KR20240099473A - 항-il-17/vegf 이중기능성 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

항-il-17/vegf 이중기능성 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 융합 단백질 기술분야에 관한 것으로, 특히 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이며, 상기 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질은 항-IL-17 항체 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하고, 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 VEGFR이며, 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 직접 또는 링커를 통해 항-IL-17 항체에 연결된다. 상기 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질은 IL-17 및 VEGF 신호 전달 경로를 동시에 차단할 수 있고, 상기 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질은 IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환 치료용 약물의 제조에 사용될 수 있다.

Description

항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 및 이의 용도
본 발명은 융합 단백질 기술분야에 관한 것으로, 특히 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
인터루킨 17(IL-17)은 염증성 사이토카인으로, 주로 보조 T 세포(Th17)에서 분비되고, 다른 T 세포 및 비만 세포, 호중구와 같은 선천 면역 세포에서도 소량으로 분비된다. IL-17 패밀리는 6개의 구성원(A, B, C, D, E, F 및 A/F)을 포함하고, 동종 이량체 또는 이종 이량체 형태로 존재한다. IL-17 수용체는 IL-17RA, IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD, IL-17RE 및 SEF를 포함한다. 여기서 동종 이량체 IL-17A, IL-17F 및 이종 이량체 IL-17A/F가 주요 존재 형태이고, IL-17RA 및 IL-17RC에 함께 작용한다. IL-17A는 정상적인 생리학적 상태에서 발현이 극히 낮고, 병리학적 상태에서 IL-17A는 대량으로 분비되며, 세포 표면의 IL-17A에 결합하고 신호 전달 복합체 IL-17R-Act1-TRAF6을 통해 다운스트림 NF-kB, JNK 등 신호 전달 경로를 활성화시켜 염증 반응에 참여하며, 염증 및 자가면역질환(예: 건선, 류마티스 관절염)의 병리학적 반응에서 중요한 작용을 발휘한다. 현재 항-IL-17 단클론 항체 약물은 건선 치료의 중요한 수단이 되었다.
건선은 흔한 재발성 염증성 피부병이다. 세 가지 조직병리학적 요소는 각질형성세포(KC) 과도 증식, 염증 세포 침윤 및 신생 혈관 형성이다. 현재 연구에 따르면, 건선 병소의 진피 유두층에 있는 모세혈관이 확장되고 구불구불하며, 투과성이 증가하고, 혈관 수가 증가하며, 이러한 변화는 주로 모세혈관 후 세정맥에서 발생하는 것으로 여겨진다. 건선에서 발생하는 첫 번째 병리학적 변화는 혈관의 분포와 형성의 변화이다. 건선 환자의 비병소 피부에서도 비정상적으로 확장된 혈관을 흔히 볼 수 있다. 또한 일부 연구에서는 건선 환자의 피부 병소에서 혈관내피성장인자(VEGF)의 mRNA 및 단백질 발현 수준이 정상 인간 피부에서의 수준에 비해 크게 증가하는 것으로 나타났다. 따라서, 항혈관형성 약물은 건선을 치료하는 효과적인 경로가 될 수 있고, IL-17 및 VEGF를 동시에 표적으로 하는 약물은 건선 치료에 부가적인 치료 효과를 가질 가능성이 높다.
이 밖에 여러 연구에서 당뇨망막병증, 맥락막 신생혈관병증(CNV) 및 황반병증에서 IL-17 함량이 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 레이저 유도 CNV 모델에서 항-IL-17 항체 또는 항-VEGF 항체를 주입하면 신생 혈관 형성 및 누출을 크게 줄일 수 있다. 따라서 IL-17 및 VEGF를 동시에 표적으로 하는 약물은 황반병증 등 망막병증의 혁신적인 새로운 요법이 될 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 IL-17 및 VEGF 신호 전달 경로를 동시에 차단할 수 있는 새로운 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 또한 상기 이중기능성 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하고; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공하며; 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하고; 상기 이중기능성 융합 단백질의 제조 방법을 제공하며; 상기 이중기능성 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물을 제공하고; IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환 치료용 약물의 제조에서 상기 이중기능성 융합 단백질 또는 상기 약학적 조성물의 응용을 제공하며; IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환의 치료를 위한 상기 융합 단백질 또는 상기 약학적 조성물의 사용 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기와 같은 기술적 해결수단을 제공한다.
본 발명의 제1 양태는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질을 제공하며, 상기 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질은 항-IL-17 항체 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하고, 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 VEGFR이며; 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 직접 또는 링커를 통해 항-IL-17 항체에 연결된다.
상기 VEGFR은 완전한 수용체 단백질일 수 있고, VEGFR의 세포외 영역일 수도 있다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 VEGFR의 세포외 영역이다. 예시적인 VEGFR의 세포외 영역은 예를 들어 VEGFR1의 D2 도메인 또는 D3 도메인; VEGFR2의 D2 도메인, D3 도메인 또는 D4 도메인; VEGFR3의 D1 도메인, D2 도메인 또는 D3 도메인이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 VEGFR1의 세포외 영역이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 VEGFR1의 D2 도메인이다.
항-IL-17 항체는 상기 항체가 IL-17과 리간드의 결합을 억제하거나 감소시킬 수 있는 한 임의의 항-IL-17 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항-IL-17 항체는 608 항체이다.
구체적으로, 상기 항-IL-17 항체 중쇄는 상보성 결정 영역 HCDR1-3을 포함하되, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시되고, HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 15로 표시되며, HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시되고; 상기 항-IL-17 항체 경쇄는 상보성 결정 영역 LCDR1-3을 포함하되, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 17로 표시되며, LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 18로 표시되고, LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 19로 표시된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항-IL-17 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 20으로 표시되고, 상기 항-IL-17 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 21로 표시된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항-IL-17 항체는 단클론 항체이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항-IL-17 항체는 인간화 항체이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항-IL-17 항체는 IgG 클래스 항체이다. 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG4 유형의 전장 항체이다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항-IL-17 항체 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되고, 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시된다.
다른 실시형태에서, 상기 항-IL-17 항체는 또한 IL-17에 결합하기 위해 608 항체와 경쟁하는 다른 항체일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일부 실시형태에서, 상기 항-IL-17 항체는 또한 서열번호 4로 표시되는 중쇄 아미노산 서열 또는 서열번호 1로 표시되는 경쇄 아미노산 서열에서 하나 이상(구체적으로 1~50개, 1~30개, 1~20개, 1~10개, 1~5개, 또는 1~3개일 수 있음)의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 통해 획득될 수 있고, 치환, 결실 또는 첨가 후의 아미노산 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 1과 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 또는 99% 이상의 유사성을 가질 수 있다.
일 실시형태에서, VEGFR의 D2 도메인은 야생형 또는 돌연변이체일 수 있다.
야생형 VEGFR-D2의 아미노산 서열은 서열번호 34로 표시된다.
상기 VEGFR의 D2 도메인의 돌연변이체는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열에서 하나 이상(구체적으로 1~50개, 1~30개, 1~20개, 1~10개, 1~5개, 또는 1~3개일 수 있음)의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 통해 획득되고, 치환, 결실 또는 첨가 후의 아미노산 서열은 서열번호 34와 80%, 85%, 90%, 93%, 95%, 97%, 또는 99% 이상의 유사성을 가질 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, VEGFR-D2의 돌연변이체는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열의 138번 위치에 돌연변이가 존재한다.
보다 추가적으로, VEGFR-D2의 돌연변이체는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열의 138번 위치에 치환 돌연변이가 존재한다.
보다 추가적으로, VEGFR-D2의 돌연변이체는 138M/A, 138M/P 또는 138M/T로부터 선택된다. 이 세 가지 돌연변이는 예기치 못한 기술적 효과를 가지며, 융합 단백질의 중쇄 파손을 크게 줄이고 가속 열안정성을 향상시킨다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 링커는 (G4S)x와 같은 유연성을 갖는 폴리펩티드 서열일 수 있고, 여기서 x는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 수 있다.
바람직한 일부 실시형태에서, 상기 항-IL-17 항체 IgG 중쇄의 C-말단(도 1A에 도시된 바와 같음) 또는 N-말단(도 1B에 도시된 바와 같음)은 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질과 직렬 연결하여, 이중기능성 융합 단백질의 중쇄를 형성한다.
바람직한 일부 실시형태에서, 상기 항-IL-17 항체 IgG 경쇄의 C-말단(도 1C에 도시된 바와 같음) 또는 경쇄의 N-말단(도 1D에 도시된 바와 같음)은 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질과 직렬 연결하여, 이중기능성 융합 단백질의 경쇄를 형성한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 항-IL-17 항체 중쇄의 C-말단 또는 N-말단은 VEGFR1의 D2 도메인에 연결된다. 바람직한 다른 실시형태에서, 상기 항-IL-17 항체 경쇄의 C-말단 또는 N-말단은 VEGFR1의 D2 도메인에 연결된다.
융합 단백질의 파손을 줄이기 위해, Fc 말단 아미노산을 돌연변이시킬 수 있고, 예를 들어 실시예의 인간 IgG1 유형 Fc 세그먼트 말단의 아미노산 K를 A로 돌연변이시킨다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 이중기능성 융합 단백질의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10으로 표시되고, 상기 이중기능성 융합 단백질의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시된다.
본 발명의 제2 양태는 핵산 분자를 제공하며, 상기 핵산 분자는 상기 융합 단백질을 코딩한다.
바람직한 일 실시형태에서, 융합 단백질 중쇄를 코딩하는 상기 핵산 분자의 핵산 서열은 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 33으로 표시되고, 경쇄를 코딩하는 상기 핵산 분자의 핵산 서열은 서열번호 24, 서열번호 28 또는 서열번호 29로 표시된다.
상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 치환, 결실, 변화, 삽입 또는 추가를 적절하게 도입하여 핵산 분자의 상동체를 제공할 수 있음을 당업자는 알고 있다.
본 발명의 제3 양태는 발현 벡터를 제공하며, 상기 발현 벡터는 상기 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 제4 양태는 숙주 세포를 제공하며, 상기 숙주 세포는 상기 발현 벡터를 포함한다.
본 발명의 제5 양태는 이중기능성 융합 단백질의 제조 방법을 제공하며, 상기 제조 방법은,
발현 조건에서, 상기 숙주 세포를 배양하여, 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질을 발현하는 단계 a); 및
단계 a)에 따른 이중기능성 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계 b)를 포함한다.
본 발명의 제6 양태는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 약학적 조성물은 유효량의 상기 이중기능성 융합 단백질 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 포함한다.
본 발명의 제7 양태는 IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환 치료용 약물의 제조에서 상기 이중기능성 융합 단백질, 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환은 염증성 피부병 또는 안과 질환으로부터 선택된다.
상기 염증성 피부병은 예를 들어 건선이다.
상기 안과 질환은 예를 들어 당뇨망막병증, 맥락막 신생혈관병증(CNV) 또는 황반병증이다.
상기 황반병증은 예를 들어 습성 연령 관련 황반변성이다.
본 발명의 제8 양태는 염증성 피부병 또는 안과 질환 치료용 약물의 제조에서 상기 이중기능성 융합 단백질, 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
상기 염증성 피부병은 예를 들어 건선이다.
상기 안과 질환은 예를 들어 당뇨망막병증, 맥락막 신생혈관병증(CNV) 또는 황반병증이다.
상기 황반병증은 예를 들어 습성 연령 관련 황반변성이다.
본 발명에서 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 및 이의 약학적 조성물이 인간을 비롯한 동물에게 투여될 때 투여 용량은 환자의 연령 및 체중, 질환 특성 및 중증도, 및 투여 경로에 따라 다르고, 동물 실험의 결과 및 다양한 상황을 참조할 수 있으며, 총 투여량은 일정 범위를 초과할 수 없다. 본 분야의 상식에 기반하여 상기 바람직한 조건 각각을 임의로 조합하여 본 발명의 바람직한 구현예를 얻을 수 있다.
본 발명의 제9 양태는 IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 필요한 피험자에게 상기 이중기능성 융합 단백질 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 상기 IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환은 염증성 피부병 또는 안과 질환으로부터 선택된다.
상기 염증성 피부병은 예를 들어 건선이다.
상기 안과 질환은 예를 들어 당뇨망막병증, 맥락막 신생혈관병증(CNV) 또는 황반병증이다.
상기 황반병증은 예를 들어 습성 연령 관련 황반변성이다.
본 발명의 제10 양태는 염증성 피부병 또는 안과 질환의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 필요한 피험자에게 상기 이중기능성 융합 단백질 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
상기 염증성 피부병은 예를 들어 건선이다.
상기 안과 질환은 예를 들어 당뇨망막병증, 맥락막 신생혈관병증(CNV) 또는 황반병증이다.
상기 황반병증은 예를 들어 습성 연령 관련 황반변성이다.
상기 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 및 이의 약학적 조성물이 피험자에게 투여될 때 투여 용량은 치료학적 유효량이어야 한다. 상기 치료학적 유효량은 IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환의 치료에 효과적인 양을 의미한다. 구체적으로, 상기 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 및 이의 약학적 조성물이 피험자에게 투여될 때 투여 용량은 환자의 연령 및 체중, 질환 특성 및 중증도, 및 투여 경로에 따라 다르고, 동물 실험의 결과 및 다양한 상황을 참조할 수 있으며, 총 투여량은 일정 범위를 초과할 수 없다.
본 발명의 제11 양태는 VEGFR1의 D2 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 상기 VEGFR1의 D2 도메인에 돌연변이가 존재한다. 상기 융합 단백질은 개선된 안정성을 갖는다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 융합 단백질은 적어도 하나의 이종 도메인을 포함하고, 상기 이종 도메인은 항체, Fc 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 이는 표적화, 안정성, 독성, 종양 사멸 활성 등을 개선한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 VEGFR1의 D2 도메인은 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열의 138번 위치에 돌연변이가 존재한다.
보다 추가적으로, 상기 VEGFR1의 D2 도메인은 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열의 138번 위치에 치환 돌연변이가 존재한다.
보다 추가적으로, 상기 VEGFR1의 D2 도메인에 138M/A, 138M/P 또는 138M/T 돌연변이가 존재한다.
본 발명의 긍정적인 효과는 다음과 같다: 본 발명의 이중기능성 융합 단백질은 IL-17 및 VEGF에 높은 친화력으로 결합할 수 있고, IL-17에 대한 친화력은 항-IL-17 단클론 항체 양성 대조 608과 비슷하다. 본 발명의 융합 단백질은 IL-17 수용체와 IL-17의 결합을 효과적으로 차단할 수 있고, 차단 능력은 항-IL-17 단클론 항체 양성 대조 608과 비슷하며, VEGF와 수용체 KDR 간의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있고, 차단 능력은 항-VEGF 단클론 항체 양성 대조 Bevacizumab보다 우수하다. 본 발명의 융합 단백질은 세포 수준 약효 실험에서 IL-17에 의해 유도된 IL-6 및 VEGF의 분비를 효과적으로 억제할 수 있다. 동물 수준 약력학 실험에서, 건선 및 맥락막 신생혈관병증을 효과적으로 치료할 수 있다. 요약하면, 본 발명의 융합 단백질은 IL-17 및 VEGF 활성 관련 질환을 치료할 가능성이 있다.
도 1A 내지 도 1D는 본 발명의 상이한 이중기능성 융합 단백질의 구조 모식도를 보여주고, 여기서 밝은 회색 부분은 가변 영역을 나타내고, 어두운 회색 부분은 불변 영역을 나타내며, 텍스처 충진 부분은 VEGFR1의 D2 도메인을 나타낸다.
도 2A 내지 도 2H는 본 발명의 실시예 2에서 제조된 각 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 순도에 대한 HPLC 검출 결과도를 보여주고, 도 2A 내지 도 2H는 순차적으로 17V01, 17V02, 17V03, 17V04, 17V05, 17V06, 17V07, 17V08의 결과이다.
도 3A는 본 발명의 실시예 3에서 IL-17에 대한 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 친화력의 ELISA 검출 차트를 보여준다.
도 3B는 본 발명의 실시예 3에서 VEGF에 대한 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 친화력의 ELISA 검출 차트를 보여준다.
도 4는 본 발명의 실시예 6에서 IL-17A에 의해 유도된 HeLa 세포의 IL-6 분비에 대한 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 차단 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 실시예 7에서 VEGF와 수용체 KDR의 결합에 대한 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 차단 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명의 실시예 10에서 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 투여 후 동물 혈관 누출 면적 변화율을 보여준다.
도 7은 본 발명의 실시예 10에서 3~4 등급 누출 광반의 통계 데이터를 보여준다.
도 8은 본 발명의 실시예 10에서 맥락막 절편 준비 후 IB4 면역 형광 염색 결과를 보여준다.
하기 실시예는 본 발명에 대한 추가 설명이고, 본 발명에 대한 한정으로 이해해서는 안 된다. 실시예는 핵산 분자의 제조 방법, 벡터 및 플라스미드를 구축하기 위한 방법, 단백질을 코딩하는 유전자를 이러한 벡터 및 플라스미드에 삽입시키는 방법 또는 플라스미드를 숙주 세포에 도입하는 방법, 숙주 세포의 배양 방법과 같은 기존 방법 또는 본 분야의 일반적인 방법에 대한 상세한 설명을 포함하지 않는다. 이러한 방법은 당업자에게 알려져 있고, Sambrook,J.,Fritsch,E.F. and Maniais,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold spring Harbor Laboratory Press를 비롯한 많은 간행물에 기재되어 있다.
본 발명에서, 용어 “이중기능성 융합 단백질”은 2개 이상의 동일하거나 상이한 폴리펩티드 서열이 융합되어 획득된 새로운 폴리펩티드 서열을 의미한다. 용어 “융합”은 펩티드 결합이 직접 연결되거나 하나 이상의 연결 펩티드(펩티드 링커)를 통해 효과적으로 연결됨을 의미한다. 용어 “연결 펩티드(링커)”는 2개의 폴리펩티드 서열을 연결할 수 있는 짧은 펩티드를 의미하고, 일반적으로 길이는 2~30개의 아미노산의 펩티드이다.
본 발명에서, 용어 "항체(Antibody, 약어 Ab)"는 전장 항체 및 항체 단편을 포함한다. "전장 항체”는 동일한 구조 특징이 있는 약 150000달톤의 이종사량체 당단백질을 의미하고, 이는 2개의 동일한 경쇄(LC) 및 2개의 동일한 중쇄(HC)로 구성된다. 각각의 중쇄의 일단에는 가변 영역(VH)이 있고, 그 뒤는 불변 영역이다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄의 일단에는 가변 영역(VL)이 있고, 타단에는 불변 영역이 있으며, 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL을 포함하고; 경쇄의 불변 영역은 중쇄 불변 영역의 CH1 도메인과 쌍을 이루고, 경쇄의 가변 영역은 중쇄의 가변 영역과 쌍을 이룬다. 불변 영역은 항체와 항원의 결합에 직접 참여하지 않지만, 항체 의존성 세포 매개 세포 독성 작용(ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)과 같은 상이한 이펙터 기능을 나타낸다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 서브타입을 포함하고; 경쇄 불변 영역은 κ(Kappa) 또는 λ(Lambda)를 포함한다. 항체의 중쇄와 경쇄는 중쇄의 CH1 도메인과 경쇄의 CL 도메인 간의 이황화 결합에 의해 공유적으로 연결되고, 항체의 2개의 중쇄는 힌지 영역 사이에 형성된 폴리펩티드 간 이황화 결합에 의해 공유적으로 연결된다. “항체 단편”은 항체로부터 유래되고 항원 에피토프에 결합하는 능력을 보유하는 기능성 단편을 의미하며, scFv, Fv, Fd, Fab, F(ab')2 또는 F(ab')를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 용어 “단일 클론 항체(단클론 항체)”는 기본적으로 균일한 집단으로부터 획득된 항체를 의미하고, 즉 상기 집단에 포함된 단일 항체는 소수로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 높은 특이성으로 단일 항원 부위를 표적으로 한다. 또한, 일반적인 다클론 항체 제제(일반적으로 상이한 항원 결정 요인을 표적으로 하는 상이한 항체를 갖는 혼합물)와 달리, 각 단클론 항체는 항원의 단일 결정 요인을 표적으로 한다. 이들 특이성 외에도, 단클론 항체의 장점은 다른 면역글로불린에 의한 오염 없이 하이브리도마 배양에 의해 합성될 수 있다는 것이다.
본 발명에서, 용어 “인간화”는 CDR이 비인간 종(바람직하게는, 마우스) 항체로부터 유래되고, 항체 분자의 잔류 부분(프레임워크 영역 및 불변 영역 포함)이 인간 항체로부터 유래됨을 의미한다. 이 밖에, 프레임워크 영역 잔기는 결합 친화성을 유지하기 위해 변경될 수 있다.
본 발명에서, 용어 “항” 및 “결합”은 항체와 그것이 표적으로 삼는 항원 간의 반응과 같이 두 분자 간의 비무작위 결합 반응을 의미한다. 일반적으로, 항체는 약 10-7M 미만, 예를 들어 약 10-8M, 10-9M, 10-10M, 10-11M 미만 또는 그 이하의 평형 해리 상수(KD)로 상기 항원에 결합한다. 용어 “KD”는 항체와 항원 간의 결합 친화력을 설명하기 위해 사용되는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 의미한다. 평형 해리 상수가 작을수록 항체-항원 결합이 더 단단해지고 항체와 항원 간의 친화력이 더 높아진다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, 약어 SPR)을 사용하여 BIACORE 기기에서 항체와 항원의 결합 친화력을 측정하거나 ELISA를 사용하여 항체와 항원 결합의 상대 친화력을 측정한다.
본 발명에서, 용어 “VEGFR1의 D2 도메인”은 VEGFR1의 세포외 영역의 D2 도메인을 의미하고, 상기 돌연변이된 도메인이 VEGF에 대한 결합 활성을 여전히 유지하는 한 천연 서열 및 이의 변이체(적어도 하나의 아미노산 돌연변이 포함)를 포함한다.
