KR840001957B1

KR840001957B1 - 데(마이시노실옥시)타일로신의 제조방법

Info

Publication number: KR840001957B1
Application number: KR1019810002108A
Authority: KR
Inventors: 헨리발츠 리차드; 뮤리엘 와일드 진; 토마스 세노 유진; 앤드류 커스트 허버트
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니; 아더 알. 웨일
Priority date: 1980-06-12
Filing date: 1981-06-12
Publication date: 1984-10-26
Also published as: CA1172190A; NZ197360A; IE811296L; YU144281A; GR75276B; PH15924A; PT73164A; ATE6468T1; JPS5731698A; KR830006430A; HU189979B; IE51613B1; EP0042694A1; IL63076A0; ZA813578B; CS225842B2; DE3162501D1; SU1134120A3; GB2077730A; RO81017A

Abstract

내용 없음.

Description

데(마이시노실옥시)타일로신의 제조방법

도면은 클로로포름중에서 DMOT(유리염기)의 적외선흡수 스펙트럼

본 발명은 마크롤라이드 항생물질, 특히 잘 알려진 치료제 타일로신[Tetrahedron Letters, 2339(1970)참조]과 유사한 화합물인 다음 일반식(Ⅰ)의 데(마이시노실옥시) 타일로신, 그의 아실 에스테르 및 이들의 산부가염의 제조방법에 관한 것이다.

상기식에서

Q는 -CH₂OH 또는 -CHO이다.

타일로신의 탁월한 효과에도 불구하고, 신규의 항생물질, 그 중에서 특히 내성균주의 출현 가능성면에서 신규한 항생물질을 개발하려는 끊임없는 요구가 있어왔다. 또한 구조적 변형에 의하여 항생물질의 감수성미생물에 대한 범위에 변화를 일으킬 수도 있다. 그러나, 타일로신-형 마크롤라이드 항생물질 구조의 화학적 변형은 상당히 어려운 것임이 입증되었다. 예를 들어 문헌 [J. Org. chem. 44(12), 2050-2(1979)]에는 화학적 방법에 의해 타일로신의 마이시노실 글리코사이드 결합을 분해하는데 수반되는 문제에 대하여 언급되어 있다.

실제로 대다수의 문제를 해결하기 위한 새로운 구조의 항생물질을 연구하고자 하는 본 분야의 연구자들은 배양에 의해 유사한 구조의 항생물질을 생성할 수 는 천연적으로 존재하거나 합성할 수 있는 새로운 미생물을 찾는데 중점을 두었다.

놀랍게도, 본 발명에 따라 타일로신과 유사하나 타일로신의 마이시노실옥시 작용기를 갖지않는 화합물이 특정한 스트렙토마이세스 프라디아에(Streptomyces fradiae) 균주의 액침 호기성 발효에 의해 제조될 수 있음을 알게되었다.

본 발명에 따라서 상기 일반식(Ⅰ)의 신규한 마크롤라이드 항생물질 또는 그의 아실 에스테르 또는 일반식(Ⅰ)의 화합물 및 그의 에스테르의 산부가염을 함유하는 수의과용 조성물이 제공된다.

상기 구조식에는 어떠한 입체화학적 배위도 지적되어 있지 않지만 본 발명 화합물의 입체화학적 배위는 타일로신의 배위와 동일하다. 중성 당은 마이카로즈이며 아미노당은 마이카미노즈이다.

Q가 -CHO 일때 일반식(Ⅰ)의 화합물은 신규 마크롤라이드 항생물질, 즉 23-데(마이시노실옥시) 타일로신이며, 본 명세서에서는 편의상 데(마이시노실옥시)타일로신 또는 DMOT라 칭하고 다음 구조식으로 나타낼 수 있다.

DMOT의 디하이드로 유도체, 즉 20- 디하이드로-23 데(마이시노실옥시) 타일로신은 본 명세서에서 편의상 디하이드로-DMOT라고 부르며 다음의 구조를 갖는다 :

DMOT 및 디하이드로-DMOT는 동물에 대해 병원성인 미생물의 성장을 억제한다. 더욱 특히, 이들은 그람양성 미생물 및 마이코플라스마종(Mycroplasma species)에 대해 특히 활성이 있는 항균제이다.

DMOT 및 디하이드로-DMOT의 하이드록실그룹은 2',4",3" 및 3-하이드록실그룹상에서 에스테르화되어 유용한 아실 에스테르 유도체를 형성할 수 있다. 또한 디하이드로-DMOT는 20-하이드록실 그룹상에서 에스테르화될 수도 있다. 2'-하이드록실그룹의 에스테르화가 가장 용이하다. 전형적인 에스테르는 모노카복실산의 에스테르 또는 탄소수 2 내지 18의 디카복실산의 헤미에스테르이다.

DMOT, 디하이드로-DMOT 및 이들의 아실 에스테르 유도체는 염기성 화합물이며, 산으로 처리할시, 산부가염으로 전환된다. 이들 산부가염도 또한 본 발명에 포함된다. 간소화를 위하여 "DMOT 화합물"이란 용어를 사용하며, 이는 DMOT, 디하이드로-DMOT, 이들 화합물의 특점 아실 에스테르 유도체 또는 DMOT, 디하이드로-DMOT 또는 이들의 아실 에스테르 유도체의 약제학적으로 허용되는 산부가염을 의미하는 것이다.

