KR20240086785A - 트리코델마 롱기브라키아툼 ｇｙｕｎ－１０７０１ 신균주 및 이의 용도 - Google Patents

트리코델마 롱기브라키아툼 ｇｙｕｎ－１０７０１ 신균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 길항 곰팡이 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) GYUN-10701 균주(수탁번호: KACC93397P), 상기 균주를 포함하는 식물병 방제용 조성물, 상기 식물병 방제용 조성물을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주를 포함하는 식물병 방제제는 식물병원균에 대한 길항작용이 탁월하므로 상품성과 안정성이 높은 식물 및 과실을 재배할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 신균주를 이용할 경우, 종래 화합물 농약 사용에 따른 환경오염의 문제 및 잔류 농약에 의한 인체독성 문제점을 개선할 수 있어, 보다 안전하면서도 친환경적으로 식물 및 과수의 생산량을 증대시킬 수 있어 경제적으로도 매우 유용한 효과가 있다.

Description

트리코델마 롱기브라키아툼 ＧＹＵＮ－１０７０１ 신균주 및 이의 용도{Novel Trichoderma longibrachiatum GYUN-10701 strain and use thereof}
본 발명은 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) GYUN-10701 신균주 및 상기 균주를 이용한 식물병 방제제에 관한 것이다.
식물병을 방제하기 위해 지금까지 세계 각국은 유기 화합물을 기초로 한 농약을 제조하여 사용하여 왔지만 환경오염, 잔류 농약으로 인한 인체 독성 문제, 농약에 내성을 가지는 병원균 출현 등과 같은 문제가 발생하고 있다. 이에 유기 합성 농약을 대신할 식물병 방제 기술로 세균이나 곰팡이 등 미생물에 의한 친환경적 식물병 방제(생물적 방제) 기술이 주목받고 있다.
한편, 고추는 열대성 식물로 우리나라에서 주요 경제작물로 자리 잡고 있고, 조미 채소류 중 가장 넓은 재배면적을 차지하고 있지만, 연작, 소규모 재배, 노동 집약, 긴 재배 작기로 인해 여러 병해 피해가 큰 작물이기도 하다. 우리나라에 보고된 고추 병해는 35종이며, 그 중 역병과 탄저병, 모자이크병 등 약 10종의 병이 매년 고추 재배에 큰 피해를 주는 것으로 보고되었고, 고추탄저병과 역병이 가장 심각한 피해를 일으키고 있다.
특히 고추탄저병균 중 수량과 품질에 직접적인 영향을 미치는 균은 C. acutatum과 C. gloeosporioides로 알려져 있으며 최근에는 C. acutatum이 주로 발생한다고 보고되었다. 주로 미숙한 과실로부터 수학 후까지 발생하며 수침상으로 음푹 들어간 원형 반점으로 나타나고 병반 윗부분에 담황색 내지 핑크색이나 오렌지색의 포자 덩어리 증상을 보이며 식물체 전 생육기에 걸쳐 고추 과실에서 강한 병원성이 보고된 바 있다.
또한 사과 탄저병은 병원성 곰팡이균인 콜레토트리큠(Colletotrichum) 속 균에 의해 발생하는 과수병으로, 과실의 표면에 연한 갈색의 둥근무늬가 생기고 썩게 된다. 사과 탄저병은 1856년 Berkeley에 의해 영국에서 처음 보고되었으며, 탄저병의 원인균인 콜레토트리큠(Colletotrichum) 속 균은 기주범위가 넓은 병원균으로 세계각지에 분포하고 있다. 국내에서 사과 탄저병의 최대발병기는 7월 하순에서 8월 하순까지이며, 9월 중순 이후 감소한다. 그러나 저장 중에도 많이 발생되므로 과수농가에 많은 피해를 주는 치명적인 과수병이다.
현재 이러한 탄저병 방제를 위해 화학농약으로 Dithianon, Carbendazium, Chlorothalonill, Azoxystrobin, Mancozeb 등이 사용되고 있으나, 생태계 파괴와 같은 문제점과 C. acutatum의 약제 내성 등으로 인하여 방제 효과가 미비한 문제점이 있다.