본 발명에서, 용어 “발현 벡터”는 플라스미드, 바이러스 벡터(예: 아데노바이러스, 레트로바이러스), 파지, 효모 플라스미드 또는 기타 벡터와 같이 특정 관심 단백질 또는 기타 물질을 발현하기 위한 발현 카세트를 운반하는 벡터를 의미한다. 예를 들어 프로모터, 터미네이터, 인핸서와 같이 적절한 조절 서열을 포함하는 본 분야의 일반적인 발현 벡터는 바이러스 벡터(예: 아데노바이러스, 레트로바이러스), 플라스미드, 파지, 효모 플라스미드 또는 기타 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터는 바람직하게는 pDR1, pcDNA3.4(+), pDHFR 또는 pTT5를 포함한다. 관련 서열을 획득하면 재조합 방법을 통해 관련 서열을 대량으로 획득할 수 있다. 이는 일반적으로 벡터로 클로닝하고 세포로 형질도입한 다음 일반적인 방법을 통해 증식된 숙주 세포에서 분리하여 관련 서열을 획득한다.
본 발명에서, 용어 “숙주 세포”는 벡터가 안정적으로 자가 복제될 수 있고 운반된 핵산 분자가 효과적으로 발현될 수 있는 한 본 분야의 일반적인 다양한 숙주 세포이다. 여기서 상기 숙주 세포는 원핵 발현 세포 및 진핵 발현 세포를 포함하고, 상기 숙주 세포는 바람직하게는 COS, CHO, NS0, sf9, sf21, DH5α, BL21(DE3), TG1, BL21(DE3), 293F 세포 또는 293E 세포로부터 선택된다.
본 발명에서, 용어 “약학적 조성물”은 상기 이중기능성 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 포함한다. 일반적으로, 이러한 물질은 무독성, 불활성 및 약학적으로 허용 가능한 수성 담체 매질에서 조제될 수 있고, 여기서 pH 값은 조제되는 물질의 특성 및 치료할 병증에 따라 다르지만 pH는 일반적으로 약 4~8이고, 바람직하게는 pH는 약 5~7이다. 조제된 약학적 조성물은 일반적인 경로를 통해 투여될 수 있고, 여기서 정맥 주사, 정맥 점적, 피하 주사, 국소 주사, 근육 주사, 종양내 주사, 복강내 주사(예: 복막내), 두개내 주사 또는 강내 주사를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 용어 “약학적 조성물”은 약물 제제로 보다 안정적으로 치료 효과를 발휘하고, 이러한 제제는 본 발명에 공개된 이중기능성 융합 단백질의 아미노산 핵심 서열의 구조 완전성을 보장하는 동시에 단백질의 다관능기를 분해(축합, 탈아미노 또는 산화를 포함하지만 이에 한정되지 않음)로부터 보호할 수 있다.
“약학적으로 허용 가능한”은 약물이 동물 또는 인간에게 적절하게 투여되었을 때 부작용, 알레르기 또는 기타 이상 반응이 일어나지 않음을 의미한다.
“약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제”는 상기 유효 성분과 상용되어야 하고, 즉 일반적인 상황에서 약물의 효과를 크게 감소시키지 않고 상기 유효 성분과 혼합되어야 한다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제로 사용될 수 있는 일부 물질의 구체적인 예는 토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당류; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 메틸셀룰로오스나트륨, 에틸셀룰로오스 및 메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 트라가칸스검 분말; 맥아; 젤라틴; 활석; 스테아르산 및 스테아르산마그네슘과 같은 고체 윤활제; 황산칼슘; 땅콩유, 면실유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 코코아 버터와 같은 식물성 오일; 프로필렌글리콜, 글리세롤, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리올; 알긴산; Tween과 같은 유화제; 라우릴황산나트륨과 같은 습윤제; 착색제; 향미제; 압축 정제, 안정제; 희석제; 부형제; 항산화제; 방부제; 발열원이 없는 물; 등장성 식염수 용액; 인산염 완충액과 같은 완충액이다. 이러한 물질은 필요에 따라 배합의 안정성을 보조하거나 활성 또는 생체이용률을 향상시키는 데 도움이 되거나 경구 투여 시 허용 가능한 식감 또는 냄새를 생성한다.
본 발명의 약학적 조성물은 안전 유효량(예를 들어 0.001~99wt%, 바람직하게는 0.01~90wt%, 보다 바람직하게는 0.1~80wt%)의 본 발명에 따른 이중기능성 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 이러한 담체는 식염수, 완충액, 글루코스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 약물 제제는 투여 방식과 일치해야 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 주사제 형태로 제조될 수 있고, 예를 들어 생리식염수 또는 글루코스 및 기타 보조제를 포함하는 수용액을 사용하여 일반적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 주사제, 용액과 같은 약학적 조성물은 멸균 조건에서 제조되어야 한다. 활성 성분의 투여량은 치료학적 유효량이고, 예를 들어 매일 약 10μg/kg 체중 내지 약 50mg/kg 체중으로 투여된다. 이 밖에, 본 발명의 이중기능성 융합 단백질은 다른 치료제와 함께 사용될 수도 있다.
본 발명에서, 용어 “유효량”은 본 발명의 약학적 조성물을 피험자에게 투여한 후 치료되는 개체에서 원하는 효과를 생성하는 양 또는 용량을 의미하고, 상기 원하는 효과에는 개체 병증의 개선이 포함된다. 용어 “피험자”는 인간, 비인간 영장류 동물, 래트 및 마우스와 같은 포유동물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환의 치료 방법에서, 상기 “치료” 또는 “요법”은 특정 상태의 예방 또는 완화, 특정 상태의 발생 또는 진행 속도 감소, 특정 상태의 진행 위험 감소, 특정 상태와 관련된 증상 진행 예방 또는 지연, 특정 상태와 관련된 증상 감소 또는 종료, 특정 상태의 완전 또는 부분 역전, 특정 상태 치유, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본문에 설명된 방법은 추가로 선행기술의 다른 화합물 또는 다른 치료 방안과 병용할 수 있다. 하기 실시예에 관한 서열에 대응되는 서열번호는 하기 표0에 요약되어 있다.
서열번호 서열 설명 및 구체적인 서열
1 17V01,17V02,17V05,17V06,17V07,17V08 및 608 단클론 항체의 경쇄 아미노산 서열
2 17V01의 중쇄 아미노산 서열
3 17V02의 중쇄 아미노산 서열
4 17V03,17V04 및 608 단클론 항체의 중쇄 아미노산 서열
5 17V03 경쇄 아미노산 서열
6 17V04 경쇄 아미노산 서열
7 17V05 중쇄 아미노산 서열
8 17V06 중쇄 아미노산 서열
9 17V07 중쇄 아미노산 서열
10 17V08 중쇄 아미노산 서열
11 FC-D2 아미노산 서열
12 Bevacizumab 중쇄 아미노산 서열
13 Bevacizumab 경쇄 아미노산 서열
14 608 단클론 항체-HCDR1 아미노산 서열
15 608 단클론 항체-HCDR2 아미노산 서열
16 608 단클론 항체-HCDR3 아미노산 서열
17 608 단클론 항체-LCDR1 아미노산 서열
18 608 단클론 항체-LCDR2 아미노산 서열
19 608 단클론 항체-LCDR3 아미노산 서열
20 608 단클론 항체 중쇄 가변 영역 아미노산 서열
21 608 단클론 항체 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
22 인간 IgG1불변 영역 아미노산 서열
23 인간 kappa 사슬 불변 영역 아미노산 서열
24 17V01,17V02,17V05,17V06,17V07,17V08 및 608 단클론 항체의 경쇄 핵산 서열
25 17V01의 중쇄 핵산 서열
26 17V02의 중쇄 핵산 서열
27 17V03,17V04 및 608 단클론 항체의 중쇄 핵산 서열
28 17V03 경쇄 핵산 서열
29 17V04 경쇄 핵산 서열
30 17V05 중쇄 핵산 서열
31 17V06 중쇄 핵산 서열
32 17V07 중쇄 핵산 서열
33 17V08 중쇄 핵산 서열
34 VEGFR1의 D2 도메인 아미노산 서열
실시예 1. 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 제조
본 발명은 항-IL-17 단클론 항체(608 단클론 항체) IgG 중쇄의 C-말단(도 1A에 도시된 바와 같음) 또는 N-말단(도 1B에 도시된 바와 같음), 및 경쇄의 C-말단(도 1C에 도시된 바와 같음) 및 경쇄의 N-말단(도 1D에 도시된 바와 같음)에서, VEGFR1의 D2 도메인과 직렬 연결하는 방식으로 항체융합 단백질을 구축하였다. 여기서, 608 단클론 항체는 중국 특허출원 201780033670.5의 인간화된 항-인간 IL-17A단클론 항체로부터 유래된다. 여기서, VEGFR1의 D2 도메인(129~227번째 아미노산)은 야생형의 D2 도메인 및 특이적으로 돌연변이된 D2 도메인을 포함하고, 각 융합 단백질의 구조 설명은 표 1에 나타낸 바와 같다.
