KR20240111799A - 항tslp의 단일 클론 항체, 이의 항원 결합 단편 및 이의 응용 - Google Patents
항tslp의 단일 클론 항체, 이의 항원 결합 단편 및 이의 응용 Download PDFInfo
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Abstract
항TSLP의 단일 클론 항체, 이의 항원 결합 단편 및 이의 응용을 제공한다. 해당 항체는 TSLP 항원에 대한 친화도가 높아 TSLP 항원과 그의 수용체 복합물의 결합을 효과적으로 억제하여 TSLP를 표적으로 하는 면역세포가 전염증성 사이토카인을 방출하는 것을 방지하고 천식 발작을 예방하고 천식에 대한 제어를 개선할 수 있고, 본 발명에서 선별한 단일 클론 항체 분자는 또한 높은 열 안정성과 좋은 안전성을 가지고 있으며, 본 발명은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 피부염의 치료에 사용될 수 있고, 천식에는 중증 천식, 호산구성 또는 비호산구성 천식 및 저호산구성 천식을 포함된다.
Description
[관련 출원의 상호 참조]
본 출원은 2021년 12월 2일에 출원된 중국 특허 출원 202111461974.6의 우선권을 주장하고, 이 출원의 내용은 인용을 통해 본문에 통합된다.
[기술분야]
본 발명은 생물 의약 기술 분야에 관한 것으로, 특히 항TSLP의 단일 클론 항체, 이의 항원 결합 단편 및 이의 응용에 관한 것이다.
천식은 현재 세계에서 가장 흔한 만성질환 중의 하나로서 천식의 발병률은 약 4.3%이고, 전 세계적으로 약 3억명의 천식환자가 있으며, 천식의 유병률은 국가별로 1~18%이며 그 중 10~20%의 중증 천식환자는 현재의 치료법으로 제어하기 어렵고, 이러한 환자가 천식 의료비의 50~60%를 소비하고 있으며, 경제적 제약으로 인해 중국을 포함한 많은 개발도상국에서는 아주 많은 환자가 효과적인 진단과 치료를 받지 못하고 있다. 2019년 6월 21일, 세계적 권위 있는 의학 저널 '란셋'(The Lancet)은 중국 학자들이 완성한 대규모 인구 연구[중국 성인 폐 건강 연구](CPH Study)의 또 다른 중요한 성과를 발표하여 중국의 천식 유행 상황을 개시하였고, 20세 이상 인구의 천식 유병률이 4.2%이고 환자 수는 4,570만 명에 달한 것을 확정하였다. 중국에서 천식은 진지하게 직면하고 해결해야 하는 주요 공중 보건 및 의료 문제 중의 하나가 되었다. 중국 기관지 천식 예방 및 치료 지침에 따르면 국내 천식 환자의 70% 이상이 여전히 제대로 조절되지 않고 있으며, 환자가 1년 내에 천식 발작으로 인한 응급 및 입원의 발생률이 27% 및 23%에 달하였고, 천식 조절이 잘 되지 않으면 환자의 생활 품질에 심각한 영향을 미치게 된다고 지적하였다.
천식은 다양한 염증세포와 매개체가 참여하는 기도의 만성 염증성 질환으로 기도 과반응성과 관련이 있으며 임상증상은 반복적인 쌕쌕거림, 숨가쁨, 가슴 답답함, 기침 등의 증상으로서 주로 밤과(또는) 이른 아침에 발작, 악화되며, 대부분의 환자는 스스로 완화하거나 치료하여 완화할 수 있으며 병리학적으로 기도의 만성 염증성 변화 및 기도 개형로 나타나며, 후자는 기도벽 비후, 기질 및 콜라겐 침착 상피하 섬유화, 평활근 증식 및 비대, 근섬유아세포 증식 및 점액선, 술잔세포(goblet cell) 화생(metaplasia) 및 증식 등으로 나타나 치료에 큰 어려움을 초래한다. 지금까지 전 세계적으로 시판되는 천식 약물은 여러 가지가 있는데, 그 중 대부분이 화학 약품이며 생물 약물의 지속적인 발전과 함께 천식에 대한 생물 약물의 연구 개발이 계속 사람들의 주목을 받고 있다.
T2 염증 유발(T2 고) 천식은 중증 천식 환자의 3분의 2 이상에 존재하며 전형적인 특징은 T2 염증 바이오 마커의 증가된 수치와 진단 및 예측성 바이오마커(혈액 호산구, 혈청 IgE 및 호기성 산화질소(FeNO), 페리오스틴(Periostin) 등)의 감정으로 인해 중증 천식의 표적 치료에 혁명적인 변화가 발생하였다. Th2-유도 염증을 표적으로 하는 단일 클론 항체는 일반적으로 성인 중증 천식 환자에 대해 안전하다. 나머지 중증 천식 환자의 약 3분의 1은 활성화된 T2 염증 경로의 특성을 가지고 있지 않으며, 이러한 환자의 비T2 유발 질환에 대한 임상 표준 지침 치료는 여전히 통제되지 않는다. 비2형 천식에 대한 연구는 아직 명확하지 않으며 추가적인 연구를 통하여 바이오마커를 확정하여 이로써 다양한 형태의 비2형 천식의 표적 치료를 지도할 필요가 있다.
흉선 기질 림프구 생성 호르몬 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)는 흉선 세포의 증식을 향상시키는 효과가 있는 염증 유발 자극(예: 폐 알레르겐, 바이러스 및 기타 병원체)에 의해 생성되는 상피 사이토카인이다. TSLP는 IL-4, IL-5 및 IL-13을 포함한 다운스트림 T2 사이토카인의 방출을 유도하여 염증 및 천식 증상을 유발한다. TSLP는 또한 비 T2 구동 염증에 관여하는 다양한 유형의 세포를 활성화할 수 있다. 따라서 염증 캐스케이드에서 TSLP의 초기 상류 활동은 광범위한 천식 환자군에서 잠재적인 표적으로 확인되었다.
또한 TSLP는 미성숙 DC, 림프구, 비만 세포, 호염구 및 호산구를 활성화하여 면역을 조절한다. TSLP는 이의 특정 수용체 TSLPR 및 공통 수용체 IL-7Rα와 복합물을 형성하여 세포내 신호 전달을 시작한다. TSLP는 먼저 TSLPR에 고친화성으로 결합한 다음 IL-7Rα의 세포외 도메인과 3원 복합물을 형성한다. TSLP의 두 반대면은 각각 TSLPR 및 IL-7Rα와 상호 작용한다. STAT5의 활성화는 TSLP 매개 Th2 반응에 필요한 신호이다. 항TSLP 인간화 단일 클론 항체는 인간 TSLP에 특이적으로 결합하여 수용체 복합체와의 상호작용을 차단하여 TSLP에 의해 표적화된 면역 세포가 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines)을 방출하는 것을 방지하여 천식 발작을 예방하고 천식 제어를 개선할 수 있다.
현재 아스트라제네카 및 그 파트너인 암젠 회사의 테제펠루맙(Tezepelumab, AMG157이라고도 함)은 TSLP를 표적으로 하는 최초의 단일 클론 항체이지만 아직 시판되지 않았으며 임상 연구에 따르면 항TSLP의 인간화 단일 클론 항체는 염증 캐스케이드의 초기 상류에 작용하여 T2-유도 천식 환자를 포함한 광범위한 중증 비통제 천식 환자에 적합하며 경증 및 아토피 천식 환자에서 개념적 검증 흡입성 알레르겐 챌린지 연구를 통해 초기 및 후기 천식 반응을 억제하고 T2 염증 바이오 마커 수준을 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 천식 치료에서 TSLP 표적 약물의 중요성을 고려할 때 국내외 천식 환자의 요구를 충족시키기 위해서는 천식에 대한 단독 또는 보조 치료를 갖는 단일 클론 항체 치료제의 개발이 시급하다.
시장의 수요를 충족시키기 위하여, 본 발명은 면역 라이브러리의 스크리닝을 통해, TSLP에 특이적으로 결합할 수 있고 높은 생물학적 활성을 갖는 항TSLP의 단일 클론 항체, 이의 항원 결합 단편 및 이의 응용을 획득하였다.
본 발명의 구체적인 기술적 수단은 다음과 같다.
본 발명은 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 표시되는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 표시되는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1이 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR2가 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR3이 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1이 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR2가 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR3이 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 A-I;
상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1이 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR2가 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR3이 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1이 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR2가 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR3이 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 A-Ⅱ;
상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1이 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR2가 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR3이 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1이 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR2가 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR3이 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 A-Ⅲ;
상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1이 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR2가 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR3이 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1이 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR2가 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR3이 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 A-Ⅳ로부터 선택되는 어느 하나인 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 면역 라이브러리의 스크리닝을 통해, TSLP 항원에 고친화도로 결합할 수 있는 상기 4가지 단일 클론 항체 분자를 얻었고, 이의 결합 활성이 좋기에 수용체 복합물과의 상호작용을 차단하여 TSLP에 의해 표적화된 면역세포가 전염증성 사이토카인을 방출하는 것을 방지하고 천식 발작을 예방하고 천식 제어를 개선하며, 또한 본 발명의 스크리닝으로 얻은 단일 클론 항체 분자는 높은 열안정성을 가지며 완제 의약품 조건을 충족한다.
나아가, 상기 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 MA-Ⅰ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 MA-Ⅱ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 MA-Ⅲ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 MA-Ⅳ로부터 선택되는 어느 하나인 마우스 유래 항체(murine antibody) 분자이며;
바람직하게는, 상기 마우스 유래 항체 분자는 MA-Ⅰ이다.
