포디에스테르 결합에 의하여 DNA분자 전체에 걸쳐서 균일한 "골격"이 형성되나, 핵산 염기의 서열은 매우 다양한 것으로 이러한 다양성은 단백질내에서 아미노산 서열을 나타내는 분자에 따라서 염기가 달라지기 때문인데, 이러한 핵산염기들 각각은 단일한 아미노산 서열을 나타내는 분자에 따라서 염기가 달라지기 때문인데, 이러한 핵산염기들 각각은 단일한 아미노산을 생산하는 세포들을 지정하는 것이다.
DNA내의 핵산 염기의 서열과 단백질내의 아미노산 서열 사이의 상응관계가 유전자 암호에 있어서 기본인 것이다.
항상 변화하는(evergrowing) 뉴클레오사이드 사슬에 하나의 뉴클레오사이드를 일시에 가하므로써 실험실에서의 DNA합성이 가능하며, 이러한 "합성 DNA"는 유전공학에 있어서 매우 중요하게 이용되는 것이다. 가장 일반적인 용도는 과학적 또는 상업적으로 유용한 자연발생적인 유전인자의 탐색에 사용되는 "소식자"의 제조에 이용되는 것으로 일단 특정한 탐색유전자를 찾게되면, 이 특징을 연구조사하여 필요한 경우에는 실험실에서의 복사도 가능하게 되는 것이다.
올리고뉴클레오타이드 특히, DNA의 서열 결정은 DNA분자의 구조와 기능을 이해하는데 있어서 매우 중요한 수단으로 현재, DNA의 서열은 통상적으로 다음의 2가지 방법중의 하나로 결정한다. DNA서열을 결정하는 첫번째 방법은 F.S.상거, I, 니클렌 및 A.R.콜슨(Proceedings of the National Academy of Sciences, 74 : 5463)에 의하여 1977년에 보고된 것으로, 이 방법에서는 서열을 결정하고자 하는 목적하는 핵산 염기를 포함하는 DNA단편을 M13박제리오파아지 벡터내로 서브클로닝한 후, 단일 가닥 형태의 DNA를 분리하여 디데옥시 사슬 절단제의 존재하에서 프리머 익스텐션(primer extension)시킨다. 디데옥시 사슬 절단방법은 비교적 용이하게 실시할 수 있는 것이나, DNA단편의 서브클로닝에 시간이 매우 소모되므로, 다른 방법을 찾게된 것이다. DNA의 서열을 결정하는데 바람직한 방법으로서는 A.M. 맥삼과 W. 길버트(Proceedings of the National Academy of Science, 76 : 560, and Methods in Enzymology, 65 : 499, 1980)가 1977년에 보고한 방법으로 여기에서는 하기한 바와같은 4개의 염기 특이적인 반응을 이용하여 말단이 표시된 DNA의 서열을 결정하고 있다. 구아닌과 아데닌의 반응 공정은 4개의 염기에 대한 특이적인 반응에서와 같이, 0.1M피페리딘을 1001첨가하는 공정으로 이어진다.
Figure kpo00003
Figure kpo00004
맥삼-길버트의 방법은 DNA단편을 서브클로닝 할 필요가 없기 때문에 간단한 방법이라고는 할수 있으나 (1) 염기의 특이 변형공정, (2) 반응의 정지공정, (3) 연속 에탄올 침전공정, (5) 피페리딘 분해공정, (6) 반복증발공정과 (7) 겔 전기영동에 의한 분해 생성물의 분석, 감압하의 증발공정등을 연속적으로 행하는 데는 장시간이 소요되는 단점이 있고 이외에 소량의 DNA만을 정상적으로 이용할 수는 있으나, 반복 에탄올 침전공정이나 원심분리공정중 DNA펠리트를 상실한 가능성이 높고, 더구나 에탄올 침전공정중 DNA는 하이드라진과 공침될 수 있어 반응의 특이성을 간섭할 우려가 있다.
결국, 피페리딘은 여러시간의 반복된 동결건조로 항상 제거하여야 하는 것이 요구된다.
