KR20230079126A - 혈관 투과성 문제를 해결하는 자가포식-저해성 펩타이드 및 이의 유기산 염 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로 생명공학 및 의약에 관한 것이며, 약학적 화합물로서 이용가능한 자가포식-저해성 펩타이드의 공급원 및 염에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산들의 공급원을 세포에 제공하는 단계를 포함하는, 세포의 포르밀-펩타이드-수용체 (FPR)에 의해 매개되는 p38 MAPK 키나제 활성을 낮추는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 일반적으로 생명공학 및 의약에 관한 것이며, 혈관 장벽 기능을 조절할 수 있는, 특히 부종, 유해한 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압을 유발할 수 있는 유해한 혈관 투과성을 조절할 수 있는 약학적 화합물로서 이용가능한 약학적 화합물, 수성 용액 및 염에 관한 것이다. 본 발명은 예를 들어 중환자에서 흔히 발견되는 유해한 혈관 투과성 문제를 치료하기 위한 약학적 제형, 용액, 방법 및 이러한 해법을 달성하기 위한 수단을 제공한다.
중환자의 경우 적절한 수액 소생법 (fluid resuscitation)을 이용하여 심박출량, 전신 혈압 및 신장 관류를 회복시키는 것이 필수적이다. 적절한 수준으로 용적 관리를 달성하기 위해서는 기본적인 병리생리학에 대한 지식, 용적 상태 평가, 용적 보충을 위한 적절한 용액의 선택과 조직 관류의 유지 및 조절이 필요하다. 다수의 최근 연구들에서, 체액 과부하 (긍정적인 체액 균형으로도 언급됨)와 사망률 간의 상관관계가 중환자들에서 확립되었다. 체액 과부하 인지와 평가에는 흡입 및 배출에 대한 정확한 기록이 필수적이지만, 평가, 검토 및 활용 방식에는 큰 차이를 보인다. 용적 평가 실수로 필수적인 치료 결여 또는 불필요한 수액 투여가 발생할 수 있는데, 이러한 2가지 시나리오는 사망률 증가와 연관되어 있어, 적절한 요법을 위해서 용적 상태를 정확하게 평가하여야 한다. 체액 상태를 평가하기 위한 방법들이 여러 가지 있지만, 현재 이용되는 대부분의 검사는 상당히 부정확하다. 이뇨제, 특히 루프 이뇨제가 유효한 치료 대안으로 남아있다. 의학적 요법에 불응성인 체액 과부하시에는 체외 요법 (extracorporeal therapy)을 적용하여야 한다. 체액 과부하는 전형적으로 사망률 증가와 연관성이 있으며, 또한 폐부종, 심부전, 상처 치유 지연, 조직 파괴 및 장 기능 손상과 같은 여러가지 합병증을 유발할 수도 있다. 따라서, 용적 상태 평가는 중환자를 조기에 관리하는데 중요하며, 질병이 심각해질 위험이 있는 환자의 경우에는 훨씬 더 중요할 것이다. 이뇨제가 흔히 초기 요법으로 사용되지만, 제한된 효과로 인해 체액 과부하를 치료하기 위해서는 흔히 지속적인 신장 대체 기법을 사용하여야 한다. 체액 과부하에 대한 치료 성공은 개별 용적 상태에 대한 정확한 평가, 한외여과를 이용한 체액 관리 원칙 이해 및 명확한 치료 목표에 달려있다. 아울러, 과도한 수액 투여로 인한 잠재적인 위험에 대한 기계론적 이해 개선 (Marik PE. Iatrogenic salt water drowning and the hazards of a high central venous pressure. Ann Intensive Care. 2014 Jun 21;4:21)과 긍정적인 체액 균형을 높은 사망률과 연관짓는 새로운 관찰 데이터 (Sakr et al; Higher Fluid Balance Increases the Risk of Death From Sepsis: Results From a Large International Audit. Crit Care Med. 2017 Mar;45(3):386-394)는 대량 수액 요법의 패러다임을 최근 제기하였다.
즉, 즉각적인 정맥내 수액 요법이 환자들에 대한 근본적인 치료법이지만, 소생술에서 정맥내 수액을 투여하기 위한 최적의 접근 방식은 알려져 있지 않으며, 환자의 혈관 투과성 문제에 대한 종종 승압제의 사용으로 더욱 복잡해진다. 경쟁적인 2가지 소생 전략이 등장하였다 - 처음 다량의 수액 [처음 6시간 동안 50 - 75 ml/kg (4-6 L/80 kg 성인)] 투여와 이후 승압제 사용으로 구성된 자유로운 수액 방식과, 처음에는 소량의 수액 [≤30 ml/kg (≤2-3 L)]과 혈압 및 관류를 유지하기 위해 승압제를 조기에 주입하는 것으로 구성된 제한적인 수액 방식. 조기 수액 요법은 정맥 환류 및 심박출량을 증가시킴으로써 조직 관류를 강화 또는 유지할 수 있다. 그러나, 수액 투여는 주요 장기에 부종을 유발하여 장기 기능부전 및 산소 전달 장애를 일으킴으로써 유해한 영향을 미칠 수 있다. 반대로, 제한적인 수액 방식은 주로 저혈압을 역전시키고 관류를 유지하는데에는 승압제에 의존하고, 수액 투여는 제한적이다. 이들 2가지 전략은 이의 사용을 뒷받침하는 몇가지 증거가 있지만, 어떤 전략이 다른 전략보다 유용함을 검증하는 확실한 데이터가 부족하여, 임상적 그리고 과학적으로 평형 상태이다. 아울러, 여러가지 타입의 소생 수액들이 있다. 주 분류 2종은 결정질액과 콜로이드로 구별된다. 결정질액은 전형적으로 소분자이고, 저렴하고, 사용하기 용이하고, 즉각적인 수액 소생을 제공하지만, 부종을 증가시킬 수 있다. 콜로이드는 더 큰 분자로서, 더 비싸고, 혈관내 공간에서 더 빠른 용적 팽창을 제공할 수 있지만, 알레르기 반응, 혈액 응고 장애 및 신부전을 유발할 수 있다.