따라서 독성이 약하면서 환경에 해가 없는 생물학적 방제제의 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허 10-1066283
이에 본 발명자들은 식물병원균에 대한 우수한 방제효과를 갖는 신규한 균주인 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주를 동정하였고 이의 미생물 제제로서의 사용 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 길항 곰팡이 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) GYUN-10701 균주(수탁번호: KACC93397P)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주, 상기 균주로부터 생산되는 천연 휘발성 화합물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 식물병 방제용 조성물을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물병 방제방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 길항 곰팡이 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) GYUN-10701 균주(수탁번호: KACC93397P)를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 식물병 병원균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 콜레토트리쿰 아큐타텀(Colletotrichum acutatum), 푸자리움 옥시스포룸 f. sp. 리코펄시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 피톱토라 캡시(Phytopthora capsici)로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주, 상기 균주로부터 생산되는 천연 휘발성 화합물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물병은 고추 탄저병 또는 사과 탄저병일 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명의 식물병 방제용 조성물을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물병 방제방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물병은 고추 탄저병 또는 사과 탄저병일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고추 탄저병 또는 사과 탄저병은 콜레토트리쿰 아큐타텀(Colletotrichum acutatum) 병원성 곰팡이에 의해 유발되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주를 포함하는 식물병 방제제는 식물병원균에 대한 길항작용이 탁월하므로 상품성과 안정성이 높은 식물 및 과실을 재배할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 신균주를 이용할 경우, 종래 화합물 농약 사용에 따른 환경오염의 문제 및 잔류 농약에 의한 인체독성 문제점을 개선할 수 있어, 보다 안전하면서도 친환경적으로 식물 및 과수의 생산량을 증대시킬 수 있어 경제적으로도 매우 유용한 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주와 식물 병원균인 Colletotrichum acutatum, Fusarium oxysproum 및 Phyotophthora capcisi를 각각 대치배양하여 상기 신균주의 식물병원균 억제 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주 유래의 휘발성 유기 화합물에 대한 식물 병원균 억제 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주로부터 분비되는 대사산물에 대한 식물 병원균 억제 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 각 살균제 배지에서의 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주 생장여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 고추 과실을 대상으로 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주 현탁액 처리에 따른 고추 탄저병 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6 및 도 7은 고추 과실을 대상으로 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주 현탁액을 농도별 처리한 군에서의 고추 탄저병 예방 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 고추 밭 포장에서 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주 현탁액 처리에 따른 고추 탄저병 방제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 사과 과실을 대상으로 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주 현탁액 처리에 따른 사과 탄저병 방제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 식물병원균에 대한 우수한 방제효과를 갖는 신규한 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) GYUN-10701 균주를 제공함에 특징이 있다.
본 발명자들은 토양으로부터 식물병원균에 대한 항진균 활성이 우수한 신균주를 동정하였고, 이를 “트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701” 균주로 명명하였으며, 2022년 12월 02일자로 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 수탁하여 수탁번호 KACC93397P를 부여받았다.
본 발명에 따른 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주는 식물병원균에 대한 우수한 항진균 활성을 갖는 특징이 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주를 식물병원성 곰팡이와 대치배양한 결과, 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주에 의해 병원성 곰팡이인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 콜레토트리쿰 아큐타텀(Colletotrichum acutatum), 푸자리움 옥시스포룸 f. sp. 리코펄시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 피톱토라 캡시(Phytopthora capsici)의 균사 생장이 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
또 다른 일실시예에서는, 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주가 휘발성 유기화합물을 생성할 수 있고, 상기 휘발성 유기화합물이 식물병원균에 대한 항균 활성을 나타낼 수 있는지 확인하는 실험을 수행하였는데, 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주를 배양한 배지와 식물 병원성 곰팡이를 배양한 배지를 샌드위치 형태로 위치시키고, 본 발명의 균주에서 생성되는 휘발성 유기화합물에 의해 병원성 곰팡이의 균사 생장을 억제할 수 있는지 관찰한 결과, 병원성 곰팡이의 균사 생장이 본 발명의 균주에서 생성되는 휘발성 유기화합물에 의해 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주의 식물병원성 병원균에 대한 항균활성은 GYUN-10701 신균주 및 상기 신균주로부터 생성되는 휘발성유기화합물 이외에도 상기 신균주로부터 생산되는 대사산물을 포함하는 균주 배양물에서도 나타났다.
본 발명의 다른 일실시예에서는, 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) GYUN-10701 균주를 살균제와 병용처리할 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 GYUN-10701 균주는 살균제인 Pyraclostrobin 및 Kresoxim-methyl 농약 배지에서 생장이 되는 것으로 나타나, 이들 살균제와는 식물병 방제를 위해 혼용(병용)할 수 있음을 알 수 있었다. 한편, 다른 살균제인 Tebuconazole 농약 배지에서는 본 발명의 GYUN-10701 균주가 생장하지 못해 Tebuconazole와는 혼용할 수 없음을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주, 상기 균주로부터 생산되는 천연 휘발성 화합물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 식물병 방제용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 식물병은 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 콜레토트리쿰 아큐타텀(Colletotrichum acutatum), 푸자리움 옥시스포룸 f. sp. 리코펄시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 또는 피톱토라 캡시(Phytopthora capsici)에 의해 발병되는 것일 수 있다.
구체적으로 상기 식물병은 콜레토트리쿰 아큐타텀(Colletotrichum acutatum)에 의해 발병되는 고추 탄저병 또는 사과 탄저병일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 상기 본 발명의 균주 자체, 상기 균주에서 생성된 휘발성 유기화합물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 또는 상기 배양물의 추출물을 모두 유효성분으로 사용할 수 있으며, 상기 배양물은 균주를 포함하는 배양물 또는 상기 균주에서 분비되는 대사물질들을 포함하는 배양액일 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에서는, 본 발명의 신균주 현탁액을 이용하여 고추 탄저병 및 사과 탄저병에 대한 방제 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주 현탁액을 처리한 군에서는 고추 탄저병 및 사과 탄저병의 발병율이 상기 균주 현탁액을 처리하지 않은 군에 비해 훨등하게 감소된 것으로 나타났다.
따라서 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주는 식물병의 발병을 사전에 효과적으로 예방할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명은 본 발명의 식물병 방제용 조성물을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 식물병 방제방법은 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주 또는 상기 균주로부터 생산되는 천연 휘발성 화합물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 또는 상기 배양물의 추출물을 식물부위, 토양 또는 식물의 종자에 처리하여 수행할 수 있다. 상기 처리는 경엽처리 및 관주처리를 단독 수행할 수 있거나 또는 같이 수행할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주의 분리 및 동정
<1-1> 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주의 분리
토양 샘플은 경상북도 안동 지역에서 채집하였다. 뛰어난 근권진균을 선발하기 위해 토양을 멸균한 SDW에 넣어 현탁시킨 후, 희석하고 도말하였다. 토양은 코니칼 튜브에 5g, 멸균수 40ml를 넣어 vortex로 30초 동안 진탕하였다. 샘플을 연속적으로 5회 희석하고 100μL의 샘플을 PDA 플레이트에 분주하였다. 배양용 배지로는 PDA(Potato dextrose broth 12g + Agar 8g)을 사용하였다. 이후 40종의 곰팡이 콜로니를 수집하였고 ITS 영역을 기반으로 미생물 동정을 수행하였다.
<1-2> 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주의 분자생물학적 동정
상기 <1-1>에서 분리된 미생물에 대한 분자생물학적 동정을 위해, 분리된 미생물의 16S rDNA 유전자에 대한 PCR 증폭을 진행하였다. Genomic DNA는 Biofact Genomic DNA prep kit (Biofact co, korea)를 사용하여 제조사의 실험방법에 따라 추출하였다. 추출을 위해 분리 및 배양을 한 균주는 25℃, 7일 동안 PDA배지에서 배양하였다. 배지 위에 형성된 포자 및 균사를 멸균한 메스를 이용하여 막자사발에 옮긴 뒤 액체 질소를 넣고 막자를 이용하여 갈았다. 잘 갈아진 가루는 1.5 ml 튜브에 옮긴 후, GD1 200μl와 Proteinase K (20mg/ml) 5μl를 넣고 vortex로 1분간 섞어주었으며, 워터배스(water bath)에서 65℃의 온도로 10분 동안 넣어주었다. 