따라서 DNA단편의 서열 결정을 위한 상술한 2가지 방법의 단점 해결을 위해 본 발명이 완성되기전까지도 수많은 시도가 이루어지고 있었는바, 특히 DNA의 손실을 제거하므로써 실제적으로 겔상에 정치시키기 위한 DNA시료의 제조에 필요한 시간을 단축시키는 것이라고 믿어지고 있었던 변형된 방법으로 고체 지지물 위에 맥삼-길버트의 반응을 행하는 맣은 시도가 이루어졌다.
Chuvpilo와 Kravchenko(Biolog, Khim.9 : 1694) 등은 1980년 맥삼-길버트 반응을 행하기전에 DE81 음이온 교환지(anion exchange paper)를 사용하여 다양한 올리고뉴클레오타이드를 결합시키는 변형방법을 보고한 바 있으나, 결합이 이루어졌다 하더라도 종이지지체 (paper support)의 기계적 불안정성은 다른 방법을 택하지 않으면 사용할 수 없는 불충분한 것이다. 최근에는 Rosenthal등이 핵산 연구지(Nucleic Acid Research 13 : 1173)에 음이온 교환의 특성들과 셀룰로우즈로된 새로운 담체를 사용하므로써 불안전성에 관한 문제의 해결을 보고한 바 있다. 그러나 이 지지체를 사용하므로써 서열이 결정된 올리고뉴클레오타이드를 성공적으로 얻을 수는 있다하더라도 이와같은 방법은 DNA의 단편이 긴 경우에는 사용할 수 없고 또한, 담체로부터 결합된 DNA를 용출시키는데 사용된 피페리딘을 수회에 걸쳐 반복적으로 동결건조시켜 계로부터 제거하지 않으면 안되기 때문에 장시간이 소요되는 단점이 있었다.
따라서 DNA와 같은 올리고뉴클레오타이드의 서열 결정을 위해 현재 사용하는 방법의 단점을 해소키 위한 또 다른 방법의 요구가 필요로 하게 되었다.
즉, 본 발명은 종래 방법의 단점을 해결한 것으로 본 발명은 DNA와 같은 올리고뉴클레오타이드에 고형 지지물체인 담체를 사용하는 변형된 맥삼-길버트 방법을 제공할 뿐만 아니라, DNA에 같은 올리고뉴클레오타이드의 서열결정을 자동화하는 방법을 제공함을 그 특징으로 하는 것이다.
또한, 본 발명은 공정을 진행중 DNA의 손실을 최소로 하면서 DNA와 같은 올리고뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법을 제공하는 것으로, 특히 맥삼-길버트방법을 행함에 있어 원심분리 공정과 증발공정을 필요로 하지 않는 특징이 있을뿐만 아니라, 에탄올로 하이드라진을 침전시키는 공정이 필요없이도 올리고뉴클레오타이드의 서열을 결정할 수 있는 방법을 제공하는 특징이 있다.
본 발명의 또 다른 특징은 다음에 기술하는 상세한 설명 및 도면에 따라 더욱 명백하게 이해될 수 있다.
제1도는 본 발명에 의한 변형된 맥삼-길버트의 방법을 행하기 위한 자동화된 장치의 개략도이다. 올리고뉴클레오타이드, 특히 DNA의 서열 결정을 위한 본 발명에 따른 변형된 맥삼-길버트의 방법을 요약하면 다음과 같다.
DNA와 시약
↓
역상크로마토그래피 컬럼에 흡착
↓
복합체의 선택적 용출
↓
피페리딘 존재하에 90℃에서 가열
↓
역상 크로마토그래피 컬럼으로 반응혼합물 흡착
↓
DNA단편의 선택적 용출
↓
겔 전기영동에 의한 분석
따라서 본 발명은 DNA(또는 기타 올리고뉴클레오타이드)를 비활성 담체와 기계적으로 안정한 담체상에서 고정시킬 수 있고, 고정된 DNA를 사용하므로써 맥삼-길버트의 반응을 진행시킬 수 있으며 이와같은 방법으로 DNA의 서열 결정을 매우 빠르게 하므로써 단시간내에 행할 수 있음은 물론, 전 공정의 방법을 자동화 할수 있는 가능성을 제공할 수 있기 때문에 개량된 발명이라는 확신을 갖게 되었다.