본 발명은 또한 신규 균주인 스트렙토마이세스 프라디아에 NRRL 12171 및 이 균주를 상당량의 항생물질 활성이 생성될 때까지 액침 호기성 발효조건하에서 배양함으로써 DMOT 또는 디하이드로 -DMOT를 생성하는 방법에 관한 것이다. DMOT 또는 디하이드로-DMOT는 염기화된 배양여액으로부터 극성 유기용매로 추출할 수 있으며, 흡착 또는 수출조작에 의해 더 정제할 수 있다.

본 발명은 DMOT 또는 디하이드로-DMOT의 온화한 산 가수분해에 의해 각각 23-데옥시-5-0-마이카미노실 타일로놀라이드(약자 DMOT로 표시함) 및 20-디하이드로-23-데옥시-5-0-마이카미노실 타일로놀라이드(디하이드로-DMOT)를 제조하는 신규한 방법에 관한 것이다. DMOT는 다음의 구조를 가진다 :

디하이드로-DMOT는 화학적 환원 방법에 의해서나 발효에 의해서 수득할 수 있다. 화학적 환원 방법에 의해 디하이드로-DMOT를 제조할 경우에는, 예를 들어 알콜성 용매중에서 나트륨 보로하이드라이드와 같은 거의 화학량론적 양의 화학적 환원제로 처리하는 것과 같은 공지된 방법을 사용할 수 있다. 디하이드로-DMOT는 또한 조절된 발효조건하에서 본 발명의 스트렙토마이세스 파라디아에 NRRL 12171에 의해 제조할 수도 있다.

DMOT와 디하이드로-DMOT는 본 분야에서 공지된 방법을 사용하여 아실화제로서 처리함으로서 2',4",3" 및 3-위치에서 에스테르화하여 아실 에스테르 유도체를 생성시킬 수 있다. 그외에도, 디하이드로-DMOT는 20-위치에서 에스테르화할 수 있다. 2'-하이드록실그룹의 에스테르화가 가장 용이하다. 대표적 아실화제에는 유기산의 무수물, 할라이드(통상적으로 염기 또는 기타 산제거제와 병용한다) 및 활성 에스테르등이 포함된다. 아실화는 유기산과, N,N'-디사이클로헥실 카보디이미드와 같은 탈수제의 혼합물을 사용하여 수행할 수도 있다. 아실화는 또한 미합중국 특허 제4,092,473호에서 오까모도(Okamoto)등에 의해 기술된 바와 같이 효소적으로 수행할 수도 있다. 형성된, 아실유도체는 공지 방법에 의해 분리 정제할 수 있다.

2'-모노에스테르 유도체는 본 분야에서 일반적으로 공지된 선택된 에스테르화 방법, 예를 들면 항생물질을 화학량론적 양(또는 약간 과량)의 아실화제(예 : 아실 무수물)로 실온에서 에스테르화가 거의 완결될 때까지 약 1시간 내지 약 24시간동안 처리함으로써 제조될 수 있다. 2'-모노에스테르는 반응 혼합물로부터 추출 크로마로그라피 및 결정화등의 표준 공정에 의해 분리할 수 있다.

유용한 아실 에스테르는 지방족, 시클로지방족, 아릴, 아르알킬, 헤테로 시클릭 카복실산, 설폰산 및 알콕시카본산등을 포함하는 유기산, 바람직하게는 탄소수 2 내지 18의 산, 더욱 바람직하게는 탄소수 2 내지 12의 산의 에스테르이다.

대표적인 적절한 에스테르에는 아세트산, 클로로아세트산, 프로피온산, 부티르산, 이소발레르산, 알콕시카본산, 스테아르산, 시클로프로판카복실산, 시클로헥산카복실산, β-시클로헥실프로피온산, 1-아다만탄카복실산, 벤조산, 페닐아세트산, 펜옥시아세트산, 만델산 및 2-티에닐아세트산 및 알킬-, 아릴- 및 아르알킬-설폰산, 방향족 잔기상에 임의로 할로겐, 니트로, 저급알콕시등의 치환체를 가지는 아릴-및 아르알킬-산등으로부터 유도되는 에스테르등이 포함된다. 적당한 에스테르에는 또한 석신산, 말레산, 푸마르산, 말론산 및 프탈산과 같은 디카복실산으로부터 유도된 헤미-에스테르가 포함된다.

약제학적으로 허용되는 에스테르 유도체가 바람직한 그룹이다. 그러나 기타 에스테르 유도체도 중간체로 유용하다.

DMOT, 디하이드로-DMOT 및 이들의 특정한 아실 에스테르 유도체는 산부가염을 형성한다. DMOT, 디하이드로-DMOT 및 이들의 아실 유도체의 산부가염도 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 염은 예를 들면 DMOT, 디하이드로-DMOT 및 이들의 아실유도체를 분리 및 정제하는데 유용하다. 이외에도 이러한 염은 물에서 개선된 용해도를 나타낸다.