표 1: 융합 단백질 구조 설명
융합 단백질 D2 도메인 링커 연결 방식
17V01 야생형 (G4S)2 D2 도메인은 항-IL-17 단클론 항체(608 단클론 항체) IgG 중쇄의 C-말단에 연결됨(도 1A)
17V02 야생형 (G4S)4 D2 도메인은 항-IL-17 단클론 항체(608 단클론 항체) IgG 중쇄의 N-말단에 연결됨(도 1B)
17V03 야생형 (G4S)2 D2 도메인은 항-IL-17 단클론 항체(608 단클론 항체) 경쇄의 C-말단에 연결됨(도 1C)
17V04 야생형 (G4S)4 D2 도메인은 항-IL-17 단클론 항체(608 단클론 항체) 경쇄의 N-말단에 연결됨(도 1D)
17V05 138M/A (G4S)2 D2 도메인은 항-IL-17 단클론 항체(608 단클론 항체) IgG 중쇄의 C-말단에 연결됨(도 1A)
17V06 138M/P (G4S)2 D2 도메인은 항-IL-17 단클론 항체(608 단클론 항체) IgG 중쇄의 C-말단에 연결됨(도 1A)
17V07 138M/T (G4S)2 D2 도메인은 항-IL-17 단클론 항체(608 단클론 항체) IgG 중쇄의 C-말단에 연결됨(도 1A)
17V08 138M/A; 139M/A (G4S)2 D2 도메인은 항-IL-17 단클론 항체(608 단클론 항체) IgG 중쇄의 C-말단에 연결됨(도 1A)
실시예 2. 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 제조
항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 중쇄 및 경쇄의 DNA 단편을 각각 pcDNA3.4 벡터(thermofisher에서 구입, A14697)에 서브클로닝하고, 재조합 플라스미드를 추출하여 CHO 세포 및/또는 293F 세포에 공동 형질감염시켰다. 세포 배양 7일 후, 배양액을 고속 원심분리하고, 미세다공성 여과막으로 진공 여과한 후 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼에 로딩하며, 100mM 시트르산, pH3.5 용리액으로 단백질을 단번에 용리하고, 표적 샘플을 회수한 후 투석하여 배지를 PBS로 교체하였다. 정제된 단백질을 HPLC로 검출하였다. 결과는 도 2A 내지 도 2H에 도시된 바와 같으며, 검출 결과에 따르면 융합 단백질 분자 상태는 균일하고, 1차 정제된 단량체 순도는 94.0%~98.9% 사이이다.
실시예 3. 효소면역분석법(ELISA)에 의한 항원에 대한 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 친화력 측정
3.1 ELISA에 의한 IL-17A에 대한 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 친화력 검출
IL-17A 단백질(acrobiosystems에서 구입, Cat.# ILA-H5118)을 100ng/웰로 플레이트를 코팅하고, 4℃에서 밤새 두었다. PBST로 플레이트를 3회 세척하고, 200μl/웰의 차단 용액을 첨가하며, 37℃에서 1시간 동안 방치한 후 나중에 사용하기 위해 PBST로 플레이트를 1회 세척하였다. 희석액으로 항체를 25nM로 희석하고, 4배로 희석하여 8개의 농도 구배를 형성하며, 차단된 ELISA 플레이트에 100μl/웰을 순차적으로 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. PBST로 플레이트를 3회 세척하고, HRP 표지된 염소 항-인간 Fab 항체(abcam에서 구입, Cat.# ab87422)를 첨가한 후, 37℃에서 30분 동안 방치하였다. PBST로 플레이트를 3회 세척한 후, 흡수지에서 잔류 액적을 최대한 두드려 건조시키고, 각 웰에 100μl의 TMB를 첨가한 후, 실온(20±5℃)의 암실에서 5분 동안 방치하며; 각 웰에 정지 용액을 첨가하여 기질 반응을 종료시키고, 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 OD 값을 판독하며, GraphPad Prism6으로 데이터 분석을 수행하고, 그래프를 작성하여 EC50을 계산하였다.
실험 결과는 도 3A에 도시된 바와 같으며, 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질17V01, 17V02, 17V03, 17V04 및 양성 대조 608 단클론 항체는 모두 IL-17A에 효과적으로 결합할 수 있고, EC50(nM) 값은 각각 0.052, 0.062, 0.041, 0.105 및 0.052이며, 친화력이 비슷하다.
3.2 ELISA에 의한 VEGF에 대한 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 친화력 검출
VEGF에 대한 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 결합 능력을 검출하기 위해, VEGF 단백질(acrobiosystems에서 구입, Cat.# VE5-H4210)을 100 ng/웰로 플레이트를 코팅하고, 4℃에서 밤새 두었다. PBST로 플레이트를 3회 세척하고, 200μl/웰의 차단 용액을 첨가하며, 37℃에서 1시간 동안 방치한 후 나중에 사용하기 위해 PBST로 플레이트를 1회 세척하였다. 희석액으로 항체를 25nM로 희석하고, 4배로 희석하여 8개의 농도 구배를 형성하며, 차단된 ELISA 플레이트에 100μl/웰을 순차적으로 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. PBST로 플레이트를 3회 세척하고, HRP 표지된 염소 항-인간 Fab 항체(abcam에서 구입, Cat.# ab87422)를 첨가한 후, 37℃에서 30분 동안 방치하였다. PBST로 플레이트를 3회 세척한 후, 흡수지에서 잔류 액적을 최대한 두드려 건조시키고, 각 웰에 100μl의 TMB를 첨가한 후, 실온(20±5℃)의 암실에서 5분 동안 방치하며; 각 웰에 정지 용액을 첨가하여 기질 반응을 종료시키고, 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 OD 값을 판독하며, GraphPad Prism6으로 데이터 분석을 수행하고, 그래프를 작성하여 EC50을 계산하였다.
실험 결과는 도 3B에 도시된 바와 같으며, 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질17V01, 17V02, 17V03, 17V04, FC-D2는 VEGF에 효과적으로 결합할 수 있고, EC50(nM) 값은 각각 0.379, 0.327, 0.326, 0.371 및 0.397이며, 친화력이 비슷하다. 항-IL-17 단클론 항체 608은 VEGF에 효과적으로 결합할 수 없다.