최근 유행하고 있는 생화학 연구에 있어서 분석기술로서의 역상 고성능 액체 크로마토그래피는 실리카와 같은 미세한 입자로된 역상 충전물을 도입하여 유기질과 반응시키므로써 지방족기와 결합시킬 수 있다는 것이 알려져 있다. 일종의 담체 물질은 컬럼내에 충진되어 워터즈 어쏘시에이트에서 C18역상 컬럼으로 판매되고 있다. 최근 Khorana등은 C18역상 컬럼상에서 DNA단편 뿐만아니라 올리고뉴클레오타이드를 1.6Kb까지 정제할 수 있음을 보고한 바 있다(proc.Nat.Acad.Sci.USA 81 : 2285).
이 방법을 사용하므로써 본 발명자는 C18역상 컬럼으로부터 DNA단편들을 25Kb까지 정량적(90%이상)으로 용출시킬 수 있음을 발견하였다. 이와같은 컬럼에서의 DNA결합에 대한 이론과 체류메카니즘에 대해서는 명백하게 이해할 수는 없으나 결합이 공유 결합적 상호 작용을 포함하지 않는다는 것을 믿게되었다. 이 컬럼에서의 DNA결합은 비공유 결합적 상호 작용을 포함하기 때문에 본 발명에서는 이와같은 DNA의 결합이 화학적 변형반응에 유용할 것이라고 예측되는 것이다.
C18역상 컬럼을 사용함에 있어서, 기능적으로 등가인 여러 고체 지지물들이 C18물질에 대하여 치환될 수 있다로 하더라도 본 발명은 DNA의 서열 결정에 대한 맥삼-길버트 방법의 현저하게 간단한 변형 방법인 것이다.
결과적으로, 이 변형된 방법은 DNA의 서열 결정을 행하기 위한 개선된 자동화 공정을 유도하는 것이다. 따라서 결정된 DNA를 컬럼에 결합시킬 수 있기 때문에 변형된 본 발명은 종래 기술에서는 밝혀지지 않았던 다음과 같은 7가지의 개선된 특징을 갖는 것이다.
1) 디메틸 설페이트(DMS), 포름산(HCOOH)와 하이드라진(NH2-NH2)이 용액내에서와 유사한 방법으로 C18지지물 상에서 고정된 DNA와 반응한다는 것.
2) 포름산은 C18지지물로부터 약 20%의 DNA를 용출시킨다는 것.
3) NH2-NH2는 DNA를 용출시키지 못한다는 것.
4) 피페리딘이 DNA를 용출시킨다는 것.
5) 피페리딘이 중화될때 피페리딘 아세테이트는 의결합을 용이하게는 하나, 결합된 DNA는 용출시키지 못한다는 것.
6) 30%(V/V)의 수용성 아세토니트릴로 DNA를 용출시킬 수 있다는 것과
7) 25mM의 트리에틸암모늄 비카보네이트(TEAC)에 용해시킨 5%(V/V)의 아세토니트릴로는 하이드라진, 포름산과 DMS는 세척할 수 있으나 결함 DNA는 용출시키지 못한다는 것.
본 발명에 의한 DNA서열 결정방법은 맥삼-길버트의 방법에 사용된 다음과 같은 통상적인 시약을 사용할 수 있다.
* DMS 완충액
50mM소듐카코딜레이트
(pH8.0)
1mM EDTA
* 정지 용액
1M 트리스-아세테이트(pH7.5)
1M 머캅토 에탄올
1.5M NaOAc
0.5M Mg(OAc)2
1mM EDTA
0.1mg/m1 tRNA
* 하이드라진 정지 용액
0.3M NaOAc
0.01M Mg(OAc)2
O.1mM EDTA
25μg/m1 tRNA
* 염색액(Loading dye)
탈이온화포름아미드 20%
50mM 트리스-보레이트(pH8.3)
1mM EDTA
0.1%(w/v) 크실렌 시아놀
0.1%(w/v) 브로모페놀블루
상술한 바와같이 본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 서열 결정, 특히 DNA의 서열결정을 위한 초기의 맥삼-길버트의 서열결정 방법보다 7가지의 특징을 가지고 있는 개선된 방법으로 본 발명에 의한 좀더 구체적인 이해는 도면에 의한 다음의 실시예의 기술로부터 명백하게 구해질 것이다.
