CS237319B2 - Způsob výroby peptidů inhibujících uvolňování gonadotropinů z hypofýzy savců - Google Patents

Abstract

Způsob výroby peptidů inhibujících uvolňování gonadotropinů z hypofýzy savců obecného vzorce X-Ri-Rz-Rs-Ser-Tyr-Rd-Rs-Arg-Pro-Rs, Kde jednotlivé substituenty mají význam uvedený v definici předmětu vynálezu, jakož i netoxických solí těchto peptidů, při němž se z meziproduktu obecného vzorce X4-Ri-R2-R3-Ser(χ2) -Tyr- (X3 J -R4-R5- -Arg(X4)-Pro-X5, odštěpí alespoň jedna skupina X* 1 až X5 a popřípadě se výsledný peptid převede na netoxickou sůl.

Description

Vynález se týká způsobu výroby peptidů, které inhibují uvolňování gonadotropinů z hypofýzy savců včetně lidí; uvedenými peptidy je možno předcházet ovulaci a/nebo brzdit uvolňování steroidů. Jde tedy o peptidy, které způsobují inhibici funkce pohlavních žláz a tím i uvolňování steroidních hormonů, progesteronu a testosteronu.

Hypofýza je připojena stopkou na bázi mozku v místě, které se nazývá hypothalamus, Hypofýza má dva laloky, přední a zadní. Zadní lalok této žlázy vyrábí a předává do oběhu dva hormony, které se produkují také v hypotalamu, a to vasopresin a oxytocin. Přední lalok hypofýzy vylučuje celou řadu hormonů, které jsou komplexními bílkovinami nebo molekulami glykoproteinů a dostávají se krevní cestou do různých orgánů a podporují vylučování jiných hormonů z periferních orgánů. Jde zejména o folikulostimulační hormon FSH a luteinizační hormon LH, kterým se obvykle říká také gonadotropiny nebo gonadotropní hormony. Tyto hormony řídí funkci pohlavních žláz, zejména výrobu testosteronu ve varlatech a progesteronu a estrogenu ve vaječnících a mimoto také řídí zrání gamet.

Uvolňování hormonu předním lalokem hypofýzy obvykle vyžaduje předběžné uvolnění jiného hormonu, který se vyrábí v hypothalamu. Jeden z hypothalamických hormonů přímo vyvolává uvolnění gonadotropních hormonů, zvláště LH. Tento hypothalamický hormon uvolňující LH se nazývá LRF, přestože se někdy také uvádí jako LH-RH a GnRH. LRF byl izolován a analyzován jako dekapeptid se strukturou p-Glu/his-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2.

Peptidy jsou sloučeniny, které obsahují 2 nebo více aminokyselin, v nichž je karboxylová skupina jedné aminokyseliny vázána na aminoskupinu druhé kyseliny. Vzorec LRF, tak jak byl svrchu uveden odpovídá běžnému typu peptidů, kde aminoskupina se nachází na levé straně a karboxylová skupina na pravé straně. Poloha zbytku aminokyseliny se identifikuje počtem aminokyselinových zbytků zleva doprava. V případě LRF byla hydroxylová skupina karboxylové skupiny glycinu nahrazena aminoskupinou.

Zkratky pro jednotlivé zbytky aminokyselin jsou běžně používány a jsou založeny na jménech aminokyselin, p-Glu je kyselina pyroglutamová, His znamená histidin, Trp znamená tryptofan, Ser znamená serin, Tyr znamená tyrosin, Gly znamená glycin, Leu znamená leucin, Arg znamená arginin a Pro znamená prolin. S výjimkou glycinu jsou aminokyseliny v peptidech podle vynálezu v konfiguraci L, není-li uvedeno jinak.

Je známo, že při náhradě D-aminokyselin za glycin v poloze 6 dekapeptidu LRF se získává peptidový materiál, jehož účinnost je 1 až 35krát vyšší než účinnost LRF, pokud jde o uvolňování LH a dalších gonadotropinů v hypofýze savců. K tomuto účinku dochází v případě, že uvedený analog se podává savcům nitrožilně, podkožně, nitrosvalově, perorálně, nosem nebo do pochvy.

Je také známo, že při náhradě různých aminokyselin za His nebo při vynechání H,is v poloze 2 uvedeného dekapeptidu vzniká analog s inhibičním účinkem na uvolňování LH a dalších gonadotropinů hypofýzou savců. Různých stupňů inhibice uvolňování LH se dosáhne v případě, že se His vynechá (des His) nebo nahradí D-Ala, D-Phe nebo Gly. Inhibiční účinek peptidů, modifikovaných v poloze 2 je možno dále zvýšit tak, že se zavede D-aminokyselina místo Gly v poloze 6 dekapeptidu. Například peptid vzorce p-Glu-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 je čtyřikrát účinnější jako inhibitor uvolňování gonadotropinů než tentýž peptid, který obsahuje Gly v poloze 6.

Některé samice savců, které nemají ovulační cyklus a které jsou zcela zdravé začnou vylučovat normální množství gonadotropinu LH a FSH po podání LRF. To znamená, že podání LRF je pravděpodobně vhodné pro ty případy sterility a infertility, jejichž příčinou je porucha v hypothalamu.

Je také možno předpokládat, že bude možno bránit ovulaci při podání analogů LRF. Z tohoto důvodu se zkoumají analogy LRF, které mohou být potenciálními antikoncepčními prostředky, jimiž je možno početí řídit. Bylo by žádoucí vyrábět peptidy, které mají silný antagonistický účinek a brzdí vylučování LH a uvolňování steroidů z pohlavních žláz savců.

Předmětem vynálezu je způsob výroby peptidů, které inhibují uvolňování genadotropinu u savců včetně člověka a je tedy při jejich použití možno brzdit uvolňování steroidů z pohlavních žláz samců i samic. Zlepšené analogy LRF angatonizují LRF a mají tedy inhibiční účinek na reprodukční pochody u savců. Je možno je použít k inhibici produkce genadotropinů a pohlavních hormonů za různých okolností včetně předčasné puberty, nádorů, závislých na. hormonech, dysmenorrhey a endometriózy.

Způsobem podle vynálezu je tedy možno získat peptidy, které působí silnou inhibici genadotropinů a inhibici jejich uvolňování hypofýzou savců včetně lidí a/nebo inhibují uvolňování steroidů pohlavními žlázami. Tyto peptidy jsou analogy LRF, kde v poloze 1 se nachází dehydroprolin nebo kyselina metha-thiazolidin-2-karboxylová a s výhodou jsou také přítomny substituenty v polohách 2, 3 a Θ. Substituent v poloze 1 může být modifikován tak, že na aminoskupinu v poloze a je vázána acylová skupina, například formyl, acetyl, akrylyl, vinylacetyl nebo benzoyl. V poloze 1 je výhodný dehydro L-Pro.

V poleze 2 se s výhodou nachází modifikovaný D-Phe a v důsledku jeho· přítomnosti vzrůstá antagonistická účinnost, zejména v záv'slasti na specifických modifikacích benzenového kruhu. Obvykle ss nahrazuje jediný atom vodíku v poloze para nebo v poloze 4, při náhradě dvou atomů vodíku se substituce provádí s výhodou v polohách 2,4- nebo 3,4-, Substituenty se s výhodou volí ze skupiny dichior, methyl, fluor, difluor, trifluormethyl, methoxyskupina, brom, dibrom, nitroskuphia, ďntroskupina, acetylaminoskupina a msthylmerkaptoskupina. V poloze 3 je výhodný D-Trp a v poloze 6 imBzl D-His nebo D-Trp nebo některé jiné lipofilní aromatické D-aminokyseliny, přestože je možno použít také Gly nebo jakýkoliv D-isomer aminokyseliny, například D-Leu a D-Ser (O-terc.but). Subst tuce v poloze 7 a 10 se používá pouze ve zvláštních případech.

Frotože tyto peptidy jsou vysoce účinné při inhibici LH, nazývají se často antagonisty LRF. Tyto peptidy inhibují ovulaci u sanrc savců při podávání velmi nízkých dávek v prcestru a jsou také účinné při resorpci oplodněných vajíček v případě, že se podají velni: krátce po početí.

Předmětem vynálezu je způsob výroby peptidů ínhibujících uvolňování gonadotropinů z hypofýzy savců obecného vzorce

X-Rl-R2-R3-Sor-Tyr-Ri-R)-Arg-Pro-R6, kde

X znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku,

Ri znamená dehydro Pro, dehydro D-Pro, Thz nebo D-Thz,

Rž znamená D-Phe, D-H's, D-Trp, Trp, Cl-D-Phe, dichlor-D-Phe, CFs-D-Fhe, F-D-Phe, difluor-D-Phé, AcNH-D-Phe, kde '

Ac znamená acetyl,

NOz-Ď-Phe, dinitro-D-Phe, Br-D-Fhe, dibrom-D-Phe, CH3S-D-Phe, OCH3-D-Phe nebo CH3-D-Phe,

R3 znamená D-Trp, Trp, D-Phe, nebo D-His,

Ri D-isomer lipofilní «-aminokyseliny ze skupiny Arg, Lys, Trp, Phe, His, Tyr a C-fenylglycin,

Rs znamená Leu nebo N“-Me-Leu kde

Me znamená methyl,

Re znamená Gly-NHz nebo NHCH2CH3, jakož i netoxických solí těchto peptidů vyznačující se tím, že se z meziproduktu obecného vzorce

Xi-Rl-R2-R3-Ser (X²) -Tyr- (X³) -R4-R5-Arg(X⁴)-Pro-X⁵, kde

X¹ znamená ochrannou skupinu na a-aminoskupině,

X² znamená ochrannou skupinu na alkoholové hydroxylové skupině Ser,

X³ znamená ochrannou skupinu na fenolové hydroxylové skup'ně Tyr,

X⁴ znamená ochrannou skupinu na dusíkových atomech Arg a

X³ se voli za skupiny Gly-O-CH2-(pryskyřice), O-CHs-ípryskyřice), Gly-NH-(pryskyřice), Gly-NHz a NHCH2CI-I3,

Ri, R2, Rs, R4 a Rs mají svrchu uvedený význam, odštěpí alespoň jedna skupina X¹ až X⁵ a popřípadě se výsledný peptid převede na netoxickou sůl.

Pod pojmem dehydro Pro se rozumí 3,4-dihydroprolin vzorce C5H7O2N, v případě, že X znamená acylový zbytek, je tento zbytek vázán na atom dusíku. Thz je kyselina metath^:azolidm-2-karboxylová vzorce C4H7O2NS, kterou je možno připravit reakcí cisteinhydrochloridu s formaldehydem a například Ac-Thz je možno získat reakcí Thz s anhydridem kyseliny octové.

Peptidy podle vynálezu je možno získat v pevné fázi při použití chlormethyl ováné pryskyřice, raethylbenzhydrylanrnové pryskyřice (MBHA) nebo benzhydrylaminové pryskyřice (BHA). Reakce se provádí tak, že se postupně přidávají aminokyseliny tak, jak je podrobně uvedeno v US patentu číslo 4 211 693. Ochranné skupiny na postranním řetězci, tak jak je běžně v oboru známo, se s výhodou přidávají k Ser, Tyr, Arg a His předtím, než se tyto aminokyseliny váží na řs^xězec, vybudovaný na pryskyřici.

Tímto způsobem vzniká plně chráněný meziprodukt peptidu, vázaného na pryskyřici.

Kritérium pro volbu postranního řetězce a, ochranných skupin X² až X⁴ je skutečnost, že ochranné skupiny musí být stálé k reakčním čimdlům za reakčních podmínek, které se volí k odstranění «-aininoskupiny a ochranné skupiny na «-aminoskupině v každém stupni syntézy. Ochranná skupina hesiiií být odštěpena v průběhu vazby a musí být možno ji odstranit pó syntéze požadovaného sledu aminokyselin za reakčních podmínek, které nezmění peptidový řetězec.

Plně chráněný peptid je možno odštěpit od chlormethylovš pryskyřice ammonolýzou známým způsobem za vzniku, plně chráněného meziproduktu. Odstranění ochranných skupin a odštěpení peptidu od benzhydrylaminové pryskyřice se provádí při teplotě 0 °G působením kyseliny fluorovodíkové (HF). Před působením této kyseliny se k peptidu přidá anisol. Po odstranění kyseliny fluorovodíkové ve vakuu se působí na odštěpený peptid zbavený ochranných skupin etherem, výsledný produkt se izoluje dekantací, rozpustí se ve zředěné kyselině octové a lyofilizuje.

Čištění peptidu se provádí iontoměničovou chromatografii na sloupci karboxymethylcelulózy s následnou dělicí chromatografii při použití směsi n-butanolu a 0,1 N kyseliny octové v objemovém poměru 1:1 na sloupci, naplněném Sephadexem G-25 nebo při použití vysokotlaké kapalinové chromatografie.

Peptidy podle vynálezu jsou účinné v dávkách nižších než 2J0 ,tíg/kg tělesné hmotnosti v případě použití v poledne při proestru a tímto způsobem je možno účinně bránit ovulaci u krysích samic. V případě, že je nutno potlačit ovulaci na delší dobu, je nutno použít dávek 0,1 až 5 mg/kg. Tyto látky jsou rovněž účinné jako anťkoncepční látky v případě, že se podávají samcům.

Protože sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu smžují hladiny testosteronu, což je u normálního samce nežádoucí, může být nutno podávat testosteron spolu s účinnou dávkou těchto látek.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Přikladl

Peptidy obecného vzorce

X-dehydro Pro-R2-D-Trp-Ser-Trp-D-Trp-R5-Arg-Pro-Gly-NH2 je možno připravit v pevné fázi svrchu uvedeným způsobem.

Tabulka I

Peptid	X	R2	Rs	Kd22°
1	Ac	3,4-Cl-D-Phe	Leu	—79,9
2	Ac	4 CF3-D-Phe	Leu	—69,1
3	Ac	4 F-D-Phe	Leu	—78,2
4	Ac	4 AvNH-D-Phe	Leu	—76,5
5	Ac	4 NOž-S-Phe	Leu	—89,6
6	Ac	4 Br-D-Phe	Leu	—76,0
7	Ac	4 CHsS-D-Phe	Leu	—79,8
3	Ac	4 OCH3-D-Phe	Leu.	—82,7
9	Ac	4 CH3-D-Pihe	Leu	—81,7
10	Ac	2,4 Cl2-D-Phe	Leu	—77,2
11	Aer	3,4 Cl2-D-Phe	Leu	—72,5
12	Ac	4 OCH3-D-Phe	NKMeLeu	—113,4
13	Ac	4 CH3-S-Phe	N“MeLeu	—106,5
14	Ac	3,4 Cl2-D-Phe	N“MeLeu	—110,—

Jako příklad bude dále uvedena syntéza peptidu č. 1, který je možno vyjádřit vzorcem [Ac-dehydro Pro¹, 3,4 Ch-D-Phe², D-Trp³'^ó]-LRE nebo podrobněji _; . ......

Ac-dehydro Pro-3,4 Ch-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Použije se pryskyřice BHA a na pryskyřici se naváže Gly s ochrannou skupinou Boc v průběhu 2 hodin v CH2CI2 při použití trojnásobného přebytku Boc-derivátu a DGC jako aktivovaného reakčního činidla. Glycinové zbytky jsou napojeny na zbytek BHA amidovou vazbou.

Po navázání zbytku každé aminokyseliny, promytí, odstranění ochraně skupiny a vazbě dalšího zbytku aminokyseliny se navazuje další aminokyselina podle následujícího schématu, přičemž se používá automatické zařízení a začíná se s 5 g pryskyřice:

Stupeň Reakční činidlo a postup

Reakční doba (min)

1	CH2CI2 promytí 80 ml dvakrát	3
2	methanol (MeOH) promytí 30 ml	3
3	CH2CI2 promytí 80 ml třikrát	3
4	50 % TFA s 5 % 1,2-ethandithiolu v CH2CI2 — 70 ml, dvakrát	10
5	CH2CI2 — 80 ml, dvakrát	3
6	TEA 12,5 % v CH2CI2 — 70 ml, dvakrát	5
7	MeOH — 40 ml, dvakrát	2
8	CH2CI2 — 80 ml třikrát	3
9	Boc-aminokyselina (10 mmolů) ve 30 ml DMF nebo CH2CI2 podle rozpustnosti chráněné aminokyseliny, jedenkrát a DCC (10 mmolů) v 7- GH2CI2	30
10	MeOH — 40 ml, dvakrát	3
11	TEA 12,5 % v CH2CI2 — 70 ml), jedenkrát	3
12	MeOH — 30 ml, dvakrát	3
13	CH2CI2 — 80 ml, dvakrát	3

237313

Po stupni 13 se odebere vzorek reakční směsi na ninhydrinový test. V případě, že tento test je negativní, je zapotřebí začít znovu na stupni 1 pro vazbu další aminokyseliny. Je-li test pozitivní nebo slabě pozitivní, je třeba opakovat stupně 9 až 13.

Svrchu uvedené schéma se používá pro vazbu aminokyselin v peptidu podle vynálezu po navázání první aminokyseliny. Ochranná skupina N^KBoc se používá pro každou další aminokyselinu v průběhu syntézy. Postranní řetězec Arg se chrání Tos. Jako ochranná skupina pro hydroxylovou skupinu Ser se použije OBZ1 a 2,6-dichlorbenzyl se použije jako ochranná skupina hydroxylové skupiny Tyr postranního řetězce. N-acetyldehydro-Pro se zavádí jako poslední aminokyselina, Boc-Arg(Tos) a Boc-D-Trp s nízkou rozpustností v CH2CI2 se naváží při použití směsi dimethylformamídu a methylendichloridu.

Odštěpení peptidu z pryskyřice a úplné odstranění ochranných skupin na postranním řetězci lze snadno provést působením kyseliny fluorovodíkové při teplotě 0 °C. Před působením kyseliny se přidá anisol. Po odstranění kyseliny ve vakuu se pryskyřice extrahuje 50% kyselinou octovou a promývací kapalina se lyofilizuje, čímž se získá surový pepthl ve formě prášku.

Čištění peptidu se pak provádí iontoměničovou chromatografií na karboxymethylcelulóze (Whatman CM 32) při použití 0,05 až 0,3 M octanu amonného ve směsi methanolu a vody v poměru 50 : 50 s následnou dělicí chromatografií filtrací na gelu pří použití směsi n-butanolu a 0,1 N kyseliny octové v objemovém poměru 1: 1.

Paptidy uvedené v tabulce byly zkoumány in vitro a in vivo. Při testu in vitro bylo použito buněk krysí hypofýzy, která byla pěstována v kultuře 4 dny před pokusem. Hladiny LH byly mírou odpovědi na aplikaci peptidů, výsledky byly zjišťovány radioimunologicky. Kontrolní vzorky buněk obsahovaly 3 mol LRF, pokusné buňky obsahovaly 3 mol LRF a 0,01 až 3 mol peptidu, získaného způsobem podle vynálezu. Pak bylo srovnáváno množství LH vylučovaného kontrolními vzorky a pokusnými vzorky. Výsledky byly propočítány a jsou uvedeny v tabulce IA jako molární koncentrační poměr zkoumaného peptidu k LRF, kterého je zapotřebí ke snížení množství LH, uvolňovaného 3 mol LRF na 50 % kontrolní hodnoty (ICR50).

Svrchu popsané peptidy byly použity k zábraně ovulace u krysích samic. Při tomto testu byly použity dospělé samice Sprague-Dowley o hmotnosti 225 až 250 g, samicím bylo podáno 5 nebo 10 pg peptidu v kukuřičném oleji v poledne při proestru. Proestrus je odpoledne před ovulací. Oddělená kontrolní skupina byla ponechána bez podání peptidu. U každé z kontrolních krys se dostavila ovulace. Jak je zřejmé z následující tabulky, peptidy účinně potlačily ovulací u krysích samic ve velmi nízkých dávkách a všechny peptidy byly zcela účinné v dávce 1 mg.

Tabulka IA

In vitro

Peptid 1'ČRso

In vivo (10 ^g) počet oivulujících krys

In vivo (5 ^g) počet ovulujících krys

1	0,039	0/10	4/7
2	0,070		7/9
3	0,021	0/10	0/10
4		9/10
5	0,011	0/10	2/10
6	0,010		5/7
7	0,030	1/10	7/10
8	0,125	3/10
9	0,044	1/7	9/9
10		5/10	4/7
11	0,048	1/10	4/10
12	0,29	5/10
13	0,11	3/4
14	0,05	1/3	8/10
Příklad 2

je možno získat v pevné fázi způsobem podle

Peptidy obecného vzorce příkladu 1 s výjimkou peptidu č. 20, který se získá na chlormethylované pryskyřici.

X-Ri-pCl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-Rí-Rí-Arg-Pro-Re

Pí to

CO ΙΌ 00 r-ý 00 00 O r-í σί 05 rH ψ CM CO o in> τ-T σΓ co t> lf) Η H oo co t>-~ 00 r-Γ t>

τ—1 .JI 1

NNNfNNMCSCNCSMMNNco

KKKKESttKXKXEKS

ZZZZZÍZZZZZZZZ i i i i i LJ i i i i i f i i jj* {X Ž? r^? 4^? Ž* r^? r—k*

00000^0000000 0· .3

1-3 h3 §

a z

CD

3 3 CD

21

CD CD

Š2 a a

Z Z

SJ

CD

3 3 3 3 CD CD CD CD CD 23 21 23 23 23 m m m ω f—< «r>k >r—I «1—1

Κ K ffi ffi QQQQ

TJ1 eej aaaaaaaaa annnn k k k k HH.kkkK 0 g g g QQQQQQQQQQ Z,Z.ZS^ τ—I

Pí o o o u c-< n o o a a o a t-l (-1 i ' 2 '

CMPmQQ feQ o o o o o o

ÍH tq tk tk ti tk

3T3 τί ΌΌ Ό N N ř*. £>. >> í>i Cs-ί 23 23

23 23 Λ 2! 23 N N^H 03 33332323'' tíTJTiTJTJTJHHQQ o

t-i

Oi

O tk

O tk

CL, ,

Q o

tk

TJ TJ 21 23

CD 3

O Ό

N H 23 > k Q □ CJCJUOUOUOUUOOU <<<<<<<<<<<<<<

ctí ώ

£5 α, Ctí 05 H Pí incDNoo^QH^cwincosco rHrHrHrHrHOOOOOOCMCMCMCMCMOj

Peptidy uvedené v tabulce byly zkoumány in vitro a. in vivo. Pokus in vitro byl opět proveden při použiti disociováných buněk krysí hypofýzy, které byly pěstovány v kultuře 4 dny před pokusem. Hladiny LH vznikající jako odpověď na aplikaci peptidů byly zjišťovány radioimunologicky.

Kontrolní vzorky byly pěstovány v prostředí s 3 mol LRF, pokusné buňky v prostředí se 3 mol LRF a mimoto 1 až 100 mol zkoumaného' peptidů. Množství LH vylučovaného kontrolními vzorky bylo srovnáno s množstvím, které bylo vylučováno vzorky pokusnými. Výsledky byly propočítány a jsou uvedeny v tabulce IIA jako poměr molární koncentrace zkoumaného peptidů ke koncentraci LRF, kterého je zapotřebí ke snížení množství uvolňovaného LH na 50 % kontrolní hodnoty. (ICRso).

Některé peptidy byly použity k zábraně ovulace u krysích samic. Při provádění tohoto pokusu bylo použito 4, 7, 9 nebo 10 dospělých krys Sprague-Dawley o hmotnosti 225 až 250 g, krysám bylo podáno· 0,02 mg peptidu, není-li uvedeno jinak v kukuřičném oleji v poledně při proestru. Proestrus je odpoledne před ovulací. Kontrolní skupinu tvořilo 10 krysích samic, kterým nebyl podán pepť.d. Všechny krysy z kontrolní skupiny ovulovaly. Jak je uvedeno v následující tabulce, byly peptidy účinné při zábraně ovulace u krysích samic ve velmi nízkých dávkách a všechny peptidy byly úplně účinné v dávce 1 mg.

Tabulka IIA

In vitro ICRso

Peptid in vivo počet ovuluiících krys

15	0,043	0/10
16	0,058	0/7
17	0,19	3/8
18	0,27	5/10
19	0,03	0/9
20	0,2
21	0,14	5/8
22	0,13	9/10
23	0,1
24	0,12
25	0,042	4/10
26	0,2	10/10
27	0,15	7/10
28	0,1	7/10

* 0,025 mg **0,010 mg

Příklad 3

Peptidy vzorce

X-Ri-R2-R3-Ser-Tyr-D-Trp-R5-Arg-Pro-R6 je možno získat v pevné fázi příkladu 1 s výjimkou peptidů č. 37, v jehož případě se použije chlormethylované pryskyřice.

237313 cí cí tx

LO <N tx.

tx

C-l <N M <N Cl C·) ůq £ £> O oq oq Oq 09 09

ΖΖΖΖΖΖΖΖΚΖΖΖΖΖΖ

I I I i I I < I LJ I I < I i ř>» ř>> e>> £*> >> í>> íti í>> t>> í**' ř—H r—I p—< r-H r—I p—I r-H t“— ι-H i—-I r—f *—* r—4 <“<

ϋϋϋϋϋϋϋϋΖϋϋΟϋΟΟ g

φ

Ω φ

G φ

U

Φ

1-3 |J 2 |J

3 φ Φ 1-3 Ω

Φ i-3

Tabulka III cí

Pí cí

X!

a ω

Cm

HHHHHHHHHHO4 ft &X H QQQQQQQQQQQHHQQ

ΦΦΦΦΦΦΦΦΦ^^ΙΛΟ)

Λ »G pG pG pCj 43 pG pG pG Ph f_< ·ζΗ Ρ-,Ρ-»Ρ-ίΡ-ιΡ-ιΟ-<Ο-ι(ΧιΡ-ιΕ-ίΕ-ιΙΧίΧί Ω a

I t I I I I 1 1 t I I I I Lj Cj qqqqqqqqqqqqqhh o o o o

JL| ÍH ř-í ř_, 0-1 CL) P_| p_i o o

ΟΛΟΡμΟΟΟΟΟΟΟ

£. I C_I I S-1 S_i C_1 t-1 ε_i c_i E-i ωωωω£ω£ο£££^£££

I I I 1 I I I | I I I I 1 I I

OOOOOOOOOOOOOOO

S-<í_lP-lP^f_lS-lí-lř-<P-lf-lS-lí-lf-lí-lt-<

Ό'ΰ'ΰΌ’ΰΌ'ΰ'ϋ’ΰ^ΟΰΌ'ΰ'ϋ'ΰ {>>

ΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦ

Όχί'ϋ^'ϋ'ϋ'ΰ'ϋ'ΰΌ'Ο'ύ'ΰ'ΰ'ΰ ?-4 f-4 f4

O O O N O O O N CJ

ΩΧ<Ω<<ΩΩΩω^^<Ω<

OTQr-ICMeO^LOCObsCOOOrHiNCO

CMČOCOQOCOOOCOOOCOQQOO^Mí'^’^

Peptidy uvedené v tabulce byly zkoumány in vitro a in vivo. Pokus in vitro byl opět proveden při použití disociovaných buněk krysí hypofýzy, které byly pěstovány v kultuře 4 dny před pokusem. Hladiny vznikající jako odpověď na aplikaci peptidů byly zjišťovány radioimunologicky. Kontrolní vzorky buněk byly pěstovány v prostředí s 3 mol LRF, pokusné buňky v prostředí se 3 mol LRF a nrmoto 1 až 100 mol zkoumaného peptidů. Množství LH vylučovaného kontrolními vzorky bylo srovnáno s množstvím, které bylo vylučováno vzorky pokusnými. Výsledky byly propočítány a jsou uvedeny v tabulce IIIA jako poměr molární koncentrace zkoumaného peptidů ke koncentraci LRF, kterého je zapotřebí ke snížení množství uvolňovaného LH na 50 % kontrolní hodnoty (ICRso).

Některé peptidy byly použity k zábraně ovulace u krysích samic, při provádění tohoto pokusu bylo použito 4, 7, 9 nebo 10 dospělých krys Sprague-Dawley o hmotnosti 225 až 250 g, krysám bylo podáno 0,2 mg peptidů, není-li uvedeno jinak v kukuřičném oleji v poledne při proestru. Proestrus je odpoledne před ovulací. Kontrolní skupinu tvořilo 10 krysích samic, kterým nebyl podán pepbd. Všechny krysy z kontrolní skupiny ovulovaly. Jak je uvedeno v následující tabulce,byly peptidy účinné při zábraně ovulace u krysích samic ve velmi nízkých dávkách a všechny peptidy byly úplně účinné v dávce 1 mg.

Tabulka IIIA

Peptid

In vitro ICRso in vivo počet ovulujících krys * 0,025 mg

Tyto peptidy je možno podávat savcům nitrožilně, podkožně, nitrosvalově, perorálně, intranazálně nebo do pochvy, čímž je možno dosáhnout inhibici a/nebo řízení fertility. Účinná dávka se pohybuje v závislosti na cestě podání a druhu savce. Příkladem typické formy pro podání je fyziologický roztok chloridu sodného s obsahem peptidů. Tento roztok se podává tak, aby bylo možno

0,5 : 1	4/10
0,8 :1	7/10
0,3 : 1	1/10
0,4 : 1	2/10
0,6 : 1	0/4

zaručit dávku 0,1 až 5 mg/kg. Perorálně je možno peptidy podávat v pevné nebo kapalné formě.

Přestože vynález byl popsán na základě výhodných provedení, je zcela zřejmé, že je možno navrhnout řadu modifikací, spadající rovněž do oboru vynálezu, je například možno použít jiné substituenty, které se podstatně neliší účúrností výsledného peptidů.

Claims (11)

1. PŘEDMĚT

   1. Způsob výroby peptidů ihibujících uvolňování gonadotropinů z hypofýzy savců obecného vzorce

   X-Ri-R2-R3-Ser-Tyr-R4-R5-Arg-Pro-R6, kde

   X znamená atom vodíku nebo acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku,

   Rl znamená dehydro Pro, dehydr-o D-Pro, Thz nebo D-Thz,

   R2 znamená D-Phe, D-His, D-Trp, Trp, Cl-D-Phe, dichlor-D-Phe, CF3-D-Phe, F-D-Phe, difluor-D-Phe, AcNH-D-Phe, kde

   Ac znamená acetyl, NO-D-Phe, dinitro-D-Phe, Br-D-Phe, dibrom-D-Phe, CH3S-D-Phe, OCH3-D-Phe nebo CH3-D-Phe,

   R3 znamená D-Trp, Trp, D-Phe nebo D-His,

   R4 D-iso-mer lipofilní α-aminokyseliny ze skupiny Arg, Lys, Trp, Phe, His, Tyr a C-fenylglycin,

   Rs znamená Leu nebo N“-Me-Leu vynalezu kde

   Me znamená methyl,

   Re znamená Gly-NH2 nebo NHCH2CH3, jakož i netoxických solí těchto peptidů, vy značující se tím, že se z meziproduktu obec ného vzorce

   X¹-Ri-R2-R3-Ser (X²) -Tyr- (X³ ] -Ri-Rs-Arg(X⁴)-Pro-X⁵, kde

   X¹ znamená ochrannou skupinu na a-aminoskupině,

   X² znamená ochrannou skupinu na alko holové hydroxylové skupině Ser,

   X³ znamená ochrannou skupinu na fenolové hydroxylové skupině Tyr,

   X⁴ znamená ochrannou skupinu na dusíkových atomech Arg a

   X⁵ se volí ze skupiny Gly-G-CH2( pryskyřice}, O-CH2-(pryskyřice), Gly-NH-(pryskyřice), Gly-NH2a NHCH2CH3,

   Ri, R2, R3, R4 a Rs mají svrchu uvedený význam,

   ÍS odštěpí alespoň jedna skupina X¹ až X⁵ a popřípadě se výsledný peptid převede na netoxlckou sůl.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vychází z meziproduktu v němž X¹ znamená acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku, Rz znamená 3,4-Cl-D-Phe a Rs znamená Leu a zbývající substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vychází z meziproduktu, v němž X¹ znamená acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku, Rz znamená 4 F-D-Phe a Rs znamená Leu a zbývající substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
4. 4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vychází z meziproduktu, v němž X¹ znamená acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku, R2 znamená 4 NO2-D-Phe a Rs znamená Leu a zbývající substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
5. 5. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vychází z meziproduktu, v němž X¹ znamená acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku, R2 znamená 2,4 Cl2-D-Phe a Rs znamená Leu a zbývající substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
6. 6. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vychází z meziproduktu, v němž X¹ znamená acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku, R2 znamená 3,4 Cl-D-Phe a Rs znamená Leu a zbývající substituenty mají význam uvedený v bodu 1.

   ltí
7. 7. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vychází z meziproduktu, v němž X¹ znamená acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku, R2 znamená 3,4 Cl2-D-Phe a Rs znamená N“MeLeu a zbývající substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
8. 8. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vychází z meziproduktu, v, němž X¹ znamená acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku, Ri znamená dehydro-Pro, R4 znamemená D-Trp, Rs znamená Leu a X⁵ znamená Gly-NH2 a zbývající substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
9. 9. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vychází z meziproduktu, v němž X¹ znamená acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku, Ri znamená dehydro-Pro, R4 znamená D-Trp, Rs znamená NⁿMeLeu a X⁵ znamená Gly-NH2 a zbývající substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
10. 10. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vychází z meziproduktu, v němž X¹ znamená acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku, Ri znamená dehydro Pro, R4 znamená D-Trp, Rs znamená N“MeLeu a X⁵ znamená Gly-NH2 a zbývající substituenty mají význam uvedený v bodu 1.
11. 11. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vychází z meziproduktu, v němž X¹ znamená acylovou skupinu až o 7 atomech uhlíku, Ri znamená dehydro Pro, R4 znamená (imBzl)D-His, Rs znamená Leu a X⁵ znamená Gly-NHz a zbývající substituenty mají význam uvedený v bodu 1.