실시예 4. 항원 IL-17A에 대한 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 친화력 해리 상수 KD의 측정
Biacore 8K 분자 상호작용 분석기를 이용하고, 포획 방법을 사용하여 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질과 항원 IL-17A의 결합 및 해리의 동역학 매개변수를 측정하였다. HBS-EP+ buffer pH7.4(Cat.# BR-1007-69, GE Healthcare)를 희석 완충액으로 사용하고, 17V01, 17V05, 17V06, 608을 각각 1.5μg/ml로 희석하며, IL-17A의 최고 농도를 12.5nM의 6개 농도 구배로 설정하고, 농도 0을 추가 설정하였다. Protein A(Cat.# 29-1275-56, GE Healthcare) 결합 칩을 사용하여 항체를 포획하였다. 그런 다음 IL-17A를 분석물(Analyte)로 사용하여 주입하여, 결합-해리 곡선을 얻고, 6M Guanidine hydrochloride(Cat.# 30095516, Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd에서 구입)을 재생 완충액으로 사용하여 용리한 후 다음 사이클을 반복하며; Biacore 8K Evaluation Software를 이용하여 데이터를 분석하였다.
실험 결과는 표 2에 나타낸 바와 같고, 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질17V01, 17V05, 17V06은 IL-17A에 대한 친화력이 양성 대조 항-IL-17 단클론 항체 608과 비슷하다.
표 2: 친화력 해리 상수
고정상 이동상 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
608 IL-17A 2.44E+06 4.00E-05 1.64E-11
17V01 IL-17A 2.55E+06 4.72E-05 1.85E-11
17V05 IL-17A 2.72E+06 5.00E-05 1.84E-11
17V06 IL-17A 2.28E+06 5.13E-05 2.25E-11
참고: KD 친화력 상수, ka 결합 속도 상수, kd 해리 속도 상수
실시예 5. 항원VEGF에 대한 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 친화력 해리 상수 KD의 측정
Biacore 8K 분자 상호작용 분석기를 이용하고, 포획 방법을 사용하여 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질과 항원 VEGF의 결합 및 해리의 동역학 매개변수를 측정하였다. HBS-EP+ buffer pH7.4를 희석 완충액으로 사용하고, Bevacizumab, 17V01, 17V05, 17V06을 각각 5μg/ml로 희석하며, VEGF의 최고 농도를 10nM의 6개 농도 구배로 설정하고, 농도 0을 추가 설정하였다. Protein A 결합 칩을 사용하여 항체를 포획하였다. VEGF를 분석물(Analyte)로 사용하여 주입하여, 결합-해리 곡선을 얻고, 6 M Guanidine hydrochloride을 재생 완충액으로 사용하여 용리한 후 다음 사이클을 반복하며; Biacore 8K Evaluation Software를 이용하여 데이터를 분석하였다.
실험 결과는 표 3에 나타낸 바와 같고, 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질17V01, 17V05, 17V06은 VEGF에 대한 친화력이 양성 대조 Bevacizumab보다 약간 우수하다.
표 3: 친화력 해리 상수
고정상 이동상 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
Bevacizumab VEGF165 1.27E+06 6.03E-05 4.74E-11
17V01 VEGF165 4.08E+07 7.86E-04 1.93E-11
17V05 VEGF165 3.94E+07 4.32E-04 1.10E-11
17V06 VEGF165 3.79E+07 5.82E-04 1.53E-11
참고: KD 친화력 상수, ka 결합 속도 상수, kd 해리 속도 상수
실시예 6. IL-17A에 의해 유도된 HeLa 세포의 IL-6 분비에 대한 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 차단 작용
IL-17A는 상피 세포를 자극하여 IL-6을 분비할 수 있고, 10ng/ml의 인간 IL-17A를 사용하여 인간 자궁경부암 세포주 HeLa를 자극하며, ELISA를 사용하여 유의한 인간 IL-6 분비를 검출할 수 있고, 상기 시스템을 사용하여 인간 IL-17A에 의해 유도된 HeLa의 인간 IL-6 분비를 차단하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 수준을 검출할 수 있다. 기하급수적 성장 단계까지 배양된 HeLa 세포의 배지를 버리고, 트립신으로 소화하며, 300g에서 5분 동안 원심분리한 후, 재현탁하고, 계수하며, 밀도를 조정한 세포를 96웰 플레이트에 10000개/웰로 접종하고, 각 웰에 100μl를 첨가하였다. 세포 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 시험할 샘플을 배지로 시작 농도 40μg/ml, 3배 희석, 10개 농도로 희석하고, 각 그룹에 2개의 중복 웰을 설정하며, 70μl를 취하여 새로운 96웰 플레이트에 첨가하였다. 배지로 IL-17A를 40ng/ml 농도로 희석하고, 70μl을 취하여 70μl의 희석된 항체가 함유된 96웰 플레이트에 첨가하였다. 상기 용액을 접종된 HeLa 세포에 웰당 100μl씩 첨가하였다. 즉, 항체의 최종 농도는 10μg/ml이고, IL-17A의 최종 농도는 10ng/ml이다. 37℃의 인큐베이터에서 밤새 배양하였다.
래트 항-인간 IL-6 항체를 코팅 용액으로 2.5μg/ml로 희석하고, 100μl/웰을 ELISA 플레이트에 첨가한 후, 4℃에서 밤새 두었다. PBST로 플레이트를 3회 세척하고, 200μl/웰의 차단 용액을 첨가하며, 37℃에서 2시간 동안 방치한 후 나중에 사용하기 위해 PBST로 플레이트를 3회 세척하였다. IL-6 표준 물질의 조제: 배지로 표준 물질을 조제하고, 초기 농도가 50ng/ml가 되도록 하며, 순차적으로 2배 희석하고, 총 12개 구배이며, 코팅된 ELISA 플레이트에 웰당 100μl씩 첨가하고, 각각의 농도에 대해 2개의 중복 웰을 설정하였다. 밤새 배양한 HeLa 세포를 골고루 혼합하고, 100μl를 취하여 DMEM 배지로 2배 희석하여 새로운 96웰 플레이트에 첨가한 후, 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 각 웰의 상청액을 100μl 취하여 ELISA 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1.5시간 동안 배양하였다. PBST로 플레이트를 3회 세척하고, 각 웰에 100μl의 비오틴화된 래트 항-인간 IL-6(작업 농도: 1: 2000)을 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 방치하며, PBST로 플레이트를 3회 세척한 후, 흡수지에서 잔류 액적을 최대한 두드려 건조시켰다. 각 웰에 100μl의 Streptavidin HRP를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 배양하고, PBST로 플레이트를 3회 세척하며, 각 웰에 100μl의 TMB를 첨가하고, 실온(20±5℃)의 암실에서 5분 동안 방치하며; 각 웰에 50μl의 2M H2SO4 정지 용액을 첨가하여 기질 반응을 종료시키고, 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 OD 값을 판독하며, 소프트웨어를 사용하여 각 웰의 IL-6 발현 수준을 계산하였다. GraphPad Prism6으로 데이터 분석을 수행하고, 그래프를 작성하여 IC50을 계산하였다.
실험 결과는 도 4에 도시된 바와 같으며, 결과에 따르면, 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 17V05, 17V06 및 양성 대조 608 단클론 항체는 용량 의존적으로 인간 IL-17A에 의해 유도된 HeLa 세포의 인간 IL-6 분비를 차단하고, IC50은 각각 0.726, 0.778 및 0.877nM이며, 이중기능성 융합 단백질은 608 단클론 항체와 비슷한 생물학적 활성을 나타낸다.