[실시예 1]
G,A,T 및 C라고 표시한 4개의 C18Sep-pak역상 실라카겔 크로마토그래피 컬럼(밀리포어사 제품)에 4개의 에를렌마이어(erlenmayer) 여과 플라스크를 장치한 후, 이를 진공 공급장치에 연결하였다. 물 1㎖와 TEAC 1㎖로 된 수세용액을(진공하에서) 통과시켜 각 컬럼을 안정화시킨 다음, (P32로) 말단을 표식한 DNA수용액을 통과시켰다. C18카아트리지(Cartridge)에 고정시킨 DNA는 맥삼-길버트의 방법에 따라서, 컬럼을 미리 혼합한 염기 특이적인 용액을 침지시킴으로서 처리하였다.
G카아트리지는 디메틸 설페이트 용액으로 2분동안 침지시켰으며, A카아트리지는 50%포름산으로 4분동안 침지시켰다. 또한, T카아트리지는 60%하이드라진으로 3분동안 침지시켰으며, C카아트리지는 1.5N NaC1을 포함하는 60%하이드라진으로 4분동안 침지시켰다. 맥삼-길버트 방법에서와 같은 G,A,T 및 C에 대한 정지용액을 각각의 컬럼에 통과시켰다. 각 컬럼을 25mM TEAC(20㎖)에 용해시킨 5%아세토니트릴 용액으로 컬럼을 세척한 후, 연속하여 10%피페리딘 200ℓ를 통과시켜 DNA를 용출시켰다. 용출제를 90℃에서 30분동안 가열한 다음, 각각의 용출제에 동량의 1N아세트산을 가하여 피페리딘 아세테이트를 형성시켰다. 물과 TEAC로 상기한 바와같이 전 평형화시킨 4개의 새로운 C18카아트리지에 피페리딘 아세테이트를 포험하는 용액을 통과시켰다. 20mM TEAC에 용해시킨 5%아세토니트릴 용액으로 컬럼을 세척한 후, 30%아세토니트릴 수용액 0.58㎖를 통과시켜 컬럼으로부터 적당하게 절단된 DNA단편을 포함하는 최종 생성물을 용출시켰다. 시료를 스피드백(speedvac) 내에서 30분 동안 건조시킨 다음, 여기에 15 내지 20μL의 종량 염료를 가하고, 통상적인 서열 결정을 위한 겔상에 올려 놓았다.
통상적인 맥삼-길버트의 방법에 비하여 실시예에서 예시한 방법은 몇가지의 잇점을 제공하는 것이다. 예를들면, 하이드라진과 에탄올의 공침에 의한 문제점을 제거하였으며, 지루하고 시간을 요하는 에탄올 침전 단계와 원심분리단계도 제거한 것이다. 또한, 공정중 DNA시료도 본질적으로 손실시키지 않았으며, 피페리딘을 아세테이트로 제거시키는 것에 의하여 감압하에서의 반복적인 증발 공정의 필요성도 제거한 것이다. 그러나, 본 발명에 따르는 개선된 방법에 있어서 가장 중요한 것은 서열 결정을 위한 공정을 자동화 할 수 있었다는 것이다.
제1도는 본 발명에 따라서 올리고뉴클레오타이드 특히, DNA의 서열을 결정하는데 사용하는 자동화된 장치의 개략도이다.
비록, 도면에는 이러한 장치의 특정한 배열만이 나타나 있으나, 표시된 기구들에 대한 수정이 있을 수 있으며, 이러한 수정도 본 발명의 범위에 속하는 것이다.
본 발명의 자동화 장치는 압력계 PG(샘플과 시약들을 역상 컬럼에 주입시키기 위하여 사용하는 공기 공급장치와 동일 선상에 위치한다 : 샘플과 시약들의 주입을 위하여 공기 펌프가 선택적으로 사용될 수 있다.), 공정을 연속적으로 실시하도록 장치를 프로그램하는데 사용되는 자동화 조절장치(표시되지 않았음)의 조절에 따라서 시약들을 저장하거나 역상 컬럼으로 분산시키는 여러개의 시약 저장조 R, 밸브 장치 V, 소비된 물질들을 처리하는 라피테이트 폿트 W, 단편 포집장치 FC 및 반응용기 RV로 구성되어 있다.
