KR20240073966A

KR20240073966A - 혈관신생 조절, 바람직하게는 혈당 조절과 조합된 혈관신생의 조절

Info

Publication number: KR20240073966A
Application number: KR1020247014959A
Authority: KR
Inventors: 헤르트 벤스보르트
Original assignee: 바이오템프트, 비.브이.; 레실리운 비. 브이.
Priority date: 2021-10-05
Filing date: 2022-10-05
Publication date: 2024-05-27
Also published as: CO2024005131A2; WO2023059188A1; AU2022359382A1; CA3234504A1

Abstract

본 발명은 뚜렷이 구별되는 신생 약물 유형: 자가포식 저해 화합물로서 작용하고 라파마이신의 기계적 표적 (mTOR)의 영양 감지 시스템을 표적으로 하고 자가혈관신생 활성을 유도하는 mTOR의 펩타이드 모듈레이터에 관한 것이다. 본 발명은 혈관신생 조절을 혈당 조절과 동시에 달성하거나 또는 유지하기 위해, 혈관병증, 특히 당뇨병성 혈관병증을 예방 또는 치료하기 위한 제형, 방법 및 수단을 제공한다.

Description

혈관신생 조절, 바람직하게는 혈당 조절과 조합된 혈관신생의 조절

본 발명은 뚜렷이 구별되는 신생 약물 유형: 자가포식 저해 화합물로서 작용하고 mTOR (mechanistic target of rapamycine)의 영양 감지 시스템을 표적으로 하고 자가포식을 저해하는 mTOR의 펩타이드 모듈레이터에 관한 것이다. 본 발명은 단독으로 사용하기 위한, 특히 혈관신생 조절과 병용하여 혈당 조절을 발휘하기 위한 확립된 인슐린 제형, 방법 및 수단과 조합한, 혈관신생 조절을 발휘하기 위한 약제학적 제형, 방법 및 수단을 제공한다.

진성 당뇨병은 고혈당을 유발하는 전반적인 인슐린 결핍 또는 인슐린 기능 결함으로 인한 내분비 장애이다. 1형 당뇨병은 통상적으로 어린 환자에서 발생하고, 세계적으로 사례의 5-10%를 차지하며, 췌장의 베타-섬세포의 자가면역성 파괴로 인해 부수적으로 발생하는 것으로 보인다. 2형 당뇨병은 전세계 사례의 90% 내지 95%를 차지하고 있으며, 유전자 및 환경 요인으로 인해 인슐린 내성 및 췌장 베타-세포의 기능부전을 유발하는 것으로 보인다. 고혈당에 기인한 합병증은 대혈관 또는 미세혈관성일 수 있다. 대혈관 질환은 주로 심혈관계 및 뇌혈관계에 영향을 미치고, 미세혈관 질환으로는 신장병증, 망막병증 및 신경병증이 있다. 진성 당뇨병에서 혈당 조절은 흔히 인슐린 요구성을 감지하여 환자 신체의 필요성에 따라 인슐린을 투여하도록 췌장의 베타 세포의 기능을 대체하는 것을 수반한다. 인슐린은 천연 호르몬으로, 다양한 질환 상태들에 대해 필수적인 약물이다. 인슐린의 가장 중요한 용도 중 하나는 1형 진성 당뇨병 및 2형 진성 당뇨병에서이다. 인슐린은 임신성 당뇨병 관리용으로 의도된 소수의 약물들 중 하나이다. 진성 당뇨병 환자의 경우 (Dave HD, Preuss CV. Human Insulin. [Updated 2021 Feb 17]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021 Jan-.　Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK545190/), 진성 당뇨병이 없는 건강한 성인에서와 마찬가지로 비슷한 24-시간 인슐린 활성을 가진 정상적인 혈당 조절 목표를 달성하기 위해, 작용의 개시, 피크 및 지속 기간이 규정된 한가지 단일 인슐린 제형은 종종 도움이 되지 않는 것으로 보인다. 그래서, 여러가지 약동학적 특성을 가진 다양한 종류의 인슐린이 요구되고 있다. 작용 방식에 따라 적어도 4가지 타입의 인슐린 유사체가 존재한다. 즉효성 인슐린 (rapid-acting insulin)은 즉각적인 작용 개시 (약 30분 이내), 약 1시간에 피크 작용, 그리고 짧은 작용 기간 (최대 5시간) 특성을 가지고 있다. 인슐린 리스프로 (Lispro) 및 인슐린 아스파르트 (Aspart)가 즉효성 인슐린의 예이다. 이들 인슐린은 혈당 조절을 달성하는데, 특히 식후 상태에서 도움이 된다. 속효성 인슐린 (short-acting insulin) 유사체의 활성은 약 30-60분에 개시되고 2-4시간에 피크에 도달해 약 8시간 동안 활성이 지속된다. 인슐리 글루리신 (Glulisine)과 같은 이러한 인슐린 유사체는 효능을 위해 식전 약 20-30분에 투여하여야 한다. 즉효성 또는 속효성 인슐린 유사체 (예, 인슐린 리스프로, 인슐린 아스파르트 및 인슐린 글루리신)는 전형적으로 일반 인간 인슐린보다 더 빠르게 작용한다. 중기-작용성 (intermediate-acting) 인슐린 유사체는 약 1-2시간에 활성이 개시되어 6-10시간에 피크 작용에 도달하고 최대 약 16시간 작용이 지속된다. 중성 프로타민 하게도른 (Neutral protamine Hagedorn, NPH) 및 렌테 (Lente) 인슐린이 중기-작용성 인슐린 유사체의 예이다. 장기-작용성 인슐린 (long-acting insulin) 유사체의 일부는 인슐린 데테미르 (Detemir) 및 인슐린 글라르긴 (Glargine)이다. 이의 활성은 약 2시간에 개시되어 6-20시간에 피크 효과를 나타내고, 최대 약 36시간 동안 지속된다. 중기-작용성 및 장기-작용성 (basal) 인슐린은 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 또는 임신성 당뇨병을 앓고 있는 환자에게 권장된다.　이는 또한 다른 유형의 당뇨병 (즉, 스테로이드-유발성)에도 이용할 수 있다. 1형 당뇨병 환자는 일반적으로 혈당 조절을 달성하기 위해 일반 또는 즉효성 인슐린과 병용하여, 중기-작용성 인슐린 또는 장기-작용성　인슐린을 이용한다. 2형 당뇨병 환자는 혈당 조절을 달성하기 위해 일반 또는 즉효성 인슐린과 병용하여, 또는 경구 약물과 병용하여, 장기-작용성 인슐린을 이용할 수 있다.

그러나, 혈당 조절을 달성하거나 또는 발휘하는 것이 내인성 인슐린 결핍 환자들의 모든 질병을 해결하는 것은 아니다. 특히, 인슐린 결핍된 전반적인 상태에서 망막병증, 말초 신경병증 (DPN)과 같은 당뇨병성 혈관병증이 최상의 혈당 조절로도 해소되지 않는 잘 알려진 진성 당뇨병의 미세혈관 합병증이다. DPN은 예를 들어 추가적인 감염을 유발하고, 당뇨병성 족부 궤양 (도 1), 비-외상성 절단 및 사망의 위험을 높인다. 고혈당증뿐 아니라 저혈당증이 DPN 발병에 중요한 역할을 담당하지만, (인슐린을 이용한 또는 인슐린 없이) 집중적인 혈당 조절로는 당뇨병 환자에서 DPN 발병 위험을 제거하지 못하여, 인슐린 부족 또는 불안정한 글루코스 대사 이외의 다른 요인들이 DPN 발병에 관여할 수 있음을 의미한다. 말초혈에서 C-펩타이드 수준이 가장 적절한 인슐린 분비 척도로서 널리 용인되어 있으며, 간을 통한 1차 통과 대사를 통해 제거되지 않는다. 이전에 인슐린의 불활성 부산물로서 간주된 C-펩타이드는 호르몬 활성 펩타이드이다. 1형 당뇨병의 경우, 이탈리아 연구 Panero et al. Fasting plasma C-peptide and micro- and macrovascular complications in a large clinic-based cohort of type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 2009;32:301-5)에서 C-펩타이드 수준과 신경병증 등의 미세혈관 합병증 간에 유의하고 네거티브 연관성이 확인되었다. 전형적으로, C-펩타이드 결핍이 이러한 미세혈관 합병증과 연관되어 있어, 이러한 환자를 외인성 C-펩타이드로 치료하고자 하는 시도를 촉구하였다. 동물 당뇨병 모델 및 1형 당뇨병 환자를 대상으로 한 여러 연구들에서, C-펩타이드 대체 (C-peptide replacement)가 당뇨병에서 자율 신경 기능과 말초 둘다에 유익한 효과가 있는 것으로 실제 입증되었다 (Johansson et al. Beneficial effects of C-peptide on incipient nephropathy and neuropathy in patients with Type 1 diabetes mellitus. Diabetic Med. 2000;17:181-9). 2형 당뇨병의 경우, 중국 연구 (Qiao et al.　C-peptide is independent associated with diabetic peripheral neuropathy: a community-based study.　Diabetol Metab Syndr　9,　12 (2017))에서, C-펩타이드 수준은 물론 DPN과 관련한 미세혈관 합병증과 유의하고 네거티브 연관성이 있었다. 내인성 C-펩타이드는 혈관계의 혈관신생 조절을 통해 혈관병증의 해소에 기여하여, 이러한 혈관계에 대해 혈관신생 활성을 발휘하는 것으로 보인다. C-펩타이드 수준이 낮은 환자에서는 망막병증, 신장병증 및 신경병증을 포함한 혈관병증이 높은 유병률로 관찰되었다. 신체에 말초 신경병증 변화로 페달 감각 (pedal sensation)이 감소되고, 당뇨병성 발은 기계적 상해 또는 욕창으로 상처 입기 쉽다. 미세혈관 변화는 사지 혈류를 저하하여 상처 치유를 지연시킨다. 이러한 합병증은 유발 요인이 대부분 경미한 외상이므로 예방할 수 있다. 이러한 피부 손상의 초기 식별 역시 진행 위험을 낮추고 결과를 개선할 수도 있다.

그러나, 1형 당뇨병 및 신경병증 개체에서 장기-작용성 (페길화된) C-펩타이드의 효능과 안전성을 평가하는 임상 시험은 이의 1차 엔드포인트를 충족하지 못하였다 (Wahren et al., Long-acting C-peptide and neuropathy in type 1 diabetes: A 12-month clinical trial. Diabetes Care. 2016 Apr;39(4):596-602). 1형 당뇨병 및 말초 신경병증 환자 총 250명에 장기-작용성 (페길화된) C-펩타이드를 매주 0.8 mg (n　= 71) 또는 2.4 mg (n　= 73)의 용량으로 또는 위약 (n　= 106)을 52주간 투여하였다. 장기-작용성 C-펩타이드를 52주간 주 1회 투여시, 양측 비복 신경 전도 속도 (SNCV), 기타 전기생리학적 변수 또는 수정된 토론토 임상 신경병증 점수 (mTCNS)는 개선되지 않았지만, 위약과 비교해 진동 인지 역치 (VPT)의 개선만 달성되었고, 이 제형에서 C-펩타이드는 혈관신생의 조절은 달성하지 못하였다.

감염성 발 괴저는 심각한 당뇨병 합병증이다. 이는 일반적으로 특정 높이에서의 하지 절단 (LEA)으로 이어진다. 발 괴저는 부적절한 혈류 공급으로 인한 발의 죽은 조직으로서 정의된다. 이는 중증 사지 허혈증의 최종 징후 중 하나이다. 이는 말초 순환 폐쇄 또는 미생물 감염으로 발생할 수 있다. 당뇨병 환자에서 족부 궤양은 주로 말초 동맥 질환으로 인해 발 괴저가 발생할 위험이 높다. 발 괴저는 2가지 극단을 망라한다: (도 1A) 허혈성 및 괴사 조직을 동반한 건성 괴저가 발생하지만 감염은 없는 초기 증상에서부터 (도 1B) 감염성 및 괴사성 조직을 동반한 습성 괴저의 후기 증상. 건성 괴저는 따라서 습성 괴저에까지 이를 수 있다. 보다 확연한 건성 괴저 단계에서는, 발병된 영역이 종종 짙은 녹색 또는 보라색, 거의 검은 색상으로 특정된다. 습성 괴저는 물집 및 종창을 동반한 습성 외양을 가진다. 습성 괴저는 또한 동상에 걸렸거나 또는 중증 화상을 입은 사람에서도 발생할 수 있다. 당뇨병 환자는 궁극적으로 예들 들어 무좀에서 볼 수 있듯이 경미한 발가락 또는 발 상해를 겪은 후 습성 괴저가 발생할 수 있다. 사지 혈류는 일반적으로 당뇨병 환자에서 감소한다. 이는, 이들 영역의 조직들이 신속하게 치유될 수 없음을 의미한다. 그래서, 감염이 더 쉽게 발생할 수 있다. 습성 괴저는 빠르게 퍼질 수 있으며, 치료하지 않고 방치할 경우 치명적일 수 있다. 전형적으로, 이러한 환자는 빠르게 패혈증이 발생해 사망한다.

모든 형태의 괴저에 대한 치료는 죽은 조직의 제거, 치료 및 감염 확산 가능성 중단, 그리고 괴저를 유발한 병태의 치료를 수반한다. 치료는 감염 확산을 방지하기 위해 죽은 조직을 제거하는 수술 (괴저 제거라 함)을 포함할 수 있다. 발병한 사지, 손, 손가락, 발 또는 발가락을 제거해야할 수도 있다. 때로는, 수술 대신 파리 유충의 구더기를 궤양 상처에 두어, 건강한 조직은 손상시키지 않으면서 죽은 감염된 조직을 먹게 한다. 감염을 치료 또는 예방하기 위해 항생제를 이용할 수 있으며, 고압 산소 요법도 당뇨병 또는 말초 동맥 질환과 관련한 습성 괴저나 궤양을 치료할 수 있다.

따라서, 감염성 괴저는 사지-위협 질환이자 생명을 위협하는 질환이다. 항생제 및 상처 드레싱을 이용한 적절한 의학적 처치는 괴사성 및 감염성 조직을 제거하기 위한 시기 적절한 수술 없이는 유효하지 않으므로, 궁극적으로는 사지 절단으로 이어질 수 있다. 그러나, 발표에 따르면, 당뇨병-관련 절단 환자는 여전히 사망 위험이 높고, 5년 생존율이 절단 병인과 무관하게 40-48%이었다 (Huang et al., Survival and associated risk factors in patients with diabetes and amputations caused by infectious foot gangrene. J Foot Ankle Res. 2018 Jan 4;11:1), 또한 도 2를 참조한다.

진성 당뇨병 (1형 또는 2형) 환자는 영국에서만도 당뇨병성 족부 궤양 합병증의 평생 발병 위험이 최대 25% (일부는 50%로 발표됨)이고, 이미 NHS에 9억 35백만 파운드의 비용이 추정되었다　(Diabetic foot care in England: an economic study - Marion Kerr, Insight Health Economics, 2017). 치료하기 어려운 당뇨병성 궤양의 최종 결과는 전반적인 질병률 증가이다 (Packer CF, Ali SA, Manna B. Diabetic Ulcer. [Updated 2021 Feb 20]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021 Jan-.　Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK499887/).

명시된 바와 같이, 당뇨병성 궤양 발생은 혈당 조절이 악화된 상황에서 악화되고 가속화된다. Peled 등 (Association of Inpatient Glucose Measurements With Amputations in Patients Hospitalized With Acute Diabetic Foot,　The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, Volume 104, Issue 11, November 2019, Pages 5445-5452)은, 임의의 고혈당증 및 임의의 또는 중증 저혈당증을 겪고 있는 환자는 입원 중에 임의의 또는 중대한 절단을 시술받을 가능성이 더 높다는 것을 발견하였다. 높은 혈당 변동성은 중대한 절단과 관련성이 존재하였다. 말초 혈관 질환 (PVD), 높은 바그너 점수 및 저혈당증은 독립적인 예측 인자였다. 노령, 말초 혈관 질환 (PVD), 이전 절단, 백혈구 수치 상승, 높은 바그너 점수 및 저혈당증은 중대한 절단의 독립적인 예측 인자였다. 60건의 관찰 실험에 대한 체계적인 검토를 통해 이중 47건이 메타-분석에 포함되었으며 (Lane et al., Glycemic control and diabetic foot ulcer outcomes: A systematic review and meta-analysis of observational studies. J Diabetes Complications. 2020 Oct;34(10):107638), 고혈당증 (더 높은 A1C 및 더 높은 공복 글루코스)은 당뇨병성 족부 궤양을 가진 개체들에서 하지 절단 가능성 증가와 연관성이 있었다. Lane 등의 발견 결과는, A1C 수치 8% 이상 및 공복 글루코스 수치 126 mg/dl 이상이 기존에 당뇨병성 족부 궤양을 가진 환자들에서 하지 절단 가능성 증가와 연관성이 있음을 시사하였다.