대표적인 적절한 염에는 황산, 염산, 인산, 아세트산, 석신산, 시트르산, 락트산, 푸마르산, 말레산, 팔미트산, 콜산, 파모산, 무스산, D-글루탐산, d-캄포산, 글루타르산, 글리콜산, 프탈산, 타타르산, 포름산, 라우르산, 스테아르산, 살리실산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 소르브산, 피크르산, 벤조산, 신남산등의 유기 및 무기산과의 통상적인 반응에 의해 형성된 염들이 포함된다.

본 발명의 염중 특히 바람직한 그룹은 약제학적으로 허용되는 산부가염이다. "약제학적으로 허용되는" 염은 온혈동물의 화학요법에 이용될 수 있을 정도로 충분히 비독성인 염류이다.

본 발명은 또한 DMOT 및 디하이드로-DMOT의 온화한 산가수분해에 의해 각각 23-데옥시-5-마이카미노실 타일로노라이드(3)(DMOT) 및 디하이드로-DMOT를 제조하는 신규의 방법에 관한 것이다. 온화한 산 가수분해 조건은 본 분야에서 잘 알려져 있다.

pH 약 4이하의 적당한 용액이 가수분해 반응에 사용될 수 있다. 약 20

내지 약 100℃의 온도가 이 방법에 사용될 수 있다. 가수분해를 수행하는 데 필요한 반응시간은 사용되는 반응 혼합물의 pH 및 온도에 따라 변한다. pH가 높으면 높을수록 반응속도는 늦어지며, 온도가 높으면 높을수록 반응 속도는 빨라진다. 반응은 DMOT 또는 디하이드로-DMOT를, 마이카로실 그룹을 제거하여 각각 DMOT 또는 디하이드로-DMOT를 생성시키기에 충분한 시간동안 온화한 산용액으로 처리하여 수행한다.

또한 때로는, DMOT 또는 디하이드로-DMOT는 이들이 생성되는 발효육즙중에서 상술한 바와 같은 온화한 산성조건을 사용하여, DMOT 또는 디하이드로 -DMOT를 각각 DMOT 또는 디하이드로-DMOT로 전환시키는데 충분한 시간동안 처리함으로써 제조하는 것이 바람직하다. 이렇게하여 제조된 DMOT 또는 디하이드로-DMOT는 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 발효육즙으로부터 분리할 수 있다.

DMOT는 데폭시시라마이신 A₁(데-에폭시 시라마이신 A₁)과 동일하다. 데폭시시라마이신 A₁의 제조 및 활성은 문헌 [H. Tsukiura et al., J. Antibiotics 22(3), 89-99 및 100 내지 105(1969)]에 기술되어 있다. 츄키우라등은 시리마이신 A₁을 아세트산중에서 요오드화칼륨으로 처리함으로써 데폭시시라마이신 A₁을 제조하였다.

DMOT를 제조하는 또 다른 가능한 방법이 문헌[T. Suzuki et al., Chemistry letters 1973, 793-798]에 제안되었다. 이 방법은 아세트산중에서 항생물질 B-58941을 요오드화 칼륨으로 처리하여 데폭시시라마이신 A₁와 동일한 것으로 예상되는 생성물을 수득하는 방법이다.

DMOT는 또한 각각 4'-하이드록시-M-4365 G₂또는 데-에폭시-4'-하이드록시로사마이신으로써, M-4365 G₂(레프로마이신) 및 로사마이신과 관련된 화합물이다. [A. Kinumaki 등, J. Antibiotics 30(6), 450-454(1977) 참조]. 그러나 M-3465 G₂또는 로사마이신으로부터 DMOT의 제조는 실제로 불가능하다.

DMOT 및 디하이드로-DMOT는 이들 화합물을 생성하는 스트렙토마이세스 프라디아에 균주를 적당한 배지내에서 액침 호기성 조건하에 상당량의 항생물질 활성이 생성될 때까지 배양함으로써 제조할 수 있다. 본 분야의 전문가들이 알 수 있는 바와 같이, DMOT는 일차적으로 발효공정에서 발효공정에서 생성된다. 디하이드로-DMOT는 발효가 장시간동안 수행되고 따라서 존재하는 DMOT가 효소적으로 환원되는 경우에 생성된다.

스트렙토마이세스 프라디아에 NRRL 12171의 배양에 사용되는 배지로는 여러가지 배지중 어느 것이나 될 수 있다. 그러나 생산의 경제성, 최적수율 및 생성물 분리의 용이성을 위해서는 특정한 배지가 바람직하다. 따라서 예를 들어 대규모 발효시에 바람직한 탄소 공급원에는 덱스트린, 글루코오즈, 전분 및 옥수수 가루와 같은 탄화수소류 및 대두유와 같은 오일등이 포함된다. 바람직한 질소 공급원에는 옥수수가루, 콩가루, 어분, 아미노산등이 포함된다. 영양소중에서 배지에 함께 첨가할 수 있는 무기염류에는 철, 칼륨, 나트륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 클로라이드, 카보네이트, 설페이트, 니트레이트등의 이온을 생성할 수 있는 통상적인 가용성 염류가 있다.

세균의 성장 및 발육에 필요한 필수 미량원소가 또한 배지중에 포함되어야 한다. 이러한 미량원소는 통상적으로 세균의 성장에 필요한 조건을 충족시키기에 충분한 양으로 배지중의 다른 성분에 불순물로서 존재한다. 만일 기포 형성이 문제가 된다면 대규모 발효 배지에 폴리프로필렌글리콜(분자량 약 2,000)과 같은 소포제를 소량(즉 0.2ml/L)으로 가하는 것이 필요할 수도 있다.

다량의 DMOT 또는 디하이드로-DMOT를 제조하기 위하여는, 탱크중에서 액침 호기성 발효가 바람직하다. 소량의 DMOT 또는 디하이드로-DMOT는 진탕-플라스크 배양에 의해 수득할 수 있다. 미생물의 포자체를 대규모 탱크 배양에서 접종물로 사용하여 항생물질을 제조하는 경우에 통상적으로 시간이 지연되기 때문에 증식용 접종물을 사용하는 것이 바람직하다. 증식용 접종물은 소량의 배지를 미생물의 포자체 또는 균사단편으로 접종하여, 신선하고 활발히 성장하는 미생물의 배양물을 얻음으로써 제조된다. 그후 증식용접종물을 대규모 탱크에 옮긴다. 증식용 접종물의 제조에 사용되는 배지는 대규모 발효에 사용되는 배지와 동일할 수도 있으나, 다른 배지를 사용할 수도 있다.

스트렙토마이세스 파라디아에 NRRL 12171은 약 10

내지 약 37℃의 온도에서 성장할 수 있다. 항생물질 생성의 최적 온도는 약 28℃이다.

액침 호기성 배양 공정에서 통례인 것처럼, 멸균 공기를 배지에 통과시킨다. 효율적인 항생물질 제조를 위하여 탱크 제조에 있어서의 공기포화율을 약 30% 이상으로 하여야한다(28℃ 대기압에서).

항생물질의 제조시에는 발효 과정중에 이들 항생물질에 대해 감수성인 것으로 알려진 미생물에 대한 육즙시료의 시험을 수행할 수 있다. 유용한 분석 미생물로는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 9144가 있다. 생물학적 검정은 자동비탁법에 의해 편리하게 수행한다. 이외에도, 항생물질 제조는 UV 검출과 함께 고성능 액체 크로마토그라피로 용이하게 모니터할 수 있다.

액침 호기성 발효조건하에서 제조한 후에, DMOT 또는 디하이드로-DMOT는 발효 분야에서 사용되는 방법에 의해 발효 배지로부터 회수할 수 있다. DMOT 또는 디하이드로-DMOT의 회수는 발효육즙의 초기여과에 의해 달성된다. 그후 여과된 육즙은 더 정제해서 원하는 항생물질을 얻을 수 있다. 이러한 정제에는 여러 기법을 사용할 수 있다. 여과한 육즙의 정제에 바람직한 기법은 육즙을 약 pH 9로 조정하고 육즙을 에틸 아세테이트, 아밀 아세테이트 또는 메틸 이소부틸 케톤등의 적당한 용매로 추출한뒤, 유기상을 산성 수용액으로 추출하고 수성 추출액을 염기성으로 조정함으로써 항생물질을 침전시키는 것을 포함한다. 더 정제하기 위하여는 추출, 흡착 및/또는 침전 방법을 사용한다.

본 발명의 신규 미생물은 타일로신을 생성하는 스트렙토마이세스 프라디아에 균주의 화학적 돌연변이에 의해 수득된다. 돌연변이에 의해 수득된 미생물은 타일로신은 최소량만을 생성하고 주성분으로서 DMOT를 생성한다.

신규 미생물을 특정화시키기 위해서는 미생물을 에스. 프라디아에 NRRL 2702로부터 유도된 타일로신 생성 균주인 스트렙토마이세스 프라디아에 균주 M48-D2724. 1과 비교한다. 에스. 프라디아에 NRRL 2702는 1965년 4월 13일 특허원 미합중국 특허 제 3,178,341호에서 해밀등에 의해 기술되었다. 본 명세서에서는 타일로신 생성 에스. 프라디아에 M-48-E 2724. 1 배양물을 E2724. 1"라 칭한다.

신규의 DMOT 및 디하이드로-DMOT-생성균주 NRRL 12171은 또한 스트렙토마이세스 프라디아에 균주로서 분류된다. 이 미생물의 특정화에는 스트렙토마이세스 종의 특정화를 위한 International streptomyces Project의 추천 방법을 특정한 보충시험과 함께 [E·B. Shirling and D. Gottlieb, "Methods For Characterization of Streptomyces Species," Internal. Journal of Systematic Bacteriology, 16(3), 313-340(1966)]수행한다. 문헌중 에스. 프라디아에에 대해서는 다음과 같은 문헌을 참고했다. 1) R.E. Buchanan and N.E. Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8th ed., The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md., 1974, p.815; and 2) E.B. Shirling and D. Gottlieb, "Cooperative Description of Streptomyces. II. Species Description from First Study, "Internal, Journal of Systematic Bacteriology, 18(2), 118, (1968).