각각의 염기 특이적인 반응을 위한 역상 컬럼으로는 구아닌인 경우에는 G1과G2를 아데닌인 경우에는 A1과 A2를 티민인 경우에는 T1과 T2를 그리고 시토신인 경우에는 C1과 C2를 사용한다. 컬럼을 장치한 후, R1내의 물로 세척하고 이어서 R2내에 존재하는 25mM TEAC로 세척한다. 그런다음, 맥삼-길버트 반응 생성물을 손 또는 일련의 펌프장치(표시되지 않았음)를 사용하여 컬럼 G1,A1,T1 및 C1상에 올려 놓은후, R2내에 존재하는 25mM TEAC로 컬럼을 세척하고, 이어서 R3내에 존재하는 25mM TEAC에 용해된 5%아세토니트릴 용액으로 세척한다. 세척액들은 모두 적당한 밸브 장치, V5 내지 V8, 각각에 의하여 라피네이트 폿트로 흘러들어가게 된다. R4내의 1M 피페리딘 용액으로 컬럼을 용출시킨 후, 커버를 덮고 가열시킨 반응용기 RV내에 포집시킨다. 30분동안 90℃로 가열한 후, R6내에 존재하는 1M아세트산을 동량으로 가하여 피페리딘을 중화시킨다. 중화된 용액을 미리 평형화 시킨 또 다른 셋트의 컬럼들 즉, G2,A2,T2 및 C2상에 각각 올려놓는다. 세척을 되풀이 한 후, R5내에 존재하는 30%아세토니트릴 수용액으로 생성물을 용출시키고, 단편포집기 FC에 포집시킨다. 그런다음, 시료를 건조시키고, 서열결정 겔 상에서 전개시킨다.
본 발명이 속하는 분야에서 숙련된 사람이면 전술한 내용으로부터 본 발명의 본질적인 특성을 쉽게 확인할 수 있으며, 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어남이 없이 본 발명을 수정 및 변경하여 여러 용도 및 조건들에 적용시킬 수 있을 것이다.
따라서, 이러한 수정 및 변경들도 모두 본 발명의 범위에 속하는 것이다.

Claims (2)

  1. 서열을 결정하고자 하는 올리고뉴클레오타이드를 고형의 지지체인 담체상에 고정시킨 후, 고정화된 올리고뉴클레오타이드에 맥삼-길버트의 염기 특이적인 용액을 가하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드의 서열 결정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 서열을 결정하는 공정은 서열을 결정하고자 하는 올리고뉴클레오타이드에 맥삼-길버트의 염기 특이적인 용액을 가한후, 생성된 물질을 역상 크로마토그래피의 고형의 지지체상에 흡착시킨 다음, 이 지지체로부터 DNA복합체를 선택적으로 용출시키고, 용출된 물질을 피페리딘 존재하에서 가열한 다음, 가열에 의하여 얻어진 반응 생성물을 역상 크로마토그래피 고형의 지지체상에 흡착시키고, 올리고뉴클레오타이드 단편을 선택적으로 용출시킨 다음, 이 단편들의 올리고뉴클레오타이드 서열을 분석하는 것으로 구성된 것임을 특징으로 하는 방법.
