KR850001159B1 - 펩타이드의 제조방법 - Google Patents

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Description

펩타이드의 제조방법
본 발명은 포유동물 및 인간의 뇌하수체에 의해 고나도트로핀(gonadotropin)방출을 억제하는 펩티드 및 배란 예방과 스테로이드 방출 억제방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 생식기능과 스테로이드 호르몬, 프로제스테론 및 테스토스테론 방출을 억제하는 펩티드에 관한 것이다.
뇌하수체 경상부(莖狀部)에 의해 시상하부(hypothalamus)로 알려진 뇌의 밑부분에 붙어 있다.
뇌하수체에는 두 개의 엽(葉)을 가지고 있는데 즉 전엽(前葉)과 후협이 있다. 뇌하수체의 후엽은 시상하부에서 만들어진 두가지 호르몬, 즉 바소프레신(vasopressin)과 옥시토신(oxytocin)을 일반적인 순환계로 통과시키거나 축적한다. 뇌하수체의 전엽은 다수의 호르몬을 분비하는데, 이 호르몬들은 혈액 이동을 통해 각종 기관으로 이동하는 복합 단백질 또는 글리코 단백질 분자인데, 이들은 다시 주변의 기관에서부터 다른 호르몬의 혈액이동시에 혈액속으로의 분비를 자극한다. 특히 생식샘 자극 호르몬으로불리어지기도 하는 여포자극 호르몬(follicale stimulating hormone : FSH)과 황체 형성호르몬(luteinizing hormone : LH)은 뇌하수체에서 방출된다. 이들 호르몬은 복합적으로 생식샘의 기능을 조절하여 정소(精巢)에 테스토스테론을, 그리고 난소(卵巢)에 프로제스테론과, 에스토로겐을 생성하며 배우자(gamete)의 생성 및 성숙을 조절한다.
뇌하수체의 전엽이 호르몬을 방출할 때는 시상하부에 의해 생긴 다른 종류의 호르몬이 먼저 방출되어야 한다. 시상하부 호르몬 중 한가지는 생식샘을 자극호르몬, 특히 황체형성호르몬(LH)의 방출을 자극하는 인자로 작용한다. 시상하부 호르몬은 LH에 대한 방출 인자로 작용하는 것으로서 LRF로 부르기도 한다. LRF는 분리되는 것으로서 다음과 같은 구조를 가진 데카펩티드로서의 특징을 가진다.
P-Clu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg--Pro-Gly-NH2
펩티드는 아미노산 두 개 이상을 가진 화합물로서 이 아미노산에는 기타 산의 아미노기에 아미노산 한 개 중의 카르복시기가 연결되어 있다. LRF의 구조식은 아미노기가 왼쪽에, 그리고 카르복시기가 오른쪽에 나 아미노산 잔류기의 위치는 왼쪽에서부터 오른쪽으로 아미노산 잔류기의 수를 세어가면 확인이 된다. LRF의 경우에 있어서 글리신의 카르복시기 중 히드록시기부분은 아미노기(NH2)와 대체되어 있다. 각각의 아미노산 잔류기의 약자는 종래에 사용하고 있는 것으로서 아미노산의 평범한 명칭에 입각한것이다. 즉 p-Glu는 피로글루탐산(pyroglutamic acid)이고 His 는 히스티딘, Trp 는 트립토판, Ser 는 세린, Tyr 는 티로신, Gly 는 글리신, Leu 는 류우신, Arg 는 아르기닌이고 Pro 는 프롤린이다. 글리신외에 본 발명의 펩티드의 아미노산은 별도로 명시하지 않는 한 L-배위의 것이다.
LRF 데카펩티드의 6위치에 Gly대신에 D-아미노산을 대치하면 LRF보다 효능이 1-35배 정도나 큰 펩티드로 되어 포유동물의 뇌하수체에 의한 LH 및 기타 고나도트로핀의 방출이 효과적으로 된다. LRF동족체를 포유동물에 정맥내, 피하, 근육내, 경구 코속 또는 질내에 투여하면 방출효과가 나타난다.
또한 LRF데카펩티드의 2위치에 His대신에 각종 아미노산을 대치(또는 His제거)하면 포유동물의 뇌하수체에 의해 LH 및 기타 고나도트로핀에 대한 억제효과를 가진 동족체가 생성되는 것은 공지의 사실이다. His를 제거하거나(des His) D-Ala, D-Phe 또는 Gly을 대치하면 특히 LH방출억제 정도를 변화시킬 수 있다. 2위치에서 개질시킨 이러한 펩티드의 억제효과는 데카펩티드의 6위치에 Gly대신에 D-아미노산을 대치할 경우 더 커진다.
예를 들자면 pGlu-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Arg-Pro-Gly-NH2인 펩티드는 Gly가 D-Ala보다 6-위치에 있게 되면 동일한 펩티드의 경우보다 고나도 트로핀방출에 대한 억제제로서의 효능이 4배정도나 크다.
배란 주기가 없고 단소 또는 뇌하수체 결합을 나타내지 않는 여성포유동물은 정상적인 량의 고나도트로핀 LH와 FSH를 LRF의 적정량 투여후 분비하기 시작한다. 따라서 LRF투여는 기능적인 결합이 시상하부에 있는 불임증의 경우 이것을 치료하는데 적합하다고 생각된다.
여성 포유동물에 있어서 배란을 억제할 필요가 있을 때도 있으며 LRF의 정상적인 기능에 대해 반대작용을 하는 LRF동족체의 투여를 이용하여 배란을 억제하고 있다. 이러한 이유로 해서 LRF에 길항(拮抗)작용이 있는 LRF동족체의 피임제로서의 효능과 임신주기 조절에 대한 효능에 대해 연구가 진행되고 있다. 내생(內生)의 LRF에 강한 길항작용이 있으며 포유동물의 생식샘에 의한 스테로이드의 방출 및 LH의 분비를 억제하는 펩티드를 만들 필요가 있다.
본 발명은 포유동물과 인간의 고나도트로핀 방출을 억제하는 펩티드와 남성 및 여성 포유동물의 생식샘에 의한 스테로이드 방출을 억제하는 방법에 관한 것이다. 개량된 LRF동족체 LRF에 대한 길항작용이 있으며 포유동물의 생식과정에 억제효과를 가지고 있다. 이들 동족체를 사용하여 조기발정, 호르몬의존성증생, 월경불순 및 자궁 내막증을 포함한 각종 조건하에서 고나도트로핀과 성호르몬의 생성을 억제할 수 있다.
일반적으로 본 발명에 의하여 페티드를 합성하여 포유동물과 인간의 뇌하수체에 의한 고나도트로핀의 분비를 강력히 억제하고 생식샘에 의한 스테로이드 방출을 억제할 수 있다. 이들 펩티드는 LRF동족체로서 1위치에 데히드로프롤린(dehydroproline)이나 메타-티아졸리딘-2-카르복시산의 형태로 치환된 것인데 이들 치환요소가 2-, 3-및 6-위치에 있는 것이 좋다. 1-위치 치환요소를 개질시키므로서 알파아미노기에 포르밀, 아세틸, 아크릴일, 비닐아세틸 또는 벤조일 등의 아실기를 포함시킨다. 이때 1-위치에 데히드로 L-Pro(dehydro L-Pro)가 있는 것이 좋다.
개질된 D-Phe를 2-위치에 있도록 하면 벤젠 고리에 특수한 변화가 일어나서 결과적으로 길항작용이 커지게 된다. 파라-또는 4-위치에 수소에 대한 단일 치환을 하고 2, 4-또는 3, 4-위치에 이중치환을 하는 것이 좋다. 이러한 치환은 거의가 디클로로, 메틸, 플루오로, 디플루오로, 트리플루오로메틸, 메톡시, 브로모, 디브로모, 니트로, 디니트로, 아세틸아미노 및 메틸 메르 캅토 중에서 선택하는 것이 좋다. 3-위치에 타나는 종래의 펩티드 표현방식에 따라 표현된다.
D-Trp이 있는 것이 좋고 6-위치에 imBzl D-His 또는 D-Trp 또는 어떤 다른 친유성(親油性)의 방향족 D-아미노산이 있는 것이 좋은데 Gly 또는 어떤 D-이성질체 아미노산, 즉 D-Leu와 D-Ser(O-tBut)도 사용할 수 있다. 7-과 10-위치에서의 치환은 임의적이다.
이들 펩티드는 LH방출을 강력히 억제하기 때문에 이들을 LRF 길항물질이라고 부를 때도 있다. 펩티드는 발정전기에 극히 소량 투여하면 여성 포유동물의 배란이 억제되고 임신직후 투여 하면 수정란이 흡수되어 버린다.
특히 본 발명에 의한 펩티드는 다음과 같은 구조를 가지고 있다. 즉 X-R1-R2-R3-Ser-Tyr-R4-R5-Arg-Pro-R6위의 식에서 X는 수소 또는 탄소원자수가 7이하인 아실기, R1은 데히드로(dehydro) Pro, 데히드로(dehydro) D-Pro, Thz 또는 D-Thz, R2는 D-Phe, D-His, D-Trp, Trp, Cl-D-Phe, 디클로로-D-Phe, CF3-D-Phe, F-D-Phe, 디플루오로-D-Phe, ACNH-D-Phe, NO2-D-Phe, 디니트로-D-Phe, Br-D-Phe, 디브로모-D-Phe, CH3S-D-Phe, OCH3-D-Phe 또는 CH3-D-Phe, R3는 D-Trp, Trp, D-Phe 또는 D-His, R4는 Gly 또는 D-이성질체 아미노산, R5는 Leu 또는 NαMe-Leu이고, R6는 Gly-NH2또는 NHCH2CH3이다.
데히드로 Pro는 3, 4-데히드로프롤린, C5H7O2N이고 X가 아실라디칼일 때는 질소에 붙는다. Thz는 메타-티아졸리딘-2-카르복산, C4H7O2NS인데 이것은 시스테인 염산염을 포름알데히드로 처리하여 만들며 Ac-Thz는 Thz와 아세트산 무수물과 반응시켜 만든다.
본 발명의 펩티드는 클로로메틸화된 수지, 메틸벤즈히드릴아민(MBHA)수지 또는 벤즈히드릴아민(BHA)수지를 사용하여 고상 반응에 의해 합성한다. 이 합성법을 미국특허 제4,211,693호에 있는 바와 같이 단계적으로 실시하여 사슬 중의 아미노산을 첨가한다.
공지로 되어 있는 결사슬 보호기를 Ser, Tyr, Arg 및 His에 첨가한 후 이들 아미노산을 수지에 구성되는 사슬에 결합시키는 것이 좋다.
이 방법에 의해 완전히 보호된 중간체인 펩티도레진을 만들 수 있다. 본 발명에 의한 중간체는 다음과 같은 구조의 것이다. 즉 X1-R1-R2-R3-Ser(X2)-Tyr(X3)-R4-R5-Arg(X4)-Pro-X5위의식에서 X1은 폴리펩티드의 단계적인 합성시에 사용되고 있는 공지의 α-아미노 보호기이며 소요의 펩티드조성중에 있는 X가 특수한 아실기일 때는 이 기를 보호기로 사용할 수 있다. X1에 의해 보호된 α-아미노 보호기의 종류가운데는 (1) 아실형보호기 : (예) 포르말(For), 트리플루오로아세틸, 프탈릴, P-톨루엔술포밀(Tos), 벤조일(Bz), 벤젠술포닐, O-니트로페닐술페닐(O-nitrophenylsulfenyl)(Nps), 트리틸술페닐.
O-니트로페녹시아세틸, 아크릴일(Acr), 클로로아세틸, 아세틸(Ac) 및 γ-클로로부티릴.
(2) 방향족 우레탄형 보호기 <(예) : 벤질옥시 카르보닐(Z)과 치환된 벤질옥시카르보닐> : (예) : P-클로로벤질옥시카르보닐, P-니트로벤질옥시카르보닐, P-브로모벤질옥시카르보닐 및 P-메톡시벤질옥시카르보닐.
(3) 지방족 우레탄 보호기 : (예) tert-부틸옥시카르보닐(Boc), 디이소프로필메톡시카르보닐, 이소프로필옥시카르보닐, 에톡시카르보닐 및 알릴옥시카르보닐.
(4) 시클로알킬우레탄형 보호기 : (예) 시클로펜틸옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, 시클로헥실옥시카르보닐.
(5) 티오우레탄형 보호기 : (예) 페닐티오카르보닐.
(6) 알킬형 보호기 : (예) 알릴(Aly), 트리페닐메틸(trityl), 벤질(Bzl).
(7) 트리알킬실란기 : (예) 트리메틸실란 등이 있다.
α-아미노보호기로서 적합한 것은 X가 수소인 Boc이다. X2는 Ser의 알코올성 히드록시기의 보호기로서 아세틸, 벤조일, 테트라히드로피란일, tret-부틸, 트리틸, 벤질 및 2, 6-디클로로벤질 등이 있는데, 이중에서 벤질이 좋다.
X3는 Tyr의 페놀성 히드록시기의 보호기로서 테트라히드로피란일, tert-부틸, 트리틸, 벤질, 벤질옥시카르보닐, 4-브로모벤질옥시카르보닐 및 2, 6-디클로로벤질 등이 있다.
X4는 Arg의 질소원자의 보호기로서 니트로, Tos, 벤질옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐 및 Boc가 있는데 X4는 수소라도 된다. 이것은 아르기닌의 결사슬의 질소원자에 보호기가 없다는 것을 뜻한다.
X5는 Gly-O-CH2-[수지지지체],O-CH2-[수지지지체] 및 Gly-NH-[수지지지체] 등이다.
X2-X4의 결사슬 보호기 선택기준은 선택된 반응 조건하에서 시약에 대한 보호기의 안정성이 있으므로 해서 합성의 각 단계에서 α-아미노보호기를 제거할 수 있는 것이라야 한다. 보호기는 결합조건하에서 분리되지 않아야 하고 펩티드 사슬을 변화시키지 않는 반응조건하에서 소요의 아미노산 순서가 합성 완표되는 즉시 보호기가 제거되는 것이라야 한다.
X5기가 Gly-O-CH2-[수지지지체]일 경우 폴리스티렌수지 지지체중의 많은 관능기중 한개의 에스테르성분으로 나타내어진다.
X5기가 Gly-NH-[수지지지체]일 경우 아미드 결합은 Gly을 BHA수지 또는 MBHA수지에 결합시킨다.
X가 아세틸, 포르밀, 아크릴일, 비닐아세틸, 벤조일 또는 탄소원자수가 7이하인 기타 아실기일 때는 R1의 α-아미노기의 X1보호기로 사용할 수 있는데, 이 경우에 있어서 최종 아미노산이 펩티드 사슬에 결합하기 전에 첨가한다. 또한 수지의 펩티드에 대해 반응시키는데, 즉 디시클로헥실 카르보디이미드(DCC) 존재하에 아세트산과 반응시키는데, 이때아세트산 무수물과 반응시키는 것이 좋다. 완전히 보호된 펩티드를 가암모니아 분해에 의해 클로로메틸화된 수지지지체로부터 분리시켜 완전히 보호된 아미드 중간체를 얻을 수 있다. 벤즈히드릴아민수지로부터 펩티드를 분해시킴과 아울러 펩티드를 탈보호(脫保護)시킬 때는 플루오르화수소산(HF)을 이용하여 0℃에서 진행시킨다. 아니솔은 펩티드에 첨가한 후 HF와 처리한다. 진공 상태하에서 HF를 제거한 후 분해되고 탈보호된 펩티드를 에테르로 처리하고 경사분리하여 묽은 아세트산에 취한후 동결 건조한다. CMC칼럼에서 이온 교환 크로마토그래피처리를 하여 펩티드를 정제한 후 용리계를 사용하여 분배 크로마토그래피처리, 즉 n-부탄올 : 0.1N아세트산(체적비 1 : 1)을 사용하여 세파덱스(Sephadex) G-25를 충전한 칼럼에서 처리하던지 공지의 방법인 HPLC를 이용하여 처리한다. 본 발명에 의한 펩티드를 발정 전기가 되는 날의 정오 정도되는 시간에 체중 1kg당 200μg이하의 량으로 투여한 결과 암컷쥐의 배란이 효과적으로 억제되었다. 배란을 장기간 억제하자면 약 0.1-5mg/kg(체중)의 량의 범위에서 사용할 필요가 있다.
이들 길항 물질을 정기적으로 수컷 포유동물에 투여하면 피임제로서 효과도 나타낸다.
이들 화합물은 테스토스테론 량을 감소시키므로(정상적이면 성적으로 왕성한 수컷에 있어서 불필요한 결과를 가져옴) LRF길항 물질과 더불어 테스토스테론의 대체용량을 투여하는 것이 합리적이다.
본 발명을 실시예에 따라 상술하기로 한다.
[실시예 1]
앞서 나온 바와 같이 고상반응법에 의해 X-데히드로(dehydro) Pro-R2-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-R6-Arg-Pro-Gly-NH2의 구조식을 가진 다음의 펩티드를 제조했다.
[표 1]
Figure kpo00001
Figure kpo00002
본 실시예의 목적에 따라 [Ac-데히드로(dehydro)Pro1, 3, 4 Cl2-D-Phe2, D-Trp3, 6]-LRF인 펩티드 1번의 대표적인 고상 합성법에 대해 상술하기로 한다. 이 펩티드는 다음과 같은 구조식을 가진다 : Ac-데히드로(dehydro) Pro-3, 4 Cl2-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
BHA수지를 사용하며 Boc로 보호된 Gly을 CH2Cl2중에서 2시간 이상 수지에 결합시키는데, 이때 3배 과잉량의 Boc유도체와 DCC를 활성화제로 사용했다. 글리신기는 아미드결합에 의해 BHA기에 결합된다.
각각의 아미노산을 결합한 후 세척하고 데블록킹(deblocking)한 후 자동화된 장치를 사용하여 수지 5g정도부터 시작하여 다음과 같은 계획에 따라 그 다음의 아미노산을 결합시켰다.
Figure kpo00003
단계 13이 끝나면 일정량을 분취하여 닌히드린 시험을 실시한다. 만일 이 시험이 음성으로 나타나면 다시 단계 1로 되돌아 가서 그 다음 아미노산의 결합을 실시한다. 만일 이 시험이 양성(다소간에)으로 나타나면 단계 9-13을 반복한다.
첫번째 아미노산이 결합된 후 위의 계획을 이용하여 본 발명의 펩티드 중의 각 아미노산을 결합시킨다.
NαBoc 보호를 이용하여 전 합성과정을 통해 나머지 아미노산 각각을 보호한다. Arg의 곁사슬을 Tos를 사용하여 보호한다. OBzl은 Ser의 히드록시기의 곁사슬보호기를 사용하며 2, 6-디클로로벤질은 Tyr의 히드록시기의 곁사슬 보호기로 사용한다. N-아세틸-데히드로(dehydro) Pro를 최종 아미노산으로 도입한다.
Boc-Arg(Tos)와 Boc-D-Trp은 CH2Cl2중에서 낮은 용해도를 가진 것으로서 DMF CH2Cl2혼합물을 사용하여 결합시킨다.
수지로부터 펩티드를 분해시키고 곁사슬의 완전한 탈보호가 일어나게 할 때 HF를 사용하여 0℃에서 실시하면 극히 잘 된다.
HF처리하기전에 아니솔을 스케빈저(scavenger)로 첨가한다. 진공하에서 HF가 제거되면 50%아세트산으로 수지를 추출하고 세척물을 동결 건조하여 미정제 펩티드 분말을 얻는다.
CMC에서 이온 교환 크로마토그래피처리(Whatman CM32, 메탄올/ 물(50/50)에서 0.05-0.3M NH4OAc의 구배를 이용함)한 후 n-부탄올 : 0.1N아세트산(체적비 1 : 1)의 용리계를 이용하여 겔 여과 칼럼에서 분배 크로마토그래피 처리하여 펩티드를 정제한다.
위의 표에 나온 펩티드를 생체외 및 생체내 시험을 했다. 생채내 시험은 쥐의 외하수체 세포를 떼어내어 4일간 배양한 후 분석에 사용했다.
펩티드 사용에 대해 조절한 LH의 량을 쥐의 LH에 대해 특수한 방사 면역분석시험에 의해 시험했다. 세포의 기본시료 접시에는 LRF 중에서 3나노몰(nanomolar)로 나타났다. 즉 시료 시험접시는 LRF 중의 3나노몰과 시험용 펩티드의 농도범위가 0.01-3나노몰인 것이었다. LRF로서만 처리한 시료에서 분비된 LH의 량을 펩티드와 LRF로 처리한 시료가 분비한 것과 비교했다. 결과를 계산하여 표 1A에 나타내었는데(생체의 시험) 3나노몰의 LRF가 방출한 LH의량이 기본값의 50%(ICR50)로 감소될 때까지 소요되는 시험용 펩티드와 LRF의 몰 농도비(길항 물질/ LRF)로 나타낸 것이다.
이 펩티드를 사용하여 암컷쥐의 배란 억제효과를 측정했다. 이 시험에 있어서 체중이 225-250g인 성숙한 암컷 쥐(Sprague-Dawley 쥐)를 인정한 수로 취하여 펩티드 5 또는 10μg을 옥수수기름에 혼합한 것을 각 쥐에다 발정 전기가 되는 날의 정오쯤해서 주사했다. 별도로 암컷 쥐 무리를 펩티드를 투여하지 않는 기본 무리로 사용했다.
기본 무리의 각 암컷쥐는 발정시에 배란을 했다. 생체내 시험에서 나타난 바와 같이 펩티드는 극히 소량 투여했을 때도 암컷쥐의 배란을 효과적으로 억제하고 있고 모든 펩티드 조성물은 전부가 1mg용량에서 완전히 효과가 있는 것으로 생각되었다.
[표 1A]
Figure kpo00004
Figure kpo00005
[실시예 2]
펩티드 20번을 클로로메틸화된 수지에서 제조한 것 외에는 실시예 1의 방법을 따라 고상 방법으로 X-R1-pCl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-R4-R5-Arg-Pro-R6의 구조식을 가진 다음의 펩티드를 제조했다.
[표 2]
Figure kpo00006
위의 표에 있는 펩티드를 생체외 및 생체내 시험에 사용했다. 생체외 시험은 쥐의 뇌하수체 세포를 떼어내어 4일간 배양한 후 분석에 사용했다.
펩티드 사용에 대해 조절한 LH의 량을 쥐의 LH에 대해 특수한 방사면역분석 시험법에 의해 시험했다.
세포의 기본시료 접시에는 LRF 중에서 3나노몰로 나타났다. 즉 시료 시험접시는 LRF중의 3나노몰과 시험용 펩티드의 농도범위가 1-100나노몰인 것이었다. LRF로서만 처리한 시료에서 분비된 LH의 량을 펩티드와 LRF로 처리한 시료가 분비한 것과 비교했다. 결과를 계산하여 표 2A에 나타내었는데(생체외 시험) 3나노몰의 LRF가 방출한 LH의 량이 기본 값의 50%(LCR50)로 감소될 때까지 소요되는 시험용 펩티드와 LRF의 몰 농도비(길항 물질/ LRF)로 나타낸 것이다.
이 펩티드를 이용하여 암컷쥐의 배란 억제 효과를 측정했다. 이 시험에 있어서 체중이 225-250g인 성숙한 암컷쥐(Sprague-Dawley 쥐)를 4마리, 7마리, 9마리 또는 10마리 취하여 펩티드 0.02mg을 옥수수 기름에 혼합한 것을 각 쥐에다 발정 전기가 되는 날의 정오쯤해서 주사했다. 발정 전기는 발정하기전(배란전)의 정오이다. 별도로 암컷쥐 10마리를 기본 무리로 하여 펩티드를 투여하지 않았다. 10마리의 암컷쥐(기본 무리) 각각은 발정시 배란을 했다. 생체내 시험에서 나타난 바와 같이 펩티드는 극히 소량 투여했을 때도 암컷쥐의 배란을 효과적으로 억제하고 있고 모든 펩티드 조성물은 전부가 1mg 용량에서 완전히 효과가 있는 것으로 생각되었다.
[표 2A]
Figure kpo00007
**0.025mg*0.010mg
[실시예 3]
펩티드 37번을 클로로메틸화된 수지에서 제조한 것 외에는 실시예 1의 방법을 따라 고상방법으로 X-R1-R2-R3-Ser-Tyr-D-Trp-R5-Arg-Pro-R6의 구조식을 가진 다음의 펩티드를 제조했다.
[표 3]
Figure kpo00008
Figure kpo00009
위의 표에 있는 펩티드를 생체외 및 생체내 시험에 사용했다. 생체외 시험은 쥐의 뇌하수체 세포를 떼어내어 4일간 배양한 후 분석에 사용했다.
펩티드 사용기 대해 조절한 LH의 량을 쥐의 LH에 대해 특수한 방사면역분석 시험법에 의해 시험했다.
세포의 기본 시료 접시에는 LRF 중에서 3나노몰로 나타났다. 즉 시료 시험접시는 LRF 중의 3나노몰과 시험용 펩티드의 농도범위가 1-100나노몰인 것이었다.
LRF로서만 처리한 시료에서 분비된 LH의 량을 펩티드와 LRF로 처리한 시료가 분비한 것과 비교했다. 결과를 계산하여 표 3A에 나타내었는데(생체외 시험) 3나노몰의 LRF가 방출한 LH의 량이 기본값의 50%(ICR50)로 감소될 때까지 소요되는 시험용 펩티드와 LRF의 몰 농도비(길항물질/ LRF)로 나타낸 것이다.
이 펩티드를 이용하여 암컷 쥐의 배란 억제 효과를 측정했다. 이 시험에 있어서 체중이 225-250g인 성숙한 암컷쥐(Sprague-Dawley 쥐)를 일정수로 취하여 펩티드 0.02mg을 옥수수 기름에 혼합한 것을 각 쥐에다 발정 전기가 되는 날의 정오쯤해서 주사했다. 발정 전기는 발정하기전(배란전)의 정오이다. 별도로 암컷쥐를 기본 무리로 하여 펩티드를 투여하지 않았다. 기본 암컷쥐 무리 각각은 발정시에 배란을 했다. 생체내 시험에서 나타난 바와 같이 펩티드는 극히 소량 투여했을 때도 암컷쥐의 배량을 효과적으로 억제하고 있고 모든 펩티드 조성물은 전부가 1mg 용량에서 완전히 효과가 있는 것으로 생각되었다.
[표 3A]
Figure kpo00010
Figure kpo00011
*용량 : 0.025mg
이들 펩티드를 포유동물에다 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 코속 또는 질내에 투여하므로서 임신억제를 할수 있다. 효과적인 용량은 투여형태와 처리대상 포유동물의 종에 따라 달라진다. 한가지 대표적인 용량형태는 펩티드를 가한 생리식염용액인데 이 용액을 투여할 때 용량범위는 약 0.1-5mg/kg(체중)정도이다. 펩티드를 경구 투여할 때는 고체 또는 액체형태로 해도 된다.

Claims (1)

  1. 고상(solid phase) 반응에 의하여, 다음 일반식(Ⅳ) 화합물을 일반식(Ⅲ) 화합물과 반응시켜 일반식(Ⅱ)로 표시되는 중간 화합물을 제조하고 이어서 보호기를 강산으로 처리하여 분할함을 특징으로 하는, 일반식(Ⅰ) 화합물 또는 그의 비독성염의 제조방법.
    (Ⅵ) H-R2-R3-Ser(X2)-Tyr-(X3)-R4-R5-Arg(X4)-Pro-X5
    (Ⅲ) X1-R1-OH
    (Ⅱ) X1-R1-R2-R3-Ser(X2)-Tyr-(X3)-R4-R5-Arg(X4)-Pro-X5
    (Ⅰ) X-R1-R2-R3-Ser-Tyr-R4-R5-Arg-Pro-R6
    단, 위의 식에서
    X1: α-아미노 보호기
    X2: Ser의 알코올성 히드록시기의 보호기
    X3: Tyr의 페놀성 히드록시기의 보호기
    X4: Arg의 질소원자의 보호기
    X5: Gly-O-CH2-[수지 지지체], O-CH2-[수지지지체], Gly-NH-[수지지지체], Gly-NH2또는 NHCH2CH3
    X : 수소 또는 탄소 원자수가 7이하인 아실기
    R1: 각카르복시 말단에서 OH가 제외된 형태의, 데히드로(dehydro) Pro, 데히드로(dehydro) D-Pro, Thz 또는 D-Thz,
    R2: 각 아미노 말단에서 H가 제외된 형태의, D-Phe, D-His, D-Trp, Trp, Cl-D-Phe, 디클로로-D-Phe, CF3-D-Phe, F-D-Phe, 디플루오로-D-Phe, AcNH-D-Phe, NO2-D-Phe, 디니트로-D-Phe, Br-D-Phe, 디브로모-D-Phe, CH3S-D-Phe, OCH3-D-Phe 또는 CH3-D-Phe,
    R3: D-Trp, Trp, D-Phe 또는 D-His,
    R4: Gly 또는 D-이성질체 아미노산,
    R5: Leu 또는 NαMe-Leu,
    R6: Gly-NH2또는 NHCH2CH3
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