여러가지 형태와 기능을 가진 혈관들로 구성된 맥관 구조는 혈액을 모든 조직들로 분배하며, 생리학적 조직 항상성을 유지시킨다. 특히, 항상성 유지에 있어 이의 중추적인 역할을 예시하는 것으로서, 맥관 구조는 폐에서 조직으로의 가스 교환 (특히, 산소 (및 그 반대의 경우 특히 이산화탄소))의 주요 운반체로서 작용할 뿐 아니라 영양분을 장에서 간으로 조직으로, 그리고 대사로부터 생성된 독성 부산물을 조직에서 신장으로 배출하기 위해 뇨로 운반한다.
혈관 투과성은 건강한 인간에서 중요한 기능이지만, 다양한 병리학적 상태에서는 맥관 구조가 흔히 질환 과정에 의해 영향을 받아 이에 참여한다. 이는 주로 부종, 유해한 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압을 동반한 유해한 혈관 투과성을 초래하며, 또한 혈류가 불량한 새로운, 불안정한 저-투과성 혈관이 과도하게 생길 수 있는데, 이는 저산소증 및 질환 증폭을 추가로 촉진한다. 만성적인 유해한 혈관 투과성 역시 암의 전이성 전파를 촉진한다. 그래서, 건강 및 질환에서 혈관 생물학의 중요한 측면, 즉 혈관 투과성의 조절에 대해 더 많은 강력한 학습 동기가 부여된다.
여러 혈관과 여러 장기에 존재하는 내피 세포는 기능 및 형태 측면에서 구분되지만 (Aird WC. Molecular heterogeneity of tumor endothelium. Cell Tissue Res. 2009;335:271-81), 일반적으로 혈액과 조직 사이에 장벽을 제공하는 역할을 한다. 뇌 및 내분비 기관과 같은 특정 장기의 경우에는, 내피 세포는 장기와 순환계 간의 교류 필요성을 반영하는 형태학적 특징을 가진다. 뇌 맥관 구조는 특히 강력한 장벽, 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 형성해, 뇌 실질을 유해한 부종으로부터 보호한다. 내분비 췌장과 같은 호르몬-생산 장기에는 내피 세포가 그 표면 위에 특별한 창 (specialized fenestrae)을 제공한다. 이것은 원형질 막 내 횡경막으로 덮인 '구멍'으로서, 호르몬을 매우 빨리 세포외 배출시킬 수 있다. 대부분의 장기에서는 내피 세포가 혈액과 조직 사이의 동적 장벽을 형성한다. 맥관 구조는 휴지 상태에서는 용질과 소분자를 계속적으로 누출하지만, 더 큰 분자 및 세포의 혈관외유출은 제한한다. 암을 비롯한 다수의 질환들에서는 혈관 장벽이 붕괴되어 누출이 증가하고, 만성화될 수 있다. 더 큰 분자와 세포의 누출은 부종, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압을 야기할 수 있으며, 종종 질환 진행을 유발할 수 있다.
예를 들어 브래디키닌과 같은 키닌은 내피 장벽 기능에 영향을 미치는 일련의 생리학적, 때때로 병리학적 혈관 반응에 참여하는 것으로 잘 알려져 있다. 이의 작용 대부분이 B1 및 B2로 명명된 2 G 단백질-커플링된 수용체의 활성화에 의해 매개된다. 키닌 수용체의 활성화는 미세혈관신생 촉진, 혈관 평활근 세포 증식의 저해, 관상 혈관이완, 국소 산화질소 합성 증가 또는 항-혈전 작용을 통해 죽상동맥경화증 위험을 조절하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 브래디키닌 B1 수용체 (B1R)는 전형적으로 생리학적 조건에서는 존재하지 않지만, 예를 들어 COVID-19 질환에서 최근 보고된 바와 같이 조직 상해, 스트레스, 화상, 외상성 손상 이후에 강하게 유도될 수 있다.
조직 상해로 인한 손상은 B1R mRNA 발현과 유사한 des-Arg9-브래디키닌 (des-Arg9-BK) 반응성을 현저하고 시간-의존적으로 증가시킬 수 있다. 이것은 미토겐 활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 패밀리에 속하는 일부 구성원, 즉 세포외 신호-조절되는 키나제 (ERK) 및 p38 MAPK의 활성화를 유도한다. 선택적인 저해제를 이용해 ERK 경로가 아닌 p38 MAPK를 차단하면, 선택적인 B1R 작용제 des-Arg9-BK에 의해 유도된 상향 조절된 수축 반응이 현저하게 감소하고, 조직 손상에 의해 유도되는 유해한 혈관 투과성을 강화하는 B1R mRNA 발현의 유도가 크게 억제된다.
다른 스트레스 자극들 중에서도 혈류 장애로 인해 또는 폐포와 주변 모세혈관 간의 기체 교환 장애로 인해 저산소증에 노출되면, 이 역시 백혈구 및 혈소판과의 상호작용과 투과성에 변화를 유발하는 구조적인 변화가 혈관의 내피 세포 층에서 이루어진다. 이러한 구조적인 변화는 재차 내피 세포의 장벽 기능을 손상시켜, 부종, 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압 (도 1 참조)을 동반한 유해한 혈관 투과성과 같은 좋지 않은 혈관 효과를 야기하고, 폐에서 혈액으로 그리고 혈액에서 조직으로, 그 반대의 기체 교환을 더욱 악화시킬 수 있다.
스트레스에 대한 반응으로 잘 규명된 세포골격 변화들 중 한가지는 액틴 세포골격의 재구성과 스트레스 섬유의 형성이다. Kayali 등 (J Biol Chem (2002) 277(45): 42596-602)은 저산소증에 대한 반응으로 폐 미세혈관 내피 세포에서 세포골격의 변화와 이러한 과정과 관련한 잠재적인 기전들을 언급하였다. 저산소증-유도된 액틴 재분배는 저산소증에 반응하여 폐 내피 세포에서 활성화되는 MAPK p38의 하류 구성성분에 의해 매개되는 것으로 보인다. 그 결과로 P38의 기질인 키나제 MK2가 저산소증에 의해 활성화되어, 이의 기질들 중 하나, 즉 HSP27의 인산화가 유도되는 것으로 보인다. 다른 예로서, F-액틴 재정렬은 또한 화상-유발성 내피 장벽 기능부전시 발생하는 초기 현상으로, HSP27이 p38 MAPK/MK2 경로의 표적으로서 액틴 다이나믹스에서 중요한 역할을 담당한다. HSP27 인산화가 액틴 분포를 변형시켜 세포의 수축성을 변화시키는 것으로 알려져 있어, Kayali 등은 p38-MK2-HSP27 경로가 예를 들어 저산소증에서 관찰되는 바와 같이 액틴 재분배로 인해 혈관 투과성에 변화를 유발하는 것으로 제시하였다.
이러한 결과들을 종합하면 조직 손상이 p38-MK2-HSP27 경로를 자극해 액틴 세포골격에 현저한 변화를 일으키는 것으로 보인다. 또한, p38 MAPK 경로의 저해가 내피 세포 수축을 현저하게 낮춤으로써 혈관 기능장애를 개선하는 것으로 이전에 공지된 바 있다 (Wang et al, APMIS (2014) 122(9):832).
최근 또 다른 경로에서 PI3K/AKT/mTOR [포스파티딜이노시톨 3' 키나제 (PI3K), 단백질 키나제 B (PKB 또는 AKT) 및 라파마이신의 포유류 표적 (mammalian target of rapamycin, mTOR)] 경로가 내피 세포의 수축성을 조절하는데 필연적인 것으로 동정 되었으며, Tsuji-Tamura 및 Ogawa (Journal of Cell Science 2016 129: 1165-1178)는 실제 혈관 내피 세포에 의해 좌우되는 혈관 투과성을 회복하는데 필요한 내피 세포의 신장에 대한 강력한 유도물질로서 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)-Akt-경로의 저해제와 mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1)의 저해제를 동정하였다. 이러한 신장은 세포가 p38-MK2-HSP27 및/또는 PI3K/AKT/mTOR 신호전달에 의한 세포골격 재구성 후 세포 수축시 내피 세포 사이에 형성된 갭을 채우기 위해 필요하다. 이들 갭을 통해 유해한 누출 및 유해한 혈관외유출이 이루어지며, 이는 발생된 부종, 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압 위험을 동반한 혈관 체액 소실을 설명해준다 (도 1 참조).
이들 갭의 폐쇄는 일반적으로 혈관 투과성이 증가된 부위에서 안지오포이에틴-2 대 안지오포이에틴-1과 같은 다양한 혈관신생 인자들의 비율에 의해 좌우되는데, 안지오포이에틴-2는 일반적으로 내피 세포의 세포자살을 유도 (갭 형성 강화)하는데 반해 안지오포이에틴-1은 내피 세포 신장과 갭 폐쇄를 촉진함으로써 갭 형성을 억제한다. p38 경로의 저해는 안지오포이에틴-2-매개 내피 세포의 세포자살을 약화시키지만, ERK1/2 경로의 저해는 그렇지 않다 (Li et al, Exp Ther Med. 2018 Dec; 16(6): 4729-4736. Published online 2018 Oct 1)). 아울러, PI3K/AKT/mTOR 경로는 질소 산화물 및 안지오포이에틴과 같은 다른 혈관신생 인자의 발현을 조절한다 (Karar and Mayti, Front. Mol. Neurosci., 02 December 2011, https://doi.org/10.3389/fnmol.2011.00051).
즉, p38/ p38-MK2-HSP27 및/또는 PI3K/AKT/mTOR 경로 - 세포골격 수축 신호 전달 - 에서 신호전달 현상의 저해는 혈관 투과성을 감소시키고, 그에 따라 유해한 투과성 및 유해한 혈관외유출을 감소시키고, 그에 따라 발생되는 부종, 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압 위험을 동반한 혈관 체액의 감소를 낮춘다. 이러한 저해를 달성하기 위한 제형, 방법 및 수단들이 본 발명의 과제이다.
1van den Blink B, Branger J, Weijer S, Deventer SH, van der Poll T, Peppelenbosch MP. Human endotoxemia activates p38 MAP kinase and p42/44 MAP kinase, but not c-Jun N-terminal kinase. Mol Med. 2001 Nov;7(11):755-60.
2O'Toole T, Peppelenbosch MP. Phosphatidyl inositol-3-phosphate kinase mediates CD14 dependent signaling. Mol Immunol. 2007 Mar;44(9):2362-9.
3Versteeg HH, Nijhuis E, van den Brink GR, Evertzen M, Pynaert GN, van Deventer SJ, Coffer PJ, Peppelenbosch MP. A new phosphospecific cell-based ELISA for p42/p44 mitogen-activated protein kinase (MAPK), p38 MAPK, protein kinase B and cAMP-response-element-binding protein. Biochem J. 2000 Sep 15;350:717-22.
4Bos CL, Diks SH, Hardwick JC, Walburg KV, Peppelenbosch MP, Richel DJ. Protein phosphatase 2A is required for mesalazine-dependent inhibition of Wnt/beta-catenin pathway activity. Carcinogenesis. 2006 27:2371-82.
본 발명은 환자, 바람직하게는 인간 환자의 혈관 투과성 문제를 해결하거나 및/또는 수액 소생 (fluid resuscitation)에 유용한 수성 제형 또는 용액을 제공하며, 여기서 상기한 제형 또는 용액은 바람직하게는 자가포식-저해성 아미노산들 (autophagy inhibiting amino acids)의 공급원을 포함하고, 상기한 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기한 공급원은 상기한 아미노산을 적어도 50%로 포함하는 하나 이상의 펩타이드를 포함하고, 상기한 펩타이드는 유기산의 염으로서, 바람직하게는 말레산의 염으로서, 더 바람직하게는 타르타르산의 염, 가장 바람직하게는 구연산의 염으로서 존재한다. 바람직하게는, 상기한 제형은 적어도 아미노산의 적어도 75%가 자가포식 저해 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 환자, 바람직하게는 인간 환자의 혈관 투과성 문제를 해결하거나 및/또는 수액 소생술에 유용한 상기한 제형은 AQGVLPGQ-말리에이트, LQGVLPGQ-말리에이트, AQGLQPGQ-말리에이트, LQGLQPGQ-말리에이트, AQGV-말리에이트, LQGVL-말리에이트, AQGLQ-말리에이트 및 LQGLQ-말리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는 AQGVLPGQ-아세테이트, LQGVLPGQ-아세테이트, AQGLQPGQ-아세테이트, LQGLQPGQ-아세테이트, AQGV-아세테이트, LQGVL-아세테이트, AQGLQ-아세테이트 및 LQGLQ-아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 더 바람직하게는 AQGVLPGQ-타르트레이트, LQGVLPGQ-타르트레이트, AQGLQPGQ-타르트레이트, LQGLQPGQ-타르트레이트, AQGV-타르트레이트, LQGVL-타르트레이트, AQGLQ-타르트레이트 및 LQGLQ-타르트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 더 바람직하게는 AQGVLPGQ-사이트레이트, LQGVLPGQ-사이트레이트, AQGLQPGQ-사이트레이트, LQGLQPGQ-사이트레이트, AQGV-사이트레이트, LQGVL-사이트레이트, AQGLQ-사이트레이트 및 LQGLQ-사이트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 환자, 바람직하게는 인간 환자의 혈관 투과성 문제를 해결하거나 및/또는 수액 소생술에 유용한 상기한 제형은, AQGVLPGQ-말리에이트, LQGVLPGQ-말리에이트, AQGLQPGQ-말리에이트, LQGLQPGQ-말리에이트, LQGVL-말리에이트, AQGLQ-말리에이트 및 LQGLQ-말리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는 AQGVLPGQ-아세테이트, LQGVLPGQ-아세테이트, AQGLQPGQ-아세테이트, LQGLQPGQ-아세테이트, LQGVL-아세테이트, AQGLQ-아세테이트 및 LQGLQ-아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 더 바람직하게는 AQGVLPGQ-타르트레이트, LQGVLPGQ-타르트레이트, AQGLQPGQ-타르트레이트, LQGLQPGQ-타르트레이트, LQGVL-타르트레이트, AQGLQ-타르트레이트 및 LQGLQ-타르트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 더 바람직하게는 AQGVLPGQ-사이트레이트, LQGVLPGQ-사이트레이트, AQGLQPGQ-사이트레이트, LQGLQPGQ-사이트레이트, LQGVL-사이트레이트, AQGLQ-사이트레이트 및 LQGLQ-사이트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함한다. 추가적인 바람직한 구현예에서, 환자, 바람직하게는 인간 환자의 혈관 투과성 문제를 해결하거나 및/또는 수액 소생술에 유용한 상기한 제형은 AQGVLPGQ-말리에이트, LQGVLPGQ-말리에이트, AQGLQPGQ-말리에이트 및 LQGLQPGQ-말리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는 AQGVLPGQ-아세테이트, LQGVLPGQ-아세테이트, AQGLQPGQ-아세테이트 및 LQGLQPGQ-아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 더 바람직하게는 AQGVLPGQ-타르트레이트, LQGVLPGQ-타르트레이트, AQGLQPGQ-타르트레이트 및 LQGLQPGQ-타르트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 더 바람직하게는 AQGVLPGQ-사이트레이트, LQGVLPGQ-사이트레이트, AQGLQPGQ-사이트레이트 및 LQGLQPGQ-사이트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함한다. 추가적인 바람직한 구현예에서, 환자, 바람직하게는 인간 환자의 혈관 투과성 문제를 해결하거나 및/또는 수액 소생술에 유용한 상기한 제형은 AQGV-말리에이트, LQGVL-말리에이트, AQGLQ-말리에이트 및 LQGLQ-말리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는 AQGV-아세테이트, LQGVL-아세테이트, AQGLQ-아세테이트 및 LQGLQ-아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 더 바람직하게는 AQGV-타르트레이트, LQGVL-타르트레이트, AQGLQ-타르트레이트 및 LQGLQ-타르트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 더 바람직하게는 AQGV-사이트레이트, LQGVL-사이트레이트, AQGLQ-사이트레이트 및 LQGLQ-사이트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함한다. 추가적인 바람직한 구현예에서, 환자, 바람직하게는 인간 환자의 혈관 투과성 문제를 해결하거나 및/또는 수액 소생술에 유용한 상기한 제형은 LQGVL-말리에이트, AQGLQ-말리에이트 및 LQGLQ-말리에이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 바람직하게는 LQGVL-아세테이트, AQGLQ-아세테이트 및 LQGLQ-아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 더 바람직하게는 LQGVL-타르트레이트, AQGLQ-타르트레이트 및 LQGLQ-타르트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함하고, 더 바람직하게는 LQGVL-사이트레이트, AQGLQ-사이트레이트 및 LQGLQ-사이트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드를 포함한다. 다른 보다 더 바람직한 구현예에서, 환자, 바람직하게는 인간 환자의 혈관 투과성 문제를 해결하거나 및/또는 수액 소생술에 유용한 상기한 제형은 AQGV-말리에이트, 바람직하게는 AQGV-아세테이트, 더 바람직하게는 AQGV-타르트레이트, 더 바람직하게는 AQGV-사이트레이트를 포함한다.
또한, 본 발명은 세포, 바람직하게는 인간 세포에 아미노산을 포함하는 펩타이드를 제공하는 단계로서, 상기한 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계; 세포에 fMLP를 제공하고, fMLP 제공 후 상기한 펩타이드의 존재 및 부재하에 p38 MAPK의 인산화를 적절한 시점에, 바람직하게는 수분 경과시, 가장 바람직하게는 약 30초 내지 약 5분, 예를 들어 30초 내지 600초 경과 시점에 검출하는 단계; 결과들을 비교하여 인산화에 대한 펩타이드의 효과를 확인하는 단계를 포함하는, 환자, 바람직하게는 인간 환자의 혈관 투과성 문제를 해결하거나 및/또는 수액 소생술에 유용한 펩타이드 등의, p38 MAPK 키나제 활성을 낮출 수 있는 펩타이드를 식별하는 방법을 제공한다. 자가포식-저해성 AQGV-펩타이드를 검사한 결과, 프로토타입 FPR-리간드 fMLP를 이용한 FPR-발현 세포의 활성화가 PKB (AKT라고도 알려짐)(도 3a) 및 p38 MAPK 키나제 (도 3c)의 인산화 상태에 대해 빠르게 유도된 현저한 변화를 유발하는 것으로 검출되었지만, STAT3, JNK (도 3b) 및 P42/p44MAPK/ERK1,2 (도 3d) 키나제는 그렇지 않았다 (또는 검출되지 않음). 아울러, 본 발명은 또한 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산들로 이루어진 펩타이드를 세포에 제공하는 단계; 이 세포에 fMLP를 제공하는 단계; 및 FPR-자극 후 적절한 시간 경과시, 바람직하게는 수분 경과시, 가장 바람직하게는 약 30초 내지 약 5분, 예를 들어 30 내지 600초 경과 시점에 상기 펩타이드의 존재 및 부재하에 PKB (AKT)의 인산화를 검출하는 단계를 포함하는, 환자, 바람직하게는 인간 환자의 혈관 투과성 문제를 해결하거나 및/또는 수액 소생술에 유용한 펩타이드 등의, PI3K/AKT/mTOR 활성을 낮출 수 있는 펩타이드를 식별하는 방법을 제공한다. p38 MAPK에 대한 AQGV-펩타이드 효과 (도 3c)는 FPR-자극 후 30초 시점에 이미 검출되며, PKB(AKT)에 대한 AQGV-펩타이드 효과는 300초 시점에 2-상 패턴 (bi-phasic pattern)으로 뒤따른다 (도 3a). p38 및 PKB-매개 신호전달에 대한 AQGV-펩타이드 효과는 검사한 전체 600초 동안 지속되는 반면, 검사한 다른 키나제는 전반적으로 영향을 받지 않았다. 이러한 치료에 대한 빠른 특이적인 반응은 PI3K/AKT/mTOR 경로의 조절 맥락에서 p38 신호전달에 대한 자가포식-저해성-AQGV-펩타이드의 특이적이고 신속한 영향을 발휘하게 되므로, 이러한 경로는 단백질 분해와 단백질 생성 간에 균형을 좌우하여 세포골격 변화를 조절함으로써 혈관 투과성에 영향을 미친다. 이러한 활성은 AQGV-펩타이드로 검사한 STAT3, JNK (도 3b) 및 P42/p44MAPK/ERK1,2 (도 3d) 키나제에서는 검출되지 않는다. AQGV-펩타이드는 p38 MAPK 키나제 활성화된 변화를 감소시킬 뿐 아니라 내피 세포 수축 및 유해한 혈관 투과성에 영향을 미치는 세포의 세포골격의 재구성에 대한 PI3K/AKT/mTOR 활성화된 유도된 변화를 감소시키는 것으로 확인된다. 또한, 본 발명은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로 선택되는 아미노산들로 이루어진 펩타이드를 세포에 제공하는 단계; 상기 세포에 fMLP를 제공하고, fMLP 제공 후 적절한 시간 경과 시점에, 바람직하게는 수분, 가장 바람직하게는 약 30초 내지 약 5분, 예를 들어 30 내지 600초 경과 시점에 상기 펩타이드의 부재 및 존재하에 PKB (AKT)의 인산화를 검출하는 단계; 및 결과를 비교하여 인산화에 대한 펩타이드의 효과를 확인하는 단계를 포함하는, PI3K/AKT/mTOR 경로를 저하할 수 있는 펩타이드를 식별하는 방법을 제공한다. 식별된 AQGV-펩타이드는 인간 개체에서 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압을 동반한 부종으로 나타나는 바와 같이 유해한 혈관 투과성에 대해 유용하며, 이를 해결할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포, 바람직하게는 인간 세포에 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산들로 이루어진 펩타이드를 제공하는 단계; 상기 세포에 fMLP를 제공하고, fMLP 제공 후 적절한 시간 경과 시점에, 바람직하게는 수분, 가장 바람직하게는 약 30초 내지 약 5분, 예를 들어 30초 내지 600초 경과 시점에, 상기 펩타이드의 부재 및 존재하에 PKB (AKT)의 인산화를 검출하는 단계; 및 결과를 비교하여 인산화에 대한 펩타이드의 효과를 확인하는 단계를 포함하는, PI3K/AKT/mTOR 활성을 감소시킬 수 있는 펩타이드를 식별하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산들로 이루어진 펩타이드를 세포에 제공하는 단계; 상기 세포에 fMLP를 제공하고, fMLP 제공 후 적절한 시간 경과 시점에, 바람직하게는 수분, 가장 바람직하게는 약 30초 내지 약 5분 경과 시점에, 상기 펩타이드의 부재 및 존재하에 p38 MAPK 및/또는 PKB (AKT)의 인산화를 검출하는 단계; 및 결과를 비교하여 인산화에 대한 펩타이드의 효과를 확인하는 단계를 포함하는, 세포골격 재구성을 저하할 수 있는 펩타이드를 식별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 구분되는 새로운 유형의 약물에 관한 것이다: 라파마이신의 기계론적 표적, mTOR의 영양 감지 시스템 (nutrient sensing system)을 표적으로 하며 자가포식을 저해하는, 펩타이드 및/또는 아미노산을 포함하는 자가포식-저해성 화합물. 