KR1019860004816A 1985-06-17 1986-06-17 역상 크로마토그래피를 이용한 올리고뉴클레오타이드의 서열 결정방법 KR890003949B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US74554785A 1985-06-17 1985-06-17
US745547 1985-06-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR870000429A KR870000429A (ko) 1987-02-18
KR890003949B1 true KR890003949B1 (ko) 1989-10-13

Family

ID=24997153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019860004816A KR890003949B1 (ko) 1985-06-17 1986-06-17 역상 크로마토그래피를 이용한 올리고뉴클레오타이드의 서열 결정방법

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP0206411A3 (ko)
KR (1) KR890003949B1 (ko)
AU (1) AU5877086A (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8801070D0 (sv) * 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
KR100455457B1 (ko) * 1998-09-26 2005-01-27 (주)바이오니아 올리고뉴클레오티드염기서열결정방법및이에사용되는앵커

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59155800A (ja) * 1983-02-24 1984-09-04 富士写真フイルム株式会社 蓄積性蛍光体シ−ト
JPS59182364A (ja) * 1983-03-31 1984-10-17 Fuji Photo Film Co Ltd オ−トラジオグラフイ−における信号検出法
JPS59181335A (ja) * 1983-03-31 1984-10-15 Fuji Photo Film Co Ltd オ−トラジオグラフイ−における信号検出方法
EP0134622A3 (en) * 1983-05-25 1986-10-08 Georgetown University Apparatus and method for separating polynucleotides and detecting specific polynucleotide sequences
JPS6066998A (ja) * 1983-09-19 1985-04-17 Fuji Photo Film Co Ltd オ−トラジオグラフィ−による遺伝子のスクリ−ニング方法
US4655796A (en) * 1983-09-30 1987-04-07 Exxon Research & Engineering Co. Continuous sorption process
US4849077A (en) * 1984-08-06 1989-07-18 Akademie Der Wissenschaften Der Ddr Process for solid phase-sequencing of nucleic acid fragments

Also Published As

Publication number Publication date
EP0206411A2 (en) 1986-12-30
AU5877086A (en) 1986-12-24
KR870000429A (ko) 1987-02-18
EP0206411A3 (en) 1988-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Matthes et al. Simultaneous rapid chemical synthesis of over one hundred oligonucleotides on a microscale
US5607646A (en) Device for separating polynucleotides having a plurality of electrode-containing cells and movable collecting capillary
Schaller et al. Affinity Chromatography of DNA‐Binding Enzymes on Single‐Stranded DNA‐Agarose Columns
US5853668A (en) Apparatus allowing sequential chemical reactions
US4483964A (en) Reactor system and method for polynucleotide synthesis
US4997927A (en) Improved process for the purfication of synthetic oligonucleotides
Das et al. Processiveness of DNA polymerases. A comparative study using a simple procedure.
Broker et al. Electron microscopic visualization of tRNA genes with ferritin-avidin: biotin labels
WO1990004652A1 (en) Dna sequencing by multiple mixed oligonucleotide probes
AU2019395588B2 (en) Biochip and manufacturing method and application thereof
Mirzabekov et al. 5 s RNA conformation. Studies of its partial T1 ribonuclease digestion by gel electrophoresis and two-dimensional thin-layer chromatography
Bahl et al. Chemical and enzymatic synthesis of lactose operator of Escherichia coli and its binding to lactose repressor.
Gulle et al. RNA-protein cross-linking in Escherichia coli 50S ribosontal subunits; determination of sites on 23S RNA that are cross-linked to proteins L2, L4, L24 and L27 by treatment with 2-iminothiolane
EP1234182A2 (en) Hybridization of target dna with immobilized nucleic acid analogs
KR890003949B1 (ko) 역상 크로마토그래피를 이용한 올리고뉴클레오타이드의 서열 결정방법
US4448764A (en) Direct-acting iodinating reagent
US5106585A (en) Method and apparatus for cleaving deoxyribonucleic acid
CA2259493A1 (en) Oligonucleotide linker and techniques involving immobilized and linked oligonucleotides
WO1998000435A9 (en) Oligonucleotide linker and techniques involving immobilized and linked oligonucleotides
Richards et al. Electrochemical modification of lysozyme: Anodic reaction of tyrosine residues
Birch‐Hirschfeld et al. Oligonucleotide Synthesis on Polystyrene‐Grafted Poly (tetrafluoroethylene) Support
EP0322677B1 (en) Carrier for DNA-hybridization
JPH06189784A (ja) ペプチドｎ末端フラグメントの分取方法
Coull et al. Development of membrane supports for the solid-phase sequence analysis of proteins and peptides
WO1993014108A1 (en) Selection of binding-molecules

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
G160 Decision to publish patent application
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee