KR810001055B1

KR810001055B1 - 핵산분해 효소의 제조방법

Info

Publication number: KR810001055B1
Application number: KR7903488A
Authority: KR
Inventors: 한상렬; 이새배; 최종수
Original assignee: 홍연석; 미원 주식회사
Priority date: 1979-10-12
Filing date: 1979-10-12
Publication date: 1981-09-07

Abstract

내용 없음.

Description

핵산분해 효소의 제조방법

본 발명은 핵산분해 효소 생산능력이 있는 페니실리움 시트리늄(penicillium cirtrinum)에 속하는 균주와 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)에 속하는 균주의 혼합배양에 의한 핵산분해 효소의 효과적인 생산방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 핵산분해 효소라 함은 페니실리움 시트리늄이 생산하는 효소 즉 핵산의 3'-5' 포스포디에스텔 결합을 절단해서 5'-모노 뉴클레오타이드를 생성하는 뉴클레아제 P₁과 아스퍼질러스 나이거가 생산하는 효소 즉 핵산의 2'-5'-포스포디에스텔 결합을 절단해서 5'-모노 뉴클레오타이드를 생성하는 2'-5'-포스포디에스테라제를 의미한다.

본 발명에서 사용한 균주는 토양에서 분리한 페니실리움속 균주와 아스퍼질러스속 균주중 핵산분해효소 생산능이 있는 균주를 다음 문헌에 의하여 동정후 사용하였다.

The Penicilla-Atlas of Microorganisms : Abe(1957)

A Manual of Penicillia : Raper Thom(1968)

The Genus Aspergillus : K. B. Raper D.E. Fennell(1973)

The Fungi vol. 4A, 4B : E.C. Ainsworth. et. al.(1973)

본 발명의 가장 특징적인 점은 이들 양균주를 혼합 배양함으로써 이들 균주의 단일 배양에 비해 배지원료당 효소 생산량을 높임은 물론 핵산의 3'-5'-포스포 디 에스텔 및 2'-5'-포스포 디 에스델 결합을 동시에 분해하여 핵산분해 수율을 높일 수 있는 공업적으로 이용가치가 큰 효소를 생산하는데 있다.

종래 이들 균주의 단일배양에 의한 핵산분해 효소의 생산방법(일본 특허 소 51-23590) 등은 잘 알려져 있으며 특히 페니실리움 시트리늄 색소 생산능 결실 변이주를 이용한 고활성의 뉴클레아제 P₁은 현재 공업적으로 리보핵산분해 효소로 가장 많이 사용되고 있다.

그러나 뉴클레아제 P₁을 이용해서 리보핵산을 분해하면 5'-모노뉴클레오 타이드 이외에 약간의 오리고 뉴클레오 타이드가 남으며 이 오리고 뉴클레오타이드의 대부분은 뉴클레아제 P₁에 의해서 분해되지 않은 2'-5'-디뉴클레오타이드이며 그 이유는 효모로부터 리보핵산을 추출하는 과정에서 포리뉴클레오 타이드 결합이 부분적으로 절단되거나 3'-5'-포스포 디 에스텔 결합이 2'-5'-포스포 디 에스텔 결합으로 전이하기 때문으로 추측된다.

본 발명자들은 이러한 결점을 보완한 보다 공업적으로 유용한 핵산분해 효소를 생산할 목적으로 뉴클레아제 P₁의 생산능이 있는 페니실리움속 균주 예를 들면 페니실리움시트리늄(P.citrinum), 페니실리움 노타튬(P.notatum), 페니실리움 카네센스(P.canescens) 등 수종의 균주와 2'-5'-포스포 디 에스테라제 생산능을 가진 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 포에니시스(Aspergillus phoenicis) 등 수종의 균주를 이용하여 핵산분해 효소의 생산을 연구하던 중 놀랍게도 페니실리움 시트리늄에 속하는 균주와 아스퍼질러스 나이거에 속하는 균주의 혼합배양에서 3'-5'-포스포 디 에스테라제와 2'-5'-포스포 디 에스테라제가 공업적으로 사용하기에 적합한 비율로 동시에 생산됨은 물론 배지원료당 효소생산 수율이 현저히 증가됨을 알고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서 공업적으로 사용하기에 적합한 비율이라 함은 공업적으로 리보핵산을 분해할 때 분해물 중에 3'-5'-포스포-디 에스테르 결합이나 2'-5'-포스포 디 에스테르 결합을 갖는 오리고 뉴클레오타이드가 잔류하지 않도록 핵산분해효소 3'-5'-포스포 디 에스테라제와 2'-5'-포스포 디 에스테라제가 15-25대 1의 비율로 함유됨을 뜻한다.

또한 본 발명에서 혼합배양이라 함은 밀기울, 미강 등을 이용한 고체배지 중에 페니실리온 시트리늄에 속하는 균주와 아스퍼질러스 나이거에 속하는 균주를 일정한 비율로 혼합접종하여 배양함을 의미하며 배양조건은 일반사상균의 고체배양방법에 준하나 25-27℃에서 6-7일 배양하는 것이 가장 좋으며 효소는 배양추출액을 그대로 사용가능하며 상법에 따라 부분 정제하여도 좋다.

종균접종 비율에 따른 효소 활성은 표 1에 예시된 바와 같다.

[표 1]

주 1) 종균 혼합비율은 페니실리움 시트리늄 T-4306과 아스퍼질러스 나이거 D-114의 혼합비율이며 밀기울 10, 왕겨 3, 물 6 비율의 고체 배양기에서 25℃ 7일간 배양한 종균 현탁액을 사용하였다.

