JP2024500579A

JP2024500579A - 神経疾患の治療

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Publication number: JP2024500579A
Application number: JP2023563135A
Authority: JP
Inventors: ハイポーチョウ; シントーフー; チンリンスー
Original assignee: シャンハイジェネマジックバイオサイエンシズカンパニー，リミティド
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2024-01-09
Also published as: EP4267196A4; CN117241835A; EP4267196A1; WO2022134107A1; US20240050589A1

Abstract

本願は、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を介して送達されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを用いて、ＰＴＢ及び任意のｎＰＴＢノックダウンによってグリア細胞をインビボでニューロンに変換する、特定の神経変性疾患（例えば、ＲＧＣ損失関連変性疾患及びパーキンソン病）を治療するための方法及び組成物を提供する。

Description

本願は、再生医療、神経病学及びバイオ製薬の分野に関するものである。特に、本願は、神経変性疾患及び病症を治療するための、非ニューロン細胞をニューロン細胞に分化させるための方法及び組成物に関するものである。

神経変性疾患は、神経系の各部分のニューロンの進行性損失に関連する破壊性疾患である。一方、再生医療は、細胞（例えば、ニューロン）の損失を引き起こす神経変性疾患の治療において将来性が期待できる。１つの方法は細胞置換を採用し、もう１つの方法は細胞の分化転換を採用する。
分化転換は、内因性細胞の既存の細胞可塑性を利用して、新規な細胞型を生成する。しかしながら、この方法の１つのチャレンジは、培養のみならず、インビボの天然環境、特に所望の場所（例えば、組織又は器官タイプ）において、特定の標的細胞を所望の細胞タイプ（例えば、ニューロン）に変換するための有効な策を同定することである。

最近の研究では、線条体中の単一遺伝子であるポリピリミジントラクト結合タンパク質１（Ｐｔｂｐ１）のダウンレギュレーションが、マウスのアストロサイトをドーパミン作動性ニューロンに直接変換し、パーキンソン病モデルマウスの症状を緩和できることが示されている（Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，２０２０，Ｃｅｌｌ１８１：５９０－６０３）。しかし、この策が非ヒト霊長類やヒトに適用できるか否かは不明である。げっ歯類モデルで有効性を示した実験療法の多くは、非ヒト霊長類やヒトでは効果がないか、非現実的である可能性がある。これらの策は、生物学的な内在的差異や拡張性の欠如など、さまざまな理由で失敗する可能性がある。非ヒト霊長類の研究は重要なステップであり、臨床試験の前にこれらの問題を解決する上で重要な価値を持つ。

したがって、本願の目的は、霊長類、すなわちヒト及び非ヒト霊長類の神経変性疾患及び病症を治療するための、非ニューロン細胞をニューロン細胞に分化させるための方法及び組成物を提供することである。

第１態様では、本願は、非ヒト霊長類又はヒトの神経系領域における機能性ニューロンの変性に関連する神経状態を治療する方法に関する。

一実施形態では、方法は、非ニューロン細胞における霊長類ＰＴＢタンパク質の発現又は活性を阻害して、非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングすることを可能にするために霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列若しくはその相補配列を標的とする核酸分子を含む組成物の有効量を、必要な被験者の神経系領域における非ニューロン細胞に投与するステップを含み、標的配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８７と少なくとも９５％同一の配列に含まれ、標的配列がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で標的化された場合、ガイド配列は、配列番号１～８６の少なくとも１つの配列と少なくとも１０ヌクレオチドの重複を有し、前記ｇＲＮＡは、Ｃｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現し、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、上記細胞において０．５未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現が観察される。

配列番号87:
atggacggca ttgtcccaga tatagccgtt ggtacaaagc ggggatctga cgagcttttc 60
tctacttgtg tcactaacgg accgtttatc atgagcagca actcggcttc tgcagcaaac 120
ggaaatgaca gcaagaagtt caaaggtgac agccgaagtg caggcgtccc ctctagagtg 180
atccacatcc ggaagctccc catcgacgtc acggaggggg aagtcatctc cctggggctg 240
ccctttggga aggtcaccaa cctcctgatg ctgaagggga aaaaccaggc cttcatcgag 300
atgaacacgg aggaggctgc caacaccatg gtgaactact acacctcggt gacccctgtg 360
ctgcgcggcc agcccatcta catccagttc tccaaccaca aggagctgaa gaccgacagc 420
tctcccaacc aggcgcgggc ccaggcggcc ctgcaggcgg tgaactcggt ccagtcgggg 480
aacctggcct tggctgcctc ggcggcggcc gtggacgcag ggatggcgat ggccgggcag 540
agccccgtgc tcaggatcat cgtggagaac ctcttctacc ctgtgaccct ggatgtgctg 600
caccagattt tctccaagtt cggcacagtg ttgaagatca tcaccttcac caagaacaac 660
cagttccagg ccctgctgca gtatgcggac cccgtgagcg cccagcacgc caagctgtcg 720
ctggacgggc agaacatcta caacgcctgc tgcacgctgc gcatcgactt ttccaagctc 780
accagcctca acgtcaagta caacaatgac aagagccgtg actacacacg cccagacctg 840
ccttccgggg acagccagcc ctcgctggac cagaccatgg ccgcggcctt cggtgcacct 900
ggtataatct cagcctctcc gtatgcagga gctggtttcc ctcccacctt tgccattcct 960
caagctgcag gcctttccgt tccgaacgtc cacggcgccc tggcccccct ggccatcccc 1020
tcggcggcgg cggcagctgc ggcggcaggt cggatcgcca tcccgggcct ggcgggggca 1080
ggaaattctg tattgctggt cagcaacctc aacccagaga gagtcacacc ccaaagcctc 1140
tttattcttt tcggcgtcta cggtgacgtg cagcgcgtga agatcctgtt caataagaag 1200
gagaacgccc tagtgcagat ggcggacggc aaccaggccc agctggccat gagccacctg 1260
aacgggcaca agctgcacgg gaagcccatc cgcatcacgc tctcgaagca ccagaacgtg 1320
cagctgcccc gcgagggcca ggaggaccag ggcctgacca aggactacgg caactcaccc 1380
ctgcaccgct tcaagaagcc gggctccaag aacttccaga acatattccc gccctcggcc 1440
acgctgcacc tctccaacat cccgccctca gtctccgagg aggatctcaa ggtcctgttt 1500
tccagcaatg ggggcgtcgt caaaggattc aagttcttcc agaaggaccg caagatggca 1560
ctgatccaga tgggctccgt ggaggaggcg gtccaggccc tcattgacct gcacaaccac 1620
gacctcgggg agaaccacca cctgcgggtc tccttctcca agtccaccat ctag 1674

一実施形態では、方法は、非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を阻害して、非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングすることを可能にするために霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列若しくはその相補配列を標的とする核酸分子を含む組成物の有効量を、必要な被験者の神経系領域における非ニューロン細胞に投与するステップを含み、標的配列は、配列番号８７の９５１～１４８７位と少なくとも９５％同一の配列に含まれる。方法のいくつかの実施形態では、標的配列がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で標的化された場合、ガイド配列は、配列番号３８～６８の少なくとも１つの配列と少なくとも１０ヌクレオチドの重複を有し、前記ｇＲＮＡは、Ｃｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現し、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、０．４未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現が観察される。

一実施形態では、該方法は、核酸分子がアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子、又はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のうちの少なくとも１つであるか、又はこれらをコードするものである方法である。いくつかの実施形態では、該方法は、組成物がｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質及び少なくとも１種のｇＲＮＡ、又はｉｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードし、少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする少なくとも１種の発現ベクターを含み、任意に、Ｃａｓエフェクタータンパク質及び少なくとも１種のｇＲＮＡ、又は少なくとも１種の発現ベクターがナノ粒子、好ましくはリポソームに含まれる方法である。

一実施形態では、該方法は、ａ）Ｃａｓエフェクタータンパク質はＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質であり、また、ｂ）ｇＲＮＡは、配列番号８７と少なくとも９５％同一の配列中の１７～６０個のヌクレオチドの連続した配列に相補的なガイド配列を含む方法である。いくつかの実施形態では、該方法は、ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｄ、ＣａｓＲｘ、Ｃａｓ１３ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｆ、及びそれらの機能ドメインからなる群から選択され、好ましくはＣａｓＲｘである方法である。いくつかの実施形態では、該方法は、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号１～８６のうちの少なくとも１つの配列の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７の連続したヌクレオチド又はすべてのヌクレオチドを含むか、又はこれらからなり、好ましくは、ｇＲＮＡがＣｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現した場合、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１５未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現が観察される方法である。いくつかの実施例では、該方法は、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、４５、４０、６１、５０、５５、４１、４４、４２、６６、４９、５１、及び４６からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、又はそれらからなる方法である。

一実施形態では、該方法は、組成物は、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とする単一型のみのｇＲＮＡ、又は２種類、３種類、４種類、５種類、又は６種類の異なるｇＲＮＡを含むか、又は霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とする単一型のみのｇＲＮＡ、又は２種類、３種類、４種類、５種類、又は６種類の異なるｇＲＮＡの発現ベクターを含む方法である。

一実施形態では、該方法は、少なくとも１種の発現ベクターは、
ｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、霊長類の非ニューロン細胞においてＣａｓエフェクタータンパク質の発現を引き起こすプロモーターに作動可能に連結されており、好ましくは、前記プロモーターはグリア細胞特異的プロモーター又はミュラーグリア（ＭＧ）細胞特異的プロモーターであり、グリア細胞特異的プロモーターは、より好ましくＧＦＡＰプロモーター、ＡＬＤＨ１Ｌ１プロモーター、ＥＡＡＴ１／ＧＬＡＳＴプロモーター、グルタミン合成酵素プロモーター、Ｓ１００βプロモーター及びＥＡＡＴ２／ＧＬＴ-１プロモーターから選択され、又はＭＧ細胞特異的プロモーターは、より好ましくＧＦＡＰプロモーター、ＡＬＤＨ１Ｌ１プロモーター、ＧＬＡＳＴ（Ｓｌｃ１ａ３とも呼ばれる）プロモーター及びＲｌｂｐ１プロモーターから選択される、ヌクレオチド配列と、
ｉｉ）霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列であって、非ニューロン細胞においてｇＲＮＡの発現を引き起こすプロモーター、例えばＵ６プロモーターに作動可能に連結されている、ヌクレオチド配列と、を含む、方法である。

一実施形態では、該方法は、発現ベクターはナノ粒子に含まれる、又は前記発現ベクターは、遺伝子治療ベクター、好ましくは、ウイルス遺伝子治療ベクター、より好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンタウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０ベクター、ポックスウイルスベクター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるウイルスベクターであり、最も好ましくは、ＡＡＶである、方法である。

一実施形態では、該方法は、ｉ）成熟網膜の非ニューロン細胞、ｉｉ）線条体の非ニューロン細胞、好ましくは被殻の非ニューロン細胞、ｉｉｉ）黒質の非ニューロン細胞、ｉｖ）内耳の非ニューロン細胞、ｖ）脊髄の非ニューロン細胞、ｖｉ）前頭前皮質の非ニューロン細胞、ｖｉｉ）運動皮質の非ニューロン細胞、及びｖｉｉｉ）中脳腹側被蓋野（ＶＴＡ）の非ニューロン細胞の少なくとも１種の細胞に組成物を局所的に投与する方法である。いくつかの実施形態では、該方法は、組成物を線条体の非ニューロン細胞に投与して、機能性ドーパミン作動性ニューロンを生成し、好ましくは、前記非ニューロン細胞はグリア細胞であり、好ましくは、前記組成物は被殻及び黒質の少なくとも一方に投与される方法である。好ましい実施形態では、グリア細胞はアストロサイトである。いくつかの実施形態では、該方法は、前記神経状態は、パーキンソン病；アルツハイマー病；ハンチントン病；統合失調症；うつ病；薬物依存症；脳卒中；運動障害例えば舞踏病、脊髄損傷、舞踏病アテトーゼ、及びジスキネジアなど；双極性障害；自閉症スペクトラム（ＡＳＤ）；及び機能障害からなる群から選択される機能性ニューロンの変性に関連する状態である方法である。いくつかの実施形態では、該方法は、前記組成物には、ｉ）１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子、又はｉｉ）非ニューロン細胞において１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子を発現させるための少なくとも１種の発現ベクターをさらに含む方法である。好ましい実施形態では、１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子は、Ｌｍｘ１ａ、Ｌｍｘ１ｂ、ＦｏｘＡ２、Ｎｕｒｒ１、Ｐｉｔｘ３、Ｇａｔａ２、Ｇａｔａ３、ＦＧＦ８、ＢＭＰ、Ｅｎ１、Ｅｎ２、ＰＥＴ１、Ｐａｘファミリータンパク質、ＳＨＨ、Ｗｎｔファミリータンパク質、及びＴＧＦ-βファミリータンパク質からなる群から選択される方法である。

一実施形態では、該方法は、組成物は、機能的網膜神経節細胞（ＲＧＣ）ニューロンを生成するために、成熟網膜のグリア細胞又はミュラーグリア細胞（ＭＧ）に投与される方法である。一実施形態では、該方法は、組成物は、機能的網膜光受容体を生成するために、成熟網膜のグリア細胞又はミュラーグリア細胞（ＭＧ）に投与される方法である。いくつかの実施形態では、該方法は、神経状態は、緑内障、加齢に伴うＲＧＣ損失、視神経損傷、網膜虚血、及びレーベル遺伝性視神経症からなる群から選択される、成熟網膜の機能性ニューロンの変性に関連する状態である方法である。一実施形態では、該方法は、組成物には、ｉ）β-カテニン、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３及びＮｒｌからなる群から選択される１つ又は複数の因子、及び／又はｉｉ）非ニューロン細胞において、β-カテニン、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３及びＮｒｌからなる群から選択される１つ又は複数の因子を発現させるための少なくとも１種の発現ベクターをさらに含む方法である。

一実施形態では、該方法は、細胞プログラミング剤を投与する前、同時又は後に、免疫抑制剤を投与することをさらに含み、より好ましくは、免疫抑制剤は、コルチコステロイド、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＩＭＤＨ阻害剤、免疫抑制抗体、インターフェロン、Ｊａｎｕｓキナーゼ阻害剤、及びアナキンラのような生物学的製剤からなる群から選択される方法である。

第２態様では、本願は、霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の前記で定義された標的配列若しくはその相補配列を標的とする核酸分子を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、ｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質及び少なくとも１種のｇＲＮＡ、又はｉｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードし、少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする発現ベクターを含み、任意に、Ｃａｓエフェクタータンパク質及び少なくとも１種のｇＲＮＡ又は少なくとも１種の発現ベクターはナノ粒子、好ましくはリポソームに含まれる。好ましい実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質及び少なくとも１種のｇＲＮＡは本明細書で定義された通りである。好ましい実施形態では、発現ベクターは、本明細書で定義された発現ベクターである。

一実施形態では、機能性ドーパミン作動性ニューロンを生成するための組成物は、ｉ）１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子、又はｉｉ）非ニューロン細胞において１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子を発現させるための少なくとも１種の発現ベクターをさらに含み、
好ましくは、１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子は、Ｌｍｘ１ａ、Ｌｍｘ１ｂ、ＦｏｘＡ２、Ｎｕｒｒ１、Ｐｉｔｘ３、Ｇａｔａ２、Ｇａｔａ３、ＦＧＦ８、ＢＭＰ、Ｅｎ１、Ｅｎ２、ＰＥＴ１、Ｐａｘファミリータンパク質、ＳＨＨ、Ｗｎｔファミリータンパク質、及びＴＧＦ-βファミリータンパク質からなる群から選択される。

一実施形態では、機能性ＲＧＣニューロンを生成するための組成物は、ｉ）β-カテニン、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３及びＮｒｌからなる群から選択される１つ又は複数の因子、及び／又はｉｉ）非ニューロン細胞において、β-カテニン、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３及びＮｒｌからなる群から選択される１つ又は複数の因子を発現させるための少なくとも１種の発現ベクターをさらに含む。

一実施形態では、組成物は、注射、吸入、胃腸外投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮膚内投与、局所投与、又は経口投与のために調製される。

第３態様では、本願は、（ａ）ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質のコード配列と、
（ｂ）本明細書で定義されたｇＲＮＡをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列と、を含む、ＡＡＶベクターに関する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｄ、ＣａｓＲｘ、Ｃａｓ１３ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｆ及びそれらの機能ドメインからなる群から選択され、好ましくはＣａｓＲｘであるベクターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、霊長類非ニューロン細胞においてＣａｓエフェクタータンパク質の発現を引き起こすプロモーターに作動可能に連結されており、好ましくは、前記プロモーターはグリア細胞特異的プロモーター又はミュラーグリア細胞（ＭＧ）細胞特異的プロモーターであり、グリア細胞特異的プロモーターは、より好ましくＧＦＡＰプロモーター、ＡＬＤＨ１Ｌ１プロモーター、ＥＡＡＴ１／ＧＬＡＳＴプロモーター、グルタミン合成酵素プロモーター、Ｓ１００βプロモーター及びＥＡＡＴ２／ＧＬＴ-１プロモーターから選択され、又はＭＧ細胞特異的プロモーターは、より好ましくＧＦＡＰプロモーター、ＡＬＤＨ１Ｌ１プロモーター、ＧＬＡＳＴ（Ｓｌｃ１ａ３とも呼ばれる）プロモーター及びＲｌｂｐ１プロモーターから選択され、かつ
ｉｉ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列は、非ニューロン細胞においてｇＲＮＡの発現を引き起こすプロモーター、例えばＵ６プロモーターに作動可能に連結される、ベクターである。

効率的なｇＲＮＡのスクリーニングである。（Ａ）ヒト２９３Ｔ細胞において、ＣａｓＲｘ及びｇＲＮＡをコードするプラスミドを一過性トランスフェクションした２日後に、８６個のｇＲＮＡでＰｔｂｐ１ｍＲＮＡをダウンレギュレーションした。なお、以下の実験では、ｇＲＮＡ６０を使用した。（Ｂ）ヒトＰｔｂｐ１遺伝子の８６個のｇＲＮＡの標的部位及びノックダウン効率の情報（暗色：＜０．１；淡い色：＞０．１）。キー領域は、ノックダウン効率の高い標的領域を表す。キー領域は、配列番号８７の９５１～１４８７位、すなわち、配列番号８８の１～５３６位に対応する。すべての値は平均値±ＳＥＭで表される。ｇＲＮＡ６０はヒト２９３Ｔ細胞で高いノックダウン効率を示す。すべての値は平均値±ＳＥＭで表される。対応のないｔ検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ｇＲＮＡ６０によるサルとマウスの細胞におけるＰｔｂｐ１発現のノックダウン。（Ａ,Ｂ）ｇＲＮＡ６０は、サルのＣｏｓ７細胞とマウスのＮ２ａ細胞で高いノックダウン効率を示す。すべての値は平均値±ＳＥＭで表される。対応のないｔ検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＣａｓＲｘ対照（ｘ軸）に対して、ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１のＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）ライブラリーで検出されたすべての遺伝子のｌｏｇ２（断片数／キロ塩基／百万マッピングされた読み取り［ＦＰＫＭ］＋１）値の発現レベル（ｙ軸）は、Ｐｔｂｐ１が特異的にダウンレギュレーションされたことを示す。Ｃｏｓ７細胞、ｎ＝３の２群は独立に重複する。ｇＲＮＡ６０を用いた。アストロサイトはインビボでドーパミンニューロンに変換される。（Ａ）ＡＡＶベクター及び注射戦略の概略図。ベクター１（ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ｍＣｈｅｒｒｙ）はアストロサイト特異的プロモーターＧＦＡＰにより駆動されるｍＣｈｅｒｒｙをコードし、ベクター２（ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ）はＣａｓＲｘをコードし、ベクター３（ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１）はＣａｓＲｘ及びｇＲＮＡをコードする。線条体にＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１又は対照ベクターＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ及びＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ｍＣｈｅｒｒｙを注射する。注射後約２～３週間でアストロサイトからドーパミンニューロンへの変換を評価する。ＳＴ：線条体。（Ｂ）代表的な画像は、マウスアストロサイトにおいてｍＣｈｅｒｒｙ（ベクター１）とＣａｓＲｘ（Ｆｌａｇと融合したベクター３）が特異的に発現していることを示す。なお、ＧＦＡＰはアストロサイト特異的マーカーである。（Ｃ）及び（Ｄ）共焦点画像は、ベクター１＋３を注射してから２週間後に、マウスで変換後のｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＮｅｕＮ^＋（白い矢印）とｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＴＨ^＋（白い矢印）細胞を観察したが、対照ＡＡＶを注射した線条体では観察されなかった。なお、ＮｅｕＮはニューロン特異的マーカーであり、ＴＨはドーパミンニューロン特異的マーカーである。（Ｅ）共焦点画像は、ベクター１＋３を注射してから１カ月後に、マウスで変換後のｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＮｅｕＮ^＋（白い矢印）とｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＴＨ^＋（白い矢印）細胞が観察されたことを示すが、対照線条体では観察されなかった。なお、ＤＡＴは成熟したドーパミンニューロン特異的マーカーである。（Ｆ）代表的な画像は、ベクター１と３（黄色矢印）を注射したカニクイザルの被殻中のｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＴＨ^＋細胞を示す。ｇＲＮＡ６０を用いた。ドーパミンニューロン関連転写因子の共注射によりアストロサイトのドーパミンニューロンへの変換効率を向上させる。共焦点画像は、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＦｏｘＡ２、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－Ｌｍｘ１ａ、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＦｏｘＡ２＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－Ｌｍｘ１ａ及びＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＦｏｘＡ２＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－Ｌｍｘ１ａ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－Ｎｕｒｒ１を注射して２～３週間後、マウスで変換後のｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＮｅｕＮ^＋ＴＨ^＋（黄色の矢印）細胞が観察されたが、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘを注射した対照線条体では観察されなかった。なお、ＮｅｕＮはニューロン特異的マーカー、ＴＨはドーパミンニューロン特異的マーカーである。白い矢印はｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＮｅｕＮ^－ＴＨ^－細胞を示す。ｇＲＮＡ６０を用いた。 β-カテニンを中年マウスに併用して注射することにより、ＭＧからＲＧＣへの変換効率を向上させる。（Ａ）ＭＧからＲＧＣへの変換の概略図を示す。ベクターＩ（ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅ）は、ＭＧ特異的プロモーターＧＦＡＰにより駆動されるＣｒｅリコンビナーゼ及びＧＦＰを発現する。ベクターＩＩ（ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１）は、ＣａｓＲｘ及びｇＲＮＡを発現する。ＭＧからＲＧＣへの変換を誘導するために、ＡＡＶ－ＧＦＡＰＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１又は対照ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘをＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅとともに網膜に注射した（Ａｉ９マウス、４～５月齢）。注射後２～３週間で、ＲＧＣ変換の誘導を検証する。ＯＮＬ：外顆粒層、ＯＰＬ：外網状層、ＩＮＬ：内顆粒層、ＩＰＬ：内網状層、ＧＣＬ：神経節細胞層。（Ｂ-Ｅ）代表的な画像は、ＧＣＬにおけるＲＢＰＭＳ＋ｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞、ならびにＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β－カテニン、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１及びＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β－カテニンからなる群におけるＲＢＰＭＳ＋ｔｄＴｏｍａｔｏ＋視神経の共局在化を示す。なお、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘとＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β－カテニンは対照群である。黄色矢印はＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＧＦＰ-Ｃｒｅ、ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１及びＡＡＶ-ＧＦＡＰ-β-カテニンを注射した網膜におけるｔｄＴｏｍａｔｏとＲＢＰＭＳの共局在化を示す。ＲＢＰＭＳはＲＧＣの特異的マーカーである。ｇＲＮＡ６０を用いた。

発明の説明
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。当業者は、本明細書に記載された方法及び材料と類似又は同等の方法及び材料の多くが、本願を実施するために使用され得ることを認識する。実際には、本願は、この方法に限定されるものではない。

本書類及びその特許請求の範囲において、動詞「含む」及びその変形は、その語に後続する項目を含むことを意味する非限定的な意味で使用されているが、具体的に言及されていない項目を排除していない。さらに、不定冠詞「一（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」に言及される要素は、文脈によって明示的に必要とされている要素が１つのみである場合を除き、１つ又は複数の要素が存在する可能性を排除するものではない。そのため、不定冠詞の「一」又は「１つ」は通常「少なくとも１つ」を意味している。

本明細書で使用されるように、用語「及び／又は」は、１つ又は複数の状況が、単独で、又はすべての状況と組み合わされるまで少なくとも１つの状況と組み合わされて発生する可能性があることを意味する。

本明細書で使用されるように、「少なくとも」特定値は、この特定値またはそれ以上を意味する。例えば、「少なくとも２」は、「２以上」、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、・・・等と同一であると理解されるべきである。

数値（例えば約１０）と組み合わせて使用される場合、「約」又は「程度」という語は、当該値が当該値（１０の）の所定の値の約０．１％であり得ることを意味することが好ましい。

「アストロサイト」とは、一般的に、脳及び脊髄に特徴的な星形のグリア細胞を指し、星形であること、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリーのメンバーＬＩ（ＡＬＤＨ１Ｌ１）、興奮性アミノ酸トランスポーター１／グルタミン酸アスパラギン酸トランスポーター（ＥＡＡＴ１／ＧＬＡＳＴ）、グルタミン合成酵素、Ｓ１００β又は興奮性アミノ酸トランスポーター１／ＧＬＡＳＴ１（ＥＡＡＴ２／ＧＬＴ-１）などのマーカーが発現していること、血液脳関門は内皮細胞とともに関与すること、伝達物質の摂取と放出、細胞外空間のイオン濃度を調節すること、ニューロン損傷への反応と神経系修復への関与、及び末梢ニューロンの代謝サポートのうちの１つ又は複数を特徴とする。

いくつかの実施形態では、アストロサイトは、神経系の非ニューロン細胞を意味し、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリーのメンバーＬ１（ＡＬＤＨ１Ｌ１）、又はその両方を発現する。

いくつかの実施形態では、アストロサイトは、神経系の非ニューロン細胞であり、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターにより駆動されるトランスジーン（例えば、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ）を発現する。

