KR20240082366A - 신경계 질환 치료를 위한 직접 전환분화 - Google Patents
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Abstract
비뉴런 세포를 뉴런 세포로 전환분화시키기 위한 표적으로서의 RE1/NRSE 요소; 및 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 있어서 RE1/NRSE 차단제의 용도가 제공되며; 또한 RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합을 감소시키거나 REST의 양 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함하는 비뉴런 세포에서 뉴런 관련 유전자 발현을 조절하기 위해 RE1/NRSE 요소를 차단하는 방법이 제공되며; 또한 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있는 RE1/NRSE 요소 차단제, 특히 내인성 RE1/NRSE 결합 단백질의 결합 도메인 및 이의 변이체가 제공된다.
Description
본 개시 내용은 생물의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 비뉴런 세포를 뉴런 세포로 전환분화시키기 위한 표적으로서의 RE1/NRSE 요소 및 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 있어서 RE1/NRSE 차단제의 용도에 관한 것이다.
억제 요소 1/뉴런 제한성 침묵 요소(repressor element 1/neuron-restrictive silencer element, RE1/NRSE)는 길이가 약 21bp(20-23bp 부동함)인 특정 DNA 서열로, 주로 REST(RE1 침묵 전사 인자(RE1-silencing transcription factor), 이는 뉴런 제한성 침묵 인자(neuron-restrictive silencer factor, NRSF)라고도 칭함)와 결합하여 뉴런의 성장 및 성숙과 관련된 유전자의 발현을 조절한다. RE1은 뉴런의 성숙과 관련된 음성 조절 요소로서, NaV1.2 및 SCG10의 촉진자 5' 단에서 처음 발견되어 이러한 유전자의 발현을 조절한다. 비뉴런 세포에서, RE1 부위는 히스톤 탈아세틸화효소와 메틸라제로 이루어진 침묵 복합체에 결합되고, 뉴런 관련 유전자의 발현을 억제한다. 그러나, 마우스와 인간에는 약 1800개 초과의 RE1 요소가 있어 기존의 일부 기술로는 이를 조절하기가 어렵다. 예를 들어, CRISPR에 의해 매개되는 유전자 조절 및 후성유전학적 변형 기술은 정확성이 매우 높아 특정 유전자의 발현을 정확하게 조절할 수 있지만, 이러한 방식으로 RE1에 의해 조절되는 유전자의 발현을 조절하기는 어렵다.
파킨슨병(PD)은 중뇌의 흑색질에서 도파민 뉴런의 결실을 특징으로 하는 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환이다. 현재 파킨슨병 치료 수단에는 레보도파와 같은 도파민 유사체로 대표되는 소분자 약물이다. 최근 개발된 뇌심부 전극 자극술과 같은 수술적 치료법도 질환의 증상을 어느 정도 개선할 수 있다. 그러나 이러한 방법은 병태를 부분적으로만 완화할 수 있을 뿐 병태의 진행을 방지하거나 도파민 뉴런의 사망을 늦출 수는 없다. 반면에 전환분화 치료 개념의 제안은 도파민 뉴런의 재생에 대하여 희망을 가져다주고 있다. 교세포에서 일부 유전자를 과발현하거나 교세포의 유전자를 편집함으로써 교세포는 도파민 뉴런으로 전환분화되어 결실되거나 사망된 도파민 뉴런을 보충할 수 있도록 한다. 뮐러 교세포(Muller glia, MG)는 망막 조직의 주요한 신경교세포이다. 망막 신경절 세포(RGC)는 망막의 최내층에 위치한 신경세포로서 수상돌기는 주로 양극 세포와 시냅스 연결을 확립하며, 축색은 시신경 머리까지 연장되어 뇌로 연장하는 시신경을 형성한다. 망막 신경절 세포(RGC)의 손상 또는 퇴행성 병변은 영구적 실명의 주요 원인이다. RGC는 망막의 유일한 출력 뉴런이므로 RGC 손상이나 퇴행성 병변은 영구적 실명으로 이어진다. 현재 실명 환자가 시력을 되찾을 수 있는 유일한 방법은 기능성 RGC를 재건하는 것이며, RGC 세포는 재생이 매우 어렵기 때문에 RGC 세포를 재생하는 방법을 탐구하면 RGC 세포 사망으로 인한 많은 실명 환자에게 희망을 가져다줄 수 있다.
광수용체 세포 사망은 실명의 가장 주요한 원인으로 광수용체 세포는 간상세포와 원추세포로 구분되며, 유전성 실명, 후천성 실명 및 노년 퇴행성 실명을 포함하는 광수용체 세포가 사망하는 원인은 다양하다. 망막색소변성 및 선천성 흑내장과 같은 일반적인 유전성 실명은 망막의 광수용체 세포의 사망으로 인하여 발생한다. 시각 시스템에서 광수용체 세포는 광신호를 신경 전기 신호로 전환시키는 유일한 세포로, 광수용체 세포와 하류의 양극 세포 사이에 연결을 구축하여 양극 세포에 신경 전기 신호를 전달하고, 그 다음, 양극 세포는 신경 신호를 하류로 계속 전달하기 위해, RGC 또는 무축색 세포 사이에 연결을 구축한다. 현재, 광수용체 세포 사망으로 인한 실명을 치료할 수 있는 약물은 없다. 유전자치료 기술이 발달함에 따라, 유전적 요인으로 인한 실명에 대한 약물이 점차 개발되고 있으나, 스파크 컴퍼니(Spark Company)에 의해 개발된 RPE65 유전자 기능의 결실을 치료하는 것과 같은 이러한 약물은 광수용체 세포가 죽지 않은 유전성 실명에만 사용될 수 있는 유전자 치료 약물이다. 현재 광수용체 세포가 죽은 실명 환자에게 현재 치료할 수 있는 약물은 없다. 이 분야에서, 사람들은 줄기 세포 치료법과 재생 치료법에 희망을 걸고 있다.
내이 나선 신경절 세포의 사망은 신경성 난청을 유발하는 가장 중요한 원인이다. 내이 나선 신경절 세포는 내이 나선 신경절에 위치하며, 이의 일단은 내이 유모세포에 연결되고, 다른 일단은 중추신경계에 연결되어 청각 신호를 중추신경계에 전달하는 유일한 통로이다. 내이 나선 신경절 세포는 유전자 발현 프로파일이 일반 뉴런과 매우 큰 차이가 있는 아주 특별한 종류의 뉴런이다. 유전성이든 비유전성이든 관계없이 내이 나선 신경절 세포의 사망으로 인한 영구적 난청을 치료할 수 있는 약물은 현재 없다. 내이 나선 신경절의 특별한 구조로 인해 줄기 세포 이식 기술은 아직까지 진전을 이루지 못하였다. 기대를 모으고 있는 다른 기술은 원위치(in situ) 재생 기술이지만, 내이 나선 신경절 세포의 특수성으로 인해 현제 내이 나선 신경절 세포의 유도에 성공하지 못하고 있다. 유전자 변형 마우스를 통해 내이나선 신경절 세포를 유도한 연구가 있지만, 이는 발육 과정에서 생성된 것이며, 내이 나선 신경절 세포의 사망으로 인한 난청은 성인이나 노년층에서 자주 발생하는 데, 성숙한 내이 시스템에서는 내이나선 신경절 세포가 아직 유도된 적이 없다.
이전 연구에서 과학자들은 여러 유전자 및 전사 인자의 발현과 함께 다양한 배지와 소분자를 추가하여 체외 배양 시스템에서 다양한 특수 유형의 뉴런을 성공적으로 유도했지만, 이러한 체외 실험을 체내에 적용하기는 어렵다. 체내의 환경이 복잡하기 때문에 체외에서 스크리닝된 다양한 인자들이 체내에서는 체외 실험에서와 같은 기능을 발휘하지 못하며, 따라서 뉴런 전환분화를 유도하기 위해 체외에서 스크리닝된 많은 인자는, 체내에서 교세포의 전환분화를 유도하지 못하였다. 현재 체내에서 뉴런을 성공적으로 유도할 수 있는 인자는 주로 AscL1, NgN2, NeuroD1 및 PTBP1이다. AscL1, NgN2 및 NeuroD1은 체내에서 뉴런을 유도할 수 있지만, 일반적인 글루타메이트성 뉴런만 생성할 수 있으며, 도파민 뉴런, 5-세로토닌 뉴런, 콜린성 뉴런, 망막 신경절 세포, 광수용체 세포 및 와우 나선 신경절 세포와 같은 특별한 기능을 가진 뉴런을 유도할 수 없다. 현재 보고된 전환분화 인자에서 Ptbp1만이 체내에서 교세포가 특별한 유형의 뉴런으로 전환분화하도록 유도할 수 있으며, 이의 유형은 도파민 뉴런이다. 교세포에서 AscL1+NeuroD1+Lmx1b+miR218이라는 네 가지 인자의 동시 과발현은 교세포로부터 도파민 뉴런의 생성을 촉진할 수 있다는 보고가 있지만 그 효율이 매우 낮으며 여러 AAV와의 공동 감염으로 인해 제한되어 실제 약물 개발에서는 거의 구현될 수 없다. 이는 또한 체내에서 특별한 유형의 뉴런을 재생하는 것이 매우 어려운 도전적인 연구이지만, 특별한 유형의 뉴런을 재생하는 것이 매우 중요한 의미를 갖는 것을 보여준다. 이러한 특수한 유형의 뉴런은 인간이 직면하는 질환에서 흔히 가장 주요한 세포 유형이다. 전술된 바와 같이, 이러한 세포는 많은 질환과 관련되어 있으며, 현재로서는 줄기 세포 이식 기술이나 전환분화 재생 기술을 막론하고 모두 획기적인 발전이 이루어지지 않았다. 따라서, 본 분야에서는 도파민 뉴런, 망막 신경절 세포, 광수용체 세포 또는 기타 기능성 신경을 재생할 수 있는 방법을 개발하는 것이 시급한 과제이다.
일 측면에서, 본 출원은 RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합을 감소시키거나 REST의 양 또는 활성을 감소시키는 단계를 포함하는, 비뉴런 세포에서 뉴런 관련 유전자 발현을 조절하기 위해 RE1/NRSE 요소를 차단하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, REST의 양은 유전자 편집, 작은 RNA 간섭 또는 단백질 분해 가속화와 같은 방법을 통해 감소된다.
일부 실시양태에서, 유전자 편집, 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense Oligonucleotide，ASO), 작은 RNA 간섭, miRNA 기술, 소분자 화합물 또는 단백질 분해 가속화와 같은 방법을 통해 REST 양을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 유전자 편집을 통해 REST의 억제 활성 영역을 제거하거나 REST 활성 억제제를 통해 REST의 활성을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합은 REST 항체와 같은 REST 결합제가 REST에 결합을 통해 차단된다.
일부 실시양태에서, RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합은 RE1/NRSE 요소에 결합하는 RE1/NRSE 요소 차단제를 통해 차단된다.
일부 실시양태에서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 REST의 경쟁적 결합 단백질, 짧은 펩티드 또는 유전자 편집 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 또는 핵산 및 핵산 유사체, 또는 소분자 RE1/NRSE 요소 차단제이다.
일부 실시양태에서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 REST 변이체 또는 이를 코딩하는 핵산이다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 REST의 N-단 및 C-단 억제 도메인이 결실된 REST의 DNA 결합 도메인이며, 바람직하게는 REST의 155-420번째 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 상기 REST의 DNA 결합 도메인은 활성화 도메인에 융합된다.
일부 실시양태에서, 상기 활성화 도메인은 후성유전학적 변형 단백질 또는 유전자 활성화 조절 요소, 예를 들어 VP64, P65-HSF1, VP16, RTA, Suntag, P300, CBP 또는 이들의 조합으로부터 선택되며, 바람직하게는 VP64 또는 P65-HSF1이다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 및 9의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 2, 4, 6 및 10의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 적어도 70%, 60%, 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 비뉴런 세포는 예를 들어 교세포, 섬유 아세포, 줄기 세포, 신경 전구 세포, 신경 줄기 세포를 포함하며, 여기서 교세포는 성상 교세포, 희돌기 교세포, 뇌실막 세포, 슈반 세포, NG2 세포, 위성 세포, 뮐러 교세포, 내이 신경교세포 또는 이들의 조합, 바람직하게는 성상 교세포, 뮐러 교세포 및 와우 신경교세포로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 교세포는 뇌, 척수, 눈 또는 귀로부터 유래되고, 여기서 뇌 교세포는 선조체, 흑색질, 중뇌 복측 피개 영역, 척수, 시상하부, 등쪽 중뇌 또는 대뇌 피질로부터 유래되며, 바람직하게는 선조체 및 흑색질이다.
일부 실시양태에서, 상기 비뉴런 세포에서 뉴런 관련 유전자의 발현은 상기 비뉴런 세포를 뉴런 세포로 전환분화하도록 조절하며, 여기서 상기 뉴런 세포는 포유동물 뉴런이고, 여기서 바람직하게는 도파민 뉴런, GABA 뉴런, 5-HT 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, ChAT 뉴런, NE 뉴런, 운동 뉴런, 척수 뉴런, 척수 운동 뉴런, 척수 감각 뉴런, 광수용체 세포(간상세포 및 원추세포), 양극 세포, 수평 세포, 무축색 세포, 망막 신경절 세포(RGC), 와우 신경 세포(와우 나선 신경절 세포 및 전정 뉴런), 피라미드 뉴런, 중개 뉴런, 중간 가시 뉴런(MSN), 푸르키네 세포, 과립 세포, 후각 감각 뉴런, 사구체 주위 세포 또는 이들의 조합이고, 보다 바람직하게는 도파민 뉴런, 망막 신경절 세포, 광수용체 세포 및 와우 나선 신경절 세포이다.
일부 실시양태에서, 상기 비뉴런 세포 및/또는 뉴런 세포는 예를 들어 인간, 비인간 영장류 동물, 래트 및 마우스로부터 유래되며, 바람직하게는 인간이다.
다른 일 측면에서, 본 출원은 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 RE1/NRSE 요소 차단제의 용도를 제공하며, 여기서 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 RE1/NRSE 요소에 대한 RE1/NRSE 내인성 결합 인자의 결합을 감소시키며, 여기서 상기 RE1/NRSE 내인성 결합 인자는 REST와 같은 아연 핑거 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 RE1/NRSE 요소에 결합함으로써 RE1/NRSE 요소에 대한 RE1/NRSE 내인성 결합 인자의 결합을 차단하게 된다.
일부 실시양태에서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 REST의 경쟁적 결합 단백질, 짧은 펩티드 또는 유전자 편집 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산, 또는 핵산 및 핵산 유사체, 또는 소분자 RE1/NRSE 요소 차단제이다.
일부 실시양태에서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 REST 변이체 또는 이를 코딩하는 핵산이다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 REST의 N-단 및 C-단 억제 도메인이 결실된 REST의 DNA 결합 도메인이며, 바람직하게는 REST의 155-420번째 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 상기 REST의 DNA 결합 도메인은 활성화 도메인에 융합된다.
일부 실시양태에서, 상기 활성화 도메인은 후성유전학적 변형 단백질 또는 유전자 활성화 조절 요소, 예를 들어 VP64, P65-HSF1, VP16, RTA, Suntag, P300, CBP 또는 이들의 조합으로부터 선택되며, 바람직하게는 VP64 또는 P65-HSF1이다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 및 9의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 2, 4, 6 및 10의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 적어도 70%, 60%, 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 상기 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중(중풍), 정신분열증, 헌팅턴병, 우울증, 운동 뉴런 질환, 근위축성 측삭 경화증, 척수성 근위축증, 픽병, 수면 장애, 간질, 운동실조, RGC 세포 사망으로 인한 시력 장애, 녹내장, 연령 관련 RGC 병변, 시신경 손상, 망막 허혈 또는 출혈, 레버(Leber) 유전성 시신경 병변, 손상 또는 퇴행성 병변으로 인한 광수용체 세포 변성 또는 사망, 황반 변성, 망막색소변성, 당뇨병 관련 실명, 야맹증, 색맹, 유전성 실명, 선천성 흑내장, 나선 신경절 세포 사망으로 인한 난청 또는 청력 저하, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
다른 일 측면에서, 본 출원은 REST 변이체 또는 이를 코딩하는 핵산인 RE1/NRSE 요소 차단제, 또는 인공적으로 설계된 REST의 DNA 결합 도메인 유사체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 REST의 N-단 및 C-단 억제 도메인이 결실된 REST의 DNA 결합 도메인이며, 바람직하게는 REST의 155-420번째 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 상기 REST의 DNA 결합 도메인은 활성화 도메인에 융합된다.
일부 실시양태에서, 상기 활성화 도메인은 후성유전학적 변형 단백질 또는 유전자 활성화 조절 요소, 예를 들어 VP64, P65-HSF1, VP16, RTA, Suntag, P300, CBP 또는 이들의 조합으로부터 선택되며, 바람직하게는 VP64 또는 P65-HSF1이다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 및 9의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 2, 4, 6 및 10의 뉴클레오티드 서열 또는 이와 적어도 70%, 60%, 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체 또는 REST의 DNA 결합 도메인은 예를 들어 인간, 비인간 영장류 동물, 래트 및 마우스로부터 유래되며, 바람직하게는 인간이다.
다른 일 측면에서, 본 출원은 상기 차단제를 포함하는 약학적 조성물 또는 키트 또는 시약 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물 또는 키트 또는 시약 키트는 주사, 두개내 투약, 안구내 투약, 귀 내 투약, 흡입, 비경구 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피내 투여, 표피 투여 또는 경구 투여용으로 배합된다.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물 또는 키트 또는 시약 키트는 또한 상기 RE1/NRSE 요소 차단제를 전달하기 위한 담체 또는 운반체를 포함하며, 여기서 상기 담체 또는 운반체는 바이러스 벡터, 리포솜, 나노 입자, 엑소솜 및 바이러스 유사 입자이고, 여기서 바이러스 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터(rAAV), 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, SV40 바이러스 벡터 및 이들의 조합을 포함하며, 여기서, 바람직하게는 AAV 및 rAAV이다.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물 또는 키트 또는 시약 키트는 REST 변이체를 발현하기 위한 발현 벡터를 포함하며, 여기서 상기 발현 벡터는 REST 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이의 발현을 일으키는 촉진자와 작동 가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물 또는 키트 또는 시약 키트는 i) 선조체에 있는 교세포; ii) 대뇌 흑색질에 있는 교세포; iii) 망막에 있는 교세포; iv) 내이에 있는 교세포; v) 척수에 있는 교세포; vi) 전두엽 피질에 있는 교세포; vii) 운동 피질에 있는 교세포; viii) 시상하부에 있는 교세포; 및 ix) 복측 피개 영역(VTA)에 있는 교세포 중 적어도 하나에 국소 투여된다.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물 또는 키트 또는 시약 키트는 또한 i) 하나 이상의 도파민 뉴런 관련 인자, 또는 ii) 뮐러 교세포에서 발현하기 위한, 하나 이상의 망막 신경절 세포 관련 인자를 포함하고,
1) 여기서 상기 하나 이상의 도파민 뉴런 관련 인자는 FoxA2, Lmx1a, Lmx1b, Nurr1, Pbx1a, Pitx3, Gata2, Gata3, FGF8, BMP, En1, En2, PET1, Pax 패밀리 단백질(Pax3, Pax6 등), SHH, Wnt 패밀리 단백질 및 TGF- 패밀리 단백질 또는 이들의 조합으로부터 선택되며;
2) 여기서 상기 하나 이상의 망막 신경절 세포 관련 인자는 β-catenin, Oct4, Sox2, Klf4, Crx, aCamKII, Brn3a, Brn3b, Brn3C, Math5, Otx2, Ngn2, Ngn1, AscL1, miRNA9, miRNA-124, Nr2e3 및 Nrl 등 인자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 촉진자는 교세포 특이적 촉진자 또는 뮐러 교세포(MG) 특이적 촉진자이고, 상기 교세포 특이적 촉진자는 GFAP 촉진자, ALDH1L1 촉진자, EAAT1/GLAST 촉진자, 글루타민 합성효소 촉진자, S100 촉진자, EAAT2/GLT-1 촉진자 및 Rlbp1 촉진자로부터 선택되며, 바람직하게는 GFAP 촉진자이다.
일부 실시양태에서, 교세포의 전환분화 효율은 적어도 1%, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%이다.
도 1. 내인성 아연 핑거 단백질 및 억제 시스템의 디자인 개략도. (A) REST 단백질 구조를 나타내는 개략도로서, REST 단백질은 N-단 억제 도메인 및 RE1과의 결합을 담당하는 중간 DNA 결합 구조 및 C-단 전사 억제 도메인을 포함한다. RZFD-V1은 RZFD의 첫 번째 디자인을 나타내며, RE1 DNA와의 결합을 담당하는 인간 REST 단백질 중간에 8개의 아연 핑거 도메인(RZFD, REST Zinc Figure 도메인)이 포함된다. RZFD-V2 및 RZFD-V3의 두 가지 디자인에서, RZFD를 각각 RZFD-V2 및 RZFD-V3으로 명명된 두 가지 상이한 활성화 인자에 융합하였다. RZFD-V2는 RZFD의 C-말단에 VP64를 융합하여 얻어지며, RZFD-V3은 하나의 P65 및 하나의 HSF1의 전사 활성화 도메인에 융합된 RZFD의 C-말단으로 이루어진다. RZFD는 RZFDmax를 코돈 최적화하여, 포유동물에서 이의 발현을 증가시키는 동시에, RZFD의 양단에 BPNLS 서열을 추가하여 핵에 진입하여 기능을 발휘하는 효율을 증강시킨다. (B) 교세포에서 REST는 RE1에 결합하고, REST의 C-단과 N-단은 각각 일부 전사 억제 인자를 모집하여, RE1에 의해 조절되는 뉴런 관련 유전자가 발현되지 못하게 한다. (C) RZFD-V1이 교세포에서 발현된 후, RZFD가 RE1에 경쟁적으로 결합하여 REST와 RE1의 결합을 방지함으로써, REST 침묵 복합체를 형성할 수 없어 RE1에 의해 조절되는 유전자를 억제할 수 없고, 여기서 뉴런 관련 유전자 발현이 포함되어 있다고 구상한다. (D) RZFD-V2는 RZFD 도메인을 통해 RE1에 경쟁적으로 결합하여, REST/NRSF와 RE1의 결합을 방지하는 동시에, 이의 VP64 도메인은 전사 활성화 인자를 모집하고, RE1에 의해 조절되는 뉴런 관련 유전자의 발현을 증강시킬 수 있다. (E) 교세포에서 뉴런으로 전환분화되는 과정에서, RZFD-V3의 RZFD 도메인 결합은 RE1에 결합하여 REST와 RE1의 결합을 방지하고, RE1에 의해 조절되는 유전자에 대한 REST의 억제를 해제시키는 동시에, P65-HSF1 활성화 도메인은 일부 전사 활성화 인자를 모집하여 RE1에 의해 조절되는 뉴런 관련 유전자의 발현을 추가로 촉진한다. (F) REST의 N-단 및 C-단을 이용하여 개발된 억제 시스템 디자인의 개략도로서, dCas9로 각각 REST의 N-단과 C-단에 연결시키고, dCas9-Krab는 양성 대조 시스템이다. (G 및 H) gRNA의 작용 하에 표적 유전자 발현을 억제하는 dCas9-Krab 또는 dCas9-3xKrab의 개략도이다. (I-K) gRNA의 가이드 하에 표적 유전자 발현을 억제하는 N-dCas9 또는 3xN-dCas9 또는 3xN-dCas9-3xC의 개략도로서, 여기서 N은 REST의 N-단 억제 도메인을 나타내고, C는 REST의 C-단 억제 도메인을 나타낸다. (L) HEK293T 세포를 각 억제 시스템으로 형질감염시켜 Ptbp1 유전자 발현 효율을 억제하고, dCas9-Krab, N-dCas9 및 3xN-dCas9의 억제 효율은 모두 비교적 낮고, dCas9-3xKrab 및 3xN-dCas9-3xC의 억제 효율은 비교적 높다.