당뇨병성 궤양은 그 자체로도 환자를 쇠약하게 만들뿐 아니라, 치료하기 어려운 족부 궤양으로 인한 비-외상성 하지 절단 위험이 비-당뇨병과 비교해 당뇨병성 환자들에서 15배 더 높다. 당뇨병 환자는 하지 절단의 위험성이 높고, 건강 관리 비용도 더 높으며, 삶의 질은 더 낮다 (Song K, Chambers AR. Diabetic Foot Care. [Updated 2021 Jul 31]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021 Jan-.　Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK553110/). 진성 당뇨병 및 말초 혈관 질환을 가진 환자의 비-외상성 절단에 대한 체계적인 연구에서 (Thorud et al., Mortality After Nontraumatic Major Amputation Among Patients With　Diabetes and Peripheral Vascular Disease: A Systematic Review.　J Foot Ankle Surg.　2016 May-Jun;55(3):591-9), 무릎 이하 절단 후 환자의 5년 사망율은 40-82%이고, 무릎 위 절단 후 사망율은 40-90%였다. 이러한 합병증 다수는 환자에 의한 정기적인 발 관리와 매년 철저한 발 검사를 통해 예방할 수 있다. 올바른 발 관리 실무에 대한 환자 교육이 현재 당뇨병성 발 질환을 예방하는 초석이다. 족부 궤양은 일반적인 당뇨병 환자의 입원 사유이다. 족부 궤양의 경우 치유하는데 수주 또는 심지어 수개월 걸릴 수 있다. 당뇨병성 궤양은 흔히 (발의 감각 감소로 인해) 무통증이다. 당뇨병성 족부 궤양에 대한 치료는 복잡한 문제이다 (Lepantalo et al., Chapter V: Diabetic foot. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2011 Dec;42 Suppl 2:S60-74). 허혈증, 신경병증 및 감염은 당뇨병성 족부 합병증을 유발하는 병리학적 요소 3종이고, 이들은 병인학적 3요소로서 함께 발생하는 경우가 많다. 신경병증과 허혈증이 개시 인자이고, 대부분 신경허혈증으로서 함께 발생하고, 감염은 대부분 결과이다. 아울러, 궤양 치유는 미세혈관 기능부전에 의해 방해를 받는다. 가이드라인은 당뇨병성 족부 궤양과 관련한 이러한 특별한 필요성을 대부분 무시한다. 임의의 당뇨병성 족부 궤양은 달리 입증되지 않은 한 혈관 손상이 있는 것으로 간주하여야 한다. 당뇨병성 족부 궤양을 개선하고 절단을 예방하기 위해서는 초기 진료 의뢰, 혈관 검사, 영상 촬영 및 개입이 중요하다. 궤양을 치유해 발을 구할 기회를 놓치기 쉽기 때문에 타이밍이 중요하다. 그러나, 이러한 당뇨병성 환자를 진단 및 치료하는 최선의 방법에 대한 데이터가 부족하다. 당뇨병성 발을 다룬 실험들 대부분이 환자 집단, 개입 또는 성과 측면에서 비교 가능하지 않다.

진성 당뇨병은 상처 회복을 방해하여 혈관신생 손상으로 인한 만성 상처를 발생시킬 가능성이 높다. 자율 신경병증은 15년 이상 된 진성 당뇨병 환자의 약 40%에서 발생한다. 이는 체온 조절의 결함, 발기부전 및 방광 기능장애를 통해, 그리고 다음으로 심혈관 반사 이상으로 인해 발생할 수도 있다. 후기 증상으로는 전신 발한 장애, 체위성 저혈압, 위장 문제 및 혈당 조절 저하를 포함할 수 있다. 후자 증상은 상처 치유 불량, 만성 궤양 및 그로 인한 사지 절단의 심각한 합병증을 비롯한 무수한 동반질환을 수반하는 심각한 임상적인 의미를 가진다. 명확하고 정연한 단계들로 구비된 피부 상처 치유에서, 당뇨병은 모든 단계들에서 부적절한 작용을 유발한다. 만성적인 비-치유성 당뇨병성 상처의 병인은 다면적이지만, 비-치유성 표현형으로의 진행은 혈관형성/혈관신생 불량을 의미하는 혈관 망 불량과 밀접하게 연관되어 있다. 이들 용어는 종종 (본원에서 물론 혈관 형성 및 회복의 다양한 측면을 지칭하기 위해) 상호 호환적으로 사용되지만, 엄밀히 말해 혈관형성은 원시 혈관 망으로 합쳐지는 전구 세포로부터 신생 혈관의 형성으로서 정의되고, 혈관신생은 확립된 혈관 구조로부터 새로운 모세관이 생성되는 것이다. 이러한 구별은 혈관이 2개의 후속 과정, 즉 혈관형성 및 혈관신생을 통해 발생한다는 사실을 나타내며, 이 둘다 혈관 유지 및 회복에 매우 중요하다. 이러한 과정은 또한 태아 및 태반 혈관구조의 발생에도 참여한다. 혈관 발생 (신혈관 형성, Rafii S, Lyden D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nat Med. 2003 Jun;9(6):702-12; Masuda, H and Asahara, T. Post-natal endothelial progenitor cells for neovascularization in tissue regeneration,　Cardiovascular Research, Volume 58, Issue 2, May 2003, Pages 390-398)은 인접한 기존 혈관으로부터 기존 내피 세포의 인 시추 증식 또는 이동에 의해 (혈관신생) 또는 중배엽성 전구체로부터 내피 선구 세포 (EPC)의 분화 (혈관형성) 후 조작되는, 내피 세포 (EC)의 증식, 이동 및 리모델링을 수반하는 제어된 과정이다. 혈관형성 및 혈관신생은 세포와 성장인자 간의 광범위한 상호작용을 수반하는 중대하고 복잡한 과정이다. 혈관형성 중에, 최초기 모세관의 형성은 만능성 간엽 세포로부터 유래한 혈관신생 줄기 세포의 인 시추 분화에 의해 달성된다. 후속 과정, 즉 혈관신생은 이미 존재하는 혈관 및 혈관 세포로부터 기인한 세포의 증식과 더불어 혈관신생 활성을 통한 새로운 혈관의 발달을 특징으로 하며, 이는 다양한 성장인자의 자극에 의해 개시되는 잘-조화된 과정이다. 전형적으로, 조직 재생 및 상처 회복 (즉, 출생 후)에서 신혈관형성은 주로 혈관신생 활성을 수반한다. 혈관형성 활성은 전형적으로 콜로니 분석 (클론형성 분석 또는 콜로니 형성 분석), 즉 단일 세포가 콜로니로 자라는 능력에 기반한 시험관내 세포 생분 분석에서 시험관내에서 조사한다. 혈관신생 활성은 전형적으로 발아 (sprouting) 분석 (관 형성 분석 또는 혈관신생 분석), 즉 혈관신생을 요약하는 검사 세포가 시험관내에서 모세관 유사 구조를 형성하는 능력을 기반으로 한 시험관내 세포 생존 분석)으로 시험관내에서 조사한다. 우리 신체에서 내피 세포는 얇고 고도로 전문화된 세포외 매트릭스 (ECM)인 기저 막으로 둘러싸여 있다. 인간 제대 정맥 세포 (HUVEC)와 같은 내피 세포를 기저 막-유사 표면 (예를 들어, Matrigel^®)에 접종하면, 모세혈관과 비슷한 분지 관 또는 싹 (spout)이 생성된다.

과거 10년간, 수많은 인간 및 동물 실험들에서, C-펩타이드가 혈당 조절에 영향을 미치는 것은 아니지만 1형 당뇨병의 만성 합병증 일부를 예방하고, 잠재적으로 회복에 역할을 할 수 있는 것으로 입증되었다. Lim 등 (Proinsulin C-peptide prevents impaired wound healing by activating angiogenesis in diabetes. J Invest Dermatol. 2015 Jan;135(1):269-278)은 인간 C-펩타이드가 당뇨병에서 혈관병증을 방지할 수 있음을 입증하였으며, 스트렙토조톡신-유발성 당뇨병 마우스 및 인간 제대 정맥 내피 세포를 이용한 혈관신생 유발에 의해 손상된 상처 치유를 방지하는데 C-펩타이드의 잠재적인 역할을 조사하였다. 당뇨병은 마우스 피부에서 상처 치유를 지연시켰으며, 삼투 펌프를 이용한 C-펩타이드 공급은 당뇨병성 마우스에서 피부 상처 봉합 속도를 현저하게 증가시켰다. 아울러, C-펩타이드는 용량-의존적인 방식으로 내피 세포 이동 및 관 형성을 유도하였으며, 0.5 nM에서 최대 효과를 거두었다. 생체내 C-펩타이드-강화된 혈관신생은 면역조직화학 및 마트리겔 플러그 분석에 의해 입증되었다. Lim 등의 발견 사실은 C-펩타이드의 혈관신생 역할과 이의 손상된 상처 치유를 방지하는 능력을 부각하였으며, 이는 당뇨병에서 회복 및 치료학적 혈관신생에 중대한 영향을 미칠 수 있으며, C-펩타이드 대체가 당뇨병에서 손상된 혈관신생 및 지연된 상처 치유에 대해 유망한 요법임을 제기하였다. 지속적인 C-펩타이드 부족은 외인성 C-펩타이드로 치료가능할 수 있는 미세혈관 병변을 야기할 수 있으며, 이는 C-펩타이드가 혈관 회복 과정에 양호하게 참여함을 의미한다. 베타-세포가 고갈되어 C-펩타이드가 거의 또는 전혀 배출되지 않을 경우, 이러한 미세혈관 합병증은 망막병증, 신장병증 및 신경병증을 야기할 수 있으며, 이러한 합병증은 C-펩타이드를 이용한 치료에 의해 잠재적으로는 치유 가능할 수 있다. C-펩타이드가 당뇨병성 마우스에서 손상된 상처 치유를 정상화할 수 있는 지를 조사하기 위해, 스트렙토조톡신-유발성 당뇨병 마우스에 피하 이식된 삼투 펌프를 이용해 C-펩타이드를 지속적으로 공급하였다. 정상, 당뇨병 및 C-펩타이드-공급되는 당뇨병 마우스의 뒷다리 등 표면에 직경 4 mm로 상처를 만들었다. 당뇨병 마우스는 정상 마우스와 비교해 현저하게 느린 치유율을 나타내었다. 그러나, C-펩타이드 공급은 당뇨병 마우스에서 상처 봉합을 가속화하였다. 이러한 효과는 상처 직경을 측정해 Lim 등 (ibid)에 의해 정량적으로 분석되었다. 이들 결과는, C-펩타이드가 당뇨병 마우스에서 상처 봉합 등의 손상된 상처 치유를 현저하게 방지함을, 보여주었다. 혈관신생이 상처 치유에 중요한 과정이므로, Lim 등 (ibid)은 C-펩타이드가 내피 세포 이동, 증식 및 관 형성을 활성화할 수 있는 지를 발아 분석으로 지칭되는 시험관내 분석으로 조사하였다. C-펩타이드는 혈관신생의 기본인 내피 세포 이동, 증식 및 관 형성을 활성화함으로써 발아를 유도하는 것으로 검증되었다. 그러나, 이러한 유망한 전-임상 실험들은 당뇨병 혈관병증을 조절하는데 어떠한 진전도 달성하지 못하였던 C-펩타이드를 이용한 인간 임상 실험과는 완전히 대조적이었다.

간략하게는, C-펩타이드 결핍 (전형적으로, 1형 및 말기 2형 당뇨병) 환자, 즉 궁극적으로 당뇨병성 궤양 관리에서 신장병증, 망막병증 및 신경병증과 같은 당뇨병성 혈관병증을 가진 환자에 대한 치료에 패러다임의 전환이 시급하게 요구되고 있으며; 즉 임상 실습 및 연구와 관련하여 혈관 장애가 있는 당뇨병 환자에 대한 새로운 접근법 및 분류가 요구되고 있다. 신장병증, 망막병증 및/또는 신경병증을 가진 환자와 같은 당뇨병성 혈관병증 환자에 대해, 궁극적으로는 혈관 손상된 궤양 환자들에 대해, 선택된 개입 기법과는 상관없이, 치유를 개선하고, 치유 속도를 높이고, 절단을 방지하기 위해, 새로운 전략을 개발 및 구현하여야 한다. 예측 검사의 가치, 새로운 치료 용법뿐 아니라 선택적이고 표적화된 전략에 대해 집중적인 연구들이 요구된다. 당뇨병성 족부 궤양에 대해 구체적인 데이터가 부족하므로, 권장 사항은 종종 낮은 등급에 대한 것이다. 간단히 말해, 기존의 잘 검사된 혈당 조절 전략을 넘어, 이러한 환자들 다수에서 혈관신생 조절의 일부 형태에 대해서도 추구하고자 한다.

영양분 감지는 정상적인 세포 생장과 증식을 유지하는데 중요하다. mTOR복합체 1 (mTORC1)은 영양분을 감지해 세포 생장, 자가포식 및 기타 mTORC1-매개 과정을 제어한다. 인슐린, IGF, PDGF 및 VEGF와 같은 성장인자, 아미노산, 에너지 상태 및 스트레스가 mTORC1을 조절한다. 아미노산이 mTORC1 활성화에 본질적이다. 성장인자는 단독으로는 아미노산 공급 없이 mTORC1 최대 활성을 달성하지 못한다 (Sancak et al., The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 2008 Jun 13;320(5882):1496-501). 세포내 아미노산 농도 증가는 mTORC1 리소좀 국지화 및 후속적인 활성화를 촉진한다.