いくつかの実施形態では、ミュラーグリア細胞（ＭＧ）は、ＭＧ特異的プロモーターにより駆動されるトランスジーン（例えば、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ））を発現する、網膜に見出された非ニューロングリア細胞を指す。ＭＧ特異的プロモーターは、ＧＦＡＰ、ＧＬＡＳＴ（Ｓｌｃ１ａ３とも呼ばれる）及びＲｌｂｐ１由来のプロモーターを含む。

「ＰＯＵドメイン、クラス３転写因子２」（「ＰＯＵ３Ｆ２」）又は「Ｏｃｔ－７」とも呼ばれる「ＢＲＮ２転写因子」又は「Ｂｒａｉｎ－２転写因子」は、約７５アミノ酸のＮ末端ＰＯＵ特異的ドメインと約６０アミノ酸のＣ末端ＰＯＵ相同ドメインとからなるＤＮＡ結合ＰＯＵドメインを有するクラスＩＩＩＰＯＵドメイン転写因子を指し、これらドメインは短いα-らせんフォールディングを含むリンカーを介して連結され、主に中枢神経系で発現することができる。

「細胞プログラミング剤」という用語は、一般に、ＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現及び／又は機能を阻害することにより、分化した非ニューロン細胞をニューロン細胞にリプログラミングする薬剤を指す。特定の実施形態では、細胞プログラミング剤は、ＰＴＢｍＲＮＡ又はｎＰＴＢｍＲＮＡに相補的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（そのバリアント、誘導体、機能的同等物又は断片を含むことも含まないこともあり得る）を意味し、非ニューロン細胞をニューロン細胞に変換するのに十分な程度まで、好ましくはインビボの局所的な微小環境において、ＰＴＢ又はｎＰＴＢの発現及び／又は活性をノックダウンすることができ、この微小環境において、変換されたニューロンが機能性を有することが期待される。細胞プログラミング剤は、また、上記で定義されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質及び／又はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを指し得る。ポリヌクレオチドは、上記で定義されたＣａｓエフェクターのｍＲＮＡを含むことができる。ポリヌクレオチドは、上記で定義されるＣａｓエフェクター及び／又はＰＴＢ／ｎＰＴＢｍＲＮＡに相補的なｇＲＮＡをコードするＤＮＡをさらに含むことができる。上記で定義されたＣａｓエフェクター及び／又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター又はレンチウイルスベクター、又は以下で説明する他の任意のウイルスベクター）を含むベクターの一部であってもよい。ＡＡＶの場合、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６などを含む、ＣＮＳ及び／又はＰＮＳのグリア細胞又は非ニューロン細胞に対して向性（トロピズム）を有する任意のＡＡＶを使用することができる。ＡＡＶの場合も、同様に、Ｃａｓエフェクターのコード配列がＡＡＶのパッケージング容量よりも小さい、４．７ｋｂ、４．５ｋｂ、４．０ｋｂ、３．５ｋｂ、３．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂまたはそれ以下である限り、上記で定義された任意のＣａｓエフェクターを使用することができる。本願で使用することができる例示的なＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、ＣａｓＲｘ、Ｃａｓ１３ｅ、Ｃａｓ１３ｆ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９、及びそれらの機能的等価物又は断片を含む。最も狭い意味では、「細胞プログラミング剤」という用語は、ｇＲＮＡを有するＣａｓエフェクター又はそれらをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はベクター）と交換して使用することができる。

本明細書に記載された出願に使用することができるＣａｓエフェクタータンパク質は、単一の大きなＣａｓタンパク質を利用して標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を分解するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓクラス２系を含む。適切なクラス２のＣａｓエフェクターは、Ｃａｓ９（例えば、化膿レンサ球菌ＳｐＣａｓ９及びサーモフィラス連鎖球菌Ｃａｓ９）のようなタイプＩＩのＣａｓエフェクターを含むことができる。適切なＣａｓエフェクターはまた、Ｃａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１と呼ばれていたが、例えば、フランシセラ・ノビサイドＣｐｆ１及びプレボテラ菌Ｃｐｆ１）、Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３を含む、ＨＮＨヌクレアーゼを欠くが、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性を有するクラス２Ｖ型Ｃａｓタンパク質であってもよい。特に適切なＣａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３（Ｃ２ｃ２とも呼ばれる）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ／ＣａｓＲｘ、Ｃａｓ１３ｅ、及びＣａｓ１３ｆを含むクラス２のＶＩ型Ｃａｓタンパク質を含むことができ、これらのそれぞれはＲＮＡガイドＲＮａｓｅである（すなわち、これらのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ａにおける標的ＤＮＡ配列ではなく、そのｃｒＲＮＡを用いて標的ＲＮＡ配列を認識する）。一般的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３系は、従来のＲＮＡｉ及びＣＲＩＳＰＲｉ技術と比較して高いＲＮＡ消化効率を実現すると同時に、ＲＮＡｉと比較してオフターゲットの切断が少ない。

したがって、特定の実施形態では、本願の細胞プログラミング剤は、その典型的なｇＲＮＡと共にＰＴＢ又はｎＰＴＢｍＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質であるか、又はこのＣａｓエフェクタータンパク質をコードする。他の実施形態では、ＣａｓエフェクターはＰＴＢ又はｎＰＴＢＤＮＡを標的とする。

本開示の組成物を用いて細胞に「接触する」という句は、組成物（例えば、化合物、核酸、ウイルスベクターなど）を、「接触した」細胞を生成するために細胞に接触することを可能にする位置に配置することを意味する。接触は任意の適切な方法で行うことができる。例えば、一実施形態では、接触は、化合物を細胞培養物に添加することによって行われる。接触はまた、組成物が標的細胞型に「接触」するように、組成物を注射するか、又は体内の位置に送達することによって達成され得る。

「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ／又はｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）」又は「変換」又は「分化誘導」という用語は、デフォルトの細胞型（遺伝子型及び／又は表現型）を非デフォルトの細胞型（遺伝子型及び／又は表現型）に変更することを意味して、交換的に使用され得る。したがって、「アストロサイトにおける分化誘導」とは、アストロサイトの形態からニューロン細胞型の形態（すなわち、マイクロアレイ等の遺伝子解析により決定される遺伝子発現の変化）及び／又は表現型（すなわち、タンパク質発現の変化）への細胞の形態変化を誘導することを意味する。

本明細書で使用されるように、「有効量」とは、未治療の患者に対して疾患の症状を改善するために必要な薬剤の量を意味する。例えば癌の治療のために本願を実施するための活性剤の有効量は、投与方法、被験者の年齢、体重、及び全体的な健康状態に応じて変化する。最終的には、主治医か獣医師が適切な量と投与スケジュールを決定する。このような量は「有効」量と呼ばれ、１ｋｇ当たりのゲノムコピー数（ＧＣ／ｋｇ）として決定することができる。したがって、現在開示されている文脈において、疾患又は状態に「効果的に対抗する」薬物の投与に関しては、臨床的に適切な方法での投与が、少なくとも統計学的に有意な部分の患者に有益な効果、例えば、症状の改善、治癒、少なくとも１つの疾患徴候又は症状の緩和、寿命の延長、生活の質の改善、又は特定のタイプの疾患又は状態の治療に精通している医師が一般的に肯定的であると考える他の効果をもたらすことが示されている。

「発現制御配列」という用語は、少なくともその存在が発現に影響を与えるように設計された配列を含むことが意図されており、追加の有利な構成要素も含むことができる。例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列は、発現制御配列である。この用語はまた、フレーム内及びフレーム外の不要な潜在的開始コドンが配列から除去されるような核酸配列の設計を含むことができる。また、不要な潜在的スプライシング部位を除去するような核酸配列の設計を含むことができる。ｐｏｌｙＡ配列と呼ばれるｍＲＮＡの３’末端のアデニン残基の列であるｐｏｌｙＡテール又はポリアデニル化配列（ｐＡ）の付加を指示する配列を含む。また、ｍＲＮＡの安定性を高めるように設計することもできる。転写及び翻訳の安定性に影響を与えるプロモーターなどの発現制御配列、及び翻訳に影響を与えるＫｏｚａｋ配列などの配列は、当該分野において知られている。発現制御配列は、それに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を調節する性質を有し、それにより、より低い発現レベル又はより高い発現レベルを達成することができる。

「遺伝子」という用語は、適切な調節領域（例えば、プロモーター）に動作可能に連結された、細胞内でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、一般に、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域、及びポリアデニル化部位を含む３’-非翻訳配列（３’-末端）のように、動作可能に連結されたいくつかの断片を含む。「遺伝子の発現」とは、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、生物学的活性を有するＲＮＡに転写され、すなわち生物学的活性を有するタンパク質又はペプチドに翻訳され得るプロセスをいう。

「グリア細胞」という用語は、一般に、中枢神経系（例えば、脳及び脊髄）及び末梢神経系の支持細胞の１種を指し得る。

いくつかの実施形態では、グリア細胞は電気パルスを伝導しないか、又は活動電位を示す。いくつかの実施形態では、グリア細胞は互いに情報を伝達せず、シナプス接続又は電気シグナルを介してニューロンと情報を伝達しない。神経系又はインビトロ培養系において、グリア細胞はニューロンを取り囲み、ニューロンの支持及びニューロン間の絶縁を提供することができる。グリア細胞の非限定的な例としては、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ミュラーグリア細胞、上衣細胞、シュワン細胞、小グリア細胞、らせん神経節グリア細胞、及びサテライト細胞が含まれる。

本明細書では、「ガイド配列」とは、ＲＮＡ又はＤＮＡでガイドされるエンドヌクレアーゼをＲＮＡ又はＤＮＡ分子中の特定の部位にガイドする配列を意味する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）-ＣＡＳ複合体の文脈では、「ガイド配列」は、本願では、さらに、ｇＲＮＡ（又はｃｒＲＮＡ）の一部として理解されるべきであり、ｇＲＮＡ-ＣＡＳ複合体を標的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子の特定の部位に標的化するために必要である。ｇＲＮＡ中の「ガイド配列」は、標的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子中の、「標的配列」である特定の部位に相補的である（下記参照）。

「相同」という用語は、所定の（組換え）核酸又はポリペプチド分子と所定の宿主生物又は宿主細胞との間の関係を表すために使用される場合、自然界において、核酸又はポリペプチド分子が同じ種、好ましくは同じ変種又は菌株の宿主細胞又は生物によって生産されることを意味するものと理解されるべきである。宿主細胞と相同である場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、通常、（必ずしもではないが）別の（異種の）プロモーター配列に動作可能に連結され、適用可能であれば、自然環境における別の（異種の）分泌シグナル配列及び／又はターミネーター配列に動作可能に連結される。制御配列、シグナル配列、ターミネーター配列なども宿主細胞と相同であり得ることが理解されるべきである。この文脈では、「相同」配列要素のみを使用することにより、「自己クローニング」されたトランスジェニック生物（ＧＭＯ’ｓ）の構築が可能になる（本願における自己クローニングの定義は、欧州指令９８／８１／ＥＣ附属書ＩＩにおける定義と同じである）。２つの核酸配列の関連性を表すために使用される場合、「相同」という用語は、１つの一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列とハイブリダイズし得ることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の程度や、後で議論する温度や塩濃度などのハイブリダイゼーション条件など、多くの要因に依存する可能性がある。

核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質について使用される場合、「異種」及び「外因性」という用語は、核酸又はタンパク質が存在する生物、細胞、ゲノム、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列の一部として天然に存在しないか、又は自然界で発見された細胞、あるいはゲノム、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列とは異なる１つ又は複数の位置で発見された核酸又はタンパク質を意味する。異種及び外因性核酸又はタンパク質は、それらが導入された細胞に対して内因性ではなく、他の細胞から取得されたか、合成又は組換えにより生成されたものである。一般的であるが必ずしもそうではないが、このような核酸は、通常はＤＮＡを転写又は発現する細胞によって生成されないタンパク質、すなわち外因性タンパク質をコードする。同様に、外因性ＲＮＡは、外因性ＲＮＡが存在する細胞では通常発現しないタンパク質をコードする。異種／外因性核酸及びタンパク質は、外来核酸又はタンパク質とも呼ばれる。当業者が発現している細胞に外来性であると考える核酸又はタンパク質は、本願では、異種又は外因性核酸又はタンパク質という用語に含まれる。異種及び外因性という用語は、核酸配列又はアミノ酸配列の非天然の組み合わせ、すなわち、少なくとも２つの組み合わせ配列が互いに外因性である組み合わせにも適用される。

「ｍｉｃｒｏＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」は、少なくとも部分的に相補的な核酸配列（ｍＲＮＡ）に結合し、転写後のレベルで標的ｍＲＮＡの発現を負に制御するノンコーディング核酸（ＲＮＡ）配列を意味する。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、通常、二本鎖ヘアピンループ構造を持つ「前駆体」ｍｉＲＮＡから「成熟した」形式に加工される。通常、成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列の長さは約１９～２５ヌクレオチドである。

「ｍｉＲ－９」は短い非コードＲＮＡ遺伝子であり、遺伝子制御に関与し、ショウジョウバエやマウスからヒトに至るまで高度に保存されている。成熟した～２１ｎｔｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体配列からＤｉｃｅｒ酵素により加工されて得られる。ｍｉＲ－９は、発育中及び成体の脊椎動物の脳で最も発現しているｍｉｃｒｏＲＮＡの１つである可能性がある。ＦｏｘＧ１、Ｈｅｓｌ或いはＴｌｘなどの重要な転写調節因子はｍｉＲ－９の直接標的であり、それをニューロン前駆細胞の状態を制御する遺伝子ネットワークの核心に置くことができる。

本明細書で使用される「ニューロン」又は「ニューロン細胞」という用語は、当業者に理解される一般的な意味を有することができる。いくつかの実施形態では、ニューロンは、電気シグナル（例えば、膜電位放電）及び化学シグナル（例えば、神経伝達物質のシナプス伝達）によって情報を受信、処理、伝達することができる電気興奮性細胞を指し得る。当業者によって理解されるように、ニューロン間で伝達される化学的シグナル（例えば、神経伝達物質に基づく放出及び識別）は、シナプスと呼ばれる特別な結合によって生じることができる。

「成熟ニューロン」という用語は、分化したニューロンを指し得る。いくつかの実施形態では、ニューロンは、例えば、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）及びニューロン核抗原（ＮｅｕＮ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、１６０ｋＤａニューロフィラメント媒体、２００ｋＤａニューロフィラメント重鎖、シナプス後密度タンパク質９５（ＰＤＳ－９５）、シナプシンＩ、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ６７）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ６５）、パルブアルブミン、ドーパミン及びｃＡＭＰによって調節された神経リンタンパク質３２（ＤＡＲＰＰ３２）、小胞性グルタミン酸トランスポーター１（ｖＧＬＵＴ１）、小胞性グルタミン酸トランスポーター２（ｖＧＬＵＴ２）、アセチルコリンやチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）などの成熟ニューロンの1つ又は複数のマーカーを発現する場合、成熟ニューロンである。

「機能性ニューロン」という用語は、化学的又は電気的シグナルによって情報を送信又は受信することができるニューロンを指し得る。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、興奮性（例えば、細胞膜に亘る電圧又は膜電位の急速な上昇及びその後の低下などの活動電位を示す能力）、他のニューロンとのシナプス接続の形成、シナプス前神経伝達物質の放出、及びシナプス後応答（例えば、興奮性シナプス後電流又は阻害性シナプス後電流）を含むが、これらに限定されない、正常神経系に存在する成熟ニューロンの１つ又は複数の機能的特性を示す。

いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、シナプシン、シナプトフィジン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ６７）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ６５）、パルブアルブミン、ドーパミン及びｃＡＭＰによって調節された神経リンタンパク質３２（ＤＡＲＰＰ３２）、小胞性グルタミン酸トランスポーター１（ｖＧＬＵＴ１）、小胞性グルタミン酸トランスポーター２（ｖＧＬＵＴ２）、アセチルコリン、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ドーパミン、小胞性ＧＡＢＡトランスポーター（ＶＧＡＴ）、及びγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含むがこれらに限定されない、１つ又は複数の機能性ニューロンのマーカーを発現することを特徴とする。

「非ニューロン細胞」という用語は、ニューロンではないあらゆる種類の細胞を指し得る。例示的な非ニューロン細胞は、ニューロン系統とは異なる細胞系統（例えば造血系統）を有する細胞である。いくつかの実施形態では、非ニューロン細胞は、ニューロン系統の細胞であるが、ニューロンではなく、たとえばグリア細胞である。いくつかの実施形態では、非ニューロン細胞は、グリア細胞、成人初代線維芽細胞、胚線維芽細胞、上皮細胞、メラノサイト、ケラチノサイト、脂肪細胞、血球細胞、骨髄間質細胞、ランゲルハンス細胞、筋肉細胞、直腸細胞又は軟骨細胞などの非ニューロン体細胞であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、非ニューロン細胞は非ニューロン細胞株、例えば、グリア芽細胞腫細胞株、Ｈｅｌａ細胞株、ＮＴ２細胞株、ＡＲＰＥ１９細胞株、又はＮ２Ａ細胞株に由来するが、これらに限定されない。

「細胞系統」や「系統」は、受精胚の組織や器官の発生歴を表すことができる。

「ニューロン系統」とは、神経幹細胞（神経上皮細胞、放射状グリア細胞）、神経前駆細胞（例えば、中間神経前駆体）、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びミクログリア細胞などのようなプロセスに沿った様々な段階（神経発生と呼ばれる）を含む、神経幹細胞から成熟したニューロンまでの発達の歴史を指し得るが、これらに限定されるものではない。

本明細書で使用されるように、生物に言及する場合、「天然に存在しない」という用語は、その生物が、参照種の天然に存在する菌株（参照種の野生型菌株を含む）に通常見られない少なくとも１つの遺伝学的変化を有することを意味する。遺伝学的変化は、例えば、タンパク質又は酵素をコードする発現可能な核酸を導入する修飾、他の核酸の付加、核酸の欠失、核酸の置換、又は生物遺伝物質の他の機能的破壊を含む。このような修飾は、例えば、参照種の異種ポリペプチド又は相同ポリペプチドのコード領域及びその機能的断片を含む。追加の修飾は、例えば、遺伝子又はオペロンの発現を変化させる非コーディング調節領域を含む。酵素又はその機能的断片をコードする核酸分子の遺伝学的修飾は、天然に存在しない生物に、その天然に存在する状態から変化する生化学的反応能又は代謝経路能を付与することができる。

本明細書で交換可能に使用される用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを意味することができる。この用語は、既知のヌクレオチド類似体又は修飾された主鎖残基又は連結体を含み、合成され、天然に存在し、かつ天然に存在せず、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の方法で代謝される核酸を包含することができる。このような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、リン酸メチル、キラルリン酸メチル、２-Ｏ-メチルリボヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

本明細書では、「核酸構築体」又は「核酸ベクター」は、組換えＤＮＡ技術を用いて生成された人工核酸分子を意味するものと理解される。したがって、「核酸構築体」という用語は、天然に存在する核酸分子を含まないが、核酸構築体は天然に存在する核酸分子を（部分的に）含んでいてもよい。「ベクター」は、外因性核酸配列（すなわち、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主細胞に導入するための核酸構築体（通常、ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。ベクターは、自律的複製及び宿主細胞ゲノムへの組み込みの少なくとも１つによって宿主に保持されることが好ましい。「発現ベクター」又は「発現構築体」という用語は、そのような配列と適合する宿主細胞又は宿主生物における遺伝子発現に影響を与えることができるヌクレオチド配列を意味する。これらの発現ベクターは、通常、少なくとも１つの「発現カセット」を含み、これは、発現されるべき産物をコードする配列の発現に影響を与えることができる機能ユニットであり、ここで、コード配列は、少なくとも適切な転写調節配列及び任意に３’転写終結シグナルを含む適切な発現制御配列に動作可能に連結されている。発現エンハンサー要素など、発現に影響を与えるために必要又は有用な他の因子も存在する可能性がある。発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入され、宿主細胞のインビトロ細胞培養物におけるコード配列の発現に影響を与えることができる。好ましい発現ベクターは、ウイルスタンパク質及び／又は核酸、特に組換えＡＡＶタンパク質及び／又は核酸を発現するのに適している。

「オリゴデンドロサイト」とは、ニューロンの軸索を取り囲むミエリン鞘を生成し、中枢神経系の軸索を支持し絶縁するグリア細胞の一種を指し得る。オリゴデンドロサイトはまた、ＰＤＧＦ受容体α（ＰＤＧＦＲ-α）、ＳＯＸＩＯ、神経／グリア抗原２（ＮＧ２）、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２及びＯｌｉｇ３、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、又はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）を発現することを特徴とする。

「ポリピリミジントラクト結合タンパク質」又は「ＰＴＢ」及びそのホモログである神経ＰＴＢ（ｎＰＴＢ）は、いずれも一般的に存在するＲＮＡ結合タンパク質である。ポリピリミジントラクト結合タンパク質１とも呼ばれるＰＴＢは、ヒトにおいてＰＴＢＰ１遺伝子によってコードされる。ＰＴＢＰ１遺伝子は一般的に発現されているヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）サブファミリーに属する。

ｈｎＲＮＰは、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）と複合するＲＮＡ結合タンパク質である。これらのタンパク質は、細胞核内の前駆体ｍＲＮＡに関連しており、前駆体ｍＲＮＡの加工、及びｍＲＮＡの代謝及び輸送の他の面に影響を及ぼすと考えられる。ＰＴＢは、ＲＮＡを結合する、４つの繰り返しの準ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）ドメインを有することができる。ＰＴＢはその広範な発現と一致して、多くの選択的スプライシングイベントを阻害するのに役立つことができる。ＰＴＢは、ＵＣＵＵ及びＵＣＵＣＵのような、ピリミジンに富む環境に位置する短いＲＮＡモチーフを認識することができ、一般に、構成型及び選択的エクソンの３’スプライシング部位の上流のポリピリミジントラクトに関連する。

いくつかの場合、ＰＴＢの結合部位は、エクソン配列と、調節エクソンの下流のイントロンの配列とを含むこともできる。

ＰＴＢによって制御されるほとんどの選択的スプライシング系において、阻害は、ＰＴＢと選択的エクソンの周囲の複数のＰＴＢ結合部位との相互作用によって達成され得る。

いくつかの場合、阻害は単一のＰＴＢ結合部位に関連し得る。ＰＴＢのスプライシング阻害は、ＰＴＢとＵ２ＡＦ６５との直接競合によって生じることができ、これにより反って分岐点でのＵ２ｓｎＲＮＰの組み立てを阻止することができる。いくつかの場合、ＰＴＢのスプライシング阻害は、選択的エクソンの両側に位置するＰＴＢ結合部位に関連し得、また、ＲＮＡをループアウトしたＰＴＢ分子間の相乗的相互作用によって、スプライシング部位がスプライシング機構に入ることができない可能性がある。ＰＴＢのスプライシング阻害は、高親和性結合部位からのＰＴＢの多重化にも関連する可能性があり、選択的エクソンを覆ってその認識を阻止する阻害波を発生させる。

ＰＴＢは非ニューロン細胞で広く発現するが、ｎＰＴＢはニューロンのみに限定されることがある。ＰＴＢ及びｎＰＴＢは、ニューロン分化の過程でプログラムされた変換を受けることができる。例えば、ニューロン分化の過程では、ＰＴＢはニューロン誘導段階で徐々にダウンレギュレーションされ、偶然あるいは必然的に、ｎＰＴＢレベルはピークレベルまで徐々にアップレギュレーションされる。その後、ニューロン分化がニューロン成熟期に入ると、ｎＰＴＢレベルは最初に上昇した後に低下し、その後ニューロン分化過程のピークレベルと比較して相対的に低いレベルに回復し、この時点で細胞は成熟ニューロンに発達する。

ＰＴＢとｎＰＴＢの配列は既知であるため(例えば、Romanelli et al. (2005) Gene 356:11-8; Robinson et al., PLoS One. (2008) 3(3):el801. doi:10.1371/journal.pone.0001801; Makeyev et al., Mol. Cell (2007) 27(3):435-448を参照)、当業者は、本願の方法を実施するために、例えばＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現を低下又は阻害するように調節するｇＲＮＡ分子等を設計及び構築することができる。

「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、交換して使用することができ、特定の作用パターン、大きさ、３次元構造又は由来を問わず、アミノ酸ポリマー又は２種以上の相互作用又は結合したアミノ酸ポリマーのセットを指し得る。

本明細書で使用されるように、「プロモーター」又は「転写調節配列」という用語は、コード配列転写開始部位の転写方向上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、及び任意の他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に識別される、１つ又は複数のコード配列の転写を制御する機能を有する核酸断片を意味し、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータタンパク質結合部位、エンハンサー、及びプロモーターの転写量を直接又は間接的に調節するために当業者に知られている任意の他のヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されない。「構成型」プロモーターは、大多数の環境と発育条件下で大多数の組織において活性を有するプロモーターである。「誘導型」プロモーターは、環境又は発育によって調節されるものであり、例えば、化学的誘導剤又は生物学的実体を用いて誘導されるものである。

本明細書で使用されるように、「動作可能に連結される」という用語は、機能関係にあるポリヌクレオチド（又はポリペプチド）要素の連結を意味する。核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合には、「動作可能に連結されている」。例えば、転写調節配列がコード配列の転写に影響を与える場合、それはコード配列に動作可能に連結される。動作可能に連結されることは、連結されるＤＮＡ配列が、通常は連続しており、必要に応じて２つのタンパク質のコード領域を連結し、連続しており、リーディングフレーム内にあることを指す。発現制御配列は、ヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節する場合に、ヌクレオチド配列に「動作可能に連結されている」。したがって、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及びターミネートコドンを含むことができる。

「リプログラミング」又は「分化転換」という用語は、多能性幹細胞の特徴を示す細胞へと細胞を脱分化させることなく、異なるタイプの細胞（例えば、線維芽細胞）からある系統の細胞（例えば、ニューロン細胞）を生成する中間プロセスを指し得る。

「多能性」とは、体又は体細胞（つまり胚そのもの）のすべての系統を形成する細胞の能力を指し得る。例示的な「多能性幹細胞」は、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞を含むことができる。

用語「配列同一性」、「相同性」などは、本明細書では互換的に使用され得る。配列同一性は、配列を比較することによって決定されるように、２以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係として本願で定義される。当該分野では、「同一性」とは、場合によっては、アミノ酸配列又は核酸配列間の配列関連性の程度を意味し、そのような配列の列間の一致によって決定される。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存アミノ酸置換体と、２番目のポリペプチドの配列とを比較することにより決定される。「同一性」や「類似性」は、既知の方法で容易に算出することができる。

「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列を、２つの配列の長さに依存して、グローバルまたはローカルアラインメントアルゴリズムを用いてアラインメントすることにより決定することができる。類似した長さの配列は、全体の長さにわたって配列を最適にアラインメントするグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎＷｕｎｓｃｈ）を用いてアラインメントすることが好ましく、本質的に異なる長さの配列は、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、ＳｍｉｔｈＷａｔｅｒｍａｎ）を用いてアラインメントすることが好ましい。配列が（例えば、プログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによってデフォルトパラメータを用いて最適なアラインメントを行う場合に）、配列同一性の少なくともある最小パーセントを共有する場合（以下で定義されるように）、配列は、「実質的に同じ」又は「実質的に類似」と呼ばれることがある。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを用いて、全体の長さ（全長）にわたって２つの配列をアラインメントし、一致する数を最大化し、ギャップの数を最小化する。２つの配列が類似した長さを有する場合、配列の同一性を決定するのにグローバルアラインメントが適している。通常、デフォルトのＧＡＰパラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、ギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドについてはｎｗｓｇａｐｄｎａ、タンパク質についてはＢｌｏｓｕｍ６２(Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919)のデフォルトスコアリング行列が使用される。配列アラインメント及び配列同一性パーセントのスコアは、Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USAから入手可能なＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅバージョン１０．３、又はＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）又は「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）などのオープンソースソフトウェアなどのコンピュータプログラムを用いて、上記のＧＡＰと同じパラメータ、又はデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」と「ｗａｔｅｒ」及びタンパク質とＤＮＡアラインメントの場合、デフォルトのギャップ開放ペナルティは１０．０、デフォルトのギャップ伸長ペナルティは０．５である。デフォルトのスコアリング行列はタンパク質のＢｌｏｓｓｕｍ６２とＤＮＡのＤＮＡＦｕｌｌである）で決定することができる。配列の全長が実質的に異なる場合、ローカルアラインメントが望ましい。例えば、ＳｍｉｔｈＷａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するものである。

あるいは、類似性又は同一性パーセントは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを用いて共通データベースを検索することによって決定することができる。したがって、本願の核酸配列及びタンパク質配列は、例えば他のファミリーのメンバー又は関連配列を同定するために、共通データベースを検索するための「照会配列」としてさらに使用することができる。この検索には、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を用いて、本願の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｘプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて、本願のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップアラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されているように、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）を使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/国立バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照する。
別段の記載がない限り、交換して使用可能な「被験者」及び「患者」という用語は、ヒト及び非ヒト霊長類のような哺乳動物、ならびにウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ブタ及び他の哺乳動物種を指し得る。この用語は、被験者が特定の疾患と診断されたことを必ずしも示すものではなく、医学的監督下にある個人を指し得る。

「標的配列」とは、標的化される核酸内のヌクレオチドの順序（例えば、改変が導入されるか検出される）を意味する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）-ＣＡＳ複合体の文脈では、「標的配列」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子内の部分であり、ｇＲＮＡ中の「ガイド配列」との相補性によってｇＲＮＡ－ＣＡＳ複合体によって標的化されていることが本願でさらに理解される（上記も参照）。同様に、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｍｉＲＮＡは、標的化されるＲＮＡ又はＤＮＡ分子内の「標的配列」とのその相補性により標的化される。

例えば、標的配列は、ＤＮＡ二本鎖体の第１鎖に含まれるヌクレオチドの順序である。

例えば、開示された方法及び組成物から利益を得る哺乳動物種は、類人猿、チンパンジー、オランウータン及びヒトのような霊長類を含むが、これらに限定されない。

「ベクター」とは、別の核酸を細胞に運ぶことができる核酸のことである。ベクターは、適切な環境に存在する場合、ベクターに担持された１つ又は複数の遺伝子によってコードされる１つ又は複数のタンパク質、又はポリヌクレオチドによってコードされるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現を指導することができる。

本明細書に記載されている物質の薬物としての使用は、当該物質の薬物製造における使用と解釈することもできる。同様に、ある物質が治療に用いられたり、薬物として用いられたりする場合、治療薬の製造にも用いることができる。本願に記載された薬物として使用される製品は、使用された製品を投与することを含む治療方法に使用することができる。

「ウイルスベクター」は、別の核酸を細胞に運ぶことができるウイルス由来の核酸である。ウイルスベクターは、適切な環境に存在する場合、ベクターに担持された１つ又は複数の遺伝子によってコードされる１つ又は複数のタンパク質、又はベクターに担持されたポリヌクレオチドによってコードされるｍｉｃｒｏＲＮＡの発現を指導することができる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。

汎用的な方法及び組成物
一態様では、本願は、非ヒト霊長類又はヒトの神経系領域における機能性ニューロンの変性に関連する神経状態を治療する方法に関する。方法は、好ましくは、細胞プログラミング剤を含む有効量の組成物を必要とされる被験者に投与するステップを含む。一実施形態では、細胞プログラミング剤を含む組成物は、非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を阻害して、非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングすることを可能にするために霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列若しくはその相補配列を標的とする核酸分子を少なくとも含む。したがって、霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列若しくはその相補配列を標的とする核酸分子は、アンチセンス核酸（例えば、エクソンスキッピングを誘導するための）、ｍｉＲＮＡ、又はガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ活性を指導するためのｇＲＮＡ）のうちの少なくとも１つであってもよく、又はそれらをコードしてもよい。

一実施形態では、細胞プログラミング剤を含む組成物中の核酸分子は、霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列を標的とする核酸分子であり、又は二本鎖ＰＴＢＤＮＡ又はＲＮＡ配列の場合、核酸分子は、２本の相補鎖のいずれかを標的とすることができる。核酸分子が霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列（又はその相補配列）を標的とすることは、少なくとも一部の核酸分子が霊長類ＰＴＢ核酸中の標的配列と実質的に相補的であることで、好ましくは生理学的条件下で霊長類ＰＴＢ核酸塩基と対になるようにし、その生物学的効果、すなわち非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性の阻害を発揮することを意味すると理解される。

本発明者らは、霊長類又はヒトのＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡの有効な標的配列の中の標的配列を同定しており、本願の核酸分子による標的配列の標的化は、非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を効果的に阻害することを保証し、これは以下でさらに詳しく説明する。

一実施形態では、細胞プログラミング剤を含む組成物は、ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質及びポリピリミジン配列結合タンパク質（ＰＴＢ）ｍＲＮＡに相補的なｇＲＮＡ、又はｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質及びＰＴＢｍＲＮＡに相補的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１種の発現ベクターを含む。

具体的には、本願の一態様は、非ニューロン細胞を成熟ニューロンにリプログラミングする方法を提供する。例示的な方法は、非ニューロン細胞を提供するステップと、非ニューロン細胞におけるＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現及び／又は活性を阻害する細胞プログラミング剤（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター又はそれらをコードするポリヌクレオチド）を含む組成物に非ニューロン細胞を接触させることにより、非ニューロン細胞を成熟ニューロンにリプログラミングするステップと、を含む。方法及び組成物は、インビトロで細胞を変換するだけでなく、神経系（例えば線条体、網膜、内耳及び脊髄）においてインビボで直接変換する。

いくつかの実施形態では、本願は、ｉ）ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質と霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、又はｉｉ）ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質をコードし、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡをコードする少なくとも１種の発現ベクターを含む組成物の有効量を、必要な被験者の神経系領域における非ニューロン細胞に投与することにより、非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を阻害して、非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングすることを可能にする、非ヒト霊長類又はヒトの神経系領域における機能性ニューロンの変性に関連する神経状態を治療する方法に関する。

本開示のいくつかの実施形態によれば、非ヒト霊長類又はヒトの非ニューロン細胞（例えば、成熟網膜中のＭＧ細胞又は線条体のアストロサイト）におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現及び／又は活性を阻害する単一細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ）は、非ニューロン細胞を成熟ニューロン（例えば、それぞれ、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）ニューロン、網膜光受容体、又はドーパミンニューロン）に直接変換することができる。いくつかの実施形態では、単一細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ）を介して非ニューロン細胞をニューロンに直接変換することは、単一細胞プログラミング剤と接触させるだけで、他の介入を必要とせずに非ニューロン細胞をニューロンに変換することを意味し得る。

別の実施形態では、本開示は、アストロサイトを成熟ニューロンにリプログラミングする方法を提供する。例示的な方法は、リプログラミングされるアストロサイトを提供するステップと、アストロサイトを、アストロサイトにおけるＰＴＢの発現又は活性を阻害する細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢ／ｎＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ又はそれらをコードするポリヌクレオチド）を含む組成物と少なくとも１日接触させることにより、アストロサイトをドーパミンニューロンのような成熟ニューロンにリプログラミングするステップと、を含む。いくつかの実施形態では、アストロサイトにおけるＰＴＢの発現又は活性を阻害する単一細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ）は、アストロサイトをドーパミンニューロンのようなニューロンに直接変換することができる。いくつかの実施例では、アストロサイトは線条体中にある。

別の実施形態では、本願は、ＭＧ細胞（例えば、成熟網膜中の細胞）をＲＧＣニューロンにリプログラミングする方法を提供する。例示的な方法は、リプログラミングされるＭＧ細胞を提供するステップと、ＭＧ細胞を、ＭＧ細胞におけるＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現又は活性を阻害する細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢ／ｎＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ又はそれらをコードするポリヌクレオチド）を含む組成物と少なくとも１日接触させることにより、ＭＧ細胞をＲＧＣニューロンにリプログラミングするステップと、を含む。いくつかの実施形態では、ＭＧ細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を阻害する単一細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ）は、ＭＧ細胞をＲＧＣニューロンに直接変換することができる。いくつかの実施形態では、ＭＧ細胞は成熟網膜中にある。

本開示によれば、いくつかの場合、ＰＴＢ減少は多くの重要なニューロン分化因子を誘導することができる。例えば、ある理論に縛られることは望ましくないが、ＰＴＢとｎＰＴＢは独立しているが互いに絡み合っている２つのループにそれぞれ関与することができ、これはニューロン分化において重要であり得る。ＰＴＢはニューロン誘導ループを阻害することができ、ｍｉｃｒｏＲＮＡｍｉＲ－１２４は転写リプレッサーＲＥ１－サイレント転写因子（ＲＥＳＴ）を阻害することができ、後者はｍｉＲ－１２４及び多くのニューロン特異的遺伝子の誘導（ループＩ）を阻害することができる。通常のニューロン分化過程では、ＰＴＢを徐々にダウンレギュレーションさせることができるため、ＰＴＢのダウンレギュレーションにより、転写活性化因子Ｂｒｎ２とｍｉＲ－９（ループＩＩ）を含むニューロン成熟の第２ループの一部であるｎＰＴＢの発現を誘導することができる。ループＩＩでは、ｎＰＴＢがＢｒｎ２を阻害するので、ｍｉＲ-９が阻害され、逆には、ｍｉＲ-９がｎＰＴＢを阻害する。

いくつかの実施形態によれば、非ニューロン細胞におけるｍｉＲ-９又はＢｒｎ２の発現レベルは、非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を阻害する細胞プログラミング剤によって、非ニューロン細胞の成熟ニューロンへの変換に影響を与えることができる。例えば、成人線維芽細胞はｍｉＲ－９及びＢｒｎ２の発現レベルが低い場合がある。いくつかの実施形態では、成人線維芽細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を阻害する単一の薬剤は、ニューロン様細胞へ分化できるが（例えば、Ｔｕｊ１タンパク質の発現）、成熟ニューロンへは分化しない（例えば、ＮｅｕＮタンパク質又は成熟ニューロンの他のマーカーの発現）ように成人線維芽細胞を誘導することができる。

特定の理論に縛られることは望ましくないが、いくつかの実施形態では、主題となる方法及び組成物は、非ニューロン細胞をニューロンへと誘導する分子変化において強化されたフィードバックループを生成するのに特に効果的である。特定の理論に縛られることは望ましくないが、ＰＴＢの発現又は活性が最初に外因性抗ＰＴＢ薬剤によってダウンレギュレーションされる場合、ＲＥＳＴレベルはダウンレギュレーションすることができ、これはまたｍｉＲ－１２４レベルのアップレギュレーションを招く。

特定の理論に縛られることは望ましくないが、いくつかの場合、ｍｉＲ－１２４はＰＴＢの発現を標的化し、阻害することができるので、アップレギュレーションされたｍｉＲ－１２４は細胞におけるＰＴＢの阻害を強化することができる。この積極的な増強作用は、ＰＴＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのような抗ＰＴＢ剤が細胞内に存在し、一時的にのみ活性を有する場合があるとしても、永続的であり得る。

本開示のいくつかの実施形態によれば、ヒト非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害する単一細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢ／ｎＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ又はそれらをコードするポリヌクレオチド）は、任意にヒト非ニューロン細胞が成人線維芽細胞で発現されるレベルよりも高いレベルでｍｉＲ-９又はＢｒｎ２を発現する場合に、非ニューロン細胞を成熟ニューロンに直接変換することができる。

本明細書で提供される方法で使用され得る例示的なヒト非ニューロン細胞は、ｍｉＲ-９又はＢｒｎ２を、成人線維芽細胞で発現されるレベルよりも少なくとも２倍高いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ヒト非ニューロン細胞は、ｍｉＲ-９又はＢｒｎ２を、成人線維芽細胞で発現されるレベルよりも少なくとも約１．２、１．５、２、５、１０、１５、２０又は５０倍高いレベルで発現する。

いくつかの実施形態では、ヒト非ニューロン細胞がｍｉＲ－９及びＢｒｎ２を成人線維芽細胞で発現されるレベルよりも高いレベルで発現する場合、ヒト非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害する単一細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢ／ｎＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ）は、非ニューロン細胞を成熟ニューロンに直接変換することができる。

本明細書で提供される方法で使用され得る例示的なヒト非ニューロン細胞は、ｍｉＲ-９及びＢｒｎ２を、成人線維芽細胞で発現されるレベルよりも少なくとも２倍高いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ヒト非ニューロン細胞は、ｍｉＲ-９及びＢｒｎ２を、成人線維芽細胞で発現されるレベルよりも少なくとも約１．２、１．５、２、５、１０、１５、２０、又は５０倍高いレベルで発現する。

いくつかの実施形態では、ヒト非ニューロン細胞が内因性ｍｉＲ-９又は内因性Ｂｒｎ２を成人線維芽細胞で発現されるレベルよりも高いレベルで発現する場合、ヒト非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害する単一細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢ／ｎＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ）は、非ニューロン細胞を成熟ニューロンに直接変換することができる。いくつかの実施形態では、ヒト非ニューロン細胞には外因性ｍｉＲ－９が導入されていない。いくつかの実施形態では、ヒト非ニューロン細胞には外因性Ｂｒｎ２が導入されていない。
いくつかの実施形態では、非ニューロン細胞におけるｍｉＲ－９又はＢｒｎ２の発現レベルは、当業者に理解されている任意の技術によって評価することができる。例えば、細胞におけるｍｉＲ－９の発現レベルは、逆転写（ＲＴ）-ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ｍｉＲＮＡアレイ、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ-ｓｅｑ）、及びマルチプレックスｍｉＲＮＡ解析によって測定することができる。ｍｉＲ－９の発現レベルは、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションのようなｉｎｓｉｔｕ法で測定することもできる。タンパク質としてのＢｒｎ２の発現レベルは、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）及び免疫染色などの従来技術、又はタンパク質マイクロアレイ及び分光法などを含むが、これらに限定されない他の技術（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ））によって測定することができる。いくつかの実施形態では、細胞又はある種の組織／細胞におけるｍｉＲ-９の発現レベルに関する情報は公的に利用可能なｍｉｃｒｏＲＮＡデータベースを参照することによって得ることができ、このようなデータベースは、ヒトＭｉＲＮＡ発現データベース（ＨＭＥＤ）、ｍｉＲＧａｔｏｒ３．０、ｍｉＲｍｉｎｅ及びＰｈｅｎｏｍｉＲなどであるが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、細胞又はある種の組織／細胞におけるｍｉＲ－９の発現レベルに関する情報は公的に利用可能なタンパク質発現データベースを参照することによって得ることができ、これらのデータベースは、ヒトタンパク質アトラス、ＧｅＭＤＢＪプロテオミクス、ヒトプロテインペディア（ＨｕｍａｎＰｒｏｔｅｉｎｐｅｄｉａ）、及びＫａｈｎ動的プロテオミクスデータベースを含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態によれば、例示的な方法は、リプログラミングされるヒト非ニューロン細胞を提供するステップと、ヒト非ニューロン細胞を、ヒト非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性の低下、及びＰＴＢの発現又は活性の低下後のｎＰＴＢの発現又は活性の低下をもたらす単一細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢ／ｎＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ）を含む組成物と接触させるステップと、を含む。いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤は、ある種の非ニューロン細胞（例えば、ヒト非ニューロン細胞、例えば、ヒトグリア細胞）におけるＰＴＢ及びｎＰＴＢの発現又は活性レベルに関する連続的なイベントを引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ）との接触の直接的な作用は、非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を低下させることである。いくつかの実施形態では、非ニューロン細胞において、非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性の低下は、非ニューロン細胞におけるｎＰＴＢの発現レベルの初期上昇を伴う。いくつかの実施形態では、ＰＴＢの発現又は活性が阻害されると、初期ｎＰＴＢ発現レベルは、高いｎＰＴＢ発現レベルまで上昇する。いくつかの実施形態では、ｎＰＴＢ発現は、初期上昇の後に、高いｎＰＴＢ発現レベルから低いｎＰＴＢ発現レベルに低下する。いくつかの実施形態では、ＰＴＢの発現又は活性が阻害されると、低ｎＰＴＢ発現レベルは、初期ｎＰＴＢ発現レベルよりも高いままである。いくつかの実施形態では、ＰＴＢの発現又は活性を阻害する細胞プログラミング剤以外の外部介入がない場合、ｎＰＴＢの発現レベルは、初期上昇後に自発的に低下する。ある理論に縛られることは望ましくないが、細胞プログラミング剤によるＰＴＢの発現又は活性の低下後の、非ニューロン細胞におけるｎＰＴＢの発現レベルの低下は、細胞プログラミング剤による非ニューロン細胞の成熟ニューロンへの直接変換に関連し得る。いくつかの実施形態によれば、ＰＴＢの発現又は活性を阻害する単一細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ）は、成人線維芽細胞（例えば、ｎＰＴＢ）において上記の順序イベントを誘導しない。例えば、ｎＰＴＢは発現レベルの初期上昇を経験することができるが、その後、ある低いレベルまで低下しない。

いくつかの実施形態では、ヒトアストロサイトにおいて、ヒトアストロサイトにおけるＰＴＢの発現又は活性を阻害する単一細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ）は、ＰＴＢの発現又は活性の即時の低下、ｎＰＴＢの発現レベルの初期上昇、及びｎＰＴＢの発現レベルのその後の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＴＢの発現又は活性を阻害する単一細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ）は、ヒトアストロサイトを成熟ニューロンに直接変換する。いくつかの実施形態では、非ニューロン細胞におけるｍｉＲ-９又はＢｒｎ２の発現レベルは、細胞プログラミング剤によってＰＴＢの発現又は活性が阻害された後に、非ニューロンにおけるｎＰＴＢの発現レベルが最初に上昇した後に低下するか否かに関連していてもよい。例えば、ヒトアストロサイトでは、ｍｉＲ－９又はＢｒｎ２の発現レベルは成人線維芽細胞よりも高く、非ニューロンにおけるｎＰＴＢ発現レベルは、細胞プログラミング剤によってＰＴＢの発現又は活性が阻害された後、最初に上昇した後に低下するが、成人線維芽細胞では、上述したように、いくつかの場合、ｎＰＴＢ発現レベルのその後の低下が起こらない場合がある。

いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される方法において、成熟ニューロンにリプログラミングされ得る例示的な非ニューロン細胞は、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、小グリア細胞、ミュラーグリア細胞、らせん神経節グリア細胞、シュワン細胞(Schwan cell)、ＮＧ２細胞、及びサテライト細胞などのグリア細胞を含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、霊長系グリア細胞、例えば、ヒトグリア細胞又は非ヒト霊長系グリア細胞であってもよい。グリア細胞は、霊長類アストロサイト、例えばヒトアストロサイト又は非ヒト霊長類アストロサイトであることが好ましい。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で使用することができるグリア細胞は、脳から単離されたグリア細胞である。いくつかの実施形態では、グリア細胞は細胞培養物中のグリア細胞、例えば親グリア細胞から分裂したグリア細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるグリア細胞は、外部誘導によってさまざまなタイプの細胞から分化したグリア細胞、例えば、分化因子を含有する培地中でニューロン幹細胞からインビトロで分化したグリア細胞、又は誘導多能性幹細胞から分化したグリア細胞である。いくつかの他の実施形態では、グリア細胞は、神経系中のグリア細胞、例えば、成熟網膜中のＭＧ細胞、又は線条体のような脳領域に存在するアストロサイトである。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で使用することができるアストロサイトは、脳又は脊髄中のアストログリア細胞である。いくつかの実施形態では、アストロサイトは、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）及びアルデヒド脱水素酵素１ファミリーのメンバーＬＩ（ＡＬＤＨ１Ｌ１）、興奮性アミノ酸トランスポーター１／アスパラギン酸グルタミン酸トランスポーター（ＥＡＡＴ１／ＧＬＡＳＴ）、グルタミン合成酵素、Ｓ１００β又は興奮性アミノ酸トランスポーター１／グルタミン酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ２／ＧＬＴ-１）を含むが、これらに限定されない、公知のアストロサイトマーカーの１つ又は複数を発現する。いくつかの実施形態では、アストロサイトは、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリーのメンバーＬＩ（ＡＬＤＨ１Ｌ１）、又はその両方を発現する。いくつかの実施形態では、アストロサイトは、神経系の非ニューロン細胞であり、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターにより駆動されるトランスジーン（例えば、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、Ｃｒｅリコンビナーゼ）を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたアストロサイトは、ニューロンマーカー、例えば、Ｔｕｊ１、ＮＳＥ、ＮｅｕＮ、ＧＡＤ６７、ＶＧｌｕＴ１又はＴＨに対して免疫陽性ではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたアストロサイトは、オリゴデンドロサイト転写因子２、ＯＬＩＧ２などのオリゴデンドロサイトマーカーに対して免疫陽性ではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたアストロサイトは、小グリア細胞マーカー、例えば、膜貫通タンパク質１１９（ＴＭＥＭ１１９）、ＣＤ４５、イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａｌ）、ＣＤ６８、ＣＤ４０、Ｆ４／８０、又はＣＤ１１抗原様ファミリーメンバーＢ（ＣＤｌｌｂ）に対して免疫陽性ではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたアストロサイトは、ＮＧ２細胞マーカー（例えば、神経／グリア抗原２、ＮＧ２）に対して免疫陽性ではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたアストロサイトは、神経前駆細胞マーカー、例えば、ネスティン、ＣＸＣＲ４、Ｍｕｓａｓｈｉ、Ｎｏｔｃｈ-１、ＳＲＹ-Ｂｏｘ１（ＳＯＸ１）、ＳＲＹ-Ｂｏｘ２（ＳＯＸ２）、段階特異的胚抗原１（ＳＳＥＡ-１、ＣＤ１５とも呼ばれる）、又はビメンチンなどに対して免疫陽性ではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたアストロサイトは、多能性マーカー、例えば、ＮＡＮＯＧ、８量体結合転写因子４（Ｏｃｔ-４）、ＳＯＸ２、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子４（ＫＬＦ４）、ＳＳＥＡ-１又は段階特異的胚抗原４（ＳＳＥＡ-４）に対して免疫陽性ではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたアストロサイトは、線維芽細胞マーカー（例えば、フィブロネクチン）に対して免疫陽性ではない。

アストロサイトは、さまざまなタイプ又は分類を含むことができる。本願の方法は、さまざまなタイプのアストロサイトに適用することができる。さまざまなタイプのアストロサイトの非限定的な例としては、Ｒａｎ２^＋、ＧＦＡＰ^＋、線維芽細胞増殖因子受容体３陽性（ＦＧＦＲ３^＋）及びＡ２Ｂ５であってもよい１型アストロサイトが含まれる。１型アストロサイトは、３電位グリア限定前駆細胞（ＧＲＰ）により生成され得る。１型アストロサイトは、２電位の０２Ａ／０ＰＣ（オリゴデンドロサイト、２型アストロサイト前駆体）細胞に由来しない可能性がある。他の非限定的な例としては、Ａ２Ｂ５^＋、ＧＦＡＰ^＋、ＦＧＦＲ３^－、及びＲａｎ２であってもよい２型アストロサイトが含まれる。２型アストロサイトは、３電位ＧＲＰ又は２電位０２Ａ細胞からインビトロで、又はこれらの前駆細胞を損傷部位に移植する際にインビボで発生することができる。本明細書で提供される方法に使用することができるアストロサイトは、その解剖学的表現型に応じて、例えば、灰白質に見られ、末端足がシナプスを封入する多数の分岐突起（ｂｒａｎｃｈｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）を有する原形質アストロサイト、白質に見られ、終足がランビエ節を封入する長細い非分岐突起を有する線維アストロサイトなど、さらに分類することができる。本明細書で提供される方法で使用することができるアストロサイトはまた、ＧｌｕＴ型及びＧｌｕＲ型を含むことができる。ＧｌｕＴ型アストロサイトはグルタミン酸トランスポーター（ＥＡＡＴ１／ＳＬＣ１Ａ３及びＥＡＡＴ２／ＳＬＣ１Ａ２）を発現し、トランスポーター電流によってグルタミン酸のシナプス放出に応答することができ、一方、ＧｌｕＲ型アストロサイトはグルタミン酸受容体（主にｍＧｌｕＲ及びＡＭＰＡ型）を発現し、チャネル媒介電流及びＩＰ３依存性Ｃａ２^＋を介してグルタミン酸のシナプス放出に瞬間的に応答する。
細胞プログラミング剤、その成分及びそれを含む組成物

本明細書で提供されるように、細胞プログラミング剤を含む組成物は、非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を阻害して、非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングすることを可能にするために、霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列若しくはその相補配列を標的とする核酸分子を含む。一実施形態では、核酸分子は、霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列若しくはその相補配列を標的とする少なくとも１つのアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、又はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であるか、又はそれらをコードする。

いくつかの実施形態では、核酸分子（例えば、ｇＲＮＡ）は、非ヒト霊長類ＰＴＢ遺伝子配列、好ましくはヒトＰＴＢ遺伝子配列などの霊長類ＰＴＢ遺伝子配列中の標的配列を標的とする。標的化される霊長類ＰＴＢ遺伝子配列の例は、例えば、ヒトＰＴＢＰ１遺伝子配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＩＤ５７２５）を含む。

霊長類とヒトＰＴＢ及びｎＰＴＢの配列は既知であるので（例えば、Romanelli et al. (2005) Gene, August 15:356:11-8; Robinson et al., PLoS One. 2008 Mar. 12; 3(3):e1801. doi: 10.1371/journal.pone.0001801; Makeyev et al., Mol. Cell (2007) August 3; 27(3):435-48を参照)、したがって、当業者は、霊長類ＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現を調節、例えば低下又は阻害して、本願の方法を実施するために、アンチセンス、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡガイドＲＮＡ分子などを設計及び構築することができる。

いくつかの実施形態では、核酸分子（例えば、ｇＲＮＡ）は、霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ配列中の標的配列を標的とし、ヒトと非ヒト霊長類との間で保存される。

いくつかの実施形態では、核酸分子（例えば、ｇＲＮＡ）は、非ヒト霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列などの霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列、好ましくはヒトＰＴＢｍＲＮＡ配列の標的配列を標的とする。いくつかの実施形態では、核酸分子（例えば、ｇＲＮＡ）は、霊長類ｍＲＮＡ配列中のタンパク質コード配列中の標的配列を標的とする。

いくつかの実施形態では、ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列は、配列番号８７と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のＰＴＢ配列に含まれる。好ましい標的配列は、非ニューロン細胞における霊長類ＰＴＢタンパク質の発現又は活性を効果的に阻害するように標的化された標的配列である。したがって、一実施形態では、ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列は、配列番号８７と少なくとも９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一のＰＴＢ配列に含まれ、標的配列がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で標的化された場合、前記ｇＲＮＡのガイド配列は、配列番号１～８６の少なくとも１つの配列と少なくとも１０ヌクレオチドの重複を有し、前記ｇＲＮＡは、Ｃｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現し、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、上記細胞において０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１５未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現量が観察される。より好ましくは、ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列は、配列番号８７と少なくとも９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一のＰＴＢ配列に含まれ、標的配列がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で標的化された場合、前記ｇＲＮＡのガイド配列は配列番号１～８６のうちの少なくとも１つを含む、又は配列番号１～８６のうちの少なくとも１つからなり、前記ｇＲＮＡは、Ｃｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現し、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、上記細胞において、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１５未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現量が観察される。

一実施形態では、ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列は、ＰＴＢ配列中の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチド及び／又は６０、５５、５０、４５、４０、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、又は２６個以下のヌクレオチドの連続配列を含むか、又はそれらからなり、該ＰＴＢ配列は、配列番号８７と少なくとも９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一である。

一実施形態では、ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列は、ＰＴＢ配列中の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチド及び／又は６０、５５、５０、４５、４０、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、又は２６個以下のヌクレオチドの連続配列を含むか、又はそれらからなり、該ＰＴＢ配列は、配列番号８７の９５１～１４８７位と少なくとも９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一であり、好ましくは、標的配列がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で標的化された場合、前記ｇＲＮＡのガイド配列は、配列番号３８～６８のうちの少なくとも１つを含むか、又はそれらからなり、前記ｇＲＮＡは、Ｃｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現し、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、上記細胞において０．５０、０．４５、０．４０、０．３５、０．３、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１５未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現量が観察される。

一実施形態では、ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列は、ＰＴＢ配列中の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個のヌクレオチド及び／又は６０、５５、５０、４５、４０、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７又は２６個以下のヌクレオチドの連続配列を含むか、又はそれらからなり、該ＰＴＢ配列は、配列番号８７の１０００～１４８７位；配列番号８７の１０５０～１４８７位；配列番号７の１１００～１４８７位；配列番号８７の１１５０～１４８７位；配列番号８７の１２００～１４８７位；配列番号８７の１２５０～１４８７位；配列番号８７の１３００～１４８７位；配列番号７の１３５０～１４８７位；配列番号８７の１４００～１４８７位；配列番号８７の９５１～１４００位；配列番号８７の９５１～１３５０位；配列番号８７の９５１～１３００位；配列番号８７の９５１～１２５０位；配列番号８７の９５１～１２００位；配列番号８７の９５１～１１５０位；配列番号８７の９５１～１１００位；配列番号８７の９５１～１０５０位；及び配列番号８７の置９５１～１０００位の少なくとも１つと少なくとも９５、９６、９７、９８、９９又は１００％同一である。また、好ましくは、標的配列がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で標的化された場合、前記ｇＲＮＡのガイド配列は配列番号３８～６８の少なくとも１つを含むか、又はそれらからなり、前記ｇＲＮＡは、Ｃｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現し、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、上記細胞において０．５０、０．４５、０．４０、０．３５、０．３、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１５未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現量が観察される。

本願によれば、霊長類ＰＴＢ標的配列を標的とするために使用される核酸分子又は核酸配列は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はこれらの任意の断片、ゲノム又は合成由来のＤＮＡ又はＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖であってもよく、センス鎖又はアンチセンス鎖を表す場合がある）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は天然又は合成由来の任意のＤＮＡ様又はＲＮＡ様物質であってもよい。本願を実施するための核酸分子は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド又はこれらの任意の断片を含む「核酸」又は「核酸配列」；ゲノム又は合成由来（一本鎖又は二本鎖であってもよく、センス鎖又はアンチセンス鎖を表す場合がある）のＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｉＲＮＡ）、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は天然又は合成由来の任意のＤＮＡ様又はＲＮＡ様物質（例えば、ｉＲＮＡ、リボヌクレオタンパク（例えば、ｉＲＮＰのような二本鎖ｉＲＮＡ）を含む。本願を実施するための核酸分子は、核酸、すなわち天然ヌクレオチドの既知の類似体を含むオリゴヌクレオチドを含む。本願を実施するための核酸分子は、例えばMata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156を参照して、合成骨格を有する核酸様構造を含む。本願を実施するための核酸分子は、化学的に合成可能な一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は相補的な２本のポリデオキシヌクレオチド鎖を含む「オリゴヌクレオチド」を含む。本願を実施するための核酸分子は、５’リン酸塩を有さない合成オリゴヌクレオチドを含むので、キナーゼの存在下でＡＴＰを有するリン酸塩を添加しなければ、他のオリゴヌクレオチドに連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、非脱リン酸化断片に連結されていてもよい。

一実施形態では、本願によれば、霊長類ＰＴＢ標的配列を標的とするために使用される核酸分子は、アンチセンス阻害核酸分子である。したがって、いくつかの実施形態では、本願は、ＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢ遺伝子又はタンパク質の発現を低下又は阻害することができるアンチセンス又は他の阻害核酸分子を提供する。一実施形態では、アンチセンス阻害核酸分子は、ＰＴＢｐｒｅ－ＭＲＮＡのエクソンスキッピングを誘導することによって、ＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢ遺伝子又はタンパク質の発現を低下又は阻害することができる。いくつかの実施形態では、本願の方法は、ＰＴＢ及びｎＰＴＢノックダウンを生成するか、又はＰＴＢ及びｎＰＴＢの発現を除去又は著しく低下させることができる分子の使用を含む。いくつかの実施形態では、本願の方法は、これらの分子が最初のＰＴＢ、次にｎＰＴＢを順次ノックダウンすることで、霊長類の非ニューロン細胞を成熟ニューロンマーカーを有する機能性ニューロン細胞に効率的に変換するための使用を含む。

天然に存在するか又は合成された核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドとして有用である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の長さであってもよく、例えば、別の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５～１００、約１０～８０、約１５～６０、約１８～４０の間にある。最適な長さは、通常のスクリーニングによって決定される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の濃度で存在し得る。最適な濃度は、通常のスクリーニングによって決定することができる。合成されて天然に存在しない多くのヌクレオチド及び核酸類似体は、この潜在的な問題を解決することが知られている。例えば、非イオン性骨格（例えば、Ｎ-（２-アミノエチル）グリシン単位）を含むペプチド核酸（ＰＮＡ）を用いることができる。ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996)に記載されるように使用されてもよい。本願で提供される合成ＤＮＡ骨格類似体を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’－チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’－Ｎ－カルバメートおよびモルホリノカルバメート核酸をさらに含むことができる。

いくつかの実施形態では、本願は、霊長類ＰＴＢ又はｎＰＴＢ遺伝子、情報、又はタンパク質の発現を減少又は阻害することができるＲＮＡｉ阻害性核酸分子を使用する。

一実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ＲＮＡｉ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）及び／又はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を含むことができる。例えば、一実施形態では、本願は、霊長類ＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現及び／又は活性を阻害又は阻止する、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡのような阻害性核酸を使用する。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉの長さは、約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はそれ以上の二本鎖ヌクレオチドである。本願は、特定の作用機構に限定されないが、ＲＮＡｉは細胞内に導入され、内因性ｍＲＮＡを含む類似又は同一配列の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）の分解を引き起こす。細胞が二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に曝露されると、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスによって、相同遺伝子由来のｍＲＮＡが選択的に分解される。ＲＮＡｉ（例えば、転写を阻害するためのｓｉＲＮＡ及び／又は翻訳を阻害するためのｍｉＲＮＡ）の背後にある可能性のある基本的な機構は、特定の遺伝子配列に適合する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を短い干渉ＲＮＡと呼ばれる短い断片に切断することであり、それにより、その配列に適合するｍＲＮＡの分解を引き起す。一態様では、本願のＲＮＡｉは、分化細胞の分化表現型の維持に関与する転写因子の１つ又は１つのセットをサイレンシングするなどの遺伝子サイレンシング治療のために使用され、例えば、Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046を参照する。一態様では、本願は、本願のＲＮＡｉを用いてＲＮＡを選択的に分解する方法を提供する。一態様では、本願のＲＮＡｉ分子は、細胞内に機能喪失変異を生じさせるのに有用である。これらのプロセスは、インビトロ、エクソボ、又はインビボで行うことができる。

一実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｍｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）の細胞内への導入は、吸着されたＲＮＡｉ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）を含むＲＮＡ結合タンパク質に結合する標的細胞特異的リガンドの内在化によって行われる。リガンドは、特定の標的細胞表面抗原に特異的であってもよい。リガンドは、細胞表面抗原と結合した後に自発的に内在化することができる。特定の細胞表面抗原がそのリガンドと結合した後に自然に内在化されない場合、アルギニンに富むペプチド又は他の膜透過性ペプチドをリガンド又はＲＮＡ結合タンパク質の構造に組み込むか、又はそのようなペプチドをリガンド又は結合タンパク質に連結させることによって、内在化を促進することができる。例えば、米国特許出願公開２００６００３０００３、２００６００２５３６１、２００６００１９２８６、２００６００１９２５８を参照する。一態様では、本願は、例えば、米国特許出願公開２００６０００８９１０を参照して、ＲＮＡｉ分子を含む核酸-脂質粒子として本願の核酸を細胞に導入するような送達のための脂質ベース製剤を提供する。

ＲＮＡを選択的に分解するＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡ）を製造及び使用するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第６,５０６,５５９号、６,５１１,８２４、６,５１５,１０９、６,４８９,１２７を参照する。阻害性ポリヌクレオチド（例えば、本願の二本鎖ｓｉＲＮＡ）を転写する発現構築体（例えば、ベクター又はプラスミド）の製造方法は、よく知られており、従来から知られているものである。調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、スプライスドナー、受容体など）を用いて、発現構築体から阻害性ポリヌクレオチドの１つ又は複数のＲＮＡ鎖を転写することができる。二本鎖ｓｉＲＮＡ阻害分子を調製する場合、ＩＲＥＳの標的部分を標的とするセンス鎖及びアンチセンス鎖は、一緒にアニーリングされる２本の個別のＲＮＡ鎖として転写され得るか、又はヘアピンループを形成して自体とアニーリングされる単一のＲＮＡ鎖として転写され得る。例えば、転写が双方向に発生し、相補的なＲＮＡ鎖を生成するように、遺伝子部分を標的とする構築体を２つのプロモーターの間に挿入し、その後アニーリングして本願の阻害ｓｉＲＮＡを形成することができる。

あるいは、遺伝子、コード配列、プロモーター又は転写物の標的部分は、単一の発現ベクター上で一緒になった第１及び第２アンチセンス結合領域として設計することができ、例えば、制御プロモーターに対してセンス方向にある標的遺伝子の第１コード領域を含み、その遺伝子の第２コード領域は、制御プロモーターに対してアンチセンス方向にある。標的遺伝子の標的部分のセンスコード領域及びアンチセンスコード領域の転写が２つの独立したプロモーターから生じる場合、その結果は２つの独立したＲＮＡ鎖になり、これらはその後アニーリングされて本願を実施するための遺伝子阻害ｓｉＲＮＡを形成することができる。

別の実施形態では、標的遺伝子のセンス及びアンチセンス標的部分の転写は単一のプロモーターによって制御され、生成された転写物は、自己相補的な単一のヘアピンＲＮＡ鎖、すなわち自己折り畳みによって二本鎖体を形成して遺伝子阻害性ｓｉＲＮＡ分子を生成するものである。このような構成において、標的遺伝子の標的部分のセンスコード領域とアンチセンスコード領域との間のスペーサー、例えばヌクレオチドのスペーサーは、一本鎖ＲＮＡのヘアピンループ形成能を向上させることができ、ヘアピンループはスペーサーを含む。一実施形態では、スペーサーは、約５～５０個のヌクレオチドの間の長さを有するヌクレオチドを含む。一態様では、ｓｉＲＮＡのセンスコード領域及びアンチセンスコード領域は、それぞれ別個の発現ベクター上に配置され、自己のプロモーターによって制御され得る。

一実施形態では、核酸分子は、非ニューロン細胞における霊長類ＰＴＢタンパク質の発現又は活性の阻害を引き起こすエクソンホッピングを誘導するために、ＰＴＢｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書におけるエクソンスキッピングとは、通常そこに存在する特定のエクソンを含まない成熟ｍＲＮＡを細胞内に誘導することを指す。エクソンスキッピングは、前記ｍＲＮＡのｐｒｅ-ｍＲＮＡを発現する細胞に、配列を干渉することができる分子を供給することにより達成され、該配列は、例えば、スプライシングを可能にする酵素プロセスに必要なスプライシングドナー又はスプライシング受容体配列、又はｍＲＮＡに含まれるエクソンとしてヌクレオチドの一部を認識するのに必要なエクソン封入シグナルと干渉することができる分子である。Ｐｒｅ-ｍＲＮＡという用語は、未加工又は部分的に加工された前駆体ｍＲＮＡであり、細胞核内のＤＮＡ鋳型から転写によって合成される。本願の文脈において、本明細書で示されるようなエクソンのスキッピングの誘導及び／又は促進とは、非ニューロン細胞中の少なくとも１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のＰＴＢｍＲＮＡが前記エクソンを含まないことを意味する。これは、例で説明されたＰＣＲによって評価されることが好ましい。

１つの好ましい実施形態では、霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列若しくはその相補配列を標的とする核酸分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリーエフェクタータンパク質（Ｃａｓエフェクタータンパク質）のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。したがって、一実施形態では、組成物は、ｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列若しくはその相補配列を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡ、又はｉｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードし、少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする少なくとも１種の発現ベクターを含む細胞プログラミング剤を含む。同様に、本願は、このような細胞プログラミング剤を含む組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質及び少なくとも１種のｇＲＮＡ、又は少なくとも１種の発現ベクターを含む）は、リポソームのようなナノ粒子に含まれる。

一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリーエフェクタータンパク質（Ｃａｓエフェクタータンパク質）、及びＰＴＢ遺伝子配列を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、又はＣａｓエフェクタータンパク質をコードし、かつＰＴＢ遺伝子配列を標的とするｇＲＮＡをコードする少なくとも１種の発現ベクターを含む細胞プログラミング剤が提供される。

いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤中のＣａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｄ、ＣａｓＲｘ、Ｃａｓ１３ｅ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｆ及びそれらの機能ドメインからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、４．５ｋｂ以下、４ｋｂ以下、３．５ｋｂ以下、３ｋｂ以下、２．５ｋｂ以下、２．１ｋｂ以下、１．５ｋｂ以下のＯＲＦ（開始コドンから終了コドンまで）によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、核局在シグナルを含むように修飾される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＤＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ｓｐＣａｓ９又はそのバリアント、ＳａＣａｓ９又はそのバリアント、Ｃｐｆ１又はそのバリアント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、ＤＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質である。

いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤中のＣａｓエフェクタータンパク質は、ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質である。本明細書では、ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓエフェクタータンパク質のｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡを用いて、標的ＤＮＡ配列のＣａｓエフェクタータンパク質の代わりに、標的ＲＮＡ配列を識別して分解するものとして理解される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ系のエフェクタータンパク質、好ましくはＶＩ-Ｄ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ系のエフェクタータンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は２つのＨＥＰＮリボヌクレアーゼモチーフを含み、ＲＸＸＸＸＨ-モチーフを含む（Anantharaman et al., 2013, Biol Direct. 2013; 8: 15を参照）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ／ＣａｓＲｘ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３ｅ、及びＣａｓ１３ｆ、ならびにそれらの機能ドメインからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質は、４．５ｋｂ以下、４ｋｂ以下、３．５ｋｂ以下、３ｋｂ以下、２．５ｋｂ以下、２．１ｋｂ以下、１．５ｋｂ以下のＯＲＦ（開始コドンから終了コドンまで）によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質は、核局在シグナルを含むように修飾される。

好ましい実施形態では、ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｄ又はそのオルソログであり、最も好ましくは、ＣａｓＲｘ（Konermann et al., 2018, Cell 173, 665-676に記載される）である。ＣａｓＲｘはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ｄのオルソログであり、最小のサイズを有し、高い標的特異性と効率を示すため、インビボ治療用としての第一選択となる。
霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡは、ＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓファミリーエフェクタータンパク質と組み合わせて、本願の細胞プログラミング剤に使用されることが好ましい。したがって、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡにおける標的配列に相補的な配列、例えばヒトＰＴＢＰ１コード配列（NM_002819; 配列番号87）であり、好ましくは、ｇＲＮＡは、本明細書において上記で定義されるような標的配列に相補的な配列を含む。

一実施形態では、ｇＲＮＡは、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列（例えば、配列番号８７）中の１４～６０個のヌクレオチドの連続部分に相補的なガイド配列を含む。好ましくは、ｇＲＮＡは、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列（例えば、配列番号８７）中の少なくとも１７個以上６０個以下のヌクレオチドの連続部分に相補的なガイド配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列（例えば、配列番号８７）中の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のヌクレオチドの連続部分に相補的なガイド配列、及び／又は霊長類ＰＴＢ配列（例えば、配列番号８７）中の６０、５５、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１又は４０個以下のヌクレオチドの連続部分に相補的なガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列（例えば、配列番号８７）中の２５～４５個のヌクレオチドの連続部分に相補的なガイド配列を含む。

一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号１～８６のうちの少なくとも１つの、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７個の連続ヌクレオチド、又はすべてのヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。

一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号１～８６のうちの少なくとも１つの、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７個の連続ヌクレオチド又はすべてのヌクレオチドを含むか、又はこれらからなり、ｇＲＮＡがＣｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現した場合、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１５未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現が観察される。

一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号１～８６のうちの少なくとも１つを含むか、又はそれらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号１～８６のうちの少なくとも１つを含むか、又はそれらからなり、好ましくは、表１に決定されるような０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１５未満の相対発現を発生させる。

一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、４５、４０、６１、５０、５５、４１、４４、４２、６６、４９、５１、４６、７９、０７、５８、５３、３８、６４、６３、５９、５４、６２、８１、８３、５７、０５、０８、７０、７３、７６、１０、０４、３６、５２、２６、６７、２５、３９、３４、８０、０６、２３、８５、２４、３０、０２、１３、０３、７７、３１、２１、６９、１６、７５、１２、７８、２０、７４、７１、及び３７からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、４５、４０、６１、５０、５５、４１、４４、４２、６６、４９、５１、４６、７９、０７、５８、５３、３８、６４、６３、５９、５４、６２、８１、８３、５７、０５、０８、７０、７３、７６、１０、０４、３６、５２、２６、６７、２５、３９、３４、８０、０６、２３、８５、２４、３０、及び０２からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、４５、４０、６１、５０、５５、４１、４４、４２、６６、４９、５１、４６、７９、０７、５８、５３、３８、６４、６３、５９、５４、６２、８１、８３、５７、０５、０８、７０、７３、７６、１０、０４、３６、５２、２６、６７、及び２５からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、４５、４０、６１、５０、５５、４１、４４、４２、６６、４９、５１、４６、７９、０７、５８、５３、３８、６４、６３、５９、５４、６２、８１、８３、５７、０５、０８、７０、７３、及び７６からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、４５、４０、６１、５０、５５、４１、４４、４２、６６、４９、５１、４６、７９、０７、５８、５３、３８、６４、６３、及び５９からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、４５、４０、６１、５０、５５、４１、４４、４２、６６、４９、５１、及び４６からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、４５、４０、６１、５０、５５、４１、４４、４２、６６、及び４９からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、４５、４０、及び６１からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、４５、及び４０からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、及び４５からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、及び４３からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、及び４８からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、及び４７からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。一実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、及び６０からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、これらからなる。

好ましい実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号６０を含むか、又はそれらからなる。他の好ましい実施形態では、ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６を含むか、又はそれらからなる。

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ中の配列を標的とし、該配列は、ａ）配列番号８７の５９～９１位；ｂ）配列番号８７の３０３～３４９位；ｃ）配列番号８７の４２２～４５１位；ｄ）配列番号８７の４６０～４８９位；ｅ）配列番号８７の５４２～５７６位；ｆ）配列番号８７の６４６～６８１位；ｇ）配列番号８７の７０６～７６９位；ｈ）配列番号８７の７７３～８０６位；ｉ）配列番号８７の１０７９～１１３９位；ｊ）配列番号８７の１１５２～１１８４位；ｋ）配列番号８７の１１９１～１２５４位；ｌ）配列番号８７の１３７４～１４３４位；ｍ）配列番号８７の９５１～１４８７位；ｎ）配列番号８７の１５０２～１５７５位；及びｏ）配列番号８７の１６２６～１６６９位からなる群の配列から選択される。本明細書で理解されるように、配列番号８７の位置に対する配列に対応する霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ中の配列（配列番号８７を除く）は、ヌクレオチド配列アラインメントにおいて配列番号８７中のこれらの位置に対応する配列であり、好ましくは、デフォルト設定（デフォルトのギャップ開放ペナルティ１０．０、デフォルトのギャップ伸長ペナルティ０．５、デフォルトのスコアリング行列ＤＮＡＦｕｌｌ）を用いて、グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いる。

いくつかの特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列の少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチド、及び／又は６０、５５、５０、４９、４８、４７、４６、４４、４３、４２、４１、又は４０個以下のヌクレオチドを含むか、又はこれらからなり、該霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列は、配列番号８７の９５１～１４８７位と少なくとも９５、９６、９７、９８、９９％、又は１００％と同一であり、好ましくは、標的配列がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で標的化された場合、前記ｇＲＮＡのガイド配列は、配列番号３８～６８のうちの少なくとも１つを含むか、これらからなり、前記ｇＲＮＡは、Ｃｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現し、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、上記細胞において０．５０、０．４５、０．４０、０．３５、０．３、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１５未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現が観察される。

一実施形態では、ｇＲＮＡは、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列と少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチド、及び／又は６０、５５、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１又は４０個以下のヌクレオチドの連続部分に相補的なガイド配列を含むか、これらからなり、該霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列は、配列番号８７の１０００～１４８７位；配列番号７の１０５０～１４８７位；配列番号８７の１１００～１４８７位；配列番号８７の１１５０～１４８７位；配列番号８７の１２００～１４８７位；配列番号８７の１２５０～１４８７位；配列番号８７の１３００～１４８７位；配列番号８７の１３５０～１４８７位；配列番号８７の１４００～１４８７位；配列番号８７の９５１～１４００位；配列番号８７の９５１～１３５０位；配列番号８７の９５１～１３００位；配列番号８７の９５１～１２５０位；配列番号７の９５１～１２００位；配列番号７の９５１～１１５０位；配列番号８７の９５１～１１００位；配列番号８７の９５１～１０５０位；及び配列番号８７の９５１～１０００位のうちの少なくとも１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％と同一であり、好ましくは、標的配列がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で標的化された場合、前記ｇＲＮＡのガイド配列は、配列番号３８～６８のうちの少なくとも１つを含むか、これらからなり、前記ｇＲＮＡは、Ｃｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現し、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、上記細胞において０．５０、０．４５、０．４０、０．３５、０．３、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１５未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現が観察される。

いくつかの実施形態では、ヒト又は非ヒト霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞のうちの少なくとも一方）における本願のｇＲＮＡとＣａｓＲｘとの共発現は、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、０．９、０．８５、０．８、０．７５、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現を引き起こす。本願のｇＲＮＡの相対発現は、本明細書の実施例で説明したように測定することができる。例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（又は類似のトランスフェクション試薬）を用いて、ＣＡＧ-ＣａｓＲｘ-Ｐ２Ａ-ＧＦＰを発現するベクター４μｇ及びＵ６-ｇＲＮＡ-ＣＭＶ-ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド２μｇを用いて、瞬間共トランスフェクションを行うことができる。ＣＡＧ-ＣａｓＲｘ-Ｐ２Ａ-ＧＦＰプラスミドのみでトランスフェクションされた細胞を対照として用いることができる。一過性トランスフェクションの２日後、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により約３０ＫＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙの二重陽性（ＧＦＰの上位２０％）細胞を採取して分解し、ｑＰＣＲ分析に用い、対応する量の対照細胞（ＧＦＰの上位２０％のみをソーティング）と比較したＰＴＢｍＲＮＡの相対発現を決定する。

本明細書で提供されるように、細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ又はそれらをコードするポリヌクレオチド）は、ＰＴＢの発現又は活性を少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の内因性又は天然レベルで阻害する。本明細書で提供されるように、細胞プログラミング剤（例えば、ｎＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ又はそれらをコードするポリヌクレオチド）は、ｎＰＴＢの発現又は活性を約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の内因性又は天然レベルで阻害する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢ／ｎＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ又はそれらをコードするポリヌクレオチド）は、ＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現レベル、例えば、ＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの転写、翻訳、又はタンパク質安定性を直接阻害する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞プログラミング剤（例えば、ＰＴＢ／ｎＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓ又はそれらをコードするポリヌクレオチド）は、ＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性に直接影響を与え、他の細胞シグナル伝達経路には影響を及ぼさない。

いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤を含む組成物は、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡを含むか、又は霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする少なくとも１種の発現ベクターを含む。別の実施形態では、細胞プログラミング剤を含む組成物は、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とする１種以下（タイプ）のｇＲＮＡを含むか、又は霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とする１種以下（タイプ）のｇＲＮＡをコードする少なくとも１種の発現ベクターを含む。さらに別の実施形態では、細胞プログラミング剤を含む組成物は、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とする２種類、３種類、４種類、５種類又は６種類の異なる（タイプ）ｇＲＮＡ、又は霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とする２種類、３種類、４種類、５種類又は６種類の異なる（タイプ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１種の発現ベクターを含む。

本明細書で提供されるように、非ニューロン細胞を、本明細書で提供される細胞プログラミング剤を含む組成物と接触させることは、リプログラミングされる非ニューロン細胞のタイプ、非ニューロン細胞が置かれている環境、及び必要とされる細胞リプログラミングの結果に依存して、任意の適切な方法で行うことができる。

いくつかの実施形態では、非ニューロン細胞を、ＰＴＢ／ｎＰＴＢを標的とするｇＲＮＡを有するＣａｓをコードするポリヌクレオチドの形態の、本明細書で提供される細胞プログラミング剤を含む組成物と接触させる。したがって、一実施形態では、非ニューロン細胞を、Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードし、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とする少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする発現ベクターの形態の、本明細書で提供される細胞プログラミング剤と接触させる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の発現ベクターは、Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチドは、非ニューロン細胞においてＣａｓエフェクタータンパク質の発現を引き起こすプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、非ニューロン細胞における発現を引き起こすプロモーターは、グリア細胞特異的プロモーター又はミュラーグリア（ＭＧ）細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、グリア細胞特異的プロモーターは、ＧＦＡＰプロモーター、ＡＬＤＨ１Ｌ１プロモーター、ＥＡＡＴ１／ＧＬＡＳＴプロモーター、グルタミン合成酵素プロモーター、Ｓ１００βプロモーター、及びＥＡＡＴ２／ＧＬＴ-１プロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＭＧ細胞特異的プロモーターは、ＧＦＡＰプロモーター、ＡＬＤＨ１Ｌ１プロモーター、ＧＬＡＳＴ（Ｓｌｃ１ａ３とも呼ばれる）プロモーター、及びＲｌｂｐ１プロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、グリア細胞特異的プロモーター又はミュラーグリア細胞（ＭＧ）特異的プロモーターは、霊長類、ヒト、又は非ヒト霊長類プロモーターである。

いくつかの実施形態では、少なくとも１種の発現ベクターは、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、非ニューロン細胞においてｇＲＮＡの発現を引き起こすプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施例では、ｇＲＮＡコード配列に動作可能に連結された（そして、非ニューロン細胞においてｇＲＮＡの発現を引き起こす）プロモーターは、Ｕ６ｓｎＲＮＡ遺伝子に由来するプロモーター、好ましくは霊長類、ヒト、又は非ヒト霊長類Ｕ６プロモーターである。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、霊長類、ヒト、又は非ヒト霊長類（非ニューロン）宿主細胞のコドン使用に適合するように、それらのコドン使用を最適化するのに適している。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の宿主細胞コドン使用への適応性は、コドン適応指数（ＣＡＩ）として表され得る。コドン適応指数は、特定の宿主細胞や生体における高発現遺伝子のコドン使用に対する、遺伝子のコドン使用の相対適応性のメトリックスであると本明細書で定義されている。各コドンの相対適応性（ｗ）は、同一アミノ酸の最も豊富なコドンの使用に対する各コドンの使用の比率である。ＣＡＩ指数は、これらの相対適応性値の幾何平均として定義される。非同義コドンと終止コドン（遺伝暗号による）は除外されている。ＣＡＩ値の範囲は０～１で、値が高いほど最も豊富なコドンの割合が高いことを示す(Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295;及びJansen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(8):2242-51)を参照）。Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする適応ヌクレオチド配列は、ＣＡＩが０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８又は０．９以上であることが好ましい。異種生物における最適な遺伝子発現のためのコドン最適化方法は、当技術分野で知られており、先に説明されている（例えば、Welch et al., 2009, PLoS One 4:e7002; Gustafsson et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:346-353; Wu et al., 2007, Nucl. Acids Res. 35:D76-79; Villalobos et al., 2006, BMC Bioinformatics 7:285; 米国特許公開第2011/0111413号;及び米国特許公開第2008/0292918号を参照）。

これらの構成において、細胞プログラミング剤は、非ウイルストランスフェクション法又はウイルス導入法を利用して導入される。非ウイルストランスフェクションは、ウイルスを介さないすべての細胞トランスフェクション法を指し得る。非ウイルス性トランスフェクションの非限定的な例としては、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストランとそれに続くポリエチレングリコールなどのカチオン性ポリマーによるトランスフェクション、デンドリマーによるトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション（「脂質トランスフェクション」）、微粒子衝撃（「遺伝子銃」）、ｆｕｇｅｎｅ、直接音波負荷、細胞スクイズ、光学トランスフェクション、プロトプラスト融合、穿刺トランスフェクション、磁気トランスフェクション、核トランスフェクション、及びこれらの任意の組合せが含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、非ニューロン細胞への細胞プログラミング剤の送達のための適切な媒体として、遺伝子治療ベクター、例えばウイルスベクターを利用する。本明細書で提供されるように、ウイルスベクター方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスベクターの使用を含むことができる。適切なウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、レンタウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、又はマウスマロニーベース(murine Maloney-based)のウイルスベクターが含まれる。

いくつかの実施例では、ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤はＡＡＶベクターの形態で投与される。いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤は、レンチウイルスベクターの形態で投与される。例えば、細胞プログラミング剤は、ＰＴＢ／ｎＰＴＢに対するｇＲＮＡを有するＣａｓエフェクタータンパク質を発現するために、レンチウイルス又はアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いて非ニューロン細胞に送達され得る。

本開示のいくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される方法は、非ニューロン細胞（例えば、グリア細胞又はアストロサイト）におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を、非ニューロン細胞を成熟ニューロンにリプログラミングするのに十分な量の細胞プログラミング剤によって阻害することを含む。当業者が容易に理解できるように、十分な量の細胞プログラミング剤を経験的に決定することができる。いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤の量は、非ニューロン細胞における細胞プログラミング剤の活性を調べる任意の種類のアッセイによって決定することができる。

例えば、細胞プログラミング剤が非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現を阻害するように構成されている場合、十分な量の細胞プログラミング剤は、薬剤投与後、例えば、ウェスタンブロットにより、例示的な非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現レベルを評価することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤を例示的な非ニューロン細胞に送達した後、ＰＴＢ／ｎＰＴＢの活性を機能性アッセイで評価する。いくつかの実施形態では、十分な量の細胞プログラミング剤を決定するために、ニューロンマーカーの免疫染色、ニューロン機能特性の電気的記録など、下流のニューロン特性の他の機能的アッセイが検査される。

いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤はウイルスベクターの形態で送達される。ウイルスベクターは、細胞プログラミング剤をコードする発現配列の１つ又は複数のコピー、例えば、ＰＴＢ／ｎＰＴＢに対するｇＲＮＡコード配列の１つ又は複数のコピー、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０コピーを有するＣａｓエフェクタータンパク質を含むことができる。

当業者が判断できるように、ウイルスベクターは任意の適切な投与量に滴定することができる。例えば、ＰＣＲ、ＲＴ-ＰＣＲ、又は他の方法によって決定される力価は、少なくとも約１０^５ウイルス粒子／ｍＬ、１０^６粒子／ｍＬ、１０^７粒子／ｍＬ、１０^８粒子／ｍＬ、１０^９粒子／ｍＬ、１０^１０粒子／ｍＬ、１０^１１粒子／ｍＬ、１０^１２粒子／ｍＬ、１０^１３粒子／ｍＬ、１０^１４粒子／ｍＬ又は１０^１５粒子／ｍＬであり得る。

いくつかの実施形態では、投与されるウイルスベクターの力価は少なくとも約１０^１０粒子／ｍＬ、１０^１１粒子／ｍＬ、１０^１２粒子／ｍＬ、１０^１３粒子／ｍＬ又は１０^１４粒子／ｍＬである。
本願の他の実施形態では、上記で定義されたようなＰＴＢを標的とする細胞プログラミング剤を含む組成物は、ニューロン変換効率をさらに向上させるために、１種又は複数種のＰＴＢを標的としない細胞プログラミング剤などの追加成分を含む。

ＰＴＢを標的とする細胞プログラミング剤と、ＰＴＢを標的としない１種又は複数種の細胞プログラミング剤との組み合わせは、ニューロン変換効率を向上させるために相乗的に作用することができる。

したがって、一実施形態では、上記で定義されるようなＰＴＢを標的とする細胞プログラミング剤を含む組成物は、ｉ）１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子、及び／又はｉｉ）好ましくは、非ニューロン細胞において、１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子を発現するための少なくとも１種の発現ベクターをさらに含む。好ましくは、ＰＴＢを標的とする細胞プログラミング剤及びドーパミンニューロン関連因子を含むこのような組成物は線条体中の非ニューロン細胞に局所的に投与するために使用される。より好ましくは、この組成物を線条体中の非ニューロン細胞に投与して機能性ドーパミン作動性ニューロンを生成させ、さらに好ましくは、線条体中のグリア細胞に投与して機能性ドーパミン作動性ニューロンを生成させる。

一実施形態では、１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子は、Ｌｍｘ１ａ、Ｌｍｘ１ｂ、ＦｏｘＡ２、Ｎｕｒｒ１、Ｐｉｔｘ３、Ｇａｔａ２、Ｇａｔａ３、ＦＧＦ８、ＢＭＰ、Ｅｎ１、Ｅｎ２、ＰＥＴ１、Ｐａｘファミリータンパク質、ＳＨＨ、Ｗｎｔファミリータンパク質、及びＴＧＦ-βファミリータンパク質からなる群から選択される。一実施形態では、１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子は、ＦｏｘＡ２、Ｌｍｘ１ａ及びＮｕｒｒ１からなる群から選択される。好ましい実施形態では、１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子は、単独のＦｏｘＡ２、単独のＬｍｘ１ａ、単独のＮｕｒｒ１、ＦｏｘＡ２とＬｍｘ１ａとの組み合わせ、ＦｏｘＡ２とＮｕｒｒ１との組み合わせ、Ｎｕｒｒ１とＬｍｘ１ａとの組み合わせ、又はＦｏｘＡ２、Ｌｍｘ１ａ及びＮｕｒｒ１の組み合わせである。これらのドーパミンニューロン関連因子／遺伝子の適切な霊長類及びヒトアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列は、当業者に知られており、公知のデータベースでアクセスすることができる。１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子を非ニューロン細胞で発現するための発現ベクターの構築及び送達は、ＰＴＢを標的とする細胞プログラミングのための上記の発現ベクターについて記載された通りであってもよい。

別の実施形態では、上記で定義されるようなＰＴＢを標的とする細胞プログラミング剤を含む組成物は、ｉ）β-カテニン、ＯＳＫ因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及び細胞再循環又はエピジェネティック再構築に関与する他の因子とも呼ばれる）、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３及びＮｒｌからなる群から選択される１つ又は複数の因子、及び／又はｉｉ）β-カテニン、ＯＳＫ因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及び細胞再循環又はエピジェネティック再構築に関与する他の因子とも呼ばれる）、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３及びＮｒｌからなる群から選択される１つ又は複数の因子を好ましくは非ニューロン細胞で発現するための少なくとも１種の発現ベクターを含む。一実施形態では、１つ又は複数の因子は、β-カテニン及びＯＳＫ因子、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４からなる群から選択される。好ましい実施形態では、１つ又は複数の因子は、β-カテニンとＯｃｔ４との組み合わせ、β-カテニンとＳｏｘ２との組み合わせ、β-カテニンとＫｌｆ４との組み合わせ、β-カテニンとＯｃｔ４とＳｏｘ２との組み合わせ、β-カテニンとＯｃｔ４とＫｌｆ４との組み合わせ、β-カテニンとＳｏｘ２とＫｌｆ４との組み合わせ、β-カテニンとＯＳＫ因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４の３つのすべてとの組み合わせ、又はβ-カテニンとＯＳＫ因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（β－カテニンを含まない）の３つのすべてとの組み合わせである。好ましくは、ＰＴＢを標的とする細胞プログラミング剤及び因子を含むこのような組成物は、成熟網膜中の非ニューロン細胞に局所的に投与するために使用する。より好ましくは、機能的網膜神経節細胞（ＲＧＣ）ニューロン及び／又は機能的網膜光受容体を生成するために、成熟網膜中の非ニューロン細胞にこの組成物を適用し、さらに好ましくは、機能的網膜神経節細胞（ＲＧＣ）ニューロン及び／又は機能的網膜光受容体を生成するために、成熟網膜中のグリア細胞又はミュラーグリア（ＭＧ）細胞にこの組成物を適用する。好ましい実施形態では、因子はβ-カテニンである。β－カテニン、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３及びＮｒｌ、又はその遺伝子の適切な霊長類及びヒトのアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列は、技術者に知られており、公知のデータベースでアクセスすることができる。β-カテニン、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３、及びＮｒｌから選択される１つ又は複数の因子を非ニューロン細胞で発現するための発現ベクターの構築及び送達は、ＰＴＢを標的とする細胞プログラミング剤に関する上記の発現ベクターについて記載された通りであってもよい。
投与及び治療レジメン

本明細書で提供される方法は、非ニューロン細胞を成熟ニューロンにリプログラミングするのに十分な期間だけ、非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害するステップを含むことができる。

いくつかの実施形態では、例示的な方法は、非ニューロン細胞を、非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害する細胞プログラミング剤と少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、又は少なくとも１年間接触させることにより、非ニューロン細胞を成熟ニューロンにリプログラミングするステップを含む。

いくつかの実施形態では、ＰＴＢ及びｎＰＴＢの発現又は活性の阻害は相次いでいる。例えば、ｎＰＴＢの発現又は活性が阻害される前に、例えば上記のいずれかの期間だけ、ＰＴＢの発現又は活性が先に阻害される。

いくつかの実施形態では、ＰＴＢ及びｎＰＴＢの発現又は活性の阻害は同時に起こる。

いくつかの実施形態では、例示的な方法は、非ニューロン細胞を、非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を阻害する細胞プログラミング剤と約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、３週間、４週間、５週間、２か月、３か月、４か月、又は５か月接触させることにより、非ニューロン細胞を成熟ニューロンにリプログラミングするステップを含む。

いくつかの構成において、本明細書で提供される方法は、細胞プログラミング剤を１回だけ投与するステップ、例えば、非ニューロン細胞を含む細胞培養物に細胞プログラミング剤を加えるステップ、又は、非ニューロン細胞を含む脳領域（例えば、線条体）に細胞プログラミング剤を１回だけ送達するステップを含み、細胞プログラミング剤は、非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害するのに必要な期間（例えば、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも４日、又は最後の１０日）にわたって活性を維持することができる。例えば、細胞プログラミング剤がＣａｓエフェクター及び抗ＰＴＢｇＲＮＡのコード配列を発現するＡＡＶベクターを含む場合、ＡＡＶベクターは、長期にわたって転写活性を維持するように設計され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１２回、少なくとも１５回、少なくとも２０回以上のように、細胞プログラミング剤を複数回投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、少なくとも１種の免疫抑制剤を投与するステップをさらに含む。一実施形態では、例えば、細胞プログラミング剤が、Ｃａｓエフェクター及び抗ＰＴＢｇＲＮＡのコード配列を発現するＡＡＶベクターを含む場合、免疫抑制剤は、細胞プログラミング剤の投与の前、同時及び／又は後に投与される。適切な免疫抑制剤としては、例えば、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾンなど）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムスなど）、ｍＴＯＲ阻害剤（シロリムス、エベリムスなど）、ＩＭＤＨ阻害剤（例えば、アザチオプリン、ミコフェロール酸など）、抗体（例えば、バシリキシマブ、リツキシマブ、アレムツズマブなど）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γなど）、Ｊａｎｕｓキナーゼ阻害剤（例えば、トファシチニブなど）、生物学的製剤（例えば、アナキンラなど）が含まれる。一実施形態では、免疫抑制剤は、細胞プログラミング剤の投与前及び／又は投与後の約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、３週間、４週間、５週間、２カ月、３カ月、４カ月、又は５カ月に投与される。一実施形態では、免疫抑制剤は、細胞プログラミング剤の投与とほぼ同時に投与される。
マーカー

本開示のいくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される方法は、複数の非ニューロン細胞を成熟ニューロンに効率的にリプログラミングするステップを含む。

いくつかの実施形態では、該方法は、ＭＧ細胞又はアストロサイトを成熟ニューロンにリプログラミングし、ＭＧ細胞／アストロサイトの少なくとも６０％をＭａｐ２又はＮｅｕＮ陽性の成熟ニューロンに変換するステップを含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも４０％のアストロサイトがＭａｐ２陽性の成熟ニューロンに変換される。いくつかの実施形態では、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％又は１００％のＭＧ細胞／アストロサイトが、ＮｅｕＮ又はＭａｐ２陽性の成熟ニューロンに変換される。

いくつかの実施形態では、１０ｍｍ×５０μｍあたりの網膜神経節細胞層（ＧＣＬ）中の少なくとも１０個のＭＧ細胞が、Ｂｒｎ３ａ又はＲｂｐｍを発現するＲＧＣに変換される。いくつかの実施形態では、１０ｍｍ×５０μｍあたりの網膜神経節細胞層（ＧＣＬ）において、少なくとも約１、２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０個のＭＧ細胞が、Ｂｒｎ３ａ又はＲｂｐｍｓを発現するＲＧＣに変換される。

いくつかの実施形態では、該方法は、ヒトアストロサイトを成熟ニューロンにリプログラミングし、ヒトアストロサイトの少なくとも４０％、少なくとも６０％、又は少なくとも８０％をＭａｐ２又はＮｅｕＮ陽性の成熟ニューロンに変換するステップを含む。いくつかの実施形態では、ヒトアストロサイトの少なくとも２０％、少なくとも４０％、又は少なくとも６０％がＭａｐ２又はＮｅｕＮ陽性の成熟ニューロンに変換される。いくつかの実施形態では、ヒトアストロサイトの少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％又は１００％がＭａｐ２又はＮｅｕＮ陽性の成熟ニューロンに変換される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、複数の非ニューロン細胞、例えばヒト非ニューロン細胞、例えばヒトグリア細胞又はアストロサイト、及び約２０％、２５％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は９９％の非ニューロン細胞、例えばヒト非ニューロン細胞、例えばヒトグリア細胞又はアストロサイトを成熟ニューロンにリプログラミングするステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２０％、２５％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、又は１００％の非ニューロン細胞、例えばヒト非ニューロン細胞、例えばヒトグリア細胞、ＭＧ細胞、又はアストロサイトを成熟ニューロンにリプログラミングする。

いくつかの実施形態では、成熟ニューロンは、ＮｅｕＮ（ニューロン核抗原）、Ｍａｐ２（微小管関連タンパク質２）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、１６０ｋＤａニューロフィラメント媒体、２００ｋＤａニューロフィラメント重鎖（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｈｅａｖｙ）、ＰＤＳ－９５（シナプス後密度タンパク質９５）、シナプシンＩ、シナプトフィジン、ＧＡＤ６７（グルタミン酸脱炭酸酵素６７）、ＧＡＤ６５（グルタミン酸脱炭酸酵素６５）、パルブアルブミン、ＤＡＲＰＰ３２（ドーパミン及びｃＡＭＰによって調節された神経リンタンパク質３２）、ｖＧＬＵＴ１（小胞性グルタミン酸トランスポーター１）、ｖＧＬＵＴ２（小胞性グルタミン酸トランスポーター、アセチルコリン、小胞性ＧＡＢＡトランスポーター（ＶＧＡＴ）、γ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、及びＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）からなる群から選択される１つ又は複数のニューロンマーカーを発現することを特徴とする。いくつかの実施形態では、非ニューロン細胞、例えばヒト非ニューロン細胞、例えばヒトグリア細胞、又はアストロサイトの少なくとも４０％が成熟ニューロンにリプログラミングされる。

いくつかの実施形態では、ＭＧ細胞は、ロドプシン及びＧＮＡＴ１から選択される１つ又は複数の桿体細胞マーカー（ｒｏｄｃｅｌｌｍａｒｋｅｒ）を発現することを特徴とする、及び／又はＳ-オプシン、Ｍ-オプシン及びｍＣＡＲから選択される１つ又は複数の錐体細胞マーカーを発現することを特徴とする網膜光受容体に変換される。

当業者であれば容易に理解できるように、上記のすべてのマーカーの表現は、いずれの従来技術によっても評価することができる。例えば、本明細書に記載された特定の細胞型マーカーに対する抗体を用いた免疫染色は、標的細胞が対応する細胞型マーカーを発現しているか否かを明らかにすることができる。特定の条件下での免疫染色は、細胞型マーカーの亜細胞分布を明らかにすることもでき、これは標的細胞の発達段階を決定する上でも重要である。例えば、Ｍａｐ２の発現は、有糸分裂後の成熟ニューロンのさまざまな神経突起（例えば樹状突起）に見られるが、ニューロンの軸索には存在しない。電圧依存性ナトリウムイオンチャネルの発現（例えば、ａサブユニットＮａｖｉ．１-１．９）及びｂサブユニット）は、軸索の初期セグメントの成熟ニューロン（ここでは、動作電位を開始することができる）及びランビエ結節にクラスター化され得る別の例であってもよい。いくつかの実施形態では、フローサイトメトリー、質量分析、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＴ-ＰＣＲ、及びマイクロアレイなどの他の技術も、本明細書に記載された特定の細胞型マーカーの発現を評価するために使用することができる。
変換効率

本開示の特定の態様により提供される方法は、複数の非ニューロン細胞、及び少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は９９％の非ニューロン細胞、例えばヒト非ニューロン細胞、例えばヒトグリア細胞、ＭＧ細胞、又はアストロサイトを機能性ニューロンにリプログラミングするステップを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、非ニューロン細胞、例えばヒト非ニューロン細胞、例えばヒトグリア細胞、ＭＧ細胞、又はアストロサイトの少なくとも２０％を機能性ニューロンにリプログラミングする。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、非ニューロン細胞、例えばヒト非ニューロン細胞、例えばヒトグリア細胞、ＭＧ細胞、又はアストロサイトの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、又は１００％を機能性ニューロンにリプログラミングする。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、ｉ）本明細書で定義されたようなＰＴＢを標的とする細胞プログラミング剤、及びｉｉ）本明細書で定義されたようなＰＴＢを標的としない１つ又は複数の細胞プログラミング剤の組み合わせの使用を含み、前記組み合わせは、ニューロン変換効率を少なくとも１．１倍、１．２倍、１．５倍、２．０倍、３．０倍、４．０倍、５．０倍、８．０倍、１０倍、１５倍、又は２０倍向上させる。
機能評価

いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、ニューロンネットワークを形成する能力、ニューロンシグナルを送受信する能力、又はその両方を特徴とする。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは活動電位を励起する。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、他のニューロンとシナプス接続を確立する。例えば、機能性ニューロンは、例えばその樹状突起末端、例えば樹状突起スパインを有し、別のニューロンとシナプスにおいてシナプス後区画を形成する、シナプスにおけるシナプス後ニューロンであり得る。例えば、機能性ニューロンは、シナプスにおけるシナプス前ニューロンであってもよく、例えば、別のニューロンとのシナプスにおいてシナプス前終末を形成する軸索末端を有する。

機能性ニューロンが他のニューロンと形成することができるシナプスは、軸索間シナプス、軸索樹状突起間シナプス、及び軸索細胞体間シナプスを含むが、これらに限定されない。機能性ニューロンが他のニューロンと形成することができるシナプスは、興奮性（例えば、グルタミン酸作動性）、阻害性（例えば、γ-アミノ酪酸作動性）、調節性、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンが他のニューロンと形成するシナプスは、グルタミン酸機作動性、γ-アミノ酪酸作動性、コリン作動性、アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、又は任意の他の適切なタイプである。機能性ニューロンは、シナプス前ニューロンとして、例えば、グルタミン酸、ＧＡＢＡ、アセチルコリン、アスパラギン酸、Ｄ-セリン、グリシン、一酸化窒素（ＮＯ）、一酸化炭素（ＣＯ）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、ドーパミン、ノルエピネフリン（ノルアドレナリンとも呼ばれる）、エピネフリン（アドレナリン）、ヒスタミン、セロトニン、フェネチルアミン、Ｎ-メチルフェネチルアミン、チラミン、３-ヨードチロナミン（３-ｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎａｍｉｎｅ）、オクトパミン、トリプタミン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、オピオイドペプチド、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン、及びアナンダミドを含むが、これらに限定されない神経伝達物質を放出することができる。機能性ニューロンは、シナプス後ニューロンとして、シナプス前ニューロンからシナプス間隙に放出された神経伝達物質に対するシナプス後反応を引き起こすことができる。本明細書で提供される方法において生成される機能性ニューロンのシナプス後反応は、機能性ニューロンによって発現される神経伝達物質受容体のタイプに依存して、興奮性、阻害性、又はそれらの任意の組み合わせとすることができる。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、イオン性グルタミン酸受容体及びイオン性ＧＡＢＡ受容体のようなイオン性神経伝達物質受容体を発現する。イオン性グルタミン酸受容体は、α-アミノ-３-ヒドロキシ-５-メチル-４-イソオキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）型グルタミン酸受容体（例えば、ＧｌｕＡｌ／ＧＲＩＡｌ、ＧｌｕＡ２／ＧＲＩＡ２、ＧｌｕＡ３／ＧＲＩＡ３、ＧｌｕＡ４／ＧＲＩＡ４）、δ受容体（例えば、ＧｌｕＤｌ／ＧＲＩＤｌ、ＧｌｕＤ２／ＧＲＩＤ２）、カイニン受容体（例えば、ＧｌｕＫｌ／ＧＲＩＫｌ、ＧｌｕＫ２／ＧＲＩＫ２、ＧｌｕＫ３／ＧＲＩＫ３、ＧｌｕＫ４／ＧＲＩＫ４、ＧｌｕＫ５／ＧＲＩＫ５）及びＮ-メチル-Ｄ-アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体（例えば、ＧｌｕＮｌ／ＧＲＩＮｌ、ＧｌｕＮ２Ａ／ＧＲＩＮ２Ａ、ＧｌｕＮ２Ｂ／ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧｌｕＮ２Ｃ／ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧｌｕＮ２Ｄ／ＧＲＩＮ２Ｄ、ＧｌｕＮ３Ａ／ＧＲＩＮ３Ａ、ＧｌｕＮ３Ｂ／ＧＲＩＮ３Ｂ）を含むことができるが、これらに限定されない。イオン性ＧＡＢＡ受容体は、ＧＡＢＡＡ受容体を含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、代謝型グルタミン酸受容体（例えば、ｍＧｌｕＲｉ、ｍＧｌｕＲｓ、ｍＧｌｕＲ、ｍＧｌｕＲ、ｍＧｌｕＲｉ、ｍＧｌｕＲｅ、ｍＧｌｕＲ、ｍＧｌｕＲｓ）及び代謝型ＧＡＢＡ受容体（例えば、ＧＡＢＡＢ受容体）などの代謝型神経伝達物質受容体を発現する。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、１つのタイプのドーパミン受容体、例えばＤ１及びＤ５受容体（ＤＩＲ及びＤ５Ｒ）のようなＤ１様ファミリーのドーパミン受容体、又はＤ２、Ｄ３及びＤ４受容体（Ｄ２Ｒ、Ｄ３Ｒ及びＤ４Ｒ）のようなＤ２様ファミリーのドーパミン受容体を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される機能性ニューロンは、別のニューロンと電気シナプス（例えば、ギャップ接続）を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される機能性ニューロンは、オータプスとして知られる、それ自体と化学的シナプス又は電気的シナプスを形成する。

機能性ニューロンの特徴は、当業者が利用可能な従来技術によって評価することができる。例えば、活動電位の励起及び神経伝達物質の放出に対するシナプス後の反応などの機能性ニューロンの電気的特性は、例えば、パッチクランプ記録（例えば、電流クランプ記録及び電圧クランプ記録）、細胞内記録及び細胞外記録（例えば、四極管記録、単線記録及び電界電位記録(ｆｉｌｅｄｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｅｃｏｒｄｉｎｇ)）などの技術によって調べることができる。機能性ニューロンの特定の特性（例えば、イオンチャネルの発現及び静止膜電位）も、パッチクランプ記録によって調べることができ、この場合、パッチクランプ記録のさまざまな変形は、細胞付着型パッチクランプ、インサイドアウトパッチクランプ、アウトサイドアウトパッチクランプ、全細胞記録、穴あきパッチクランプ、遊離パッチクランプ（loose patch）などのさまざまな目的に適用することができる。電気的方法によるシナプス後反応の評価は、シナプス前ニューロンの電気刺激、神経伝達物質又は受容体アゴニスト又はアンタゴニストの適用のいずれかと組み合わせてもよい。いくつかの場合、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体媒介シナプス後電流は、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト（例えば、ＡＭＰＡ）又はアンタゴニスト（例えば、２,３-ヒドロキシ-６-ニトロ-７-スルホニルアミノ-ベンゾキノキサリン（ＮＢＱＸ）又は６-シアノ-７-ニトロキノキサリン-２,３-ジオン（ＣＮＱＸ）によって評価され得る。いくつかの場合、ＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体媒介シナプス後電流は、ＮＭＤＡ受容体アゴニスト（例えば、ＮＭＤＡ及びグリシン）又はアンタゴニスト（例えば、ＡＰ５及びケタミン）によって評価され得る。

いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、電気的方法以外の技術によって検査される。例えば、機能性ニューロンによって伝達又は送達される電気シグナルは、最近開発された様々な蛍光色素又は遺伝的にコードされた蛍光タンパク質、及びイメージング技術を利用して監視することができる。この場合、ｆｕｒａ-２、ｉｎｄｏ-１、ｆｌｕｏ-３、ｆｌｕｏ-４、及びカルシウムグリーン-１などのカルシウム依存性蛍光色素（例えばカルシウム指示薬）、及びＣａｍｅｌｅｏｎｓ、ＦＩＰ-ＣＢＳＭ、Ｐｅｒｉｃａｍｓ、ＧＣａＭＰ、ＴＮ-Ｌ１５、ＴＮ-ｈｕｍＴｎＣ、ＴＮ-ＸＬ、ＴＮＸＸＬ及びＴｗｉｔｃｈ’ｓなどのカルシウム依存性蛍光タンパク質は、神経細胞膜電位の指標としてカルシウムの流入及び流出を追跡するために有用である。あるいは、又はさらに、電圧変化に応答して分光特性を変化させることができる電圧感受性色素も、ニューロン活動を監視するために使用することができる。

神経伝達物質の放出は機能性ニューロンの重要な側面であることができる。本明細書で提供される方法は、非ニューロン細胞を、ある種の神経伝達物質を放出する機能性ニューロンにリプログラミングするステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、グルタミン酸、ＧＡＢＡ、アセチルコリン、アスパラギン酸、Ｄ-セリン、グリシン、一酸化窒素（ＮＯ）、一酸化炭素（ＣＯ）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、ドーパミン、ノルエピネフリン（ノルアドレナリンとも呼ばれる）、エピネフリン(アドレナリン)、ヒスタミン、セロトニン、フェネチルアミン、Ｎ-メチルフェネチルアミン、チラミン、３-ヨードチロナミン、オクトパミン、トリプタミン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、オピオイドペプチド、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン、及びアナンダミドなどの神経伝達物質を放出する。

いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、主要な神経伝達物質としてドーパミンを放出する。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、複数のタイプの神経伝達物質を放出する。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、活動電位に応答して神経伝達物質を放出する。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、段階的な電位（例えば、活動電位を誘発するための閾値を超えない膜電位の変化）に応答して神経伝達物質を放出する。いくつかの実施形態では、機能性ニューロンは、基礎レベル（例えば、自発的な神経伝達物質の放出）で神経伝達物質の放出を示す。本明細書に記載された機能性ニューロンによって放出される神経伝達物質は、当業者が利用可能な種々の技術によって評価することができる。いくつかの実施形態では、イメージング方法は、機能性ニューロンの神経伝達物質放出を特徴付けるために使用することができ、例えば、小胞タンパク質を含む遺伝的にコードされる蛍光融合分子をイメージングすることによって、シナプス小胞がシナプス前膜に融合されるプロセスを監視することができる。

あるいは、又はさらに、特定の神経伝達物質のレベルを直接監視するために、他の方法を適用することができる。例えば、ＨＰＬＣプローブは、シャーレ又は機能性ニューロンがその軸索を投影する脳領域におけるドーパミンの含有量を測定するために使用され得る。ＨＰＬＣによって検出されるドーパミンレベルは、機能性ニューロンのシナプス前活動を示すことができる。いくつかの実施形態では、このような評価を機能性ニューロンの刺激と組み合わせて、その膜電位を変化させる、例えば、活動電位を開始させることができる。

一態様では、本開示は、機能性ニューロンをインビボで生成する方法を提供する。例示的な方法は、神経系領域の非ニューロン細胞（例えば、グリア細胞又はアストロサイト）のうち、成熟網膜又は内耳、あるいは脳又は脊髄の領域（例えば、線条体）など、被験者の神経系領域に、細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢに標的／相補的なｇＲＮＡ、又はそれらをコードするポリヌクレオチド）を含む組成物を投与し、非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングするステップを含む。いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤は、ＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現又は活性を阻害する。
投与経路

本開示のいくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される方法は、細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢに標的／相補的なｇＲＮＡ、又はそれらをコードするポリヌクレオチド）を、被験者の神経系領域（例えば、成熟網膜又は内耳、あるいは脳又は脊髄内の領域（例えば線条体））に直接投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢに標的／相補的なｇＲＮＡ、又はそれらをコードするポリヌクレオチド）を、神経系の領域（例えば、成熟網膜、脳又は脊髄内の領域（例えば線条体））に局所的に送達する。一実施形態では、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）のような細胞プログラミング剤を含む組成物は、定位送達(stereotaxic)又は対流促進送達によって、脳領域（例えば、線条体）への送達によって被験者又は生体に投与される。

当業者は、定位固定位置決めシステムを用いて、細胞プログラミング剤を含む組成物が投与される特定の脳領域（例えば、線条体）を位置決めすることができる。このような方法及び装置は、本明細書で提供される組成物を被験者又は生体に送達するために容易に使用することができる。別の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、被験者又は被験者の神経系領域、例えば脳（例えば線条体）又は脊髄、例えば脳脊髄液又は脳室に全身送達され、この組成物は、細胞プログラミング剤を被験者の神経系の特定の領域（例えば線条体）又は被験者の神経系の特定のタイプの細胞に再配置するように構成された１つ又は複数の薬剤を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で使用される細胞プログラミング剤は、Ｃａｓエフェクター及び抗ＰＴＢ又は抗ｎＰＴＢｇＲＮＡを発現するウイルスを含み、この方法は、ウイルスを所望の脳領域に定位的に注射するステップを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、又はマウスマロニーベースのウイルスを含む。本明細書で提供される方法で使用することができるＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９のような任意の適切なＡＡＶ血清型であってもよいが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＶ２又はＡＡＶ９に基づくウイルスベクターを送達するステップを含み、このウイルスベクターは、神経系領域（例えば、脳（例えば、線条体）又は脊髄）の非ニューロン細胞におけるＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現又は活性を阻害する薬剤を発現する。

いくつかの実施形態では、上述したように、本明細書で提供される方法は、複数の非ニューロン細胞を成熟ニューロンにリプログラミングするステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞プログラミング剤を含む組成物を被験者の神経系領域（例えば、脳（例えば、線条体）又は脊髄）に投与するステップを含み、該細胞プログラミング剤は、例えば、神経系のアストロサイト、オリゴデンドロサイト、ＮＧ２細胞、サテライト細胞又は上衣細胞などのグリア細胞であるが、これらに限定されない多数の非ニューロン細胞におけるＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現又は活性を阻害し、非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングすることを可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、被験者の神経系領域（例えば、脳（例えば、線条体）又は脊髄）内のアストロサイトを機能性ニューロンにリプログラミングするステップを含む。

上述したように、本明細書で提供される方法は、特定の脳領域（例えば、線条体）内の非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングするステップを含むことができる。本明細書で提供される方法で使用することができる例示的な脳領域は、後脳、中脳、又は前脳のいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、成熟網膜又は線条体の非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を阻害し、非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングすることを可能にする細胞プログラミング剤を含む組成物を、被験者の中脳、線条体又は皮質に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、成熟網膜又は線条体中の非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害し、非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングすることを可能にする細胞プログラミング剤を含む組成物を、被験者の成熟網膜又は線条体に投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、脳領域中の非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングするステップを含み、前記脳領域は、例えば、延髄、髄錐体、オリーブ体、下オリーブ核、吻側延髄腹側外側、尾側延髄腹外側、孤立核、呼吸中枢-呼吸器グループ、背側呼吸群、腹側呼吸群または無呼吸中枢(apneustic centre)、前ブッツィンガー複合体、ボッツィンガー複合体(botzinger complex)、後台形核、後顔面核、疑核後核、疑核亜核、傍正中網様核、巨大細胞網様核、顔面傍帯(parafacial zone)、楔状核、薄核、舌下核、介在核、前置核、舌下核、後野、髄質頭蓋核、下唾液分泌核、疑核、迷走神経背側核、舌下神経核、後脳、脳橋、脳橋核、脳橋脳神経核、三叉神経感覚核の主核または脳橋核、三叉神経運動核(v)、外転核(vi)、顔面神経核(vii)、前庭蝸牛核(前庭核および蝸牛核）（viii）、上唾液核、橋被蓋、脳橋排尿中枢（バリントン核）、青斑核、足橋核、後背被蓋核、橋被蓋網様体核、腕傍領域、腕傍核、外側腕傍核、腕傍核(kdlliker-fuse核)、脳橋呼吸群、上オリーブ複合体、内側上オリーブ(medial superior olive)、外側上オリーブ、台形体内側核、傍正中橋網様体、小細胞網様核、尾側橋網様体核、小脳脚、上小脳脚、中小脳脚、下小脳脚、第4脳室、小脳、小脳虫、小脳半球、前葉、後葉、綿状結節葉、小脳核、止骨核、介在核、球状核、塞栓核、歯状核、中脳(midbrain/mesencephalon)、蓋、四叉体、下丘、上丘、蓋前、被蓋、水道周囲灰色、内側縦束吻側間質核、中脳網様体、背側縫線核、赤色核、腹側被蓋野、腕傍色素核(parabrachial pigmented nucleus)、パラニグラル核、吻内側被蓋核(rostromedial tegmental nucleus)、尾線状核(caudal linear nucleus)、縫線吻側線状核(rostral linear nucleus of the raphe)、筋束間核、黒質、緻密部、網状部、脚間核、大脳脚(cerebral peduncle/crus cerebri)、中脳脳神経核、動眼核(iii)、動眼神経副核(edinger-westphal nucleus)、滑車核(iv)、中脳管（脳水道、シルビウス水道）、前脳(forebrain/prosencephalon)、間脳、視床上、松果体、手綱核、延髄条、無鉤条体視床(taenia thalami)、第三脳室、交連下器官、視床、前核群、前腹核（別名、腹前核）、前背側核、前内側核、内側核群、内側背側核、正中核群、パラテニア核、レユニエンス核(reuniens nucleus)、菱形核、層内核群、セントロメディアン核、筋膜傍核、中心傍核、中心外側核、外側核群、外側背側核、外側後部核、視床枕、腹側核群、腹側前部核、腹側後部核、後腹核、腹後外側核、腹後内側核、視床後部、内側膝状体、外側膝状体、視床網様核、視床下部（大脳辺縁系）（hpa軸）、前方、内側領域、視索前野、内側視索前核、視交叉上核、室傍核、視索上核（主に）、視床下部前核、外側領域、視索前領域、外側視索前核、外側核の前部、視索上核の一部、視索前野の他の核、正中視索前核、脳室周囲視索前核、結節、内側領域、視床下部背内側核、腹内側核、弓状核、外側領域、外側の結節部核、外側結節核、後部、内側領域、乳頭核、後部核、側方領域、外側核後部、視交叉、脳円形下器官、脳室周囲核、下垂体茎、灰白質結節、結節核、結節乳頭核、結節領域、乳頭体、乳頭核、視床下、視床下核、不定帯、下垂体、下垂体神経、中間部（中間葉）、下垂体腺、前頭葉、頭頂葉、後頭葉、側頭葉、小脳、脳幹、半卵円中心、放射状冠、内部カプセル、外部カプセル、極端カプセル(extreme capsule)、皮質下、海馬、歯状回、コルヌアンモニス(CA野)、コルヌアンモニス領域1(CA1)、コルヌアンモニス領域2(CA2)、コルヌアンモニス領域3(CA3)、コルヌアンモニス領域4(CA4)、扁桃体、扁桃体中心核、扁桃体内側核、扁桃体の皮質核および基底内側核、扁桃体の外側核および側底核、拡張扁桃体(extended amygdala)、終端線、終端線床核、前クローストラム、大脳基底核、線条体、背線条体、被殻、尾状核、腹側線条体、側坐核、嗅結節、淡蒼球、腹側淡蒼球、視床下核、前脳基底部、前穿孔物質、無名質、基底核、ブローカ対角帯、中隔核、内側中隔核、終板、終板血管器官、嗅脳（古皮質）、嗅球、嗅道、前嗅核、梨状皮質、前交連、鉤爪(uncus)、扁桃周囲皮質、大脳皮質、前頭葉、皮質、一次運動野（中心前回、Ml)、補足運動野、運動前野、前頭前野、眼窩前頭皮質、背外側前頭前野、脳回、上前頭回、中前頭回、下前頭回、ブロードマン野4、6、8、9、10、11、12、24、25、32、33、44、45、46、47、頭頂葉、皮質、一次体性感覚皮質（SI）、二次体性感覚皮質（S2）、後頭頂皮質、脳回、中心後回（一次知覚野）、楔前部、ブロードマン野1、2、3、5、7、23、26、29、31、39、および40、後頭葉、皮質、一次視覚野（VI）、v2、v3、v4、v5/mt、脳回、外側後頭回、楔骨、ブロードマン野17（VI、一次視覚野）18および19、側頭葉、皮質、一次聴覚皮質（A1）、二次聴覚皮質（A2）、下側頭葉皮質、後下側頭葉皮質、脳回、上側頭回、中側頭回、下側頭回、嗅内皮質、鼻周囲皮質(perirhinal cortex)、海馬傍回、紡錘状回、ブロードマン野20、21、22、27、34、35、36、37、38、41及び42、内側上側頭野（MST）、島皮質、帯状皮質、前帯状皮質、後帯状皮質、後脾皮質、インドゥシウム・グリセウム、膝下領域25、およびブロードマン領域23、24；26、29、30(脾後領域)31、32であってもよいが、これらに限定されない。

一態様では、本願は、ドーパミン作動性ニューロンをインビボで生成する方法を提供する。例示的な方法は、脳の非ニューロン細胞（例えば、グリア細胞又はアストロサイト）におけるＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現又は活性を阻害し、非ニューロン細胞をドーパミン作動性ニューロンにリプログラミングすることを可能にする細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢに対するｇＲＮＡのコード配列）を含む組成物を、被験者の脳内の線条体に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、脳の非ニューロン細胞（例えば、グリア細胞又はアストロサイト）におけるＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現又は活性を阻害し、非ニューロン細胞をドーパミン作動性ニューロンにリプログラミングすることを可能にする細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢに対するｇＲＮＡのコード配列）を含む組成物を被験者の被殻に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、脳の非ニューロン細胞（例えば、グリア細胞又はアストロサイト）におけるＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現又は活性を阻害し、非ニューロン細胞をドーパミン作動性ニューロンにリプログラミングすることを可能にする細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢに対するｇＲＮＡのコード配列）を含む組成物を、被験者の被殻に特別に投与する（例えば、尾状核及び／又は線条体の他の部分への投与を回避する）ステップを含む。

別の態様では、本発明は、ＲＧＣニューロンをインビボで生成する方法を提供する。例示的な方法は、成熟網膜の非ニューロン細胞（例えば、グリア細胞又はＭＧ細胞）におけるＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現又は活性を阻害し、非ニューロン細胞をＲＧＣニューロンにリプログラミングすることを可能にする細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢに対するｇＲＮＡコード配列）を含む組成物を被験者の成熟網膜に投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、領域内の非ニューロン細胞におけるＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢの発現又は活性を阻害し、非ニューロン細胞を当該領域内で優勢なサブタイプの機能性ニューロンにリプログラミングすることを可能にする細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢに対するｇＲＮＡのコード配列）を含む組成物を、被験者の神経系領域（例えば、脳又は脊髄）に投与するステップを含む。

特定の理論に縛られることなく、本明細書で提供される方法は、非ニューロン細胞がインビボで機能性ニューロンにリプログラミングされるときに、領域（例えば、特定の脳領域）における局所的な誘導シグナルを利用することができる。例えば、線条体における局所的なシグナルは、ＰＴＢ／ｎＰＴＢが阻害された非ニューロン細胞をドーパミンニューロンに変換することを誘導する可能性がある。局所ニューロン、非ニューロン細胞（例えば、アストロサイト、ミクログリア細胞、又はその両方）、又は線条体の他の局所成分は、細胞プログラミング剤によって誘導されて非ニューロン細胞によって生成されるニューロンのサブタイプ特異性に寄与することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、脳領域の複数の非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害する細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢに対するｇＲＮＡのコード配列）を含む組成物を、被験者の脳領域（例えば、線条体）に投与するステップを含み、この方法は、さらに、少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は９９％の非ニューロン細胞をドーパミン作動性ニューロンにリプログラミングするステップをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、脳領域の複数の非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害する細胞プログラミング剤（例えば、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＰＴＢ及び／又はｎＰＴＢに対するｇＲＮＡのコード配列）を含む組成物を、被験者の成熟網膜又は脳領域（例えば線条体）に投与するステップを含み、この方法によって生成される少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は９９％の機能性ニューロンはそれぞれＲＧＣニューロン又はドーパミン作動性ニューロンである。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で生成されるドーパミン作動性ニューロンは、ドーパミン、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、小胞性モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２）、エングレイルドホメオボックス１（Ｅｎｌ）、核受容体関連タンパク質-１（Ｎｕｃｌｅａｒｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｌａｔｅｄ-１、Ｎｕｒｒｌ）、Ｇタンパク質調節内向き整流性カリウムチャネル２（Ｇｉｒｋ２）、フォークヘッドボックスＡ２（ＦｏｘＡ２）、オルソデンティクルホメオボックス２（ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅｈｏｍｅｏｂｏｘ２、ＯＴＸ２）、及び／又はＬＩＭホメオボックス転写因子１α（Ｌｍｘ１ａ）を含むがこれに限定されない、ドーパミン作動性ニューロンの１種又は複数種のマーカーを発現する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で生成されたドーパミンニューロンは、過分極活性化環状ヌクレオチド依存性（ＨＣＮ）チャネルによって媒介され得るＩｈ電流を示す。Ｉｈ電流はゆっくりと活性化された内向き電流として特徴付けられ、過分極ステップによって活性化され得る。例えば、電圧クランプと保持電位Ｖｈが－４０ｍＶの場合、ドーパミンニューロンは内向きにゆっくりと活性化する電流をトリガし、反転電位は－３０ｍＶに近い。本明細書で提供される方法で生成されるドーパミンニューロンのＩｈ電流特性の活性化曲線は、-５０ｍＶから-１２０ｍＶの範囲内であり、中間活性化点は-８４ｍＶから１ｍＶであり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で生成されるドーパミン作動性ニューロンは、天然のドーパミン作動性ニューロンと類似した遺伝子発現プロファイルを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で生成されるドーパミン作動性ニューロンは、ドーパミンを神経伝達物質として放出する。

本明細書で提供される方法で生成されるドーパミン作動性ニューロンは、Ａ９（例えば、Ｇｉｒｋ２に免疫陽性）、Ａ１０（例えば、カルシウム結合タンパク質-Ｄ２８ｋに免疫陽性）、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１６、Ａａｑ、及び終脳ドーパミンニューロンを含むが、これらに限定されないドーパミン作動性ニューロンの任意のサブタイプであってもよい。

本開示のいくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される方法は、被験者の神経系領域、例えば、成熟網膜、脳又は脊髄領域（例えば、線条体）の非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングするステップを含む。いくつかの実施形態では、本願に記載された機能性ニューロンは、神経系内のニューラルネットワークに統合される。本願で説明するように、リプログラミングされた機能性ニューロンは、局所ニューロン（例えば、リプログラミングされた機能性ニューロンに隣接するニューロン）とシナプス接続を形成することができる。例えば、リプログラミングされたニューロンがインビボで成熟すると、リプログラミングされたニューロンと、隣接する一次ニューロン（例えば、グルタミン酸作動性ニューロン）、ＧＡＢＡ作動性中間ニューロン、又は他の隣接するニューロン（例えば、ドーパミン作動性ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、又はコリン作動性ニューロン）とのシナプス接続が形成され得る。局所ニューロンへのこれらのシナプス接続において、リプログラミングされた機能性ニューロンは、シナプス前ニューロン、シナプス後ニューロン、又はその両方であってもよい。

いくつかの実施形態では、リプログラミングされた機能性ニューロンは、遠隔脳領域に軸索投射を送る。

いくつかの実施形態では、リプログラミングされた機能性ニューロンは、それ自体を脳又は脊髄の１つ又は複数の既存の神経経路に統合することができる。例えば、上縦束、弓状束、鉤状束、穿孔路、視床皮質放射、脳梁、前交連、腹側扁桃体遠心路、視床間癒着、後交連、手綱交連、円蓋、乳頭被蓋束、視床下部間経路、大脳脚、内側前脳束、内側縦束、ミオクロニー三角、中皮質経路、中脳辺縁系経路(mesolimbic pathway)、黒質リアタル経路、結節漏斗経路(tuberoinfundibular pathway)、錐体外路系、錐体路、皮質脊髄路または脳脊髄線維、外側皮質脊髄路、前皮質脊髄路、皮質橋線維、前頭橋線維、側頭橋線維、皮質延髄路、皮質中脳路、蓋脊髄路、間質脊髄路、赤核脊髄路、ルブロ-オリーブ管、オリーブ小脳路、オリーブ脊髄路、前庭脊髄路、外側前庭脊髄路、内側前庭脊髄路、網様体脊髄路、外側縫合脊髄路、後柱内側レムニスカス経路、薄束(gracile fasciculus)、楔状束、内側レムニスカス、脊髄視床路、外側スピン視床路、前脊髄視床路、脊髄中脳路、脊髄小脳路、脊髄オリーブ路、および脊髄網様路を含むが、これらに限定されない。

特定の理論に縛られることなく、局所的な細胞環境は、本開示のいくつかの実施形態に従って生成される機能性ニューロンの投影に関連することができる。例えば、本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態に係る線条体中に生成される機能性ニューロンは、線条体の局所環境中の他の細胞の影響を受ける可能性がある。
治療可能な状態／疾患

一態様では、本開示は、神経系領域における機能性ニューロンの変性に関連する神経状態を治療するための方法を提供する。例示的な方法は、必要とされる被験者の神経系領域、例えば、成熟網膜、脳又は脊髄（ｓｐｉｎａｌ）領域（例えば線条体）又は内耳に、該領域の非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害し、該非ニューロン細胞を機能性ニューロン（例えば、ＲＧＣ又はドーパミン作動性ニューロン）にリプログラミングすることを可能にする細胞プログラミング剤を含む組成物を投与することにより、該領域の変性機能性ニューロンを補充するステップを含む。

本開示のいくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される方法は、パーキンソン病、失明、難聴、脊髄損傷、アルツハイマー病、ハンチントン病、統合失調症、うつ病、及び薬物依存症を含むが、これらに限定されない神経状態を治療するステップを含む。

適用可能な神経状態はまた、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び運動ニューロン疾患など、脊髄におけるニューロン損失に関連する病症を含むことができるが、これらに限定されない。本明細書で提供される方法は、神経変性疾患の１つ又は複数の症状を治療又は改善するためにも有用であるが、この神経変性疾患は、常染色体優性小脳性運動失調、シャルルボワ・サグネの常染色体劣性痙性運動失調症、皮質基底核変性症、皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病(Creutzfeldt-Jakob disease)、脆弱性X関連振戦/運動失調症候群、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、クフォー・ラケブ症候群、ライム病、マシャド・ジョセフ病(Machado-Joseph disease)、ニーマン・ピック病、橋小脳低形成症、レフサム病、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損症(pyruvate dehydrogenase complex deficiency)、サンドホフ病、シャイ・ドレーガー症候群、テイ・サックス病(Tay-Sachs disease)、及びハリネズミふらつき症候群(Wobbly hedgehog syndrome)を含むが、これらに限定されるものではない。

本明細書で提供されるように、「神経変性」又はその文法的等価物は、ニューロンの構造、機能、又はその両方の進行性の喪失（ニューロンの死を含む）を意味することができる。

神経変性は、あらゆる種類のメカニズムによって引き起こされる可能性がある。本明細書で提供される方法が適用される神経状態は、どのような病因であってもよい。神経状態は、遺伝的又は偶発的なものであってもよく、遺伝子変異、タンパク質の誤った折り畳み、酸化ストレス、又は環境暴露（例えば、毒素又は薬物の乱用）に起因する可能性がある。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、脳領域におけるドーパミン作動性ニューロンの変性に関連する神経状態を治療する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、成熟網膜におけるＲＧＣニューロンの変性に関連する神経状態を治療する。他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、グルタミン酸作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、アドレナリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、又は任意の他の適切なタイプのニューロンを含む任意のタイプのニューロンの変性に関する神経状態を治療し、前記ニューロンは、神経伝達物質として、アスパラギン酸、Ｄ-セリン、グリシン、一酸化窒素（ＮＯ）、一酸化炭素（ＣＯ）、硫化水素（Ｈ２Ｓ）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリンとも呼ばれる）、ヒスタミン、セロトニン、フェネチルアミン、Ｎ-メチルフェネチルアミン、チラミン、３--ヨードチロナミン、オクトパミン、トリプタミン、ソマトスタチン、サブスタンスＰ、オピオイドペプチド、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン、又はアナンダミドを放出する。本明細書で提供される方法は、中脳領域（例えば、黒質又は腹側被蓋領域）、前脳領域、後脳領域、又は脊髄などであるが、これらに限定されるものではない、任意の領域のニューロン変性に関連する神経状態を治療するために使用することができる。本明細書で提供される方法は、ニューロン変性に関連する神経状態を治療するために、神経系の任意の適切な領域における非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングするステップを含むことができる。

本明細書で提供される方法は、パーキンソン病に関連する１つ又は複数の症状を治療又は改善するために有用である。パーキンソン病は、黒質緻密部（ＳＮｐｃ）のドーパミン作動性ニューロンに早期の著しい機能性障害が現れたり、死亡したりする神経変性疾患である。これにより生じる基底神経節内のドーパミン欠乏は、典型的なパーキンソン運動症状を特徴とする運動障害を引き起こす可能性がある。パーキンソン病は、多くの非運動症状と関連している可能性もある。パーキンソン病を診断するための１つの基準は、死後の病理検査でＳＮｐｃ変性及びＬｅｗｙ病理学の有無である。Ｌｅｗｙ病理学には、Ｌｅｗｙ小体及びＬｅｗｙ神経突起と呼ばれるアシヌクレインタンパク質の異常凝集が含まれる場合がある。パーキンソン病患者は、運動症状と非運動症状を含む様々な症状を示すことがある。本明細書で提供される方法は、パーキンソン病に関連するこれらの運動症状又は非運動症状のうちの１つ又は複数を治療又は改善することができる。パーキンソン病の運動症状（パーキンソン症候群の症状）には、運動遅延（緩慢）、硬直、平衡障害、引きずり歩行、不安定な姿勢などが含まれる。パーキンソン病患者の運動特性は異質である可能性があり、このことは、疾患のサブタイプ、例えば、振戦優位型パーキンソン病（他の運動症状が相対的に欠如している）、非振戦優位型パーキンソン病（その中には、無動硬直症候群（akinetic-rigid syndrome）および姿勢不安定性歩行障害として説明される表現型が含まれる可能性がある）、及び同等の重症度のいくつかの運動症状を伴う混合または不定の表現型を持つ追加のサブグループなどに分類する試みが行われている。パーキンソン病の非運動症状には、嗅覚機能障害、認知障害、精神症状（例えば、うつ病）、睡眠障害、自律神経機能障害、疼痛及び疲労が含まれ得る。これらの症状は、パーキンソン病の初期によく見られる。典型的な運動症状が発症する前に、パーキンソン病にも運動以外の特徴がしばしば現れる可能性がある。この疾患の運動前又は前駆期は、嗅覚障害、便秘、うつ病、日中の過度の眠気、および急速眼球運動睡眠行動障害によって特徴付けられる場合がある。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、パーキンソン病の進行を軽減または遅延させる。パーキンソン病の進行は運動機能の悪化を特徴づけることができる。疾患が進行すると、長期的な対症療法に伴う合併症として、運動・非運動性の変動、運動障害、精神病などが発生することがある。

パーキンソン病の病理学的特徴の１つは、黒質、例えば黒質緻密部（ＳＮｐｃ）におけるドーパミン作動性ニューロンの損失である可能性がある。いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される方法は、患者の黒質（例えば、ＳＮｐｃ）におけるドーパミンニューロンの損失によって減少したドーパミン（線条体から変換されたドーパミンニューロンから分泌）を補充する。パーキンソン病のニューロン損失は、青斑核、マイネルト基底核（ｎｕｃｌｅｕｓｂａｓａｌｉｓｏｆＭｅｙｎｅｒｔ）、脚橋核、縫線核、迷走神経背側運動核、扁桃体、視床下部など、他の多くの脳領域でも起こる可能性がある。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように、被験者のパーキンソン病の１つ又は複数の症状を治療又は改善する方法は、パーキンソン病患者においてニューロン損失を経験している脳領域の非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングするステップを含む。

本明細書で提供される方法は、さまざまな病因のパーキンソン病を治療するために有用である。例えば、１つ又は複数の遺伝子変異がパーキンソン病を引き起こす可能性があるため、遺伝子変異は、例えば、遺伝子ＳＮＣＡ、ＬＲＲＫ２、ＶＰＳ３５、ＥＩＦ４Ｇ１、ＤＮＡＪＣ１３、ＣＨＣＨＤ２、Ｐａｒｋｉｎ、ＰＩＮＫ１、ＤＪ－１、ＡＴＰ１３Ａ２、Ｃ９ＯＲＦ７２、ＦＢＸ０７、ＰＬＡ２Ｇ６、ＰＯＬＧ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＹＮＪ１、ＲＡＢ３９Ｂの変異、及び２２ｑｌｌ２における微小欠失症候群が影響を受ける可能性がある１つ又は複数の遺伝子の変異などであるが、これらに限定されない。あるいは遺伝的特徴が知られていないパーキンソン病である。

本明細書で提供されるように、本明細書で提供される方法によって改善され得るパーキンソン病の１つ又は複数の症状は、上述したような運動症状及び非運動症状だけでなく、他のレベルの病理的特徴も含むことができる。例えば、パーキンソン病患者の脳におけるドーパミンシグナル伝達の減少は、本明細書で提供される方法により、神経回路に組み込まれ、ドーパミンニューロンを適切な脳領域に投射再構築することができる機能性ドーパミンニューロンを補充することにより、逆転又は緩和することができる。

一態様では、本開示はまた、通常レベルと比較してドーパミンの生物学的発生量が減少している被験者においてドーパミン放出を回復させる方法を提供する。例示的な方法は、被験者の脳領域（例えば、線条体）の非ニューロン細胞をリプログラミングし、非ニューロン細胞をドーパミン作動性ニューロンにリプログラミングすることを可能にして、ドーパミン減少量の少なくとも５０％を回復させるステップを含む。いくつかの実施形態では、リプログラミングは、脳領域の非ニューロン細胞（例えば、アストロサイト）におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害する細胞プログラミング剤を含む組成物を、被験者の脳領域（例えば、線条体）に投与することによって行われる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％のドーパミン減少量を回復させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は１００％のドーパミン減少量を回復させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９８％のドーパミン減少量を回復させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、ドーパミン減少量の少なくとも約５０％を回復させる。
医薬組成物

一態様では、本開示は、非ニューロン細胞におけるＰＴＢ／ｎＰＴＢの発現又は活性を阻害することにより、哺乳動物の非ニューロン細胞を成熟ニューロンにリプログラミングするのに有効な量の細胞プログラミング剤を含む医薬組成物を提供する。例示的な医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤をさらに含むことができる。上述したように、本明細書で提供される細胞プログラミング剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質及びＰＴＢ／ｎＰＴＢに対するｇＲＮＡのコード配列であり得る。

本明細書で提供される医薬組成物は、１つ又は複数の担体及び賦形剤（緩衝液、糖類、マンニトール、タンパク質、ペプチド又はアミノ酸、例えばグリシン、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤、懸濁剤、増粘剤及び／又は防腐剤などを含むがこれらに限定されない）、水、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの油類（石油、動物、植物又は合成由来のものなど）、塩（saline）溶液、グルコース及びグリセリン水溶液、矯味剤、着色剤、粘着防止剤、及び他の許容される添加剤、又は結合剤、ｐＨ緩衝剤、等張調整剤、乳化剤、湿潤剤などの生理学的条件に近づくために必要な他の薬学的に許容される補助物質を含むことができる。賦形剤の例としては、澱粉、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリル、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、エチレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。別の場合、該組成物は、実質的に防腐剤を含有しない。他の実施形態では、該組成物は、少なくとも１つの防腐剤を含む。薬物の剤形に関する一般的な方法は、Ansel et ah, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore Md. (1999))に記載されている。当業者に知られている任意の適切な担体は、本明細書に記載された医薬組成物を投与するために使用することができるが、担体のタイプは、投与方法に応じて変化することができることが当業者に認識されるべきである。適切な製剤及び追加の担体は、Remington “The Science and Practice of Pharmacy” (20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore Md.)に記載されており、その教示は、引用によって全体として本願に組み込まれている。

例示的な医薬組成物は、注射、吸入、胃腸外投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮膚内投与、局所投与、又は経口投与のために配合され得る。

いくつかの実施形態では、ＣａｓエフェクターをコードするＡＡＶベクター及びＰＴＢ／ｎＰＴＢに対するｇＲＮＡのコード配列を含む医薬組成物を、成熟網膜又は被験者の脳の線条体に注射することができる。

当業者が理解するように、医薬組成物は、細胞プログラミング剤のタイプ及び組成物の設計された投与経路に依存して、任意の適切な担体又は賦形剤を含むことができる。例えば、本明細書で提供される細胞プログラミング剤を含む組成物は、胃腸外投与のために配合することができ、単位用量の形態でアンプル、プレフィルドシリンジ、少量注入、又は防腐剤が添加された複数回用量容器に存在することができる。この組成物は、例えば水性ポリエチレングリコール中の溶液のような、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形態をとることができる。例えば、注射可能な製剤の場合、ビヒクルは、ごま油、トウモロコシ油、綿実油又は落花生油を含む水溶液又は油懸濁液、又は乳剤とエリキシル剤、マンニトール、ブドウ糖又は無菌水溶液を含む当業者に知られた適切なもの、及び同様の薬物ビヒクルから選択され得る。

該製剤はまた、ポリ乳酸-ヒドロキシ酢酸コポリマーのような生体適合性の生分解性ポリマー組成物を含んでいてもよい。これらの材料は、優れた持続放出性を提供するために、薬物を担持し、さらにコーティング又は誘導体化して、マイクロスフェア又はナノスフェアとすることができる。
眼周囲又は眼内注射に適したビヒクルとしては、例えば、注射グレードの水における活性剤の懸濁液、リポソーム、及び親油性物質に適したビヒクル、及びその分野で知られているものが含まれる。本明細書で提供される組成物は、細胞プログラミング剤及び薬学的に許容される担体又は賦形剤に加えて、追加の薬剤を含むことができる。例えば、ニューロンの生存を促進する目的で追加の試薬を提供することができる。あるいは、又はさらに、薬力学のモニタリング目的のために追加の試薬を提供することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、浸透増強剤として、又は活性成分（例えば、細胞プログラミング剤）の持続的放出又は制御放出のための追加の試薬を含む。

本明細書で提供される組成物は、約０．０００５、０．００１、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０ｍＬ以上の用量で被験者に投与することができる。組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の用量-治療レジメンで投与することができる。いくつかの場合、この組成物は、２、３又は４回の用量-治療レジメンで投与することができる。いくつかの場合、組成物は１回の用量-治療レジメンで投与することができる。

２回用量-治療レジメンの第１剤（例えば、Ｃａｓエフェクター及びＰＴＢに対するｇＲＮＡをコードするＡＡＶベクター）及び第２剤（例えば、Ｃａｓエフェクター及びｎＰＴＢに対するｇＲＮＡをコードするＡＡＶベクター）の投与は、約０日、１日、２日、５日、７日、１４日、２１日、３０日、２カ月、４カ月、６カ月、９カ月、１年、１．５年、２年、３年、４年、５年、１０年、２０年又はそれ以上の期間の間隔をおいてもよい。本発明の組成物は、１日に１回、週に１回、２週間に１回、月に１回、年に１回、年に２回、年に３回、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年又はそれ以上に１回、被験者に投与することができる。

この組成物は、２、３、４、５、６、７年又はそれ以上の年に１回、被験者に投与することができる場合がある。この組成物は、被験者に１回投与することができる場合がある。
その他の態様

本開示のいくつかの実施形態は、細胞又は組織の移植のための方法及び組成物を提供する。例示的な方法は、非ニューロン細胞をニューロンにインビトロでリプログラミングし、リプログラミングしたニューロンを被験者の脳領域に移植するステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、インビトロリプログラミングは、本明細書で提供される方法に従って行われてもよい。例示的な組成物は、本明細書で提供される方法の任意の実施形態に従ってリプログラミングされたニューロンを含むことができる。

他の実施形態では、本明細書で提供される方法は、非ニューロン細胞をニューロンにインビボでリプログラミングし、リプログラミングしたニューロンを外植するステップを含む。いくつかの実施形態では、外植片は、リプログラミングされたニューロンを含む脳組織を含む。いくつかの実施形態では、外植片は被験者の脳領域に移植される。本明細書で提供されるように、本明細書で提供される方法に従ってリプログラミングされたニューロンの移植は、ニューロン損失に関連する状態に罹患している被験者において変性したニューロンを補充するために使用され得る。
本開示のいくつかの他の態様は、本明細書で提供される方法のいずれかの実施形態に従ってリプログラミングされたニューロンを含む動物に関する。

本明細書で提供されるように、動物は任意の哺乳動物であってもよい。動物はヒトであってもよい。動物は、例えば、アカゲザル、カニクイザル、スタンプオザル、ブタオザル、リスザル、フクロウザル、ヒヒ、チンパンジー、マーモセット、およびクモザルなどの非ヒト霊長類であり得るが、これらに限定されない。動物は、研究動物、トランスジェニック動物、又は任意の他の適切な種類の動物であり得る。

本明細書では、本開示の任意の実施形態に従ってリプログラミングされた１つ又は複数のニューロンを含む動物の脳組織（例えば、外植片）も提供される。このような脳組織は生きていてもよい。いくつかの実施形態では、脳組織は、任意の適切な固定剤によって固定され得る。脳組織は、移植、医学研究、基礎研究、又はあらゆる種類の目的で使用することができる。

本開示は、この方法が神経変性疾患モデルに適用可能であることを証明する。例えば、本開示は、アストロサイトからニューロンへの変換戦略が、化学的に誘導されたパーキンソン病モデルにおいて機能し得ることを示している。該方法及び組成物は、アストロサイトを、ドーパミン作動性ニューロン、グルタミン酸作動性ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンを含む神経細胞に変換することができ、これらのニューロンは、脳内でシナプスを形成することができ、なお、変換されたニューロンは、測定可能なパーキンソン表現型を修正するために、損傷した黒質線条体経路を効率的に再構築することができる。この方法の有効性は、培養したアストロサイト（ヒトとマウス）及びマウスパーキンソン病モデルで確認された。したがって、この戦略は、パーキンソン病を治癒する可能性を有し、また、広範な神経変性疾患（例えば、ニューロン機能障害に関連する他の神経疾患）にも適用することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、２つの哺乳動物アストロサイト中にすでに存在するが潜伏しているニューロン成熟プログラムの遺伝的基礎を利用し、アストロサイトがＰＴＢ阻害によりリプログラミングされると、成熟ニューロンを徐々に生成する。これらの知見は、Ｃａｓエフェクター及びＰＴＢ／ｎＰＴＢに対するｇＲＮＡをコードする配列を含むベクターの単用量を用いて、哺乳動物の脳内の局所的アストロサイトからニューロンを生成することができる臨床的に実行可能な方法を提供する。ＰＴＢ／ｎＰＴＢノックダウンにより誘導されるニューロンの表現型は、それらを生成する環境及び／又はそれらの由来であるアストロサイトに関連している可能性がある。
本開示は、アストロサイトのニューロン（例えば、線条体のドーパミンニューロン）への効果的な変換を証明する。より具体的には、本開示では、霊長類モデルにおいてこの戦略はアストロサイトをニューロンに変換するのに効果的であり、それによってインビボでリプログラミングされる５つの因子のすべてを満足させることが示されている。本明細書で提供されるデータは、霊長類の脳におけるＰＴＢの減少がアストロサイトをドーパミンニューロン（例えば、ドーパミン作動性ニューロン）に変換することを示唆している。

本開示の組成物の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、体重、及び個体において所望の応答を誘発する組成物の能力などの要因に応じて変化する。治療有効量はまた、組成物のいずれかの毒性又は有害作用が治療上有益な作用を超える量であってもよい。特定の理論に縛られることは望ましくないが、本明細書で提供される細胞プログラミング剤の治療有効量は、いくつかの場合には、脳領域（ニューロン損失を経験している）における所定の割合のアストロサイトを変換する細胞プログラミング剤の量であってもよく、脳領域におけるこのような割合のアストロサイトの機能性ニューロンへの変換はニューロン損失に関連する疾患又は病態を改善又は治療するのに十分であり、一方、アストロサイトのこの割合は、例えば、ニューロン変換の直接的な結果に起因する脳領域におけるアストロサイトの数の過度の減少など、ニューロン変換によってもたらされる有益な効果を上回る嫌悪効果をもたらす可能性のある閾値レベルを超えないことが予想される。
以下の実施例は、本開示を説明することを意図しているが、限定するものではない。これらは使用され得る典型的な例であるが、当業者に知られている他の手順も代替的に使用することができる。

実施例１
方法と材料
マウス及び細胞株
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは上海ＳＬＡＣ実験室から購入した。マウスは水と餌のある明るい／暗い循環室に置かれた。すべての動物実験は中国・上海の中国科学院ＣＥＢＳＩＴ動物保護・使用委員会によって行われ、承認された。Ｃｏｓ７、２９３Ｔ及びＮ２ａ細胞株は中国科学院上海生化学・細胞生物学研究所（ＳＩＢＣＢ）の細胞バンクから得られ、３７℃のインキュベータ、５％ＣＯ_２で、１０％胎児ウシ血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭにおいて培養した。

トランスフェクション、ｑＰＣＲ及びＲＮＡ-ｓｅｑ
リポソーム３０００を用い、ＣＡＧ－ＣａｓＲｘ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ発現ベクター４μｇ＋Ｕ６－ｇＲＮＡ－ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド２μｇを用いて一過性トランスフェクションを行った。対照としてＣＡＧ-ＣａｓＲｘ-Ｐ２Ａ-ＧＦＰプラスミドを用いた。一過性トランスフェクションの２日後に、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）により約３０ＫＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙの二重陽性（ＧＦＰの上位２０％）の細胞を採取し、ｑＰＣＲ分析用に分解した。まず、Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＲＮＡを抽出し、次に、逆転写キット（ｑＰＣＲ用ＨｉＳｃｒｉｐｔＱＲＴＳｕｐｅｒＭｉｘ、Ｖａｚｙｍｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてｃＤＮＡに変換した。ＡｃｅＱｑＰＣＲＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｖａｚｙｍｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈ）により増幅を追跡した。ＲＮＡ-ｓｅｑについては、１０-ｃｍシャーレでＣｏｓ７細胞を培養した。ＦＡＣＳにより約１００ｋの陽性細胞（ＧＦＰの上位２０％）を分離し、ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡに逆転写した後、ＲＮＡ－ｓｅｑに使用した。ＲＮＡ－ｓｅｑデータ分析は既報の通り行われ(Zhou et al., 2018, Cell 181: 590-603)、すべての重複の平均値として示された。

ガイドＲＮＡ配列
使用されるガイドＲＮＡのガイド配列（すなわち、標的とするＰＴＢｍＲＮＡ配列に相補的な配列）は、表１のように示されている。
表１ガイドＲＮＡのガイド配列と、それぞれのガイドＲＮＡで得られた相対発現レベル（ｇＲＮＡなしの対照に対する）
高効率ｇＲＮＡは、すべて重要な領域（配列番号８７の９５１～１４８７位、つまり配列番号８８、図１を参照する）に位置し、太字で示されている。

定位注射及び免疫蛍光染色
本研究ではＡＡＶ８を用いた。前述したようにマウスに定位注射を行った(Zhou et al., 2014, Elife 3, e02536, doi:10.7554/eLife.02536)。マウスを定位フレーム内に配置した。次に、頭蓋骨の皮膚をカミソリで剃り落として、頭蓋骨を切開した。前頭骨と頭頂骨の境界の上に座標（ＡＰ＋０．８ｍｍ、ＭＬ±１．６ｍｍ）による開頭手術を行い、注射マイクロピペット（先端外径約２０μｍ）を置くことを可能にした。ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ｍＣｈｅｒｒｙ又はＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ＋ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ｍＣｈｅｒｒｙのいずれかを含むウイルス溶液をゆっくり（約０．３μｌ／ｍｉｎ）注射した。マウスの線条体（ＡＰ＋０．８ｍｍ、ＭＬ±１．６ｍｍ、及びＤＶ２．６ｍｍ）へＡＡＶを注射した（＞１×１０^１２ｖｇ／ｍｌ、１μＬ、８～１０週齢マウス）。カニクイザルでは、ＡＡＶ注射の約１４時間前に免疫抑制剤であるデキサメタゾン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射で投与した。ＡＡＶ注射の場合、被殻の両側に８０μＬ（＞１×１０^１２ｖｇ／ｍｌ）のＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙとＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙを注射した。ＧＦＡＰ-ｍＣｈｅｒｒｙとＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ又はＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１との体積比は１：２０である。免疫蛍光染色の場合、脳を４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流して一晩固定化し、３０％のスクロースで少なくとも１２時間（マウスの場合）及び２週間（カニクイザルの場合）保存した。包埋・凍結後の脳切片について、マウス３０μｍとカニクイザル３０μｍの厚さの切片を用いて免疫蛍光染色した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）で脳切片を完全に洗浄した。一次抗体：ウサギ抗ＮｅｕＮ（１：５００、２４３０７Ｓ、細胞シグナル技術）、モルモット抗ＮｅｕＮ抗体（１：５００、ＡＢＮ９０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗Ｆｌａｇ（１：２０００、Ｆ３１６５、Ｓｉｇｍａ）、ウサギ抗ＴＨ抗体（１：５００、ＡＢ１５２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ラット抗ＤＡＴ（１：１００、ＭＡＢ３６９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ＲＢＰＭＳ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃１５１８７－１－ＡＰ）。本研究では、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒａ４８８ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００、７１１－５４５－１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ免疫研究）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒａ４８８ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００、７１５－５４５－１５０、Ｊａｃｋｓｏｎ免疫研究）、Ｃｙ５－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗モルモットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００、７０６－１７５－１４８、Ｊａｃｋｓｏｎ免疫研究）、Ｃｙ５ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００、７１１－１７５－１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ免疫研究）を用いた。抗体をインキュベートした後、切片を洗浄し、封入剤（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で覆った。ＯｌｙｍｐｕｓＦＶ３０００顕微鏡下で画像を収集した。

網膜下注射及び免疫蛍光染色
網膜下注射によりＮＭＤＡとＡＡＶ（ＡＡＶ８）を導入した。網膜下注射では、マウスを麻酔し、ＡＡＶを網膜下腔にゆっくり注射した。完全な網膜における変換を決定するために、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅ（０．２μｌ）とＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１（０．４μｌ）、又はＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅ（０．２μｌ）とＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ（０．４ｍｌ）と、ＰＢＳ（０．４μｌ）、又はＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅ（０．２μｌ）とＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１（０．４μｌ）とＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β－カテニン（０．４μｌ）の合計１μｌを網膜下注射により網膜に送達した（Ａｉ９及びＣ５７ＢＬ／６マウス、４月齢）。ＡＡＶ注射後２～３週間後、眼と視神経を採取し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定化した後、３０％のスクロースを含む溶液で保存した。包埋後、目をスライスし、切片を洗浄して封入剤（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で覆った。ＯｌｙｍｐｕｓＦＶ３０００顕微鏡を用いて画像を収集した。

結果実施例１
本研究では、マウス、カニクイザル、及びヒトの細胞におけるＰｔｂｐ１の発現を特異的にダウンレギュレーションすることができるシステムを設計し、さらにＣａｓＲｘ媒介Ｐｔｂｐ１のダウンレギュレーションが、カニクイザルの線条体におけるアストロサイトをドーパミンニューロンに効率的に直接変転できることを明らかにした。要するに、我々の研究はＰｔｂｐ１媒介ドーパミンニューロン変換が霊長類（つまりヒトと非ヒトの霊長類）でも可能であることを示す前臨床証拠を提供し、臨床試験への道を開いた。