도 2. RZFD에 의해 매개되는 교세포를 뉴런으로 전환분화시킴. (A) AAV 벡터 디자인 개략도로서, 벡터 1은 GFAP에 의해 mCherry의 발현을 구동하는 벡터 개략도이고, GFAP는 교세포에서 특이적으로 발현되는 촉진자이며, mCherry는 교세포를 표지하기 위해 사용되는 적색 형광 단백질이다. 벡터 2는 성상 교세포의 특이적 촉진자 GFAP에 의해 RZFD의 발현을 구동하는 인간 RZFD 발현 벡터 개략도이다. (B) 주사 및 샘플링채취 분석을 나타내는 개략도로서, AAV를 주사한 날을 0일째로 기록하였고, 주사 후 2주에 후 샘플링채취하여 교세포가 뉴런으로 전환분화된 결과를 분석하였고, 주사 후 1.5개월에 교세포가 뉴런 및 도파민 뉴런으로 전환분화된 결과를 분석하였다. (C) AAV 바이러스 주사 및 전환분화의 개략도로서, 마우스의 선조체 또는 흑색질에 GFAP-mCherry를 단독으로 주사하거나 GFAP-mCherry와 GFAP-RZFD를 혼합한 AAV를 주사하면, GFAP-mCherry는 교세포를 적색으로 표지하고, GFAP-RZFD는 교세포를 뉴런으로 전환분화시킨다. (D) 야생형 C57 마우스의 선조체에 GFAP-mCherry를 단독으로 주사한 후 성상 교세포는 적색으로 표지되고, mCherry 채널은 GFAP-mCherry로 표지된 성상 교세포를 나타내며, DAPI는 세포핵 염색이고, NeuN은 뉴런 특이적 마커이며, 중첩도는 GFAP-mCherry가 성상 교세포를 특이적으로 표지하지만 뉴런은 표지하지 않음을 나타낸다. (E) GFAP-mCherry와 GFAP-RZFD를 혼합한 AAV를 마우스의 선조체에 주사한 2주 후에 채취하여 분석하고, 대부분의 교세포가 변형되기 시작했으며 소량의 mCherry 양성 세포가 NeuN을 발현하기 시작했지만, TH를 발현하는 세포는 없었고, 여기서, NeuN은 뉴런 특이적 마커이고 TH는 도파민 뉴런 특이적 마커이다. (F) GFAP-mCherry와 GFAP-RZFD를 혼합한 AAV를 마우스의 선조체에 주사한 1.5개월 후에 채취하여 분석하고, 대부분의 mCherry 양성 세포는 뉴런 특이적 마커를 발현하였으며, 일부 세포에는 도파민 특이적 마커 TH의 발현이 있다. 화살표는 mCherry와 TH를 동시에 발현하는 뉴런을 가리킨다. (G) GFAP-mCherry와 GFAP-RZFDmax를 혼합한 AAV를 마우스의 선조체에 주사한 후, 약 1.5개월 후에 채취하여 분석하고, GFAP-mCherry+GFAP-RZFDmax는 마우스의 선조체 성상 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시키는 것을 촉진하며, TH는 도파민 특이적 마커이다. 스케일 바는 50μm이다. (H) TH 양성 세포가 없는 대조 그룹에서, RZFD와 RZFDmax 전환분화에서 생성된 도파민 뉴런 수를 통계하고, RZFDmax 전환분화에서 생성된 도파민 뉴런의 수가 RZFD 그룹에 비해 유의하게 많았다(P=0.0212).
도 3. 6-OHDA로 모델링된 DAT-Cre: Ai9 마우스에서, RZFD가 성상 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시킴. (A) AAV 주사 개략도로서, GFAP-EGFP는 AAV를 표지하고, GFAP 촉진자에 의한 촉진 하에, 성상 교세포를 특이적으로 표지한다. GFAP-EGFP와 GFAP-RZFD를 혼합하여 마우스의 선조체 또는 흑색질에 주사하여 성상 교세포가 도파민 뉴런으로 전환분화되도록 유도한다. (B) AAV를 주사한 대조 그룹을 분석하면, 녹색 형광 신호는 GFAP-EGFP로 특이적으로 표지된 성상 교세포이며, 여전히 전형적인 성상 교세포 형태를 나타내며, 도파민 뉴런을 특이적으로 표지하는 tdTomato 신호와 TH 양성 세포는 없으며, 황색 화살표는 EGFP 양성 성상 교세포를 가리킨다. (C) GFAP-EGFP와 GFAP-RZFD를 혼합하여 주사한 그룹에서는 거의 모든 녹색 형광 표지 세포가 모두 이미 뉴런 형태를 가지고 있었고, 선조체에는 tdTomato 신호가 나타났으며, tdTomato 신호는 TH 신호와 함께 표지되고, 흰색 화살표는 TH 양성 tdTomato 적혈구를 가리킨다. 스케일 바는 50μm이다. (D) 로타로드 시험은, 각 그룹에 8마리 초과의 마우스를 대상으로 GFAP-EGFP를 주사한 대조 그룹과 GFAP-EGFP+GFAP-RZFD를 주사한 치료 그룹의 마우스에 대해 수행하였다. (E) 드럼 실험 시험은, 각 그룹에 8마리 초과의 마우스를 대상으로 앞발이 신체의 같은 쪽 벽에 접촉하는 횟수를 통계한다. (F 및 G) 약물 유도 회전 행동 시험은 각 그룹에 8마리 초과의 마우스를 대상으로 분당 회전 수를 통계하고, 동측 회전 비율을 통계한다.
도 4. RZFD-VP64 또는 RZFD-P65-HSF1에 의해 매개되는 교세포가 뉴런으로 전환분화시킴. (A) GFAP-RZFD-V2 및 GFAP-RZFD-V3 발현 벡터의 디자인 개략도이다. RZFD-V2는 RZFD와 VP64의 융합 단백질로서, 교세포 특이적 촉진자 GFAP에 의해 발현이 구동되며, RZFD-V3은 RZFD 및 P65-HSF1에 의해 활성화 도메인으로 이루어진다. (B) GFAP-RZFD-V2와 GFAP-mCherry를 혼합한 AAV를 주사한 마우스의 선조체 또는 흑색질을 나타내는 개략도로서, 주사 후 1.5개월에 채취하여 분석한다. (C) 선조체에서 GFAP-RZFD-V2에 의해 교세포를 뉴런 또는 도파민 뉴런으로 전환분화시키는 대표도로서, mCherry는 GFAP-mCherry에 의해 표지된 세포이고, TH는 도파민 뉴런 특이적 마커이고, NeuN은 뉴런 특이적 마커이다. 화살표는 mCherry와 TH를 동시에 발현하는 뉴런을 가리킨다. (D) DAT-Cre:Ai9 마우스에 GFAP-RZFD-V3을 주사한 개략도로서, GFAP-RZFD-V3을 DAT-Cre:Ai9 마우스의 선조체 또는 흑색질에 주사하고, 1.5개월 후에 채취하여 분석하고 Dat -Cre는 Dat 내인성 촉진자 뒤에 Cre를 삽입한 것이고, Ai9는 Rosa26-CAG-LSL-tdTomato-WPRE 마우스이며, DAT-Cre: Ai9 마우스의 대뇌에서는 성숙된 도파민 뉴런만이 tdTomato 적색 형광 신호로 표지될 수 있다. (E) GFAP-RZFD-V3을 선조체에 주사한 1.5개월 후에 채취하여 분석한 결과를 나타내는 대표도로서, 적색 형광 신호(tdTomato)는 전환된 성숙한 도파민 뉴런을 나타내고, 녹색 신호는 도파민 뉴런 특이적 마커 TH로 염색된 것이며, 흰색 신호는 뉴런 특이적 마커 NeuN으로 염색된 것이고, Merge도는 tdTomato 적색 신호가 TH 염색된 녹색 신호와 겹친 것을 나타내며, 화살표는 tdTomato와 TH를 동시에 발현하는 뉴런을 가리킨다. 스케일 바는 50μm이다.
도 5. 망막에서 GFAP-RZFD의 과발현에 의해 뮐러 교세포를 광수용체 세포 또는 망막 신경절 세포로 전환분화시킴. (A) 뮐러 교세포를 광수용체 세포 또는 망막 신경절 세포로 전환분화시키기 위해 GFAP-RZFD를 과발현시키는 실험 과정을 나타내는 개략도로서, 여기서 벡터 1은 GFAP-EGFP-2A-Cre이고, Ai9 마우스의 망막에 주사하여 마우스의 뮐러 교세포에 특이적 표지를 하는데 사용될 수 있고, 표지된 세포는 tdTomato에 의해 표지된다. (B) Ai9 마우스 망막에 대조 그룹 바이러스 GFAP-EGFP-2A-Cre를 주사한 후 적색 형광 신호가 뮐러 교세포에서 특이적으로 발현된다. (C) GFAP-RZFD+GFAP-EGFP-2A-Cre를 주사한 그룹에서 흰색 화살표는 전환분화된 광수용체 세포를 가리킨다. 스케일 바는 50μm이다. (D) GFAP-EGFP-2A-Cre 대조 그룹 바이러스를 주사한 마우스의 시신경은, 시신경에서 tdTomato로 표지된 축색이 관찰되지 않는다. (E) GFAP-RZFD+GFAP-EGFP-2A-Cre를 주사한 그룹의 마우스의 시신경은, 시신경에서 대량의 tdTomato로 표지된 축색이 관찰된다. (F) NMDA로 모델링된 Ai9 마우스의 망막하에 대조 그룹 바이러스 GFAP-EGFP-2A-Cre를 주사한 후, 적색 형광 신호가 뮐러 교세포에서 특이적으로 발현되었으며, RGC 특이적 단백질 마커 Rbpms와 공동 표지되지 않았으며, 황색 화살표는 Rbpms 양성의 RGC를 가리킨다. (G) GFAP-RZFD 그룹 중 AAV를 주사한 망막에서, 일부 tdTomato 양성 세포가 망막 신경절 세포층에 위치하고 RGC 특이적 단백질 마커 Rbpms와 공동 표지되었음을 발견하고, 흰색 화살표는 tdTomato 및 Rbpms 이중 양성 세포를 가리킨다. (H) 광수용체 세포가 특이적 단백질 마커 Rhodopsin으로 염색된 것으로, 일부 tdTomato 양성 세포는 GFAP-RZFD를 주사한 그룹의 망막 외부 과립층에서 Rhodopsin과 공동 표지된 것을 발견하고, 흰색 화살표는 공동 표지된 세포를 가리킨다. (I) 원추세포가 특이적 단백질 마커 Cone Arrestin(mCAR)으로 염색된 것으로, GFAP-RZFD를 주사한 그룹의 망막 외부 과립층에 소수의 tdTomato 양성 세포가 mCAR과 공동 표지되되고, 흰색 화살표는 공동 표지된 세포를 가리킨다. 스케일 바는 50μm이다. (J) 각 그룹에 3마리 초과의 마우스를 대상으로, 대조 그룹과 시험 그룹의 tdTomato 양성 광수용체 세포의 수를 통계한 것으로, 대조 그룹에는 tdTomato로 표지된 광수용체 세포가 거의 없고, GFAP-RZFD 과발현 그룹에서는 전환분화된 tdTomato 양성 광수용체 세포가 관찰되었다. (K) 각 그룹에 3마리 초과의 마우스를 대상으로, GFAP-EGFP-2A-Cre 대조 그룹 AAV, GFAP-RZFD+GFAP-EGFP-2A-Cre 그룹 AAV를 주사한 마우스의 시신경에서 tdTomato 양성 축색의 수.
도 6. miRNA의 과발현에 의해 도파민 뉴런을 생성할 수는 없지만 마우스의 성상 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음. (A) miRNA를 과발현시킴으로써 성상 교세포를 뉴런으로 전환시키는 것을 구현하는 개략도이다. 벡터 1은 AAV-GFAP-mCherry이고, 벡터 2(AAV-GFAP-miRNA)는 GFAP에 의해 miRNA 과발현을 구동한다. 벡터 1 단독 주사는 대조 그룹이고, 벡터 1+2 혼합 주사는 실험 그룹이다. (B) 도 A의 벡터 2에 해당한다. GFAP 촉진자에 의해 miR-124(miR-124-5p 및 miR-124-3p 포함), miR-9(miR-9-5p 및 miR-9-3p 포함) 또는 miR-9-miR-124를 발현하도록 각각 구동하는 AAV 발현 벡터 개략도이다. (C) GFAP-mCherry를 마우스의 선조체에 주사한 것으로서, mCherry는 교세포에서 특이적으로 발현되고 선조체에는 TH 양성 세포가 없다. (D) 실험 그룹 AAV 바이러스(GFAP-mCherry+GFAP-miR-124)를 마우스의 선조체에 주사한 것으로, 흰색 화살표는 표지된 세포를 가리키고, 중첩도는 적색 형광이 NeuN과 중첩되지 않음을 나타내며, 스케일 바는 50μm이다. (E) GFAP-mCherry+GFAP-miR-9+miR-124를 마우스 선조체에 주사한 것으로, 흰색 화살표는 표지된 세포를 가리키고, 중첩도는 적색 형광이 NeuN과 중첩된 것을 나타내며, 스케일 바는 50μm이다. (F) GFAP-mCherry+GFAP-miR-9+miR-124를 마우스의 선조체에 주사한 것으로, TH는 도파민 뉴런 특이적 마커이고, 흰색 화살표는 표지된 세포를 가리키고, 중첩도는 적색 형광이 TH 신호와 중첩되지 않음을 나타내며, 스케일 바는 50μm이다.
도 7. CasRx가 체외에서 Ctdsp1의 mRNA 발현을 녹다운시킬 수 있음. 체외에서 인간 293T 및 마우스 N2A 세포주에서 CasRx와, Ctdsp1 mRNA를 표적으로 하는 gRNA를 발현시키면 Ctdsp1의 mRNA 녹다운을 구현할 수 있다. Ctdsp1의 정식 명칭은 카르복시 말단 도메인 RNA 폴리머라제 II 폴리펩티드 A 소형 포스파타제 1(Ctdsp1)이다.
도 8. Ctdsp1의 녹다운은 도파민 뉴런을 생성할 수 없지만 마우스의 성상 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음. (A) 유전자 녹다운을 통해 성상 교세포를 뉴런으로 전환시키는 것을 구현하는 개략도이다. 벡터 1(AAV-GFAP-mCherry)은 성상 교세포 특이적 촉진자 GFAP에 의해 형광 단백질 mCherry를 발현하도록 구동되고, 벡터 2(AAV-GFAP-CasRx)는 GFAP에 의해 RNA 편집 단백질 CasRx를 발현하도록 구동된다. 벡터 3(AAV-GFAP-CasRx-Ctdsp1)은 CasRx 및 Ctdsp1을 표적으로 하는 gRNA를 코딩한다. AAV-GFAP-CasRx-Ctdsp1 또는 gRNA를 함유하지 않은 대조 벡터 AAV-GFAP-CasRx 및 AAV-GFAP-mCherry를 C57BL/6 마우스의 선조체 또는 흑색질에 주사한다. 성상 교세포 또는 성상 교세포에 의해 전환된 뉴런을 특이적으로 표지하기 위해 AAV-GFAP-mCherry를 공동 주사한다. 주사 후 1~2개월에 발생된 전환을 조사한다. 벡터 1+2는 대조 그룹이고, 벡터 1+3은 시험 그룹이다. (B) 대조 그룹 AAV(GFAP-mCherry+GFAP-CasRx)를 마우스의 선조체에 주사한 것으로, 주황색 화살표는 표지된 성상 교세포를 가리키고, NeuN은 뉴런 특이적 마커이며, 중첩도는 적색 형광이 NeuN과 중첩되지 않음을 나타내고, 스케일 바는 50μm이다. (C) 실험 그룹 AAV 바이러스(GFAP-mCherry+GFAP-CasRx-Ctdsp1)를 마우스의 선조체에 주사한 후, 교세포가 뉴런으로 전환분화된 결과로서, 흰색 화살표는 적색 형광 신호가 NeuN과 공동 표지된 세포를 가리키며, 스케일 바는 50μm이다.
도 9. Ctdsp1의 녹다운 또는 miRNA의 과발현에 의해 망막 신경절 세포, 광수용체 세포 또는 와우 나선 신경절 세포를 생성할 수 없음. (A) 벡터 디자인 개략도로서, 벡터 1(GFAP-EGFP-2A-Cre)은 성상 교세포 특이적 촉진자 GFAP에 의해 뮐러 교세포에서 Cre를 특이적으로 발현하도록 구동되고, 벡터 2(GFAP-CasRx)는 GFAP에 의해 RNA 편집 단백질 CasRx를 발현하도록 구동된다. 벡터 3(GFAP-CasRx-Ctdsp1)은 CasRx 및 Ctdsp1을 표적으로 하는 gRNA를 코딩한다. (B) GFAP-CasRx-Ctdsp1+GFAP-EGFP-2A-Cre 또는 대조 바이러스 GFAP-CasRx+GFAP-EGFP-2A-Cre를 마우스 망막에 주사한다. 뮐러 교세포를 특이적으로 표기하기 위해 GFAP-EGFP-2A-Cre를 공동 주사한다. 벡터 1+2는 대조 그룹이고, 벡터 1+3은 시험 그룹이다. (C) 망막에서 miRNA를 과발현하는 개략도이다. 벡터 1은 GFAP-EGFP-2A-Cre이고, 벡터 2(GFAP-miRNA)는 GFAP에 의해 miRNA를 과발하도록 구동된다. 벡터 1 단독 주사는 대조 그룹이고, 벡터 1+2 혼합 주사는 실험 그룹이다. (D) 도 C의 벡터 2에 해당한다. GFAP 촉진자에 의해 각각 miR-124, miR-9 또는 miR-9-miR-124를 발현하도록 구동하는 AAV 발현 벡터의구동되는 개략도이다.
도 2. RZFD에 의해 매개되는 교세포를 뉴런으로 전환분화시킴. (A) AAV 벡터 디자인 개략도로서, 벡터 1은 GFAP에 의해 mCherry의 발현을 구동하는 벡터 개략도이고, GFAP는 교세포에서 특이적으로 발현되는 촉진자이며, mCherry는 교세포를 표지하기 위해 사용되는 적색 형광 단백질이다. 벡터 2는 성상 교세포의 특이적 촉진자 GFAP에 의해 RZFD의 발현을 구동하는 인간 RZFD 발현 벡터 개략도이다. (B) 주사 및 샘플링채취 분석을 나타내는 개략도로서, AAV를 주사한 날을 0일째로 기록하였고, 주사 후 2주에 후 샘플링채취하여 교세포가 뉴런으로 전환분화된 결과를 분석하였고, 주사 후 1.5개월에 교세포가 뉴런 및 도파민 뉴런으로 전환분화된 결과를 분석하였다. (C) AAV 바이러스 주사 및 전환분화의 개략도로서, 마우스의 선조체 또는 흑색질에 GFAP-mCherry를 단독으로 주사하거나 GFAP-mCherry와 GFAP-RZFD를 혼합한 AAV를 주사하면, GFAP-mCherry는 교세포를 적색으로 표지하고, GFAP-RZFD는 교세포를 뉴런으로 전환분화시킨다. (D) 야생형 C57 마우스의 선조체에 GFAP-mCherry를 단독으로 주사한 후 성상 교세포는 적색으로 표지되고, mCherry 채널은 GFAP-mCherry로 표지된 성상 교세포를 나타내며, DAPI는 세포핵 염색이고, NeuN은 뉴런 특이적 마커이며, 중첩도는 GFAP-mCherry가 성상 교세포를 특이적으로 표지하지만 뉴런은 표지하지 않음을 나타낸다. (E) GFAP-mCherry와 GFAP-RZFD를 혼합한 AAV를 마우스의 선조체에 주사한 2주 후에 채취하여 분석하고, 대부분의 교세포가 변형되기 시작했으며 소량의 mCherry 양성 세포가 NeuN을 발현하기 시작했지만, TH를 발현하는 세포는 없었고, 여기서, NeuN은 뉴런 특이적 마커이고 TH는 도파민 뉴런 특이적 마커이다. (F) GFAP-mCherry와 GFAP-RZFD를 혼합한 AAV를 마우스의 선조체에 주사한 1.5개월 후에 채취하여 분석하고, 대부분의 mCherry 양성 세포는 뉴런 특이적 마커를 발현하였으며, 일부 세포에는 도파민 특이적 마커 TH의 발현이 있다. 화살표는 mCherry와 TH를 동시에 발현하는 뉴런을 가리킨다. (G) GFAP-mCherry와 GFAP-RZFDmax를 혼합한 AAV를 마우스의 선조체에 주사한 후, 약 1.5개월 후에 채취하여 분석하고, GFAP-mCherry+GFAP-RZFDmax는 마우스의 선조체 성상 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시키는 것을 촉진하며, TH는 도파민 특이적 마커이다. 스케일 바는 50μm이다. (H) TH 양성 세포가 없는 대조 그룹에서, RZFD와 RZFDmax 전환분화에서 생성된 도파민 뉴런 수를 통계하고, RZFDmax 전환분화에서 생성된 도파민 뉴런의 수가 RZFD 그룹에 비해 유의하게 많았다(P=0.0212).
도 3. 6-OHDA로 모델링된 DAT-Cre: Ai9 마우스에서, RZFD가 성상 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시킴. (A) AAV 주사 개략도로서, GFAP-EGFP는 AAV를 표지하고, GFAP 촉진자에 의한 촉진 하에, 성상 교세포를 특이적으로 표지한다. GFAP-EGFP와 GFAP-RZFD를 혼합하여 마우스의 선조체 또는 흑색질에 주사하여 성상 교세포가 도파민 뉴런으로 전환분화되도록 유도한다. (B) AAV를 주사한 대조 그룹을 분석하면, 녹색 형광 신호는 GFAP-EGFP로 특이적으로 표지된 성상 교세포이며, 여전히 전형적인 성상 교세포 형태를 나타내며, 도파민 뉴런을 특이적으로 표지하는 tdTomato 신호와 TH 양성 세포는 없으며, 황색 화살표는 EGFP 양성 성상 교세포를 가리킨다. (C) GFAP-EGFP와 GFAP-RZFD를 혼합하여 주사한 그룹에서는 거의 모든 녹색 형광 표지 세포가 모두 이미 뉴런 형태를 가지고 있었고, 선조체에는 tdTomato 신호가 나타났으며, tdTomato 신호는 TH 신호와 함께 표지되고, 흰색 화살표는 TH 양성 tdTomato 적혈구를 가리킨다. 스케일 바는 50μm이다. (D) 로타로드 시험은, 각 그룹에 8마리 초과의 마우스를 대상으로 GFAP-EGFP를 주사한 대조 그룹과 GFAP-EGFP+GFAP-RZFD를 주사한 치료 그룹의 마우스에 대해 수행하였다. (E) 드럼 실험 시험은, 각 그룹에 8마리 초과의 마우스를 대상으로 앞발이 신체의 같은 쪽 벽에 접촉하는 횟수를 통계한다. (F 및 G) 약물 유도 회전 행동 시험은 각 그룹에 8마리 초과의 마우스를 대상으로 분당 회전 수를 통계하고, 동측 회전 비율을 통계한다.
도 4. RZFD-VP64 또는 RZFD-P65-HSF1에 의해 매개되는 교세포가 뉴런으로 전환분화시킴. (A) GFAP-RZFD-V2 및 GFAP-RZFD-V3 발현 벡터의 디자인 개략도이다. RZFD-V2는 RZFD와 VP64의 융합 단백질로서, 교세포 특이적 촉진자 GFAP에 의해 발현이 구동되며, RZFD-V3은 RZFD 및 P65-HSF1에 의해 활성화 도메인으로 이루어진다. (B) GFAP-RZFD-V2와 GFAP-mCherry를 혼합한 AAV를 주사한 마우스의 선조체 또는 흑색질을 나타내는 개략도로서, 주사 후 1.5개월에 채취하여 분석한다. (C) 선조체에서 GFAP-RZFD-V2에 의해 교세포를 뉴런 또는 도파민 뉴런으로 전환분화시키는 대표도로서, mCherry는 GFAP-mCherry에 의해 표지된 세포이고, TH는 도파민 뉴런 특이적 마커이고, NeuN은 뉴런 특이적 마커이다. 화살표는 mCherry와 TH를 동시에 발현하는 뉴런을 가리킨다. (D) DAT-Cre:Ai9 마우스에 GFAP-RZFD-V3을 주사한 개략도로서, GFAP-RZFD-V3을 DAT-Cre:Ai9 마우스의 선조체 또는 흑색질에 주사하고, 1.5개월 후에 채취하여 분석하고 Dat -Cre는 Dat 내인성 촉진자 뒤에 Cre를 삽입한 것이고, Ai9는 Rosa26-CAG-LSL-tdTomato-WPRE 마우스이며, DAT-Cre: Ai9 마우스의 대뇌에서는 성숙된 도파민 뉴런만이 tdTomato 적색 형광 신호로 표지될 수 있다. (E) GFAP-RZFD-V3을 선조체에 주사한 1.5개월 후에 채취하여 분석한 결과를 나타내는 대표도로서, 적색 형광 신호(tdTomato)는 전환된 성숙한 도파민 뉴런을 나타내고, 녹색 신호는 도파민 뉴런 특이적 마커 TH로 염색된 것이며, 흰색 신호는 뉴런 특이적 마커 NeuN으로 염색된 것이고, Merge도는 tdTomato 적색 신호가 TH 염색된 녹색 신호와 겹친 것을 나타내며, 화살표는 tdTomato와 TH를 동시에 발현하는 뉴런을 가리킨다. 스케일 바는 50μm이다.
도 5. 망막에서 GFAP-RZFD의 과발현에 의해 뮐러 교세포를 광수용체 세포 또는 망막 신경절 세포로 전환분화시킴. (A) 뮐러 교세포를 광수용체 세포 또는 망막 신경절 세포로 전환분화시키기 위해 GFAP-RZFD를 과발현시키는 실험 과정을 나타내는 개략도로서, 여기서 벡터 1은 GFAP-EGFP-2A-Cre이고, Ai9 마우스의 망막에 주사하여 마우스의 뮐러 교세포에 특이적 표지를 하는데 사용될 수 있고, 표지된 세포는 tdTomato에 의해 표지된다. (B) Ai9 마우스 망막에 대조 그룹 바이러스 GFAP-EGFP-2A-Cre를 주사한 후 적색 형광 신호가 뮐러 교세포에서 특이적으로 발현된다. (C) GFAP-RZFD+GFAP-EGFP-2A-Cre를 주사한 그룹에서 흰색 화살표는 전환분화된 광수용체 세포를 가리킨다. 스케일 바는 50μm이다. (D) GFAP-EGFP-2A-Cre 대조 그룹 바이러스를 주사한 마우스의 시신경은, 시신경에서 tdTomato로 표지된 축색이 관찰되지 않는다. (E) GFAP-RZFD+GFAP-EGFP-2A-Cre를 주사한 그룹의 마우스의 시신경은, 시신경에서 대량의 tdTomato로 표지된 축색이 관찰된다. (F) NMDA로 모델링된 Ai9 마우스의 망막하에 대조 그룹 바이러스 GFAP-EGFP-2A-Cre를 주사한 후, 적색 형광 신호가 뮐러 교세포에서 특이적으로 발현되었으며, RGC 특이적 단백질 마커 Rbpms와 공동 표지되지 않았으며, 황색 화살표는 Rbpms 양성의 RGC를 가리킨다. (G) GFAP-RZFD 그룹 중 AAV를 주사한 망막에서, 일부 tdTomato 양성 세포가 망막 신경절 세포층에 위치하고 RGC 특이적 단백질 마커 Rbpms와 공동 표지되었음을 발견하고, 흰색 화살표는 tdTomato 및 Rbpms 이중 양성 세포를 가리킨다. (H) 광수용체 세포가 특이적 단백질 마커 Rhodopsin으로 염색된 것으로, 일부 tdTomato 양성 세포는 GFAP-RZFD를 주사한 그룹의 망막 외부 과립층에서 Rhodopsin과 공동 표지된 것을 발견하고, 흰색 화살표는 공동 표지된 세포를 가리킨다. (I) 원추세포가 특이적 단백질 마커 Cone Arrestin(mCAR)으로 염색된 것으로, GFAP-RZFD를 주사한 그룹의 망막 외부 과립층에 소수의 tdTomato 양성 세포가 mCAR과 공동 표지되되고, 흰색 화살표는 공동 표지된 세포를 가리킨다. 스케일 바는 50μm이다. (J) 각 그룹에 3마리 초과의 마우스를 대상으로, 대조 그룹과 시험 그룹의 tdTomato 양성 광수용체 세포의 수를 통계한 것으로, 대조 그룹에는 tdTomato로 표지된 광수용체 세포가 거의 없고, GFAP-RZFD 과발현 그룹에서는 전환분화된 tdTomato 양성 광수용체 세포가 관찰되었다. (K) 각 그룹에 3마리 초과의 마우스를 대상으로, GFAP-EGFP-2A-Cre 대조 그룹 AAV, GFAP-RZFD+GFAP-EGFP-2A-Cre 그룹 AAV를 주사한 마우스의 시신경에서 tdTomato 양성 축색의 수.
도 6. miRNA의 과발현에 의해 도파민 뉴런을 생성할 수는 없지만 마우스의 성상 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음. (A) miRNA를 과발현시킴으로써 성상 교세포를 뉴런으로 전환시키는 것을 구현하는 개략도이다. 벡터 1은 AAV-GFAP-mCherry이고, 벡터 2(AAV-GFAP-miRNA)는 GFAP에 의해 miRNA 과발현을 구동한다. 벡터 1 단독 주사는 대조 그룹이고, 벡터 1+2 혼합 주사는 실험 그룹이다. (B) 도 A의 벡터 2에 해당한다. GFAP 촉진자에 의해 miR-124(miR-124-5p 및 miR-124-3p 포함), miR-9(miR-9-5p 및 miR-9-3p 포함) 또는 miR-9-miR-124를 발현하도록 각각 구동하는 AAV 발현 벡터 개략도이다. (C) GFAP-mCherry를 마우스의 선조체에 주사한 것으로서, mCherry는 교세포에서 특이적으로 발현되고 선조체에는 TH 양성 세포가 없다. (D) 실험 그룹 AAV 바이러스(GFAP-mCherry+GFAP-miR-124)를 마우스의 선조체에 주사한 것으로, 흰색 화살표는 표지된 세포를 가리키고, 중첩도는 적색 형광이 NeuN과 중첩되지 않음을 나타내며, 스케일 바는 50μm이다. (E) GFAP-mCherry+GFAP-miR-9+miR-124를 마우스 선조체에 주사한 것으로, 흰색 화살표는 표지된 세포를 가리키고, 중첩도는 적색 형광이 NeuN과 중첩된 것을 나타내며, 스케일 바는 50μm이다. (F) GFAP-mCherry+GFAP-miR-9+miR-124를 마우스의 선조체에 주사한 것으로, TH는 도파민 뉴런 특이적 마커이고, 흰색 화살표는 표지된 세포를 가리키고, 중첩도는 적색 형광이 TH 신호와 중첩되지 않음을 나타내며, 스케일 바는 50μm이다.
도 7. CasRx가 체외에서 Ctdsp1의 mRNA 발현을 녹다운시킬 수 있음. 체외에서 인간 293T 및 마우스 N2A 세포주에서 CasRx와, Ctdsp1 mRNA를 표적으로 하는 gRNA를 발현시키면 Ctdsp1의 mRNA 녹다운을 구현할 수 있다. Ctdsp1의 정식 명칭은 카르복시 말단 도메인 RNA 폴리머라제 II 폴리펩티드 A 소형 포스파타제 1(Ctdsp1)이다.
도 8. Ctdsp1의 녹다운은 도파민 뉴런을 생성할 수 없지만 마우스의 성상 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음. (A) 유전자 녹다운을 통해 성상 교세포를 뉴런으로 전환시키는 것을 구현하는 개략도이다. 벡터 1(AAV-GFAP-mCherry)은 성상 교세포 특이적 촉진자 GFAP에 의해 형광 단백질 mCherry를 발현하도록 구동되고, 벡터 2(AAV-GFAP-CasRx)는 GFAP에 의해 RNA 편집 단백질 CasRx를 발현하도록 구동된다. 벡터 3(AAV-GFAP-CasRx-Ctdsp1)은 CasRx 및 Ctdsp1을 표적으로 하는 gRNA를 코딩한다. AAV-GFAP-CasRx-Ctdsp1 또는 gRNA를 함유하지 않은 대조 벡터 AAV-GFAP-CasRx 및 AAV-GFAP-mCherry를 C57BL/6 마우스의 선조체 또는 흑색질에 주사한다. 성상 교세포 또는 성상 교세포에 의해 전환된 뉴런을 특이적으로 표지하기 위해 AAV-GFAP-mCherry를 공동 주사한다. 주사 후 1~2개월에 발생된 전환을 조사한다. 벡터 1+2는 대조 그룹이고, 벡터 1+3은 시험 그룹이다. (B) 대조 그룹 AAV(GFAP-mCherry+GFAP-CasRx)를 마우스의 선조체에 주사한 것으로, 주황색 화살표는 표지된 성상 교세포를 가리키고, NeuN은 뉴런 특이적 마커이며, 중첩도는 적색 형광이 NeuN과 중첩되지 않음을 나타내고, 스케일 바는 50μm이다. (C) 실험 그룹 AAV 바이러스(GFAP-mCherry+GFAP-CasRx-Ctdsp1)를 마우스의 선조체에 주사한 후, 교세포가 뉴런으로 전환분화된 결과로서, 흰색 화살표는 적색 형광 신호가 NeuN과 공동 표지된 세포를 가리키며, 스케일 바는 50μm이다.
도 9. Ctdsp1의 녹다운 또는 miRNA의 과발현에 의해 망막 신경절 세포, 광수용체 세포 또는 와우 나선 신경절 세포를 생성할 수 없음. (A) 벡터 디자인 개략도로서, 벡터 1(GFAP-EGFP-2A-Cre)은 성상 교세포 특이적 촉진자 GFAP에 의해 뮐러 교세포에서 Cre를 특이적으로 발현하도록 구동되고, 벡터 2(GFAP-CasRx)는 GFAP에 의해 RNA 편집 단백질 CasRx를 발현하도록 구동된다. 벡터 3(GFAP-CasRx-Ctdsp1)은 CasRx 및 Ctdsp1을 표적으로 하는 gRNA를 코딩한다. (B) GFAP-CasRx-Ctdsp1+GFAP-EGFP-2A-Cre 또는 대조 바이러스 GFAP-CasRx+GFAP-EGFP-2A-Cre를 마우스 망막에 주사한다. 뮐러 교세포를 특이적으로 표기하기 위해 GFAP-EGFP-2A-Cre를 공동 주사한다. 벡터 1+2는 대조 그룹이고, 벡터 1+3은 시험 그룹이다. (C) 망막에서 miRNA를 과발현하는 개략도이다. 벡터 1은 GFAP-EGFP-2A-Cre이고, 벡터 2(GFAP-miRNA)는 GFAP에 의해 miRNA를 과발하도록 구동된다. 벡터 1 단독 주사는 대조 그룹이고, 벡터 1+2 혼합 주사는 실험 그룹이다. (D) 도 C의 벡터 2에 해당한다. GFAP 촉진자에 의해 각각 miR-124, miR-9 또는 miR-9-miR-124를 발현하도록 구동하는 AAV 발현 벡터의구동되는 개략도이다.
본 출원은 RE1/NRSE 조절과 관련된 조성물, 내인성 RE1/NRSE 결합 단백질 REST의 다른 도메인을 기반으로 개조된 생물학적 활성 분자 및 이의 응용을 제공한다. 특히, 본 출원은 REST 단백질의 서로 다른 영역을 통해 유전자 발현을 조절하는 기능을 이용하기 위해, 내인성 RE1 결합 단백질 REST의 개조에 관한 것이다.
억제 요소 1/뉴런 제한 침묵 요소(repressor element 1/neuron-restrictive silencer element, RE1/NRSE)는 길이가 약 21bp(20-23bp 부동함)인 특정 DNA 서열로, 많은 신경 관련 유전자의 촉진자 영역에 존재한다. 본 출원에서, RE1/NRSE와 RE1은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. RE1은 뉴런의 성숙과 관련된 음성 조절 요소로서, NaV1.2 및 SCG10의 촉진자 5' 단에서 처음 발견되어 이러한 유전자의 발현을 조절한다. 비뉴런 세포에서, RE1 부위는 히스톤 탈아세틸화효소와 메틸라제로 이루어진 침묵 복합체에 결합되고, 뉴런 관련 유전자의 발현을 억제한다. 마우스와 인간에는 약 1800개 초과의 RE1 요소가 있다.
RE1은 주로 REST(RE1-침묵 전사 인자(RE1-silencing transcription factor))와 결합하여 뉴런의 성장 및 성숙과 관련된 유전자의 발현을 조절한다. 뉴런 제한 침묵 인자(NRSF)라고도 칭한 REST는, RE1을 내인성적으로 결합하는 단백질이다. 인간 REST 단백질의 전장 서열은 SEQ ID NO: 20에 제시된 바를 참조한다.
도메인 예측 및 단백질 구조 모델링을 통해, 본 출원의 발명자는 인간 REST 단백질의 159-412번째에 8개의 아연 핑거 단백질 도메인(Zinc Finger Domain, ZFD)(도 1A)이 포함되며, 이의 N-단 1-83번째는 주로 Sin3a 및 Sin3b 등 단백질에 결합하는 N-단 억제 영역이고, 1008-1097번째는 주로 RCOR1 등 단백질에 결합하는 C-단의 억제 도메인 및 아연 핑거 도메인임을 발견하였다. 중간의 84-158번째 및 413-1007번째에는 뚜렷한 단백질 도메인이 없고, 이의 기능도 아직 명확하지 않으며, REST와 RE1의 결합을 조절하는 것을 관여할 수 있다. REST 단백질의 아연 핑거 도메인은 RE1과의 결합과 관련될 수 있으며, 나아가 REST 단백질의 전사 억제 도메인(REST 단백질의 N-단 또는 C-단에 존재하는 것으로 생각됨)이 RE1에 대해 전사 조절을 허용함으로써, RE1 표적 유전자의 발현을 억제하게 된다. 이전의 연구에 따르면, REST 단백질의 1-83번째 및 1008-1097번째를 삭제하면 REST와 RE1의 결합에 영향을 미치지 않지만 정상적으로 기능할 수 없는 것을 나타낸다.
일 측면에서, 본 출원은 RE1을 조절함으로써 개체 체내에서 비뉴런 세포를 기능성 뉴런 세포로 전환분화시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 체내의 관심 있는 부위(예를 들어, 질환의 영향을 받는 부위)에서 RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합을 차단함으로써, 관심 있는 부위에서 비뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 전환분화시키는 것을 구현할 수 있다.
이전의 연구에 따르면, RE1이 많은 신경 관련 유전자의 촉진자 영역에 존재하는 것으로 밝혀졌지만, RE1을 조절하여 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있는지 여부는 아직 알려지지 않았다. 본 연구에서는, 내인성 RE1 결합 단백질을 유전 공학적으로 개조하여 RE1과 결합할 수 있는 내인성 단백질 REST의 아연 핑거 도메인(Zinc Finger Domain, ZFD)을 이용하여 RE1을 조절하여 이의 관련 유전자의 발현을 조절하는 것을 구현한다. 이전의 연구에서, 체외에서 배양된 세포에서 REST의 아연 핑거 도메인을 과발현하거나, 또는 REST 발현을 녹다운시킴으로써 섬유 아세포를 Tuj-1 및 Map2 양성 뉴런으로 전환분화시키지만 성숙한 뉴런이 아니다. 또한, 이러한 연구는 체외에서 배양된 세포에서 수행되었으며, 체외 연구 시스템에 의해 구현된 기능은 대부분이 더 복잡한 체내에서 구현되기 어렵다. 또한, 이전의 연구에서는 전환분화를 통해 일반 뉴런만 얻었을 뿐, 도파민 뉴런, 5-세로토닌 뉴런, 망막 신경절 세포 및 광수용체 세포와 같은 특수한 유형의 뉴런은 얻을 수 없었다. 따라서, 체내에서 RE1을 조절하여 교세포를 특수한 유형의 뉴런으로 전환분화시킬 수 있는지 여부를 탐구하는 것은 아주 중요한 과학적 의미를 갖는다.
다른 일 측면, 본 출원의 발명자는 REST 단백질의 N-단 및 C-단이 다양한 후성유전학적 조절 요소를 모집하여, 나아가 이의 작용하는 유전자를 음성 조절할 수 있음을 발견하였다. DNA 결합 단백질이 REST 단백질의 N-단 및/또는 C-단에 조합되거나 융합될 경우, DNA 결합 단백질이 결합된 표적 유전자 영역에서 음성 조절하는 것이 구현될 수 있다.
전환분화의 방법
일 측면에서, 본 출원은 개체 체내에서 비뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 전환분화시키는 방법을 제공한다.
다른 일 측면에서, 본 출원은 필요가 있는 개체 체내에서 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 질환의 영향을 받은 부위의 비뉴런을 기능성 뉴런으로 전환분화시키는 단계를 포함한다.
i) 기능성 뉴런
본 출원에서, 용어 "기능성 뉴런"은 특정 기능을 가질 수 있는 뉴런 세포, 예를 들어 도파민 뉴런, 망막 신경절 세포, 광수용체 세포 등과 같은 특정 기능을 갖는 뉴런을 가리킨다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 축색과 같은 시냅스를 갖는 것과 같은 뉴런의 형태학적 특징을 적어도 하나를 갖는다. 일부 실시양태에서, 기능성 뉴런은 NeuN 유전자 발현 생성물과 같은 적어도 하나의 성숙한 뉴런 마커를 발현한다. 일부 실시양태에서 기능성 뉴런은 전기 생리학적 특성을 갖는다.
기능성 뉴런은 다른 기능을 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 기능성 뉴런은 도파민 뉴런, 망막 신경절 세포, 광수용체 세포 및 와우 나선 신경절 세포, GABA 뉴런, 5-HT 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, ChAT 뉴런, NE 뉴런, 운동 뉴런, 척수 뉴런, 척수 운동 뉴런, 척수 감각 뉴런, 양극 세포, 수평 세포, 무축색 세포, 피라미드 뉴런, 중개 뉴런, 중간 가시 뉴런(MSN), 푸르키네 세포, 과립 세포, 후각 감각 뉴런, 사구체 주위 세포 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 기능성 뉴런은 NeuN 유전자를 발현한다. NeuN 유전자는 알려진 성숙한 뉴런 특이적 마커이다. 비뉴런 세포에서 NeuN 유전자 발현 생성물(예를 들어, NeuN 단백질)이 검사되면, 이는 비뉴런 세포가 기능성 뉴런으로 전환분화됨을 제시한다.
일부 실시양태에서, 상기 기능성 뉴런은 축색을 갖는다. 뉴런의 축색은 현미경을 통해 관찰할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 기능성 뉴런은 도파민 뉴런, 망막 신경절 세포, 광수용체 세포 또는 와우 나선 신경절 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 기능성 뉴런은 도파민 뉴런을 포함한다. 본 출원에서, 도파민 뉴런과 도파민성 뉴런은 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 도파민성 뉴런(dopaminergic neuron)은 신경전달물질로서 도파민(dopamine, DA)을 함유하고 방출하는 뉴런이다. 도파민성 뉴런은 중추신경계에서 도파민의 주요 공급원이다. 도파민은 정서와 보상 등 신경 기능에 영향을 줄 수 있는 카테콜아민계 신경전달물질에 속하며, 중추신경계에서 중요한 생물학적 역할을 한다. 뇌의 도파민성 뉴런은 주로 중뇌의 흑색질 치밀부(SNc), 복측 피개 영역(VTA), 시상하부 및 뇌실 주위 영역에 집중되어 있다. 많은 실험은 도파민성 뉴런이 인체의 다양한 질환, 가장 대표적인 파킨슨병과 밀접한 관련이 있음이 입증되었다. 도파민성 뉴런의 점진적인 상실은 파킨슨병과 관련된 많은 운동 증상을 유발한다.
일부 실시양태에서, 상기 도파민 뉴런은 티로신 히드록실라제(TH), FoxA2, Nurr1, Pitx3, Vmat2 및 DAT로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다. 본 출원에서 "마커"는 mRNA 또는 단백질과 같은 유전자의 발현 생성물을 의미할 수 있다. 기능성 뉴런 세포에서 하나 이상의 이러한 마커가 발현되는 것이 검사되면, 이는 해당 기능성 뉴런 세포가 도파민 뉴런이라는 것을 제시한다. 이러한 마커의 예시적인 유전자 서열 및 단백질 서열은 모두 당업계에 공지되어 있으며, 공공 데이터베이스(예를 들어, 미국 국립보건원 산하의 국립 생명공학 정보 센터(NCBI)의 유전자 데이터베이스 및 단백질 데이터베이스)를 통해 검색할 수 있으며, 본 출원에서 표 A에 나열되어 있다. 티로신 히드록실라제(TH)는 아미노산 L-티로신이 디히드록시페닐알라닌(도파(dopa))로 전환되는 것을 촉매하는 효소이고, 도파민성 뉴런에서 도파민의 합성 대사에 관여하는 효소이다. 도파민 뉴런의 기타 마커는 또한 FoxA2, Nurr1, Vmat2 및 DAT 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 도파민 뉴런은 NeuN, TH 및 DAT를 발현한다.
일부 실시양태에서, 상기 기능성 뉴런은 망막 신경절 세포를 포함한다. 망막 신경절 세포는 망막 내부 표면(신경절 세포층) 근처에 위치한 뉴런이고, 두 가지 중개 뉴런(양극 세포와 무축색 세포)을 통해 광수용체로부터 시각 정보를 수신한다. 이의 수상돌기는 주로 양극 세포와 시냅스 연결을 확립하며, 이의 축색은 시신경 머리까지 연장되어 뇌로 연장하는 시신경을 형성한다.
일부 실시양태에서, 상기 망막 신경절 세포(RGC)는 RBPMS, Pax6, Brn3a, Brn3b, Brn3c 및 Map2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다. RBPMS는 RGC의 특이적 마커이다. 기능성 뉴런 세포에서 RBPMS의 발현이 검사되면, 이는 해당 기능성 뉴런 세포가 RGC임을 제시한다. RBPMS의 예시적인 유전자 서열 및 단백질 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 공공 데이터베이스를 통해 검색할 수 있고, 본 출원의 표 A에 나열되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 망막 신경절 세포(RGC)는 NeuN 및 RBPMS를 발현한다.
일부 실시양태에서, 상기 기능성 뉴런은 광수용체 세포를 포함한다. 광수용체 세포는 망막에서 발견되는 특별한 신경상피 세포이고, 빛을 감지하고 광변환 기능을 수행하는 역할을 한다. 이는 양극 세포와 신경절 세포에 의해 처리되어 광신호를 전기 신호로 변환하여 대뇌로 전달할 수 있다. 광수용체 세포는 간상세포와 원추세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 광수용체 세포는 Rhodopsin, mCAR, m-opsin 및 S-opsin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다. Rhodopsin, mCAR, m-opsin 및 S-opsin은 모두 RGC의 특이적 마커이다. 기능성 뉴런 세포에서 Rhodopsin, mCAR, m-opsi 및/또는 S-opsin의 발현이 검사되면, 이는 해당 기능성 뉴런 세포가 광수용체 세포임을 제시한다. Rhodopsin, mCAR, m-opsi 및 S-opsin의 예시적인 유전자 서열 및 단백질 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 공공 데이터베이스를 통해 검색할 수 있으며, 본 출원의 표 A에 나열되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 광수용체 세포는 NeuN, Rhodopsin 및/또는 mCAR을 발현한다.
일부 실시양태에서, 상기 기능성 뉴런은 와우 나선 신경절 세포를 포함한다. 와우 나선 신경절 세포는 청각 전달 경로에서 1차 뉴런인 양극 신경절 세포이고, 이의 말초 돌기는 유모세포와 연결되어 있으며, 중추 돌기는 청각 신경 형성에 관여한다. 나선 신경절 세포는 소리 신호의 전달과 코딩에 중요한 역할을 한다.
일부 실시양태에서, 상기 와우 나선 신경절 세포는 NeuN, Prox1, Tuj-1 및 Map2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다. 기능성 뉴런 세포에서 Prox1 및 Map2의 발현이 검사되면, 이는 해당 기능성 뉴런 세포가 와우 나선 신경절 세포임을 제시한다. Prox1, Tuj-1 및 Map2의 예시적인 유전자 서열 및 단백질 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 공공 데이터베이스를 통해 검색할 수 있으며, 본 출원의 표 A에 나열되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 와우 나선 신경절 세포는 NeuN, Prox1, Tuj-1 및 Map2를 발현한다.
(표 A) 기능성 뉴런의 마커
ii) 비뉴런 세포
일부 실시양태에서, 상기 비뉴런 세포는 교세포(예를 들어, 신경교세포), 섬유 아세포, 줄기 세포, 신경 전구 세포 또는 신경 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 비뉴런 세포는 교세포(예를 들어, 신경교세포)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 교세포는 성상 교세포, 희돌기 교세포, 뇌실막 세포, 슈반 세포, NG2 세포, 위성 세포, 뮐러 교세포, 내이 신경교세포 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 뮐러 교세포(Muller glia, MG)는 망막 조직의 주요한 신경교세포이다.
일부 실시양태에서, 상기 교세포는 뇌, 척수, 눈 또는 귀에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 교세포는 선조체, 흑색질, 중뇌의 복측 피개 영역, 연수, 시상하부, 등쪽 중뇌 또는 대뇌 피질에 위치한다.
일부 실시양태에서, 상기 활성 물질은 상기 개체 체내에서 i) 선조체에 있는 교세포, ii) 대뇌 흑색질에 있는 교세포, iii) 망막에 있는 교세포, iv) 내이에 있는 교세포, v) 척수에 있는 교세포, vi) 전두엽 피질에 있는 교세포, vii) 운동 피질에 있는 교세포, viii) 시상하부에 있는 교세포, 및 ix) 복측 피개 영역(VTA)에 있는 교세포 중 하나 이상의 부위에 있는 교세포에 국소 투여된다.
어떠한 이론에 구애되지 않고 바라지만, 교세포가 체내에 처하는 미세환경이 본 출원에 기재된 활성 물질에 의해 유도된 전환분화를 촉진하는 역할을 하여, 상기 교세포가 체내에서 기능성 뉴런으로 전환분화되는 것을 촉진한다고 생각한다.
일부 실시양태에서, 상기 교세포는 성상 교세포, 뮐러 교세포 및 와우 신경교세포로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 교세포는 성상 교세포를 포함하고, 상기 기능성 뉴런은 도파민 뉴런 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 출원에서 제공되는 방법은 개체 체내에서 성상 교세포를 도파민 뉴런 세포로 전환분화시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 성상 교세포는 선조체 및/또는 흑색질에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 상기 개체의 선조체 및/또는 흑색질에 본 출원에서 제공되는 활성 물질을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 교세포는 뮐러 교세포를 포함하고, 상기 기능성 뉴런 세포는 망막 신경절 세포(RGC) 및/또는 광수용체 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 출원에서 제공되는 방법은 개체 체내에서 뮐러 교세포를 망막 신경절 세포(RGC) 및/또는 광수용체 세포로 전환분화시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 뮐러 교세포는 망막 또는 유리체강에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본 출원에서 제공되는 활성 물질을 상기 개체의 망막하 또는 유리체강에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 교세포는 와우 신경교세포를 포함하고, 상기 기능성 뉴런 세포는 와우 나선 신경절 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 출원에서 제공되는 방법은 개체 체내에서 와우 신경교세포를 와우 나선 신경절 세포로 전환분화시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 와우 신경교세포는 내이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본 출원에서 제공되는 활성 물질을 상기 개체의 내이에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 활성 물질을 투여한 후 상기 교세포를 기능성 뉴런으로 전환분화시키는 효율은 적어도 1%, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%에 달한다. 전환분화 효율은 당업자에게 공지된 방법으로 검사하고 계산할 수 있다. 예를 들어, 형광 단백질을 이용하여 GFAP-mCherry, GFAP-tdTomato, GFAP-EGFP 등과 같은 전환분화된 초기 세포(예를 들어, 교세포)를 표지하고, 예를 들어 Ai9 유전자 변형 마우스도 사용할 수 있으며, 여기서 교세포에는 형광 표지가 있다. 전환분화된 세포에도 형광을 보유하므로, 전환분화 효율은, 전환분화를 통해 얻은 세포 수를 초기 표지된 세포 수의 백분율로 계산하여 얻을 수 있다. 또는, 전환분화 효율은 전환분화에 의해 생성된 세포 수를 투여 부위에서 해당 유형의 세포 수의 백분율로 계산하여 얻을 수 있으며, 예를 들어, 흑색질에서 새로 생성된 도파민 뉴런이 흑색질 내에서 도파민 뉴런 중 차지하는 백분율로 계산할 수 있다.
iii) 활성 물질
일부 실시양태에서, 본 출원에서 제공되는 개체 체내에서 비뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 전환분화시키는 방법은, 상기 게체에 RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합을 감소시키거나 REST의 양 또는 활성을 감소시키는 활성 물질을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 일부 실시양태에서, 본 출원에서 제공되는 필요가 있는 개체 체내에서 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법은, 상기 질환의 영향을 받는 상기 개체의 부위에 치료 유효량의 RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합을 감소시키거나 REST의 양 또는 활성을 감소시키는 활성 물질을 투여하여, 상기 질환의 영향을 받는 부위에 있는 비뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 전환분화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 활성 물질은 REST의 양 또는 활성을 감소시킬 수 있다. REST의 양 또는 활성을 감소시킬 수 있는 임의의 활성 물질을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, REST의 양은 유전자 편집, 작은 RNA 간섭 또는 단백질 분해 가속화와 같은 방법을 통해 감소된다. 일부 실시양태에서, REST의 양은 유전자 편집, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 작은 RNA 간섭, miRNA 기술, 소분자 화합물 또는 단백질 분해 가속화와 같은 방법을 통해 감소된다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집을 통해 REST의 억제 활성 영역을 제거하거나 REST 활성 억제제를 통해 REST의 활성을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 상기 활성 물질은 RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합은 REST 항체와 같은 REST 결합제가 REST에 결합을 통해 차단된다.
일부 실시양태에서, 상기 활성 물질은 RE1/NRSE 요소에 결합하여 RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합을 차단할 수 있는 RE1/NRSE 요소 차단제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 REST와 경쟁하여 RE1에 결합하는 소분자 화합물, 핵산 또는 핵산 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 REST와 경쟁하여 RE1에 결합하는 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, REST와 경쟁하여 RE1에 결합하는 상기 단백질은 REST 변이체를 포함한다. 본 출원에서 "변이체"는 부모 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환(보존적 치환를 포함하나 이에 한정되지 않음), 첨가, 결실, 삽입 또는 절단 또는 이들의 임의의 조합을 가진 파생 서열을 가리킨다. 특정 실시양태에서, REST 변이체는 REST 단백질의 단편 또는 REST 단백질의 단편과 기타 단백질의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 REST의 DNA 결합 도메인을 포함하지만, REST의 N-단 및/또는 C-단 억제 도메인이 결실된다. 천연 REST 단백질은 N-단 억제 도메인, DNA 결합을 담당하는 중간 DNA 결합 도메인 및 C-단의 전사 억제 도메인을 포함한다. 인간 REST 단백질에는 DNA에 대한 결합, 보다 구체적으로 RE1/NRSE 요소에 대한 결합을 담당하는 8개의 아연 핑거 도메인을 갖는다. REST의 DNA 결합 도메인은 REST 단백질 내의 8개 아연 핑거 도메인 또는 DNA와 결합할 수 있는 단편(예를 들어, 이 중 8개 미만의 아연 핑거 도메인)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 REST(특히는 인간 REST)의 155-420번째 아미노산을 포함하지만, REST의 N-단 및/또는 C-단 억제 도메인이 결실된다. 일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 REST(특히는 인간 REST)의 155-420번째 아미노산에 있는 RE1 결합 단편을 포함하지만, REST의 N-단 및/또는 C-단 억제 도메인이 결실된다. 본 출원에서 "RE1 결합 단편"은 RE1 요소에 결합할 수 있는 단백질 단편을 가리킨다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 9의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 60% 또는 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 상기 REST 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 REST 변이체를 코딩하는 상기 핵산은 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 10의 뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 60% 또는 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는다.
아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 대한 용어 "서열 일치성 백분율(%)"은 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 수의 동일한 아미노산(또는 핵산)을 구현한 후, 후보 서열에서 참조 서열에 있는 아미노산(또는 핵산) 잔기와 동일한 아미노산(또는 핵산) 잔기의 백분율로 정의된다. 다시 말해서, 아미노산 서열(또는 핵산 서열)의 서열 일치성 백분율(%)은 비교되는 참조 서열에 대해 동일한 아미노산 잔기(또는 염기)의 수를 후보 서열 또는 참조 서열의 아미노산 잔기(또는 염기)의 총 수(짧은 것을 기준으로 함)로 나누어서 계산할 수 있다. 아미노산 잔기의 보존적 치환은 동일한 잔기로 간주될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 아미노산(또는 핵산) 서열의 일치성 백분율을 확정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLASTN, BLASTp(미국국립 생명공학 정보 센터(U.S. National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 웹사이트를 참조할 수 있고, 또한 Altschul S.F. 등의 "분자 생물학 저널" 215:403-410 (1990), Stephen F. 등의 "핵산 연구(Nucleic Acids Res.)" 25:3389-3402 (1997)를 참조할 수 있음), ClustalW2(유럽생물정보연구소(European Bioinformatics Institute) 웹사이트를 참조할 수 있고, 또한 Higgins D.G 등의 "효소학적 방법(Methods in Enzymology)", 266:383-402(1996), Larkin M.A 등의 "생물정보학(Bioinformatics)"(일글랜드 옥스퍼드(Oxford, England)), 23(21): 2947-8(2007)를 참조할 수 있음) 및 ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 얻을 수있는 도구를 사용하여 구현할 수 있다. 당업자는 상기 도구에 의해 제공되는 기본 파라미터를 사용할 수 있거나, 예를 들어 적절한 알고리즘을 선택함으로써 필요에 따라 정렬할 파라미터를 정의할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체를 코딩하는 상기 핵산은 코돈 최적화되고, 선택적으로 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 60% 또는 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는다. 이론에 구애되지 않지만, 코돈 최적화 후의 REST 변이체의 핵산 서열이 인간 세포에서 더 높은 수준으로 발현될 수 있는 것으로 여겨진다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 상기 REST의 DNA 결합 도메인에 융합된 활성화 도메인을 추가로 포함한다. 본 출원에서 "활성화 도메인"은 표적 유전자의 조절 서열과 상호작용하여 표적 유전자의 발현을 활성화하거나 증가시킬 수 있는 도메인을 가리킨다.
일부 실시양태에서, 상기 활성화 도메인은 후성유전학적 변형 단백질 또는 유전자 활성화 조절 요소를 포함하며, 선택적으로, 상기 활성화 도메인은 VP64, P65-HSF1, VP16, RTA, Suntag, P300, CBP 또는 이들의 임의의 조합을 포함하며, 선택적으로, 상기 활성화 도메인은 VP64 또는 P65-HSF1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 하나 이상의 핵 위치 신호 서열(즉, NLS)에 융합된다. 어떠한 이론에 구애되지 않고 바라지만, 핵 위치 신호 서열은 REST 변이체가 세포 핵으로 진입할 수 있도록 촉진하며, 나아가 유전자 발현의 조절과 세포의 전환분화 작용을 더 잘 발휘할 수 있다고 여겨진다. 임의의 적합한 핵 위치 신호 서열을 사용할 수 있다. 핵 위치 신호 서열의 예시는 BPNLS(예를 들어, SEQ ID NO: 13에 제시된 아미노산 서열) 및 아미노산 서열 PKKKRKV(SEQ ID NO: 41)를 갖는 SV40 바이러스 대형 T 항원의 NLS; 핵질 단백질로부터 유래되는 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK를 갖는 핵질 단백질 이분 NLS)(SEQ ID NO: 42); 아미노산 서열 PAAKRVKLD(SEQ ID NO: 43) 또는 RQRRNELKRSP(SEQ ID NO: 44)를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO:45)를 갖는 hRNPA1M9NLS; 임포틴 단백질-α의 IBB 도메인으로부터 유래되는 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:46); 근종 T 단백질의 서열 VSRKRPRP(SEQ ID NO:47) 및 PPKKARED(SEQ ID NO:48); 인간 p53 서열 POPKKKPL(SEQ ID NO 49); 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:50); 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR(SEQ ID NO:51) 및 PKQKKRK(SEQ ID NO:52); 간염 바이러스 δ 항원의 서열 RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:53); 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR(SEQ ID NO:54); 인간 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:55); 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO: 56)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. NES의 비제한적 예시는 NES 서열 LYPERLRRILT(SEQ ID NO: 57), PKKKRKV(SEQ ID NO: 58)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 상기 REST 변이체의 N-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 상기 REST 변이체의 C-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 각각 상기 REST 변이체의 N-말단 및 C-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 상기 핵 위치 신호 서열은 SEQ ID NO: 13 및 41-58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 출원의 실시예에서, 단백질 구조 예측을 이용하고, 유전 공학 개조 기술을 결부하여 REST의 내인성 아연 핑거 도메인에 대하여 일련의 분석 및 개조를 수행하였다. 먼저, 절단 실험을 통해 발명자는 REST의 155-420번째 아미노산(RZFD: REST Zinc Finger Domain이라고 불리는 8개의 아연 핑거 도메인만 포함)을 과발현하면 REST와 RE1의 결합을 차단할 수 있다는 사실을 발견하였다. AAV에 의해 매개되는 유전자 전달 기술을 통해, 마우스 선조체의 성상 교세포에서 RZFD을 과발현시켜 교세포를 기능성 뉴런으로 전환분화시킬 수 있다. RZFD를 추가로 개조함으로써, RZFD의 N-단 또는 C-단에 VP64를 융합하여 RZFD-VP64를 형성하고 AAV에 의해 매개되는 체내 교세포를 뉴런으로 전환분화시키는 것을 성공적으로 구현한다. P65 및 HSF1의 전사 활성화 도메인을 RZFD에 추가로 융합하여, RZFD-P65-HSF1을 형성한다. AAV에 의해 매개되는 체내 전환분화 기술을 응용하여, 선조체에서 RZFD-P65-HSF1이 교세포를 기능성 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음을 발견하였다.
이전의 연구에 따르면, RE1이라는 게놈의 DNA 서열에 결합하는 REST를 억제하면 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. RE1은 CRISPR 기술로 표적화할 수 없는 서열의 일종인데, 본 연구에서는 인간 내인성 아연 핑거 구조(REST 아연 핑거 도메인(RZFD))를 채택하여 RE1 서열을 교묘하게 표적으로 함으로써 RE1에 대한 REST 침묵 복합체의 결합을 차단하였다. 교세포와 같은 비뉴런 세포에서, RZFD(RZFD-V1)의 발현은 뉴런 관련 유전자의 발현에 대한 REST 침묵 복합체의 억제를 해제하였다. RZFD에 VP64(RZFD-V2) 또는 P65-HSF1(RZFD-V3) 등 활성화 도메인을 추가로 융합시키고, 뉴런 관련 유전자의 발현을 추가로 촉진하고 교세포를 뉴런으로 전환분화시키는 것을 촉진하였다. 본 출원의 실시예에서, 면역형광 염색 및 DAT-Cre:Ai9 표지 시스템을 통해, 또한 RZFD-V1, RZFD-V2 및 RZFD-V3이 모두 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음을 발견하였다.
본 출원의 실시예에서, AAV를 Ai9 망막의 하강에 주사함으로써, RZFD, RZFD-VP64 및 RZFD-P65-HSF1이 뮐러 세포를 망막 신경절 세포로 전환분화시킬 수 있음을 발견하였고, 일부 광수용체 세포가 관찰되었다. 망막 신경절 세포는 시각 경로에서 유일한 시각 신호를 대뇌에 전달하는 세포이며, 이의 결실 또는 사망은 영구적 실명을 초래한다. 비인간 영장류 동물에 대한 연구는 마우스에서의 결과와 유사하고 발명자는 대뇌에서 RZFD, RZFD-VP64 및 RZFD-P65-HSF1이 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시킬 수 있으며, 망막에서 RZFD, RZFD-VP64 및 RZFD-P65-HSF1이 뮐러 세포를 망막 신경절 세포와 광수용체 세포로 전환분화시킬 수 있음을 발견하였다.
iv) 개체 및 질환 치료
일부 실시양태에서, 상기 개체는 인간 또는 동물이다.
일부 실시양태에서, 상기 동물은 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이), 래트 또는 마우스이다.
본 출원의 내용에서, 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환은 주로 도파민 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환 및 시신경절 또는 광수용체 세포의 결실 또는 사망과 관련된 시각 장애를 포함한다. 일부 실시양태에서, 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 상기 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중(중풍), 정신분열증, 헌팅턴병, 우울증, 운동 뉴런 질환, 근위축성 측삭 경화증, 척수성 근위축증, 픽병, 수면 장애, 간질, 운동실조, RGC 세포 사망으로 인한 시각 장애, 녹내장, 연령 관련 RGC 병변, 시신경 손상, 망막 허혈 또는 출혈, 레버 유전성 시신경 병변, 손상 또는 퇴행성 병변으로 인한 광수용체 세포 변성 또는 사망, 황반 변성, 망막색소변성, 당뇨병 관련 실명, 야맹증, 색맹, 유전성 실명, 선천성 흑내장, 나선 신경절 세포 사망으로 인한 난청 또는 청력 저하 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 필요가 있는 개체 체내에서 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 선조체 및/또는 흑색질의 성상 교세포를 도파민 뉴런 세포로 전환분화시키기 위해 상기 개체의 상기 선조체 및/또는 흑색질에 치료 유효량의 본 출원에서 제공되는 활성 물질을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 상기 질환은 파킨슨병, 우울증 및 알츠하이머병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 필요가 있는 개체 체내에서 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 망막 또는 유리체강의 뮐러 교세포를 망막 신경절 세포(RGC) 및/또는 광수용체 세포로 전환분화시키기 위해 상기 개체의 상기 망막하 또는 유리 체강에 치료 유효량의 본 출원에서 제공되는 활성 물질을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 상기 질환은 RGC 세포 사망으로 인한 시력 장애, 녹내장, 연령 관련 RGC 병변, 시신경 손상, 망막 허혈 또는 출혈, 레버 유전성 시신경 병변, 손상 또는 퇴행성 병변으로 인한 광수용체 세포 변성 또는 사망, 황반 변성, 망막색소변성, 당뇨병 관련 실명, 야맹증, 색맹, 유전성 실명 및 선천성 흑내장으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 필요가 있는 개체 체내에서 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 내이의 와우 신경교세포를 와우 나선 신경절 세포로 전환분화시키기 위해 상기 개체의 상기 내이에 치료 유효량의 본 출원에서 제공되는 활성 물질을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 상기 질환은 나선 신경절 세포 사망으로 인한 난청 또는 청력 저하로 이루어진 군으로부터 선택된다.
REST 변이체
다른 일 측면에서, 본 출원은 REST의 DNA 결합 도메인을 포함하지만, REST의 N-단 및/또는 C-단 억제 도메인이 결실된 REST 변이체를 제공한다. 본 출원에서 REST는 모든 종의 REST를 포함하는 천연 또는 내인성 REST 분자를 가리킨다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 REST의 155-420번째 아미노산을 포함하지만, REST의 N-단 및/또는 C-단 억제 도메인이 결실된다. 일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 REST(특히는 인간 REST)의 155-420번째 아미노산에 있는 RE1 결합 단편을 포함하지만, REST의 N-단 및/또는 C-단 억제 도메인이 결실된다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 9의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 60% 또는 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 상기 REST 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 REST 변이체를 코딩하는 상기 핵산은 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 10의 뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 60% 또는 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 상기 REST의 DNA 결합 도메인에 융합된 활성화 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 활성화 도메인은 후성유전학적 변형 단백질 또는 유전자 활성화 조절 요소를 포함하며, 선택적으로, 상기 활성화 도메인은 VP64, P65-HSF1, VP16, RTA, Suntag, P300, CBP 또는 이들의 임의의 조합을 포함하며, 선택적으로, 상기 활성화 도메인은 VP64 또는 P65-HSF1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 REST 변이체는 하나 이상의 핵 위치 신호 서열에 융합된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 상기 REST 변이체의 N-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 상기 REST 변이체의 C-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 각각 상기 REST 변이체의 N-말단 및 C-말단에 융합된다.
일부 실시양태에서, 상기 핵 위치 신호 서열은 SEQ ID NO: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
REST 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
다른 일 측면에서, 본 출원은 본 출원에 기재된 바와 같은 REST 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 일 측면에서, 본 출원은 REST 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 촉진자를 추가로 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 촉진자는 교세포 특이적 촉진자이다. 일부 실시양태에서, 상기 교세포 특이적 촉진자는 성상 교세포 특이적 촉진자 또는 뮐러 교세포(MG) 특이적 촉진자이다.
일부 실시양태에서, 상기 교세포 특이적 촉진자는 GFAP 촉진자, ALDH1L1 촉진자, EAAT1/GLAST 촉진자, 글루타민 합성효소 촉진자, S100 촉진자, EAAT2/GLT-1 촉진자 및 Rlbp1 촉진자로부터 선택되며, 바람직하게는 GFAP 촉진자이다.
일부 실시양태에서, 상기 교세포 특이적 촉진자는 와우 신경교세포 특이적 촉진자이다.
일부 실시양태에서, 상기 와우 신경교세포 특이적 촉진자는 GFAP 촉진자(예를 들어, SEQ ID NO 39 또는 40을 참조), ALDH1L1 촉진자, EAAT1/GLAST 촉진자 및 Plp1 촉진자로부터 선택된다.
약학적 조성물, 키트, 시약 키트
다른 일 측면에서, 본 출원은 본 출원에 기재된 바와 같은 REST 변이체, 또는 상기 REST 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 REST 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물은 상기 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위한 운반체를 추가로 포함하며, 여기서 상기 운반체는 바이러스 벡터, 리포솜, 나노 입자, 엑소솜 또는 바이러스 유사 입자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 바이러스 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터(rAAV), 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, SV40 바이러스 벡터 또는 이들의 임의의 조합을 포함하며, 여기서 바람직하게는 AAV 또는 rAAV이다.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물은 i) 선조체에 있는 교세포, ii) 대뇌 흑색질에 있는 교세포, iii) 망막에 있는 교세포, iv) 내이에 있는 교세포, v) 척수에 있는 교세포, vi) 전두엽 피질에 있는 교세포, vii) 운동 피질에 있는 교세포, viii) 시상하부에 있는 교세포 및 ix) 복측 피개 영역(VTA)에 있는 교세포 중 하나 이상의 부위에 있는 교세포에 국소 투여하기에 적합하다.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물은 두개 내 투약 또는 안구 내 투약에 적합하다.
일부 실시양태에서, 상기 약학적 조성물은 또한 i) 하나 이상의 도파민 뉴런 관련 인자, 또는 ii) 뮐러 교세포에서 발현하기 위한, 하나 이상의 망막 신경절 세포 관련 인자를 포함하고,
1) 여기서 상기 하나 이상의 도파민 뉴런 관련 인자는 FoxA2, Lmx1a, Lmx1b, Nurr1, Pbx1a, Pitx3, Gata2, Gata3, FGF8, BMP, En1, En2, PET1, Pax 패밀리 단백질(Pax3, Pax6 등), SHH, Wnt 패밀리 단백질, TGF- 패밀리 단백질 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되며;
2) 여기서 상기 하나 이상의 망막 신경절 세포 관련 인자는 -catenin, Oct4, Sox2, Klf4, Crx, aCamKII, Brn3a, Brn3b, Brn3C, Math5, Otx2, Ngn2, Ngn1, AscL1, miRNA9, miRNA-124, Nr2e3, Nrl, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
다른 일 측면에서, 본 출원은 본 출원에서 제공되는 약학적 조성물을 포함하는 키트 또는 시약 키트를 제공한다.
융합 단백질 및 단백질 복합체
다른 일 측면에서, 본 출원은 하나 이상의 REST 억제 도메인에 융합되는 DNA 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. DNA 결합 단백질은 조절하고자 하는 표적 DNA에 결합할 수 있으며, 조절하고자 하는 표적 DNA의 전사 활성을 억제하기 위해, 이에 융합된 REST 억제 도메인이 해당 조절하고자 하는 표적 DNA가 음성 조절 작용을 발휘하도록 허용한다.
DNA 결합 단백질은, 직접적인 융합 외에도, 비공유 방식을 통해 하나 이상의 REST 억제 도메인에 결합되거나 복합되어, 단백질 복합체를 형성할 수 있다.
따라서, 본 출원은 또한 a) DNA-결합 단백질 및 b) 하나 이상의 REST 억제 도메인을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 a)와 b)는 결합하여 단백질 복합체를 형성할 수 있다. 본 출원에서 "단백질 복합체"는 두 개의 단백질 분자가 비공유 결합을 통해 결합되어 형성된 복합체를 가리킨다. 예를 들어, 상기 DNA 결합 단백질에는 상기 하나 이상의 REST 억제 도메인을 포함하는 단백질에 결합할 수 있는 결합 부분(예를 들어, 항체 또는 이 중의 항원 결합 단편)을 추가로 가질 수 있다. 다른 일 예시에서, 하나 이상의 REST 억제 도메인을 포함하는 단백질에는 상기 DNA 결합 단백질에 결합할 수 있는 결합 부분(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)을 추가로 가질 수 있다. 당업자는 해당 결합 부분이 DNA 결합 단백질과 표적 DNA의 결합에 영향을 주지 않고, 또한 상기 하나 이상의 REST 억제 도메인을 포함하는 단백질과 RE1의 결합에 영향을 주지 않음을 이해할 수 있다. 즉, 형성된 단백질 복합체는 여전히 적어도 부분적으로 표적 DNA에 결합하는 기능 및 적어도 부분적으로 RE1에 결합하는 기능을 갖는다. 이러한 방식을 통해, 조절하고자 하는 표적 DNA에 결합할 수 있는 상기 DNA 결합 단백질을 포함하고, 조절하고자 하는 표적 DNA의 전사 활성을 억제할 수 있는 REST 억제 도메인도 포함하는 비공유 결합된 단백질 복합체를 얻을 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 출원에서 제공되는 조성물에 있어서, 상기 a) 및 b)는 각각 자기조립 리간드 쌍에 연결되고, 상기 자가조립 리간드는 서로 결합될 수 있다. 본 출원에서 "자기조립 리간드"는 자발적으로 서로 결합될 수 있는 두 개의 리간드를 가리킨다. 두 개의 리간드는 자발적으로 결합될 수 있기 때문에, 자기조립 리간드 쌍이라고도 칭한다.
일부 실시양태에서, 상기 자기조립 리간드 쌍은 i) 서로 결합된 두 개의 단백질 도메인, 및 ii) RNA 절단 공여체 및 절단 수용체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 서로 결합될 수 있는 임의의 두 개의 단백질 도메인은 항원과 항체; 항원과 항체에 있는 항원 결합 단편; 수용체 및 리간드; 또는 서로 결합된 두 가지 단백질과 같이 본 출원에 기재된 자기조립 리간드로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 자기조립 리간드 쌍은 KFBP 및 FRB; 또는 PYL 및 ABI를 포함한다. 임의의 RNA 절단 공여체 및 절단 수용체는 본 출원에 기재된 자기조립 리간드로 사용될 수 있으며, 예를 들어 단편화된 단백질 인트론(Split Intein)을 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 자기조립 리간드 쌍의 두 개의 리간드는 각각 a) DNA 결합 단백질 및 b) 하나 이상의 REST 억제 도메인을 포함하는 단백질에 연결된다. 예를 들어, REST 억제 도메인은 항원에 연결될 수 있고, CRISPR-Cas 단백질은 이에 결합된 항체에 연결되어 항원과 항체 사이의 상호작용을 통해 본 출원에 기재된 단백질 복합체로 자기조립될 수 있다.
i) REST 억제 도메인
본 출원에서 제공되는 융합 단백질, 조성물 및 단백질 복합체에는 모두 하나 이상의 REST 억제 도메인을 갖는다. 본 출원에서 "REST 억제 도메인"은, REST 단백질 내에서 유전자 발현을 억제하는 기능을 갖는 도메인을 가리킨다. 어떠한 이론에 구애되지 않고 바라지만, REST 단백질에는 REST 단백질의 N-말단 영역과 REST 단백질의 C-말단 영역을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 REST 억제 도메인이 존재하는 것으로 여겨진다. 본 출원에서, 상기 "하나 이상의 REST 억제 도메인"은 동일한 억제 도메인의 여러 개 중복과 같은 하나 이상의 동일한 REST 억제 도메인을 가리키거나, 하나 이상의 상이한 REST 억제 도메인을 가리킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 REST 억제 도메인은 REST의 N-말단 억제 영역 및/또는 REST의 C-말단 억제 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 하나 이상의 REST 억제 도메인은 인간 REST 단백질 또는 동물 REST 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기 동물 REST 단백질은 비인간 영장류 동물의 REST 단백질(예를 들어, 원숭이), 설치류 동물의 REST 단백질(예를 들어, 마우스, 래트), 가금류(예를 들어, 닭, 오리, 거위 등), 농장 동물(예를 들어 소, 양, 돼지 등)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 REST의 N-말단 억제 영역은 REST의 1-83번째 아미노산 또는 전사 억제 활성을 갖는 단편을 포함한다. 본 출원에서 "전사 억제 활성"은 REST 억제 도메인이 특정 표적 유전자의 전사 조절 서열과 상호작용할 때, 상기 REST 억제 도메인은 상기 표적 유전자의 전사를 감소시키거나 줄이시킬 수 있음을 가리킨다. 본 출원에서, "전사 억제 활성을 갖는 단편"은 REST의 아미노산 서열에서 적어도 부분적으로 전사 억제 활성을 제공할 수 있는 단편을 가리킨다.
일부 실시양태에서, 상기 REST의 N-말단 억제 영역은 SEQ ID NO: 16에 제시된 바와 같은 서열 또는 전사 억제 활성을 갖는 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 REST의 C-말단 억제 영역은 REST의 1008-1097번째 아미노산 또는 전사 억제 활성을 갖는 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, REST의 C-말단 억제 영역은 SEQ ID NO: 18에 제시된 바와 같은 서열 또는 전사 억제 활성을 갖는 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 전사 억제 활성을 갖는 단편은 REST 단백질에 있는 적어도 20개 연속적인 아미노산, 30개 연속적인 아미노산, 40개 연속적인 아미노산 또는 50개 연속적인 아미노산의 단편을 포함한다.
ii) DNA 결합 단백질
본 출원에서 제공되는 융합 단백질, 조성물 및 단백질 복합체에는 모두 DNA 결합 단백질을 갖는다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA 결합 단백질은 특정 표적 DNA 서열에 표적으로 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 DNA 결합 단백질은 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), CRISPR-Cas 단백질과 같은 서열 가이드 DNA 결합 단백질, 또는 전사 인자에 있는 DNA 결합 부분일 수 있다. ZFN 및 TALEN은 단백질-DNA 상호작용을 통해 특이적 DNA 결합을 구현하고 CRISPR-Cas 단백질(예를 들어, Cas9, Cas12)은 표적 DNA와 염기쌍을 이루는 짧은 가이드 RNA의 가이드를 통해 특이적 DNA 서열에 표적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 전사 인자에 있는 DNA 결합 부분은 REST에 자연적으로 존재하는 DNA 결합 도메인이 아니다.
일부 실시양태에서, 상기 DNA 결합 단백질은 서열 가이드 DNA 결합 단백질로부터 선택된다. "서열 가이드 DNA 결합 단백질"은 표적화 모이어티의 가이드 하에 특정 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 DNA 결합 단백질을 가리킨다. 서열 가이드 DNA 결합 단백질은 CRISPR-Cas 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 서열 가이드 DNA 결합 단백질은 CRISPR-Cas 단백질 또는 이의 변이체이다. "CRISPR-Cas 단백질"은 박테리아 또는 고세균의 적응성 면역계로부터 유래되는 뉴클레아제의 일종으로, 표적 가이드 RNA(gRNA)의 가이드 하에 특정 핵산 서열에 표적으로 결합하고 이를 절단할 수 있는 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문구조 반복 서열 관련 단백질을 가리킨다. DNA에 결합할 수 있는 CRISPR-Cas 단백질은 Cas9 및 Cas12를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 CRISPR-Cas 단백질 변이체는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 서열 가이드 DNA 결합 단백질은 Cas9 단백질이거나 또는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas9 변이체이다. 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas9 변이체의 예시로는 nCas9 또는 dCas9가 포함된다.
Cas9 단백질은 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)으로부터 유래되는 Cas9(SpCas9), 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus)으로부터 유래되는 Cas9(SaCas9), 연쇄구균 서모필루스(Streptococcus thermophilus)로부터 유래되는 Cas9(StCas9) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 세균으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 단백질은 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하도록 개조될 수 있다. Cas9 단백질의 돌연변이로 인해, 이는 DNA 이중 가닥을 절단시키는 활성이 잃도록 만들거나 DNA 단일 가닥을 절단시키는 활성만 가기도록 만들 수 있다. 예를 들어, SpCas9를 예로 들면, 10번째의 Asp 잔기를 Ala 잔기(즉, D10A 돌연변이체)로 전환시키거나, 840번째의 His 잔기를 Ala 잔기(H840A 돌연변이체)로 전환시킬 수 있으며, 이로하여, 단일 가닥 DNA만 절단할 수 있는 돌연변이체, 즉 nCas9를 얻었다. 다른 예시로는 SpCas9를 예로 들면, D10A와 H840A의 이중 돌연변이를 동시에 도입할 수 있고 Cas9는 DNA 이중 가닥을 절단하는 활성을 잃게 만들고, 이러한 Cas9 돌연변이체를 dCas9라고도 칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 dCas9는 SEQ ID NO: 21 또는 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 여기서 상기 서열 가이드 DNA 결합 단백질은 Cas12 단백질이거나 또는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas12 변이체이다.
Cas12 단백질은 Cpf1라고도 칭하고 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium)의 Cpf1(LbCpf1), 아시다미노코커스(Acidaminococcus)의 Cpf1(AsCpf1) 및 프란시셀라노비시다(Francisella novicida)의 Cpf1(FnCpf1) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 세균으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas12 단백질은 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하도록 개조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 상기 REST 단백질의 N-말단 억제 도메인이 상기 DNA 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 상기 REST 단백질의 C-말단 억제 도메인이 상기 DNA 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결된다.
일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 상기 DNA 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 직렬로 연결된 적어도 하나의 상기 REST의 N-말단 억제 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 상기 DNA 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 직렬로 연결된 적어도 하나의 상기 REST의 C-말단 억제 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 25-27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드
다른 일 측면에서, 본 출원은 본 출원에 기재된 융합 단백질, 조성물 또는 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
폴리뉴클레오티드로서, 이는 본 출원에 기재된 단백질 복합체를 코딩한다.
일부 실시양태에서, 여기서 DNA 결합 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 단편 및 하나 이상의 REST 억제 도메인의 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 여기서 상기 제1 폴리뉴클레오티드 단편과 제2 폴리뉴클레오티드 단편은 자가 절단 가능한 제3 뉴클레오티드 단편을 통해 연결된다.
다른 일 측면에서, 본 출원은 본 출원에 기재된 바와 같은 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 세포에 전달하는 단계를 포함하는, 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 DNA 결합 단백질은 상기 표적 유전자 또는 이의 조절 서열에 결합하여 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
다른 일 측면에서, 본 출원은 본 출원에 기재된 바와 같은 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상기 개체에 전달하는 단계를 포함하는, 개체에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 DNA 결합 단백질은 상기 표적 유전자 또는 이의 조절 서열에 결합하여 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 DNA 결합 단백질은 CRISPR-Cas 단백질 또는 이의 변이체이다.
일부 실시양태에서, 상기 CRISPR-Cas 단백질 변이체는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 상기 서열 가이드 DNA 결합 단백질은 Cas9 단백질이거나 또는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas9 변이체이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 표적 유전자 또는 이의 조절 서열의 표적 영역과 상보적인 표적 서열 및 상기 DNA 결합 단백질에 결합하는 서열을 포함하는 가이드 RNA를 상기 세포 또는 상기 개체에 전달하는 단계를 추가로 포함한다.
실시예
일반적인 방법
동물 윤리:
본 연구에서 동물의 사육 및 사용은 중국과학원 뇌과학 및 지능기술 우수센터 생물의학 연구윤리위원회의 지도하에 완료되었다.
플라스미드 구축:
본 연구에 사용된 플라스미드는 모두 자체 실험실에서 구축하였으며, AAV 백본 벡터를 제한 효소로 절단하고 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 백본 벡터를 회수하였다. 삽입된 DNA 단편은 세포 cDNA를 탬플릿으로 하여 PCR, 아가로스 겔 전기영동을 수행한 후 회수한PCR 단편이다. 백본 벡터와 단편을 연결하기 위해 Novozym Biotechnology Co., Ltd.의 ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(Vazyme, C113-02)를 사용하였다. 연결한 후, DH5a 대장균으로 전환을 수행하고 플레이를 코팅하였다. 다음날, 단일 클론을 선별하여 감정하고, 양성 클론을 시퀀싱하고, 완전히 정확하게 시퀀싱된 클론은 확장 배양하고 플라스미드를 추출하였다.
마우스 뇌에 AAV 주사:
본 연구에 사용된 AAV 혈청형은 AAV8이다. Reward 입체 정위 주사 시스템을 이용하여 정위 주사(C57BL/6 또는 Dat-Cre:Ai9 마우스, 연령이 2개월 초과)를 수행하였다. AAV-GFAP-RZFD-V1, AAV-GFAP-RZFD-V2 및 AAV-GFAP-RZFD-V3의 역가는 5×1012vg/ml(주사당 1-3μl)보다 크다. AAV를 선조체(AP+0.8mm, ML±1.6mm 및 DV-2.8mm) 또는 흑색질(AP-3.0mm, ML±1.25mm 및 DV-4.5mm)에 주입하였다.
마우스 조직의 면역형광 염색:
주사 후 2주와 주사 후 1.5-2개월에 채취하고 절편화하여 면역형광 염색을 수행하였다. 마우스에게 생리식염수와 4% PFA를 관류시킨 후 뇌를 취하고 4% 파라포름알데히드(PFA)로 밤새 고정시킨 다음 조직이 용액 바닥에 가라앉을 때까지 30% 수크로스에서 적어도 12시간 이상 탈수시켰다. OCT로 임베딩한 후 냉동시켜 절편하고, 절편 두께는 30μm 또는 40μm이다. 면역형광 염색 전에 뇌 절편을 0.1M 인산염 완충액(PBS)으로 매번 5-10분 동안 3회 세척하였다. 1차 항체를 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후 PBS로 매번 10-15분 동안 3-4회 세척하였다. 그 다음, 항체 희석액으로 희석한 후의 2차 항체를 첨가하여 인큐베이션을 수행하고 실온에서 2-3시간 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션이 끝난 후 다시 PBS로 10-15분 동안 3-4회 세척하였다. 마지막으로 슬라이드를 항형광 담금질 장착 매체(Life Technology)를 사용하여 장착하고 보존하였다.
항체:
이 연구에 사용된 1차 항체는 네덜란드 돼지 항-NeuN(1:500, ABN90, Millipore), 토끼 항-TH(1:500, AB152, Millipore), 래트 항-DAT(1:100, MAB369, Millipore), 토끼 항-RBPMS(Proteintech, Cat# 15187-1-AP) 및 마우스 항-Flag(1:2000, F3165, Sigma)를 포함한다. 이 연구에 사용된 2차 항체는 Cy5-AffiniPure 당나귀 항-기니피그 IgG(H+L)(1:500, 706-175-148, Jackson ImmunoResearch), Alexa Fluora-488 AffiniPure Donkey 항-토끼 IgG(H+L)(1:500, 711-545-152, Jackson ImmunoResearch), Alexa Fluora-488 AffiniPure 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)(1:500, 715-545-150, Jackson ImmunoResearch) 및 Cy5 AffiniPure 당나귀 항-토끼 IgG(H+L)(1:500, 711-175-152, Jackson ImmunoResearch)이다.
6-OHDA PD 마우스 모델
본 실험에 사용된 마우스는 성년 C57BL/6 마우스(7-10주)이다. 마취 30분 전에 25mg/kg의 데시프라민 염산염(D3900, Sigma-Aldrich)을 복강 내로 주사하였다. 마취 후, 3μg의 6-OHDA(H116, Sigma-Aldrich) 또는 생리식염수를 마우스의 오른쪽 내측 전뇌 다발에 전후 부위(A/P)=-1.2mm, 내측-외측(M/L)=-1.1mm, 배측(D/V)=-5mm 주사하였다. 수술 1시간 후, 마우스에게 4% 포도당-식염수 용액 1ml를 피하 주사하였다.
아포모르핀 유도된 회전 시험
시험 10분 전에 마우스에게 0.5mg/kg의 아포모르핀(A4393, Sigma-Aldrich)을 복강 내 주사하였다. 시험 동안, 마우스를 각각 불투명한 원통(직경 30cm) 안에 방치하고 그 위에 있는 비디오 카메라로 20분 동안 행위를 기록하였다. 회전은 한쪽 뒷발을 중심으로 하고 머리 방향에 변화가 없는 전신 회전으로 정의하였다. 주사를 맞은 쪽과 반대쪽의 회전 수를 통계하고 20분 동안 반대쪽 반전 횟수로 데이터를 정량화하였다.
실린더 시험
마우스를 유리 비이커(1000ml)에 조심스럽게 넣고 이 앞에 비디오 카메라로 마우스의 행위를 10분 동안 기록하였다. 주사를 맞은 쪽과 반대쪽의 앞발이 벽에 접촉한 수를 각각 계산하여 데이터를 벽에 접촉한 전체 수에 대한 동측 벽에 접촉한 수의 비율로 정량화하였다.
로타로드 시험
마우스를 2일 동안 훈련시키고, 3일째에 행위 시험를 수행하였다. 1일째, 마우스는 로타로드에서 4바퀴/분의 고정 속도로 매회 300초 동안 4회 훈련시켰다. 2일째 마우스를 4-40바퀴/분의 가속 방식으로 4회 훈련시켰다. 3일째 4-40바퀴/분의 방식으로 4회 행위 시험를 수행하였다. 마우스가 떨어지기 전 막대에 머무른 시간을 체류기간으로 기록하고, 3개의 가장 긴 체류기간의 평균 값을 사용하여 분석하였다.
NMDA 모델링:
손상된 망막에서 RGC가 재생될 수 있는지 연구하기 위해 PBS에 200mM의 NMDA 용액을 배합하고, 유리체내 주사를 통해 1.5μl의 NMDA 용액을 4-8주령의 Ai9 마우스 또는 5-6주령의 C57BL/6 마우스 눈에 주사하였다(VEP 및 흑백 장면 선호도 시험용). NMDA 주사 2-3주 후에 GFAP-GFP-Cre는 GFAP-CasRx-REST 또는 GFAP-CasRx와 함께 망막하 주사를 통해 망막에 공동 전달되었다. 손상된 망막의 기능적 구조(VEP 및 명암 상자 셔틀 실험)를 평가하기 위해 5주에서 12개월령의 마우스(C57BL/6)에 NMDA를 주사하여 망막 손상을 유도하고 주사 2-3주 후 망막 하에 GFAP-mCherry(0.1μl) 및 PBS(0.9μl) 또는 GFAP-RZFD-V1(0.9μl)/GFAP-RZFD-V2(0.9μl)/GFAP-RZFD-V3(0.9μl) 혼합물을 주사하였다.
망막하 AAV 주사
고역가(>1×1013vg/ml) AAV를 Olympus 현미경(Olympus, Tokyo, Japan) 하에 Hamilton 주사기(32G 바늘)를 사용하여 눈에 주사하였다. 손상되지 않은 망막에서 재프로그래밍을 확인하기 위해, 망막하 주사(Ai9 및 C57BL/6 마우스, 4 주에서 12개월 연령)를 통해 총 1μl의 GFAP-GFP-Cre(0.1ul)+pbs(0.9ul) 또는 GFAP-GFP-Cre(0.1μl) 및 GFAP-RZFD-V1(0.9μl)/GFAP-RZFD-V2(0.9μl)/GFAP-RZFD-V3(0.9μl)을 망막하에 주사하였다.
망막 채취 및 절편:
AAV 주사 1-3개월 후 눈, 시신경 및 뇌 조직을 채취하고, 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 2시간(눈 및 시신경) 또는 24시간(뇌) 동안 고정한 다음 30%의 수크로스 용액에서 2시간(눈) 또는 24시간(뇌) 동안 탈수시키고 시신경을 PBS로 직접 세척한 후 장착하여 관찰하였다. 그 다음, OCT를 사용하여 임베딩을 수행하고 눈 및 뇌를 30μm 두께로 절편하였다.
망막 면역형광 염색:
면역형광 염색에 사용되는 1차 항체는 토끼 항-RBPMS(1:500, 15187-1-AP, Proteintech), 마우스 항-Brn3a(1:100, MAB1585, Millipore), 토끼 항-Sox9(1:500, AB5535, Millipore), 토끼 항-Prox1(1:500, AB5475, Millipore), 토끼 항-Pax6(1:500, 901301, Biolegent)이다. 2차 항체는 Cy??5 AffiniPure 당나귀 마우스 항-IgG(H+L)(1:500, 715-175-150, Jackson ImmunoResearch) 및 Cy TM 5 AffiniPure 당나귀 토끼 항-IgG(H+L)(1:500, 711-175-152, Jackson ImmunoResearch)이다. 1차 항체를 4℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, PBS로 매번 10분 동안 3회 세척하였다. 2차 항체를 실온에서 2-3시간 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 매번 10분 동안 3회 세척하였다. 마지막으로, 슬라이드를 항형광 담금질제로 장착(Life technology)하고, Olympus FV3000 현미경을 사용하여 이미지화하였다.
통계 분석:
오차선은 s.e.m.에 의해 설정되고, 통계학적 유의성(p<0.05)은 비-쌍 양측 t 검사 또는 단일요소 분산분석을 통해 계산되었다. 모든 실험은 무작위로 작성하고, 샘플의 양을 미리 결정하기 위해 통계적 방법을 사용하지 않았다. 데이터는 정규 분포가 가정되지만 공식적으로 검사되지 않았다. 데이터 수집과 분석은 맹목적인 실험 조건 하에서 수행하지 않았다.
실시예 1. RE1을 표적으로 하는 도구 구축
RE1에 대한 조절을 구현하기 위해 REST가 RE1에 결합할 수 있는 특징을 이용하여, 이의 내인성 아연 핑거 단백질(ZF)의 RE1 결합 도메인을 발굴하여 RE1을 조절하였으며, RZFD(REST Zinc Finger Domain)(SEQ ID NO: 1)라고 칭하였다. 도메인 예측 및 단백질 구조 모델링을 통해 인간 REST 단백질의 159-412번째에 8개의 아연 핑거 단백질 도메인이 포함되어 있음을 발견하였다(도 1A). RE1에 의해 제어하는 신경 관련 단백질의 발현을 추가로 조절하기 위해, 유전자 발현 조절 인자 VP64(SEQ ID NO: 7) 또는 P65-HSF1(SEQ ID NO: 11)을 RZFD의 C-말단에 융합시켜 RZFD-VP64 및 RZFD-P65-HSF를 구축하였다(도 1A). VP64 및 P65-HSF는 RE1 근처에 전사 인자 및 히스톤 아세틸화 등 단백질을 모집할 수 있고, RE1 근처의 염색체 구조를 조절함으로써, 이에 의해 제어하는 유전자가 발현될 수 있도록 한다. RZFD 시스템을 추가로 최적화하기 위해, RZFD(SEQ ID NO: 15)를 코돈 최적화하여 포유동물 세포에서 RZFD의 발현 양을 향상시키고, 이와 동시에 RZFD의 양단에 bpNLS 서열을 각각 추가하여 이의 핵 진입 효율을 증강시키고, 이 버전을 RZFDmax로 명명하였다(도 1A). 비뉴런(예를 들어, 교세포)에서, REST 복합체를 RE1에 결합하고, 복합체에서 히스톤 탈아세틸화효소와 메틸라제의 작용 하에, RE1 근처의 염색질을 치밀 상태로 변화시키고, 뉴런 관련 유전자 발현을 폐쇄하였다(도 1B). 비뉴런 세포(예를 들어: 교세포)에서 RZFD, RZFD-VP64 또는 RZFD-P65-HSF1, RZFD, RZFD-VP64 또는 RZFD-P65-HSF1은 RE1에 경쟁적으로 결합을 발현하고, REST 침묵 복합체와 RE1의 결합을 방지하였다(도 1C, D 및 E). RZFD의 메커니즘은 RE1과의 경쟁적 결합을 통해 이루어지며, RZFD-VP64 및 RZFD-P65-HSF1은 RE1에 경쟁적으로 결합할 수 있을 뿐만 아니라 RE1 근처에 있는 염색체 상태를 추가로 변경시켜 이에 의해 조절되는 신경 관련 유전자의 발현을 촉진할 수 있다.
실시예 2. 유전자 발현 억제 시스템 구축
REST 단백질의 N-단(SEQ ID NO: 16) 및 C-단(SEQ ID NO: 18)은 다양한 후성유전학적 조절 요소를 모집하는 기능을 갖음으로써, REST 표적 유전자의 발현을 조절하는 것을 구현하게 된다. N-단과 C-단이 표적 유전자 발현을 억제하는 능력을 연구하기 위해, 여러 다른 억제 시스템을 구축하고 293T 세포에서 Ptbp1의 표적 억제 효율을 시험하였다(도 1F-K). 동시에, 알려진 유전자 발현 억제 도메인 Krab(SEQ ID NO: 28)의 억제 효율을 비교하기 위해, dCas9-Krab(SEQ ID NO: 23) 및 dCas9-3×Krab(SEQ ID NO: 24) 시스템도 구축하였다. dCas9-Krab은 세포에 진입한 후, sgRNA의 가이드 하에 내인성 유전자 발현 조절 영역에 결합함으로써 표적 유전자의 발현을 억제하는 목적을 달성하게 된다. 단일 N-단의 억제 효율, 여러 개의 직렬 연결된 N-단의 억제 효율, 및 동시에 도입된 N-단과 C-단의 억제 효율의 차이를 연구하기 위해, N-dCas9(SEQ ID NO: 25), 3×N-dCas9(SEQ ID NO: 26) 및 3×N-dCas9-3xC(SEQ ID NO: 27) 이러한 유형의 억제 시스템을 구축하였으며, Ptbp1을 표적으로 하는 sgRNA 가이드 하에 Ptbp1 발현을 억제하였다(도 1G-K). 각 시스템의 억제 효율을 시험하기 위해, 상이한 시스템을 293T 세포에 형질감염시키고, 유세포 분석법을 통해 형질감염된 양성 세포를 분류하고, 양성 세포에 대해 RT-qPCR을 수행하여 각 시스템의 Ptbp1에 대한 억제 효과를 검사하였다. N-dCas9와 dCas9-Krab의 표적 유전자에 대한 억제 효율은 유사하지만, 억제 효율이 모두 낮았다. 3×N-dCas9의 억제 효율도 높지 않았다. dCas9-3×Krab와 3×N-dCas9-3xC의 억제 효율은 비교적 높으며, 특히 3×N-dCas9-3xC의 억제 효율은 dCas9-3×Krab의 억제 효율보다 더 높았다(도 1L). 이러한 결과는 REST의 N-단과 C-단을 억제 시스템으로 구축하면 내인성 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있으며 후성유전학적 조절 도구 또는 유전자 발현 억제 도구로서 사용할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3. RZFD 및 RZFDmax에 의한 성상 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화
마우스 체내에서 교세포를 뉴런 세포로 전환분화를 구현시키기 위해 AAV 발현 벡터를 구축하였다. 성상 교세포를 특이적으로 표지하기 위해, AAV 발현 벡터에서 성상 교세포 특이적 촉진자 GFAP를 이용하여 형광 단백질 mCherry의 발현(GFAP-mCherry)을 구동하였고, 인간 RZFD도 GFAP 촉진자에 의해 구동되고(GFAP-RZFD, 여기서, RZFD의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1이고, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 2임), 성상 교세포에서 특이적으로 발현되었다(도 2A). 주사 후 2주 이상의 시간이 교세포를 뉴런 또는 도파민 뉴런으로의 전환분화를 유도할 수 있는지 검사하기 위해, 각각 AAV를 주사 후 2주 또는 1.5개월에 채취하여 뉴런 특이적 마커 NeuN 및 도파민 뉴런의 특이적 마커 티로신 히드록실라제(약칭 TH)로 염색하였다(도 2B). 8주령의 C57 마우스의 선조체 또는 흑색질에 GFAP-mCherry+GFAP-RZFD를 발현하는 AAV를 주사하여 실험 그룹으로 하거나, GFAP-mCherry를 발현하는 AAV를 단독으로 주사하여 대조 그룹으로 하였다(도 2C). 이전의 연구에서, 주사 후 1주부터 주사 후 3개월 후, 대조 그룹에서는 뉴런이 생성되지 않은 것으로 나타났다. 이전의 연구 결과와 일치하고, 대조 그룹에 AAV를 주사한 2주 후에 뉴런의 생성을 관찰하지 못하였다(도 2D). 실험 그룹에서 주사 후 2주에 일부 세포가 변형되기 시작하고 소 부분적 교세포가 뉴런 특이적 마커 NeuN을 발현하기 시작함을 발견하였다(도 2E). 이는 성상 교세포에서 RZFD를 발현하는 것은 성상 교세포를 뉴런으로 전환분화시키는 잠재력이 있음을 나타낸다. GFAP-mCherry+GFAP-RZFD를 발현하는 혼합 AAV 바이러스를 주사한 지 1.5개월 후에 분석하여, mCherry+NeuN + 이중 양성 세포가 대량으로 발견된 반면, 대조 그룹에서는 mCherry+NeuN+ 이중 양성 세포가 나타나지 않았으며, 이는 RZFD가 고효율로 성상 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음을 나타낸다. 이와 동시에, 도파민 뉴런을 검사하는 특정 마커 TH를 이용하여, 일부 mCherry 양성 세포에서 TH의 발현이 증강되어 뉴런을 형성함을 발견했으며, 이는 RZFD가 성상 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음을 나타낸다(도 2F). RZFDmax가 성상 교세포를 뉴런 및 도파민 뉴런으로 전환분화시키는 효율을 추가로 증강시킬 수 있는지 연구하기 위해, GFAP-mCherry+GFAP-RZFDmax의 혼합 AAV 바이러스를 마우스의 선조체에 주사하고 이의 전환분화 효율을 분석하였다. GFAP-mCherry+GFAP-RZFDmax를 주사한 마우스의 선조체에서는 많은 수량의 TH 양성 뉴런을 발견하였다(도 2G). GFAP-RZFD 그룹 및 GFAP-RZFDmax 그룹의 통계 분석을 통해, GFAP-RZFDmax 그룹에서 생성된 TH 양성 뉴런 수량이 GFAP-RZFD 그룹보다 유의하게 더 많다는 것을 발견하였다(도 2H). 이러한 결과는, GFAP-RZFD와 GFAP-RZFDmax는 모두 성상 교세포가 뉴런 및 도파민 뉴런으로 전환분화되도록 유도할 수 있으며, GFAP-RZFDmax가 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화되도록 유도하는 효율이 더 높다는 것을 나타낸다.
실시예 4. RZFD에 의해 성상 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시켜 파킨슨병 마우스 모델의 질환 증상을 감소
마우스 파킨슨병 마우스 모델에서 GFAP-RZFD가 파킨슨병 마우스의 질환 증상을 완화시킬 수 있는지 추가로 탐구하기 위해, 먼저 Dat-Cre:Ai9 마우스 MFB에 6-OHDA를 주사하여 모델링하였다. 그 다음, 대조 그룹과 시험 그룹 AAV를 모델링된 마우스의 선조체(약칭:ST) 또는 흑색질(Nigra)에 주사하고, 주사 후 1.5-3개월에 분석하였다(도 3A). Dat-Cre:Ai9는 도파민 뉴런을 특이적으로 표지할 수 있으며, 도파민 뉴런만이 tdTomato 양성으로 표지된다. 일반적으로, 마우스 선조체에는 양성 세포가 없으며, 도파민 뉴런으로 전환분화되는 신경교세포가 있는 경우 적색으로 표지된다. 대조 그룹에는 GFAP-EGFP를 발현하는 AAV를 주사하였고, EGFP 녹색 형광 신호는 성상 교세포에서 특이적으로 발현되었으며, 이러한 세포는 전형적인 성상 교세포의 형태를 유지하였고, 적색형광 하에 적색 신호가 발견되지 않았고, TH 양성 세포도 발견되지 않았으며, 이는 GFAP-EGFP 대조 그룹에는 전환분화에 의해 생성된 도파민 뉴런이 없음을 나타낸다(도 3B). GFAP-EGFP+GFAP-RZFD를 주사한 실험 그룹에서는, 일부 EGFP 양성 세포가 뉴런 형태로 분화되었으며, 일부 tdTomato 양성 세포가 대량으로 나타난 것으로 관찰되었으며, TH 염색은 이러한 tdTomato 양성 세포가 Th와 동일한 위치에 있음을 나타낸다(도 3C). 이는, Dat-Cre:Ai9 마우스에서 RZFD를 과발현하는 것은 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음을 나타낸다. 이러한 전환분화된 뉴런은 마우스 파킨슨병 모델의 질환 증상을 완화시킬 수 있는지 여부를 추가로 시험하기 위해, 마우스에 대해 로타로드 시험, 실린더 실험 시험 및 약물에 의해 유도된 회전 행위 시험를 수행하였다(도 3D-G). 로타로드 시험에서, 대조 그룹 마우스는 약 120s를 유지할 수 있는 반면, 치료된 마우스는 약 180s를 유지할 수 있었다(도 3D). 실린더 시험에서, 치료 그룹의 마우스가 앞발을 사용한 균형성은 대조 그룹보다 유의하게 우수하였다(도 3E). 약물에 의해 유도된 회전 행위 시험에서, 치료 그룹의 회전 행위는 대조 그룹에 비해 유의하게 감소되었다(도 3F 및 3G). 이러한 결과는, 전환분화를 통해 얻어진 도파민 뉴런이 파킨슨병 마우스 모델의 질환 증상을 유의하게 완화시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 5. RZFD-VP64 및 RZFD-P65-HSF1이 성상 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화
RE1 뉴런 관련 유전자의 발현에 대한 조절을 추가로 연구하기 위해, RZFD-VP64(GFAP-RZFD-V2으로 표시되고, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 5, 핵산 서열 SEQ ID NO: 6) 및 RZFD-P65-HSF1(GFAP-RZFD-V3으로 표시되고, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 9, 핵산 서열 SEQ ID NO: 10)의 AAV 발현 벡터를 구축하였다(도 4A). 교세포 특이적 촉진자 GFAP의 구동 하에 RZFD-VP64 및 RZFD-P65-HSF1을 발현한다. C57 마우스의 선조체 또는 흑색질에 GFAP-mCherry+GFAP-RZFD-VP64의 혼합 AAV를 주사하고, 주사 후 1.5개월에 채취하여 분석하였다(도 4B). GFAP-RZFD-VP64를 주사한 그룹에서 적색 형광으로 표지된 세포의 대부분이 뉴런 특이적 마커 NeuN을 발현하는 동시에, 일부 세포는 도파민 뉴런 특이적 마커 TH(도 4C)도 발현함을 발견하였다. DAT-Cre:Ai9 마우스의 선조체 또는 흑색질에 유사한 AAV 주사를 수행하고, GFAP-RZFD-P65-HSF1을 마우스의 선조체 또는 흑색질에 주사하고, 1.5개월 후에 채취하여 분석하였다(도 4D). DAT-Cre:Ai9 마우스에서는 성숙한 도파민 뉴런만 표지될 수 있는 반면, 연구에서는 대조 그룹 마우스의 선조체에 적색 형광으로 표지된 세포가 없음을 발견하였다. GFAP-RZFD-P65-HSF1을 주사한 DAT-Cre:Ai9 마우스의 선조체에는 적색 세포가 생성되었으며, NeuN 및 TH 염색에 걸쳐, 이러한 적색 형광 신호가 있는 세포가 뉴런 특이적 마커 NeuN를 발현하고 동시에 또한 도파민 뉴런 특이적 마커 TH를 발현하는 것을 발견하였다.(도 4E). 이는 교세포에서 RZFD-P65-HSF1을 발현하는 것은 성상 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 6. RZFD가 뮐러 교세포를 광수용체 세포와 망막 신경절 세포로 전환분화
마우스 망막에서 RZFD의 역할을 연구하기 위해, NLS-RZFD-V1(SEQ ID NO: 3)을 발현하는 AAV를 마우스의 망막하에 주사하여, RZFD가 망막에 있는 뮐러 교세포를 기타 유형의 세포로 전환분화시킬 수 있는지 여부를 탐구하였다. Ai9 마우스에서, GFAP-EGFP-2A-Cre를 발현하는 AAV를 망막하에 주사하는 방식으로 마우스의 눈에 전달하였다. 여기서, GFAP-EGFP-2A-Cre는 뮐러 교세포를 표지하는 데 사용되며, GFAP 촉진자의 작용 하에, Cre가 뮐러 교세포에서 특이적으로 발현되어 Ai9 마우스의 LSL 서열을 풀어 Ai9 마우스의 뮐러 교세포를 표지하는 역할을 달성하게 되었다(도 5A). 먼저, Ai9 마우스에 대해 NMDA 모델링을 수행하고, 모델링한 후 AAV를 주사하였다. 대조 그룹에서는, GFAP-EGFP-2A-Cre를 주사한 후, 표지된 뮐러 교세포에 뚜렷한 변형이 없었고, 뮐러 교세포 이외의 표지된 기타 세포가 관찰되지 않았다(도 5B). NLS-RZFD-V1을 발현하는 AAV를 주사한 그룹(즉, GFAP-RZFD)에서는, 외부 과립 세포층에서 tdTomato 양성 광수용체 세포가 관찰되었으며, 많은 뮐러 교세포가 변형되었음을 관찰하였다(도 5C). 광수용체 세포의 특이적 단백질 마커 Rhodopsin과 Cone arrestin을 이용하여 염색하고, 외부 과립층에 위치한 tdTomato 양성 세포가 로돕신 또는 Cone arrestin(즉, MCAR)과 공동 표지되었음을 발견하였다(도 5H 및 5I). 이는 뮐러 교세포에서 RZFD를 과발현하는 것은 RZFD를 광수용체 세포로 전환분화시킬 수 있음을 나타낸다. 광수용체 세포 수량에 대한 통계에 따르면, 각 시야에서 광수용체 세포의 평균 수는 약 8개인 반면, 대조 그룹에서는 tdTomato 양성의 광수용체 세포가 거의 관찰되지 않았다(도 5J). RZFD를 과발현하는 것은 뮐러 교세포를 망막 신경절 세포로 전환분화시킬 수 있는지 여부를 검사하기 위해, 주사한 후의 마우스 시신경을 취하여 전체 조직을 장착하여 스캔하고, 대조 그룹에는 tdTomato 양성 축색이 거의 없고, 실험 그룹에는 대량의 tdTomato 양성 축색이 있음을 발견하였다(도 5D 및 5E). Rbpms로 망막을 추가로 염색하고, 대조 그룹에서는 tdTomato 양성 세포가 모두 내부 과립 세포층에 위치하고, 망막 신경절 세포층에는 tdTomato 양성 세포가 없는 반면, RZFD 과발현 그룹에서는 일부 tdTomato 양성 세포가 망막 신경절 세포층으로 이동하고 망막 신경절 세포의 특이적 단백질 마커 Rbpms와 공동 표지되었다(도 5F 및 5G). 시신경의 통계 분석을 수행하면, 각 시신경에서 tdTomato에 의해 표지된 축색이 50개 넘게 있음을 발견하였다(도 5K). 이는 뮐러 교세포에서 RZFD를 과발현하는 것은 뮐러 교세포를 망막 신경절 세포로 전환분화시킬 수도 있음을 나타낸다. 요약하면, RZFD 과발현은 뮐러 교세포를 망막 신경절 세포로 전환분화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 광수용체 세포로 전환분화시킬 수도 있다다.
실시예 7. miR-9 또는 miR-124의 과발현은 교세포를 뉴런으로 전환분화할 수 없음
이전의 연구에 따르면, Ptbp1을 녹다운하면 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시킬 수 있는 것을 나타내었다. Ptbp1을 녹다운하면 miR-124의 발현 양이 상향 조절될 수 있으나, miR-124는 REST 발현을 하향 조절하는 것으로 보고되었다. miR-124가 REST의 발현을 효과적으로 감소시킬 수 있는지 여부를 연구하기 위해, 293T 및 N2A 세포에서 miR-124(핵산 코딩 서열 SEQ ID NO: 31)을 과발현시켜 miR-124 과발현이 REST 단백질의 발현을 효과적으로 감소시킬 수 있는지 여부를 검증하였다.
AAV 벡터를 이용하여, 조직 특이적 촉진자 GFAP를 사용하여 miR-124 pri-miRNA(SEQ ID NO: 34에 제시된 바와 같음)의 발현을 구동하고, pri-miRNA가 발현된 후 세포 내에서 pre-miRNA(SEQ ID NO: 33에 제시된 바와 같음)로 가공되고, 최종적으로 성숙된 miRNA(SEQ ID NO: 31 및 SEQ ID NO: 32)로 가공됨으로써 조직 특이적으로 miR-124를 발현시키는 것을 구현하게 되었다. 실험 결과에 따르면, miR-124 과발현은 REST의 발현을 효과적으로 감소시키지 못하는 것으로 나타났다.
추가 연구를 위해, 교세포에서 동일한 방법을 통해 유사한 AAV 벡터를 이용하여 조직 특이적 촉진자 GFAP로 miR-124의 과발현을 구동하여, 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있는지 여부를 검증하였다. 주사한 후의 마우스 뇌 절편을 분석하고, miR-124 과발현은 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 없는 것으로 나타났다(도 6A-D). 대조 그룹에서, 적색 형광 신호 mCherry는 교세포에서 발현되었으며 뉴런 특이적 마커 NeuN과 공동 표지되지 않았고, 선조체에는 TH 양성 뉴런도 없었다(도 6C). 따라서, miR-124를 상향 조절하는 것만으로는 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시키는 데 충분하지 않다.
이전의 연구에서, 또한 Ptbp2는 miR-9의 발현을 조절을 통해 체외에서 배양된 섬유 아세포를 뉴런으로 전환분화시키는 것을 촉진할 수 있음을 나타냈다. miR-9 과발현은 체외에서 분화된 뉴런의 성숙을 촉진할 수 있다. miR-9의 과발현이 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시키는 것을 효과적으로 촉진할 수 있는지 여부를 연구하기 위하여, GFAP-miR-9를 과발현하는 AAV 벡터를 구축하였고, 이를 AAV를 통해 마우스 선조체에 전달하고, GFAP 촉진자의 작용 하에, miR-9 pri-miRNA(SEQ ID NO: 38에 제시된 바와 같음)가 교세포에서 특이적으로 발현되고, miR-9 pri-miRNA는 발현된 후 세포 내에서 pre-miRNA(SEQ ID NO: 37에 제시된 바와 같음)로 가공되고, 최종적으로 성숙된 miRNA(SEQ ID NO: 35 및 SEQ ID NO: 36)로 가공됨으로써, miR-9를 조직 특이적으로 발현시키는 것을 구현하게 된다. 동시에, GFAP-mCherry를 이용하여 선조체의 성상 교세포를 표지한다.
절편 염색 분석을 통해, miR-9 과발현은 교세포를 뉴런으로 전환분화시키는 것을 촉진할 수 없는 것으로 나타났다. miR-124와 유사하게, 교세포는 형태학적으로 변화하였지만 miR-9 또는 miR-124 과발현은 성상 교세포를 뉴런 또는 도파민 뉴런으로 전환분화시킬 수 없었다.
실시예 8. miR-9 및 miR124의 공동 과발현은 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음
이전의 체외 연구에 따르면, miR-124와 miR-9의 공동 과발현은 줄기 세포를 뉴런으로 분화시키는 것을 촉진할 수 있는 것으로 나타났으며 miR-124와 miR-9의 공동 과발현이 교세포를 뉴런으로 전환분화시키는 것을 촉진할 수 있는지 여부를 연구하기 위해, miR-9와 miR124를 GFAP 촉진자로 구동하고 이를 AAV로 포장하여 마우스 선조체에 주사하였다. 놀랍게도 miR-9와 miR124의 공동 과발현이 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있다는 것을 발견하였다(도 7E). 도파민의 특이적 단백질 마커 TH를 이용하여 추가 염색을 수행한 결과, miR-9와 miR124의 공동 과발현은 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있지만, 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시킬 수 없는 것으로 나타났다(도 7F).
실시예 9. CasRx를 사용한 Ctdsp1의 체외 특이적 녹다운
이전의 연구에 따르면, Ctdsp1(아미노산 서열 SEQ ID NO: 29, 핵산 서열 SEQ ID NO: 30)의 발현을 녹다운하면 체외에서 배양된 섬유 아세포를 뉴런으로 전환분화시키는 것을 촉진할 수 있는 것으로 나타났다. 이전의 연구에서는 shRNA 녹다운 방법을 채택하였다. CasRx에 의해 매개되는 RNA 편집 기술은 효율이 더 높고, 특이성이 더 강한 차세대 RNA 녹다운 기술이다. CasRx에 의해 매개되는 Ctdsp1 녹다운 효율을 확인하기 위해, 먼저 Ctdsp1을 표적으로 하는 gRNA를 디자인하고, gRNA가 표적으로 하는 영역은 Ctdsp1 유전자의 CDS 서열의 318-347번째이며, 배양하고 있는 인간 293T 및 마우스 N2A 세포에서 이들의 억제 효율을 비교하였다. 대조 그룹 세포에 형질감염된 플라스미드는 CAG-CasRx-P2A-GFP 및 U6-nontarget-CMV-mCherry이고, 실험 그룹에 형질감염된 플라스미드는 CAG-CasRx-P2A-GFP 및 U6-gRNA(Ctdsp1)-CMV-mCherry이다. 형질감염된 후, 양성 세포를 유세포 분석법으로 분류하고, QPCR 분석을 수행하였다. 결과에 따르면 Ctdsp1 mRNA를 표적으로 하는 gRNA 및 CasRx 공동 형질감염이 인간 293T 및 마우스 N2A 세포에서 Ctdsp1의 발현을 고효율적으로 녹다운할 수 있음을 나타냈다(도 8).
실시예 10. 성상 교세포에서 Ctdsp1의 녹다운은 도파민 뉴런을 생성하지 못하지만 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음
성상 교세포에서 Ctdsp1을 녹다운하면 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있는지 여부를 체내에서 추가로 연구하기 위해, GFAP-CasRx-gRNA(Ctdsp1)를 구축함과 동시에, gRNA를 함유하지 않는 AAV 벡터 GFAP-CasRx를 대조로 하고, 교세포를 GFAP-mCherry로 표지하였다(도 9A). AAV 바이러스를 주사한 후 1-2개월에 전단하여 분석한 결과, 대조 그룹에서 GFAP-mCherry로 표지된 성상 교세포는 여전히 전형적인 교세포 형태를 유지하였으며, 뉴런 특이적 마커 NeuN와 공동 표지되지 않은 것으로 나타났다(도 9B). 반대로 Ctdsp1 녹다운 그룹에서는, 적색 형광 신호로 발현되는 일부 세포가 NeuN을 발현하는 것으로 발견하고, 이는 Ctdsp1 녹다운이 성상 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 있음을 나타냈다(도 9C). 처음으로, 체내 환경에서 Ctdsp1은 성상 교세포를 뉴런으로 전환분화시키기 위한 표적으로 작용할 수 있다는 것을 입증하였다. 도파민의 특이적 단백질 마커 TH를 사용하여 추가 염색한 결과, Ctdsp1을 녹다운하면 체내에서 성상 교세포를 도파민 뉴런으로 전환분화시킬 수 없는 것으로 나타났다.
실시예 11. 망막에서 Ctdsp1의 녹다운 또는 miR-9 또는 miR-124의 과발현은 교세포를 광수용체 세포 또는 망막 신경절 세포로 전환분화시킬 수 없음
Ctdsp1의 녹다운 또는 miR-9 또는 miR-124의 과발현이 망막에 있는 뮐러 교세포를 망막 신경절 세포 또는 광수용체 세포로 전환분화시킬 수 있는지 여부를 연구하기 위해, GFAP-gRNA(Ctdsp1) 또는 miR-9 또는 miR-124 또는 miR-9+miR-124를 각각 Ai9 마우스의 망막에 주사함과 동시에, GFAP-EGFP-2A-Cre를 주사하여 뮐러 교세포를 표지하였고, 주사한 후 1-2개월에 분석한 결과, Ctdsp1의 녹다운 또는 miR-9 또는 miR-124 또는 miR-9+miR-124의 과발현은 뮐러 교세포를 망막 신경절 세포 또는 광수용체 세포로 전환분화시킬 수 없는 것으로 나타났다(도 10). 이러한 결과는, miR-9 또는 miR-124를 단독으로 과발현시키는 것만으로는 교세포를 뉴런으로 전환분화시킬 수 없는 반면, Ctdsp1의 녹다운 또는 miR-9+miR-124의 과발현은 대뇌에서 성상 교세포를 일반적인 뉴런으로 전환분화시킬 수 있으나, 도파민 뉴런, 광수용체 세포 및 망막 신경절 세포와 같은 특이적 유형의 뉴런을 생성할 수 없음을 나타냈다.