한편, 본 발명은 뚜렷이 구별되는 신생 약물 유형: 달리 적절한 혈당 조절 하에 있는 환자에서도 심지어 발생하는, 혈관병증을 퇴치하기 위해 혈관신생 조절을 확립하는데 필요한 혈관신생 활성을 유발하는데 이용하기 위한 자가포식 저해 화합물로서 작용하는 mTOR의 펩타이드 모듈레이터의 용도를 제공한다. 본 발명은 개체의 혈관병증의 예방 또는 치료에서 혈관신생 활성을 유발하는데 이용하기 위한 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 개체의 혈관병증의 예방 또는 치료에서 혈관신생 활성을 유발하는데 이용하기 위한 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 개체의 혈관병증의 예방 또는 치료에서 혈관신생 활성을 유발하는데 이용하기 위한 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 개체의 혈관병증의 예방 또는 치료에서 혈관신생 활성을 유발하는데 이용하기 위한 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 개체의 혈관병증의 예방 또는 치료에서 혈관신생 활성을 유발하는데 이용하기 위한 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 개체의 혈관병증의 예방 또는 치료에서 혈관신생 활성을 유발하는데 이용하기 위한 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 개체의 혈관병증의 예방 또는 치료에서 혈관신생 활성을 유발하는데 이용하기 위한 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 신장병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한, 특히 말기 신장 질환의 예방에 이용하기 위한 본 발명에 따른 모듈레이터를 제공한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 망막병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한, 특히 부분 실명 (partial blindness) 또는 실명의 예방에 이용하기 위한 본 발명에 따른 모듈레이터를 제공한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 신경병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한, 더 바람직하게는 말초 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한, 더 바람직하게는 당뇨병성 궤양의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 본 발명에 따른 모듈레이터를 제공한다. 특히 바람직하게는, 이러한 본 발명에 따른 mTOR의 자가포식-저해성 펩타이드 모듈레이터는 개체를 치료해 혈당 조절을 달성 또는 유지하는 경우에, 특히 개체를 인슐린으로 치료해 혈당 조절을 달성 또는 유지하는 경우에, 사용된다. 본 발명은, 세포에 L-단백질생성 아미노산 (L-proteinogenic amino acid)을 포함하는 펩타이드를 제공하는 단계 및 발아 분석에서 혈관신생 활성을 결정하는 단계를 포함하는, 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 식별하는 방법을 제공하며, 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 혈관신생 활성은 본원에 제공된 바와 같이 모세관 형성 평가에 의해서뿐 아니라 모세관 분지 형성 평가에 의해 결정할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 루신 (단문자 코드: L), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명은 세포에 공급원, 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원을 제공하는 단계를 포함하는 혈관신생 활성을 유도하는 방법을 제공하고, 아미노산은 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 루신 (단문자 코드: L), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명은 세포에 공급원, 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원을 제공하는 단계를 포함하는 혈관신생 활성을 유도하는 방법을 제공하며, 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 루신 (단문자 코드: L), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명은 세포에 공급원, 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원을 제공하는 단계를 포함하는 혈관신생 활성을 유도하는 방법을 제공하며, 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 루신 (단문자 코드: L), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명은 세포에 공급원, 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원을 제공하는 단계를 포함하는 혈관신생 활성을 유도하는 방법을 제공하며, 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명은 세포에 펩타이드를 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원으로서 제공하는 단계를 포함하는 혈관신생 활성을 유도하는 방법을 제공하며, 펩타이드는 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 구성된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 루신 (단문자 코드: L), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명은 세포에 공급원, 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원을 제공하는 단계를 포함하는 혈관신생 활성을 유도하는 방법을 제공하며, 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직하게는, 아미노산은 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 루신 (단문자 코드: L), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아울러, 바람직하게는, 아미노산은 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명은 세포에 공급원, 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원을 제공하는 단계를 포함하는 혈관신생 활성을 유도하는 방법을 제공하며, 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 본 발명은, 공급원, 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드가 본원에 제공된 방법으로 식별가능한, 본 발명에 따른 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 특히 공급원 또는 펩타이드가 혈관신생 활성을 나타내는 또는 가진 것으로 추정되는 펩타이드 또는 단백질로부터 유래한 아미노산 서열을 가진, 본 발명에 따른 치료 방법을 제공한다. 흔히, 유기체의 프로테옴에서, 단백질 내 이러한 혈관신생 서열은 N-말단 및 C-말단에 위치한 아르기닌 (R) 또는 라이신 (K)에 가까이 또는 N-말단에 위치한 아르기닌 (R) 또는 라이신 (K)과 C-말단에 위치한 아르기닌 (R) 또는 라이신 (K) 사이에 위치하고, 전환효소 (convertase)와 같은 효소에 의해 혈관신생 아미노산 서열이 절단될 수 있어, mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드 모듈레이터로서 이용될 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드의 이용은 이를 이용하는 세포의 종과 상호 관련되어 있다. 예를 들어, 바람직하게는, 만일 펩타이드가 인간 세포에서 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드 모듈레이터로서 이용된다면, 이러한 펩타이드는 인간 프로테옴으로부터 유래한다. 마찬가지로, 종 X와 같이 다른 종의 세포에서는, 종 X 프로테옴으로부터 유래한 펩타이드를 이용하는 것이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 임신 중에 혈관신생 활성에 참여하는 단백질인 융모성 고나도트로핀 (CG)으로부터 유래한 아미노산 서열을 가진 자가포식-저해성 펩타이드를 제공하며, 바람직하게는, 이러한 펩타이드는 CG의 베타-쇄로부터 유래하고, 바람직하게는 베타-쇄의 루프 2로부터 유래한다. 인간 CG (hCG)는 혈관신생성 아미노산 서열 MTRVLQGVLPALPQVVCNYR을 가지며, 여기서 코어 혈관신생성 서열은 N-말단에 위치한 아르기닌 (R) 잔기와 C-말단에 위치한 아르기닌 (R) 잔기 사이에 위치한다. 아울러, 이러한 혈관신생성 코어는 ERC-결합 모티프 xGxxPx를 포함한다. 이 모티프의 분할 (splitting up)은, 특히 혈당뿐 아니라 혈관신생 조절을 발휘하기 위해, 즉효성 및 속효성 인슐린 제제와 조합하여, 자가포식 저해성 펩타이드 모듈레이터로서 hCG 유도체 LQGV, VLPALP AQGV, LAGV, LQAV, LQGA, ALPALP, VAPALP, VLAALP, VLPAAP 및 VLPALA의 이용을 용이하게 한다. 펩타이드 VLQGVLPALPQVV는 예를 들어 인슐린의 방출 속도에 맞춰 더 느리게 방출되는, 중기-작용성 및 장기-작용성 인슐린 제제와 조합하여 사용하는 것이 더 유익하다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 펩타이드가 C-펩타이드로부터 유래한 혈관신생성 아미노산 서열을 가진, 자가포식-저해성 펩타이드를 제공한다. 프리-프로인슐린 분자에서, 인간 C-펩타이드는 서열 RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR을 가지며, 실제 혈관신생성 코어 서열은 측면에 아르기닌 (R) 또는 라이신 (K) 잔기가 위치한다. 아울러, 이러한 혈관신생성 코어는 ERC-결합 모티프 xGxxPG를 포함한다. ERC-결합 모티프는 이러한 서열을 가진 펩타이드의 올리고머화를 통해 코아세르베이션 (coacervation)에 참여하므로, 이러한 ERG-결합 모티프를 가진 자가포식 저해성 펩타이드는 전형적으로 주사시 더 느린 방출 속도를 가지며, 전형적으로는 중기-작용성 인슐린과의 조합 제형 또는 더 바람직하게는 장기-작용성 인슐린과의 조합 제형에서와 같이, 이러한 느린-방출이 요망되는 상황에 더 유용하고 바람직하다. 코아세르베이션은 전형적으로 펩타이드의 콜로이드 액적들이 정전기적 인력에 의해 응집되는 것을 수반하며, 이는 적어도, 전형적으로 더 빠른 방출 속도를 가진 ERC-모티프가 없으며 코아세르베이션을 나타내지 않는 펩타이드와 비교해, 주사시 이러한 ERC-모티프를 포함하는 펩타이드의 느린-방출 특성을 설명해준다. 혈관신생 장애를, 특히 C-펩타이드 결핍된 상황에서 치료하는데 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드 모듈레이터로서 이용하기 바람직한 C-펩타이드 단편 펩타이드는, 바람직하게는 단리 및/또는 합성, 바람직하게는 비-페길화되고,　C-펩타이드　단편 EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPL, DLQVGQVELGGGPGAGSLQP, LVGQVELGGGPGAGSLQPL, QVGQVELGGGPGAGSLQPL, ELGGGPGAGSLQPL, DLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ, GQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ, 및 LGGGPGAGSLQPLALEGSLQ, LVGQVELGGGPGAGSLQPL, LGGGPGAGSLQPL, 및 LQVGQVELGGGPG, 및 xGxxPG 모티프를 모두 포함하는 기능성 균등물이 따라서 중기-작용성 인슐린 또는 장기-작용성 인슐린에 포함시키기에 또는 이와 조합하는데 가장 적합하고 바람직하다. LQVGQVELGG 및/또는 GGPGAGSLQPL 및 xGxxPG 모티프를 포함하지 않는 기능성 균등물은 따라서 즉효성 또는 속효성 인슐린에 포함시키기에 또는 이와 조합하는데 가장 적합하고, 바람직하다.

다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 갈렉틴-3 (galectin-3)으로부터 유래한 혈관신생성 아미노산 서열을 가진 자가포식-저해성 펩타이드를 제공한다. 인간 갈렉틴-3의 성숙한 N-말단 단편 PQGWPGAWGNQPAGAGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYPGAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYPATGPYGAPAGPLIVPYNLPLPGGVVPRM은 전형적으로 ERC-결합 모티프 xGxxPG가 수개인 것을 특징으로 하며, 혈관신생성 코어 서열은 또한 가수분해에 의해 해리된다. 전형적으로, (Pineda et al.,Trypanosoma cruzi cleaves galectin-3 N-terminal domain to suppress its innate microbicidal activity. Clin Exp Immunol. 2020 Feb;199(2):216-229), 인간 병원체 트리파노소마 크루지 (T. cruzi)는 인간 N-말단 갈렉틴-3에 결합할뿐 아니라 이를 가수분해한다. 특히, 이러한 기전은 갈렉틴-3-매개 기생충 사멸을 방지하는데, 이는 트리파노소마 크루지 (T. cruzi)가 포유류 숙주에서 성공적으로 감염, 생존 및 번성하도록 갈렉틴-3 기능을 조절하는 복잡한 전략을 발굴하였을 수 있다. 실제, 비-병원성 트리파노소마 란겔 (T. rangeli)은 갈렉틴-3에 결합하지만 단백질 구조를 변형하진 않는다. 따라서, 트리파노소마 크루지는 N-말단 콜라겐-유사 도메인을 절단해, C-말단 갈렉틴-3가 코아세르베이션을 통해 올리고머화 할 수 없게 만들고, 모티프 xGxxPG를 가진 N-말단 단편이 ERC와 상호작용하고 mTOR을 기생충에 유익하게 조절하게 허용한다. 특별히, 기생충 가수분해를 통해 수득되는 단편 3개의 N-말단 서열은 밴드 1: AGGYPGASYPG, 밴드 2: GAPGAYPGAP 및 밴드 3: GAPAGPLIVP이며, 사람에서 AGGYPGASYPGAYPGQAPPGAYPGQAPPGAYP, GAPGAYPGAPAPGVYPGPPSGPGAYPSSGQPSATGAYPATGPY 및 GAPAGPLIVPYNLPLPGGVVP로부터 유래한 갈렉틴-3 N-말단 펩타이드 단편의 mTOR 조절 특징들을 나타낸다. 예를 들어, 단편 GAYPGAPGAYPGAPAPGV 및 PGAYPG는 본원에 입증된 바와 같이 혈관신생 코어 활성을 가지고 있어, PGAYPGQAPPGAYPG, PGAYPGQA 및 GQAPPGAYPG를 사람에 이용하기에, 특히 중기-작용성 또는 장기-작용성 인슐린에 함유시키거나 또는 이와 함께 사용할 경우에, 유용한 자가포식 저해성 펩타이드가 된다. 또한, 본 발명은, 펩타이드가 여성에서 혈관신생 활성에 매달 참여하는 단백질인 루트로핀 (LH)로부터 유래한 아미노산 서열을 가지는, 바람직하게는 펩타이드가 LH의 베타-쇄로부터 유래한, 바람직하게는 베타-쇄의 루프 2로부터 유래한, 본 발명에 따른 치료 방법 및 이에서의 용도를 제공한다. 인간 LH (hLH)의 베타-2-루프는 혈관신생성 아미노산 서열 MMRVLQAVLPPLPQVVCTYR을 가지며, 여기서 코어 혈관신생성 서열은 N-말단에 위치한 아르기닌 (R) 잔기와 C-말단에 위치한 아르기닌 (R) 사이에 위치한다. 아울러, 이러한 혈관신생성 코어는 ERC-결합 모티프 xGxxPx를 포함하지 않으므로, VLQAVLPPLPQVV, VLQAVLP, VLQA, LQAVLP, LQAV, PLPQVV 및 PPLQV, 및 추가적인 유도체와 같은 LH-유래 서열을 즉효성 및 속효성 인슐린 제형에서의 mTOR 모듈레이터로서의 이용을 용이하게 한다. 또한, 본 발명은, 펩타이드가 세포외 매트릭스 단백질 (ECM)로부터 유래한 아미노산 서열을 가진, 본 발명에 따른 치료 방법 및 이러한 용도를 제공한다. ECM 단백질은 자가포식 저해성 아미노산의 풍부한 공급원을 포함하며, 자가포식-저해성 펩타이드를 설계하기 위한 주형으로서 유용하다. 기질로서 프롤린은 세포외 매트릭스, 결합 조직 및 뼈에 엘라스틴 및 콜라겐으로서 저장되며, 매트릭스 메탈로프로테나제, 펩티다제, 엘라스타제 및 프롤리다제의 연속적인 작용에 의해 저장소로부터 신속하게 방출된다. 유일한 단백질생성 2차 아미노산으로서 프롤린은 특별한 생물학적 효과를 가지며, 모든 단백질-단백질 상호작용 및 대사 스트레스 반응의 조절자로서 역할을 하고, 자가포식 등의 다양한 하류 대사 활성을 개시한다 (Kadowaki et al. Nutrient control of macroautophagy in mammalian cells. Mol Aspects Med. 2006 Oct-Dec;27(5-6):426-43). 또한, 본 발명은, 세포외 매트릭스 단백질이 엘라스틴인, 본 발명에 따른 치료 방법 및 여기에서의 용도를 제공한다. 전형적인 코어-혈관신생 활성은 인간 엘라스틴의 엑손 24 영역으로부터 둘다 유래한 본원에서 펩타이드 VGVAPG 및 VGVAPGVGVAPGVGVAPG를 이용하여 입증되었다. 또한, 본 발명은, 세포외 매트릭스 단백질이 콜라겐이고, 콜라겐에 유용할 수 있는 PGP 서열이 풍부한, 본 발명에 따른 치료 방법 및 이러한 용도를 제공한다. 전형적으로 일부 콜라겐 (본원에 인간 COL6A5의 예가 표시됨)은 코어 혈관신생 서열 AQGVPQIAVLV를 식별하는, RRAQGVPQIAVLVTHR과 같이 R 또는 K가 측면에 위치한 혈관신생 코어, 및 AQGVPQ, AQGVPQI, AQGVPQIA, GVPQIAVLV, PQIAVLV, IAVLV 등과 같은 유도체를 포함한다. 이러한 더 많은 서열들이 (인간 COL6A5) RGAPGQYGEKGFPGDPGNPGQNNNIKGQKGSKGEQGRQGRSGQKGVQGSPSSRGSRGREGQRGLRGVSGEPGNPGPTGTLGAEGLQGPQGSQGNPGRKGEKGSQGQKGPQGSPGLMGAKGSTGRPGLLGKKGEPGLPGDLGPVGQTGQRGRQGDSGIPGYGQMGRKGVKGPRGFPGDAGQK와 같은 콜라겐 가닥에서 발견될 수 있는데, 서열은 R 또는 K가 측면에 위치한 혈관신생 코어 펩타이드 서열이 반복 존재한 것으로 입증하고, 이로부터 요망하는 mTOR의 펩타이드 모듈레이터가 선택될 수 있다. 펩타이드가 본원에 제시된 다른 혈관신생성 단백질은 항원성 코어 QAQGVALQ를 함유한 서열 KDLCQAQGVALQTMK를 가진 펩타이드가 관찰된 인간 α-페토프로테인이고, 유도체 AQGV, AQGVA, AQGVAL, QGVALQ 및 GVALQ도 발견되며, 이들 모두 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드 모듈레이터로서, 바람직하게는 즉효성 또는 속효성 인슐린과 조합하여, 이용가능하다. 전형적으로, mTOR AQ의 다이펩타이드 모듈레이터에 의한 자가포식-저해는 최근 새끼 돼지에서 입증되었으며, 아미노산 A + Q에 비해 개선된 조절 특징을 가진다 (Zhang et al., Alanyl-glutamine supplementation regulates mTOR and ubiquitin proteasome proteolysis signaling pathways in piglets. Nutrition. 2016 Oct;32(10):1123-31).

본 발명에 따른 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드 모듈레이터는 특히 혈관병증이 당뇨병성 혈관병증을 포함하는 경우에, 특히 개체가 C-펩타이드 결핍된 상태이거나 또는 그런 것으로 의심되는 경우에 혈관신생 조절에 이용하기 위해 제공된다. 흔히, 이러한 환자들은 당뇨병성 혈관병증과 관련 있으며 이로 인해 발생하는 것으로 보이는 실명, 말기 심부전 또는 하지-절단에 대해 대처하기 위해, 인슐린으로 (즉효성 인슐린을 이용해 온-펌프로, 또는 즉효성, 속효성, 중기-작용성 또는 장기-작용성 인슐린을 피하로), IGF, PDGF 또는 VEGF와 같은 기타 성장 인자 또는 이와 관련한 성장 인자와 함께, 이미 치료받고 있을 수 있다. 이러한 mTOR의 모듈레이터는 C-펩타이드 결핍이 있는 환자에 특히 유익한 용도가 확인되며, 이러한 결핍은 예를 들어 환자가 바람직하게는 공복 C-펩타이드 수준이 적어도 1 nmol/L 미만, 바람직하게는 적어도 0.5 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.3 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.2 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.1 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.06 nmol/L 미만인 경우에 존재한다. 특히, 본 발명은 혈관병증, 바람직하게는 당뇨병성 혈관병증의 치료에서 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드-모듈레이터의 용도를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 신장병증, 바람직하게는 당뇨병성 신장병증의 치료에서 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드-모듈레이터의 용도를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 망막병증, 바람직하게는 당뇨병성 망막병증 치료에서 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드-모듈레이터의 용도를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 신경병증, 바람직하게는 당뇨병성 신경병증의 치료에서 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드-모듈레이터의 용도를 제공한다.

한편, 본 발명은, 본원에 제공된 바와 같이 혈관신생 조절 목적으로 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드-모듈레이터가 제공되어지는, 인슐린 제형, IGF 제형, PDGF 제형, VEGF 제형, 또는 혈관 질환의 치료에 유용한, 특히 혈당 조절에 유용한 다른 성장인자의 제형과 같은, 성장인자 제형 (본원에서 바람직하게는 약제학적 제형 또는 약학적 조성물을 포함하는 제형)을 제공한다. 성장인자 및 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터의 제형이 제공되며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 함유한 인슐린 제형을 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 함유한 인슐린 제형을 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 함유한 인슐린 제형을 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 함유한 인슐린 제형을 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 루신 (L)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 함유한 인슐린 제형을 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 함유한 인슐린 제형을 제공하며, 이러한 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고, 아미노산은 적어도 50%가, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%가 알라닌 (단문자 코드: A), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명에 따른 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 (함께) 포함하는 인슐린의 제형은, 개체의 혈관병증의 예방 또는 치료에서 혈관신생 활성을 유도하는데 이용하기 바람직하고, 이러한 개체는 또한 혈당 조절을 달성하거나 유지하는 것이 필요한 개체이고, 구체적으로는, 신장병증의 예방 또는 치료에, 말기 신장 질환의 예방 또는 치료에, 망막병증의 예방 또는 치료에, 실명 또는 실질적인 (>30% - <90%) 시력 상실의 예방 또는 치료에, 신경병증의 예방 또는 치료에, 말초 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료에, 당뇨병성 궤양의 예방 또는 치료에, 특히 본원에 정의된 바와 같이, 개체가 C-펩타이드 결핍된 상태이거나 또는 결핍된 것으로 의심되는 경우에, 이용하기 특히 바람직하고, 구체적으로, 상기한 혈관병증은 당뇨병성 혈관병증을 포함한다. 본원에 제공된 바와 같이, 이러한 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드-모듈레이터 및 성장인자 제형에서의 이의 이용은, 전형적으로, 라파마이신의 기계적 표적, mTOR의 영양분, 특히 아미노산 감지 시스템을 표적으로 하고; 자가 포식을 저해하고; 이와 함께 필요한 환자에서 혈관신생 활성을 유도하는, 펩타이드 및/또는 아미노산의 공급원을 포함한다. 전형적으로, 인슐린 제형의 이용에 의한 혈당 조절의 경우, 인슐린 요구량 (unit/kg/day)은 환자의 나이, 체중 및 잔류 췌장 인슐린 활성에 따라 결정된다. 환자는 전형적으로 0.4 - 1.0 units/kg/day의 인슐린 일일 총 용량을 필요로 할 것이며, 대사적으로 안정적인 환자의 경우 전형적인 개시 용량은 0.5 unit/kg/day이다. 그러나, 전술한 바와 같이, 인슐린을 사용하더라도 혈당 조절이 C-펩타이드 결핍에 대한 대체인 것은 아니다. 본원에서, 특히 C-펩타이드 결핍을 겪고 있는 환자에서 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드-모듈레이터를 또한 포함하는 인슐린 제형을 이용하는 것이 본원에서 제공되며, 이러한 결핍은 예를 들어, 환자가 바람직하게는 재발성, 공복 C-펩타이드 수준이 적어도 1 nmol/L 미만, 바람직하게는 적어도 0.5 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.3 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.2 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.1 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.06 nmol/L 미만일 경우에 존재한다.

본 발명은 신장병증 (말기 신장 질환의 소인), 망막병증 (실명 소인) 및/또는 신경병증, 특히 말초 당뇨병성 신경병증을 가진 환자의 치료와 같이, 환자에서 당뇨병성 혈관변증의 발생을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 제형, 방법 및 수단을 제공하며, 궁극적으로 혈관 손상, 당뇨병성 궤양, 특히 인간에서 하지 절단 소인을 가진 궤양성 환자의 치료를 제공한다. 전형적으로, 본원에서 펩타이드는 본원의 목적으로 아미노산을 50개 이하로 가진 것으로 정의되고, 단백질은 아미노산이 50개 초과인 것으로 정의된다. 본원에서 mTOR의 자가포식 저해성 펩타이드-모듈레이터는, 자가포식 저해성 아미노산 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 프롤린 (P), 이소루신 (I), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 가진 펩타이드 서열을 포함하는, 아미노산 50개 이하의 선형, 분지형 또는 고리형 스트링 (string)으로서 정의된다. 이러한 군의 펩타이드의 분자 작용 방식 (MoA)은 이의 실제 서열에 의존하지 않는다. 대신, 이를 구성하는 아미노산은 mTOR의 영양분-감지 시스템에 자가포식 저해 신호를 제공하여; 자가포식 저해를 유발하고, 단백질 생성을 유발해 질환을 해결한다.

Sciarretta 등 (New Insights Into the Role of mTOR Signaling in the Cardiovascular System. Circ Res. 2018 Feb 2;122(3):489-505)에서 논의된 바와 같이, 라파마이신의 기계적 (이전에 포유류로 지칭됨) 표적 (mTOR)은 포스포이노시티드 키나제-관련 키나제 (PIKK) 패밀리에 속하는 비정형의 세린/트레오닌 키나제이다. 이것은 세포성 생리학, 대사 및 스트레스 반응을 조절하는데 중추적인 역할을 담당하는 진화적으로 보존된 단백질이다. 일부에서는 이를 세포성 마스터 스위치라 한다. mTOR은 특이적인 어댑터 단백질과 상호작용하고, 2개의 구분되는 거대분자 복합체, 즉 mTOR 복합체 1 (mTORC1)과 mTOR 복합체 2 (mTORC2)를 형성한다. mTOR 생물학에서의 이전 패러다임은 단백질 합성, 세포 생장 및 리보솜 생물발생의 조절과, 성장인자, 영양분, 아미노산, 고갈 및 저산소증과 같은 여러가지 상류 인풋을 감지 및 통합하는데 mTOR의 관여를 포함시켰다. 그러나, mTOR 경로는 세포 생존, 미토콘드리아 생물발생과 기능, 지질 합성 및 자가포식 등의 다른 중대한 세포성 과정에 기여하는 것으로 현재 알려져 있다. mTORC2의 신호전달 네트워크는 mTORC1에 비해 특정이 덜 규명되어 있다. 일부 연구들에서는, mTORC1 및 mTORC2의 활성이 강력하게 상호 연결되어 있고, mTORC2가 mTORC1보다 급성 라파마이신 처리에 덜 민감한 것으로 시사되었다. 이전 연구는 또한 mTORC2가 세포 생존, 생장 및 증식의 조절에 참여하고 세포 아키텍처 및 극성을 제어함을 보여주었다. 전형적으로, 아미노산은 단백질의 빌딩 블록일뿐만 아니라 신호전달 분자 및 유전자 발현, 대사 과정 및 신체의 발달 변화의 조절자이며, 아미노산 및 이의 대사산물이 건강 및 질환에서 중요한 역할을 담당한다. 실질적인 증거는, 아미노산이 혈관계에서 근본적인 역할을 담당함을 보여준다. 아미노산은 단백질 합성의 기본적인 빌딩 블록으로 작용하고 중대한 에너지원을 구성하지만, 선택 군은 혈관 질환 맥락에서 광의적으로 연구되었다. mTOR, 특히 mTORC1은 아미노산 및 글루코스와 같은 영양분을 감지함으로써 세포 생장과 증식을 조절하는 중요한 키나제이다. 알라닌과 글루타민은 혈중에 순환하는 가장 풍부한 아미노산이다. 아미노산은 중간 대사에 참여할 뿐 아니라 주요 대사 경로들을 제어하는 인슐린-라파마이신의 기계적 표적 (MTOR)-매개 신호 전달을 자극한다. 그 중에는 수명이 긴 단백질의 분해 및 손상된 또는 기능적으로 중복된 세포소관의 소거를 담당하는 자가포식 경로가 있다. 이러한 과정의 적절한 기능이 세포 생존에 필수적이다. 자가포식의 조절 장애는 몇가지 병태의 병인과 연루되어 있다. 명백하게는, 특정 아미노산만 자가포식을 조절할 수 있으며, 이들의 기능은 고도로 세포-특이적이다. 그러나, 특정 아미노산과 세포 대산 간의 관계에 대한 상세 사항은 불명확하다 (추가로 도 5 참조).

추가적인 구현예들

1. 세포에 L-단백질생성 아미노산을 포함하는 펩타이드를 제공하는 단계 및 발아 분석에서 혈관신생 활성을 결정하는 단계를 포함하는, 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 식별하는 방법으로서, 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

2. 세포에 공급원, 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원을 제공하는 단계를 포함하는 혈관신생 활성을 유도하는 방법으로서, 상기 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

3. 세포에 펩타이드를 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원으로서 제공하는 단계를 포함하는 혈관신생 활성을 유도하는 방법으로서, 상기 펩타이드는 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 구성되는, 방법.

4. 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드가 추가적인 구현예 1에 따른 방법으로 식별가능한, 추가적인 구현예 2 또는 3에 따른 방법.

5. 상기 아미노산이 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 추가적인 구현예 1-4 중 어느 하나에 따른 방법.

6. 상기 공급원 또는 펩타이드가 혈관신생 활성을 가진 것으로 입증되거나 또는 의심되는 펩타이드 또는 단백질로부터 유래한 아미노산 서열을 가진, 추가적인 구현예 2-5 중 어느 하나에 따른 방법.

7. 상기 펩타이드가 융모성 고나도트로핀으로부터 유래한 아미노산 서열을 가진, 추가적인 구현예 6에 따른 방법.

8. 상기 펩타이드가 C-펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열을 가진, 추가적인 구현예 6에 따른 방법.

9. 상기 펩타이드가 갈렉틴-3으로부터 유래한 아미노산 서열을 가진, 추가적인 구현예 6에 따른 방법.

10. 상기 펩타이드가 루테오트로핀으로부터 유래한 아미노산 서열을 가진, 추가적인 구현예 6에 따른 방법.

11. 상기 펩타이드가 세포외 매트릭스 -펩타이드로부터 유래한 아미노산 서열을 가진, 추가적인 구현예 6에 따른 방법.

12. 상기 세포외 매트릭스 단백질이 엘라스틴 또는 콜라겐인, 추가적인 구현예 12에 따른 방법.

13. 상기 펩타이드가 아미노산 31개 미만, 바람직하게는 아미노산 26개 미만, 더 바람직하게는 아미노산 21개 미만, 더 바람직하게는 아미노산 16개 미만, 더 바람직하게는 아미노산 13개 미만을 포함하는, 추가적인 구현예 1-12 중 어느 하나에 따른 방법.

14. 상기 펩타이드가 아미노산을 3개보다 많이, 바람직하게는 아미노산을 5개보다 많이, 바람직하게는 아미노산을 7개보다 많이, 더 바람직하게는 아미노산을 적어도 9개 포함하는, 추가적인 구현예 1-13 중 어느 하나에 따른 방법.

15. 상기 세포에 인슐린 또는 이의 유도체와 같이 혈당을 조절할 수 있는 화합물이 제공되는, 추가적인 구현예 1-14 중 어느 하나에 따른 방법.

16. 상기 인슐린이 즉효성 인슐린인, 추가적인 구현예 15에 따른 방법.

17. 상기 공급원이 아미노산을 3개보다 많이 13개 미만으로 포함하는 펩타이드를 포함하는, 추가적인 구현예 16에 따른 방법.

18. 상기 인슐린이 속효성 인슐린인, 추가적인 구현예 15에 따른 방법.

19. 상기 공급원이 아미노산을 4개 초과 및 21개 미만으로 포함하는 펩타이드를 포함하는, 추가적인 구현예 18에 따른 방법.

20. 상기 인슐린이 중기-작용성 인슐린인, 추가적인 구현예 15에 따른 방법.

21. 상기 공급원이 아미노산을 6개 초과 및 26개 미만으로 포함하는 펩타이드를 포함하는, 추가적인 구현예 20에 따른 방법.

22. 상기 인슐린이 장기-작용성 인슐린인, 추가적인 구현예 15에 따른 방법.

23. 상기 공급원이 아미노산을 7개 초과 및 31개 미만으로 포함하는 펩타이드를 포함하는, 추가적인 구현예 22에 따른 방법.

24. 상기 펩타이드가 유기 산의 염으로서 제공되고, 바람직하게는 상기 펩타이드가 말레산의 염, 더 바람직하게는 아세트산의 염, 더 바람직하게는 주석산의 염, 가장 바람직하게는 구연산의 염으로서 제공되는, 추가적인 구현예 1-23 중 어느 하나에 따른 방법.

25. 상기 세포가 인간 기원의 것인, 추가적인 구현예 1-24 중 어느 하나에 따른 방법.

26. 상기 펩타이드가 인간 기원의 것인, 추가적인 구현예 1-25 중 어느 하나에 따른 방법.

27. 혈관병증, 바람직하게는 당뇨병성 말초 신경병증이 있거나 또는 의심되는 개체를 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드의 용도로서, 상기 아미노산이 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.

28. 상기 개체가 당뇨병성 궤양, 바람직하게는 족부 궤양이 있거나 또는 발병 위험이 있는, 추가적인 구현예 26에 따른 용도.

29. 상기 개체가 C-펩타이드 결핍되었거나 또는 결핍된 것으로 의심되는, 추가적인 구현예 26 또는 27에 따른 용도.

30. 상기 개체는 공복 C-펩타이드 수준이 적어도 1 nmol/L 미만, 바람직하게는 적어도 0.5 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 0.3 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.2 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.1 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.06 nmol/L 미만인, 추가적인 구현예 26-28 중 어느 하나에 따른 용도.

31. 상기 펩타이드가 유기 산의 염으로서 제공되고, 바람직하게는 상기 펩타이드가 말레산의 염, 더 바람직하게는 아세트산의 염, 더 바람직하게는 주석산의 염, 가장 바람직하게는 구연산의 염으로서 제공되는, 추가적인 구현예 26-29 중 어느 하나에 따른 용도.

32. 상기 치료가 추가적인 구현예 2-25 중 어느 하나에 따른 혈관신생 활성의 유도 방법을 포함하는, 추가적인 구현예 26-30 중 어느 하나에 따른 용도.

33 혈관병증, 바람직하게는 당뇨병성 말초 신경병증이 있는 개체 또는 의심되는 개체의 치료에서의, 아미노산이 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 L-단백질생성 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드.

34. 상기 개체가 당뇨병성 궤양, 바람직하게는 족부 궤양을 앓고 있거나 발병 위험이 있는, 추가적인 구현예 30에 따른 공급원.

35. 상기 개체가 C-펩타이드 결핍이 있거나 또는 의심되는, 추가적인 구현예 30 또는 31에 따른 공급원.

36. 상기 개체가 공복 C-펩타이드 수준이 적어도 1 nmol/L 미만, 바람직하게는 적어도 0.5 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 0.3 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.2 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.1 nmol/L 미만, 더 바람직하게는 적어도 0.06 nmol/L 미만인, 추가적인 구현예 32-34 중 어느 하나에 따른 공급원.

37. 상기 펩타이드가 유기 산의 염으로서 제공되고, 바람직하게는 상기 펩타이드가 말레산의 염, 더 바람직하게는 아세트산의 염, 더 바람직하게는 주석산의 염, 가장 바람직하게는 구연산의 염으로서 제공되는, 추가적인 구현예 32-35 중 어느 하나에 따른 공급원.

38. 상기 치료가 추가적인 구현예 2-24 중 어느 하나에 따른 혈관신생 활성의 유도 방법을 포함하는, 추가적인 구현예 30-33 중 어느 하나에 따른 공급원.

39. 개체에 추가적인 구현예 30-34 중 어느 하나에 따른 아미노산 공급원을 제공하는 것을 포함하는, 혈관병증, 바람직하게는 당뇨병성 말초 신경병증이 있거나 또는 의심되는 개체의 더 바람직하게는 당뇨병성 궤양, 바람직하게는 족부 궤양이 있거나 또는 발병 위험이 있는 개체의 치료 방법.

도 1
혈당 조절과 동시에 혈관신생 조절에 대한 필요성이 특히 C-펩타이드 결핍과 더불어 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병을 앓고 있는 거대 환자 세트에서 예외없이 발병하는 당뇨병성 말초 신경병증 (DPN)을 동반한 당뇨병성 혈관병증의 사례에서 특히 충분히 예시된다. DPN은 발 괴저에서 발생할 수 있는 족부 궤양에 대해 취약하게 만든다. 이는 (도 1A) 건성 괴저, 허혈증 및 괴사 조직이 발생하지만 감염은 없는 궤양에서, (도 1B) 감염성이자 괴사성 조직이 있는 습성 괴저를 망라한다. 건성 괴저는 습성 괴저로 진행될 수 있다. 본원에 묘사된 것보다 더 현저한 건성 괴저 단계에서는, 병든 영역은 종종 짙은 녹색 또는 보라색, 거의 검정 색상을 특징으로 한다. 피부는 건조하고 산소 부족으로 인해 주름질 수 있다. 습성 괴저는 축축한 외양을 가진다. 이러한 유형은 전격성 염증을 의미하는 수포 및 종창이 특징적이다.
도 2
마찬가지로, 혈당 조절과 동시에 혈관신생 조절에 대한 필요성이 특히 C-펩타이드 결핍과 더불어 1형 당뇨병 또는 2형 당뇨병을 앓고 있는 거대 환자 세트에서 궁극적으로 발병하는 당뇨병성 말초 신경병증 (DPN) 및 신경병증을 동반한 당뇨병성 혈관병증의 사례에서 특히 충분히 예시된다. 하지 절단 (LEA) 상태 및 신장 기능 상태에 따른 Cox 비례 위험 모델로부터 수득한 조정된 생존 곡선.　2A　마이너 LEA 군 대비, 사망율에 대해 조정된 위험비는 메이저 LEA인 경우에 대해 1.80 (95% CI 1.05-3.09,　P=0.03)이었다.　2b　정상적인 신장 기능 군과 비교해, 사망율에 대해 조정된 위험비는 CKD인 경우에 대해 0.87 (95% CI 0.48-1.59,　P=0.66), 투석을 받는 경우에 대해 2.09 (95% CI 0.99-4.41,　P=0.05)였다.
도 3
골격근, 간 및 장에서 개시되는 글루타민 조직 간 대사 플럭스는 면역 세포에서 계속된다. 약어: 글루타민, GLN; 글루타메이트, GLU; 아스파르테이트, ASP; 아르기닌, ARG; 루신, LEU; 알라닌, ALA; 글루코스, Gluc; 피루베이트, Pyr; 피루베이트 데하이드로게나제; PDC; 피루베이트 카르복실라제, PC; 말레이트 데하이드로게나제, MD; 글리세르알데하이드-3-포스페이트, G3-P; 락테이트, Lac; 트리아실글리세롤, TG; 리보스 5-포스페이트, R5P; 알라닌 아미노트랜스퍼라제, ALT; 글루타메이트 데하이드로게나제, GDH; 글루타민 신테타제, GS; 글루타미나제, GLS; 유도성 질소 산화물 신타제, iNOS; 세포내 열 충격 단백질, iHSP; 열 충격 인자 1, HSF-1; 열 충격 요소, HSE; 시르툴린 1, SIRT1; 헥소사민 생합성 경로, HBP; 암모니아, NH3; 글루타티온, GSH; 산화된 GSH, GSSG; 글루타티온 S-리덕타제, GSR; 단백질 키나제 B, Akt; AMP-활성화된 단백질 키나제, AMPK; mTOR 복합체 1 및 2, mTORC1/2, 세포외 신호-조절된 키나제, ERK; c-Jun N-말단 키나제, JNK; γ-아미노부티르산, GABA.
도 4
글루타민에 직접 결합된 Pib2 복합체에 결합하는 글루타민에 의한 mTOR 복합체 활성화 기전은 TOR 복합체를 활성화하고, 세포 생장을 유도하고, 자가포식을 저해한다. 글루타민이 이용가능할 경우, 세포는 생장하기 시작하고, 이용불가하면 자가포식을 개시한다.
도 5
엘라스틴-수용체-복합체 (ERC) 결합 모티프 xGxxPx는 β-인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG)의 루프 2내 ~41-57 위치로부터 유래한 펩타이드에 존재한다.
좌측: Lapthorn AJ, Harris DC, Littlejohn A, Lustbader JW, Canfield RE, Machin KJ, et al. Crystal structure of human chorionic gonadotropin. Nature. 1994;369(6480):455-61로부터 개정된, β-인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG)의 구조로서, 루프 2는 회색으로 표시한다.
상단 우측: β-hCG의 루프 2의 아미노산 서열. 이의 xGxxPx 모티프는 헥사펩타이드 QGVLPA에 의해 표시된다. β-hCG의 다양한 '닉된(nicked)' 또는 단편화된 펩타이드는 아미노산 40-54 사이 펩타이드 백본으로부터 단백질 분해에 의해 파생된다 (Birken S, Berger P, Bidart J-M, Weber M, Bristow A, Norman R, et al. Preparation and Characterization of New WHO Reference Reagents for Human Chorionic Gonadotropin and Metabolites. Clinical Chemistry. 2003;49(1):144-54). 모든 아미노산 서열은 단문자 코드로 표시된다.
하단 우측: MTRVLQGVLPALPQ, 고리형 CVLQGVLPALPQVVC, VLQGVLPALPQVVC, VLQGVLPALPQ, LQGV, AQGV, VLPALP 및 VLPALPQ 등의 루프 2의 닉된 단편으로부터 파생되는 다양한 합성 펩타이드들은, 면역 및/또는 혈관 세포에서 검사시 생활성이다. 이들 단편에 대한 수용체는 지금까지 밝혀지지 않았다.
도 6
인간 C-펩타이드의 활성은 xGxxPG 모티프에 의해 좌우되고 ERC의 길항제에 의해 차단된다.
A: 합성 인간-C-펩타이드 (1-31, ERC-결합 모티프 LGGGPG 함유)를, 음성 대조군 및 양성 대조군: C-펩타이드 무첨가, 인간 C-펩타이드의 스크램블형 버전 (1-31, 임의의 xGxxPx 모티프 결핍) 및 pig-C-펩타이드 (1-29, 인간 C-펩타이드에 대해 ~74% 유사성을 가지나 임의의 xGxxPx 모티프 결손; 인간 C-펩타이드와의 정렬을 도시함)와 함께 인간 CD4+ 림프구-이동 분석에서 검사하였다.
신선하게 단리한 인간 CD4+ 세포를 지정된 C-펩타이드 변이체 (10 nM)와 함께 3시간 동안 인큐베이션하여, 변형된 Boyden 챔버에서 세포 이동에 대한 효과를 평가하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 나타낸다, ****P<0.001 치료군 대 대조군.
B: 신선하게 단리한 인간 CD4 세포를 V14 펩타이드 (10 μM) 또는 락토스 (10 mM)와 3시간 동안 예비 배양한 다음 C-펩타이드 (1-31)로 3시간 동안 (A)에 표시된 바와 같이 자극하였다. 결과는 평균 ± SEM으로 나타낸다. *P< 0.05, ****P<0.001 치료군 대 대조군, ####P<0.001 치료군 대 인간 C-펩타이드 (1-31).
돼지 C-펩타이드 내 ERC-결합 모티프 결핍 대 인간 C-펩타이드 내 이의 존재를 예시하기 위해 인간 및 돼지 C-펩타이드의 CLUSTAL O(1.2.4) 다중 정렬을 도시한다.
도 7
정상적인 세포 생장 및 증식을 지속하기 위해서는 영양분 감지가 중요하다. mTOR복합체 1 (mTORC1)은 영양분을 감지해, 세포 생장, 자가포식 및 기타 mTORC1-매개 과정을 조절한다. 인슐린, IGF-1, PDGF 및 VEGF와 같은 성장인자, 아미노산, 에너지 상태 및 스트레스는 mTORC1을 제어한다. 아미노산은 mTORC1 활성화에 필수적이다. 성장인자는 아미노산 보충 없이 단독으로는 최대 mTORC1 활성을 달성하지 못한다 (Sancak et al., The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 2008 Jun 13;320(5882):1496-501). 아미노산 농도 증가는 mTORC1 리소좀 국지화 및 후속적인 활성화를 촉진한다. 전형적으로, 일부 아미노산은 다른 것과 비교해 mTOR을 활성화하고, 바로 다른 것과 비교해 자가포식을 더 저해한다. 자가포식-저해성 mTOR의 펩타이드 모듈레이터는 자가포식-저해성 아미노산의 함량이 비교적 증가된 펩타이드를 선호적으로 포함하여, mTOR을 최상으로 활성화한다. 이러한 펩타이드 ((인간 C-펩타이드로부터 유래한) QVGQVELGGGPGAGSLQP, (hCG로부터 둘다 유래한) QGVLPA 또는 AQGV 뿐 아니라 본원에 개시된 기타)는 상단-죄측에 도시된 바와 같이, 세포외 가수분해의 공통 기전에 의해 세포에 들어가고, 다양한 아미노산 수송체에 의해 흡수될 수 있다. 또한, 세포내 글루타민은 세포외 필수 아미노산-https://www.nature.com/articles/ncomms11457 - ref-CR14, 특히 루신과 교체하는 능력을 가진다. 상단 우측에는 펩타이드 도입이 도시된다. 세포외 다이펩타이드 및 트리펩타이드는 펩타이드 수송체 (PEPT1/2) 조절된 이송을 통해 들어갈 수 있다. 더 큰 펩타이드는 (수용체 매개) 엔도사이토시스 또는 탐식작용을 통해 들어갈 수 있다. 아르기닌-풍부 세포-침투성 펩타이드는 막 멀티라멜라러티 (multilamellarity) 및 융합을 유도함으로써 소낭 및 살아있는 세포로 수동적으로 들어갈 수 있다. 추가적으로 자가포식-저해성 펩타이드의 세포내 가수분해는 mTOR을 조절하고 세포 생존에서 세포 사망에 이르는 분해 (자가포식) 또는 대사 합성 (단백질 생성) 사이에 균형을 조절하는 복수의 프로스세들의 신호를 전달하는, 자가포식 저해성 아미노산을 해리시킨다.
도 8
마트리겔에서 배양하고 펩타이드 헥사펩타이드 QGVLPA (hCG 유래) 및 18-meric 펩타이드 QVGQVELGGGPGAGSLQP (인간 C-펩타이드 유래)의 농도 증가에 따른 반응으로서, 인간 폐 미세혈관 내피 세포 미세혈관 혈관신생 (발아) 분석. 나타낸 데이터는 t=24h에서 측정한 전체 관 길이이다. *p<0.05; **p<0.01. 헥사펩타이드 VGVAPG (인간 엘라스틴 유래), LGGGPG (인간 C-펩타이드 유래) 및 PGAYPG (인간 갈렉틴-3 유래) 또한 본 실험에서 혈관신생 활성을 유의하게 유도하였다 (도시 안함).
도 9
마트리겔에서 배양하고 펩타이드 3 (18-meric 펩타이드 VGVAPGVGVAPGVGVAPG, 인간 엘라스틴 유래) , 6 (18-meric 펩타이드 QVGQVELGGGPGAGSLQP, 인간 C-펩타이드 유래) 및 8 (18-meric 펩타이드, GAYPGAPGAYPGAPAPGV, 갈렉틴-3의 인간 N-말단 단편 유래)의 농도 증가에 따른 반응으로서, 인간 폐 미세혈관 내피 세포의 미세혈관 혈관신생 (발아) 분석. 나타낸 데이터는 t=24h에서 측정한 전체 관 길이 및 전체 분지 길이이다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001.
도 10
도 9에서 검사한 바와 같은, mTOR의 자가포식-저해성 펩타이드 모듈레이터 인간 엘라스틴으로부터 유래한 VGVAPGVGVAPGVGVAPG, 인간 C-펩타이드로부터 유래한 QVGQVELGGGPGAGSLQP 및 인간 갈렉틴-3으로부터 유래한 GAYPGAPGAYPGAPAPGV의 관- 또는 분지-형성에서 혈관신생 활성의 50%를 달성하는데 필요한 약리학적 농도로서, EC50 결정.
도 11
피부 상처 치유는 다양한 세포 타입들 (염증성 세포, 각질 형성 세포, 내피 세포 (EC), 섬유모세포, 혈소판)의 증식 및 이동으로 구성된 염증 반응, 혈관신생, 새로운 조직 형성 및 조직 리모델링을 수반하는, 최종적으로 피부 경계의 온전성을 회복하는 포괄적이고 복합적인 프로세스이다. 상처-치유에서 혈관신생은 안지오포이에틴 1 (ANG1) 대 안지오포이에틴 2 (ANG2)의 조절을 수반하며, 따라서 혈관신생에서 PI3K/AKT/mTOR 경로도 포함된다. PI3K/AKT/mTOR 경로는 질소 산화물 및 안지오포이에틴과 같은 혈관신생 인자의 발현을 매개한다. PI3K/AKT/mTOR 경로에 대해 다수의 저해제들이 개발되었으며, 이러한 물질은 VEGF 분비 및 혈관신생을 감소시키고, 상처 치유를 방해하는 것으로 입증되었다. 이와는 대조적으로, mTORC1의 활성화는 실제 혈관신생을 촉진하는 것으로 입증되었다 (Karar J, Maity A. PI3K/AKT/mTOR Pathway in Angiogenesis. Front Mol Neurosci. 2011 Dec 2;4:51). 본원에 제공된 mTOR의 자가포식-저해성 펩타이드 모듈레이터는 mTOR을 활성화하고, 이와 함께 상처 치유에서 VEGF 분비 및 혈관신생을 증가시킨다.
도 12
상처 치유 저하에 기여하는 추가적인 인자로는 고혈당증을 포함하며, 이는 적절한 혈당 조절을 유지하는 것이 중요함을 예시한다.
도 13
C-펩타이드 결핍 결정
Qiao 등　(C-peptide is independent associated with diabetic peripheral neuropathy: a community-based study.　Diabetol Metab Syndr　9,　12 (2017))은, 2형 당뇨병 환자에서 잔류 C-펩타이드와 DPN 간의 관계를 조사하였다. 당뇨병 기간 증가에 따라 섬 기능이 점진적으로 감소해, C-펩타이드 및 인슐린 수치 감소가 달성되고 DPN 유병률이 증가한다. non-DPN 군에서는 공복 C-펩타이드, 식후 2시간 C-펩타이드 및 ΔC-펩타이드 (즉, 식후 2시간 C-펩타이드 - 공복 C-펩타이드)의 혈청내 농도가 임상 DPN 군 (모든　P　≤　0.040) 및 확증된 DPN 군 (모든　P　<　0.002)에서보다 유의하게 더 높았다.

자가포식 저해성 펩타이드

단문자 코드

본원에서 단백질 또는 펩타이드 조성, 구조 및 기능을 기술함에 있어 아미노산을 참조한다. 본 명세서에서, 아미노산 잔기는 다음과 같은 약어를 이용해 식별한다. 또한, 달리 명확하게 언급되지 않은 한, 펩타이드 및 단백질의 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로, 좌측 말단에서 우측 말단으로 표시되며, N-말단은 제1 잔기로 식별된다. Ala: 알라닌 잔기; Asp: 아스파르테이트 잔기; Glu: 글루타메이트 잔기; Phe: 페닐알라닌 잔기; Gly: 글리신 잔기; His: 히스티딘 잔기; Ile: 이소루신 잔기; Lys: 라이신 잔기; Leu: 루신 잔기; Met: 메티오닌 잔기; Asn: 아스파라긴 잔기; Pro: 프롤린 잔기; Gln: 글루타민 잔기; Arg: 아르기닌 잔기; Ser: 세린 잔기; Thr: 트레오닌 잔기; Val: 발린 잔기; Trp: 트립토판 잔기; Tyr: 티로신 잔기; Cys: 시스테인 잔기. 아미노산은 또한 이의 통상적인 단문자 코드 약어로 언급될 수 있다; A=Ala; T=Thr; V=Val; C=Cys; L=Leu; Y=Tyr; I=Ile; N=Asn; P=Pro; Q=Gln; F=Phe; D=Asp; W=Trp; E=Glu; M=Met; K=Lys; G=Gly; R=Arg; S=Ser; 및 H=His.

펩타이드

펩타이드는 본원에서 펩타이드 (아미드) 결합을 통해 연결된 아미노산 단량체들로 이루어진 천연적인 생물학적 또는 인공 제작된 (합성) 짧은 사슬을 의미할 것이다. 글루타민 펩타이드는 본원에서 펩타이드 (아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체들로 이루어지되 아미노산 단량체 중 하나가 글루타민인, 천연적인 생물학적 또는 인공 제작된 (합성) 짧은 사슬을 의미할 것이다. 화학 합성 펩타이드는 일반적으로 유리 (free) N-말단 및 C-말단을 가진다. N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화는 펩타이드의 전체 전하를 감소시키며, 따라서 이의 전체 용해성이 감소할 것이다. 그러나, 펩타이드의 안정성은, 말단 아세틸화/아미드화가 본래의 단백질과 더 비슷한 모방체를 생성하므로, 증가될 수 있다. 이러한 변형은 펩타이드의 생물학적 활성을 높일 수 있으며, 또한 본원에 제공된다.

펩타이드 합성

펩타이드는, 활용시 고전적으로 공지된 고상 지지체에서의 화학적 합성 (Ansynth BV, Roosendaal, The Netherlands)에 의해 또는 용액 중의 화학 합성 (Syncom BV, Groningen, The Netherlands and Diosynth BV, Oss, The Netherlands)에 의해 합성한다. 약학적 펩타이드 조성물은 트리플루오로아세테이트를 반대-이온 또는 염으로서 이용해 합성할 수 있으며, 이후 트리플루오로아세테이트는 (말레산으로부터) 말리에이트, (아세트산으로부터) 아세테이트, (주석산으로부터) 타르트레이트 또는 (구연산으로부터) 사이트레이트 등의 반대-이온으로 교환한다. 전임상 및 임상 인간 실험에서 이용하기 위한 약물 물질 AQGV (EA-230)는 Organon N.V 사 (종래에 Diosynth B.V.), (Oss, The Netherlands)에서 제조하였으며, 최종 제품의 충진 및 마무리는 Octoplus Development, Leiden 사 (The Netherlands)에서 수행하였다. EA-230 (AQGV)의 분자량은 373 g/mol이다.

화학주성 활성 (chemotactic activity) 결정.

인간 U937 단핵구 세포는 ATCC (American Type Culture Collection, ATCC 카탈로그 번호 CRL-1593.2, Manassas, Va)에서 구입한다. 세포는 10% 소 태아 혈청과 항생제가 첨가된 RPMI 1640 배지가 든 T-75 플라스크에서 현탁 배양으로 유지시키고, 배양물은 3-5일마다 분할한다. 화학주성 분석에 이용하기 3일 전, 기술된 바와 같이 1 mmol/L 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (dbcAMP; Sigma Chemical Co)에 노출하여 U937 세포를 자극함으로써 대식세포 계통을 따라 분화시켰다. 세포를 3번 헹궈 배양 배지를 제거한 다음 화학주성 매질 (1% 락트알부민 가수분해물 1%가 첨가된 둘베코의 변형된 기본 배지)에 재현탁하여 최종 농도 2.5 x 10⁶ 세포/mL로 분석 챔버에 접종하였다. 화학주성 분석은 48웰 미세화학주성 챔버 (Neuro Probe, Cabin John, Md)에서 수행하였다. 챔버의 바닥 웰에 화학주성 자극물질 (또는 매질 단독) 25 mL을 3세트로 충진하였다. 기공 크기 5 mm의 비-코팅된 10-mm-두께의 폴리비닐피롤리돈-프리 폴리카보네이트 필터를 샘플 (Neuro Probe) 위에 배치하였다. 실리콘 개스킷 및 상부 챔버 피스를 적용하고, 단핵구 세포 현탁물 50 mL을 상부 웰에 넣었다. 챔버를 가습 5% CO₂ 분위기 하에 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 비-이동 세포는 필터의 상부 표면으로부터 부드럽게 닦았다. 필터를 30초간 메탄올계 고정제에 침지하고, 변형된 Wright-Giemsa 기법 (Protocol Hema 3 stain set; Biochemical Sciences, Inc, Swedesboro, NJ)으로 염색한 다음 유리 슬라이드 위에 탑재하였다. 필터를 통해 완전히 이동한 세포는 광 현미경에서 계수하였으며, 웰 당 랜덤 하이-파워 필드 (HPF; 오리지널 배율 x 400) 3개를 계수한다. 건강한 자원자에서 신선하게 채혈한 혈액으로부터 연속 Ficoll/Pelastin 수용체 복합체 (ERC)oll 농도 구배 원심분리를 이용하여 인간 단핵구를 도처에 기술된 바와 같이 단리하였다. 세포는 0.5% 인간 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 16시간 동안 배양하여 단리 후 휴지 상태로 만들었다. 세포의 순도는 유세포 측정 분석으로 결정한 바에 따르면 >95%이었다. 단핵구 화학주성은 48웰 미세화학주성 챔버 (Neuroprobe, Gaithersburg, MD)에서 무혈청 배지 하에 분석하였다. 상부 챔버 및 하부 챔버에서 웰들은 폴리비닐피롤리돈-프리 폴리카보네이트 막 (기공 크기 5 ㎛; Costar)에 의해 분리하였다. 신선하게 단리한 단핵구는 밀도 5x10⁵/mL에서 재조합 C-펩타이드 (Sigma)와 함께 2.5시간 동안 인큐베이션한 다음 필터 바닥면 상의 이동한 세포를 염색하여 광 현미경에서 계수하였다. 최대 화학주성 활성은 0.1 mmol/L N -포르밀-메티오닐-루실-페닐알라닌 (f-MLF; Sigma Chemical Co)을 이용해 측정하고, 바둑판 분석으로 화학주성을 화학운동성 (chemokinesis)과 구분하였다.

세포 단리

건강한 자원자로부터 채혈하여 항응고제로서 사이트레이트가 함유된 관에 수집하였다. 호중구는 Polymorphprep kit (Nicomed, Oslo, Norway)를 제조사의 지침에 따라 사용해 단리하고; 단핵구는 자기 비드 (Miltenyi Biotech)를 이용해 정제하였다. 세포의 순도는 유세포 측정 (항-CD45, 14, DR 및 CD66b)에 의해 평가한 바에 따르면 >93%이었다. 각각의 세포 유형들에 대해 2명의 기증자로부터 수득한 샘플을 조사하였다.

마우스에 정맥내 주사한 [14C]-AQGV의 분포 및 소거

본 시험은 네덜란드 우트레히츠백에 위치한 TNO Biosciences 사에서 수행하였으며, 50 mg/kg을 정맥내 1회 용량으로 투여한 후 CD-1 수컷 마우스에서 [14C]-AQGV (Ala-Gln-[1-¹⁴C]Gly-Val)의 분포 및 대사 데이터를 제공하기 위해 설계하였다. 이를 위해, 방사성 표지된 AQGV를 투여한 후 10분, 30분, 60분, 6시간 및 24시간 경과 시점에 마우스를 희생시키고, 다양한 조직에서 수치를 확인하였으며, 뇨 및 혈장에 존재하는 방사능을 HPLC에 의해 분석하였다.

방사성 표지된 펩타이드를 주사한 후 10분 경과시 혈중 방사능은 비교적 낮았다. 모든 카운트가 온전한 펩타이드에 대한 것이라면, 존재하는 양은 17.2 ㎍/g일 것이다. 그러나 10분 후 혈장에서 모 화합물은 검출할 수 없었으며, [¹⁴C]-AQGV가 매우 빨리 가수분해되는 것으로 나타났다. 모 화합물은 뇨에서 검출되지 않았다. 소변에서 방사능은 대부분 HPLC 컬럼의 데드 부피 (dead volume)에 또는 그 직후에 용출되는 친수성 화합물로서 존재하였다.

다양한 장기들에 존재하는 방사능은 혈중 방사능을 초과하였다. 10분 후 "펩타이드"의 최고 농도는 신장 (362 ㎍/g), 간 (105 ㎍/g), 고환 (85.7 ㎍/g), 폐 (75.2 ㎍/g) 및 비장 (74.7 ㎍/g)에서 확인되었다. 일반적으로, 이후에 점차적인 방사능 감소가 관찰되었다. 24시간 후, 최고 농도는 신장 (61.9 ㎍/g), 흉선 (43.1 ㎍/g), 비장 (39.3 ㎍/g), 간 (37.6 ㎍/g) 및 피부 (37.5 ㎍/g)에서 확인되었다.

용량 투여 후 10분, 30분, 60분, 6시간 및 24시간 경과시 방사능의 평균 총 회수율은 각각 83.2%, 70.5%, 62.9%, 52.6% 및 50.8%였다. 이들 결과는, 용량 투여 후 [¹⁴C]-휘발성 물질, 아마 대부분 ¹⁴C-CO₂가 빠르게 생성되어, 날숨을 통해 배출됨을 명백하게 보여준다. 24시간 후 투여된 방사능은 10.2%가 소변으로, 2.6%는 대변으로 배출되었다.

- 결론

정맥내 주사 후, [¹⁴C]-AQGV는 혈액으로부터 빠르게 제거되었다. 이는 아래 제시된 약동학 실험의 결과와 일치하였다. 혈액 혈장 및 뇨 내 대사산물 프로파일에서는 모 화합물이 발견되지 않았으며, 이는 [¹⁴C]-AQGV의 빠른 대사를 의미한다. 투여된 방사능의 약 50%는 휘발성 물질로서, 아마 대부분 ¹⁴C-CO₂로 최대 24시간 이내에 배출되었다. 본 실험의 결과는 [¹⁴C]-AQGV가 빠르게 가수분해되어 [1-¹⁴C]-글리신이 생성되고 이후 ¹⁴C-CO₂로 대사되어 호기시 배출됨을 보여준다. 혈장 및 뇨 내 모 화합물의 부재는, 조직 및 장기에 존재하는 방사능이 [¹⁴C]-AQGV 대사의 가수분해 생성물로만 존재할 수 있음을 시사한다.

펩타이드 가수분해

본 발명은, 펩타이드 AQGV와 같은 자가포식-저해성 아미노산을 함유한 펩타이드가 세포와 접촉하게 되면, 펩타이드가 세포의 표면에서 세포외 가수분해되거나, 또는 혈관 세포의 경우 엔도사이토시스 후 예를 들어 파고리소좀 (phagolysosome)에서 세포에 의한 펩타이드의 엘라스틴 수용체 매개 엔도사이토시스에 의해 가수분해됨을, 제시한다. 펩타이드를 빨리 가수분해할 수 있는 다수의 펩티다제들이 세포 상 또는 세포 내에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 계속적인 가수분해로 트리펩타이드 및 다이펩타이드가 항상 만들어진다. 마찬가지로, 리소좀에서 트리펩티딜 및 다이펩티딜 펩티다제에 의한 가수분해는 동일하게 단일 아미노산을 만들어 낼 것이다. ¹⁴C 표지된 AQGV를 이용한 연구에서 실제 마우스에 투여한 후 15분 이내에 펩타이드가 완전히 가수분해되는 것으로 밝혀졌다. 세포에 제시되었을 경우, AQGV 또는 이의 유사 화합물 LQGV의 가수분해로부터, 또는 이런 점에서 임의의 다른 적합한 올리고펩타이드로부터 트리펩타이드, 다이펩타이드 및 단일 아미노산이 만들어질 것이다.

펩타이드 수송

마찬가지로, 몇몇 연구들이 여러가지 타입의 성숙한 과립구의 생존에서 p38 MAPK의 역할을 발표하였다. 과립구 (예, 호중구, 호산구, 호염구)는 공통적인 최종 분화 단계를 가진다. 이들 세포는 단편화된 핵 (fragmented nuclei)을 가지고 있으며, 사전 형성된 분비 인자를 함유한 과립들이 축적되어 있다. 본원에서, p38 MAPK는 호중구 생존에 필수적이고, p38 MAPK의 비활성화는 이들 세포의 사멸 및 소거에 필요할 뿐 아니라, p38 MAPK는 내피 세포의 수축에 필요하고 p38 MAPK의 비활성화는 혈관 벽 온전성을 회복할 수 있도록 혈관 세포를 이완하는데 필요한 것으로 제안되었으며, 또한 p38 MAPK 활성의 비활성화는 혈관 내피 혈관벽의 혈관 투과성을 탐색하는 호중구 및 기타 백혈구를 진정시키는데 필수적이다.

다이펩타이드 및 트리펩타이드는 PEPT1/2 수송체를 통해 선택적으로 수송된다. 트리펩타이드, 다이펩타이드 및 단일 아미노산은 세포막을 통해 능동적으로 수송되며, 다이펩타이드와 트리펩타이드의 흡수는 단일 아미노산의 흡수와는 별개의 기전을 통해, 즉 PEPT1 및 PEPT2 수송체를 통해 이루어진다. 잠재적으로, 모든 400종의 다이펩타이드와 8,000종의 트리펩타이드가 PepT1 및 PEPT2에 의해 수송될 수 있다. 아미노산을 펩타이드 형태로 장 세포로 수송하는 것이 이를 구성하는 아미노산의 유리 형태보다 단위 시간 당 더 빨리 흡수되는 경로인 것으로 입증되어 있다 (J Anim Sci, 2008; 9, 2135-2155에서 검토됨).

mTOR 참여.

마지막으로, 본 발명자들은 라파마이신의 기계론적 표적, mTOR의 참여를 제안한다. 이러한 관점에서, 펩타이드는 PEPT1/2를 통해 또는 능동적인 엔도사이토시스 또는 식세포 과정을 통해 세포에 들어간 다음 펩타이드는 파고리소좀에서 완전히 가수분해되고, 생성된 자가포식-저해성 아미노산은 mTOR 복합체에 제시되어 세포의 자가포식을 저해하게 된다. 테트라펩타이드, 트리펩타이드 및 다이펩타이드 활성은 아미노산 A, Q, G, V, L 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단일 아미노산 A, Q, G, V의 최종적인 인과 활성 (causal activity)을 모두 반영할 수 있다. 이런 방식으로, 아미노산 A, Q, G, V, L 및 P가 mTOR에 대한 기질 (food)이다. 실제, 예비 결과는 FPR-신호전달 분석에서 AQGV로부터 유래한 여러가지 트리펩타이드 및 다이펩타이드를 이용하였을 경우, p38 경로에 대한 유사한 저해 효과를 보여준다. 개개 아미노산이 세포기질을 통해 mTOR에 접근할 수 있지만, 아미노산은 펩타이드 단편 (AQGV와 같은 가닥) 형태로 파고리소좀을 통해 mTOR 기구에 들어갈 가능성이 더 높다. 아미노산에 의한 mTOR의 활성화는 따라서 2가지 관점으로 설명할 수 있다, 1) 펩타이드 가닥의 엔도사이토시스는 호중구 및 단핵구와 같은 모든 식세포에 가장 중요하고, 2) 펩타이드 단편은 PEPT1/2를 통해 도입된다.

아미노산은 mTOR 경로를 활성화하고, 자가포식을 저해한다.

자가포식은 영양소가 부족할 경우 세포 생존을 위해 아미노산을 생산하는 역할을 하고, 아미노산은 자가포식에 대한 효과적인 저해제이다. mTOR (Mechanistic-target-of-rapamicin)은 자가포식 유도의 중요한 조절인자로서, 활성화된 mTOR은 자가포식을 억제하고, mTOR의 네거티브 조절은 이를 촉진한다. 아미노산은 실제 세포 증식, 단백질 합성, 자가포식 및 생존에 영향을 미치는, mTOR 복합체 1 또는 2 활성화에 중요한 조절인자인 것으로 보인다. 이러한 사실들로 아미노산에 의해 이용되는 새로운 신호전달 경로를 동정하게 되어, 세포 대사에서 이들 영양소의 결정적인 중요성을 부각시키고 약제학적 활성 펩타이드 개발에 새로운 기계론적 통찰력을 제공해준다.

mTOR 경로에 대한 아미노산의 차등 신호전달 (differential signaling).

일부 아미노산은 특히 단백질 생성 (mTOR 키나제) 또는 단백질 분해 (자가포식)를 조절하는 것으로 알려져 있다. 최근 데이터와 과거 데이터에서, 효과가 없거나 또는 반대 효과를 가진 것으로 발표된 글루타메이트 (E), 트레오닌 (T), 세린 (S), 라이신 (K), 트레오닌 (T), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 메티오닌 (M)과 같은 다른 아미노산에 비해, mTOR에 대한 강력한 활성인자로서 또는 자가포식의 저해제로서, 단독으로 또는 조합 형태로서, 루신 (L), 발린 (V), 이소루신 (I), 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 글리신 (G), 프롤린 (P) 및 아스파라긴 (N)이 파악되었다. 아미노산 루신 (L), 알라닌 (A), 글루타민 (Q) 및 프롤린 (P)은 인간 세포에서 가장 현저한 자가포식 효과를 가진 것으로 보고된 바 있다 (AJ Meijer et al Amino Acids 2015, 47, 2037-2063).

mTOR의 수종의 자가포식 저해성 펩타이드 모듈레이터 및 이들 펩타이드의 수종의 유기 염들이 염증 치료에 유용하고, PCT/NL2018/052822, PCT/NL2020/050535, PCT/NL2020/050605 또는 PCT/NL2021/050223에서 혈액학적 불안정성 문제를 해결하는데 유용한 것으로 이전에 밝혀진 바 있다. 본 출원에서는, 이러한 유형의 자가포식 저해성 펩타이드가 인간 혈관 내피 세포의 발아 분석에서 입증된 바와 같이 혈관신생 특성을 가지고 있으며, 인간에서 당뇨병성 (족부) 궤양을 치유하는데 유용함을, 개시한다.

이러한 펩타이드 수종은 인간 엘라스틴-수용체-복합체 (ERC)에 대한 결합 모티프를 가지고 있으며; 이러한 결합 모티프 xGxxPx는 예를 들어 β-인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG)의 루프 2내 ~41-57번 위치들로부터 유래한 펩타이드에 존재한다 (도 5 참조). β-인간 융모성 고나도트로핀 (β-hCG)에서 ~41-57번 위치 (일부는 40-54로 명시됨)로부터 유래한 소형 펩타이드는 임신 중에 모계 면역 반응으로부터 모체와 아이를 보호할 가능성이 높다 (US6583109B1, US7358330B2, Khan, Immunoregulatory Properties of Break Down Products of Human Choriogonadotropin, thesis, 2010). US6583109B1은 LQGVLPALPQVVC를 관여하는 것으로 식별하였고, Khan (ibid, 2010)은 MTRVLQGVLPALPQ를 관여하는 것으로 식별하였고, US7358330B2는 공통 모티프 LQGVLPALPQ (본 출원에서 코어 ERC-결합-모티프 QGVLPA를 이용해 인지됨)를 적어도 이러한 보호를 제공하는데 관여하는 것으로 식별하였다. Khan (ibid, 2010)은 1형 당뇨병에서 LQGV 및 VLPALP를 검사하였다: - 이들 펩타이드 둘다 NOD 마우스에서 T1D-발병을 현저하게 지연시킨다 (p<0.0001). Biotempt (US7358330B2)는 LQGV, VLPALP 및 각각의 hCG-유래 알라닌-대체 펩타이드를 시험관내에서 LPS-연구에서 검사하였다: LQGV, AQGV, LAGV, LQAV, LQGA, VLPALP, ALPALP, VAPALP, VLAALP, VLPAAP 및 VLPALA. 이들 모두 LPS-활성을 시험관내에서 현저하게 저해하였다. Van den Berg 등 (Synthetic oligopeptides related to the [beta]-subunit of human chorionic gonadotropin attenuate inflammation and liver damage after (trauma) haemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 2009 Mar;31(3):285-91)은 출혈성 쇼크의 랫 모델에서 LQGV, AQGV 및 LAGV를 생체내에서 검사하였다. 이들 3종은 TNF-α 및 IL-6의 전신 방출을 현저하게 방지하였다 (p<0.001). 인간 C-펩타이드의 활성은 또한 xGxxPG 모티프에 의존하고, ERC의 길항제에 의해 차단된다 (도 6 참조). 도 6A는 xGxxPG를 함유한 인간 C-펩타이드가 초기 혈관신생에서 중요한 과정인 CD4⁺ 림프구 이동에 대한 상향 조절성 효과를 보여준다 (Kwee et al., CD4 T-cells regulate angiogenesis and myogenesis. Biomaterials. 2018 Sep;178:109-121). 또한, (Lemaire et al. The elastin peptide VGVAPG increases CD4(+) T-cell IL-4 production in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Respir Res. 2021;22(1):14), VGVAPG 엘라스틴 펩타이드의 프로토타입 xGxxPG 결합 모티프는 CD4⁺　림프구 IL-4 생산을 조절하며, 이는 혈관신생에서 엘라스틴-유래 펩타이드의 유사한 CD4⁺-결합 활성을 시사한다. xGxxPG-모티프가 없는 스크램블형 C-펩타이드 및 돼지 C-펩타이드는 CD4+-이동에 영향을 미치지 않았다. Gal-3는 CD4⁺ 세포에 의해 발현되는 것으로 간주되어, 비슷한 분석에서 검사하지 않았다. 도 6B는 C-펩타이드의 CD4⁺-이동 효과가, 모티프 VGVAPG를 가진 펩타이드에 대해 당해 기술 분야에서 입증된 바와 같이, xGxxPG-엘라스틴-수용체 결합에 대해 각각 특이적인 저해제인, V14 펩타이드 및 락토스에 의해 약화됨을, 보여준다. 따라서, 인간 C-펩타이드의 중간-부분 (-단편)의 결합성은 엘라스틴 수용체-특이적이고, 혈관신생에서 xGxxPG-모티프의 존재에 따라 결정되며, 아울러 xGxxPG-함유 펩타이드는 수용체 매개 엔도사이토시스에 의해 세포에 들어간다. 실제, Luppi 등 (Luppi et al., C-peptide is internalised in human endothelial and vascular smooth muscle cells via early endosomes. Diabetologia. 2009 Oct;52(10):2218-28)은, C-펩타이드가 엔도사이토시스에 의해 세포에 들어가고, 엔도솜 내에서 신호를 보낸다. Luppi 등 (ibid)에 따르면, 엔도솜은 C-펩타이드가 이의 세포성 효과를 달성할 수 있는 신호전달 상태를 나타낸다. 이는 mTOR을 활성화하여 자가포식을 저해하는데 필수적인 상태로서 가수분해 설정을 예시한다. 전형적으로, 일부 아미노산은 다른 것에 비해 mTOR을 활성화하여, 다른 것에 비해 자가포식을 더 많이 저해한다 (도 7 참조). 알라닌은 자가포식에 대해 매우 특이적인 공동-조절 효과를 가진 것으로 입증되어 있다 (Regulation of autophagy by amino acids and MTOR-dependent signal transduction. Amino Acids. 2015 Oct;47(10):2037-63; Kadowaki et al. Nutrient control of macroautophagy in mammalian cells. Mol Aspects Med. 2006 Oct-Dec;27(5-6):426-43).　알라닌과 루신의 생리학적 농도에서의 조합은 랫 간 세포에서 자가포식성 단백질분해에 대해 아미노산 20종 전체의 완전체 혼합물과 동일한 저해 효과를 발휘한다 (Meijer et al, ibid). 이러한 동일한 연구에서, 알라닌의 대사가 자가포식에 대한 이의 저해 효과에 필요하다는 것 역시 입증되었다. 또한, 영양 및 건강에서의 L-글루타민 (Gln)의 역할이 광범위하게 입증한 바 있지만, 심혈관계에 대한 이의 효과는 최근에야 밝혀졌다 (Bertero et al., The molecular rationale for therapeutic targeting of glutamine metabolism in pulmonary hypertension. Expert Opin Ther Targets. 2019 Jun;23(6):511-524).　Tan 등 (Glutamine metabolism regulates autophagy-dependent mTORC1 reactivation during amino acid starvation. Nat Commun. 2017 Aug 24;8(1):33)은 글루타민 대사가 장기간의 아미노산 고갈 중에 자가포식-의존적인 방식으로 mTORC1 활성을 회복하기에 충분함을 보여주었다. Ukai 등 (Gtr/Ego-independent TORC1 activation is achieved through a glutamine-sensitive interaction with Pib2 on the vacuolar membrane. PLoS Genet 14(4): e1007334. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007334, 2018)은 2종의 분자 기구로서 Pib2 및 Gtr/Ego가 상호 배타적인 방식으로 TORC1과 별개의 복합체를 형성함을 보여주며, 이는 다양한 아미노산에 대한 반응으로 TORC1과 Pib2 또는 Gtr/Rag 간의 배타적인 기능적인 관계를 암시한다. 이들은 또한 TORC1의 아미노산-의존적인 활성화가 이를 액포막에 고정함으로써 Pib2 및 Gtr/Ego 경로를 통해 달성됨을 밝혀지고, 글루타민이 Pib2 복합체에 직접 결합해 Pib2-TORC1 복합체 형성을 강화하는 것으로 확인된 바, Pib2는 mTOR에 대한 추정의 글루타민 센서의 요소로서 발견되었다 (도 4 참조). 세포내 글루타민은 또한 세포외 필수 아미노산과 교환할 수 있는 능력을 가지고 있으며 - https://www.nature.com/articles/ncomms11457 - ref-CR14 (Nicklin et al., Bidirectional transport of amino acids regulates mTOR and autophagy. Cell. 2009 Feb 6;136(3):521-34), 아울러 mTOR 활성을 추가로 조절한다 (Jewell Metabolism. Differential regulation of mTORC1 by leucine and glutamine. Science. 2015 Jan 9;347(6218):194-8. doi: 10.1126/science.1259472. Epub 2015 Jan 7). Sun 등 (Glycine Regulates Protein Turnover by Activating Protein Kinase B/Mammalian Target of Rapamycin and by Inhibiting MuRF1 and Atrogin-1 Gene Expression in C2C12 Myoblasts. J Nutr. 2016 Dec;146(12):2461-2467)은 mTORC1을 활성화하고 단백질 분해를 위해 유전자의 발현을 저해함으로써 단백질 턴오버를 조절하기 위해 글리신을 발굴하였다. 또한, 데카르복실라제 (글리신 절단 시스템에 속하는 효소로서 GLDC)에 의한 글리신-제거는 자가포식을 자극한다 (Zhuang　et al.,　Glycine decarboxylase induces autophagy and is downregulated by miRNA-30d-5p in hepatocellular carcinoma.　Cell Death Dis　10,　192 (2019)). 아울러, T2D는 내피 기능장애를 유발하고, 비-정상적인 혈관신생을 유도하고, 혈청 아미노산 대사를 바꾸고, 특히 글리신의 경우 고혈당증으로 인해 현저하게 감소된다. 아미노산 프로파일에 대한 대사학적 분석 결과, 세포내 글리신은 당뇨병 환자의 내피 세포 (EC)로부터 유래한 유도된 만능성 줄기 세포-유래 세포 (iPSC)에서 건강한 개체로부터 유래한 세포와 비해 현저하게 낮은 것으로, 확인된 바 (Su et al., Diabetic Endothelial Cells Differentiated From Patient iPSCs Show Dysregulated Glycine Homeostasis and Senescence Associated Phenotypes. Front Cell Dev Biol. 2021 May 31;9:667252), T2D에서 EC의 글리신 고갈을 의미한다. 인간에서 필수아미노산인 분지쇄 아미노산 (BCAA) 발린은 세포 생장 및 대사에 특히 중요한 역할을 담당한다. 몇가지 연구들에서 발린이 라파마이신 경로의 포유류 표적 (MTOR)의 자극을 통해 모유 수율과 단백질 합성을 증가시키는 능력이 부각되었다 (Long et al., Valine increases milk fat synthesis in mammary gland of gilts through stimulating AKT/MTOR/SREBP1 pathway,　Biology of Reproduction, Volume 101, Issue 1, July 2019, Pages 126-137). 최근 수년간, 혈장 BCAA 농도는 지질 대사 항상성의 새로운 홀마트로서 간주되었다. 인간 및 랫에서의 증거는 발린 대사와 지질 대사 간의 밀접한 연관성을 확정하였다. 자가포식의 제어시, 루신이 아르기닌과 함께 가장 또는 적어도 특히 유망한 저해성 아미노산인 것으로 보인다. 아울러, 이의 항-단백질분해 효과는 인슐린에 의해, 그리고 세포 종창에 의해 강화되었다 (Meijer et al, ibid). 프롤린은 기질로서 세포외 매트릭스, 결합 조직 및 뼈에 콜라겐으로 저장되고, 매트릭스 메탈로프로테나제, 펩티다제 및 프롤리다제의 연속적인 작용에 의해 저장소로부터 빠르게 방출된다. 유일한 단백질생성 2차 아미노산으로서 프롤린은 특별한 생물학적 효과를 가지고 있어, 모든 단백질-단백질 상호작용과 대사 스트레스에 대한 반응의 조절자로서 역할을 하고, 자가포식 등의 다양한 하류 대사 활성을 개시시킨다 (Kadowaki et al. Nutrient control of macroautophagy in mammalian cells. Mol Aspects Med. 2006 Oct-Dec;27(5-6):426-43). 한가지로), 프롤린을 이용하는 효소는 스트레스 신호전달에 반응하고; 2번째로) 프롤린의 대사는 거대한 동원가능한 프롤린 풀이 존재하며; 3번째로) 프롤린의 대사는 스트레스 기능을 수행한다. 암에서는, 프롤린이 자가포식에서 영양분과 산소 고갈에 대한 반응자로서 작용하는 것으로 보고되어 있다. 아울러, 과거 수년간, 프롤린은 뉴런 자가포식에서 이의 독특한 대사 기능에 대해 조사되었다. 프롤린은 뉴런 자가포식을 저해하는 반면, 프롤린-옥시다제에 의한 프롤린의 산화는 산화 스트레스를 강화해 자가포식을 촉발하는 것으로, 확인되었다. 수십년간의 연구를 통해 효소 NO 신타제 (NOS)에 의한 기체 질소 산화물 (NO)의 생성을 통해 심혈관 건강 촉진하는데 있어 L-아르기닌의 중요성이 확립되었다. 내피 세포 (EC)에 의한 NO의 방출은 동맥 긴장을 저해함으로서 혈류 및 혈압을 조절한다. 아울러, NO는 혈액 유동성을 유지시키고, 혈소판 응집과 응착을 제한함으로서 혈전증을 방지한다. 또한, NO는 평활근 세포 (SMC) 증식, 이동 및 콜라겐 합성을 차단함으로써 내막 비후화를 방지한다. 최근 L-아스파라긴은 글루타민처럼 Rag GTPase의 부재시 Arf1을 통해 mTORC1에까지 신호를 보내고, 글루타민과 마찬가지로 세포내 아스파라긴이 세포외 아미노산과 교환하는 것으로 발견되었다. 글루타민은 글루타메이트의 생산을 통해 다양한 아미노산 합성에 참여할 수 있지만, 유일하게 아스파라긴은 드 노보 합성에 글루타민을 필요로 한다. 아스파라긴 신테타제 (ASNS)는 글루타민 및 아스파르테이트를 ATP-의존적인 방식으로 글루타메이트 및 아스파라긴으로 변환하는 효소이다⁶. ASNS 발현은 아미노산 고갈시 활성화 전사 인자 4 (ATF4)의 활성화를 통해 상향 조절된다. 아스파라긴은 라파마이신 복합체 1의 세린/트레오닌 키나제 포유류 표적 (mTORC1), 뉴클레오티드 생합성 및 증식을 조절하는 교환 아미노산 인자로서 확인되었다 (Bodineau et al., Two parallel pathways connect glutamine metabolism and mTORC1 activity to regulate glutamoptosis. Nat Commun. 2021 Aug 10;12(1):4814).