자가포식-저해성 AQGV-펩타이드의 포르밀-펩타이드 관련 신호전달 효과를 검사한 결과, 이 펩타이드는 혈관 투과성의 조절에서 신호에 의한 세포골격의 수축을 좌우하는 p38/p38-MK2-HSP27 및/또는 PI3K/AKT/mTOR 경로를 예상치 못하게도 약화시키는 것으로 밝혀졌다. 그래서, 본 발명은 혈관 투과성을 개선하기 위한, AQGV-펩타이드 및 이의 유사체 (기능적 균등물)로도 언급되는 본 발명의 자가포식-저해성 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 자가포식-저해성 펩타이드 또는 화합물은 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (본원에서 사용한 단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 프롤린 (P), 이소루신 (I) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산의 공급원이 제공된 분자 또는 조성물로서 정의된다. 상기한 (선택) 아미노산으로 구성된 자가포식-저해성 펩타이드를 가진 이들 화합물 수종은 예를 들어 US2005214943, US2008027007, (예, 본원에서 EA-230으로도 알려진 AQGV, LQGV, VLPALP 및 관련 펩타이드), US2016229890 (예, IMX942로도 알려진 RIVPA) 및 관련 펩타이드, 및 US2019315823 (VRLIVAVRIWRR-NH2, IDR-1018) 및 관련 펩타이드]에 개시되어 있다.
상기한 아미노산은 바람직하게는 전술한 아미노산 가닥 (펩타이드)을 본질적으로 (사이클릭 또는 분지형 형태의 펩타이드도 물론 적합하지만) 선형 형태로 포함하는 펩타이드 형태의 분자로 존재한다. 본 발명에서 AQGV-펩타이드는 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 자가포식-저해성 펩타이드로서 정의된다. 바람직한 구현예에서, 상기한 AQGV-펩타이드는 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함한다. 바람직하게는, AQGV-펩타이드는 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 구성된다. 바람직하게는, 펩타이드는 AQGV이다.
전형적으로, 본 발명은 자가포식-저해성 펩타이드 일군의 분자 작용 방식 (MoA)을 제공하므로, 그 효과가 반드시 이의 정확한 서열에 의존하는 것은 아니다. 대신, 이를 구성하는 아미노산은 mTOR의 영양-감지 시스템에 일반적인 하우스홀드 (household), "무-위험 또는 조직-복구" 신호를 제공하여; 자가포식의 저해를 유발하고, 질환의 해소를 달성하기 위한 것이다. 이러한 조직-복구 신호 분자는 세포에서 단백질 생성과 단백질 분해 사이의 균형을 변화시켜, 3단계로 질환을 해소할 수 있다:
1
투여된 펩타이드 또는 이의 아미노산 단편이 아미노산 수송, PEPT1/2 수송, 일반적인 엔도사이토시스 (endocytosis), 혈관 세포의 경우 엘라스틴 수용체 매개 엔도사이토시스 또는 식세포작용에 의해 흡수된다.
2
내재화된 펩타이드가 가수분해되어, 이의 아미노산이 mTOR의 영양-감지 시스템에 제공된다.
3
특정 아미노산이 자가포식을 저해하고, 이와 더불어 단백질 분해를 저해하고, 단백질 생성 분해 (proteogenic resolve) 및 약리학적 효과로 이어진다.
펩타이드 호르몬의 분해로부터 유래하거나 또는 본질적으로 자가포식-저해성 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하고 전술한 특징 하나 이상을 충족하는 새로운 합성 펩타이드로서 조립된 다양한 펩타이드들은, 다양한 동물 모델 마우스 또는 랫에서 맥관 구조에 라이닝된 내피 세포에 대한 효과를 통해 과도한 또는 유해한 - 국소 또는 전신 - 혈관 투과성에 대해 확실한 해결 방안을 제공하는 것으로 보인다. 관련한 자가포식 저해 기전을 이들 자가포식-저해성 화합물 및 관련 펩타이드 약물의 향후 임상 적용에 활용함으로써 질환을 합리적으로 치료하기 위한 흥미로운 새로운 방안을 제공한다. 그러나, 수종의 자가포식-저해성 펩타이드의 정맥내 적용 제형을 이용할 경우, 자가포식-저해 아미노산의 이용성을 떨어뜨리는 펩타이드 용해성 문제가 발생하므로, 펩타이드의 응집과 약학적 효과 감소를 방지하기 위해 펩타이드를 번거로운 대량의 원액으로 제공하여야 한다.
일반적으로, 약학적 펩타이드 조성물은 반대-이온 또는 염으로서 트리플루오로아세테이트를 이용해 합성한 다음, 트리플루오로아세테이트는 약학적 부형제로서 (아세트산으로부터) 반대-이온 아세테이트로 또는 선택 음이온으로 교환한다. 에탄산으로도 알려진 아세트산은 카르복시산으로 알려진 유기 화합물 유형에 속한다. 카르복시산은 식 -C(=O)OH의 카르복시산 기를 가진 화합물이다. 아세트산은 액체, (수) 용해성, (이의 pKa를 토대로) 약 산성 화합물로서 존재한다. 아세트산은 인간 간 및 신장 조직에서 발견된 바 있으며, 또한 변, 뇨, 모유 및 타액 등의 대부분의 생리학적 체액에서 검출된다. 아세트산은 세포 안에서 주로 세포질, 미토콘드리아 및 골지에 위치한다. 아세트산은 효모에서 인간에 이르는 모든 진핵생물들에 존재한다. 아세트산은 다수의 효소 반응에 참여한다. 아세테이트는 아세트산의 에스테르 또는 염이다. 아세트산의 염은 아세테이트로 알려져 있다. 소듐 아세테이트는 일반적으로 직접적인 인간 식품 성분으로서 안전한 (GRAS) 것으로 인정된다. 전술한 모든 특성들을 감안해, 아세테이트는 일반적으로 대부분의 약학적 펩타이드-염 제형에 사용하기 가장 적합한 옵션으로 간주되며, 널리 사용된다. 그러나, 정맥내 적용하기 위한 수종의 자가포식-저해성 펩타이드 제형을 이용하는 경우, 수성 용액 내에서 이용가능한 농도에서 원치않은 응집과 같은 펩타이드 용해성 문제가 발생한다. 최종적으로 용해성 문제와 응집은 자가포식-저해 아미노산의 선택적인 이용가능성을 저하하므로, 펩타이드의 응집과 약학적 효과 감소를 방지하기 위해 펩타이드를 번거로운 대량의 원액으로 제공하여야 한다.
응집에 대한 영향을 확인하기 위해 매우 다양한 염 및 용질들이 조사되었으며 (예, J. Phys. Chem. B 2013, 117, 27, 8150-8158; J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 4, 1299-1308), 단백질과 펩타이드가 실제 음이온-특이적이고 농도-의존적인 방식으로 용액에서 "염석 (salt out)"되는 것으로 밝혀졌다. IDR-1018 (VRLIVAVRIWRR-NH2) 및 관련 펩타이드는 포스페이트, 벤조에이트, 나이트레이트 및 사이트레이트와 같은 큰 다원자 음이온 (polyatomic anion)을 함유한 용액에서 심하게 응집되어 치료 효과를 상당히 상실하는 것으로 밝혀졌다. 설페이트 및 바이카보네이트 음이온뿐 아니라 클로라이드 및 아이오다이드 단원자 음이온 (monoatomic anion)을 함유한 용액에서는 이온 농도 200 mM 이상에서만 응집이 비교적 소량 관찰되었다. 흥미롭게도, 소듐 아세테이트 중에 조제된 IDR-1018은 어떠한 뚜렷한 응집이 유도되지 않았으며, 이는 이 음이온 (아세테이트)이 합성 펩타이드의 응집 특성에 대한 거대 다원자 음이온의 영향에 예외를 제공할 수 있음을 시사해준다 (Cell Chemical Biology, Volume 24, Issue 8 17 August 2017, Pages 969-980.e4).
용액 중에 펩타이드의 응집은, 실제 응집이 펩타이드의 생물학적 활성을 방해할 수 있고 응집이 유해한 면역 반응을 유발하는 경향이 있으므로, 합성 펩타이드 치료제를 설계할 경우에 항상 고려하여야 한다. 단량체들의 콜렉션으로서 합성 펩타이드는 거대 다원자 이온을 함유한 용액에서 훨씬 강하게 응집하는 것으로 알려져 있으며 이러한 용해성 문제는 쉽게 해결하기 어려운 것으로 간주되므로, 합성 펩타이드를 이용한 약학적 제제의 용해성 문제를 해결하는 것을 돕는 적절한 염을 식별하는 것이 유용할 것이다. 종종 문제가 되는 펩타이드의 아미노산 구성이 펩타이드 유형의 용해성을 예측하는데 도움이 될 수 있다.
일반적으로, 용매 선정 및 펩타이드 용해를 수행하기에 앞서, 펩타이드가 산성, 염기성 또는 중성인지를 확인하기 위해 펩타이드 서열을 조사하고, 펩타이드 용해성을 예측하거나 또는 설계하는 것을 돕기 위해 다음과 같은 단계들이 일반적으로 수행된다:
· 각 산성 (하전된) 잔기 (D, E 및 말단 COOH)에는 -1 값을 할당한다.
· 각 염기성 (하전된) 잔기 (K, R 및 말단 NH2)에는 +1 값을 할당한다.
· 각 H 잔기에는 pH<6에서는 +1을, pH >6에서는 0 값을 할당한다.
· 펩타이드 (D, E, K, R, 말단 COOH 및 NH2)의 총 전하 수를 계수한다.
· 펩타이드의 전체 순 전하 (net charge)를 계산한다.
- 전체 순 전하 < 0: 산성 펩타이드; 완충제에 10% NH4OH 또는 암모늄 바이카보네이트를 첨가하여 염기성 용액에서 이를 용해한다.
- 전체 순 전하 > 0: 염기성 펩타이드; 완충제에 10% 아세트산을 첨가하여 산성 용액에서 이를 용해한다.
- 전체 순 전하 = 0: 중성 펩타이드 : 펩타이드가 하전된 잔기 (예를 들어, D, K, R, H 및 E)를 >25%로 함유하는 경우, 이는 일반적으로 물 또는 수성 완충제에 용해성이다. 하전된 잔기가 25% 미만일 경우에는 유기 용매 (다이메틸 설폭사이드 (DMSO), 아세토니트릴 (ACN), 다이메틸포름아미드 (DMF)의 사용이 권장된다. 전제 서열이 소수성 아미노산 (예를 들어, W, L, I, F, M, V, Y)으로 구성된 경우를 제외한, 잔기 5개 미만으로 이루어진 매우 짧은 펩타이드는 통상적으로 물 또는 수성 완충제에 용해성이다. 아울러, 소수성 잔기 (W, L, I, F, M, V, Y, P, A)를 50% 이상 함유한 중성 펩타이드는 일반적으로 수성 용액에 거의 용해되지 않는다. 흔히 소수성 펩타이드를 100% 유기 용매 (DMSO, DMF 또는 ACN)에 용해한 다음 물 또는 완충제로 원하는 농도로 희석하는 것이 권장된다. 만일 펩타이드가 응집되면, 다른 용해화를 통해 더 낮은 희석 수준을 만들기 전 냉동-건조 단계를 이행하여야 한다.