[01]
서열 정보
인간 RZFD 아미노산 서열(SEQ ID NO: 1)
KTKPFRCKPCQYEAESEEQFVHHIRVHSAKKFFVEESAEKQAKARESGSSTAEEGDFSKGPIRCDRCGYNTNRYDHYTAHLKHHTRAGDNERVYKCIICTYTTVSEYHWRKHLRNHFPRKVYTCGKCNYFSDRKNNYVQHVRTHTGERPYKCELCPYSSSQKTHLTRHMRTHSGEKPFKCDQCSYVASNQHEVTRHARQVHNGPKPLNCPHCDYKTADRSNFKKHVELHVNPRQFNCPVCDYAASKKCNLQYHFKSKHPTCPNKTM
인간 RZFD 코딩 서열(SEQ ID NO: 2)
aagaccaaaccctttcgctgtaagccatgccaatatgaagcagaatctgaagaacagtttgtgcatcacatcagagttcacagtgctaagaaattttttgtggaagagagtgcagagaagcaggcaaaagccagggaatctggctcttccactgcagaagagggagatttctccaagggccccattcgctgtgaccgctgcggctacaatactaatcgatatgatcactatacagcacacctgaaacaccacaccagagctggggataatgagcgagtctacaagtgtatcatttgcacatacacaacagtgagcgagtatcactggaggaaacatttaagaaaccattttccaaggaaagtatacacatgtggaaaatgcaactatttttcagacagaaaaaacaattatgttcagcatgttagaactcatacaggagaacgcccatataaatgtgaactttgtccttactcaagttctcagaagactcatctaactagacatatgcgtactcattcaggtgagaagccatttaaatgtgatcagtgcagttatgtggcctctaatcaacatgaagtaacccgccatgcaagacaggttcacaatgggcctaaacctcttaattgcccacactgtgattacaaaacagcagatagaagcaacttcaaaaaacatgtagagctacatgtgaacccacggcagttcaattgccctgtatgtgactatgcagcttccaagaagtgtaatctacagtatcacttcaaatctaagcatcctacttgtcctaataaaacaatg
NLS-RZFD-V1 아미노산 서열(SEQ ID NO: 3)
MPKKKRKVGSGKTKPFRCKPCQYEAESEEQFVHHIRVHSAKKFFVEESAEKQAKARESGSSTAEEGDFSKGPIRCDRCGYNTNRYDHYTAHLKHHTRAGDNERVYKCIICTYTTVSEYHWRKHLRNHFPRKVYTCGKCNYFSDRKNNYVQHVRTHTGERPYKCELCPYSSSQKTHLTRHMRTHSGEKPFKCDQCSYVASNQHEVTRHARQVHNGPKPLNCPHCDYKTADRSNFKKHVELHVNPRQFNCPVCDYAASKKCNLQYHFKSKHPTCPNKTM
NLS-RZFD-V1 뉴클레오티드 산 서열(SEQ ID NO: 4)
atgCCTAAAAAGAAAAGAAAGGTGGGTTCTGGTaagaccaaaccctttcgctgtaagccatgccaatatgaagcagaatctgaagaacagtttgtgcatcacatcagagttcacagtgctaagaaattttttgtggaagagagtgcagagaagcaggcaaaagccagggaatctggctcttccactgcagaagagggagatttctccaagggccccattcgctgtgaccgctgcggctacaatactaatcgatatgatcactatacagcacacctgaaacaccacaccagagctggggataatgagcgagtctacaagtgtatcatttgcacatacacaacagtgagcgagtatcactggaggaaacatttaagaaaccattttccaaggaaagtatacacatgtggaaaatgcaactatttttcagacagaaaaaacaattatgttcagcatgttagaactcatacaggagaacgcccatataaatgtgaactttgtccttactcaagttctcagaagactcatctaactagacatatgcgtactcattcaggtgagaagccatttaaatgtgatcagtgcagttatgtggcctctaatcaacatgaagtaacccgccatgcaagacaggttcacaatgggcctaaacctcttaattgcccacactgtgattacaaaacagcagatagaagcaacttcaaaaaacatgtagagctacatgtgaacccacggcagttcaattgccctgtatgtgactatgcagcttccaagaagtgtaatctacagtatcacttcaaatctaagcatcctacttgtcctaataaaacaatg
NLS-RZFD-V2의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 5)
MPKKKRKVGSGKTKPFRCKPCQYEAESEEQFVHHIRVHSAKKFFVEESAEKQAKARESGSSTAEEGDFSKGPIRCDRCGYNTNRYDHYTAHLKHHTRAGDNERVYKCIICTYTTVSEYHWRKHLRNHFPRKVYTCGKCNYFSDRKNNYVQHVRTHTGERPYKCELCPYSSSQKTHLTRHMRTHSGEKPFKCDQCSYVASNQHEVTRHARQVHNGPKPLNCPHCDYKTADRSNFKKHVELHVNPRQFNCPVCDYAASKKCNLQYHFKSKHPTCPNKTMGSGGGGSGGGGSRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLYID
NLS-RZFD-V2의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 6)
atgCCTAAAAAGAAAAGAAAGGTGGGTTCTGGTaagaccaaaccctttcgctgtaagccatgccaatatgaagcagaatctgaagaacagtttgtgcatcacatcagagttcacagtgctaagaaattttttgtggaagagagtgcagagaagcaggcaaaagccagggaatctggctcttccactgcagaagagggagatttctccaagggccccattcgctgtgaccgctgcggctacaatactaatcgatatgatcactatacagcacacctgaaacaccacaccagagctggggataatgagcgagtctacaagtgtatcatttgcacatacacaacagtgagcgagtatcactggaggaaacatttaagaaaccattttccaaggaaagtatacacatgtggaaaatgcaactatttttcagacagaaaaaacaattatgttcagcatgttagaactcatacaggagaacgcccatataaatgtgaactttgtccttactcaagttctcagaagactcatctaactagacatatgcgtactcattcaggtgagaagccatttaaatgtgatcagtgcagttatgtggcctctaatcaacatgaagtaacccgccatgcaagacaggttcacaatgggcctaaacctcttaattgcccacactgtgattacaaaacagcagatagaagcaacttcaaaaaacatgtagagctacatgtgaacccacggcagttcaattgccctgtatgtgactatgcagcttccaagaagtgtaatctacagtatcacttcaaatctaagcatcctacttgtcctaataaaacaatgGGTAGTGGCGGTGGTGGTTCAGGAGGCGGCGGAAGCCGCGCCGACGCGCTGGACGATTTCGATCTCGACATGCTGGGTTCTGATGCCCTCGATGACTTTGACCTGGATATGTTGGGAAGCGACGCATTGGATGACTTTGATCTGGACATGCTCGGCTCCGATGCTCTGGACGATTTCGATCTCGATATGTTATATATCGAT
VP64 아미노산 서열(SEQ ID NO: 7)
RADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLYID
VP64 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 8)
CGCGCCGACGCGCTGGACGATTTCGATCTCGACATGCTGGGTTCTGATGCCCTCGATGACTTTGACCTGGATATGTTGGGAAGCGACGCATTGGATGACTTTGATCTGGACATGCTCGGCTCCGATGCTCTGGACGATTTCGATCTCGATATGTTATATATCGAT
NLS-RZFD-V3 아미노산 서열(SEQ ID NO: 9)
MPKKKRKVGSGKTKPFRCKPCQYEAESEEQFVHHIRVHSAKKFFVEESAEKQAKARESGSSTAEEGDFSKGPIRCDRCGYNTNRYDHYTAHLKHHTRAGDNERVYKCIICTYTTVSEYHWRKHLRNHFPRKVYTCGKCNYFSDRKNNYVQHVRTHTGERPYKCELCPYSSSQKTHLTRHMRTHSGEKPFKCDQCSYVASNQHEVTRHARQVHNGPKPLNCPHCDYKTADRSNFKKHVELHVNPRQFNCPVCDYAASKKCNLQYHFKSKHPTCPNKTMGSGGGGSGGGGSRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLYIDDYKLGSGGGGSGGGGSPSGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPLAQPPAPAPVLTPGPPQSLSAPVPKSTQAGEGTLSEALLHLQFDADEDLGALLGNSTDPGVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVSMSHSTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGTSGLPNGLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISSSGQGGGGSGFSVDTSALLDLFSPSVTVPDMSLPDLDSSLASIQELLSPQEPPRPPEAENSSPDSGKQLVHYTAQPLFLLDPGSVDTGSNDLPVLFELGEGSYFSEGDGFAEDPTISLLTGSEPPKAKDPTVSPKKKRKV
NLS-RZFD-V3 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 10)
atgCCTAAAAAGAAAAGAAAGGTGGGTTCTGGTaagaccaaaccctttcgctgtaagccatgccaatatgaagcagaatctgaagaacagtttgtgcatcacatcagagttcacagtgctaagaaattttttgtggaagagagtgcagagaagcaggcaaaagccagggaatctggctcttccactgcagaagagggagatttctccaagggccccattcgctgtgaccgctgcggctacaatactaatcgatatgatcactatacagcacacctgaaacaccacaccagagctggggataatgagcgagtctacaagtgtatcatttgcacatacacaacagtgagcgagtatcactggaggaaacatttaagaaaccattttccaaggaaagtatacacatgtggaaaatgcaactatttttcagacagaaaaaacaattatgttcagcatgttagaactcatacaggagaacgcccatataaatgtgaactttgtccttactcaagttctcagaagactcatctaactagacatatgcgtactcattcaggtgagaagccatttaaatgtgatcagtgcagttatgtggcctctaatcaacatgaagtaacccgccatgcaagacaggttcacaatgggcctaaacctcttaattgcccacactgtgattacaaaacagcagatagaagcaacttcaaaaaacatgtagagctacatgtgaacccacggcagttcaattgccctgtatgtgactatgcagcttccaagaagtgtaatctacagtatcacttcaaatctaagcatcctacttgtcctaataaaacaatgGGTAGTGGCGGTGGTGGTTCAGGAGGCGGCGGAAGCCGCGCCGACGCGCTGGACGATTTCGATCTCGACATGCTGGGTTCTGATGCCCTCGATGACTTTGACCTGGATATGTTGGGAAGCGACGCATTGGATGACTTTGATCTGGACATGCTCGGCTCCGATGCTCTGGACGATTTCGATCTCGATATGTTATATATCGATGATTACAAGCTTGGTAGTGGCGGTGGTGGTTCAGGAGGCGGCGGAAGCCCTTCAGGGCAGATCAGCAACCAGGCCCTGGCTCTGGCCCCTAGCTCCGCTCCAGTGCTGGCCCAGACTATGGTGCCCTCTAGTGCTATGGTGCCTCTGGCCCAGCCACCTGCTCCAGCCCCTGTGCTGACCCCAGGACCACCCCAGTCACTGAGCGCTCCAGTGCCCAAGTCTACACAGGCCGGCGAGGGGACTCTGAGTGAAGCTCTGCTGCACCTGCAGTTCGACGCTGATGAGGACCTGGGAGCTCTGCTGGGGAACAGCACCGATCCCGGAGTGTTCACAGATCTGGCCTCCGTGGACAACTCTGAGTTTCAGCAGCTGCTGAATCAGGGCGTGTCCATGTCTCATAGTACAGCCGAACCAATGCTGATGGAGTACCCCGAAGCCATTACCCGGCTGGTGACCGGCAGCCAGCGGCCCCCCGACCCCGCTCCAACTCCCCTGGGAACCAGCGGCCTGCCTAATGGGCTGTCCGGAGATGAAGACTTCTCAAGCATCGCTGATATGGACTTTAGTGCCCTGCTGTCACAGATTTCCTCTAGTGGGCAGGGAGGAGGTGGAAGCGGCTTCAGCGTGGACACCAGTGCCCTGCTGGACCTGTTCAGCCCCTCGGTGACCGTGCCCGACATGAGCCTGCCTGACCTTGACAGCAGCCTGGCCAGTATCCAAGAGCTCCTGTCTCCCCAGGAGCCCCCCAGGCCTCCCGAGGCAGAGAACAGCAGCCCGGATTCAGGGAAGCAGCTGGTGCACTACACAGCGCAGCCGCTGTTCCTGCTGGACCCCGGCTCCGTGGACACCGGGAGCAACGACCTGCCGGTGCTGTTTGAGCTGGGAGAGGGCTCCTACTTCTCCGAAGGGGACGGCTTCGCCGAGGACCCCACCATCTCCCTGCTGACAGGCTCGGAGCCTCCCAAAGCCAAGGACCCCACTGTCTCCCCCAAGAAGAAGCGCAAGGTG
P65-HSF1 아미노산 서열(SEQ ID NO: 11)
PSGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPLAQPPAPAPVLTPGPPQSLSAPVPKSTQAGEGTLSEALLHLQFDADEDLGALLGNSTDPGVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVSMSHSTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGTSGLPNGLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISSSGQGGGGSGFSVDTSALLDLFSPSVTVPDMSLPDLDSSLASIQELLSPQEPPRPPEAENSSPDSGKQLVHYTAQPLFLLDPGSVDTGSNDLPVLFELGEGSYFSEGDGFAEDPTISLLTGSEPPKAKDPTVS
P65-HSF1 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 12)
CCTTCAGGGCAGATCAGCAACCAGGCCCTGGCTCTGGCCCCTAGCTCCGCTCCAGTGCTGGCCCAGACTATGGTGCCCTCTAGTGCTATGGTGCCTCTGGCCCAGCCACCTGCTCCAGCCCCTGTGCTGACCCCAGGACCACCCCAGTCACTGAGCGCTCCAGTGCCCAAGTCTACACAGGCCGGCGAGGGGACTCTGAGTGAAGCTCTGCTGCACCTGCAGTTCGACGCTGATGAGGACCTGGGAGCTCTGCTGGGGAACAGCACCGATCCCGGAGTGTTCACAGATCTGGCCTCCGTGGACAACTCTGAGTTTCAGCAGCTGCTGAATCAGGGCGTGTCCATGTCTCATAGTACAGCCGAACCAATGCTGATGGAGTACCCCGAAGCCATTACCCGGCTGGTGACCGGCAGCCAGCGGCCCCCCGACCCCGCTCCAACTCCCCTGGGAACCAGCGGCCTGCCTAATGGGCTGTCCGGAGATGAAGACTTCTCAAGCATCGCTGATATGGACTTTAGTGCCCTGCTGTCACAGATTTCCTCTAGTGGGCAGGGAGGAGGTGGAAGCGGCTTCAGCGTGGACACCAGTGCCCTGCTGGACCTGTTCAGCCCCTCGGTGACCGTGCCCGACATGAGCCTGCCTGACCTTGACAGCAGCCTGGCCAGTATCCAAGAGCTCCTGTCTCCCCAGGAGCCCCCCAGGCCTCCCGAGGCAGAGAACAGCAGCCCGGATTCAGGGAAGCAGCTGGTGCACTACACAGCGCAGCCGCTGTTCCTGCTGGACCCCGGCTCCGTGGACACCGGGAGCAACGACCTGCCGGTGCTGTTTGAGCTGGGAGAGGGCTCCTACTTCTCCGAAGGGGACGGCTTCGCCGAGGACCCCACCATCTCCCTGCTGACAGGCTCGGAGCCTCCCAAAGCCAAGGACCCCACTGTCTCC
BPNLS 아미노산 서열(SEQ ID NO: 13)
KRTADGSEFESPKKKRKV
BPNLS 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 14)
AAACGGACAGCCGATGGCAGCGAGTTCGAGAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTG
RZFD 코돈 최적화(SEQ ID NO: 15)
AAGACCAAGCCCTTCAGGTGTAAACCCTGCCAGTACGAGGCCGAGTCTGAGGAACAGTTTGTCCACCACATCAGAGTGCACAGCGCTAAGAAATTCTTCGTTGAGGAATCTGCCGAGAAGCAGGCCAAGGCCCGGGAAAGCGGCTCCAGTACAGCCGAAGAGGGCGACTTCAGCAAGGGCCCTATCCGGTGCGACAGATGTGGCTATAATACCAACAGATACGACCACTACACAGCGCACCTGAAGCACCACACCCGGGCCGGCGACAACGAGAGAGTGTACAAGTGCATCATCTGCACCTACACCACAGTGTCCGAGTACCACTGGCGGAAACATCTCAGAAACCACTTTCCAAGAAAGGTGTACACCTGCGGCAAGTGCAACTACTTCAGCGACCGGAAGAACAACTACGTGCAGCACGTGCGGACACACACCGGCGAGAGACCTTATAAGTGTGAACTGTGCCCTTACAGCAGCAGCCAGAAAACTCACCTGACCCGCCACATGAGAACCCATAGCGGAGAAAAGCCATTTAAGTGCGACCAGTGCAGCTACGTGGCCAGCAATCAACACGAGGTGACCAGACACGCCAGACAGGTGCACAACGGCCCTAAGCCTCTGAACTGTCCCCACTGCGACTACAAAACCGCCGATCGGAGCAACTTCAAGAAACACGTGGAACTGCACGTGAATCCTAGACAGTTCAACTGCCCCGTGTGCGATTACGCCGCCTCCAAGAAGTGTAACCTGCAATACCACTTCAAGAGCAAGCATCCTACATGCCCTAACAAGACCATG
인간 REST N-단 아미노산 서열(SEQ ID NO: 16)
MATQVMGQSSGGGGLFTSSGNIGMALPNDMYDLHDLSKAELAAPQLIMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNNFSDSEEGEGLEESADIKGEPHGLENMELR
인간 REST N-단 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 17)
atggccacccaggtaatggggcagtcttctggaggaggagggctgtttaccagcagtggcaacattggaatggccctgcctaacgacatgtatgacttgcatgacctttccaaagctgaactggccgcacctcagcttattatgctggcaaatgtggccttaactggggaagtaaatggcagctgctgtgattacctggtcggtgaagaaagacagatggcagaactgatgccggttggggataacaacttttcagatagtgaagaaggagaaggacttgaagagtctgctgatataaaaggtgaacctcatggactggaaaacatggaactgaga
인간 REST C-단 아미노산 서열(SEQ ID NO: 18)
MDEGIHSHEGSDLSDNMSEGSDDSGLHGARPVPQESSRKNAKEALAVKAAKGDFVCIFCDRSFRKGKDYSKHLNRHLVNVYYLEEAAQGQE
인간 REST C-단 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 19)
ATGgatgaaggcatccacagccatgaaggaagtgacctaagtgacaacatgtcagagggtagtgatgattctggattgcatggggctcggccagttccacaagaatctagcagaaaaaatgcaaaggaagccttggcagtcaaagcggctaagggagattttgtttgtatcttctgtgatcgttctttcagaaagggaaaagattacagcaaacacctcaatcgccatttggttaatgtgtactatcttgaagaagcagctcaagggcaggag
인간 REST 전장 아미노산 서열(SEQ ID NO: 20)
MATQVMGQSSGGGGLFTSSGNIGMALPNDMYDLHDLSKAELAAPQLIMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNNFSDSEEGEGLEESADIKGEPHGLENMELRSLELSVVEPQPVFEASGAPDIYSSNKDLPPETPGAEDKGKSSKTKPFRCKPCQYEAESEEQFVHHIRVHSAKKFFVEESAEKQAKARESGSSTAEEGDFSKGPIRCDRCGYNTNRYDHYTAHLKHHTRAGDNERVYKCIICTYTTVSEYHWRKHLRNHFPRKVYTCGKCNYFSDRKNNYVQHVRTHTGERPYKCELCPYSSSQKTHLTRHMRTHSGEKPFKCDQCSYVASNQHEVTRHARQVHNGPKPLNCPHCDYKTADRSNFKKHVELHVNPRQFNCPVCDYAASKKCNLQYHFKSKHPTCPNKTMDVSKVKLKKTKKREADLPDNITNEKTEIEQTKIKGDVAGKKNEKSVKAEKRDVSKEKKPSNNVSVIQVTTRTRKSVTEVKEMDVHTGSNSEKFSKTKKSKRKLEVDSHSLHGPVNDEESSTKKKKKVESKSKNNSQEVPKGDSKVEENKKQNTCMKKSTKKKTLKNKSSKKSSKPPQKEPVEKGSAQMDPPQMGPAPTEAVQKGPVQVEPPPPMEHAQMEGAQIRPAPDEPVQMEVVQEGPAQKELLPPVEPAQMVGAQIVLAHMELPPPMETAQTEVAQMGPAPMEPAQMEVAQVESAPMQVVQKEPVQMELSPPMEVVQKEPVQIELSPPMEVVQKEPVKIELSPPIEVVQKEPVQMELSPPMGVVQKEPAQREPPPPREPPLHMEPISKKPPLRKDKKEKSNMQSERARKEQVLIEVGLVPVKDSWLLKESVSTEDLSPPSPPLPKENLREEASGDQKLLNTGEGNKEAPLQKVGAEEADESLPGLAANINESTHISSSGQNLNTPEGETLNGKHQTDSIVCEMKMDTDQNTRENLTGINSTVEEPVSPMLPPSAVEEREAVSKTALASPPATMAANESQEIDEDEGIHSHEGSDLSDNMSEGSDDSGLHGARPVPQESSRKNAKEALAVKAAKGDFVCIFCDRSFRKGKDYSKHLNRHLVNVYYLEEAAQGQE*
dCas9 아미노산 서열(SEQ ID NO: 21)
MAKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG
dspCas9 아미노산 서열(SEQ ID NO: 22)
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
dCas9-Krab 아미노산 서열(SEQ ID NO: 23)
MKRTADGSEFESPKKKRKVMDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDAKRTADGSEFESPKKKRKVAAADYKDDMGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESLADYKDDDDK
dCas9-3xKrab 아미노산 서열(SEQ ID NO: 24)
MPKKKRKVGIHGVPAAKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGKRPAATKKAGQAKKKKGSGSGGGGSGGGGSMGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESLGGGGSMGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESLGGGGSMGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESLAAADYKDDDDK*
N-dCas9 아미노산 서열(SEQ ID NO: 25)
MPKKKRKVGIHGVPAAKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGKRPAATKKAGQAKKKKGSMATQVMGQSSGGGGLFTSSGNIGMALPNDMYDLHDLSKAELAAPQLIMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNNFSDSEEGEGLEESADIKGEPHGLENMELRGGGGSMATQVMGQSSGGGGLFTSSGNIGMALPNDMYDLHDLSKAELAAPQLIMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNNFSDSEEGEGLEESADIKGEPHGLENMELRGGGGSMATQVMGQSSGGGGLFTSSGNIGMALPNDMYDLHDLSKAELAAPQLIMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNNFSDSEEGEGLEESADIKGEPHGLENMELRGSGGGGSGGGGSAAADYKDDDDK*
3xN-dCas9 아미노산 서열(SEQ ID NO: 26)
MPKKKRKVGIHGVPAKKKKGSMATQVMGQSSGGGGLFTSSGNIGMALPNDMYDLHDLSKAELAAPQLIMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNNFSDSEEGEGLEESADIKGEPHGLENMELRGGGGSMATQVMGQSSGGGGLFTSSGNIGMALPNDMYDLHDLSKAELAAPQLIMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNNFSDSEEGEGLEESADIKGEPHGLENMELRGGGGSMATQVMGQSSGGGGLFTSSGNIGMALPNDMYDLHDLSKAELAAPQLIMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNNFSDSEEGEGLEESADIKGEPHGLENMELRGSGGGGSGGGGSAKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGKRPAATKKAGQAKKKKGSAAADYKDDDDK*
3xN-dCas9-3xC 아미노산 서열(SEQ ID NO: 27)
MPKKKRKVGIHGVPAKKKKGSMATQVMGQSSGGGGLFTSSGNIGMALPNDMYDLHDLSKAELAAPQLIMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNNFSDSEEGEGLEESADIKGEPHGLENMELRGGGGSMATQVMGQSSGGGGLFTSSGNIGMALPNDMYDLHDLSKAELAAPQLIMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNNFSDSEEGEGLEESADIKGEPHGLENMELRGGGGSMATQVMGQSSGGGGLFTSSGNIGMALPNDMYDLHDLSKAELAAPQLIMLANVALTGEVNGSCCDYLVGEERQMAELMPVGDNNFSDSEEGEGLEESADIKGEPHGLENMELRGSGGGGSGGGGSAKRNYILGLAIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEEASKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRKLINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYKNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPHIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKGKRPAATKKAGQAKKKKGSAGSGGGGSGGGGSMDEGIHSHEGSDLSDNMSEGSDDSGLHGARPVPQESSRKNAKEALAVKAAKGDFVCIFCDRSFRKGKDYSKHLNRHLVNVYYLEEAAQGQEGGGGSMDEGIHSHEGSDLSDNMSEGSDDSGLHGARPVPQESSRKNAKEALAVKAAKGDFVCIFCDRSFRKGKDYSKHLNRHLVNVYYLEEAAQGQEGGGGSMDEGIHSHEGSDLSDNMSEGSDDSGLHGARPVPQESSRKNAKEALAVKAAKGDFVCIFCDRSFRKGKDYSKHLNRHLVNVYYLEEAAQGQEAAADYKDDDDK*
Krab 아미노산 서열(SEQ ID NO: 28)
MGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESL
Ctdsp1의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 29)
MDSSAVITQISKEEARGPLRGKGDQKSAASQKPRSRGILHSLFCCVCRDDGEALPAHSGAPLLVEENGAIPKQTPVQYLLPEAKAQDSDKICVVIDLDETLVHSSFKPVNNADFIIPVEIDGVVHQVYVLKRPHVDEFLQRMGELFECVLFTASLAKYADPVADLLDKWGAFRARLFRESCVFHRGNYVKDLSRLGRDLRRVLILDNSPASYVFHPDNAVPVASWFDNMSDTELHDLLPFFEQLSRVDDVYSVLRQPRPGS*
Ctdsp1의 핵산 서열(SEQ ID NO:30)
Atggacagctcggccgtcattactcagatcagcaaggaggaggctcggggcccgctgcggggcaaaggtgaccagaagtcagcagcttcccagaagccccgaagccggggcatcctccactcactcttctgctgtgtctgccgggatgatggggaggccctgcctgctcacagcggggcgcccctgcttgtggaggagaatggcgccatccctaagcagaccccagtccaatacctgctccctgaggccaaggcccaggactcagacaagatctgcgtggtcatcgacctggacgagaccctggtgcacagctccttcaagccagtgaacaacgcggacttcatcatccctgtggagattgatggggtggtccaccaggtctacgtgttgaagcgtcctcacgtggatgagttcctgcagcgaatgggcgagctctttgaatgtgtgctgttcactgctagcctcgccaagtacgcagacccagtagctgacctgctggacaaatggggggccttccgggcccggctgtttcgagagtcctgcgtcttccaccgggggaactacgtgaaggacctgagccggttgggtcgagacctgcggcgggtgctcatcctggacaattcacctgcctcctatgtcttccatccagacaatgctgtaccggtggcctcgtggtttgacaacatgagtgacacagagctccacgacctcctccccttcttcgagcaactcagccgtgtggacgacgtgtactcagtgctcaggcagccacggccagggagctag
인간 miRNA-124 코딩 서열(SEQ ID NO: 31)
5’-cgtgttcacagcggaccttgat-3’
인간 miRNA-124* 코딩 서열(SEQ ID NO: 32)
5’-taaggcacgcggtgaatgccaa-3’
인간 miRNA-124 Pre-miRNA 전장(SEQ ID NO: 33)
atcaagattagaggctctgctctccgtgttcacagcggaccttgatttaatgtcatacaattaaggcacgcggtgaatgccaagagcggagcctacggctgcacttgaa
인간 miRNA-124 Pri-miRNA(SEQ ID NO: 34)를 발현하는 서열
Gggtaattaacttggatccacgccgtcatttgaaaactagatttataggcttatgtatgtttttaggcgtgtgctgtaaatggcatggagatatatgcatatgtatacgcaggcacacgcaccgtctacacttccacggaacagactaattaacagcggctctggcagatgtgtcagagatgagcagagacaggagctgggcttatgagttatgactctaggggtagagactcagagcggagagagggggatgggcagggagagaagagtggtaatcgcagtgggtcttatactttccggatcaagattagaggctctgctctccgtgttcacagcggaccttgatttaatgtcatacaattaaggcacgcggtgaatgccaagagcggagcctacggctgcacttgaaggacaccaaagcatctcagggtcagaaaggggaaaaagcaattgcagggaatttagggggtagtaaaaggaacccatctcttgccgcataaatgccccccacccccacccaggactgattctggaagcaacctagtgttcgaaagggaaaggctcctacttttccattacagccgcggaaatccgcaggcaaatctccgaggagaattttagggaagcttcattgacagctgtctggagagcagtagttcccgcctgtgcaaatattccagagagttaaatcatttagaaagcactagtt
인간 miRNA-9 코딩 서열
5’-tctttggttatctagctgtatga-3’(SEQ ID NO:35)
인간 miRNA-9* 코딩 서열
5’-ataaagctagataaccgaaagt-3’(SEQ ID NO:36)
인간 miRNA-9 Per-miRNA 전장(SEQ ID NO: 37)
Ggaggcccgtttctctctttggttatctagctgtatgagtgccacagagccgtcataaagctagataaccgaaagtagaaatgattctca
인간 miRNA-9 Pri-miRNA를 발현하는 서열은 (SEQ ID NO:38)
Agcgctccgcgcgggtgccctacgtgagccccgggacgccgtcgaggcaggccggcagcgccggtgccaggacgcacggaacggggagcaggggagaaatgcgccgggagggcgagggaggaagggaactgggcgggggctgcgggcctaggtggcgggagtcagcgtgtgcgtgtgtctgtccatcccctctggctctccgcgtgcgccccaggatccgggcacggcgtccgctcaggctcccgcgctcggcaggcagcagcacgtggagcccacggcgcggcagcggcactggctaagggaggcccgtttctctctttggttatctagctgtatgagtgccacagagccgtcataaagctagataaccgaaagtagaaatgattctcacaacttctgcgtgcgagcgcccgccccaccgaccgccccggcccggcccgcaagagccagaggagccgagaggagcccagcgccggcccagcggactccagctcgacggagcggccgcgccccgaccaggtacctgacctcggctctctctctggggacacttgcagtgccagctttcccccagtcctcctctttcctggtcccccacccctatcccccagcgccggagcaggaaccccaaagtggagcgggccggggagagggagggggttggggttgcagaggggtcgctggaagggg
