KR20240111305A - 페롭토시스 유도 활성을 갖는 화합물 - Google Patents

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KR20240111305A
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서울대학교산학협력단
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    • C07C275/28—Derivatives of urea, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of urea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
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Abstract

본 발명은 페롭토시스를 유도하는 소라페닙에 기반한 유도체 화합물에 관한 것으로서, 상기 화합물은 강화된 페롭토시스 활성을 가질 뿐 아니라 개선된 생체 내 이용율을 나타내므로, 기존의 화학항암제에 대한 내성을 갖는 암 및 관련 증상을 치료, 완화, 또는 개선하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

페롭토시스 유도 활성을 갖는 화합물{Compound with ferroptosis inducing activity}
본 발명은 페롭토시스 유도 활성을 갖는 화합물에 관한 것이다.
또한, 페롭토시스 유도 활성을 갖는 항암제에 관한 것이다.
세포 사멸 메커니즘의 하나로서 최근 밝혀지고 있는 페롭토시스(ferroptosis)는 산화 환원 시스템의 조절 장애로 인해 지질 과산화가 축적되어 발생하는 것으로 알려져 있다. 페롭토시스는 녹아웃시 배아 치사를 유도하는 주요 페롭토시스 조절제인 GPX4(glutathione peroxidase 4) 또는 글루타티온(GSH) 합성에 사용되는 시스틴/글루타메이트 운반체인 xCT(SLC7A11에 의해 암호화됨)의 억제에 의해 화학적으로 유도될 수 있다. 페롭토시스 유도제(Ferroptosis inducer; FIN)는 일반적으로 작동 기전에 따라 분류되는데, 에라스틴 및 소라페닙과 같은 화합물은 (xCT 억제를 통해) GSH 합성을 방지하여 GPX4의 작용을 간접적으로 억제하는 클래스 1 FIN에 속한다.
소라페닙은 다중-단백질 키나제 억제제(multi-protein kinase inhibitor)로서 키나제 신호전달 억제 및 xCT(cystine/glutamate antiporter) 억제에 의한 페롭토시스 유도를 주요한 기전으로 하는 항암제이다. 소라페닙은 다중-단백질 키나제 억제제 약물로서 FDA 승인을 받았으며, 경구용 제제로서 상용화되기도 했으나 초기 기대와는 달리, 낮은 임상 효과 및 소라페닙 만의 특정 부작용, 예를 들어, 근골격계, 신경계, 병리학적 장애, 출혈 등이 발생하는 문제점이 있었다.
또한, 기 개발된 페롭토시스 유도제인 에라스틴(Erastin)은 내성 암세포를 포함한 대부분의 Ras 종양 유전자를 발현하는 세포에서 강한 페롭토시스를 유도하지만 낮은 약동학으로 동물 모델의 체내에서의 생체 이용율이 낮아, 항암제로서의 임상시험을 통과하지 못하였다.
대한민국 공개특허 제 10-2020-0080094호는 암세포 표적 지향성을 가지는 하이드로젤 및 철 입자가 서로 결합하여 응집된 형태의 나노 입자의 페롭토시스를 통한 항암 효과를 개시하고 있으며, 대한민국 공개특허 제10-2021-0137134호 등은 페롭토시스-관련 장애의 치료를 위한 신규 화합물을 제시하고 있다.
그러나, 세포 수준에서 유효성을 확인하고, 동물모델에서 사용이 가능할 정도의 약물 동태 프로파일을 지닌 화합물은 아직까지 보고된 바 없다.
이에 종래의 화학 항암제 내성을 지닌 세포에서 활성을 보이면서 경구투여가 가능한 약물의 개발이 여전히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 FDA 승인을 받았으며, 페롭토시스를 일으킨다고 알려진 소라페닙을 기반으로 하여 키나제 억제 모티프를 변형하여, Raf-1 저해 활성을 감소시키고, 페롭토시스 유도 활성을 상대적으로 강화하고, 약동학적 거동 및 생체 내 이용율이 개선된 화합물을 합성하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 소라페닙을 기반으로 한 페롭토시스 유도제를 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 암의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 화합물을 제공하고자 한다.
상기 목적을 해결하기 위하여,
본 발명은 일 측면에서,
하기 화합물 군으로부터 선택되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
1-(4-(4-클로로-2-메톡시페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아;
1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-메톡시페녹시)페닐)우레아;
1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)페녹시)페닐)우레아;
1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(4-클로로페녹시)-페닐)우레아;
1-(4-(3-(터트-부틸)페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아; 및
1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-히드록시에틸)페녹시)페닐)우레아.
본 발명은 다른 측면에서,
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화합물은 소라페닙의 키나제 억제 모티프를 변형시킴으로써 임상적으로 생체 내 이용률이 낮은 소라페닙의 단점을 개선하여 표적 암세포의 페롭토시스를 유도하고 기존의 화학 항암제에 저항성을 갖는 암의 예방 또는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 in-vitro 조건에서 소라페닙이 A549 세포 및 TD 세포의 세포 사멸에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 2는 in-vitro 조건에서 소라페닙이 A549 세포 및 TD 세포의 세포 성장에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 3은 in-vitro 조건에서 소라페닙이 A549 세포 및 TD 세포의 CHAC1 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 4는 in-vitro 조건에서 소라페닙 및 페로스타틴-1이 TD 세포의 CHAC1 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 5는 in-vitro 조건에서 에라스틴 및 페로스타틴-1이 TD 세포의 MT1G 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 6은 in-vitro 조건에서 소라페닙 및 페로스타틴-1이 TD 세포의 세포독성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 7은 소라페닙의 리모델링 전략을 보여주는 모식도이다.
도 8은 소라페닙의 키나제 억제 모티프를 변형시키는 리모델링 전략을 보여주는 모식도이다.
도 9는 A549 세포 및 TD 세포의 관계 및 에라스틴 민감도 차이를 보여주는 모식도이다.
도 10는 in-vitro 조건에서 실시예 화합물들의 A549 세포 및 TD 세포 성장 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 11는 in-vitro 조건에서 A549 세포, H358 세포, H1299 세포 및 Calu1 세포의 에라스틴 민감도를 보여주는 그래프이다.
도 12는 in-vitro 조건에서 A549 세포, H358 세포, H1299 세포, Calu1 세포 및 TD 세포에 대한 JB3, JB5, JB10 및 소라페닙의 세포 성장 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 in-vitro 조건에서 A549 세포, H358 세포, H1299 세포, Calu1 세포 및 TD 세포에 대한 JB3, JB5, JB10 및 소라페닙의 성장 억제 효과의 폴드 체인지(fold change)를 보여주는 그래프이다.
도 14는 in-vitro 조건에서 JB3 및 소라페닙의 Raf-1 신호 전달에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 15은 in-vitro 조건에서 JB3 및 소라페닙의 MEK/ERK 신호 전달에 대한 영향을 나타낸 웨스턴 블랏팅 결과이다.
도 16는 in-vitro 조건에서 JB3 및 에라스틴의 ERK 신호 전달에 대한 영향을 나타낸 웨스턴 블랏팅 결과이다.
도 17는 in-vitro 조건에서 JB3 및 소라페닙의 활성 산소종 생성에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 18은 in-vitro 조건에서 JB3 및 소라페닙이 MT1G/CHAC1의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 19은 in-vitro 조건에서 JB3 처리에 따른 A549, H1299 및 Calu1 세포의 사멸 효과를 보여주는 그래프이다.
도 20은 in-vitro 조건에서 JB3 처리에 따른 Calu1 세포의 시간에 따른 성장 억제 그래프이다.
도 21은 in-vivo 조건에서 JB3 처리에 따른 종양의 부피 및 크기의 성장 억제 그래프이다.
도 22은 in-vivo 조건에서 JB3 처리에 따른 마우스의 체중량 변화 그래프이다.
도 23은 in-vivo 조건에서 JB3 처리에 따른 4-HNE 발현량에 대한 영향을 보여주는 웨스턴 블랏팅 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함한다”는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 소라페닙 유도체 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 트리플루오로아세트산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.
상기 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 소라페닙 유도체 화합물은 페롭토시스를 유도하는 것을 특징으로 할 수 있다.
암은 고형암 또는 혈액암을 포함하며,
예시적으로, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 소세포폐암, 식도암, 담낭암, 난소암, 췌장암, 위암, 자궁 경부암, 갑상선암, 전립선암, 또는 피부암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 암은 다른 항암제, 특히 화학항암제에 대해서 저항성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 소라페닙 유도체 화합물은 기존의 다른 항암제와 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "유효성분으로 함유하는"이란, 신경 퇴행성 질환의 예방, 개선, 또는 치료의 효과를 가져오는 역할을 수행하는 성분으로서 함유함을 의미하고, 이때 중증도 및 제형에 따라 용량범위는 변할 수 있으며, 적용횟수도 적용 대상의 연령, 체중 및 체질에 따라 변할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물 내에서 본 발명의 소라페닙 유도체 화합물은, 예를 들어, 0.001mg/kg 이상, 0.1mg/kg 이상, 10mg/kg 이상, 100mg/kg 이상, 250mg/kg 이상, 0.1g/kg 이상 포함된다. 본 발명의 소라페닙 유도체 화합물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다. 치명적인 독성을 나타내지 않으면서 활성을 가질 수 있는 범위 내에서 선택될 수 있으며, 예를 들면 2000mg/kg 이하, 1000mg/kg 이하 일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 소라페닙 유도체 화합물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제는 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 물질을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 소라페닙 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 소라페닙 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 본 발명의 소라페닙 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "예방"이란, 본 발명의 약학적 조성물, 식품 조성물을 신경 퇴행성 질환의 투병중이지 않은 개체에게 투여, 섭취 또는 적용하여 신경 퇴행성 질환의 증세를 억제 또는 차단함으로써, 암의 증세가 사전에 발생되지 않도록 하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "치료"란, 본 발명의 약학적 조성물을 신경 퇴행성 질환 투병중인 개체에게 투여한 결과로서 신경 퇴행성 질환의 증세의 완치는 물론 신경 퇴행성 질환의 증세의 부분적 완치, 호전 및 경감을 포함한다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 상기 화합물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료 또는 개선에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명자들은 폐암 상피세포(A549)와, 이의 상피간엽 이행(Epithelial to Mesenchymal transition)을 거친 간엽성 상태로 유도된 세포인 간엽성 폐암 세포, 즉 TD 세포(transdifferentiated cells)를 사용하여 소라페닙 처리 후 세포 생존율을 분석하였다(도 1 및 도 2). TD 세포의 소라페닙 민감도가 더 높게 나타났고, 이는 TD 세포가 xCT를 억제하는 TGF-β 노출에 의해 형성되는 점을 고려하여 xCT의 표적외(off-target) 억제에서 파생된 페롭토시스 취약성에 의해 비롯된 것으로 가정하였다. 이를 확인하기 위해 소라페닙 및 페로스타틴-1 처리에 의한 xCT 억제 마커인 CHAC1의 발현량 변화(도 3 및 도 4), 에라스틴 또는 소라페닙 및 페로스타틴-1 처리에 의한 metallothionein-1G(MT1G)의 발현량 변화(도 5), 및 소라페닙과 페로스타틴-1에 의한 세포 독성 변화(도 6)를 분석하였고, TD 세포의 높은 소라페닙 민감도가 페롭토시스에 의한 것임을 확인하였다. 따라서 소라페닙의 xCT 억제 모티프는 유지하고 키나제 억제 모티프를 변형시킴으로써 임상적으로 유리한 페롭토시스 유도제를 제조하는 전략을 수립하고, 화합물 JB3, JB4, JB5, JB6, JB9, JB10를 제조하였다(도 7 및 도 8).
동종(isogenic) 세포이나 에라스틴 민감도가 현저히 다른 A549 세포와 TD 세포 쌍을 사용하여(도 9), 본 발명에 따른 소라페닙 유도체 화합물 JB3, JB4, JB5, JB6, JB9, JB10의 성장 억제 효과를 관찰한 결과, 특히 JB3, JB5, JB10 화합물이 M 상태인 TD 세포의 성장을 선택적으로 저해하는 것을 확인하였다(도 10).
JB3, JB5, JB10을 에라스틴 민감도가 낮은 세포(A549, H358, H1299)와 에라스틴 민감도가 높은 세포(TD 세포, Calu1 세포)를 대상으로 하여(도 11) 에라스틴 및 JB3, JB5, JB10의 세포 성장 저해 수준을 정량화한 결과, 에라스틴에 민감도가 낮은 세포에 대해서는 JB3 및 JB5이, 에라스틴에 높은 민감도를 갖는 TD 세포에서는 JB3 및 JB5이, Calu1 세포에서는 JB3이 소라페닙 대비 더 우수한 항암 활성을 나타내었다(도 12 및 도 13).
항암 기전을 확인하기 위해, JB3가 키나제 억제 기전과 관련 있는 Raf-1(Serine/Threonine Kinase) 발현에 미치는 영향을 평가한 결과 JB3 화합물은 Raf-1을 억제하는 활성이 매우 낮았다(도 14). 반면 Raf-1의 하류 신호 전달 경로인 MEK/ERK 신호 전달, 활성 산소종(ROS) 생성 및 MT1G 와 CHAC1의 발현량은 상향조절하는 점에서 JB3의 세포독성은 키나제 신호 억제보다는 페롭토시스 유도에 기인함을 확인하였다(도 14 내지 20).
나아가 JB3의 임상적 가능성을 확인하기 위하여 정맥 투여 및 경구 투여에 의한 약동력학을 분석하였고, 정맥 투여는 물론 경구 투여 시에도 24%의 생체 이용률로서 경구 제형 적용 가능성을 확인하였다.
또한 in-vivo 항암 효과를 분석하기 위해 Calu1 세포에 의해 종양이 유도된 마우스에 JB3를 3주동안 경구 투여한 결과 종양의 부피 및 무게가 감소하고 마우스의 비정상적인 체중감소가 발생하지 않았다(도 21 및 도 22). 그리고 JB3를 처리한 모든 종양 조직에서의 4-HNE 발현량이 증가한 바 생체 내에서 JB3가 페롭토시스를 유도하여 종양 성장을 억제한다는 것을 확인하였다(도 23).
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 화합물의 제조
Scheme 1에 따라서, 화합물 9a 내지 9f를 제조하였다.
Scheme 1.
a) Cs2CO3, DMF, 12 h, 90 °C; b) K2CO3, THF, 90 °C, 16 h; c) TMSCF3, TBAF, THF, -78 °C to RT, 16 h 이후 HCl, THF, RT, 6 h d) SnCl2, EtOAc, 50 °C, 16 h; e) Pyridine, 80 °C, 5 h
1-1. 1-(4-(4-클로로-2-메톡시페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아 (9a, JB3) 의 제조
단계 1: 화합물 3a의 제조
화합물 1a (200mg, 1.26mmol)와 1-아이오도4-나이트로벤젠 (532mg, 1.51mmmol)을 DMF에 용해시킨 후, 용액을 교반하면서 세슘카보네이트 (1.23g, 3.78mmol)를 첨가하였다. 이후 90℃에서 16시간 동안 교반한 후 물을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이후 EtOAc (x3)로 추출 후, 유기층을 모아 마그네슘 설페이트를 첨가하여 건조 후에 감압증류하였다. 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 (EtOAc/n-Hex) 정제하여 흰색 고체로서 3a 화합물을 얻었다 (345mg, 98%).
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.17 (d, J = 9.2Hz, 2H), 7.05-6.97 (m, 3H), 6.91 (d, J = 9.2Hz, 2H), 3.77 (s, 3H).
단계2: 화합물 7a의 제조
화합물 3a (201mg, 0.72mmol)를 EtOAc에 용해시킨 후, 교반하면서 틴클로라이드 2수화물 (810mg, 3.59mmol)을 첨가하였다. 이후 50℃ 에서 16시간 동안 반응 후 포화탄산수소소듐용액을 첨가하여 반응물을 염기화시켰다. 이후 EtOAc (x3)로 추출 후, 유기층을 모아 마그네슘 설페이트를 첨가하여 건조 후에 감압증류하였다. 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 (EtOAc/n-Hex) 정제하여 흰색 고체로서 7a 화합물을 얻었다 (86mg, 47%).
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 6.93 (d, J = 2.0Hz, 1H), 6.82-6.80 (m, 3H), 6.72 (d, J = 8.8Hz, 1H), 6.67 (J = 8.8Hz, 2H), 3.85 (s, 3H).
단계 3: 화합물 9a(JB3)의 제조
화합물 7a (50mg, 0.20mmol)와 화합물 8 (63mg, 0.20mmol)을 피리딘에 용해한 후, 80℃ 에서 3시간 동안 교반시켰다. 감압증류로 피리딘을 제거한 후 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 (EtOAc/n-Hex/CH2Cl2) 정제하여 흰색 고체로서 9a 화합물을 얻었다 (30mg, 31%).
1H NMR (400MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.11 (s, 1H, -NH), 8.78 (s, 1H, -NH), 8.10 (d, J = 2.0Hz, 1H), 7.63 (dd, J = 8.8, 2.4Hz, 1H), 7.59 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.40 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.24 (d, J = 2.0Hz, 1H), 6.99 (dd, J = 8.4, 2.0Hz, 1H), 6.96 (d, J = 8.8Hz, 1H), 6.84 (d, J = 9.2Hz, 2H), 3.78 (s, 3H).
1-2. 1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-메톡시 페녹시)페닐)우레아 (9b, JB4)의 제조
화합물 1b를 출발 물질로 하여, 상기 제조예 1-1의 단계 1 내지 3과 동일한 조건 및 방법으로 목적 화합물 9b을 제조하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.14 (s, 1H, -NH), 8.85 (s, 1H, -NH), 8.11 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 8.8, 2.4Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.24 (t, J = 8.2Hz, 1H), 7.00 (d, J = 9.2Hz, 2H), 6.67 (dd, J = 8.4, 2.0Hz, 1H), 6.53 (t, J = 2.4Hz, 1H), 6.49 (ddd, J = 8.0, 2.0, 0.8Hz, 1H), 3.72 (s, 3H).
1-3. 1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)페녹시)페닐)우레아 (9c, JB5)의 제조
화합물 1c를 출발 물질로 하여, 상기 제조예 1-1의 단계 1 내지 3과 동일한 조건 및 방법으로 목적 화합물 9c를 제조하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.16 (s, 1H, -NH), 8.91 (s, 1H, -NH), 8.10 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.65-7.56 (m, 3H), 7.52 (d, J = 9.2Hz, 2H), 7.43 (d, J = 7.6Hz), 7.24-7.22 (m, 2H), 7.07 (d, J = 8.8Hz, 2H).
1-4. 1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(4-클로로페녹시)-페닐)우레아 (9d, JB6)의 제조
화합물 1d를 출발 물질로 하여, 상기 제조예 1-1의 단계 1 내지 3과 동일한 조건 및 방법으로 목적 화합물 9d를 제조하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.15 (s, 1H, -NH), 8.88 (s, 1H, -NH), 8.11 (d, J = 2.4Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 8.8, 2.4Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.8Hz, 1H), 7.50 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.40 (d, J = 8.8Hz, 2H), 7.01 (d, J = 8.8Hz, 2H), 6.97 (d, J = 8.8Hz, 2H).
1-5. 1-(4-(3-(터트-부틸)페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아 (9e, JB9)의 제조
화합물 1e를 출발 물질로 하여, 상기 제조예 1-1의 단계 1 내지 3과 동일한 조건 및 방법으로 목적 화합물 9e를 제조하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.15 (s, 1H, -NH), 8.84 (s, 1H, -NH), 8.11 (d, J = 2.0Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 8.8, 2.4Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.8z, 1H), 7.48 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.26 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.12 (d, J = 7.6Hz, 1H), 7.02 (t, J = 2.0Hz, 1H), 6.98 (d, J = 9.2Hz, 2H), 6.70 (dd, J = 8.0 / 2.8Hz, 1H), 1.25 (s, 9H).
1-6. 1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-히드록시에틸)페녹시)페닐)우레아 (9f, JB10)의 제조
단계 1: 화합물 6의 제조
3-하이드록시 벤즈알데히드 (0.95g, 7.8mmol)와 1-플루오로-4-나이트로벤젠 (0.75mL, 7.1mmol)을 DMF에 용해시킨 후, 용액을 교반하면서 포타슘카보네이트 (2.94g, 21.3mmol)를 첨가하였다. 이후 90℃에서 16시간 동안 교반한 후 물을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이후 EtOAc (x3)로 추출 후, 유기층을 모아 마그네슘 설페이트를 첨가하여 건조 후에 감압증류하여 화합물 6을 얻었다. 추가적인 정제없이 다음 반응을 진행하였다.
단계 2: 화합물 3f의 제조
2,2,2-트리플루오로-1-(3-(4-니트로페녹시)페닐)에탄-1-올 (3f)의 제조
-78℃ 질소 조건에서 화합물 6 (1.22g, 5.02mmol)을 건조 THF 용액에 용해시킨 후, 교반하면서 트리플루오로메틸트리메틸실란(TMSCF3, 1.63mL, 11.92mmol)과 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드 (TBTA, 1M in CH2Cl2, 0.25mL, 0.25mmol)를 천천히 첨가하였다. 이후 상온에서 밤새 교반하여, 화합물 6의 소모를 TLC로 확인하고, 2N HCl 수용액을 첨가한 후 6시간 동안 상온에서 교반하였다. 이후 EtOAc (x3)로 추출 후, 건조 후에 감압증류하였다. 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 (EtOAc/n-Hex) 정제하여 흰색 고체로서 3f 화합물을 얻었다 (1.47g, 94%).
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.21 (d, J = 9.2Hz, 2H), 7.49 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.35 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.13 (dd, J = 8.0, 2.4Hz, 1H), 7.02 (d, J = 9.2Hz, 2H), 5.06 (m, 1H, -OH), 2.66 (d, J = 4.5Hz, 1H).
단계 3: 화합물 9f의 제조
화합물 3f를 출발물질로 하여 제조예 1-1의 단계 2 및 단계 3(화합물 3a로부터 화합물 9a의 제조)와 동일한 조건 및 방법으로 목적 화합물 9f를 제조하였다.
1H NMR (500MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.17 (s, 1H, -NH), 8.88 (s, 1H, -NH), 8.11 (d, J = 2.0Hz, 1H), 7.64 (dd, J = 8.5, 2.2Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.5Hz, 1H), 7.49 (d, J = 9.0Hz, 2H), 7.39 (t, J = 8.0Hz, 1H), 7.21 (d, J = 7.5Hz, 1H), 7.09 (s, 1H), 7.00 (d, J = 9.0Hz, 2H), 6.97 (dd, J = 8.5, 2.0Hz, 1H), 6.86 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 5.17 (quintet, J = 6.5Hz, 1H).
이하 실시예 및 실험예를 통하여 제조된 화합물 생물학적 활성을 평가하였다.
<실험방법>
1. 세포 배양
239T, A549 및 TD 세포는 10% FBS (Thermo Fisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) 및 0.1% gentamycin (Thermo Fisher SCIENTIFIC)를 포함하는 DMEM media (Cat #11995, Gibco, CA, USA) 에서,
Calu1 세포는 10% FBS (Thermo Fisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA), 0.1% gentamycin (Thermo Fisher SCIENTIFIC) 및 1% streptomycin/penicillin을 포함하는 McCoy's 5A media (Cat #16600082, Gibco, CA, USA)에서,
H1299, H358 세포는 10% FBS (Thermo Fisher SCIENTIFIC, Waltham, MA, USA) 및 0.1% gentamycin (Thermo Fisher SCIENTIFIC)를 포함하는 RPMI-1640 Media (Cat #R8758-500ML, Sigma-Aldrich, CA, USA)에서 배양하였다.
마이코플라스마 검사(Mycoplasma testing)를 매달 BioMycoX 마이코플라스마 PCR 검출 키트(CellSafe)를 사용하여 수행하였다.
2. 웨스턴 블랏팅
1% 프로테아제 억제제 칵테일 및 0.1% 오르토바나데이트 나트륨이 보충된 RIPA 완충액으로 세포 용해물을 추출했다. 얼음에서 1시간 배양 후, 원심분리기로 전체 단백질을 추출하였다. 총 단백질의 농도는 BCA 단백질 분석 키트(#23225, Thermo ScientificTM)로 정량화하였다. 약 15-20㎍의 총 단백질이 다양한(7.5%, 10%, 15%) 농도의 SDS-PAGE에서 분리되었다. 겔에서 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 단백질이 포함된 막을 TBS-T(0.1% Tween-20이 포함된 Tris-buffered saline)에 5% 탈지유로 1시간 동안 차단한 다음 TBS-T로 5분마다 세 번 세척했다. 막을 0.1% 아지드화나트륨을 함유한 TBS-T(1:1000)에서 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 배양된 막을 TBS-T로 3회 5분 동안 세척하였다. 막을 실온에서 1시간 동안 TBS-T(1:10000)에서 HRP-접합된 2차 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories)와 함께 인큐베이션하였다. 배양된 막을 TBS-T로 3회 15분 동안 세척하였다. WEST-QueenTM (#16026, iNtRON Biotechnology) 키트를 사용하여 Chemi-Doc으로 면역반응성을 검출하였다.
3. 세포 사멸 분석:
세포 사멸은 유동 세포 계측법으로 분석했다. Annexin V/7-AAD 염색과 관련하여 화합물 처리 24시간 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 FITC 결합 Annexin V 항체(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA, #556419) 및 7-AAD(BD Bioscience, #559925), PE Annexin V 항체(BD Bioscience, 556421) 또는 Propidium iodide(PI)를 어두운 곳의 실온에서 추가로 45-60분 동안 처리하였다. Annexin V/7-AAD로 염색된 세포를 FACS Calibur(BD Bioscience)로 분석했다. 촬영된 모든 명시야 이미지는 제조업체의 프로토콜에 따라 Light channel 광학 현미경(Olympus, Tokyo, Japan, CKX-41) 또는 JULI-stage(NanoEntek, Seoul, Korea)를 사용했다.
4. 라이브 셀 이미징
라이브 셀 이미지는 JuLITM Stage(NanoEnTek Inc.)로 캡처했다. 취득한 이미지는 제조 지침으로 JuLITMSTAT 소프트웨어를 사용하여 추가 처리 및 분석되었다.
5. 약동력학 연구
JB3의 약동학 특성은 건강한 수컷 Sprague-Dawley 쥐(n=4)에서 평가되었다. 생체 내 약동학 연구를 위한 프로토콜은 서울대학교 동물관리위원회(SNU-200506-6)의 승인을 받았다. Koatech Inc.(평택, 한국)로부터 입수한 래트(230 내지 250g)를 투여 전 밤새 단식시켰다. 좌측 대퇴 동맥 및 정맥을 Zoletil(Virbac, Carros, France) 마취(50mg/kg, 근육내 주사) 하에 폴리에틸렌 튜브(Intramedic™ PE-50; Becton Dickinson Diagnostics, MD, USA)로 카테터를 삽입하였다. JB3를 DMSO/EtOH/PEG400/NS(15:25:25:35, v/v/v/v)에 용해시키고 정맥내(1mg/kg) 또는 경구(5mg/kg)로 투여했다. 미리 정해진 시간(1, 5, 15, 30, 45, 60, 120, 180, 240, 360, 480, 1440분)에 대퇴 동맥에서 혈액 샘플(120μL)을 수집하고 즉시 얼음 욕조에 보관했다. 각 시점에서 혈액 응고를 방지하기 위해 헤파린(20U/mL)을 포함하는 동량의 염화나트륨(0.9%) 주사액을 보충했다. 그런 다음 혈액 샘플을 16,000 x g에서 2.5분(4℃) 동안 회전시킨 고속 원심분리를 사용하여 혈액 샘플에서 혈장을 분리했다. 샘플 상청액(혈소판이 부족한 혈장)의 분취량(50μL)을 수집하고 발사르탄의 아세토니트릴 용액(내부 표준으로서, 100ng/mL)으로 단백질 침전 방법으로 전처리했다. 각 혈장 샘플의 JB3 농도는 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 시스템을 사용하여 결정되었다. Agilent Technologies 1260 Infinity HPLC 시스템 및 Agilent Technologies 6430 Triple Quad LC/MS 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)이 장착되어 있다. 가스 온도, 가스 유속, 분무기 압력 및 모세관 전압은 각각 300℃, 11L/min, 15psi 및 3000V로 설정되었다. 역상 C18 컬럼(Zorbax, Eclipse Plus C18, 2.1 × 50mm, 5μm, Agilent Technologies)을 JB3 및 발사르탄의 크로마토그래피 분리에 사용했다. 이동상은 10mM 중탄산암모늄과 아세토니트릴(15:85, v/v)의 등용매 혼합물이었다. 다중 반응 모니터링(MRM) 모드에서 생성 이온에 대한 전구체의 m/z 값은 JB3의 경우 468.8에서 193.8로, 발사르탄의 경우 434에서 350으로 설정되었다. 프래그먼트 전압, 충돌 에너지 및 셀 가속기 전압은 수동으로 최적화되었으며 JB3의 경우 각각 110V, 10eV 및 1V, 발사르탄의 경우 각각 151V, 16eV 및 2V로 설정되었다. JB3와 발사르탄의 머무름 시간은 각각 0.75분과 0.36분이었다.
약동학 매개변수는 비구획 분석(WinNonlin, version 5.0.1, Pharsight, CA, USA)으로 계산했다. 최대 혈장 농도(Cmax), Cmax에 도달하는 시간(Tmax), 제거 반감기(t1/2), 0에서 마지막 시간까지의 혈장 농도 대 시간 곡선 아래 면적(AUClast) 및 혈장 농도 아래 면적 대 시간 0에서 시간 무한대까지의 시간 곡선(AUCinf)은 혈장 농도 데이터에서 얻었다. 절대 경구 생체 이용률(F; 백분율로 표시)은 정맥 주사 후 용량 표준화 AUC에 대한 경구 투여 후 용량 표준화 AUC의 비율로 계산하였다.
6. 동물 및 종양의 이종이식
In-vivo 실험은 체중 18 내지 20g의 6주 된 수컷 Balb/c 흉선성 누드 마우스를 사용하여 수행하였다(Orient Bio Inc., Seungnam, Republic of Korea). 모든 동물실험 절차는 대구경북첨단의료산업진흥재단 실험동물연구소의 실험동물 관리 및 이용 가이드라인에 따라 유지되고 사용되었고, 동물실험은 대구경북첨단의료산업진흥재단 동물실험윤리심의위원회(승인번호: KMEDI-22110207-02)의 승인을 받아 진행됐다.
이종 이식은 5 x 106 Calu1 세포를 마우스의 피하 조직에 투여하여 수행했다. 검사 및 촉진에 의해 종양 형성이 감지되면 JB3를 21일 동안 1일 1회 경구 투여 하였다. 대조군으로 사용된 비히클은 10% DMSO, 15% DW 및 경구 투여 용 75% PEG이다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정하고, 종양 부피(mm3)는 다음 공식을 사용하여 계산하였다:
종양 부피(mm3) = d2 × D/2 (여기서 d와 D는 각각 mm 단위의 가장 짧은 직경과 가장 긴 직경)
절제된 종양은 절개하고 추가 실험을 위해 10% 포르말린으로 고정했다.
7. 통계 분석
그래픽 데이터는 평균 ±SEM으로 표시되었다. 세 개 이상의 그룹에 대한 통계적 유의성은 Tukey 다중 비교 사후 테스트에 따라 일방향 또는 양방향 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 결정되었다. 두 그룹 간의 통계적 유의성은 unpaired Student's t-test를 사용하여 분석되었다. GraphPad Prism 8 소프트웨어(https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/)를 사용하여 통계 분석을 수행했다.
p<0.05(*), p<0.01(**), p<0.001(***)에 대해 유의성을 가정하였다.
<실시예 1> 소라페닙 리모델링 전략 구축
소라페닙은 i) 다중-단백질 키나제 억제제(multi-protein kinase inhibitor)로서 키나제 신호전달 억제 및 ii) xCT(cystine/glutamate antiporter) 억제에 의한 페롭토시스 유도 기전을 기반한 항암제이다.
소라페닙의 리모델링 전략을 구축하기 위해, 폐암 상피세포(A549)와 이의 상피간엽 이행(Epithelial to Mesenchymal transition)을 거친 M 상태 세포로서 간엽성 폐암 세포인 TD 세포를 사용하여, 소라페닙 처리 후 세포사멸 마커 Annexin-V, 7-AAD 및 세포 생존율을 분석하여 항암 효과를 비교해보았다(도 1 및 도 2).
동량의 소라페닙 처리 시 TD 세포의 세포사멸이 더 높고, 생존율이 더 낮고, 세포 성장 억제율이 더 높은 바, TD 세포에서 소라페닙의 항암효과가 더 우수하게 나타났다. TD 세포는 지속적인 EMT (epithelial-mesenchymal transition)를 유도하기 위해서 장기간 TGF-β 노출에 의해 형성되는 점에서, A549 세포와 비교하여 소라페닙에 대한 TD 세포의 높은 감수성은 다중 키나제의 표적(on-target) 억제 대신 소라페닙의 xCT의 표적외(off-target) 억제에서 파생된 페롭토시스 취약성에서 비롯된 것으로 가정하고 xCT 억제의 대표적인 마커인 CHAC1의 발현량을 확인해보았다(도 3).
TD 세포의 소라페닙에 의한 CHAC1 발현은 A549 세포에 비하여 명확하게 더 높았고, 이러한 CHAC1 발현은 페롭토시스의 억제제인 페로스타틴-1(ferrostatin-1)에 의해 상당히 약화된 것을 확인하였다(도 4). 유사하게, 에라스틴 또는 소라페닙 처리에 의한 페롭토시스 동안 발현이 상향조절 되는 metallothionein-1G(MT1G)의 발현 역시 페로스타틴-1에 의해 현격히 감소하였다(도 5). 또한 소라페닙에 의해 TD 세포에서 발생하는 세포독성은 페로스타틴-1에 의해 현저히 감소하였다(도 6). 이러한 점을 종합하였을 때 소라페닙에 대한 TD 세포의 높은 민감도는 페롭토시스로 인한 것임을 확인하였다.
<실시예 2> 소라페닙의 약물 리모델링
상기 실시예 1의 결과를 기반으로, xCT 억제에 의한 페롭토시스 유도는 유지하되 소라페닙의 키나제 억제 모티프를 변형시켜 키나제 억제 작용을 경감시켜 임상적으로 보다 유리한 FIN을 제조하는 전략을 구축하였다(도 7).
소라페닙의 피리딘 고리에 있는 말단 카르복스아마이드의 1차 아마이드 그룹은 키나제 억제를 강화시키며(키나제 억제 모티프), 페닐 고리의 -CF3 및 -Cl 치환은 xCT 억제에 중요하다(xCT 억제 모티프)는 것이 알려져 있다. 따라서 고리에 있는 말단 카르복스아마이드의 1차 아마이드 그룹을 페닐 고리로 대체하고(도 8), xCT 억제 모티프인 트리플루오로메틸 페닐 고리는 유지하는 형태의 화합물 JB3, JB4, JB5, JB6, JB9, JB10을 제조하였다.
<실험예 1> A549 세포 및 TD 세포에 대한 세포 성장 억제
실시예 화합물의 페롭토시스 유도 활성을 시험하기 위한 모델로서 동질한 유전자쌍이나 에라스틴 민감도가 현저히 차이나는 A549 세포와 TD세포를 사용하였다(도 9).
이들 세포에 일정량의 실시예 화합물과 대조군으로 소라페닙을 처리하여 24시간 동안 세포의 성장을 라이브 이미징화한 후, 각각의 세포에 대한 화합물들의 성장 억제 효과를 정량화하였다(도 10).
이러한 데이터를 기반으로 볼 때 중 JB3, JB5, JB10 화합물은 M 상태인 TD 세포의 성장을 선택적으로 저해하는 것이 확인되었다.
<실험예 2> JB3, JB5, JB10 화합물의 다양한 세포에 대한 세포 성장 억제
JB3, JB5, JB10 화합물을 선택하여, 다양한 세포 대상으로 성장 억제 실험을 수행하였다.
E 상태의 세포로서 A549에 더해서 세포 H358과 H1299, 그리고 TD 세포에 더해서 M 상태 세포로서 세포 Calu1을 실험 대상에 추가하여 총 5종의 세포에 대해 화합물의 농도를 낮추어 실험을 수행하였다.
이들은 EMT(epithelial-mesenchymal transition) 상태를 기반으로 한 NRM 스코어 및 페롭토시스를 유도하는 것으로 잘 알려진 화합물 에라스틴에 대한 반응성(AUC)을 기반으로 선별하였다(도 11).
다양한 폐암 세포에서 에라스틴 및 실시예 화합물의 영향을 라이브 이미징으로 확인하여 세포 성장 저해를 정량화한 결과는 도 12 및 도 13와 같다.
이에 따르면, 에라스틴에 높은 민감도를 갖는 세포에 대해서 JB3 및 JB5는 소라페닙 대비 더 우수한 항암 활성을 나타내었다. 구체적으로 A549 세포에 대해서는 JB3과 JB5가, H1299 세포에 대해서는 JB5가, H358 세포에 대해서는 JB5가 소라페닙보다 더 우수한 활성을 보였다.
그러나, 에라스틴에 높은 민감도를 갖는 TD 세포에서는 JB3 및 JB5 화합물이, Calu1 세포에서는 JB3 화합물이 소라페닙 대비하여 더 우수한 항암 활성을 나타내었고, 공통적으로 JB3 화합물은 에라스틴에 높은 민감도를 갖는 세포에서 소라페닙 대비하여 우수한 활성을 나타내었다.
<실험예 3> 항암 기전 확인
3-1. Raf-1 억제
JB3의 구조적 변형이 키나제 억제제의 효능에 미치는 영향을 확인하기 위해 소라페닙의 원래 표적인 Raf-1(키나제 억제 기전)에 대한 JB3의 IC50을 소라페닙의 IC50과 비교했다. JB3의 IC50은 226.9nM로서 소라페닙의 28.29nM보다 10배 정도 더 컸다(도 14).
본 발명의 JB3 화합물은 Raf-1을 억제하는 활성이 매우 낮음을 확인하였다.
3-2. MEK/ERK 분석
Raf의 하류 신호 전달 경로인 MEK/ERK 신호 전달은 소라페닙 처리에 의해 억제되었으며, 반대로 JB3는 용량 의존적으로 MEK/ERK 신호 전달을 활성화했다(도 15). 한편, JB3와 에라스틴의 시간 의존적 ERK 활성정도를 비교하여 보았으며, 유사하게 시간 의존적으로 ERK를 활성화시켰다(도 16). 이는 JB3 및 에라스틴은 xCT 억제에 의해 ERK 신호를 활성화한다는 것을 의미한다. 특히 Raf-1에 대한 IC50 결과와 비교하였을 때, JB3는 키나제 신호 전달 억제보다는 페롭토시스 유도로 인해 암세포의 세포 독성을 유도하는 것을 알 수 있었다.
3-3. 활성 산소종(ROS) 생성 및 활성 산소에 의한 손상 마커 유전자인 MT1G 와 CHAC1의 유도 분석
JB3 화합물은 활성 산소종(ROS) 생성 및 MT1G 와 CHAC1의 유도를 통해 페롭토시스를 유도한다는 측면에서 소라페닙과 유사하였다(도 17 및 도 18).
이상의 결과는 에라스틴에 높은 민감도를 갖는 폐암 세포에서 JB3의 세포독성이 키나제 신호 억제보다는 페롭토시스 유도에 기인함을 나타낸다.
중간엽 기능이 높고 에라스틴에 더 취약한 폐암 세포인 Calu1 세포는 JB3 처리로 세포 사멸 효과가 극대화되었다(도 19).