DMOT-생성 균주에 대한 이하의 기술 내용은 그의 특성을 타일로신-생성 에스. 프라디아에 균주 "E2724. 1"의 특성과 비교한 것이다.

신규 균주 및 E2724. 1균주의 포자쇄 형태학은 레티나 컬룸-아퍼룸(Retinaculum-Apertum; RA)편에 있다. 혹크형, 루프형 및 불규칙한 코일형은 짧으며 일반적으로 직경이 넓지않다. E2724. 1 균주에 대해서는 ISP #2(효모-맥아추출물 한천)상에서, 신규 균주에 대해선 자펙크(Czapek)용액 한천상에서 가장 잘 관찰된다.

포자표면은 매끄러우며 포자형태는 평균직경 0.65μM의 구형이다. 직경범위는 0.61 내지 0,71μM이다.

이들 균주 사이의 가장 분명한 차이점은 배양특징에서 알 수 있다. E2724. 1 균주는 대부분의 배지상에 기중 균사체를 상당히 잘 생성하며 백색 계열로 존재한다. 그러나 본 발명의 신규 균주는 기중 균사체를 거의 생성하지 않는다. 존재하는 경우에는 백색 내지 회색계열로 존재한다.

이들 집락의 반대면에서는 어떠한 명백한 색소도 생성하지 않는다. 이들의 색은 연황색 내지는 중황색이다. 멜라노이드 색소생성은 음성이다(*멜라노이드 색소 생성은 ISP #1(트립톤-효모추출육즙), ISP #6(펩톤 효모 추출물-철 한천), ISP #7(타일로신 한천), 및 타일로신이 없는 ISP #7 한천을 사용하여 시험한다).

E2724.1 균주와 본발명의 신규한 균주사이의 중요한 유사점 및 상이점은 표 1에 요약하였다.

[표 1]

스트렙토마이세스 프라디아에 E2724. 1과 NRRL12171의 비교

에스 프라디아에 E2724.1과 NRRL 1217.1 균주의 형태학 및 성장특성은 표 2에 비교되어 있다. 또한, 이하의 표에서는 항생물질 감수성 (표 3), 탄소이용율(표 4) 및 여러가지 생리학적 특성 (표 5)이 비교된다.

[표 2]

성장특성 및 형태학

1. 포자표면모양은 스캔닝(Scanning) 전자형미경을 사용하여 측정한다.

2. G=성장, R=집락의 반대면, Am=기중균사체, Sp=용성색소,

3. 색명은 ISCC-NBS 칼라차트를 사용하여 정의한다. (K.L. Kelly and D.B. Judd. "The ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample No. 2106," U.S. Dept. of Commerce, National Bureau of Standards. Washington, D.C.20234)

[표 3]

항생물질 감수성^{a, b}

a 접종한천 평판상에 놓인 감수성 디스크를 사용하여 측정함.

b - = 저항성(억제대 없음)

+ = 감수성(억제대)

tr = 약간의 감수성

[표 4]

탄소이용율^{a. b}

a- = 이용하지 않음

b+ = 이용함

여과 멸균된 탄소공급원을 최종농도 1.0%가 되도록가한 International Streptomyces Project (ISP)#9(탄소 이용한천) 기본 배지상에서 측정함.

평판배지는 30℃에서 배양시키고 7일 및 12일 후에 관찰

[표 5]

여러가지 생리적 특성

1. ISP#2(효모추출물-맥아추출물 한천) 배지상에서 7일 배양

2. 다음 완충액을 0.05M 농도를 사용하여 측정함 ; 시트르산, pH3,4,5 : 2-(N-몰폴리노)에탄설폰산, pH6

3-(N-몰폴리노) 프로판설폰산, pH7 ; N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산, pH8 ; 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판디올, pH9 : 3-사이클로헥실아미노-1,1-프로판설폰산, pH10, 11. 7일 배양후 한천의 pH는 몇몇 완충액이 이들의 조절된 pH를 유지하는데 실패하였기 때문에 정확한 수치로 생각되었다. 완충독성은 모든 완충액을 pH 7.0으로 조절하고 성장을 측정함으로써 시험되었다. 독성은 현저히 나타나지 않는다.

3. 5, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50 또는 55℃에서 시험.

4. 한천에 다음 중량%의 NaCl을 가함으로써 측정 : 0, 2, 3, 6, 8, 10 및 12% NaCl(중량비)

5. 전분 가수분해 ISP #4 (무기염류-전분한천) 평판상에서 요오드로 전분의 존재를 시험함으로써 측정되었다.

6. 블라체빅과 에더러의 방법은 효소분석에 따랐다. (D.J. Blazevic and G.M. Ederer, "Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology", John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1975).

전술한 특성에 근거해서, DMOT-및 디하이드로-DMOT를 생성하는 미생물 NRRL 12171은 스트렙토마이세스 프라디아에의 신규 균주로서 분리된다. 이 신규 배양물은 Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region (1815 North University Street, Peoria Illinois, 61604)에 기탁되었으며 기탁번호 NRRL 12171로 이용할 수 있다.