실시예 7. VEGF와 수용체 KDR의 결합을 차단하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 세포 실험
단층 배양된 로그 단계 성장 밀도가 약 80%~90%인 KDR 세포(promega에서 구입, Cat.# GA1082)를 취하고, 성장 배지를 버렸다. DPBS로 1회 세척한 후, Accutase® solution(Sigma, Cat.# A6964)으로 소화하고, 트립신을 중화한 후, 200g에서 5분 동안 원심분리하며, 10% FBS가 함유된 DMEM 배지(Gibco Cat.# 11995)로 세포를 재현탁하고, 트리판블루로 세포를 계수하며, 세포 밀도를 조정하여 40000개/웰로 플레이팅하고, 50μl/웰, 37℃, 5% CO2에 두었다. 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 VEGF를 30ng/ml로 희석하고, VEGF가 함유된 배지로 항체를 3배 희석, 10개 구배로 희석하였다. 희석된 항체를 세포 웰에 웰당 25μl씩(VEGF의 최종 농도는 10ng/ml이고, 항체의 시작 농도는 100nM임) 첨가하고, 37°C에서 6시간 동안 배양한 후, 각 웰에 75μl의 검출 시약 Bio-Glo(promega에서 구입, Cat.# G7940)를 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 배양한 후, SpectraMax i3x로 luminescence을 판독하였다. 모든 데이터는 이중 웰에서 획득된 것이며, 획득된 신호값을 평균화한 후 4-parameter 방법으로 피팅하고, GraphPad Prism6으로 데이터 분석을 수행하였다.
실험 결과는 도 5에 도시된 바와 같으며, 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질및 양성 대조 Bevacizumab은 모두 VEGF와 수용체 KDR 간의 상호작용을 효과적으로 차단할 수 있고, 이중기능성 융합 단백질의 차단 능력이 더 우수하다. 17V01, 17V05, 17V06 및 Bevacizumab의 IC50은 각각 0.072, 0.084, 0.072 및 0.430nM이다.
실시예 8. 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 물리적 안정성
DSC(Differential scanning calorimetry, 시차주사열량측정법)를 이용하여 PBS 완충 시스템에서 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 열안정성을 검출하였다. 샘플을 PBS 완충액으로 교체하고, 샘플 농도를 1mg/ml로 제어하며, MicroCal*Vp-Capillary DSC(Malvern)를 이용하여 검출하였다. 검출 전, 샘플 및 블랭크 완충액을 0.22μm의 여과막으로 여과하였다. 샘플 플레이트의 각 웰에 400μl의 샘플 또는 블랭크 완충액(6세트의 블랭크 완충액 쌍 설정)을 첨가하고, 세척을 위해 마지막 3쌍의 웰 플레이트에 ddH2O를 첨가하였다. 샘플 플레이트에 샘플을 첨가한 후, 플라스틱 소프트 커버로 커버하였다. 스캐닝 온도는 25℃에서 시작하여 100℃에서 종료하고, 스캐닝 속도는 150℃/h이다. 구체적인 결과는 표 4에 나타낸 바와 같으며, 샘플 17V01, 17V05 및 17V06 단백질은 우수한 열안정성을 나타낸다.
표 4: 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 열안정성 검출 데이터
샘플 TmOnse(℃) Tm1(℃)
17V01 66.16 79.54
17V05 66.55 79.58
17V06 65.83 79.52
실시예 9. 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 가속 열안정성에 관한 연구
이전 연구 결과에 따르면, 이중기능성 융합 단백질에 사용된 천연 D2 도메인 서열은 특정 제제 배합의 가속 열안정성 연구에서 소량의 중쇄 파손이 나타난 것을 발견하였다. 138번째 메티오닌을 돌연변이시킴으로써 제제 배합에서 변형된 분자의 가속 열안정성을 조사하였다.
17V01, 17V05, 17V06 및 17V07 단백질을 각각 한외여과하고 PBS 완충액 또는 히스티딘 완충액(L-히스티딘, 0.34mg/ml; 히스티딘 염산염 일수화물, 1.64mg/ml; 아르기닌 염산염, 5mg/ml; α,α-트레할로스 이수화물, 50.0mg/ml; 폴리소르베이트 80, 0.4mg/ml; pH 5.5±0.5)으로 농축하며, 단백질 농도는 5~10mg/mL 사이이고, 37℃에서 4주 동안 배양한 후, 샘플을 취하여 원심분리, 한외여과 및 탈염 처리를 수행하였다. 한외여과 및 탈염 후 100μg의 단백질을 취하고, 500000U/ml 농도의 NEB PNGase F(NEB사에서 구입, Cat.# P0704L) 1 μl를 첨가하며, 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 1M DTT(Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd에서 구입, Cat.# A620058)를 첨가하여 최종 농도가 50mM이 되도록 하고, 37℃에서 30분 동안 배양하며, 50mM의 NH4HCO3으로 샘플을 1.5mg/ml의 단백질 농도로 희석하고, 골고루 혼합한 후 10분 동안 원심분리하였다(회전 속도≥12000rpm). ACQUITY UPLC BEH300 C4 1.7μm 2.1×50mm 크로마토그래피 컬럼으로 분리한 후, 융합 단백질의 중쇄 분자량에 대해 질량 분석법(Waters UPLC-XEVO G2 Q-TOF 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템)으로 분석하였다. 결과는 표 5에 나타낸 바와 같으며, 17V05, 17V06 및 17V07 분자는 천연 D2 도메인 서열을 사용한 17V01 분자에 비해 가속 열안정성이 더 우수하다.
표 5: 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 탈-N-당 중쇄 분자량 통계표
Modification

Sample		 HC 및 HC 단편 분자량 및 함량
HC HC1-464 HC 1-458
샘플 이론 (Da) 시험 (Da) 함량(%) 이론 (Da) 시험 (Da) 함량(%) 이론 (Da) 시험 (Da) 함량(%)
17V01(PBS) 60425.35 60427.36 100 50254.59 N/A N/A N/A N/A N/A
17V01(HIS) 60426.24 96.6 50254.73 3.4
17V05(PBS) 60365.23 60367.23 100 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
17V05(HIS) 60365.87 100
17V06(PBS) 60391.27 60392.34 100 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
17V06(HIS) 60390.97 100
17V07(PBS) 60395.26 60397.93 100 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
실시예 10. 레이저 유도 마우스 맥락막 신생혈관 모델에서 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 억제 작용
레이저 조사로 마우스 안저 맥락막 혈관 신생 및 누출을 유발하여, 혈관 신생 및 누출에 대한 IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 억제 작용을 검증하였다.