이후 GD2 200μl를 넣고 vortex를 10초간 진행 후 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리를 하였으며, 원심분리 후 새로운 1.5ml 튜브로 상층액을 옮겨준 후 GB 200μl를 넣어주고 Inverting을 10회 수행하였따. Spin column을 2ml Collection tube에 장착하고 Help B 200μl를 넣고 10,000rpm으로 30초 동안 원심분리를 수행하였으며, 원심분리 후 내려간 용액은 제거를 하고 Inverting까지 한 용액을 넣어주었다. 이후 다시 7,000rpm에 1분동안 원심 분리한 후 Spin column과 Collection tube를 장착해주었다. WB 500μl를 넣고 13,000rpm으로 30초간 원심 분리 후 용액을 제거하는 과정을 2번 반복하고 13,000 rpm에 3분 동안 공회전을 수행하였다. 공회전 후 Spin column을 새로운 1.5ml 튜브에 장착을 하고 DNA Hydration Solution 용액을 30μl 넣어주고 상온에 2분간 놓아둔 후 13,000rpm으로 2분간 원심분리를 2번 반복하여 genomic DNA를 추출하였고 실험에 사용하고 남은 DNA는 -80℃ 저온 냉장고에 보관을 하였다. 균주 분석을 위해 추출한 genomic DNA를 이용하여 ITS(Internal transcribed spacer) 영역에 대해 PCR 분석을 진행하였다. ITS 영역 증폭을 위해 Primer ITS1 (5`- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`)과 Primer ITS 4 (5`- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3` ITS4)을 사용하였다. PCR 반응 조건으로는 95℃에서 1분간 initial denaturation를 한 후, 95℃에서 20초간 denaturation, 52℃에서 40초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension로 35cycle을 실행하고 72℃에서 5분간 extension 후 4℃에서 보관하여 ITS 유전자 염기 서열 분석 시료로 사용을 하였다. 분석한 DNA 염기 서열은 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 BLAST 검색을 통해 기존 DNA 염기 서열과 비교 분석을 진행하였고, ITS(Internal transcribed spacer) 영역에 대한 DNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
그 결과, 본 발명에서 분리한 토양 근권곰팡이는 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum)에 속하는 균주로서, 종래 존재하지 않은 신균주임을 확인하였고, 이를 “트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701”로 명명하였으며, 2022년 12월 2일자로 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 수탁하여 수탁번호 KACC93397P를 부여받았다.
<실시예 2>
본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주에 대한 식물 병원균 억제활성 분석
<2-1> 대치배양을 통한 식물병원균의 억제활성 분석
본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주가 식물 병원균에 길항효과가 있는지 알아보기 위해 대치배양을 수행하였다. 실험에 사용한 식물 병원균은 탄저병균 Colletotrichum acutatum, 시들음병균 Fusarium oxysproum, 역병균 Phyotophthora capcisi을 사용하였다. 대치배양을 진행할 때, 사용한 배지는 PDA 배지이며 한쪽 가장자리에 본 발명의 신균주를 올린 후 반대편 가장자리에 식물병원균들을 올려서 배양하였다. 대치배양은 25℃에 7일동안 수행하였고, 이후 결과를 확인하였다. 식물 병원균의 균사 생장 길이를 측정하였다. 식물 병원균 균사생장 억제 비율은 다음과 같은 방법으로 계산하였다.
억제율 (inhibition rate) (%) = (1- 실험군 균사 생장길이/대조군 균사 생장 길이) x 100
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주를 식물병원균인 Colletotrichum acutatum, Fusarium oxysproum, Phyotophthora capcisi와 각각 대치 배양한 결과, 대조군에 비해 상기 식물병원균은 본 발명의 GYUN-10701 균주에 의해 각각 100%, 53.8% 및 66.1%의 억제 활성을 보이는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주가 식물병원균을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
<2-2> 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주의 휘발성 유기 화합물의 식물병원균 억제활성 분석
본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주를 25℃에서 7일간 배양하고, 5mm 코르크 보러를 이용하여 잘라낸 다음 이를 새로운 PDA 배지 가운데에 치상하였다. 다른 PDA 배지에는 식물 병원균인 Colletotrichum acutatum를 25℃에서 14일간 배양을 한 후 위와 같은 과정을 수행하였다.. Colletotrichum acutatum을 배양한 PDA 배지를 위로 올리고 GYUN-10701을 배양한 PDA 배지는 밑에 놓고 두 PDA 배지를 잘 포개어 파라필름을 이용하여 실링하였다.