본 발명은 TSLP 항원으로 마우스를 면역화하고, 면역화 방법을 최적화하며, 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하고, 친화도가 높으며 활성이 좋고 비교적 안정적인 마우스 유래 항체 분자를 스크리닝하며, 대량의 세포 수준의 실험적 검증을 통해, 다른 3개의 마우스 유래 항체 분자에 비해, MA-1이 더 높은 생물학적 활성을 갖는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명에서는 MA-1을 선택하는 것이 바람직하다.
나아가, 상기 마우스 유래 항체 분자는 마우스 유래 항체 중쇄 불변 영역 및 마우스 유래 항체 경쇄 불변 영역을 더 포함하고, 상기 마우스 유래 항체 중쇄 불변 영역은 마우스의 IgG1형, IgG2a형, IgG2b형, IgG3형 중 하나이며, 상기 IgG1형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 26으로 표시되고, 상기 IgG2a형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 27로 표시되며, 상기 IgG2b형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 28로 표시되고, 상기 IgG3형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 29로 표시되며; 상기 마우스 유래 항체 경쇄 불변 영역은 마우스 Ck형의 경쇄 불변 영역이고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 25로 표시되며;
바람직하게는, 상기 마우스 유래 항체 분자는 마우스의 IgG1형의 중쇄 불변 영역과 마우스 Ck형의 경쇄 불변 영역을 포함한다.
나아가, 상기 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 상기 마우스 유래 항체 분자의 중쇄 가변 영역, 상기 마우스 유래 항체 분자의 경쇄 가변 영역, 및 인간화 항체(humanized antibody)의 불변 영역을 포함하는 키메라 항체 분자이다.
키메라 항체 분자는 마우스 유래 항체 분자의 가변 영역 서열과 인간화 항체의 불변 영역을 포함하고, 키메라 항체 분자의 설계는 본 발명의 불변 영역이 인간화된 후 CDR의 특이적 기능을 변화시키지 않는다는 것을 검증하기 위한 것으로, 인간화 항체 분자의 연구에 진일보의 연구 및 개발 기초를 제공한다.
나아가, 상기 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 HA-Ⅰ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 HA-Ⅱ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 HA-Ⅲ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 HA-Ⅳ로부터 선택되는 어느 하나인 인간화 항체 분자이며;
바람직하게는, 상기 인간화 항체 분자는 HA-Ⅰ이다.
본 발명은 마우스 유래 항체 분자에 대해 인간화 스크리닝을 통해 인간화 항체 분자를 얻었고, 체내 및 체외 실험적 검증을 통해 본 발명에서 제공하는 4가지 인간화 항체 분자에서, HA-Ⅰ의 생물학 활성이 더 높고, 약효가 가장 유의한 것을 발견하였다, 따라서 본 발명은 HA-I가 바람직하다.
나아가, 상기 인간화 항체 분자는 인간화 항체의 불변 영역을 더 포함한다.
나아가, 상기 인간화 항체 분자는 전장 항체 또는 항체 단편이고, 상기 인간화 항체 분자는 Fab, F(ab)2, Fv 또는 ScFv 중 하나 또는 복수의 조합을 포함한다.
나아가, 상기 인간화 항체의 불변 영역은 인간화 항체의 중쇄 불변 영역 및 인간화 항체의 경쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 인간화 항체의 중쇄 불변 영역은 인간의 IgG1형, IgG2형 또는 IgG4형의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되며, 상기 IgG1형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 30으로 표시되고, 상기 IgG2형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 31로 표시되며, 상기 IgG4형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 32로 표시되고, 상기 인간화 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 Ck 형의 경쇄 불변 영역이며, 그의 아미노산 서열은 서열번호 33으로 표시되고;
바람직하게는, 상기 인간화 항체의 불변 영역은 인간의 IgG1형의 중쇄 불변 영역과 인간 Ck 형의 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명은 상기 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질을 더 제공한다.
본 발명은 상기 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 더 제공한다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터를 더 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 DNA 발현 벡터를 형질감염시키는 숙주 세포를 더 제공하는데, 상기 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포를 포함하고;
바람직하게는, 상기 숙주 세포는 포유 동물 세포이며, 상기 포유 동물 세포는 HEK293E 세포, CHO 세포 또는 NS0 세포이다.
본 발명은 상기 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약물을 더 제공한다.
본 발명은 면역 질환 또는 암의 치료를 위한 약물의 제조에서의 상기 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 응용을 더 제공하는데;
바람직하게는, 상기 면역 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 피부염을 포함하고, 상기 천식은, 중증 천식, 호산구성 또는 비호산구성 천식 및 저호산구성 천식을 포함하며;
바람직하게는, 상기 암은 췌장암, 비소세포폐암, 흑색종, 전립선암, 신장암, 결장직장암 또는 유방암을 포함한다.
본 발명은 TSLP로 매개되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법을 더 제공하는데, 해당 방법은 필요하는 개체에게 치료 유효량의 상기 항TSLP의 단일 클론 항체를 투여하는 것을 포함하고; 상기 질환은 면역 질환 또는 암을 포함하며;
상기 면역 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 피부염을 포함하고, 상기 천식은, 중증 천식, 호산구성 또는 비호산구성 천식 및 저호산구성 천식을 포함하며;
상기 암은 췌장암, 비소세포폐암, 흑색종, 전립선암, 신장암, 결장직장암 또는 유방암을 포함한다.
본 발명의 유익한 효과는 적어도 하기를 포함한다. 즉, 본 발명에서 제공하는 항TSLP 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 높은 친화력을 가지며, TSLP 항원과 수용체 복합물의 결합을 효과적으로 억제하여 TSLP에 의해 표적화된 면역세포가 전염증성 사이토카인을 방출하는 것을 방지하고 천식 발작을 예방하고 천식 제어를 개선할 수 있으며, 또한 본 발명에서 선별한 항TSLP 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역 질환 또는 암을 치료하는데 사용할 수 있고, 면역 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 피부염을 포함하나 이에 한정되지 않고, 천식은 중증 천식, 호산구성 또는 비호산구성 천식 및 저호산구성 천식을 포함하며; 암은 췌장암, 비소세포폐암, 흑색종, 전립선암, 신장암, 결장직장암 또는 유방암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
도 1은 본 발명의 실시예2에서 pScFv-Disb-HS 벡터의 플라스미드 맵이다.
도 2는 본 발명의 실시예3에서 구배 희석 ELISA로 항TSLP 파지 단일 클론 항체의 상대적 친화도의 비교 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 5에서 벡터 pTSE의 맵이다.
도 4는 본 발명의 실시예 5에서 마우스 유래 항체 분자의 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 이미지이다.
도 5는 본 발명의 실시예 6에서 마우스 유래 항체와 TSLP의 결합 능력의 비교 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 7에서 마우스 유래 항체와 TSLP 수용체 단백질 CRLF2의 경쟁 억제 실험의 비교 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 12에서 인간화 항체 분자의 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 이미지이다.
도 8은 본 발명의 실시예 15에서 인간화 항체 분자와 TSLP의 결합 능력의 비교 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예 16에서 인간화 항체와 대조 항체의 경쟁 억제 실험의 비교 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 17에서 인간화 항체와 상이한 종의 TSLP의 교차 결합 실험 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예 18에서 TSLP와 세포 표면 수용체의 결합을 억제하는 항TSLP 단일 클론 항체의 실험 비교 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예 19에서 TSLP 단일 클론 항체 생물학 활성 검측(리포터 유전자법)의 비교 그래프이다.
도 13은 본 발명의 실시예 20에서 항TSLP 단일 클론 항체가 mDC세포에 대한TSLP의 유도로 인한 케모카인 방출을 차단하는 비교 그래프이다.
도 14는 본 발명의 실시예 21에서 항TSLP 단일 클론 항체 HA-1의 열 안정성 평가 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예3에서 구배 희석 ELISA로 항TSLP 파지 단일 클론 항체의 상대적 친화도의 비교 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 5에서 벡터 pTSE의 맵이다.
도 4는 본 발명의 실시예 5에서 마우스 유래 항체 분자의 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 이미지이다.
도 5는 본 발명의 실시예 6에서 마우스 유래 항체와 TSLP의 결합 능력의 비교 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 7에서 마우스 유래 항체와 TSLP 수용체 단백질 CRLF2의 경쟁 억제 실험의 비교 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예 12에서 인간화 항체 분자의 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 이미지이다.
도 8은 본 발명의 실시예 15에서 인간화 항체 분자와 TSLP의 결합 능력의 비교 그래프이다.
도 9는 본 발명의 실시예 16에서 인간화 항체와 대조 항체의 경쟁 억제 실험의 비교 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실시예 17에서 인간화 항체와 상이한 종의 TSLP의 교차 결합 실험 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예 18에서 TSLP와 세포 표면 수용체의 결합을 억제하는 항TSLP 단일 클론 항체의 실험 비교 그래프이다.
도 12는 본 발명의 실시예 19에서 TSLP 단일 클론 항체 생물학 활성 검측(리포터 유전자법)의 비교 그래프이다.
도 13은 본 발명의 실시예 20에서 항TSLP 단일 클론 항체가 mDC세포에 대한TSLP의 유도로 인한 케모카인 방출을 차단하는 비교 그래프이다.
도 14는 본 발명의 실시예 21에서 항TSLP 단일 클론 항체 HA-1의 열 안정성 평가 그래프이다.
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여, 실시예를 설명하기 전에, 먼저 본 발명의 일부 기술 및 과학 용어를 다음과 같이 설명한다.
본문에 사용된 용어 '항체'는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편을 포함하고, 항체는 마우스 유래 항체, 인간화 항체, 이중특이성 항체 또는 키메라 항체를 포함하며, 항체는 Fab, F(ab)2, Fv 또는 ScFv(단일 사슬 항체)일 수도 있고, 항체는 천연적으로 존재하는 항체 또는 변형(예를 들어 돌연변이, 결실, 치환 등)된 항체일 수도 있다.
본문에 사용된 용어 '가변 영역' 및 '불변 영역', 즉 N 단편에 접근하는 항체 중쇄 및 경쇄의 서열 영역은 가변 영역(V 영역)이고, C 단편에 접근하는 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정적인 불변 영역(C 영역)이며, 가변 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR) 및 4개의 프레임워크 영역(FR)을 포함하고, 각각의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 모두 3개의 CDR 영역 및 4개의 FR 영역으로 구성되며, 중쇄의 3개의 CDR 영역은 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 표시되고, 경쇄의 3개의 CDR 영역은 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 표시된다.
본문에 사용된 용어 '마우스 유래 항체 분자'는 TSLP 항원으로 마우스를 면역화 주사하여 얻은 항체로부터 유래된다.
본문에 사용된 용어 '키메라 항체 분자'는 마우스 유래 항체의 가변 영역을 인간화 항체의 불변 영역과 융합시켜 형성한 항체로서, 인체에서 마우스 유래 항체에 의해 유발되는 면역 응답 반응을 경감시킬 수 있다. 키메라 항체는 DNA 재조합 기술을 사용하여, 마우스 유래 단일 항체의 경쇄, 중쇄 가변 영역 유전자를 인간 항체의 불변 영역을 함유하는 발현 벡터에 삽입하여, 이러한 방식으로 발현된 항체 분자에서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 마우스 유래이지만, 불변 영역은 인간 유래이고, 전체 항체 분자의 거의 2/3 부분이 모두 인간 유래로 된다. 이렇게 생성된 항체는, 마우스 유래 항체의 면역 원성을 감소시키는 동시에 항원에 특이적으로 결합하는 모항체의 능력을 보류한다.
본문에 사용된 용어 '인간화 항체 분자'는, 마우스 유래 단일 항체의 CDR을 인간화 항체 가변 영역에 이식하여, 인간화 항체 CDR을 대체하여, 인간화 항체가 마우스 유래 단일 항체의 항원 결합 특이성을 획득하는 동시에, 이종성을 감소시키도록 한다.
용어 'CHO 세포'는 중국 햄스터 난소 세포(chinese hamster ovary cell)이고; 용어 'HEK293E 세포'는 인간 배아 신장 293E 세포(human embryonic kidney 293E cell)이며, 용어 'NS0 세포'는 마우스 NS0 흉선종 세포이다.
이하 실시예와 함께 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
실시예1
본 발명의 실시예1은 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는데, 구체적으로 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 표시되는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 표시되는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 이하로부터 선택되는 어느 하나이다. 하기 CDR는 Kabat 번호 매기기 시스템에 기반하여 결정한다.
실시예2 마우스 유래 항체 분자의 스크리닝
본 발명은 TSLP 항원을 사용하여 마우스를 면역화하고, 면역화 방법을 최적화하며, 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하고, 항원 부위 스크리닝 방법을 확립하며, 구체적인 파지 디스플레이 라이브러리의 구축 및 스크리닝 감식은 다음과 같다.
단계1: TSLP 항원으로 마우스를 면역화
1. 실험 동물:
종속 계통: BALB/c, 암컷, 마우스;
체중: 18~20g;
실험 동물 제공자: Beijing HFK Bioscience Co., Ltd.
2. 면역: 마우스를 면역화하고, 면역 항원은 인간 TSLP(Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.에서 합성한 유전자로, 당사에서 벡터를 구축하여 발현 및 정제)이다.
단계2: 파지 항체 라이브러리의 구축
역가가 높은 마우스 비장 세포를 취하고, Trizol 시약(Ambion에서 구입하고, 제품번호: 15596026)을 사용하여, 마우스 비장 세포의 총 RNA를 추출하며, RT-PCR로 cDNA를 획득하고, cDNA를 주형으로 사용하며, 축퇴 프라이머(사용된 축퇴 프라이머 참조 문헌: Journal of Immunological Methods 233(2000)167-177)를 사용하여 PCR 증폭을 수행함으로써, 면역 마우스의 항체 중쇄 가변 영역 유전자 라이브러리(VH) 및 경쇄 가변 영역 유전자 라이브러리(VL)를 획득하고, 경쇄 및 중쇄를 각각 이중 효소 분해하고, 동일한 단계에서 효소 분해 처리된 벡터에 연결하여, pScFv-Disb-HS-VH-VL 유전자 라이브러리를 구축하며, PscFv-DisB-HS 벡터는 일련의 유전자 클로닝 방법을 사용하여 벡터 pComb3 벡터(Biovector Science Lab에서 구입)가 파지 단일 사슬 항체 라이브러리의 구축 및 발현에 사용되도록 변형시킨다. 변형된 벡터를 pScFv-Disb-HS 벡터로 명명하고, 이의 플라스미드 맵을 도 1에 도시된 바와 같이 획득하며, 이 벡터를 기반으로, 마우스 면역 파지 항체 라이브러리를 구축한다.
단계3: TSLP를 항원으로 면역 튜브를 코팅하고, 항원 코팅양은 5μg/500μL/튜브이며, 4℃에서 하룻밤 코팅한 후, 4％의 탈지분유/PBST로 면역 튜브 및 면역 파지 항체 라이브러리를 각각 밀폐시키고, 실온에서 1h 동안 밀폐시킨다. 밀폐된 면역 파지 항체 라이브러리를 면역 튜브에 첨가하여 항원-항체 결합을 수행하며, 파지 투입량은 약 109~1012개이고, 실온에서 1h 동안 반응시킨 후, PBST-PBS를 사용하여 결합되지 않은 파지를 세척하며, 0.1M의 pH 2.2의 Glycine-HCl을 통해 용출하고, 마지막으로 1.5M의 pH 8.8의 Tris-HCl을 사용하여 용출된 파지 항체 용액을 pH 7.0 정도로 중화시킨다.
단계4: 상기 중화된 파지로 10ml의 대수기까지 성장된 TG1 균액을 감염시키고, 37℃의 인큐베이터에서 30min 동안 방치하며, 일부 균액을 꺼내어 구배 희석하고, 2YTAG의 플레이트에 도포하여, 파지 생성량 계산에 사용된다. 나머지 균액을 원심분리하여 상층액을 제거하고, 균체의 침전을 소량의 배지에 재현탁시키며, 흡출 후 큰 2YTAG 플레이트에 도포하여, 다음 라운드의 스크리닝을 준비한다.
단계5: 상기 감염 후 도포판의 균체를 큰 플레이트에서 긁어내어, 2YTAG 액체 배지에 접종하고, 대수기까지 진탕한 후 M13KO7 헬퍼 파지를 첨가하여 중복 감염시키며, 28℃의 조건 하에서, 220rpm에서 하룻밤 배양하여 파지를 제조하고, PEG/NaCl로 파지를 침강 정제하여 다음 라운드의 스크리닝에 사용하며, 총 1라운드의 파지 라이브러리 농축 스크리닝을 수행한다.
단계6: TSLP파지 단일 사슬 항체 양성 클로닝의 스크리닝으로, 1라운드의 스크리닝 후, 잘 분리된 단일 클론 콜로니를 선택하고, 2YTAG 액체 배지가 담긴 96웰 딥웰 플레이트에 접종하며, 37℃의 조건 하에서, 220rpm의 조건에서 대수 성장기까지 배양하고, 각 웰에 약 1010의 헬퍼 파지 M13KO7을 첨가하며, 37℃의 온도 조건 하에서 30min 동안 정적 감염시킨다. 4000rpm에서, 15min 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하며, 균체를 2YTAK로 재현탁 및 침전시키고, 28℃ 및 220rpm의 조건 하에서 하룻밤 배양한다. 4000rpm, 4℃의 조건 하에서 15min 동안 원심분리한 후, 증폭된 파지의 상층액을 흡수하여 ELISA 감식을 수행하고, 최종적으로 친화도가 높은 4개의 항TSLP의 마우스 유래 항체 분자를 스크리닝하여 얻으며, 각각 MA-Ⅰ, MA-Ⅱ, MA-Ⅲ 및 MA-Ⅳ로 명명하고, 얻은 상기 단일 클론 항체를 유전자 시퀀싱하여 정확한 항체 서열로 결정하며, 시퀀싱을 통해, 상기 스크리닝된 4개의 단일 클론 항체 서열은 다음과 같다.
구체적으로 다음과 같다. 서열번호 17(MA-I의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
QVQLEQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGLIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLGSLTSEDSAVYYCSRSLDGYFDHWGQGTLVTVSA;
서열번호 18(MA-I의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
DIVMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSFYCQHHYGTPWTFGGGTKLEIK;
서열번호 19(MA-Ⅱ의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
QVKLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYITYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYFDYWGQGTLVTVSA;
서열번호 20(MA-Ⅱ의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
DIVLTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPWTFGGGTKLEIK;
서열번호 21(MA-Ⅲ의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYFDHWGQGTLVTVSA;
서열번호 22(MA-Ⅲ의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
DIVMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIK;
서열번호 23(MA-IV의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
QVKLEQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSDTTYNQKFKGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRSLDGYFDHWGQGTLVTVSA;
서열번호 24(MA-IV의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
DIVITQTPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNTKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIK.