다른 미생물의 경우와 마찬가지로, 스트렙토마이세스 프라디아에 NRRL 재조합체(recombinants) 12171의 특성도 변화를 받게된다. 예를 들면 NRRL 12171 균주의 돌연변이체 및 인공변이체는 자외선, X선, 감마선 및 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘 같은 여러가지 공지된 물리적 및 화학적 변이유발물질로 처리하여 수득할 수 있다. DMOT 생성의 특성을 보유하는 모든 천연 및 인공변이체, 돌연변이체 및 이들의 제조합체도 본 발명에 사용할 수 있다.

DMOT 화합물은 병원성 세균, 특히 그람양성 세균 및 마이코플라스마(Mycoplasma)종의 성장을 억제한다. 예를 들어 표 6에는 표준 한천희석시험에 의해 측정된, DMOT(유리염기)가 특정 세균을 억제하는 최소억제농도(MIC)가 요약되어 있다.

[표 6]

DMOT 유리염기의 시험관내 활성

본 발명의 DMOT 화합물은 실험적 세균 감염에 대해 생체내에서 항균 활성을 나타낸다. 시험 화합물의 두가지 용량을 실험적으로 감염된 마우스(mouse)에 투여했을 때 관찰된 활성은 ED₅₀치 [50%의 시험동물을 보호하는데 유효한 용량 mg/kg : 워렌 윅등 J. Bacteriol. 81,233-235(1961) 참조]로 측정한다.

DMOT에 대해 관찰된 DD₅₀치는 표 7에 주어진다.

[표 7]

DMOT^a의 ED₅₀치

가금에서 마이코플라스마 감염의 예방 또는 치료를 위해서는 유요한 비독성량의 DMOT 화합물을 경구 또는 비경구로 조류에 투여한다. DMOT 화합물은 조류가 섭취하는 물과 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여하는 것이 가장 편리하다.

[실시예 1]

A. DMOT의 진탕플라스크 발효

스트렙토마이세스 프라디아에 NRRL 12171의 동결건조된 펠렛을 1 내지 2ml의 멸균수에 분산시킨다. 이 용액의 일부(0.5ml)를 사용하여 다음과 같은 조성의 증식용 배지(150ml)를 접종한다 :

또한, 액체 질소중에 1ml 용량으로 보존된 에스. 프라디아에 NRRL 12171의 증식용 배양물을 신속히 녹여서 증식용 배지를 접종하는데 사용한다. 접종된 증식용 배지를 300rpm의 밀폐된-박스상 진탕기상에서 약 48시간동안 29℃로 500ml 삼각플라스크중에서 배양한다.

이렇게 배양된 0.5ml의 증식용 배지를 사용하여 다음과 같은 조성의 제조용 배지 7ml를 접종한다 :

배양된 발효배지를 300rpm의 밀폐된-박스상 진탕기상에서 약 6일동안 29℃로 50ml 병중에서 배양시킨다.

B. DMOT의 탱크발효

보다 대량의 접종물을 제공하기 위하여, 상기 A항에서 기술된 것과 유사한 방법으로 제조된 60ml의 배양된 증식용 배지를 사용하여 다음 조성의 제2단계 증식용 배지 38

를 접종한다 :

pH는 50% NaOH 용액으로 8.5로 조정한다. 이 제2단계 증식용 배지는 29℃에서 약 47시간동안 68리터 탱크중에서 배양시킨다.

이렇게 제조된 배양된 제2단계 배지 4

를 사용하여 다음과 같은 조성의 멸균제조용 배지 40

를 접종한다 :

pH는 50% NaOH 용액으로 7.2로 조정한다.

접종된 생산용 배지를 68

의 탱크에서 28℃로 약 5일간 발효시킨다. 발효배지에 멸균된 공기를 통과시켜 용존 산소량이 약 30 내지 50% 되게하고 통상의 교반기를 사용하여 약 300rpm으로 교반한다.

[실시예 2]

DMOT의 분리

실시예 1에서 기술된 바와 같이 하여 수득한 발효육즙(pH7.2)을 여과보조제를 사용하여 여과한다. 400ml의 에틸아세테이트를 1,450ml의 여액에 가한다. 수산화나트륨을 가하여 용액의 pH를 9.1로 조정한다. 용액을 10분간 교반하고 에틸 아세테이트를 분리시킨다(유탁액을 등명하게 하기 위해 여과보조제를 통과시켜 여과함). 여액을 다시 에틸아세테이트 200ml로 추출한다. 200ml의 물을 혼합된 에틸아세테이트 추출물에 가하고 이 용액의 pH를 인산으로 4.1이 되도록 조정한다. 추출한후 수성상을 분리하고 유기상으로 제거한다. 수산화나트륨으로 수층을 pH 9.1로 조정하고 이어서 진공하에서 약 100ml 정도로 농축시킨다. 무정형의 침전이 형성된다. 침전물을 하룻밤 방치한후 여과하여 분리시킨다. 침전을 20ml의 아세톤에 용해시키고 75ml의 물을 가한다. 진공하에서 용액을 농축하여 아세톤을 제거시킨다. 형성된 침전을 여과하여 분리하고 수세하면 약 500mg의 DMOT가 수득된다. 여액을 동일방법으로 처리하여 추가로 260mg의 DMOT를 수득한다.