긴 GFAP 촉진자(SEQ ID NO:39)
TAATCCCACCTCCCTCTCTGTGCTGGGACTCACAGAGGGAGACCTCAGGAGGCAGTCTGTCCATCACATGTCCAAATGCAGAGCATACCCTGGGCTGGGCGCAGTGGCGCACAACTGTAATTCCAGCACTTTGGGAGGCTGATGTGGAAGGATCACTTGAGCCCAGAAGTTCTAGACCAGCCTGGGCAACATGGCAAGACCCTATCTCTACAAAAAAAGTTAAAAAATCAGCCACGTGTGGTGACACACACCTGTAGTCCCAGCTATTCAGGAGGCTGAGGTGAGGGGATCACTTAAGGCTGGGAGGTTGAGGCTGCAGTGAGTCGTGGTTGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGTGAGACCCTGTCTCAAAAGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAACATATCCTGGTGTGGAGTAGGGGACGCTGCTCTGACAGAGGCTCGGGGGCCTGAGCTGGCTCTGTGAGCTGGGGAGGAGGCAGACAGCCAGGCCTTGTCTGCAAGCAGACCTGGCAGCATTGGGCTGGCCGCCCCCCAGGGCCTCCTCTTCATGCCCAGTGAATGACTCACCTTGGCACAGACACAATGTTCGGGGTGGGCACAGTGCCTGCTTCCCGCCGCACCCCAGCCCCCCTCAAATGCCTTCCGAGAAGCCCATTGAGCAGGGGGCTTGCATTGCACCCCAGCCTGACAGCCTGGCATCTTGGGATAAAAGCAGCACAGCCCCCTAGGGGCTGCCCTTGCTGTGTGGCGCCACCGGCGGTGGAGAACAAGGCTCTATTCAGCCTGTGCCCAGGAAAGGGGATCAGGGGATGCCCAGGCATGGACAGTGGGTGGCAGGGGGGGAGAGGAGGGCTGTCTGCTTCCCAGAAGTCCAAGGACACAAATGGGTGAGGGGACTGGGCAGGGTTCTGACCCTGTGGGACCAGAGTGGAGGGCGTAGATGGACCTGAAGTCTCCAGGGACAACAGGGCCCAGGTCTCAGGCTCCTAGTTGGGCCCAGTGGCTCCAGCGTTTCCAAACCCATCCATCCCCAGAGGTTCTTCCCATCTCTCCAGGCTGATGTGTGGGAACTCGAGGAAATAAATCTCCAGTGGGAGACGGAGGGGTGGCCAGGGAAACGGGGCGCTGCAGGAATAAAGACGAGCCAGCACAGCCAGCTCATGTGTAACGGCTTTGTGGAGCTGTCAAGGCCTGGTCTCTGGGAGAGAGGCACAGGGAGGCCAGACAAGGAAGGGGTGACCTGGAGGGACAGATCCAGGGGCTAAAGTCCTGATAAGGCAAGAGAGTGCCGGCCCCCTCTTGCCCTATCAGGACCTCCACTGCCACATAGAGGCCATGATTGACCCTTAGACAAAGGGCTGGTGTCCAATCCCAGCCCCCAGCCCCAGAACTCCAGGGAATGAATGGGCAGAGAGCAGGAATGTGGGACATCTGTGTTCAAGGGAAGGACTCCAGGAGTCTGCTGGGAATGAGGCCTAGTAGGAAATGAGGTGGCCCTTGAGGGTACAGAACAGGTTCATTCTTCGCCAAATTCCCAGCACCTTGCAGGCACTTACAGCTGAGTGAGATAATGCCTGGGTTATGAAATCAAAAAGTTGGAAAGCAGGTCAGAGGTCATCTGGTACAGCCCTTCCTTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGAGACAAGGTCTCTCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGGCGCAAACACAGCTCACTGCAGCCTCAACCTACTGGGCTCAAGCAATCCTCCAGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAAGCATGAGCCACCCCACTCAGCCCTTTCCTTCCTTTTTAATTGATGCATAATAATTGTAAGTATTCATCATGGTCCAACCAACCCTTTCTTGACCCACCTTCCTAGAGAGAGGGTCCTCTTGCTTCAGCGGTCAGGGCCCCAGACCCATGGTCTGGCTCCAGGTACCACCTGCCTCATGCAGGAGTTGGCGTGCCCAGGAAGCTCTGCCTCTGGGCACAGTGACCTCAGTGGGGTGAGGGGAGCTCTCCCCATAGCTGGGCTGCGGCCCAACCCCACCCCCTCAGGCTATGCCAGGGGGTGTTGCCAGGGGCACCCGGGCATCGCCAGTCTAGCCCACTCCTTCATAAAGCCCTCGCATCCCAGGAGCGAGCAGAGCCAGAGCAGGTTGGAGAGGAGACGCATCACCTCCGCTGCTCGCGG
짧은 GFAP 촉진자(SEQ ID NO: 40)
AACATATCCTGGTGTGGAGTAGGGGACGCTGCTCTGACAGAGGCTCGGGGGCCTGAGCTGGCTCTGTGAGCTGGGGAGGAGGCAGACAGCCAGGCCTTGTCTGCAAGCAGACCTGGCAGCATTGGGCTGGCCGCCCCCCAGGGCCTCCTCTTCATGCCCAGTGAATGACTCACCTTGGCACAGACACAATGTTCGGGGTGGGCACAGTGCCTGCTTCCCGCCGCACCCCAGCCCCCCTCAAATGCCTTCCGAGAAGCCCATTGAGCAGGGGGCTTGCATTGCACCCCAGCCTGACAGCCTGGCATCTTGGGATAAAAGCAGCACAGCCCCCTAGGGGCTGCCCTTGCTGTGTGGCGCCACCGGCGGTGGAGAACAAGGCTCTATTCAGCCTGTGCCCAGGAAAGGGGATCAGGGGATGCCCAGGCATGGACAGTGGGTGGCAGGGGGGGAGAGGAGGGCTGTCTGCTTCCCAGAAGTCCAAGGACACAAATGGGTGAGGGGAGAGCTCTCCCCATAGCTGGGCTGCGGCCCAaccccaccccctcaggctatgccagggggtgttgccaggggcacccgggcatcgccagtctagcccactccttcataaagccctcgcatcccaggagcgagcagagccagagcaggttggagaggagacgcatcacctccgctgctcgc
서열목록 전자파일 첨부
Claims (100)
- 개체 체내에서 비뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 전환분화시키는 방법으로서, 상기 개체에 RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합을 감소시키거나 REST의 양 또는 활성을 감소시킬 수 있는 활성 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 필요가 있는 개체 체내에서 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법은, 상기 질환의 영향을 받는 상기 개체의 부위에 치료 유효량의 RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합을 감소시키거나 REST의 양 또는 활성을 감소시킬 수 있는 활성물질을 투여하여 상기 질환의 영향을 받는 부위의 비뉴런 세포를 기능성 뉴런으로 전환분화시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기능성 뉴런은 도파민 뉴런, 망막 신경절 세포, 광수용체 세포 및 와우 나선 신경절 세포, GABA 뉴런, 5-HT 뉴런, 글루타메이트성 뉴런, ChAT 뉴런, NE 뉴런, 운동 뉴런, 척수 뉴런, 척수 운동 뉴런, 척수 감각 뉴런, 양극 세포, 수평 세포, 무축색 세포, 피라미드 뉴런, 중개 뉴런, 중간 가시 뉴런(MSN), 푸르키네 세포, 과립 세포, 후각 감각 뉴런, 사구체 주위 세포 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
- 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런은 NeuN 유전자를 발현하는, 방법.
- 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런은 축색을 갖는, 방법.
- 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 기능성 뉴런은 도파민 뉴런, 망막 신경절 세포, 광수용체 세포 또는 와우 나선 신경절 세포를 포함하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 도파민 뉴런은 티로신 히드록실라제(TH), FoxA2, Nurr1, Pitx3, Vmat2 및 DAT로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 도파민 뉴런은 NeuN, TH 및 DAT를 발현하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 망막 신경절 세포는 RBPMS, Pax6, Brn3a, Brn3b, Brn3c 및 Map2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 광수용체 세포는 Rhodopsin, mCAR, m-opsin 및 S-opsin으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 와우 나선 신경절 세포는 NeuN, Prox1, Tuj-1 및 Map2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는, 방법.
- 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비뉴런 세포는 교세포, 섬유아 세포, 줄기 세포, 신경 전구 세포 또는 신경 줄기 세포를 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 교세포는 성상 교세포, 희돌기 교세포, 뇌실막 세포, 슈반 세포, NG2 세포, 위성 세포, 뮐러 교세포, 내이 신경교세포 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 교세포는 성상 교세포, 뮐러 교세포 및 와우 신경교세포로부터 선택되는, 방법.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교세포는 뇌, 척수, 눈 또는 귀에 위치하는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 교세포는 뇌의 선조체, 흑색질, 중뇌 복측 피개 영역, 연수, 시상하부, 등쪽 중뇌 또는 대뇌 피질에 위치하는, 방법.
- 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 물질은 상기 개체 체내의 i) 선조체에 있는 교세포; ii) 대뇌 흑색질에 있는 교세포; iii) 망막에 있는 교세포; iv) 내이에 있는 교세포; v) 척수에 있는 교세포; vi) 전두엽 피질에 있는 교세포; vii) 운동 피질에 있는 교세포; viii) 시상하부에 있는 교세포; 및 ix) 복측 피개 영역(VTA)에 있는 교세포 중 하나 이상 부위에 있는 교세포에 국소 투여되는, 방법.
- 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 교세포는 성상 교세포를 포함하고, 상기 기능성 뉴런은 도파민 뉴런 세포를 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 성상 교세포는 선조체 및/또는 흑색질에 위치하는, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교세포는 뮐러 교세포를 포함하고, 상기 기능성 뉴런 세포는 망막 신경절 세포(RGC) 및/또는 광수용체 세포를 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 뮐러 교세포는 망막 또는 유리체강에 위치하는, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교세포는 와우 신경교세포를 포함하고, 상기 기능성 뉴런 세포는 와우 나선 신경절 세포를 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 와우 신경교세포는 내이에 위치하는, 방법.
- 전술한 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 물질을 투여한 후 상기 교세포를 기능성 뉴런으로 전환분화시키는 전환분화 효율은 적어도 1%, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50%에 달하는, 방법.
- 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 물질은 RE1/NRSE 요소에 결합하여 RE1/NRSE 요소에 대한 REST의 결합을 차단할 수 있는 RE1/NRSE 요소 차단제를 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 REST와 경쟁하여 RE1에 결합하는 소분자 화합물, 핵산 또는 핵산 유사체를 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 REST와 경쟁하여 RE1에 결합하는 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 방법.
- 제27항에 있어서, REST와 경쟁하여 RE1에 결합하는 상기 단백질는 REST 변이체를 포함하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 REST 변이체는 REST의 DNA 결합 도메인을 포함하지만, REST의 N-말단 및/또는 C-말단 억제 도메인이 결실되는, 방법.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 REST 변이체는 REST의 155-420번째 아미노산을 포함하지만, REST의 N-말단 및/또는 C-말단 억제 도메인이 결실되는, 방법.
- 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 REST 변이체는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 9의 아미노산 서열 또는 이와 적어도 70%, 60% 또는 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 RE1/NRSE 요소 차단제는 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 REST 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 REST 변이체를 코딩하는 상기 핵산은 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 10의 뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 60% 또는 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는, 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 REST 변이체를 코딩하는 상기 핵산은 코돈 최적화되고, 선택적으로 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 60% 또는 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는, 방법.
- 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 REST 변이체는 상기 REST의 DNA 결합 도메인에 융합된 활성화 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
- 제34항에 있어서, 상기 활성화 도메인은 후성유전학적 변형 단백질 또는 유전자 활성화 조절 요소를 포함하고, 선택적으로 상기 활성화 도메인은 VP64, P65-HSF1, VP16, RTA, Suntag, P300, CBP 또는 이들의 임의의 조합을 포함하며, 선택적으로, 상기 활성화 도메인은 VP64 또는 P65-HSF1을 포함하는, 방법.
- 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 REST 변이체는 하나 이상의 핵 위치 신호 서열에 융합되는, 방법.
- 제36항에 있어서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 상기 REST 변이체의 N-말단에 융합되는, 방법.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 상기 REST 변이체의 C-말단에 융합되는, 방법.
- 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 각각 상기 REST 변이체의 N-말단 및 C-말단에 융합되는, 방법.
- 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵 위치 신호 서열은 SEQ ID NO: 13, 41-58로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
- 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 인간 또는 동물인, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 동물은 비인간 영장류 동물, 래트 또는 마우스인, 방법.
- 제2항에 있어서, 뉴런 기능 결실 또는 사망과 관련된 상기 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌졸중(중풍), 정신분열증, 헌팅턴병, 우울증, 운동 뉴런 질환, 근위축성 측삭 경화증, 척수성 근위축증, 픽병, 수면 장애, 간질, 운동실조, RGC 세포 사망으로 인한 시력 장애, 녹내장, 연령 관련 RGC 병변, 시신경 손상, 망막 허혈 또는 출혈, 레버 유전성 시신경 병변, 손상 또는 퇴행성 병변으로 인한 광수용체 세포 변성 또는 사망, 황반 변성, 망막색소변성, 당뇨병 관련 실명, 야맹증, 색맹, 유전성 실명, 선천성 흑내장, 나선 신경절 세포 사망으로 인한 난청 또는 청력 저하, 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
- REST의 DNA 결합 도메인을 포함하지만, REST의 N-말단 및/또는 C-말단 억제 도메인이 결실되는, REST 변이체.
- 제44항에 있어서, REST의 155-420번째 아미노산을 포함하지만, REST의 N-말단 및/또는 C-말단 억제 도메인이 결실되는, REST 변이체.
- 제44항 또는 제45항에 있어서, SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 9의 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 70%, 60% 또는 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열을 갖는, REST 변이체.
- 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 10을 갖는뉴클레오티드 서열, 또는 이와 적어도 70%, 60% 또는 50%의 동일성 백분율을 갖는 서열에 의해 코딩되어 얻어지는, REST 변이체.
- 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 REST의 DNA 결합 도메인에 융합된 활성화 도메인을 추가로 포함하는, REST 변이체.
- 제48항에 있어서, 상기 활성화 도메인은 후성유전학적 변형 단백질 또는 유전자 활성화 조절 요소를 포함하고, 선택적으로 상기 활성화 도메인은 VP64, P65-HSF1, VP16, RTA, Suntag, P300, CBP 또는 이들의 임의의 조합을 포함하며, 선택적으로, 상기 활성화 도메인은 VP64 또는 P65-HSF1을 포함하는, REST 변이체.
- 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 핵 위치 신호 서열에 융합되는, REST 변이체.
- 제50항에 있어서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 상기 REST 변이체의 N-말단에 융합되는, REST 변이체.
- 제50항 또는 제51항에 있어서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 상기 REST 변이체의 C-말단에 융합되는, REST 변이체.
- 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 상기 핵 위치 신호 서열이 각각 상기 REST 변이체의 N-말단 및 C-말단에 융합되는, REST 변이체.
- 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵 위치 신호 서열은 SEQ ID NO: 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, REST 변이체.
- 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 REST 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제55항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되는 촉진자를 추가로 포함하는, 발현 벡터.
- 제56항에 있어서, 상기 촉진자는 교세포 특이적 촉진자인, 발현 벡터.
- 제57항에 있어서, 상기 교세포 특이적 촉진자는 성상 교세포 특이적 촉진자 또는 뮐러 교세포(MG) 특이적 촉진자인, 발현 벡터.
- 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 교세포 특이적 촉진자는 GFAP 촉진자, ALDH1L1 촉진자, EAAT1/GLAST 촉진자, 글루타민 합성효소 촉진자, S100β 촉진자, EAAT2/GLT-1 촉진자 및 Rlbp1 촉진자로부터 선택되며, 바람직하게는 GFAP 촉진자인, 발현 벡터.
- 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교세포 특이적 촉진자는 와우 신경교세포 특이적 촉진자인, 발현 벡터.
- 제60항에 있어서, 상기 와우 신경교세포 특이적 촉진자는 GFAP 촉진자, ALDH1L1 촉진자, EAAT1/GLAST 촉진자 및 Plp1 촉진자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 발현 벡터.
- 제44항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따른 REST 변이체 또는 제55항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
- 제62항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위한 운반체를 추가로 포함하고, 상기 운반체는 바이러스 벡터, 리포솜, 나노 입자, 엑소솜 또는 바이러스 유사 입자를 포함하는, 약학적 조성물.
- 제63항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터(rAAV), 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, SV40 바이러스 벡터 또는 이들의 임의의 조합을 포함하며, 여기서 바람직하게는, AAV 또는 rAAV인, 약학적 조성물.
- 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, i) 선조체에 있는 교세포; ii) 대뇌 흑색질에 있는 교세포; iii) 망막에 있는 교세포; iv) 내이에 있는 교세포; v) 척수에 있는 교세포; vi) 전두엽 피질에 있는 교세포; vii) 운동 피질에 있는 교세포; viii) 시상하부에 있는 교세포; 및 ix) 복측 피개 영역(VTA)에 있는 교세포 중 하나 이상 부위에 있는 교세포에 국소 투여하기에 적합한, 약학적 조성물.
- 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 두개 내 투약 또는 안구 내 투약에 적합한, 약학적 조성물.
- 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 또한 i) 하나 이상의 도파민 뉴런 관련 인자, 또는 ii) 뮐러 교세포에서 발현하기 위한, 하나 이상의 망막 신경절 세포 관련 인자를 포함하고,
1) 상기 하나 이상의 도파민 뉴런 관련 인자는 FoxA2, Lmx1a, Lmx1b, Nurr1, Pbx1a, Pitx3, Gata2, Gata3, FGF8, BMP, En1, En2, PET1, Pax 패밀리 단백질(Pax3, Pax6 등), SHH, Wnt 패밀리 단백질, TGF- 패밀리 단백질 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되며;
2) 상기 하나 이상의 망막 신경절 세포 관련 인자는 -catenin, Oct4, Sox2, Klf4, Crx, aCamKII, Brn3a, Brn3b, Brn3C, Math5, Otx2, Ngn2, Ngn1, AscL1, miRNA9, miRNA-124, Nr2e3, Nrl 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는, 약학적 조성물. - 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 포함하는, 키트 또는 시약 키트.
- 하나 이상의 REST 억제 도메인에 융합된 DNA 결합 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
- 조성물로서, a) DNA 결합 단백질 및 b) 하나 이상의 REST 억제 도메인을 포함하는 단백질을 포함하며, 상기 a)와 b)는 결합하여 단백질 복합체를 형성할 수 있는, 조성물.
- 제70항에 있어서, 상기 a) 및 b)는 각각 자기조립 리간드 쌍에 연결되고, 상기 자기조립 리간드는 서로 결합될 수 있는, 조성물.
- 제71항에 있어서, 상기 자기조립 리간드 쌍은 i) 서로 결합된 두 개의 단백질 도메인(예를 들어, 항원과 항체; 또는 항원과 항체에 있는 항원 결합 단편); 및 ii) RNA 절단 공여체 및 절단 수용체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는, 조성물.
- 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 하나 이상의 REST 억제 도메인은 REST의 N-말단 억제 영역 및/또는 REST의 C-말단 억제 영역을 포함하는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 하나 이상의 REST 억제 도메인은 인간 REST 단백질 또는 동물 REST 단백질로부터 유래되는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제73항에 있어서, 상기 REST의 N-말단 억제 영역은 REST의 1-83번째 아미노산 또는 전사 억제 활성을 갖는 단편을 포함하는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제73항 또는 제75항에 있어서, 상기 REST의 N-말단 억제 영역은 SEQ ID NO: 16에 제시된 바와 같은 서열 또는 전사 억제 활성을 갖는 단편을 포함하는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제73항에 있어서, 상기 REST의 C-말단 억제 영역은 REST의 1008-1097번째 아미노산 또는 전사 억제 활성을 갖는 단편을 포함하는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제73항 또는 제77항에 있어서, 상기 REST의 C-말단 억제 영역은 SEQ ID NO: 18에 제시된 바와 같은 서열 또는 전사 억제 활성을 갖는 단편을 포함하는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 억제 활성을 갖는 단편은 REST 단백질애 있는 적어도 20개 연속적인 아미노산, 30개 연속적인 아미노산, 40개 연속적인 아미노산 또는 50개 연속적인 아미노산 단편을 포함하는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제68항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 서열 가이드 DNA 결합 단백질, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 전사 인자에 있는 DNA 결합 부분으로부터 선택되는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제80항에 있어서, 상기 서열 가이드 DNA 결합 단백질은 CRISPR-Cas 단백질 또는 이의 변이체인, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제81항에 있어서, 상기 CRISPR-Cas 단백질 변이체는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 가이드 DNA 결합 단백질은 Cas9 단백질이거나 또는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas9 변이체인, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 가이드 DNA 결합 단백질은 Cas12 단백질이거나 또는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas12 변이체인, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제73항, 제75항 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 상기 REST의 N-말단 억제 영역이 상기 DNA 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결되는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제73항, 제77항 또는 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 상기 REST의 C-말단 억제 영역이 상기 DNA 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결되는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제73항, 제75항 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 직렬로 연결된 적어도 하나의 상기 REST의 N-말단 억제 영역을 포함하는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제73항, 제77항 또는 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 직렬로 연결된 적어도 하나의 상기 REST의 C-말단 억제 영역을 포함하는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제69항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 25-27에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질 또는 조성물.
- 제69항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 조성물을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제90항에 있어서, DNA 결합 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 단편 및 하나 이상의 REST 억제 도메인의 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 단편을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 제91항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 단편과 제2 폴리뉴클레오티드 단편은 자가 절단 가능한 제3 뉴클레오티드 단편을 통해 연결되는, 폴리뉴클레오티드.
- 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 세포에 제69항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 조성물 또는 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 전달하는 단계를 포함하며, 상기 DNA 결합 단백질은 상기 표적 유전자 또는 이의 조절 서열에 결합하여 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는, 방법.
- 개체에서 표적 유전자 발현을 억제하는 방법으로서, 상기 개체에 제69항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 조성물, 또는 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 전달하는 단계를 포함하며, 상기 DNA 결합 단백질은 상기 표적 유전자 또는 이의 조절 서열에 결합하여 상기 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는, 방법.
- 제93항 또는 제94항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 서열 가이드 DNA 결합 단백질, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 또는 전사 인자에 있는 DNA 결합 부분으로부터 선택되는, 방법.
- 제95항에 있어서, 상기 서열 가이드 DNA 결합 단백질은 CRISPR-Cas 단백질 또는 이의 변이체인, 방법.
- 제96항에 있어서, 상기 CRISPR-Cas 단백질 변이체는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는, 방법.
- 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 가이드 DNA 결합 단백질은 Cas9 단백질이거나 또는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas9 변이체인, 방법.
- 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열 가이드 DNA 결합 단백질은 Cas12 단백질이거나 또는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas12 변이체인, 방법.
- 제93항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 표적 유전자 또는 이의 조절 서열의 표적 영역과 상보적인 표적 서열 및 상기 DNA 결합 단백질에 결합하는 서열을 포함하는 가이드 RNA를 상기 세포 또는 상기 개체에 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111158620.4 | 2021-09-30 |
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