마트리겔에서 배양한 인간 혈관 내피 세포에 대한 미세혈관 혈관신생 (발아) 분석 (도 8, 9 및 10 참조)

인간 폐 미세혈관 내피 세포 (Hpmec, HUVE 또는 기타 혈관 EC 역시 이용가능할 수 있음)를 10% FBS 및 인간 재조합 FGF-B, 인간 재조합 VEGF, 인간 재조합 R3-IGF-1, 아스코르브산, 인간 재조합 EGF 및 GA-1000 (겐타마이신 설페이트-암포테리신)을 함유한 bullet 키트 (Lonza, CC-4147)에 존재하는 모든 구성성분들이 첨가된 EBM-2 배지 (Lonza, CC-3156)에서 배양하였다. 분석하기 24시간 전, Hpmec를 10% FBS 대신 0.5% FBS가 함유된 EBM-2 배지에서 고갈시켰다. 혈관신생 분석에 투입하기 위해, 내피 세포를 따뜻한 PBS로 2번 헹구고, 트립신 처리한 후 무혈청 EBM-2 배지로 재현탁하였다. 혈관신생 분석을 위해, 마트리겔 (Fisher Scientific, Landsmeer, The NETHERlands #11523550)을 무혈청 EBM-2 배지에 1:1로 희석해 96웰 플레이트에 접종하였다 (50 ㎕). 중합 후, 세포를 실험 펩타이드 단편과 조합해, 마트리겔 (100 ㎕) 위에 부가하였다. 24시간 인큐베이션한 후 4X 대물렌즈로 미세혈관 네트워크의 사진을 촬영하고, ImageJ에서 플러그-인 혈관신생 분석기를 사용해 분석하였다.

상처-치유에서 혈관신생은 안지오포이에틴 1 (ANG1) 대 안지오포이에틴 2 (ANG2)의 조절을 요한다 (도 11 참조).

안지오포이에틴 패밀리 (Ang-1-4)는 생리학적 혈관신생 및 병리학적 신혈관형성의 조절에 중대한 역할을 담당하는 것으로 밝혀져 있다. VEGF 및 안지오포이에틴은 혈관 발생 및 배아 발생 중에 독립적인 역할을 하면서 함께 기능하고; VEGF는 혈관형성 중에 초기에 작용하고, Ang-1은 혈관 리모델린, 성숙화 및 안정화 중에 후기에 작용한다. 안지오포이에틴 1 및 2는 생체내 및 시험관내 모델에서 조사되었다. Ang-1은 VEGF의 많은 프로-혈관신생 특성을 공유하는 잘 확립된 분리형 70KDa 리간드로서, VEGF에 의해 자극된 경내피 투과성에 대응함으로써 혈장 누출 증가에 대해 혈관을 보호한다. Ang-1은 주로 혈관 내피에서 도처에 발현되는 막관통 수용체 티로신 키나제 (Tie2)를 통해 신호를 보내고, 휴지 혈관 (quiescent vessel)에서 인산화된다. Ang-1은 호중구, 내피 세포 및 섬유모 세포와 같은 수종의 세포와 인테그린을 통해 상호작용해, 생존, 세포 부착 및 이동을 매개한다. Ang-1은 Ang-1 null 마우스에 의해 입증된 바와 같이 혈관 발생의 필수적이고 중요한 조절자이며, 그래서 배아 측면에서 치명적이다. 이와는 대조적으로, Ang-1 및 Tie2 신호전달의 길항제는 일반적으로 건강한 성체 조직에서는 발현되지 않고, 치유 중인 상처와 같은 염증 및 혈관 리모델링 중인 분비성 조직에서 발현된다.

상처 치유 저하에 기여하는 인자들 (도 12 참조).

만성 당뇨병성 궤양은 미국에서 매년 42,500건 이상의 비-외상성 하지 절단의 원인이며, 당뇨병으로 인한 건강 관리 비용의 27%를 차지한다. 당뇨병성 피부 상처 치유의 표현형 손상은 입증된 여러가지 내인성 및 외인성 인자들과 연관되어 있다. 당뇨병성 환자뿐 아니라 1형 및 2형 당뇨병 뮤라인 모델에서 상처는 혈관신생, 재-상피화 및 상처 봉합에 결함을 나타낸다. 초기 재-상피화는 혈관신생에 의존하지 않지만, 완전한 치유 및 성숙화는 혈관신생 활동에 참여하는 수종의 세포들의 혈관 반응과 세포-매트릭스 상호작용에 의해 밀접하게 조절된다. 혈관신생에서의 결손은 잘 관리되지 못한 혈당 수준과 내피 세포 (EC) 및 내피 전구 세포 (EPC) 둘다에서의 관련한 혈관 결함에 기인하였다. 당뇨병에서 신혈관형성의 결함은 대사 교란 (metabolic derangement)의 결과로서 상처 치유시 허혈증에 대한 손상된 반응과 관련있는 것으로 알려져 있지만, 이러한 막연한 이해를 넘어, 당뇨병에서 허혈성 조직을 재혈관화하는 손상된 능력은 충분히 파악되어 있지 않다. 이러한 손상을 설명하는 잠재적인 기전은 혈관 내피 성장인자 (VEGF), 안지오포이에틴-1 (Ang-1)과 같은 혈관신생 성장인자 및 이들의 수용체의 발현의 감소이다. 2형 당뇨병 개체의 하지 상처 주위 부위에서 취한 피부 샘플 (상처 가장자리에서 1 cm 이내에 위치한 피부)에서는 비-당뇨병 개체의 피부 조직에 비해 VEGF (46%) 및 Ang-1 (36%)이 현저하게 적게 발현되었다. 많은 그룹들이 손상된 신혈관형성을 당뇨병성 상처의 봉합 지연과 연관시키는 증거들을 입증한 바, 나아가 VEGF, Ang-1, EGF, bFGF 및 HIF1-α와 같은 혈관신생 성장인자 및 이들 인자의 조합의, 재조합 성장인자 요법 또는 유전자 전달을 통한 보충이 신혈관형성 및 당뇨병성 상처 봉합의 결과를 개선하는데 긍정적인 영향을 미친다.

C-펩타이드 결핍 결정 (도 13 참조).

Panero 등 (Fasting plasma C-peptide and micro- and macrovascular complications in a large clinic-based cohort of type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 2009 Feb;32(2):301-5)은 미세혈관 혈관병증을 가진 T1D 환자들에서 잔류 베타-세포 기능을 분석하였으며, 공복 혈장 C-펩타이드를 측정함으로써 C-펩타이드 결핍을 분석하였다 (정상 수치 0.36-1.17 nmol/l; Diagnostics Product Corporation, Los Angeles, CA). 그 이후, 미세혈관 (망막병증, 미세알부민뇨 및 거대알부민뇨, 및 당뇨병성 말초 신경병증 (DPN)) 및 거대혈관 합병증 (심근경색, 협심증, 관상 동맥 바이패스 이식, 뇌졸중 및 말초 동맥병증)과 독립적으로 연관된 변수들을 조사하기 위해, 로지스틱 회귀 분석을 수행하였다. C-펩타이드의 독립적인 역할은 이의 분포의 삼분위를 이용해 조사되었다 (<0.06, 0.06-0.10 및 0.11-2.76 nmol/l). 최하위 삼분위 (<0.06 nmol/l)에서 공복 C-펩타이드 값과 관련하여, 값이 높을수록 미세혈관 합병증의 유병률 감소와 연관되어 있었다 (교차비 [OR] 0.59 [95% CI 0.37-0.94]). 거대혈관 합병증과의 연관성은 명확하지 않았다 (0.77 [0.38-1.58]).

Qiao 등 (C-peptide is independent associated with diabetic peripheral neuropathy: a community-based study. Diabetol Metab Syndr 9, 12 (2017))은 2형 당뇨병 환자에서 잔류 C-펩타이드 및 DPN 간의 연관성을 조사하였다. 당뇨병 기간이 길어짐에 따라 섬 기능이 점진적으로 소실되어, C-펩타이드 및 인슐린 수준은 감소하고 DPN 유병률은 증가한다. non-DPN 군에서 공복 C-펩타이드, 식후 2-h C-펩타이드 및 ΔC-펩타이드 (즉, 식후 2-h C-펩타이드 - 공복 C-펩타이드) 혈청 농도는 임상적인 DPN 군 (모든　P　≤　0.040), 및 확증된 DPN 군 (모든　P　<　0.002)에서와 비교해 현저하게 더 높았다. 3종의 C-펩타이드 매개변수는 독립적으로 나이, 성별, 당뇨병 지속 기간, 흡연 상태, 수축기 혈압, 체질량 지수, 안지오텐신-변환 효소 저해제/안지오텐신 수용체 차단제 사용, 공복 혈장 글루코스, HbA1c, 트리글리세라이드 및 추정의 사구체 여과율에 대해 조정한 이후에, DPN과 독립적으로 연관성이 있다. ΔC-펩타이드 사분위 1 (참조)과 비교해. 사분위 3 (교차비 [OR], 0.110; 95% 신뢰구간 [CI] 0.026-0.466;　P　=　0.003) 및 사분위 4 (OR, 0.012; 95% CI 0.026-0.559;　P　=　0.007) 환자는 교란변수들에 대해 조정시 DPN 위험도가 더 낮았다. C-펩타이드는 ADVIA Centaur XP 자동 분석기 (Siemens Healthcare Diagnostics)에서 샘플 부피 200 ㎕를 이용한 화학발광 (Siemens Healthcare Diagnostics, Malvern, USA)에 의해 측정하였다. 이러한 연구들을 통해, DPN 환자들에서 공복 C-펩타이드 결핍이 1 nmol/L 미만, 보다 구체적으로 0.5 nmol/L 미만, 보다 구체적으로 0.3 nmol/L 미만, 보다 구체적으로 0.3 nmol/l 미만, 보다 구체적으로 0.2 nmol/L 미만, 보다 구체적으로 0.1 nmol/L 미만, 보다 구체적으로 0.06 nmol/L 미만의 값으로 증가하여 존재하는 것으로, 강조되었다. 이러한 환자들을 더 잘 구별하기 위해, 식후 C-펩타이드 수준을 결정함으로써 (예를 들어, Qiao 등에 의해 제공된 바와 같이) 추가적인 분석이 수행할 수 있었으며, 이로써 임상적으로 관련있는 C-펩타이드 결핍이 식후에 이미 1 nmol/L 미만에서 확인할 수 있었다. ΔC-펩타이드 (즉, 식후 2-h C-펩타이드 - 공복 C-펩타이드, 예를 들어 Qiao 등의 문헌에 제공된 바와 같이)의 결정은 환자가 C-펩타이드 결핍인지를 추가로 확인할 수 있다. 일반적으로, ΔC-펩타이드가 1 nmol/L 미만인 환자는 DPN 위험이 있는 것으로 간주한다.

추가적인 용량-확인 실험 이후에 가변적일 수 있는, 제형 예.

실시예 1

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M-크레오솔--25 ㎎, 글리세롤--160 ㎎, 0.9% NaCl, 선택적으로 조성물 부피 1 ℓ 및 원하는 최종 pH를 만들기에 충분한 물 및 10% 염산 또는 10% 수산화나트륨.

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인간 단기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 50

LQGVLPAL-타르트레이트 + 중기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

LQGVLPAL-타르트레이트 --1.8 mol

인간 중기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 51

VLQAVLPP-타르트레이트 + 단기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

VLQAVLPP-타르트레이트 --1.8 mol

인간 단기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 52

PGAYPGQA-타르트레이트 + 중기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

PGAYPGQA-타르트레이트 --1.8 mol

인간 중기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 53

AQGV-타르트레이트 + 즉효성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

AQGV-타르트레이트 --1.8 mol

인간 즉효성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 54

LQGVL-타르트레이트 + 즉효성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

LQGVL-타르트레이트 --1.8 mol

인간 즉효성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 55

AQGLQ-타르트레이트 + 즉효성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

AQGLQ-타르트레이트 --1.8 mol

인간 즉효성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 56

LQGLQ-타르트레이트 + 단기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

LQGLQ-타르트레이트 --1.8 mol

인간 단기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 57

QAQGVALQ -사이트레이트 + 단기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

QAQGVALQ-사이트레이트 --1.8 mol

인간 단기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 58

LQGVLPAL-사이트레이트 + 단기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

LQGVLPAL-사이트레이트 --1.8 mol

인간 단기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 59

VLQAVLPP-사이트레이트 + 단기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

VLQAVLPP-사이트레이트 --1.8 mol

인간 단기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 60

PGAYPGQA-사이트레이트 + 중기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

PGAYPGQA-사이트레이트 --1.8 mol

인간 중기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 61

AQGV-사이트레이트 + 즉효성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

AQGV-사이트레이트 --1.8 mol

인간 즉효성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 62

LQGVL-사이트레이트 + 즉효성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

LQGVL-사이트레이트 --1.8 mol

인간 즉효성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 63

AQGLQ-사이트레이트 + 단기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

AQGLQ-사이트레이트 --1.8 mol

인간 단기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 64

LQGLQ-사이트레이트 + 단기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

LQGLQ-사이트레이트 --1.8 mol

인간 단기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 65

VGVAPGVGVAPGVGVAPG-사이트레이트 + 중기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

VGVAPGVGVAPGVGVAPG-사이트레이트 --1.8 mol

인간 중기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 66

QVGQVELGGGPGAGSLQP-사이트레이트 + 중기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

QVGQVELGGGPGAGSLQP-사이트레이트 --1.8 mol

인간 중기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 67

GAYPGAPGAYPGAPAPGV-사이트레이트 + 중기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

GAYPGAPGAYPGAPAPGV-사이트레이트 --1.8 mol

인간 중기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 68

VGVAPGVGVAPGVGVAPG-사이트레이트 + 장기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

VGVAPGVGVAPGVGVAPG-사이트레이트 -2.4 mol

인간 장기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 69

QVGQVELGGGPGAGSLQP-사이트레이트 + 장기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

QVGQVELGGGPGAGSLQP-사이트레이트 -2.4 mol

인간 장기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

실시예 70

GAYPGAPGAYPGAPAPGV-사이트레이트 + 장기-작용성 인슐린

조성물 1 ℓ를 제조하기 위해 하기 성분 혼합:

GAYPGAPGAYPGAPAPGV-사이트레이트 -2.4 mol

인간 장기-작용성 인슐린 (2800 U/mg)--100000 U

Claims

개체의 혈관병증의 예방 또는 치료에서 혈관신생 활성 (angiogenic activity)을 유도하는 것을 포함하는 혈관신생 조절에 이용하기 위한 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터로서,
상기 모듈레이터는 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고,
상기 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 모듈레이터.
제1항에 있어서, 신장병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 모듈레이터.
제1항 또는 제2항에 있어서, 말기 신장 질환의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 모듈레이터.
제1항에 있어서, 망막병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 모듈레이터.
제1항 또는 제4항에 있어서, 실명의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 모듈레이터.
제1항에 있어서, 신경병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 모듈레이터.
제1항 또는 제6항에 있어서, 말초 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 모듈레이터.
제1항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 당뇨병성 궤양의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 모듈레이터.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 혈당 조절을 달성하거나 또는 혈당 조절을 유지하기 위해 치료받는, 모듈레이터.
제9항에 있어서, 상기 개체가 혈당 조절을 달성하거나 또는 혈당 조절을 유지하기 위해 인슐린으로 또한 치료받는, 모듈레이터.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈관병증이 당뇨병성 혈관병증을 포함하는, 모듈레이터.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 C-펩타이드 결핍된 상태이거나 또는 결핍된 것으로 의심되는, 모듈레이터.
성장인자 및 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터의 제형으로서,
상기 모듈레이터가 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고,
상기 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제형.
제13항에 있어서, 상기 성장인자가 혈당 조절을 위해 이용하기 위한 인슐린과 혈관신생 조절을 위해 이용하기 위한 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 포함하는, 제형.
제13항 또는 제14항에 따른 제형을 포함하는 약학적 제형.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에서 혈관병증의 예방 또는 치료를 위해 혈관신생 활성을 유도하는데 이용하기 위한 것인, 제형.
제16항에 있어서, 신장병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 제형.
제16항 또는 제17항에 있어서, 말기 신장 질환의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 제형.
제16항에 있어서, 망막병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 제형.
제16항 또는 제19항에 있어서, 실명의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 제형.
제16항에 있어서, 신경병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 제형.
제16항 또는 제21항에 있어서, 말초 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 제형.
제16항, 제21항 또는 제22항에 있어서, 당뇨병성 궤양의 예방 또는 치료에 이용하기 위한 것인, 제형.
제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈관병증이 당뇨병성 혈관병증을 포함하는, 제형.
제13항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 C-펩타이드 결핍된 상태이거나 또는 결핍된 것으로 의심되는, 제형.
개체에 mTOR의 자가포식 저해성 모듈레이터를 투여하는 것을 포함하는, 개체의 혈관병증의 예방 또는 치료에서 혈관신생 활성을 유도하는 방법으로서,
상기 모듈레이터가 아미노산의 공급원, 바람직하게는 펩타이드를 포함하고,
상기 아미노산이 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P), 아르기닌 (R) 및 아스파라긴 (N)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.