다른 면으로부터 보면, 본 발명은 또한 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것으로, 구체적으로, 각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 표시되는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 표시되는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3는 각각 서열번호 17, 19, 21 또는 23으로 표시되는 중쇄 가변 영역의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3이고； LCDR1, LCDR2 및 LCDR3는 각각 서열번호 18, 20, 22 또는 24로 표시되는 경쇄 가변 영역의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3이다. 본 분야의 기술자는 흔히 보는 번호 매기기 시스템(예: Kabat, AbM, Chothia, Contact 또는 IMGT 등)에 기반하여 아미노산 서열의 기지의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 CDR서열을 확정한다. Kabat 번호 매기기 시스템을 사용하여 CDR를 확정하는 경우, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 CDR서열은 실시예 1에 나타난 바와 같다.
실시예3 구배 희석 ELISA로 항TSLP 파지 단일 클론 항체의 친화도 비교
실시예2에서 획득한 4개의 마우스 유래 항체（Murine antibody） 분자(MA-Ⅰ, MA-Ⅱ, MA-Ⅲ 및 MA-Ⅳ)를 단일 클론 파지의 전시 및 정제를 수행한 후, 파지 구배 희석 ELISA 실험을 수행하여 친화도를 감식하고, 대조 항체는 암젠 회사의 항TSLP 단일 클론 항체 테제펠루맙(Tezepelumab)(AMG157이라고도 함, 특허 출원번호는 CN201880026131.3이고, 특허 명칭은 '항TSLP항체에 의한 천식의 치료'임)을 사용하고, 구체적인 방법은 다음과 같다.
pH 9.6의 탄산염 완충액으로 TSLP를 코팅하고, 100ng/웰/100μl이며, 4℃의 온도 하에서 하룻밤 코팅하고, PBST로 3회 세척하며, 실시예2에서 스크리닝하여 얻은 4개의 파지 단일 클론 항체를 각각 PBST로 4배 구배 희석하고, 각 웰에 100μl의 희석된 샘플을 첨가하며, 실온에서 1시간 동안 방치한다. PBST로 ELISA 플레이트를 세척하고, PBST로 희석된 HRP-anti-M13(Bio-viewshine에서 구입, 제품 번호：GE27-9421-01) 단일 클론 항체를 ELISA 플레이트에 첨가하며, 실온에서 1h 동안 방치한다. TMB 발색 키트로 발색하고, 실온에서 10분 동안 발색하며, 2M의 H2SO4로 중지한 후, 마이크로플레이트 판독기는 450nm/630nm에서 판독하고, 대응되는 EC50값을 계산하며, 구체적인 데이터는 다음과 같다.
상기 데이터 및 도 2에 도시된 바와 같이, 실시예2에서 스크리닝된 4개의 상이한 마우스 유래 항체 분자는 모두 TSLP에 결합할 수 있으나, 본 발명에서 제공하는 단일 클론 항체MA-I은 기타 3개의 마우스 유래 항체 분자 및 대조 항체에 비하여 TSLP와 더욱 높은 친화도를 갖는다.
실시예 4
본 발명의 실시예4는 실시예2의 기초 상에서 마우스 유래 항체 분자가 마우스 유래 항체 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 더 포함하는 것을 진일보로 한정하였고, 상기 마우스 유래 항체 중쇄 불변 영역은 마우스의 IgG1형, IgG2a형, IgG2b형, IgG3형의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되고, 이 중, IgG1형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 26으로 표시되고, IgG2a형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 27로 표시되며, IgG2b형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 28로 표시되고, IgG3형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 29로 표시되며; 마우스 유래 항체 경쇄 불변 영역은 마우스 Ck형의 경쇄 불변 영역이고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 25로 표시되며, 구체적인 서열은 다음과 같다.
서열번호 25(마우스 Ck형의 경쇄 불변 영역 아미노산 서열):
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC;
서열번호 26(마우스의 IgG1형의 중쇄 불변 영역 아미노산 서열);
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG;
서열번호 27(마우스의 IgG2a형의 중쇄 불변 영역 아미노산 서열):
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK;
서열번호 28(마우스의 IgG2b형의 중쇄 불변 영역 아미노산 서열):
AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK;
서열번호 29(마우스의 IgG3형의 중쇄 불변 영역 아미노산 서열):
ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPELELNETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA.
실시예5 항TSLP마우스 유래 항체 분자의 제조
본 발명의 실시예5는 실시예4의 기초 상에서 마우스 유래 항체 분자가 마우스의 IgG1형의 중쇄 불변 영역(그의 아미노산 서열은 서열번호 26으로 표시)과 마우스 Ck형의 경쇄 불변 영역(그의 아미노산 서열은 서열번호 25로 표시)을 포함하는 것을 바람직하게 한정하였다. 항체의 제조 방법은 구체적으로 다음과 같다.
1. 실시예2에서 스크리닝된 4개의 단일 클론 항체의 중쇄 VH 및 경쇄 VL의 코딩 유전자를 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자를 포함하는 벡터 pTSE(도 3에 도시된 바와 같음)에 각각 클로닝하고, 바람직한 중쇄 불변 영역은 마우스의 IgG1형 불변 영역(아미노산 서열은 서열번호 26으로 표시)이며, 경쇄 불변 영역은 마우스 Ck 사슬(아미노산 서열은 서열번호 25로 표시)이고, pTSE 벡터 구조는 도 3에 도시된 바와 같다(pTSE 벡터의 제조 과정은 CN103525868A 명세서의 제3페이지 제[0019]단락을 참조).
2. HEK293E 세포(Institute of Basic Medical Sciences of the Chinese Academy of Medical Sciences에서 구입하고, 제품번호는 GNHu43)를 일시적으로 형질감염시키고, 항체를 발현하며, AKTA 기기를 사용하여 protein A 친화도 컬럼 정제를 통해 4개의 단일 클론 항체를 획득하고, 동시에 BCA 키트(Beijing Huitian Dongfang Science and Technology Co., Ltd.에서 구입하고, 제품번호는 BCA0020)를 사용하여 단백질 농도를 측정한 후, SDS-PAGE를 통해 단백질의 크기를 감식하며, 결과는 도 4에 도시된 바와 같이, 좌측으로부터 우측으로 순차적으로 비환원MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ 및MA-Ⅳ과 단백질 분자량 Marker 및 환원 MA-Ⅰ，MA-Ⅱ，MA-Ⅲ 및 MA-Ⅳ 마우스 유래 항TSLP 단일 클론 항체이고, 각 밴드의 분자량의 크기는 이론과 일치하다.
실시예6 마우스 유래 항체와 TSLP의 결합 실험
pH 9.6의 탄산염 완충액으로 TSLP를 코팅하고, 100ng/웰/100μl이며, 4℃의 온도 하에서 하룻밤 코팅한다. 300μl/웰의 PBST로 5회 세척한 후, 1％의 BSA-PBST를 첨가하여 37℃의 온도 하에서 1h 동안 밀폐시키고, 상이한 희석 농도의 MA-Ⅰ, MA-Ⅱ, MA-Ⅲ 및 MA-Ⅳ 마우스 유래 항체를 첨가하며, 4가지 항체의 초기 최대 농도는 모두 1μg/ml이고, 각각 5배 구배 희석 후 각 항체에 대해 모두 8개의 구배를 희석하며, 37℃의 온도 조건 하에서 1h 동안 인큐베이션한다. 300μl/웰의 PBST로 5회 세척한 후, 1％의 BSA-PBST로 1:2000 희석한 Goat Anti-Mouse IgG-HRP(solarbio에서 구입, 제품번호：SE131)를 첨가하고, 37℃의 온도 조건 하에서 1h 동안 인큐베이션한다. TMB 발색 키트로 발색하고, 100μl/웰이며, 실온에서 8min 동안 발색한 후, 2M의 H2SO4로 발색을 중지한다. 마이크로플레이트 판독기는 450nm/630nm에서 판독하고, 대응되는 EC50값을 계산하며, 구체적인 데이터는 다음과 같다.
상기 데이터 및 도 5에 도시된 바와 같이, 스크리닝된 4개의 상이한 마우스 유래 항체는 모두 TSLP에 결합할 수 있고, 또한, 이 4개의 마우스 유래 항체 분자 중 MA-Ⅰ의 EC50값이 가장 낮으며, 이와 TSLP의 결합 능력이 보다 우수함을 설명한다.
실시예 7 마우스 유래 항체와 TSLP 수용체 단백질 CRLF2의 경쟁 억제 실험
pH 9.6의 탄산염 완충액으로CRLF2-Fc를 코팅하고, 200ng/웰/100μl이며, 4℃의 온도 하에서 하룻밤 코팅한다. 300μl/웰의 PBST로 5회 세척한 후, 1％의 BSA-PBST를 첨가하여 37℃의 온도 하에서 1h 동안 밀폐시킨다. 먼저 50μl/웰로, 1% BSA-PBST로 10μg/ml까지 희석된 TSLP-His를 첨가하고, 그 다음 50μl/웰로 상이한 희석 농도의 MA-Ⅰ, MA-Ⅱ, MA-Ⅲ과 MA-Ⅳ 마우스 유래 항체를 및 대조 항체를 첨가하며, 5가지 항체의 초기 최대 농도는 모두 400μg/ml이고, 각각 5배 구배 희석 후 각 항체에 대해 모두 8개의 구배를 희석하며, 37℃의 온도 조건 하에서 2h 동안 인큐베이션한다. 300μl/웰의 PBST로 5회 세척한 후, 2％의 BSA-PBST로 1:5000 희석한 Anti-His-Tag Mouse-HRP(Beijing CWBio Technology Co., Ltd.에서 구입, 제품번호：CW0285)를 첨가하고, 37℃의 온도 조건 하에서 1h 동안 인큐베이션한다. TMB 발색 키트로 발색하고, 100μl/웰이며, 실온에서 10min 동안 발색한 후, 2M의 H2SO4로 발색을 중지한다. 마이크로플레이트 판독기는 450nm/630nm에서 판독하고, 대응되는 IC50값을 계산하며, 구체적인 데이터는 다음과 같다.
상기 데이터 및 도 6에 도시된 바와 같이, 스크리닝된 4개의 상이한 마우스 유래 항체는 모두 수용체 단백질CRLF2와 경쟁할 수 있고, 또한, 본 발명에서 제공한 4개의 마우스 유래 항체 분자 중 MA-Ⅰ의 IC50값이 가장 낮으며, 대조 항체에 비해 현저히 우수하며, 이는 TSLP와 수용체 단백질 CRLF2의 결합을 효과적으로 억제할 수 있음을 설명한다.
실시예 8
본 발명의 실시예8은 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 실시예2의 마우스 유래 항체 분자의 중쇄 가변 영역, 마우스 유래 항체 분자의 경쇄 가변 영역 및 인간화 항체의 불변 영역을 포함하는 키메라 항체 분자인 것을 진일보로 한정하였다. 인간화 항체의 불변 영역은 인간화 항체의 중쇄 불변 영역 및 인간화 항체의 경쇄 불변 영역을 포함하고, 인간화 항체의 중쇄 불변 영역은 인간의 IgG1형, IgG2형 또는 IgG4형의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되고, IgG1형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 30으로 표시되고, IgG2형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 31로 표시되며, IgG4형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 32로 표시되고; 인간화 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 Ck형의 경쇄 불변 영역이고 그의 아미노사 서열은 서열번호 33으로 표시된다.
서열번호 30(인간의 IgG1형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열):
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
서열번호 31(인간의 IgG2형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;
서열번호 32(인간의 IgG4형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열):
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK;
서열번호 33(인간 Ck 사슬의 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열):
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
실시예 9 키메라 항체 분자 항체의 제조
본 발명의 실시예9는 실시예8의 기초 상에서 인간화 항체의 불변 영역이 인간의 IgG1형의 중쇄 불변 영역(그의 아미노산 서열은 서열번호 30으로 표시)과 인간 Ck 형의 경쇄 불변 영역(그의 아미노산 서열은 서열번호 33으로 표시)을 포함하는 것을 진일보로 한정하였다.
구체적인 제조방법:
실시예2에서 면역 파지 항체 라이브러리를 스크리닝하여 얻은 항체 분자 MA-Ⅰ의 중쇄 가변 영역 VH(서열번호 17) 및 경쇄 가변 영역 VL 유전자(서열번호 18)를 마우스 유래 서열을 유지하면서 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역 유전자를 포함하는 벡터 pTSE(도 3에 도시된 바와 같음)에 각각 클로닝하고, 중쇄 불변 영역은 인간의 IgG1형(아미노산 서열은 서열번호 30으로 표시)이며, 경쇄 불변 영역은 인간 Ck형(아미노산 서열은 서열번호 33으로 표시)이다. HEK293E 세포(Institute of Basic Medical Sciences of the Chinese Academy of Medical Sciences에서 구입하고, 제품번호는 GNHu43)를 일시적으로 형질감염시키고, 항체를 발현시켜, 키메라 항체 CA-Ⅰ을 얻는다
실시예10 마우스 유래 항체 분자 MA-Ⅰ의 인간화
먼저 실시예2에서 마우스 유래 항체 분자 MA-1의 서열을 사용하여 인간화 항체 생식계열 데이터베이스(v-base)와 비교하고, 상동성이 높은 인간화 항체의 경쇄, 중쇄 생식계열을 후보 서열로 찾은 후, 마우스 유래 항체 분자 MA-1의 CDR의 서열을 인간 후보 서열에 이식하여 상동성 모델링을 수행한다. 그 다음, CDR 루프 구조를 유지하는데 중요한 역할을 할 수 있는 주요 프레임워크 아미노산 잔기를 3차원 구조 시뮬레이션으로 계산하여, 인간화 항체의 역돌연변이를 설계한다. 역돌연변이를 포함하는 설계된 인간화 항체의 경쇄, 중쇄 가변 영역은 각각 Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.에서 최적화 합성한 후, 일시적인 발현 벡터에 연결하여, 인간화하여 얻은 경쇄 및 중쇄의 조합을 분석하여, 인간화 항체 분자 HA-Ⅰ, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ 및 HA-Ⅳ를 얻고, 상기 스크리닝된 4개의 단일 클론 항체의 서열은 다음과 같다.
구체적으로 다음과 같다. 서열번호 34(HA-Ⅰ 및 HA-Ⅱ의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGLIDPSDSDTTYNQKFKGRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSRSLDGYFDHWGQGTLVTVSS;
서열번호 35(HA-Ⅰ의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKSPKLLVYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK;
서열번호 36(HA-Ⅱ 및 HA-Ⅳ의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK;
서열번호 37(HA-Ⅲ 및 HA-Ⅳ의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGLIDPSDSDTTYNQKFKGRATMTVDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSLDGYFDHWGQGTLVTVSS;
서열번호 38(HA-Ⅲ의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNARTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPWTFGGGTKVEIK.
실시예 11
본 발명의 실시예11은 실시예10의 기초 상에서 인간화 항체 분자가 인간화 항체 불변 영역을 더 포함하고, 인간화 항체 불변 영역은 인간화 항체 중쇄 불변 영역과 인간화 항체 경쇄 불변 영역을 포함하며, 인간화 항체 중쇄 불변 영역은 인간의 IgG1형, IgG2형 또는 IgG4형의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되고, IgG1형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 30으로 표시되고, IgG2형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 31로 표시되며, IgG4형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 32로 표시되고, 인간화 항체 경쇄 불변 영역은 인간 Ck형의 경쇄 불변 영역이고 그의 아미노산 서열이 서열번호 33으로 표시되는 것을 진일보로 한정하였다.
상기 인간화 항체 불변 영역의 구체적인 서열은 실시예 8과 동일하다.
실시예12 인간화 항체 분자의 제조
본 발명의 실시예12는 실시예11의 기초 상에서 인간화 항체 불변 영역이 인간의 IgG1형의 중쇄 불변 영역(그의 아미노산 서열은 서열번호 30으로 표시)과 인간 Ck형의 경쇄 불변 영역(그의 아미노산 서열은 서열번호 33으로 표시)을 포함하는 것을 진일보로 한정하였다.
상기 실시예10에서 인간화하여 얻은 4개의 인간화 항체 분자의 중쇄 VH 및 경쇄 VL의 코딩 유전자를 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역 유전자를 포함하는 벡터 pTSE(도 3에 도시된 바와 같음)에 각각 클로닝하고, 중쇄 불변 영역은 인간의 IgG1형(아미노산 서열은 서열번호 30으로 표시)이며, 경쇄 불변 영역은 Ck사슬(아미노산 서열은 서열번호 33으로 표시)이다.
대조 항체와 인간화 항체 분자 HA-Ⅰ, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ, HA-Ⅳ를 각각 HEK293E 세포(Institute of Basic Medical Sciences of the Chinese Academy of Medical Sciences에서 구입하고, 제품번호는 GNHu43)를 일시적으로 형질감염시키고, 항체를 발현하며, AKTA 기기를 사용하여 protein A 친화도 컬럼 정제를 통해 단일 클론 항체를 획득하고, 동시에 BCA 키트(Beijing Huitian Dongfang Science and Technology Co., Ltd에서 구입하고, 제품번호는 BCA0020)를 사용하여 단백질 농도를 측정한 후, SDS-PAGE를 통해 단백질의 크기를 감식하며, 결과는 도 7에 도시된 바와 같이, 좌측으로부터 우측으로 순차적으로 비환원 단백질 분자량 HA-Ⅰ, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ, HA-Ⅳ, 실시예9에서 제조한 키메라 항체 CA-I, 대조 항체, 비환원 단백질 분자량 Marker1 및 환원 단백질 분자량 Marker2, HA-Ⅰ, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ, HA-Ⅳ, 키메라 항체 CA-I, 대조 항체이고, 각 밴드의 분자량의 크기는 이론과 일치하다.
실시예 13
본 발명의 실시예13은 상기 실시예의 기초 상에서 인간화 항체 분자가 전장 항체 또는 항체 단편이고, 인간화 항체 분자가 Fab, F(ab)2, Fv 또는 ScFv 중 하나 또는 복수의 조합을 포함하는 것을 진일보로 한정하였다.
실시예 14
본 발명의 실시예14는 상기 실시예의 기초 상에서 다음과 같은 형태를 진일보로 한정하였다.
진일보로, 본 발명은, 상기 어느 하나의 실시예에서 한정된 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질을 더 제공한다.
본 발명은, 상기 어느 하나의 실시예에서 한정된 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 더 제공한다.
본 발명은, 상기 한정된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 DNA 발현 벡터를 더 제공한다.
본 발명은 상기 한정된 재조합 DNA 발현 벡터를 형질감염시키는 숙주 세포로서, 원핵 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포를 포함하고;
바람직하게는, HEK293E 세포, CHO 세포 또는 NS0 세포인 포유 동물 세포인 숙주 세포를 더 제공한다.
본 발명은, 상기 어느 하나의 실시예에서 한정된 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약물을 더 제공한다.
본 발명은 면역 질환 또는 암의 치료를 위한 약물의 제조에서의 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 응용을 더 제공한다.
본 발명은 TSLP로 매개되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법을 제공하되, 해당 방법은 필요하는 개체에게 치료 유효량의 항 TSLP의 단일 클론 항체를 투여하는 것을 포함하고; 상기 질환은 면역 질환 또는 암을 포함한다. 바람직하게는 면역 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 피부염을 포함하나 이에 한정되지 않고, 상기 천식은, 중증 천식, 호산구성 또는 비호산구성 천식 및 저호산구성 천식을 포함한다.
바람직하게는, 암은 췌장암, 비소세포폐암, 흑색종, 전립선암, 신장암, 결장직장암 또는 유방암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
실시예15 인간화 항체 분자와 TSLP의 결합 실험
pH 9.6의 탄산염 완충액으로 TSLP-His를 코팅하고, 200ng/웰/100μl이며, 4℃의 온도 하에서 하룻밤 코팅한다. 300μl/웰의 PBST로 5회 세척한 후, 1％의 BSA-PBST를 첨가하여 37℃의 온도 하에서 1h 동안 밀폐시키고, 상이한 희석 농도의 인간화 항체 HA-Ⅰ, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ, HA-Ⅳ 및 실시예9에서 제조한 키메라 항체 CA-Ⅰ 및 대조 항체를 첨가하며, 6개의 항체의 초기 최대 농도는 모두 5μg/ml이고, 각각 5배 희석 후 각 항체에 대해 모두 8개의 구배를 희석하며, 37℃의 온도 조건 하에서 1h 동안 인큐베이션한다. 300μl/웰의 PBST로 5회 세척한 다음, 1％의 BSA-PBST로 1:5000 희석한 Goat Anti Human IgG-HRP(Beijing ZSGB Biotechnology Co., Ltd.에서 구입, 제품번호: ZB-2304)를 첨가하고, 37℃의 온도 조건 하에서 1h 동안 인큐베이션한다. TMB 발색 키트로 발색하고, 100μl/웰이며, 실온에서 5min 동안 발색한 후, 2M의 H2SO4로 발색을 중지한다. 마이크로플레이트 판독기는 450nm/630nm에서 판독하고, 대응되는 EC50값을 계산하며, 구체적인 데이터는 다음과 같다.
상기 데이터 및 실험 결과는 도 8에 도시된 바와 같이, 4개의 상이한 인간화 항체 분자는 모두 TSLP에 결합할 수 있으나, 본 발명에서 제공하는 4개의 상이한 단일 클론 항체의 EC50값은 모두 대조 항체보다 유의하게 낮으며, 이는 본 발명에서 제공하는 단일 클론 항체와 TSLP의 결합 능력이 강하며, 친화도가 높음을 설명하고, 또한, 도 8 및 상기 데이터로부터 4개의 상이한 단일 클론 항체에서 HA-Ⅰ의 EC50값이 가장 낮음을 알 수 있어, 이와 TSLP의 결합 능력이 가장 우수하며, 친화도가 가장 높음을 설명하고; 동시에 HA-Ⅰ의 EC50값은 키메라 항체 CA-Ⅰ와 유사하여, 인간화된 HA-Ⅰ가 마우스 유래 모항체 MA-Ⅰ와 TSLP의 높은 친화도를 보류하였음을 설명한다.
실시예 16 인간화 항체와 대조 항체의 경쟁 억제 실험
pH 9.6의 탄산염 완충액으로TSLP-His를 코팅하고, 100ng/웰/100μl이며, 4℃의 온도 하에서 하룻밤 코팅한다. 300μl/웰의 PBST로 5회 세척한 후, 1％의 BSA-PBST를 첨가하여 37℃의 온도 하에서 1h 동안 밀폐시킨다. 먼저 50μl/웰로, 1% BSA-PBST로 4μg/ml까지 희석된 HA-Ⅰ, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ, HA-Ⅳ 및 키메라 항체 CA-Ⅰ를 첨가하고, 그 다음 50μl/웰로 상이한 희석 농도의 대조 항체를 첨가하여 혼합하며, 대조 항체의 초기 최대 농도는 400μg/ml이고, 각각 3배 구배 희석 후 모두 11개의 구배를 희석하며, 37℃의 온도 조건 하에서 2h 동안 인큐베이션한다. 300μl/웰의 PBST로 5회 세척한 후, 1％의 BSA-PBST로 1:5000 희석한 Anti-Human IgG1-HRP(Sigma에서 구입, 제품번호：SAB 4200768)를 첨가하고, 37℃의 온도 조건 하에서 1h 동안 인큐베이션한다. TMB 발색 키트로 발색하고, 100μl/웰이며, 실온에서 10min 동안 발색한 후, 2M의 H2SO4로 발색을 중지한다. 마이크로플레이트 판독기는 450nm/630nm에서 판독하고, 대응되는 IC50값을 계산하며, 구체적인 데이터는 다음과 같다.
상기 데이터 및 실험 결과는 도 9에 도시된 바와 같이, 스크리닝된 4개의 상이한 인간화 항체 및 키메라 항체는 모두 TSLP와 대조 항체의 결합을 억제할 수 있으며, 4개의 인간화 항체 분자 중 MA-Ⅰ의 IC50값이 가장 낮으며, 그의 억제 효과가 가장 우수하다.
실시예 17 인간화 항체와 상이한 종의 TSLP의 교차 결합 실험
pH 9.6의 탄산염 완충액으로 인간 TSLP-His、마우스 TSLP-His(Sino Biological Inc.에서 구입, 제품번호：51005-M08H), 원숭이 TSLP-His(Novoprotein Scientific Inc. 에서 구입, 제품번호：CR62)를 코팅하고, 100ng/웰/100μl이며, 4℃의 온도 하에서 하룻밤 코팅한다. 300μl/웰의 PBST로 5회 세척한 후, 1％의 BSA-PBST를 첨가하여 37℃의 온도 하에서 1h 동안 밀폐시키고, 상이한 희석 농도의 인간화 항체 HA-Ⅰ, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ, HA-Ⅳ를 첨가하고, 4개의 인간화 항체의 초기 최대 농도는 모두 16μg/ml이고, 각각 4배 희석 후 각 항체에 대하여 모두 8개의 구배를 희석하며, 37℃의 온도 조건 하에서 1h 동안 인큐베이션한다. 300μl/웰의 PBST로 5회 세척한 후, 1％의 BSA-PBST로 1:5000 희석한 Goat Anti Human IgG-HRP를 첨가하고, 37℃의 온도 조건 하에서 1h 동안 인큐베이션한다. TMB 발색 키트로 발색하고, 100μl/웰이며, 실온에서 5min 동안 발색한 후, 2M의 H2SO4로 발색을 중지한다. 마이크로플레이트 판독기는 450nm/630nm에서 판독하고, 대응되는 EC50값을 계산하며, 구체적인 데이터는 다음과 같다.
상기 데이터 및 실험 결과는 도 10에 도시된 바와 같이, 스크리닝된 4개의 상이한 인간화 항체는 모두 인간 TSLP、시노몰구스(cynomolgus) 원숭이 TSLP와 결합할 수 있고, 마우스 TSLP와는 모두 결합할 수 없다. 또한 이 4개의 인간화 항체 분자 중 MA-Ⅰ와 인간 TSLP 및 시노몰구스 원숭이 TSLP와의 EC50값이 가장 낮으며, 그의 결합 능력이 강한 것을 설명하고, 시노몰구스 원숭이의 실험 동물 모델 중에서 약리적 및 독리적 연구 및 안전성 평가를 진행할 수 있다.
실시예 18 항TSLP 단일 클론 항체가 TSLP와 세포 표면 수용체의 결합을 억제하는 실험
BaF/3-TSLPR 공정 세포주를 소화 및 계수하고 샘플 희석액(이 성분은 90% IMDM, 10% FBS, 300μg/ml Hygromycin 포함)을 사용하여 세포를 1×106 cells/ml로 희석하고 96웰 플레이트에 100μl/웰로 첨가하였다. 인간화 항체 HA-I, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ, HA-IV 및 대조 항체를 각각 샘플 희석액으로 초기 농도 200μg/ml로 희석하고 3배 구배로 희석하고, 총 10개 구배이다. 희석된 인간화 항체 HA-Ⅰ, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ, HA-Ⅳ 및 대조 항체를 각각 100μl BaF/3-TSLPR 세포를 포함하는 96웰 플레이트에 50μl/웰로 첨가한다. 항원 TSLP를 샘플 희석액으로 8μg/ml로 희석하고 상기 BaF/3-TSLPR 세포, 인간화 항체 및 대조 항체를 포함하는 웰 플레이트에 50μl/웰로 첨가한다. 부드럽게 혼합한 후 96웰 플레이트를 4℃의 온도 조건 하에서 1h 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝난 후 3000rpm에서 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 수집한다. 플레이트에 미리 희석된 Goat Anti Human IgG-Fc 항체(SouthernBiotech에서 구입, 제품번호: 2048-30)를 100μl/웰로 첨가하고 각 웰의 세포 펠렛과 고르게 혼합하고 4℃의 온도 조건 하에서 1h 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝난 후, 각 웰에 100μl의 PBS 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고, 3000rpm에서 원심분리하여 상층액을 제거하고, 각 웰에 100μl PBS 완충액을 첨가하여 세포 펠렛을 재현탁하고, 유세포 분석기에서 검출하였다. 데이터를 수집하고 대응되는 IC50 값을 계산하며 구체적인 데이터는 다음과 같다.
상기 데이터 및 실험 결과는 도 11에 도시된 바와 같이, 스크리닝된 4개의 상이한 인간화 항체 및 대조 항체는 모두 TSLP와 경쟁하고 세포 표면 수용체TSLPR와 결합할 수 있다. 또한 이 4개의 인간화 항체 분자 중 HA-Ⅰ의 IC50값이 가장 낮고 대조 항체에 비하여 우수하며 이가 세포 수준에서 TSLP와 그의 수용체의 결합에 대하여 좋은 차단 효과가 있음을 설명한다.