다른 방법으로는 GYUN-10701 신균주를 1주일 먼저 배양한 후 밑에 두고 Colletotrichum acutatum을 배양한 배지를 위로 올리고 두 배지를 잘 포개어 파라필름으로 실링하였다. 이 과정을 3 반복으로 진행을 하였으며 25℃ 배양기에서 14일간 관찰하였다.
이를 통해 본 발명의 GYUN-10701 신균주로부터 생성되는 휘발성 유기 화합물에 의한 식물병원균의 억제 활성 여부를 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, GYUN-10701 균주에 대한 휘발성 유기 화합물의 길항활성을 14일 동안 관찰한 결과, C. acutatum에서 상당한 억제 효과를 나타냈다. 특히 GYUN-10701 균주를 1주일 배양하고 C. acutatum를 샌드위치 형태로 배양하였을 때, 상기 병원균에 대해 78.4%의 억제 활성을 보였으며, C. acutatum와 동시 배양을 하였을 경우에는 59.7%의 억제 활성을 보였다.
이러한 결과를 통해 본 발명의 GYUN-10701 신균주 유래의 휘발성 유기 화합물도 식물병원균에 대한 억제 활성이 있음을 알 수 있었다.
<2-3> 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주의 대사산물의 식물병원균 억제활성 분석
나아가 본 발명자들은 본 발명의 신균주에서 분비되는 대사산물에 대해서도 식물병원균에 대한 항진균 활성이 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해, 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주는 7일 배양 후 사용하였고, 식물병원균 Colletotrichum actuatum은 14일 배양 후 사용하였다. PDA 배지에 멸균한 cellophane membrane을 잘 올려주고 그 위에 가운데를 맞추어서 7일 배양한 본 발명의 T. GYUN-10701 균주 절편을 올렸다. 이후 본 발명의 균주를 Cellophane membrane에서 3일간 배양 후 제거하였다. Cellophane membrane을 제거한 PDA 가운데에 맞추어서 이후 식물병원균 Colletotricum acutatum을 올려주었고 14일 동안 배양을 하였으며 위 실험 과정은 3 반복하여 진행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 GYUN-10701 균주의 대사산물 역시 탄저병원균의 생장을 억제하는 활성이 있다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 3>
본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주와 살균제와의 혼용 가능성 분석
본 발명의 GYUN-10701 균주가 살균제 화학농약이 존재하더라도 생장이 가능을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 25℃에서 7일간 배양을 한 GYUN-10701 균주를 5mm 코르크 보러를 이용하여 잘라 준 후 실험에 사용하였다. 살균제 농약 배지를 만들기 위해 PDA배지 (Potato dextrose broth 12g + Agar 8g)를 1L 삼각플라스크에 500ml를 만들고 마그네틱을 넣은 후 autoclave에서 121℃에서 20분간 멸균을 수행하였고, 이후 삼각플라스크가 만져도 뜨겁지 않을 때까지 식혀주도록 한다. 이 후 살균제를 정량으로 계산 후 삼각플라스크에 넣어주었다. 이때 실험에 사용한 살균제는 Pyraclostrobin WG 20%, Tebuconazole WP 25%, 크레속심 메틸 WG 50%를 사용하였고 대조군으로는 PDA 배지에서 살균제 첨가 없이 GYUN-10701 균주를 배양한 군을 사용하였다. 마그네틱 바를 이용하여 계속 섞어주면서 전동 피펫을 이용하여 petri dish에 20ml씩 넣어주었다. Petri dish에 넣은 살균제 농약 배지가 굳을 때까지 말렸고, 가운데 GYUN-10701 균주를 올린 다음, 25℃에서 7일간 배양하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 Pyracolostroin 살균제 처리 군에서는 본 발명의 균주가 생장은 하였으나 대조군에 비해 생장이 느린 것으로 나타났으나, 포자 형성은 대조군과 비슷한 것으로 나타났다. 또한 Tebuconazole 처리군에서는 본 발명의 균주는 생장이 되지 않은 것으로 나타났다. 또한, 크레속심 메틸은 대조군과 유사한 생장 효과가 있는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 신균주는 Tebuconazole 살균제와는 혼용이 불가하지만, Pyracolostroin 또는 크레속심 메틸 살균제 존재하에서도 생장이 가능하여 혼용할 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4>
고추 탄저병 방제효과 확인
<4-1> 고추 탄저병 치료효과 분석
본 발명의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 신균주에 대한 C. acutatum에 의해 유발되는 고추 탄저병 과실의 치료 효과 여부를 분석하였다. 이를 위해 GYUN-10701 균주는 7일 배양 후 사용하였고, C. acutatum은 14일 배양 후 사용하였다. GYUN-10701 균주 현탁액 농도는 107, 106, 105, 104 spores/ml가 되도록 준비하였고, C. acutatum 농도는 105 spores/ml로 희석하여 사용하였다. 고추는 표면 살균 후 실험에 사용하였으며 건조 후 고추 표면에는 일정한 간격으로 5개 점을 찍어주었다. 이후 점을 찍은 고추 표면은 일회용 멸균 수지침을 사용하여 살짝 찔러서 상처를 내었다. 탄저병균 C. acutatum 균 포자현탁액을 상처부위에 10 ul씩 접종하고 24시간 후, GYUN-10701 균주 현탁액을 10ul씩 접종하였다. 접종 후 표면에 현탁액이 건조된 것을 확인하고 25℃ 배양기에 넣고 진행하였으며 총 5번 반복 진행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 고추 탄저병이 발병된 고추 과실의 경우, 본 발명의 GYUN-10701 균주 현탁액을 106 spores/ml로 처리한 군에서는 31% 억제된 것으로 나타났고, GYUN-10701 107 spores/ml에서는 17% 억제된 것으로 나타나, 본 발명의 균주는 고추 탄저병에 대한 치료 효과가 있으나 그 효과가 매우 크지는 않음을 알 수 있었다.
<4-2> 고추 탄저병 예방효과 분석
고추 탄저병에 대한 본 발명의 신균주의 탄저병 예방효과가 있는지를 확인하기 위해, 탄저병 원인균 접종 전, 본 발명의 신균주 현탁액을 농도별로 고추에 접종하고, 이후 탄저병 원인균인 C.acutatum 균을 접종한 다음, 고추 탄저병에 대한 예방 효과 여부를 분석하였다.
그 결과, GYUN-10701 균주 현탁액을 106 spores/ml 농도로 처리한 군의 경우, 고추 탄저병이 96% 억제된 것으로 나타났고, GYUN-10701 균주 현탁액을 107 spores/ml 처리한 군에서는 93% 억제된 것으로 나타났다(도 6).
또한, GYUN-10701 균주 현탁액을 104 spores/ml 농도로 처리한 군의 경우, 고추 탄저병이 97% 억제된 것으로 나타났고, GYUN-10701 균주 현탁액을 105 spores/ml 처리한 군에서는 거의 100% 억제된 것으로 나타났다(도 7).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 신균주 현탁액을 고추에 처리하여 고추 탄저병을 방제할 경우, 발병된 탄저병의 치료 효과보다는 예방효과가 더 우수한 것으로 나타났다.
<4-3> 고추 밭에서의 고추 탄저병 방제효과 분석
고추 밭에서의 탄저병 방제 효과분석은 2022년 안동대학교 고추밭에서 수행하였다. 실험에 사용한 고추(칼라킹)는 5월에 재식하였고, 재식방법으로 고랑 간격 1 m, 재식 간격은 30 cm로 하였으며, 잡초 방제를 위해 이랑에는 부직포를 덮었다. 포장에서는 탄저병을 인위적으로 접종 하지 않았다. 시험구는 난괴법 3반복(20주씩 3반복)으로 진행을 하였다. 양성대조군(chemical control)으로는 Propineb 처리군, Pyraclostrobin 처리군, Chlorothalonil+Pyraclostrobin 처리군, Prochloraz+Tebuconazole 처리군, Dithianon+Metconazole 처리군을 교호살포한 군을 사용하였다. 음성대조군으로는 수돗물을 처리한 군을 사용하였다. 첫 살포는 2022년 6월 25일에 시작하였고, 10일 간격으로 6회 살포하였다. 또한 양성대조군 및 음성대조군은 경엽처리한 하였고, 본 발명의 GYUN-10701 균주는 경엽살포 단독과 경엽살포와 관주처리를 함께 처리하는 총 2가지 방법으로 수행하였다. GYUN-10701 균주 현탁액은 살포시 희석 농도는 105spores/ml로 진행하였다. 발병조사는 마지막 살포 10일 후 고추를 채집하여 처리구 별로 분리한 후, 이병과와 정상과 수를 확인하였다. 이후 탄저병 억제율 및 발병율은 다음과 같은 방법으로 계산하였다.