졸레틸(25-50mg/kg, i.p.)+자일라진 주사액(5mg/kg, i.p.)을 사용하여 11-12주령 암컷 인간화 IL-17 마우스(Biocytogen에서 구입)를 마취시키고, 532nm 레이저로 양눈의 시신경원판으로부터 시신경 원판1.5~2PD 거리에 있는 시신경유두 주위 등거리의 3개의 점을 광응고시켜 3개의 레이저 점을 태웠다. 레이저 모델링 직후 OCT 검출을 수행하여, Bruch 막이 파손되었는지 여부를 확인하고, 동시에 Bruch 막이 파손되지 않았거나 망막 출혈이 나타나지 않은 광반을 제외하였다. 레이저 모델링 후 6일차(day6)에 FFA 검출을 수행하고 생성된 누출 광반에 따라 그룹화하며, 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 투여군은 17V05(17.49mg/mL) 2μL를 주사하고, 애플리버셉트 투여군은 Aflibercept(10mg/mL) 2μL를 주사하며, 대조군은 PBS 2μL를 주사하고, 양눈에 단일 유리체강내 투여하였다. 투여 7일 후(day 14), FFA 검출을 다시 수행하고, Heidelberg Spectralis 시스템을 사용하여 마우스 생체내 CNV 누출을 관찰하며, FFA 초기 단계(1분 이내)와 후기 단계(3분 이후)에 촬영하고, 형광 누출 면적을 통계하여 형광 누출 상황에 따라 등급화(I~IV 등급)하였다:
I 등급 강한 형광 없음;
II등급 병소 초기 단계 또는 중간 단계에서 고형광을 보이고 누출이 없음;
III등급 병소 초기 단계에서 고형광을 보이고 후기 단계에서 누출이 발생함;
IV등급 병소 초기 단계에서 밝은 고형광을 보이고 후기 단계에서 누출이 발생하고 화상 부위 경계를 초과함.
검사가 완료된 후, 동물은 과량의 이산화탄소를 흡입하고, 경추 탈구로 안락사시킨 후, 실험 동물의 양눈 안구를 채취하여 4% PFA로 실온에서 2시간 동안 고정하며, 사전 냉각된 PBS를 교체한 후, 안구를 절개하고 전안부 조직, 수정체, 유리체 및 망막을 제거하며, RPE/Choroid 함유 절편을 취하여 면역 형광 염색을 수행하고, 지표 isolectin B4, DAPI를 검출하며, 각 병소를 동일한 배율과 형광 설정으로 촬영하고, imageJ로 CNV 면적을 측정하여 통계 분석하였다.
도 6은 투여 전과 비교하여 투여 7일 후 혈관 누출 면적 변화율을 보여주며, 등몰 투여 농도에서 IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질과 애플리버셉트는 모두 누출 면적을 효과적으로 감소시킬 수 있고, IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 약효가 더 우수하다. 도 7은 3~4 등급 누출 광반 통계 데이터를 보여주며, 투여 7일 후(day 14), IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질을 투여한 실험군에서는 3~4 등급 누출 광반 수가 음성 대조군에 비해 유의하게 감소하고, 효과는 양성 대조 애플리버셉트보다 우수하다. 도 8은 맥락막 절편 준비 후 IB4 면역 형광 염색을 보여주고, 투여 7일 후 마우스 안저 신생혈관의 면적을 검출하며, IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질을 투여한 실험군에서는 신생혈관의 면적이 음성 대조군에 비해 유의하게 감소하고, 효과는 양성 대조 애플리버셉트보다 우수하다.
실험 결과를 요약하면, IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질은 마우스 안저 맥락막 혈관 신생 및 누출을 효과적으로 억제할 수 있고, 효과는 양성 대조 애플리버셉트보다 우수하다.
상기 실시예는 본 발명에 공개된 실시형태를 설명하기 위한 것으로 본 발명에 대한 한정으로 이해해서는 안 된다. 이 밖에, 본문에 나열된 다양한 수정 및 본 발명의 방법의 변화는 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않는 전제 하에서 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 다양한 특정 바람직한 실시예를 결합하여 본 발명을 구체적으로 설명하였지만, 본 발명은 이러한 특정 실시예에 한정되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 본 발명을 얻기 위해 상술한 바와 같은 당업자에게 명백한 다양한 수정도 본 발명의 범위 내에 포함되어야 한다.
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Claims (22)

  1. 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질로서,
    항-IL-17 항체 및 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하고, 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 VEGFR이며; 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 직접 또는 링커를 통해 항-IL-17 항체에 연결되는 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 VEGFR의 세포외 영역이고; 바람직하게는, 상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 VEGFR1의 세포외 영역인 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 VEGF에 특이적으로 결합하는 단백질은 VEGFR1의 D2 도메인인 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항-IL-17 항체 중쇄는 상보성 결정 영역 HCDR1-3을 포함하되, HCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 14로 표시되고, HCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 15로 표시되며, HCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시되고; 상기 항-IL-17 항체 경쇄는 상보성 결정 영역 LCDR1-3을 포함하되, LCDR1의 아미노산 서열은 서열번호 17로 표시되며, LCDR2의 아미노산 서열은 서열번호 18로 표시되고, LCDR3의 아미노산 서열은 서열번호 19로 표시되는 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항-IL-17 항체 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 20으로 표시되고, 상기 항-IL-17 항체 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열번호 21로 표시되는 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항-IL-17 항체 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시되고, 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  7. 제3항에 있어서,
    VEGFR1의 D2 도메인은 야생형 또는 돌연변이체이고, 야생형 VEGFR1의 D2 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 34로 표시되는 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    VEGFR1의 D2 도메인의 돌연변이체는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열의 138번 위치의 돌연변이에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  9. 제7항에 있어서,
    VEGFR1의 D2 도메인의 돌연변이체는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열의 138번 위치의 치환 돌연변이에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  10. 제7항에 있어서,
    VEGFR1의 D2 도메인의 돌연변이체는 138M/A, 138M/P 또는 138M/T로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  11. 제3항에 있어서,
    상기 항-IL-17 항체 중쇄의 C-말단 또는 N-말단은 VEGFR1의 D2 도메인에 연결되거나, 또는, 상기 항-IL-17 항체 경쇄의 C-말단 또는 N-말단은 VEGFR1의 D2 도메인에 연결되는 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 이중기능성 융합 단백질의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10으로 표시되고, 상기 이중기능성 융합 단백질의 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 표시되는 것을 특징으로 하는 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질.
  13. 핵산 분자로서,
    상기 핵산 분자는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 중쇄를 코딩하는 상기 핵산 분자의 핵산 서열은 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 33으로 표시되고, 상기 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질 경쇄를 코딩하는 상기 핵산 분자의 핵산 서열은 서열번호 24, 서열번호 28 또는 서열번호 29로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  15. 발현 벡터로서,
    상기 발현 벡터는 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  16. 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포는 제15항에 따른 발현 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질의 제조 방법으로서,
    상기 제조 방법은,
    발현 조건에서, 제16항에 따른 숙주 세포를 배양하여, 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질을 발현하는 단계 a); 및
    단계 a)에 따른 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계 b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  18. 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물은 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환 치료용 약물의 제조에서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질, 제18항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  20. 염증성 피부병 또는 안과 질환 치료용 약물의 제조에서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항-IL-17/VEGF 이중기능성 융합 단백질, 제18항에 따른 약학적 조성물의 용도로서,
    바람직하게는, 상기 염증성 피부병은 건선이며; 및/또는, 상기 안과 질환은 당뇨망막병증, 맥락막 신생혈관병증 또는 황반병증으로부터 선택되는 용도.
  21. IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환의 치료 방법으로서,
    필요한 피험자에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중기능성 융합 단백질 또는 제18항에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 IL-17 및/또는 VEGF 과발현 질환은 염증성 피부병 또는 안과 질환으로부터 선택되고; 바람직하게는, 상기 염증성 피부병은 건선이며; 및/또는, 상기 안과 질환은 당뇨망막병증, 맥락막 신생혈관병증 또는 황반병증으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020247019392A 2021-11-11 2022-11-10 항-il-17/vegf 이중기능성 융합 단백질 및 이의 용도 KR20240099473A (ko)

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