실시예 19 항TSLP 단일 클론 항체 생물학 활성 검측(리포터 유전자법)
TSLPR, IL-7Rα, STAT5-Luc를 발현하는 BaF/3(마우스 원 B세포를 Cell Resource Center of the Institute of Basic Medical Sciences of the Chinese Academy of Medical Sciences에서 구입, 제품번호: 3111C0001CCC000095) 세포를 소화 및 계수하고, 샘플 희석액(성분은 90% IMDM, 10% FBS, 300μg/ml Hygromycin, 0.5μg/ml Puromycin 및 600μg/ml Geneticin을 포함)을 사용하여 세포를 1×106cells/ml로 희석하고, 농도가 160ng/ml되도록 TSLP-RAS-His항원을 첨가하고, 부드럽게 혼합한 후 세포액을 50μl/웰로 96웰 플레이트에 첨가한다. 인간화 항체 HA-I, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ, HA-IV 및 대조 항체를 각각 샘플 희석액으로 초기 농도 15μg/ml로 희석하고 3배의 구배로 희석하고, 총 8개 구배이다. 각 샘플 농도에 2개의 복제 웰이 설정된다. 희석된 HA-Ⅰ, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ, HA-Ⅳ 및 대조 항체를 각각 50μl 세포 혼합액을 포함하는 96웰 플레이트에 첨가하고, 부드럽게 혼합한 후 96웰 플레이트를 세포 인큐베이터에 넣어 5h 동안 인큐베이션하고, 배양 조건은 37℃, 5％ CO2이다. 5h후 96웰 플레이트를 꺼내어 3000rpm에서 5min 동안 원심분리하여 용액을 제거하고 50μl/웰로 Glo Lysis Buffer(Promega에서 구입, 제품번호：E2661)를 첨가하고 실온에서 5분간 동안 용해하고 세포 플레이트를 가볍게 두드려 세포 용해액을 균일하게 혼합하고 10μl/웰로 세포 용해액을 384웰 플레이트에 옮기고 동일한 양의 Bright-GolTMLuciferase Assay System을 첨가하고 실온에서 2~15min 동안 반응시키고 마이크로플레이트 판독기에서 형광값을 판독하고, 대응되는 IC50값을 계산하며, 구체적인 데이터는 다음과 같다.
상기 데이터 및 실험 결과는 도 12에 도시된 바와 같이, 스크리닝된 4개의 상이한 인간화 항체 및 대조 항체는 모두 TSLP와 결합할 수 있고, TSLP와 수용체 복합물의 결합을 경쟁적으로 억제하여 기능을 실현하여 세포내 신호 전달 경로를 차단할 수 있다. 공정 세포주 BaF/3-TSLPR-IL7Rα-STAT5-Luc의 구축은 TSLP의 작용하에 인간 비만 세포의 증식 반응을 시뮬레이션할 수 있다. TSLP는 세포 표면 TSLPR 및 IL7Rα 수용체에 결합하여 세포내 증식 신호(STAT5-Luc)의 발현을 자극하고 상향 조절한다. 이 4개의 인간화 항체 분자는 TSLP와 세포 표면 수용체의 결합을 효과적으로 차단하여 세포 내 증식 신호의 발생 및 발전을 억제할 수 있다. 또한, 이 4개의 인간화 항체 분자 중 HA-I의 IC50 값이 가장 낮고 대조 항체에 비해 현저히 우수하여 이가 세포 수준에서 TSLP와 수용체의 결합을 차단할 수 있고 세포 증식 억제 효과가 가장 우수함을 설명한다.
실시예 20 항TSLP단일 클론 항체는 TSLP가 mDC세포의 케모카인의 방출을 유도하는 것을 차단
PBMC 세포를 소생시키고 키트를 사용하여 mature DC 세포를 분류하여 얻고 샘플 희석액(성분은 90% 1640 및 10% FBS 포함)을 사용하여 세포 밀도를 4×105 cells/mL로 조정하고 세포 현탁액을 50μl/웰로 96웰 플레이트에 첨가한다. 인간화 항체 HA-I, HA-Ⅱ, HA-Ⅲ, HA-IV 및 대조 항체를 샘플 희석액으로 초기 농도 80ng/ml로 희석하고 3배의 구배를 희석하고, 총 8개의 구배이다. 각 샘플 농도에 2개의 복제 웰이 설정된다. 25μl/웰로 mature DC 세포를 포함하는 96웰 플레이트에 첨가한다. TSLP 단백질을 샘플 희석액으로 80ng/ml로 희석하고 25μl/웰로 mature DC 세포, 인간화 항체 및 대조 항체를 포함하는 96웰 플레이트에 첨가한다. 부드럽게 균일하게 혼합한 후, 96웰 플레이트를 37℃, CO2 인큐베이터에서 하룻밤 배양하고 약 24시간 후에 50μl/웰로 상층액을 취한다. TARC 테스트는 인간 TARC ELISA 키트(Dakewei Biotechnology Co., Ltd.에서 구입, 제품번호: 1117542)의 지침에 따라 수행하였다. 먼저 키트 중의 희석액으로 상층액을 3배 희석하고 균일하게 혼합한다. 희석된 상층액과 표준품을 100μl/웰로 샘플 웰에 첨가하고 실온에서 2h 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝난 후 웰 플레이트를 세척액으로 3회 세척한다. 100μl/웰로 Biotinylated antibody 희석액을 첨가하고 실온에서 2h 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝난 후, 웰 플레이트를 세척액으로 3회 세척한다. 100μl/웰로 Streptavidin-HRP 작업 용액을 첨가하고 실온에서 20min 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝난 후, 웰 플레이트를 세척액으로 3회 세척한다. 100μl/웰로 TMB 발색 용액을 첨가하고 암실 및 실온에서 약 15min 동안 인큐베이션하고 100μl/웰 정지 용액으로 발색을 정지한다. 마이크로플레이트 판독기로 450nm위치에서 OD값을 판독하고, 대응되는 IC50값을 계산하며, 구체적인 데이터는 다음과 같다.
상기 데이터 및 실험 결과는 도 13에 도시된 바와 같이, 스크리닝된 4개의 상이한 인간화 항체 및 대조 항체는 모두 TSLP가 mDC세포를 활성화하여 케모카인TARC을 방출하는 것을 억제할 수 있다. 또한, 이 4개의 인간화 항체 분자 중 HA-I의 IC50 값이 가장 낮고 대조 항체에 비해 현저히 우수하여 이가 세포 수준에서 TSLP의 mDC에 대한 활성화 작용을 효과적으로 억제할 수 있고 억제 효과가 가장 우수함을 설명한다.
실시예 21 항TSLP 단일 클론 항체 HA-Ⅰ의 열 안정성 평가
항TSLP 단일 클론 항체 HA-Ⅰ를 한외여과하여 PBS 완충 시스템으로 액체 교환하고, 12000rpm, 4℃의 조건 하에서, 5min 동안 원심분리하며, 다기능 단백질 열 안정성 분석 시스템(Unchained Labs에서 구입)을 사용하여 항TSLP 단일 클론 항체 HA-Ⅰ의 열 안정성을 평가한다. 온도(25℃에서 시작하여, 0.3℃/min의 승온 속도로 95℃까지 승온)에 따른 단백질 내인성 형광 변화를 모니터링하여 단백질의 구조적 변화를 검출함으로써, 단백질 융해 온도 Tm을 결정하고, 단백질의 구조적 안정성을 평가한다. 샘플이 응집되면, 산란광파가 간섭하여, 산란광 신호가 증가하고, 정적 광산란으로 단백질의 콜로이드 안정성(Tagg로 특성화)을 측정하며, 결과는 하기 표 및 도 14를 참조하면 된다.
상기 표 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 항TSLP 단일 클론 항체 HA-Ⅰ의 온도는 71.7℃이고, 평균 Tagg는 83.0℃이며, 우수한 구조적 안정성 및 콜로이드 안정성을 나타낸다.
실시예 21 항TSLP 단일 클론 항체를 시노몰구스 원숭이에게 4주 피하주사 독성 실험
연구 목적은 항TSLP 단일 클론 항체를 시노몰구스 원숭이에게 매주마다 1회 피하주사하여 연속 4주 투여한 후의 독성 반응 상황을 관찰하기 위한 것이다.
(1)실험품 정보: 항TSLP 단일 클론 항체 HA-I, 주사액(부형제는 히스티딘, 히스티딘 염산염, 소르비톨, 폴리소르베이트 80 포함)으로 조제한다.
대조품 정보: 항TSLP 단일 클론 항체 HA-I의 완충액(성분은 히스티딘, 히스티딘 염산염, 소르비톨, 폴리소르베이트 80을 포함하며, 약물 성분인 항TSLP 단일 클론 항체 HA-I를 포함하지 않은 것을 제외하고는 주사액 기타 성분과 동일함)을 대조군으로 한다.
(2)제공업체: Beijing Dongfang Biotech Co.,Ltd
(3)실험 동물:
종속 및 계통:시노몰구스 원숭이
나이 : 2.5~5세
체중 : 2~5kg;
성별: 암컷, 수컷
동물 개수: 8마리, 암컷 수컷 각 4마리.
(4)그룹화 및 투여
피하주사로 투여하고, 제 1차 투여는 D1로 표기한 후 매주마다 1회 투여하고, 연속 4주 투여하고, 총 5회 투여한다.
이 실험에서는 임상 증상 관찰, 체중, 음식섭취량, 체온, 이에 따른 안전성 약리지표 검사, 심전도, 혈압, 안과 검사, 임상 병리 검사(혈구계산，혈액 응고 기능, 혈액 생화학적 분석, 소변 분석), 면역학적 지표(면역세포 표현형, 사이토카인, 면역글로불린, 보체), 항 약물 항체(Anti-drug antibody), 독성 동역학 등 파라미터를 평가한다.