주 2) 밀기울 10, 물 6 비율로 고체배지에 각 혼합비율의 종균을 배지의 5%를 접종하여 26℃에서 4-7일간 배양한 후 3배량의 물로 추출한 조효소액을 60℃에서 30분 열처리 후 각 효소활성을 측정하였다.

주 3) 뉴클레아제 P₁의 활성측정은 3% 리보핵산 용액(pH 4.8) 0.5㎖, 1/35M 베르날초산 나트리움 완충액(pH 4.8) 1.0㎖, 효소액 0.5㎖의 조성액을 60℃에서 30분 반응시켰다. 반응액 0분, 30분액에 우라닐 시약(0.25% 초산 우라닐 함유 2.5% 과염소산 용액) 2㎖를 가하여 반응을 정지시키고 30분간 빙냉시키고 6,000rpm/15분간 원심 분리한 상징액 1㎖로 희석시킨 후 OD 260mμ값의 차이에 의한 효소활성을 다음 식으로 산출하였다.

효소활성=△OD 260mμ×4 ×1000 × 효소희석율

주 4) 2'-5'-포스포 디에스테라제 활성 측정은 5mM 아데닐(2'-5') 아데노신 0.1㎖, 1/35M 베르날초산 나트리움 완충액(pH 4.8) 1.0㎖, 효소액 0.1㎖의 조성액을 60℃에서 15분간 반응시켜 생성한 5'-AMP를 고속 액체 크로마토그라피에 의해 정량하여 기질(2'-5'- 아데노신 1mμM을 1분간에 분해하는 효소량을 1단위로 하였다. 위 표 1에서 보는 바와 같이 종균 혼합비율은 아스퍼질러스 나이거를 페니실리움 시트리늄에 대해서 0.1-1% 비율로 접종하여 6-7일간 배양하는 것이 가장 효과적이었다.

이와 같이 혼합배양을 하므로 원료 배지당 효소 생상량이 증가하는 이유는 확실하지 않지만 대체로 다음과 같이 추측되었다.

1. 페니실리움 시트리늄에 속하는 균주의 단일배양의 경우 고체 배지에 함유되어 있는 영양원이 최적조건 이상으로 함유되어 있어 배지조성이 부적합하였으나 혼합 배양을 하므로써 이러한 문제점이 다소 감소된 것으로 추측되며

2. 페니실리움 시트리늄의 단일배양의 경우 배지 중의 영양성분이 많이 존재함에도 불구하고 사실상 배양 3-4일에 균증식이 정지된 상태(통기불량)이나 혼합배양에 의해서 이러한 결점이 다소 개선되어 배지중의 영양성분이 최대로 이용된다는 점

3. 기타 각각의 균주 특성에 따라 축적물질의 이용 혹은 발육저해 등에 따라 효소생성이 촉진된 것 등으로 추측된다.

이하 실시예에서 설명한다.

[실시예 1]

표 1에서와 동일한 방법으로 배양한 페니실리움 시트리늄 T-4310 및 아스퍼질러스 나이거 D-114의 종균 현탁 혼합액(0.5%)을 밀기울 1kg 물 0.6

조성배지(120℃ 30분 멸균)에 접종한 후 26℃에서 6일 배양하였으며 동일한 방법으로 페니실리움 시트리늄 T-4310 및 아스퍼질러스 나이거 D-114를 각각 단독배양(26℃에서 4일)하였다. 각 배양물을 분쇄하여 3배량의 물로써 압축추출하여 60℃에서 30분 열처리 후 각 효소활성을 측정하였다. 혼합배양의 경우 뉴클레아제 P₁97,000 U/㎖, 2'-5'-포스포 디 에스테라제 4,400U/㎖였으며 단일배양의 경우 뉴클레아제 P₁69,000U/㎖ 및 2'-5'-포스포 디 에스테라제 3,400U/㎖였다.

혼합배양 열처리 조 효소액 2.4

를 40℃에서 진공 농축한 후 3배량의 에칠 알콜처리(72%) 여과 후 진공 건조시켜 건조 분말효소 17.06g(뉴클레아제 P₁12,608,000U/g, 2'-5'-포스포 디 에스테라제 535,000U/g을 획득했다. 반면에 이와 동일한 방법으로 처리한 단일 배양에 의해 생산된 효소는 뉴클레아제 P₁18,98g(8,026,000U/g) 및 2'-5'-포스포 디 에스테라제 14.32g(493,000U/g)였다.

[실시예 2]

실시예 1과 동일한 방법으로 밀기울 900g, 미강 100g, 물 600㎖의 조성배지에 페니실리움 시트리늄 T-4318 아스퍼질러스 나이거 D-108의 혼합배양의 결과 핵산분해 효소 18.08g(뉴클레아제 P₁11,987,000 U/g, 2'-5'-포스포 디 에스테라제 527,000U/g)을 획득했다. 반면에 단일 배양의 효소는 뉴클레아제 P₁19.43g( 7,928,000U/g) 및 2'-5'-포스포 디 에스테라제 13.48g(458,000U/g)였다.

Claims

본문에서 상술한 바와 같이 핵산분해 효소 생성력이 있는 페니실리움 시트리늄에 속하는 균주 및 아스퍼질러스 나이거에 속하는 균주를 혼합 배양함을 특징으로 하는 핵산분해 효소의 제조방법.