Calu1 세포 증식의 시간 의존적 모니터링은 Calu1의 세포 사멸이 JB3 처리 후 약 15시간 후에 발생했지만, 페롭토시스 억제 화합물인 ferrostatin-1을 함께 처리한 경우에는 세포 사멸이 억제되었음을 보여준다(도 20).
이 결과로부터 본 발명의 화합물 JB3에 의한 항암 기전이 페롭토시스에 의한 결과임을 알 수 있다. 또한 이 결과는 JB3 처리에 의한 Calu1의 세포 사멸이 ROS의 지속적인 축적으로 인해 기존 GSH의 고갈로 인해 발생할 수 있음을 의미한다.
<실험예 4> 래트에서의 약동력학적 분석
래트에서 정맥내 주사(1mg/kg, i.v) 및 경구 투여(5mg/kg, p.o) 후 JB3의 약동학 매개변수를 계산하였다. 그 결과는 아래 표와 같다.
JB3는 정맥 및 경구 투여 후 각각 1.65시간 및 6.05시간의 말단 t1/2를 나타내었다. 경구 투여 후 더 긴 t1/2는 위장관에서 JB3의 침전의 결과일 수 있는데, 그 이유는 용해 및 흡수가 느려지기 때문이다. JB3의 평균 Tmax 값은 경구 투여 후 약 1.75시간 후에 측정되었으며, 이는 경구 투여 후 빠른 흡수를 나타낸다. JB3의 계산된 경구 생체이용률(F)이 24%라는 점 또한 경구 제형으로의 적용 가능성을 긍정적으로 보여주는 결과이다.
<실험예 5> In-vivo 항암 효과
Calu1 세포의 이종 이식에 의해 종양이 유도된 마우스에 JB3을 3주 동안 매일 1회 100mg/kg (mpk) p.o 경구투여하고 종양의 크기를 관찰했다. 마우스에 JB3를 3주 동안 경구 투여한 마우스는 대조군에 비하여 종양 부피와 무게가 현저하게 감소하였다. 또한 경구 투여 기간 동안 체중의 비정상적인 감소가 발생하지 않았다(도 21 및 도 22).
나아가, 면역 블랏팅으로 페롭토시스에 의한 지질과산화 (lipid peroxidation)에 의해서 형성되는 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE)의 발현량을 측정하여, 종양 조직에서의 페롭토시스를 평가하였다. 평가 결과 JB3 처리를 한 모든 종양 조직에서 4-HNE 발현의 증가가 나타났다(도 23).
상기의 결과는 경구 투여된 JB3가 종양 세포의 페롭토시스를 유도하여 종양 성장을 효과적으로 억제한다는 사실을 시사한다.

Claims (13)

  1. 하기 화합물 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    1-(4-(4-클로로-2-메톡시페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아;
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-메톡시페녹시)페닐)우레아;
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)페녹시)페닐)우레아;
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(4-클로로페녹시)-페닐)우레아;
    1-(4-(3-(터트-부틸)페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아; 및
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-히드록시에틸)페녹시)페닐)우레아.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 1-(4-(4-클로로-2-메톡시페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아는 R1=OCH3, R2=H, R3=Cl인 하기 화학식 I으로부터 유래한 것이고;
    상기 1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-메톡시 페녹시)페닐)우레아는 R1=H, R2=OCH3, R3=H인 하기 화학식 I으로부터 유래한 것이고;
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)페녹시)페닐)우레아는 R1=H, R2=CF3, R3=H인 하기 화학식 I으로부터 유래한 것이고;
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(4-클로로페녹시)-페닐)우레아는 R1=H, R2=H, R3=Cl인 하기 화학식 I으로부터 유래한 것이고;
    1-(4-(3-(터트-부틸)페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아는 R1=H, R2=t-Butyl, R3=H인 하기 화학식 I으로부터 유래한 것이고; 또는
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-히드록시에틸)페녹시)페닐)우레아는 R1=H, R2=CHOHCF3, R3=H인 하기 화학식 I으로부터 유래한 것인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.


    화학식 I
  3. 제1항에 있어서,
    1-(4-(4-클로로-2-메톡시페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아는 R1=OCH3, R2=H, R3=Cl인 하기 화학식 II를 출발물질로 하고;
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-메톡시 페녹시)페닐)우레아는 R1=H, R2=OCH3, R3=H인 하기 화학식 II를 출발물질로 하고;
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)페녹시)페닐)우레아는 R1=H, R2=CF3, R3=H인 하기 화학식 II를 출발물질로 하고;
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(4-클로로페녹시)-페닐)우레아는 R1=H, R2=H, R3=Cl인 하기 화학식 II를 출발물질로 하고; 또는
    1-(4-(3-(터트-부틸)페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아는 R1=H, R2=t-Butyl, R3=H인 하기 화학식 II를 출발물질로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.


    화학식 II
  4. 제1항에 있어서,
    상기 1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-히드록시에틸)페녹시)페닐)우레아는 하기 화학식 III를 출발물질로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.


    화학식 III
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    1-(4-(4-클로로-2-메톡시페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아;
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(트리플루오로메틸)페녹시)페닐)우레아; 및
    1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-(4-(3-(2,2,2-트리플루오로-1-히드록시에틸)페녹시)페닐)우레아.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 1-(4-(4-클로로-2-메톡시페녹시)페닐)-3-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)우레아인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 소세포폐암, 식도암, 담낭암, 난소암, 췌장암, 위암, 자궁 경부암, 갑상선암, 전립선암, 또는 피부암인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 경구 투여되는 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 화합물은 페롭토시스를 유도하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 화합물은 ERK 신호전달을 상향조절하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 화합물은 활성 산소종(ROS) 생성을 증가시키는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 화합물은 MT1G 와 CHAC1의 발현을 상향조절하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

KR1020240003607A 2023-01-09 2024-01-09 페롭토시스 유도 활성을 갖는 화합물 KR20240111305A (ko)

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