Ｐｔｂｐ１の発現をノックダウンするために、ＲＮＡガイド及びＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲタンパク質であるＣａｓＲｘを使用し、これは、ＲＮＡをダウンレギュレーションするための有効かつ特異的な方法である。ＣａｓＲｘ媒介Ｐｔｂｐ１ノックダウンの効率を調べるために、ヒトＰｔｂｐ１遺伝子を標的とする８６個のｇＲＮＡを設計した。トランスフェクション２日後、ＣａｓＲｘ遺伝子を含むベクターとＰｔｂｐ１を標的とするｇＲＮＡとの共トランスフェクションにより、ヒト２９３Ｔ細胞中のＰｔｂｐ１ｍＲＮＡが減少することが観察された（図１Ａ、ｇＲＮＡ配列については、表１を参照する。）。具体的には、ヒトＰｔｂｐ１遺伝子を標的とする重要な領域（配列番号８７の９５１～１４８７位、配列番号８８の１～５３６位に対応）は、しばしば効果的なダウンレギュレーションを誘導する（図１Ｂ）。この実験では、この重要な領域を標的とするｇＲＮＡは４０％以下のノックダウンを達成し、この重要な領域でのみ１０％以下の有効ノックダウンが観察された。

配列番号88:
gccattcctc aagctgcagg cctttccgtt ccgaacgtcc acggcgccct ggcccccctg 60
gccatcccct cggcggcggc ggcagctgcg gcggcaggtc ggatcgccat cccgggcctg 120
gcgggggcag gaaattctgt attgctggtc agcaacctca acccagagag agtcacaccc 180
caaagcctct ttattctttt cggcgtctac ggtgacgtgc agcgcgtgaa gatcctgttc 240
aataagaagg agaacgccct agtgcagatg gcggacggca accaggccca gctggccatg 300
agccacctga acgggcacaa gctgcacggg aagcccatcc gcatcacgct ctcgaagcac 360
cagaacgtgc agctgccccg cgagggccag gaggaccagg gcctgaccaa ggactacggc 420
aactcacccc tgcaccgctt caagaagccg ggctccaaga acttccagaa catattcccg 480
ccctcggcca cgctgcacct ctccaacatc ccgccctcag tctccgagga ggatct 536

ｇＲＮＡ６０の標的部位はカニクイザル、ヒトＰｔｂｐ１、及びマウス遺伝子で保存されており、ヒト２９３Ｔ、サルＣｏｓ７細胞、及びマウスＮ２ａ細胞でＰｔｂｐ１遺伝子を効果的にダウンレギュレーションできることから、以下の実験に用いた（図２、及び３）。この戦略の標的特異性を決定するために、ＲＮＡ－ｓｅｑを行ったところ、Ｃｏｓ７細胞でＰｔｂｐ１が特異的にダウンレギュレーションされていることがわかった（図４）。最近の研究により、Ｐｔｂｐ１ノックダウンが線条体のアストロサイトをドーパミンニューロンに変換できることが明らかになり、次に、非ヒト霊長類動物の線条体のアストロサイト中のＰｔｂｐ１ノックダウンがインビボでアストロサイトを局所的にドーパミンニューロンに変換できるか否かを検証した。ＡＡＶベクターをインビボで検証するため、まず、野生型マウスにＣａｓＲｘを発現するＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１とｇＲＮＡ６０、及びアストロサイトを蛍光標識したＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙを注射した。また、Ｐｔｂｐ１ｇＲＮＡを発現しない対照ベクターＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘも構築した（図５Ａ）。注射後１週間では、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣａｓＲｘともにアストロサイトに特異的に発現し、線条体に高い共局在効率を示した。さらに、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋の割合が高い細胞は成熟ニューロンマーカーＮｅｕＮを発現したが、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙとＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘを注射した対照線条体では発現しなかった（図５Ｂと５Ｃ）。さらに、ｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞の大部は、ＡＡＶ注射後２週間でドーパミンニューロンマーカーＴＨを発現し、ＡＡＶ注射後１カ月でＤＡＴを発現した（図５Ｄ及び５Ｅ）。カニクイザルの線条体Ｐｔｂｐ１をノックダウンすることがアストロサイトをドーパミンニューロンに変換させることができるか否かを探索するために、８歳齢のカニクイザルの右半球被殻に、ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１とＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ｍＣｈｅｒｒｙを注射し、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘとＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙを左半球被殻に注射した。ＡＡＶ注射１カ月後、右被殻にｍＣｈｅｒｒｙ^＋ＴＨ^＋細胞が認められたが、対照被殻では観察されず（図５Ｆ）、Ｐｔｂｐ１をノックダウンすることは、非ヒト霊長類のアストロサイトをドーパミンニューロンに変換することもできることを示唆した。

さらに、ＦｏｘＡ２、Ｌｍｘ１ａ、及びＮｕｒｒ１など、他のドーパミンニューロン変換に関連する転写因子を組み合わせることで、ドーパミンニューロンの変換効率を向上させる可能性を探った。これらの転写因子の過剰発現がドーパミンニューロンの変換を増強する可能性があると仮定した。実際、我々の結果では、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１を単独で発現する場合と比べて、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１とＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＦｏｘＡ２、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－Ｌｍｘ１ａ、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＦｏｘＡ２＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－Ｌｍｘ１ａ又はＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｆｏｘａ２＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－Ｌｍｘ１ａ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＮｕｒＲ１との共発現により、マウスの線条体におけるドーパミンニューロンの変換効率を高めることが示された（図６参照）。

アストロサイト性ドーパミンニューロンの変換に加えて、我々のこれまでの結果では、４～８週齢の成熟網膜において、Ｐｔｂｐ１をノックダウンすると、ミュラーグリア（ＭＧ）が網膜神経節細胞（ＲＧＣｓ）に変換され得ることが示された。しかし、この戦略が中高年のマウスに適用できるか否かは不明である。そこで、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１とＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅを網膜下注射により４～５月齢のａｉ９マウス（ＣＡＧ－ＬＳＬ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）の眼に導入したところ、注射後３週間で視神経にｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索が少量認められた。ＭＧ再循環を刺激することでＭＧからＲＧＣへの変換が向上するか否かを探るため、ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１、ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＧＦＰ-ＣｒｅをＡＡＶ-ＧＦＡＰ-β-カテニンとともに４～５カ月齢の網膜に注射した。注射後約３週間で、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１及びＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅの注射と比較して、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－βカテニン＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＰ－Ｃｒｅの注射により、変換されたｒｇｃの量が増加することが確認された（図７参照）。要約すると、中年又は高齢哺乳類のＲＧＣ変換を改善するための新しい戦略を提供した。

実施例２
ＭＤモデルサルの症状軽減
アストロサイトのドーパミンニューロンへの変換がサルＰＤモデルの被殻で実現できるか否かを決定するために、組織学的に観察した結果、ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ｍＣｈｅｒｒｙとＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１を注射した被殻では、大部のｍＣｈｅｒｒｙ^＋細胞はドーパミンニューロンマーカーＴＨを発現したが、対照ＡＡＶ（ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙとＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ）を注射した被殻では発現しなかった。さらに、ｍＣｈｅｒｒｙ細胞の高パーセントが黒質Ａ９型ドーパミン作動性ニューロンマーカーであるドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）も発現していることを明らかにした。要するに、これらの結果は、被殻アストロサイトにおけるＰｔｂｐ１の発現をダウンレギュレーションすることによりドーパミンニューロンを誘導することに成功したことを示唆した。次に、誘導されたドーパミンニューロンがパーキンソン病の症状を軽減できるか否かを評価するために、動画によるサルの運動解析を用いた。その結果、ＡＡＶ注射後約１カ月で、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１を注射したＰＤサルはＰＤ症状の著明な軽減（約１５％軽減）を示した。しかし、Ｐｔｂｐ１を標的とするｇＲＮＡをコードするＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘを注射した対照サルでは、ＰＤ症状の有意な軽減は認められなかった。誘導されたドーパミンニューロンがインビボでドーパミン作動性ニューロンとして機能しているか否かを判定するために、シナプス前ドーパミン作動性機能の検出、小胞性モノアミントランスポータータイプ２（ＶＭＡＴ２）の活性の監視、ＤＡＴ密度の正確な定量化を行うために、１８Ｆ－ＤｏｐａＰＥＴ、１８Ｆ－ＤＴＢＺＰＥＴ、及び１８Ｆ－ＦＰ－ＣＩＴＰＥＴをそれぞれ実施した。これらのシグナルの増強は、ＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ｍＣｈｅｒｒｙとＡＡＶ-ＧＦＡＰ-ＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１を注射した被殻で認められたが、対照ＡＡＶでは認められなかった。これらの結果は、完全なサル被殻で誘導されたドーパミンニューロンの機能を示している。

ＮＭＤＡ誘導網膜損傷サルモデルにおけるＭＧからＲＧＣへの変換（ＲＧＣ）
誘導されたＲＧＣが網膜損傷サルモデルのＲＧＣを補充できるか否かを調べるために、成体サルガラスにＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）を注射したが、その結果、ＲＧＣの大部が失われた。ＮＭＤＡ注射後２～３週間では、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β-カテニン、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１、又はＰｔｂｐ１を標的とするｇＲＮＡをコードしない対照ＡＡＶ（ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β－カテニンとＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ）を眼に注射した。さらに、ＯＳＫ（Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１とも呼ばれる）、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４遺伝子）とＣａｓＲｘ-Ｐｔｂｐ１との中年又は高齢の網膜ＭＧにおける共発現が、ＲＧＣの変換を促進する可能性があると仮定した。そこで、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＯＳＫも網膜に注入した。ＡＡＶ投与後１～２カ月で、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＴＤｔｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β－カテニン、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＴＤｔｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＯＳＫ又はＡＶ－ＧＦＡＰ－ＴＤｔｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－ｐｔｂｐ１を注射した網膜では、ＧＣＬ中のｔｄＴｏｍａｔｏ^＋Ｒｂｐｍｓ^＋細胞数は増加したが、対照ＡＡＶを注射した網膜では、そのような細胞はほとんどなく、ＮＭＤＡ誘導網膜損傷サルモデルでは、ＭＧからＲＧＣへの変換誘導に成功したことが示唆された。また、ＧＣＬ中のｔｄＴｏｍａｔｏ^＋Ｒｂｐｍｓ^＋細胞は、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１を投与した網膜に比べて、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β－カテニン又はＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＯＳＫを注射した網膜では、より頻繁に観察された。視覚系では、ＲＧＣは視神経を介して脳に軸索を送り、サルの脳にある背外側膝状核（ｄＬＧＮ）や上丘（ＳＣ）と中枢投影を形成した。ＭＧ由来のＲＧＣが視覚系に組み込まれているか否かを探るために、サル脳をスライスし、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β－カテニン又はＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏを注射した視神経では、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１を注射したものよりも多くのｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索が認められたが、対照群ではこのような軸索はほとんど認められなかった。なお、ｄＬＧＮとＳＣでｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索を検出し、ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋軸索は同側部分よりも脳の反対側部分で豊かになっており、これは誘導されたＲＧＣが脳の右側との接続（ｒｉｇｈｔｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）を形成していることを示唆した。ＭＧが網膜光受容体に変換できるか否かを調べるために免疫染色を行い、ＡＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β－カテニン、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＯＳＫ和ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１を注射した網膜では、ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞の一部は、棒細胞マーカーであるロドプシン及びＧＮＡＴ１と、錐体細胞マーカーであるＳ－オプシン、Ｍ－オプシン及びｍＣＡＲを発現しており、錐体細胞及び桿体細胞もＭＧによって誘導され得ることを示した。

方法
ＰＤモデルサル
本研究には成体（７～１０歳）のオスのカニクイザルを用いた。非ヒト霊長類のパーキンソン病モデルを作製するために、ＭＰＴＰ（１－メチル４－フェニル１，２，３，６－テトラヒドロピリジン）を動物に静脈注射して黒質のドーパミンニューロンを枯渇させ、震動、運動遅延、平衡障害などの持続的な症状を観察した。ＡＡＶ注射前に５週間以上安定した症状が観察された。

陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）の研究（ＰＤ部分）
完全サルの脳内で変換したドーパミンニューロンのドーパミン機能をモニターするために、ＡＡＶ注射前と注射後１カ月前後にＰＥＴイメージング（１８Ｆ-ＤＯＰＡ、１８Ｆ-ＤＴＢＺ及び１８Ｆ-ＦＰ－ＣＩＴ）を行った。走査前に、サルを麻酔し、次に動物をＰＥＴスキャナーに入れて、すべての生理学的パラメータをモニターした。走査後に標準プロトコルを用いてＰＥＴデータを分析した。

行動回復の動画解析（ＰＤ部分）
動画解析のため、ＡＡＶ注射前と注射後１カ月、２カ月のサルの動きを記録した。収集後に記録された動画を解析した。サルのＰＤ症状は、頭部の動き、顔の表情、自発性活動、刺激に応答する運動、振戦、姿勢、歩行などの項目を用いて評価された。

ＮＭＤＡ誘導網膜損傷サルモデルの作製及びＡＡＶ注射（ＲＧＣ部分）
ＮＭＤＡは硝子体内、ＡＡＶは網膜下注射で注射された。硝子体内注射では、サルを麻酔してアルカインを目に滴下した。ＮＭＤＡ溶液を硝子体に注入してＲＧＣの大部を枯渇させ、次にオオフロキサシン眼軟膏を眼に塗布して感染を防止した。網膜下注射では、ＮＭＤＡ注射後２～３週間でサルを麻酔し、瞳孔を拡張した。ＡＡＶを網膜下腔にゆっくり注射した。注射後は、針を抜き、眼軟膏を投与した。変換を決定するために、ＭＧのＲＧＣへの変換を誘導する以下の３つの戦略を設計した。ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β－カテニン、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＯＳＫ、及びＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ－Ｐｔｂｐ１。さらに、Ｐｔｂｐ１を標的とするｇＲＮＡをコードしない対照ＡＡＶとして、ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－β－カテニン，ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＯＳＫ，又はＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＡＡＶ－ＧＦＡＰ－ＣａｓＲｘを注射した。ｇＲＮＡの転写がＵ６プロモーターによって駆動されることに注目した。ＡＡＶは網膜の下を通って網膜に送られた。ＡＡＶ注射後約１～２カ月後、眼、視神経、脳を採取し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定化した後、３０％スクロース溶液に保存した。包埋後、目と脳を切片し、抗体とともにインキュベートし、顕微鏡で観察した。

Claims

非ヒト霊長類又はヒトの神経系領域における機能性ニューロンの変性に関連する神経状態を治療する方法であって、
非ニューロン細胞における霊長類ＰＴＢタンパク質の発現又は活性を阻害して、非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングすることを可能にするために霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列若しくはその相補配列を標的とする核酸分子を含む組成物の有効量を、必要な被験者の神経系領域における非ニューロン細胞に投与するステップを含み、
前記標的配列は、配列番号８７と少なくとも９５％同一の配列に含まれ、前記標的配列がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で標的化された場合、前記ｇＲＮＡのガイド配列は、配列番号１～８６の少なくとも１つの配列と少なくとも１０ヌクレオチドの重複を有し、前記ｇＲＮＡは、Ｃｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現し、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、上記細胞において０．５未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現が観察される、方法。
非ヒト霊長類又はヒトの神経系領域における機能性ニューロンの変性に関連する神経状態を治療する方法であって、
非ニューロン細胞におけるＰＴＢの発現又は活性を阻害して、非ニューロン細胞を機能性ニューロンにリプログラミングすることを可能にするために霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列若しくはその相補配列を標的とする核酸分子を含む組成物の有効量を、必要な被験者の神経系領域における非ニューロン細胞に投与するステップを含み、
前記標的配列は、配列番号８７の９５１～１４８７位と少なくとも９５％同一の配列に含まれる、方法。
前記標的配列がガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で標的化された場合、前記ｇＲＮＡのガイド配列は、配列番号３８～６８の少なくとも１つの配列と少なくとも１０ヌクレオチドの重複を有し、前記ｇＲＮＡは、Ｃｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現し、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、上記細胞において０．４未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現が観察される、請求項２に記載の方法。
前記核酸分子は、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子、又はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のうちの少なくとも１つであるか、又はこれらをコードする、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
組成物は、ｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質及び少なくとも１種のｇＲＮＡ、又はｉｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードし、前記少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする少なくとも１種の発現ベクターを含み、任意に、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質及び前記少なくとも１種のｇＲＮＡ又は少なくとも１種の発現ベクターは、ナノ粒子、好ましくはリポソームに含まれる、請求項４に記載の方法。
ａ）前記Ｃａｓエフェクタータンパク質はＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質であり、
ｂ）前記ｇＲＮＡは、配列番号８７と少なくとも９５％同一の配列中の１７～６０個のヌクレオチドの連続部分に相補的なガイド配列を含む、請求項５に記載の方法。
前記ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｄ、ＣａｓＲｘ、Ｃａｓ１３ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｆ及びそれらの機能ドメインからなる群から選択され、好ましくはＣａｓＲｘである、請求項６に記載の方法。
前記ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号１～８６のうちの少なくとも１つの配列の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７個の連続するヌクレオチド又はすべてのヌクレオチドを含むか、又はそれらからなり、
好ましくは、前記ｇＲＮＡがＣｏｓ７細胞及び２９３Ｔ細胞の少なくとも一方でＣａｓＲｘと共発現した場合、ＣａｓＲｘのみを発現する対応する対照細胞と比較して、上記細胞において０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１５未満のＰＴＢｍＲＮＡの相対発現量が観察される、請求項７に記載の方法。
前記ｇＲＮＡ中のガイド配列は、配列番号５６、６０、４７、４８、４３、４５、４０、６１、５０、５５、４１、４４、４２、６６、４９、５１及び４６からなる群から選択される少なくとも１つの配列を含むか、又はそれらからなる、請求項８に記載の方法。
前記組成物は、霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とする単一型のみのｇＲＮＡ、又は２種類、３種類、４種類、５種類又は６種類の異なるｇＲＮＡを含むか、又は霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とする単一型のみのｇＲＮＡ、又は２種類、３種類、４種類、５種類又は６種類の異なるｇＲＮＡをコードする発現ベクターを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
前記少なくとも１種の発現ベクターは、
ｉ）前記Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、霊長類の非ニューロン細胞において前記Ｃａｓエフェクタータンパク質の発現を引き起こすプロモーターに作動可能に連結されており、好ましくは、前記プロモーターはグリア細胞特異的プロモーター又はミュラーグリア（ＭＧ）細胞特異的プロモーターであり、グリア細胞特異的プロモーターがより好ましくは、ＧＦＡＰプロモーター、ＡＬＤＨ１Ｌ１プロモーター、ＥＡＡＴ１／ＧＬＡＳＴプロモーター、グルタミン合成酵素プロモーター、Ｓ１００βプロモーター及びＥＡＡＴ２／ＧＬＴ-１プロモーターから選択され、又はミュラーグリア（ＭＧ）細胞特異的プロモーターがより好ましくは、ＧＦＡＰプロモーター、ＡＬＤＨ１Ｌ１プロモーター、ＧＬＡＳＴ（Ｓｌｃ１ａ３とも呼ばれる）プロモーター及びＲｌｂｐ１プロモーターから選択されるヌクレオチド配列と、
ｉｉ）霊長類ＰＴＢｍＲＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列であって、前記非ニューロン細胞において前記ｇＲＮＡの発現を引き起こすプロモーター、例えばＵ６プロモーターに作動可能に連結されているヌクレオチド配列と、を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
前記発現ベクターはナノ粒子に含まれる、又は前記発現ベクターは、遺伝子治療ベクター、好ましくは、ウイルス遺伝子治療ベクター、より好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンタウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０ベクター、ポックスウイルスベクター、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されるウイルスベクターであり、最も好ましくは、ＡＡＶである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
ｉ）成熟網膜の非ニューロン細胞、ｉｉ）線条体の非ニューロン細胞、好ましくは被殻の非ニューロン細胞、ｉｉｉ）黒質の非ニューロン細胞、ｉｖ）内耳の非ニューロン細胞、ｖ）脊髄の非ニューロン細胞、ｖｉ）前頭前皮質の非ニューロン細胞、ｖｉｉ）運動皮質の非ニューロン細胞、及びｖｉｉｉ）中脳腹側被蓋野（ＶＴＡ）の非ニューロン細胞の少なくとも１種の細胞に前記組成物を局所的に投与する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物を線条体の非ニューロン細胞に投与して、機能性ドーパミン作動性ニューロンを生成し、好ましくは、前記非ニューロン細胞はグリア細胞であり、好ましくは、前記組成物は被殻及び黒質の少なくとも一方に投与される、請求項１３に記載の方法。
前記グリア細胞はアストロサイトである、請求項１４に記載の方法。
前記神経状態は、パーキンソン病；アルツハイマー病；ハンチントン病；統合失調症；うつ病；薬物依存症；脳卒中；運動障害例えば舞踏病、脊髄損傷、舞踏病アテトーゼ、及びジスキネジアなど；双極性障害；自閉症スペクトラム（ＡＳＤ）；及び機能障害からなる群から選択される機能性ニューロンの変性に関連する状態である、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
前記組成物は、ｉ）１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子、又はｉｉ）非ニューロン細胞において１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子を発現させるための少なくとも１種の発現ベクターをさらに含む、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
前記１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子は、Ｌｍｘ１ａ、Ｌｍｘ１ｂ、ＦｏｘＡ２、Ｎｕｒｒ１、Ｐｉｔｘ３、Ｇａｔａ２、Ｇａｔａ３、ＦＧＦ８、ＢＭＰ、Ｅｎ１、Ｅｎ２、ＰＥＴ１、Ｐａｘファミリータンパク質、ＳＨＨ、Ｗｎｔファミリータンパク質、及びＴＧＦ-βファミリータンパク質からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
前記組成物は、機能的網膜神経節細胞（ＲＧＣ）ニューロン及び／又は機能的網膜光受容体を生成するために、成熟網膜のグリア細胞又はミュラーグリア細胞（ＭＧ）に投与される、請求項１２に記載の方法。
前記神経状態は、緑内障、加齢に伴うＲＧＣ損失、視神経損傷、網膜虚血、及びレーベル遺伝性視神経症からなる群から選択される、成熟網膜の機能性ニューロンの変性に関連する状態である、請求項１２又は１９に記載の方法。
前記組成物は、ｉ）β-カテニン、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３及びＮｒｌからなる群から選択される１つ又は複数の因子、及び／又はｉｉ）非ニューロン細胞において、β-カテニン、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３及びＮｒｌからなる群から選択される１つ又は複数の因子を発現させるための少なくとも１種の発現ベクターをさらに含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
細胞プログラミング剤を投与する前、同時又は後に、少なくとも１種の免疫抑制剤を投与するステップをさらに含み、
より好ましくは、前記少なくとも１種の免疫抑制剤は、コルチコステロイド、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＩＭＤＨ阻害剤、免疫抑制抗体、インターフェロン、Ｊａｎｕｓキナーゼ阻害剤、及びアナキンラのような生物学的製剤からなる群から選択される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
請求項１～４のいずれか１項に記載された霊長類ＰＴＢ遺伝子、転写物、又はｍＲＮＡ中の標的配列若しくはその相補配列を標的とする核酸分子を含む組成物。
ｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質及び少なくとも１種のｇＲＮＡ、又はｉｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードし、前記少なくとも１種のｇＲＮＡをコードする発現ベクターを含み、任意に、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質及び前記少なくとも１種のｇＲＮＡ又は前記少なくとも１種の発現ベクターはナノ粒子、好ましくはリポソームに含まれる、請求項２３に記載の組成物。
前記Ｃａｓエフェクタータンパク質及び前記少なくとも１種のｇＲＮＡは、請求項６～１０のいずれか１項に定義される、請求項２４に記載の組成物。
前記発現ベクターは、請求項１１又は１２に記載の発現ベクターである、請求項２４又は２５に記載の組成物。
前記組成物は、ｉ）１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子、又はｉｉ）非ニューロン細胞において１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子を発現させるための少なくとも１種の発現ベクターをさらに含み、
好ましくは、前記１つ又は複数のドーパミンニューロン関連因子は、Ｌｍｘ１ａ、Ｌｍｘ１ｂ、ＦｏｘＡ２、Ｎｕｒｒ１、Ｐｉｔｘ３、Ｇａｔａ２、Ｇａｔａ３、ＦＧＦ８、ＢＭＰ、Ｅｎ１、Ｅｎ２、ＰＥＴ１、Ｐａｘファミリータンパク質、ＳＨＨ、Ｗｎｔファミリータンパク質、及びＴＧＦ-βファミリータンパク質からなる群から選択される、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の組成物。
ｉ）β-カテニン、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３及びＮｒｌからなる群から選択される１つ又は複数の因子、及び／又はｉｉ）非ニューロン細胞において、β-カテニン、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｃｒｘ、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｍａｔｈ５、Ｎｒ２ｅ３及びＮｒｌからなる群から選択される１つ又は複数の因子を発現させるための少なくとも１種の発現ベクターをさらに含む、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の組成物。
注射、吸入、胃腸外投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、皮膚内投与、局所投与、又は経口投与のために調製される、請求項２３～２８のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質のコード配列と、
（ｂ）請求項６～１０のいずれか１項に記載のｇＲＮＡをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列と、を含む、ＡＡＶベクター。
前記ＲＮＡを標的とするＣａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ｄ、ＣａｓＲｘ、Ｃａｓ１３ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｆ及びそれらの機能ドメインからなる群から選択され、好ましくはＣａｓＲｘである、請求項３０に記載のＡＡＶベクター。
ｉ）前記Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、霊長類非ニューロン細胞において前記Ｃａｓエフェクタータンパク質の発現を引き起こすプロモーターに作動可能に連結されており、好ましくは、前記プロモーターはグリア細胞特異的プロモーター又はミュラーグリア細胞（ＭＧ）細胞特異的プロモーターであり、グリア細胞特異的プロモーターがより好ましくは、ＧＦＡＰプロモーター、ＡＬＤＨ１Ｌ１プロモーター、ＥＡＡＴ１／ＧＬＡＳＴプロモーター、グルタミン合成酵素プロモーター、Ｓ１００βプロモーター及びＥＡＡＴ２／ＧＬＴ-１プロモーターから選択され、又はミュラーグリア細胞（ＭＧ）細胞特異的プロモーターがより好ましくは、ＧＦＡＰプロモーター、ＡＬＤＨ１Ｌ１プロモーター、ＧＬＡＳＴ（Ｓｌｃ１ａ３とも呼ばれる）プロモーター及びＲｌｂｐ１プロモーターから選択され、
ｉｉ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列は、前記非ニューロン細胞において前記ｇＲＮＡの発現を引き起こすプロモーター、例えばＵ６プロモーターに作動可能に連結される、請求項３１に記載のＡＡＶベクター。