실험 결과: 실험 기간 동안, 각 그룹의 동물에 대해 임상 관찰한 결과, 체중, 체온, 심전도 파라미터, 혈구계산, 혈액 생화학, 소변 검사, T 림프구 하위 그룹 및 2-4 그룹의 동물 해부에서 각 항 지표에 뚜렷한 이상 변화 또는 규칙적인 명백한 이상 변화가 없었다.
또한, 300mg/kg 투여군에서 암컷 동물의 2차 투여 전(D8) 및 3차 투여 후 다음날(D16) FIB가 증가함이 보이고, 마지막 투여 후 다음날(D30)에 정상으로 회복되었으며, 다른 동물에서는 이상이 없었다. 제 1차 투여 후 1~2시간(D1), 30mg/kg 투여군에서 수컷 동물의 IL-6이 증가하였고, 300mg/kg 투여군에서 암컷 동물의 IL-10이 증가하여 다음날에는 모두 회복할 수 있다. 제1 차 투여 후 다음날(D2), 300mg/kg 투여군에서 수컷 및 암컷 동물의 IL-6이 모두 증가하였고, D8 투여 전 정상으로 회복되었으며, 제 2차 투여 전(D8), 300mg/kg 투여군에서 암컷 동물에 IL-10이 증가함이 보이고 D29에는 정상으로 회복되었으며, 나머지는 뚜렷한 이상적인 변화가 없었다.
실험 동안 각 그룹의 동물에서 ADA가 검출되지 않았다.
독성 동역학의 결과, 항TSLP 단일 클론 항체 HA-I를 각각 30, 100, 300 mg/kg의 투여량으로 시노몰구스 원숭이에 피하주사하였으며, 제 1차 및 제4차 투여 후 혈중 약물 농도와 노출량은 투여량의 증가에 따라 증가하였고 주요 독성 동역학 파라미터에는 뚜렷한 성별 차이가 없었다. 매주마다 1회, 연속 4회 투여 후 EB070은시노몰구스 원숭이의 체내에 약간 축적되었다(축적 인자는 1.49~2.71).
실시예 22 항TSLP 단일 클론 항체를 시노몰구스 원숭이에게 13주 피하주사 독성 실험
실시예 21의 기초 상에서, 본 실험의 목적은 항TSLP 단일 클론 항체를 주사하여 항TSLP 단일 클론 항체를 매주마다 1회 투여하고 시노몰구스 원숭이에게 13주 동안 반복 피하주사로 투여한 후, 독성 반응, 독성 동역학 및 약물 중단 후 6주 동안 회복한 후의 독성의 회복 상황을 평가하는 것입니다.
(1)실험품 정보: 항TSLP 단일 클론 항체 HA-I, 주사액(부형제는 히스티딘, 히스티딘 염산염, 소르비톨, 폴리소르베이트 80 포함)으로 조제한다.
대조품 정보: 항TSLP 단일 클론 항체 HA-I의 완충액(성분은 히스티딘, 히스티딘 염산염, 소르비톨, 폴리소르베이트 80을 포함하며, 약물 성분인 항TSLP 단일 클론 항체 HA-I를 포함하지 않은 것을 제외하고는 주사액 기타 성분과 동일함)을 대조군으로 한다.
(2)제공업체: Beijing Eastern Biotech Biotechnology Co., Ltd.
(3)실험 동물:
종속 및 계통:시노몰구스 원숭이
나이 : 3~5세
체중 : 2~5kg;
성별: 암컷, 수컷
동물 개수: 40마리, 암컷 수컷 각 20마리.
(4)그룹화 및 투여
피하주사로 투여하고, 제 1차 투여는 D1로 표기한 후 매주마다 1회 투여하고, 연속 13주 투여하고, 총 14회 투여한다. 이 실험에서는 임상 증상 관찰, 체중, 음식 섭취량, 체온, 이에 따른 안전성 약리 지표 검사, 심전도, 혈압, 안과 검사, 임상 병리 검사(혈구계산，혈액 응고 기능, 혈액 생화학적 분석, 소변 분석), 면역학적 지표(면역세포 표현형, 사이토카인, 면역글로불린, 보체), 항 약물 항체, 독성 동역학 등 파라미터를 평가한다.
초보적 실험 결과에서 시노몰구스 원숭이에 항TSLP 단일 클론 항체HA-Ⅰ를 중복적으로 피하주사 투여한 후 동물 임상 관찰, 체중, 체온, 안과 검사 및 해부에서 모두 뚜렷한 이상이 없었다.
본 발명은 상기 가장 바람직한 실시형태에 한정되지 않고, 누구나 본 발명의 시사 하에서 모두 다른 다양한 형태의 제품을 얻을 수 있지만, 그 형상 또는 구조를 변경하더라도, 본 출원과 동일하거나 유사한 기술적 수단을 가지면, 모두 본 발명의 보호범위 내에 속한다.
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Claims (15)
- 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
각각 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 표시되는 3개의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 표시되는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1이 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR2가 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR3이 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1이 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR2가 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR3이 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 A-I;
상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1이 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR2가 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR3이 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1이 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR2가 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR3이 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 A-Ⅱ;
상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1이 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR2가 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR3이 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1이 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR2가 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR3이 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 A-Ⅲ;
상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1이 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR2가 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR3이 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1이 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR2가 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR3이 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 A-Ⅳ로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서,
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 MA-Ⅰ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 MA-Ⅱ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 MA-Ⅲ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 MA-Ⅳ로부터 선택되는 어느 하나인 마우스 유래 항체 분자이며;
바람직하게는, 상기 마우스 유래 항체 분자는 MA-Ⅰ인 것을 특징으로 하는 항LAG-3의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제2항에 있어서,
상기 마우스 유래 항체 분자는 마우스 유래 항체 중쇄 불변 영역 및 마우스 유래 항체 경쇄 불변 영역을 더 포함하고, 상기 마우스 유래 항체 중쇄 불변 영역은 마우스의 IgG1형, IgG2a형, IgG2b형, IgG3형 중 하나이며, 상기 IgG1형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 26으로 표시되고, 상기 IgG2a형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 27로 표시되며, 상기 IgG2b형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 28로 표시되고, 상기 IgG3형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 29로 표시되며; 상기 마우스 유래 항체 경쇄 불변 영역은 마우스 Ck형의 경쇄 불변 영역이고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 25로 표시되며;
바람직하게는, 상기 마우스 유래 항체 분자는 마우스의 IgG1형의 중쇄 불변 영역과 마우스Ck형의 경쇄 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제2항에 있어서,
상기 마우스 유래 항체 분자의 중쇄 가변 영역, 상기 마우스 유래 항체 분자의 경쇄 가변 영역, 및 인간화 항체의 불변 영역을 포함하는 키메라 항체 분자인 것을 특징으로 하는 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서,
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 HA-Ⅰ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 HA-Ⅱ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 HA-Ⅲ;
상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 HA-Ⅳ로부터 선택되는 어느 하나인 인간화 항체 분자이며;
바람직하게는, 상기 인간화 항체 분자는 HA-Ⅰ인 것을 특징으로 하는 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제5항에 있어서,
상기 인간화 항체 분자는 인간화 항체의 불변 영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제5항 또는 제6항에 있어서,
상기 인간화 항체 분자는 전장 항체 또는 항체 단편이고, 상기 인간화 항체 분자는 Fab, F(ab)2, Fv 또는 ScFv 중 하나 또는 복수의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제4항 또는 제6항에 있어서,
상기 인간화 항체의 불변 영역은 인간화 항체의 중쇄 불변 영역 및 인간화 항체의 경쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 인간화 항체의 중쇄 불변 영역은 인간의 IgG1형, IgG2형 또는 IgG4형의 중쇄 불변 영역으로부터 선택되며, 상기 IgG1형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 30으로 표시되고, 상기 IgG2형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 31로 표시되며, 상기 IgG4형의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 32로 표시되고, 상기 인간화 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 Ck 형의 경쇄 불변 영역이며, 그의 아미노산 서열은 서열번호 33으로 표시되고;
바람직하게는, 상기 인간화 항체의 불변 영역은 인간의 IgG1형의 중쇄 불변 영역과 인간 Ck 형의 경쇄 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 분자.
- 제10항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 발현 벡터.
- 원핵 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포를 포함하고;
바람직하게는, HEK293E 세포, CHO 세포 또는 NS0 세포인 포유 동물 세포인 것을 특징으로 하는 제11항에 따른 재조합 DNA 발현 벡터를 형질감염시키는 숙주 세포. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물.
- 면역 질환 또는 암의 치료를 위한 약물의 제조에서의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 응용으로서,
바람직하게는, 상기 면역 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 피부염을 포함하고, 상기 천식은, 중증 천식, 호산구성 또는 비호산구성 천식 및 저호산구성 천식을 포함하며;
바람직하게는, 상기 암은 췌장암, 비소세포폐암, 흑색종, 전립선암, 신장암, 결장직장암 또는 유방암을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 질환 또는 암의 치료를 위한 약물의 제조에서의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항TSLP의 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 응용. - TSLP로 매개되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법으로서,
필요하는 개체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항TSLP의 단일 클론 항체를 투여하는 것을 포함하고;
상기 질환은 면역 질환 또는 암을 포함하며, 상기 면역 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 알레르기성 피부염을 포함하고, 상기 천식은, 중증 천식, 호산구성 또는 비호산구성 천식 및 저호산구성 천식을 포함하며;
상기 암은 췌장암, 비소세포폐암, 흑색종, 전립선암, 신장암, 결장직장암 또는 유방암을 포함하는 것을 특징으로 하는 TSLP로 매개되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 방법.
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