억제율 (%) = (1-처리구 발병율 / 대조군 발병율)*100
발병율 (%) = (처리구 별 발병과실/처리구 총 수확 과실)*100
분석결과, 상기 표 1 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 대비하여 chemical control은 92.7%의 고추 탄저병 억제효과를 보였고, Pyraclostrobin WG 20% 단독 처리군은 14.2%의 억제효과를 보였으며, 본 발명의 GYUN-10701 균주 현탁액을 경엽처리한 군은 85.2%의 억제효과를 보였고, 경엽과 관주처리를 함께 수행한 군에서는 83.6%의 억제효과를 보였다.
또한 고추밭 포장에서의 탄저병균은 Pyraclostrobin 약제에 대해 저항성이어서 Pyraclostrobin을 살포하여도 탄저병 발병율이 높은 것으로 확인되었다. 그러나 종래 알려진 살균제 처리군(chemical control)은 다양한 계통의 약제를 교호살포하여 방제효과가 우수한 것으로 나타났으며, 본 발명의 GYUN-10701 균주 현탁액을 처리한 군의 경우 chemical control을 처리한 군과 유사하게 고추 탄저병의 방제 효과가 매우 우수한 것으로 나타났다.
<실시예 5>
사과 탄저병 예방효과 확인
또한 본 발명자들은 본 발명의 신균주가 사과 탄저병균에 대해서도 항진균 활성을 가지며 사과 탄저병을 방제할 수 있는 효과가 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해 본 발명의 GYUN-10701 균주는 7일 배양 후 사용하였고, 사과탄저병균인 Colletotrichum siamense는 14일 배양 후 실험에 사용하였다. GYUN-10701 균주 현탁액의 농도는 105 spores/ml로 하였고 C. siamense는 104 spores/ml, 탄저킬은 정량 희석으로 하였다. 사과는 표면 살균 후 실험에 사용하였고, 건조 후 사과 표면에 일정 간격으로 9개 점을 찍어 표기하였다. 이후 상처, 무상처 군으로 나누고 점을 찍은 표면에 멸균 수지침을 사용하여 살짝 찔러주었다. 이때, 무상처 처리는 수지침을 사용하지 않았다. atomizer를 이용해 GYUN-10701과 탄저킬, GYUN-10701 탄저킬 혼용을 먼저 살포하였다. 살포 다음 날 C.siamense를 살포하였다. 살포 후 표면 현탁액이 건조한 다음, 락앤락 통에 넣어 습실처리하고 25℃ 온실에 넣고 관찰을 하였으며 총 3번 반복 진행하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 본 발명의 GYUN-10701 균주 현탁액을 처리한 군은 사과 탄저병의 발생율이 월등하게 감소된 것으로 나타났다.
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 신균주인 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주가 식물병원균에 대한 우수한 항진균 활성을 가지며 식물병원균에 의해 발병되는 식물병 및 과수병을 효과적으로 방제할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
농촌진흥청 국립농업과학원 미생물은행(KACC) KACC93397P 20221202
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Claims (7)

  1. 길항 곰팡이 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) GYUN-10701 균주(수탁번호: KACC93397P).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 식물병 병원균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 콜레토트리쿰 아큐타텀(Colletotrichum acutatum), 푸자리움 옥시스포룸 f. sp. 리코펄시시(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) 및 피톱토라 캡시(Phytopthora capsici)로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 병원균에 대한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 길항 곰팡이 트리코델마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) GYUN-10701 균주(수탁번호: KACC93397P).
  3. 제1항의 트리코델마 롱기브라키아툼 GYUN-10701 균주, 상기 균주로부터 생산되는 천연 휘발성 화합물, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 또는 상기 배양물의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 식물병 방제용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 식물병은 고추 탄저병 또는 사과 탄저병인 것을 특징으로 하는, 식물병 방제용 조성물.
  5. 제3항의 식물병 방제용 조성물을 식물부위, 토양 또는 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물병 방제방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 식물병은 고추 탄저병 또는 사과 탄저병인 것을 특징으로 하는, 식물병 방제방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 고추 탄저병 또는 사과 탄저병은 콜레토트리쿰 아큐타텀(Colletotrichum acutatum) 병원성 곰팡이에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는, 식물병 방제방법.
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