[실시예 3]

DMOT의 제조

실시예 2에 기술한 바와 같이하여 제조된 11g의 DMOT를 묽은 염산용액에 용해시킨다(용액의 pH가 1.8이 될 때까지 염산을 물에 가한다).

생성된 용액을 실온에서 24시간 방치하고 이어서 수산화나트륨을 가하여 pH를 9.0으로 조정한다. 생성된 염기성 용액을 클로로포름으로 추출한다. 크롤로포름 추출물을 진공건조시켜 9.65g의 DMOT를 수득한다. 첨부된 도면은 클로로포름중 DMOT(유리염기)의 IR 흡수 스펙트럼을 나타낸 것이다.

DMOT는 약 158℃에서 연화되고 약 165 내지 167℃에서 용융되는 무정형의 고체이다. 원소분석 : C₃₈H₆₃NO₁₂탄소 62% ; 수소 8% ; 질소 2% ; 산소 27% : 분자량은 약 726(질량분석기로 측정한 결과 725).

클로로포름중, DMOT(유리염기)의 IR 흡수 스펙트럼은 첨부된 도면에서 보는 바와 같다.

다음과 같은 파수(cm^-1)에서 최대 흡수가 일어난다. 3,653(약), 3,588(쇼울더), 3,470(브로드), 3,026(쇼울더), 2,998(쇼울더), 2,969(강), 2,932(강), 2,873(쇼울더), 1,709(강), 1,669(중), 1,616(매우 약), 1593(강), 1,447(중), 1,400(중), 1,364(중), 1,309(중), 1,278(약), 1,175(중), 1,151(중), 1,106(약), 1,066(쇼울더), 1,036(강), 1,001(중), 982(중), 972(쇼울더), 946(약), 913(매우 약), 891(매우 약), 853(매우 약), 826(약).

중성 에탄올중 DMOT의 자외선 흡수 스펙트럼은 283nm(ε21,500)에서 최대흡수를 나타낸다.

DMOT(유리염기)는 하기와 같은 비선광도를 갖는다 :

-62.75

(농도 : 1, 메탄올).

66%수성 디메틸 포름아미드내에서 DMOT를 전위차 적정한 결과 pKa 약 7.3에서 적정 가능한 그룹이 존재함을 나타내었다.

DMOT 유리염기는 물에는 매우 조금 용해되지만, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 디메틸 포름아미드, 클로로포름 및 디메틸설폭사이드와 같은 대부분의 극성유기용매에는 대단히 잘 용해된다. DMOT산부가염은 DMOT염기보다 물에 잘 용해된다.

[표 8]

DMOT^a의 박층 크로마토그라피

^a매질 : 머크, 다름스타트(Merck, Darmstadt) 실리카겔 60

^b용매 : A = 에틸아세테이트 : 디에틸아민 (96 : 4)

B = 아세톤 : 에탄올(2 : 1)

C = 클로로포름 : 메탄올(3 : 1)

DMOT 타일로신과 별개의 화합물이며 페퍼 및 박층 크로마토그라피에 의해 DMOT와 구별할 수 있다.

본 항생물질의 Rf 및 Rx 치는 표 8 및 9에 기재되어 있다. 표 9에서 Rx 치는 타일로신을 1.0으로 하여 상대적으로 표시한 이동율이다. 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 사용하는 생물학적 자기묘사법을 검출에 사용한다.

[표 9]

DMOT^a의 페퍼크로마토그라피

^b페퍼 : 0.75M KH₂PO₄(pH4.0)의 완충액으로 처리하여 건조시킨 왓트만 No. 1

_a용매 : D = 물로 포화시킨 에틸아세테이트

E = 물로 포화시킨 n-부탄올

[실시예 4]

디하이드로-DMOT의 제조

실시예 2에 기술된 바와 같이 하여 제조한 50mg의 DMOT를 25ml의 이소프로필 알콜수용액(약 40%)에 용해시킨다. 20mg의 나트륨 보로하이드라이드를 30%이소프로필 알콜수용액에 용해시킨다. DMOT가 함유된 상기용액에 1ml의 NaBH₄용액을 가한다. 생성된 혼합물을 5분간 교반하고 인산으로 7.5로 조정한후 진공하에서 농축시켜서 이소프로필알콜을 제거한다. 50ml의 클로로포름을 가한다. 수성상의 pH를 7.5로 조정한다. 추출후, 클로로포름을 분리하여 진공하에서 증발 건고시켜 디하이드로-DMOT를 수득한다.

[실시예 5]

디하이드로-DMOT의 제조

실시예 4의 방법으로 제조한 디하이드로-DMOT를 실시예 3의 방법으로 처리하여 디하이드로-DMOT를 수득한다.

[실시예 6]

DMOT를 제조하는 변형방법

실시예 3에 기술된 바와 같이 완화한 산을 사용하여 발효 육즙중의 DMOT를 처리하여 DMOT로부터 DMOT를 제조한다. DMOT의 분리는 실시예 2에서 DMOT에 대해 기술한 방법과 유사한 방법으로 수행한다.

[실시예 7]

2'-0-아세틸-DMOT

5.0g의 DMOT(6.9 밀리몰)을 150ml의 아세톤에 용해시키고 실온에서 교반하면 0.84ml의 무수 아세트산(8.2밀리몰)을 적가한다. 17시간동안 교반한후, 용매를 감압하에 증발시킨다. 잔사를 소량의 에틸아세테이트에 용해시키고 실리카겔(Waters Prep 500)상에서 크로마토그라피한다. 4

의 에틸아세테이트로 용출시킨다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 혼합하여 감압하에 증발건고시켜 4.2g의 2'-0-아세틸(80%)을 수득한다.

2'-0-아세틸-4"-0-페닐아세틸-DMOT

2.7g의 2'-0-아세틸-DMOT(3.5밀리몰)을 70ml메틸렌클로라이드 및 0.8ml의 피리딘에 용해시키고 실온에서 교반하면서 30ml의 메틸렌 클로라이드중의 0.56ml의 페닐아세틸클로라이드(3.5밀리몰) 용액을 적가한다.

6시간후, 용매를 증발시키고 잔사를 메틸렌클로라이드에 용해시키고 중탄산나트륨 포화용액으로 추출한다. 유기층을 분리하여 황산나트륨으로 건조시키고 여과하여 증발시킨다. 잔사를 에틸아세테이트에 용해시키고 실리카겔(Waters Prep 500)상에서 크로마토그라피한다. 칼럼을 4

의 에틸아세테이트로 용출한다. 목적하는 생성물을 함유하는 분획을 혼합하여 증발건고시켜 1.2g의 2'-0-아세틸-4"-0-페닐아세틸-DMOT(38%)를 수득한다.

[실시예 9]

2'-0-아세틸-4"-0-이소발레릴-DMOT

유사한 방법으로, 29ml의 피리딘중의 1.2g의 2'-0-아세틸-DMOT(1.6밀리몰)을 0℃에서 교반하며 0.7ml 이소바레릴클로라이드(3.8밀리몰)로 처리한다. 그후 조생성물을 톨루엔에 용해시키고 섬광크로마토그라피에 의해 실리카겔상에서 크로마토그라피한다. 톨루엔-에틸아세테이트(9 : 1에서 1 : 2까지) 혼합물로 칼럼을 용출시켜 0.12g의 생성물을 수득한다. 이어서 메틸렌클로라이드로 칼럼을 용출시켜 0.84g의 2'-0-아세틸-4"-0-페닐아세틸-DMOT(55%)를 수득한다.

[실시예 10]

4"-0-이소발레릴-DMOT

0.4g의 2'-0-아세틸-4"-0-이소발레릴 DMOT(0.47밀리몰)을 30ml의 80% 수성 메탄올에 용해시키고 4.5시간동안 환류시킨다. 용액을 실온으로 냉각시키고 감압하에 증발 건고시켜 0.13g의 4"-0-이소발레릴-DMOT (0.34%)를 수득한다.

[실시예 11]

4"-0-페닐아세틸-DMOT

0.2g의 2'-0-아세틸-4"-0-페닐아세틸-DNOT(0.23밀리몰)를 18ml의 80% 수성 메탄올에 용해시키고 5시간동안 환류시킨다. 용액을 실온으로 냉각시키고 감압하에 증발건고시켜 0.16g의 4"-0-페닐아세틸-DMOT(86%)를 수득한다.

[실시예 12]

2'-0-아세틸-4"-0-프로피오닐-DMOT

1.0g의 2'-0-아세틸-DMOT(1.3밀리몰)를 30ml의 피리딘에 용해시키고 실온에서 교반하면서 0.6ml(4.6밀리몰)의 무수프로피온산을 적가한다. 20시간후 3.0ml(23밀리몰)의 무수프로피온산을 추가로 가해주고 실온에서 26시간 동안 더 교반한다. 혼합물을 30ml의 톨루엔으로 희석하고 용매를 감압하에 증발시킨다. 잔사인 오일을 50ml의 디클로로메탄에 용해시키고 포화중탄산나트륨 유기층을 분리하여 Na₂SO₄로 건조시키고 여과하여 증발시킨다. 잔사를 실리카겔칼럼(Waters Prep 500)에 충전시키고 직선구배의 톨루엔(4

)과 에틸아세테이트(4

)로 용출시킨다. 1차적으로 305mg의 2'-0-아세틸-3,4"-디-0-프로피오닐-DMOT가 용출되고, 이어서 286mg의 2'-0-아세틸-4"-0-프로피오닐-DMOT가 용출된다.

각 화합물을 80% 수용성 메탄올중에서 환류시켜 각각 4"-0-프로피오닐-DMOT 및 3,4"-디-0-프로피오닐-DMOT를 수득한다.

Claims

스트렙토마이세스 프라디아에(Streptomyces fradiae) NRRL 12171을 액침 호기성 조건하에서 상당량의 항생물질 활성이 생성될 때까지 배양하여 다음 일반식(Ⅰ)의 데(마이시노실옥시)타일로신 및 그의 약제학적으로 허용되는 염 및 아실에스테르를 제조하는 방법.

상기식에서

Q는 -CH₂OH 또는 -CHO이다.