DMSO는 이의 낮은 독성으로 인해 간단한 생물학적 적용시 이상적인 유기 용매이지만, 정맥내 (인간) 이용을 위한 약물을 제조하는 경우에는 DMSO 또는 ACN 또는 DMF 함유는 바람직하지 않다. 6M 우레아, 6M 우레아 + 20% 아세트산 또는 6M 구아니딘과 같은 변성제 첨가는 수소 결합 네트워크를 파괴함으로써 중성 펩타이드의 응집을 줄이는데 도움이 될 수 있다. 그러나, 이들 화합물은 대부분의 생물학적 시스템을 방해할 수 있으므로, 이의 적용은 다소 제한적이며, 전반적으로 비경구 용도의 약물 개발에 사용하기에는 재차 바람직하지 않다.
본 발명의 목적은 자가포식-저해성 아미노산을 필요로 하는 개체에게 가장 편리한 방식으로 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해성 펩타이드의 타르트레이트 또는 사이트레이트를 제공하며, 펩타이드는 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진다. 더 바람직하게는, 본 발명은 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해성 펩타이드의 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드-사이트레이트를 포함하는 원액 용액, 바람직하게는 수성 용액을 제공하며, 펩타이드는 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진다.
본 발명은 펩타이드의 응집을 완화하고, 상기에 정의된 바와 같이 중성인 자가포식-저해성 펩타이드의 염을 제조하기 위한 적합한 선택 반대-이온, 약학적 부형제 또는 음이온으로서 타르트레이트 (타르타르산으로부터, 바람직하게는 (+)-타르타르산으로부터), 더 바람직하게는 사이트레이트 (구연산으로부터)를 식별하기 위한 수종의 자가포식-저해성 펩타이드에 적합한 용액을 제공한다. 본 발명에 따른 중성 펩타이드의 응집에 대한 영향을 확인하기 위해 본원에서 다양한 염을 스크리닝하였으며, 실제 중성 펩타이드가 음이온-특이적이고 농도-의존적인 방식으로 용액에서 "염석 (salt out)"되는 것으로 드러났다. 수성 용액 중의 펩타이드-설페이트, 펩타이드-말리에이트, 펩타이드-아데노신 모노포스페이트 및 펩타이드-아데노신으로서 이러한 염의 응집점 (응집된 펩타이드-염이 용해되는 경향으로 되기 전 농도점)은 펩타이드-아세테이트 응집과 관련하여 악화된 응집을 보이는 것으로 밝혀졌지만, 놀랍게도 타르트레이트는, 더욱 놀랍게도 펩타이드-사이트레이트는 펩타이드-아세테이트와 비교해 수용액에서 (강한) 응집 감소를 나타내었다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 자가포식-저해성 펩타이드-염은 K, H 및 R로 이루어진 군으로부터 선택되는 하전된 잔기를 <25%로 포함한다. 더 바람직하게는, 자가포식-저해성 펩타이드는 D, K, R, H 및 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 하전된 잔기를 <25%로 포함한다. 가장 바람직하게는, 자가포식-저해성 펩타이드-염은 D, K, R, H 및 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 잔기를 포함하지 않으며, 따라서 정맥내 사용하기 위한 유체와의 pH 부적절성 문제를 회피한다. 아울러, 바람직하게는, 상기한 용액은 수성 용액이다. 가장 바람직한 구현예에서, 이 용액은 소위 원액 용액, 바람직하게는 수성 원액 용액이다. 원액은 일반적으로 활성 물질, 본원에서 자가포식-저해성 펩타이드-염의 농축 용액으로서, 이는 이러한 물질을 실제 사용하기 위한 일부 낮은 농도로, 이른바 작업 용액으로 희석될 것이다. 이러한 더 낮은 농도의 작업 용액은 예를 들어 주입 유체이며, 예를 들어, 중환자가 될 위험이 있는 환자 또는 이미 중환자에서, 예를 들어 병원의 중환자실 또는 전장에서 종종 관찰되는 바와 같이, 환자에게 요법을 투여하기 위한 원액으로부터 펩타이드가 공급되는 정맥내 또는 복강내 사용하기 위한 주입 유체이다. 이러한 상황에서 활성 (펩타이드) 약물을 주입 유체로 희석하기 위한 (원액)을 소량의 부피로 이용가능한 것이 유용하며, 종종 불가피한 것으로 간주된다. 용해와 준비 시간을 단축하고, 물질을 보존하고, 저장 공간을 줄이고, 사용할 더 낮은 농도의 용액을 조제하는데 있어 정확도를 개선하기 위해 일반적으로 소위 원액이 제공 및 사용된다. 약물의 원액을 흔히 제조한 다음 예를 들어 중환자에서 긴급한 정맥내 용도로 제공하거나 또는 보관한다. 그러나, 자가포식-저해성 펩타이드의 원액은 이의 기본적인 더 높은 펩타이드 농도로 인해, 늘 최종 작업 용액에 비해 펩타이드 약물 응집 위험을 내포한다. 원액은 일반적으로 다양한 주변 환경에서 가능한 장기 보관시 염석 현상을 방지하기 위해 대상 염의 응집 농도 (예, 40-50%)보다 충분히 낮은 농도로 조제된다. 펩타이드 응집 (염석) 위험은 본 발명에 따른 원액을 이용해 본원에서 회피하거나 또는 완화하기 위한 현상이다. 이러한 원액은 일반적으로 적합한 작업 용액을 제공하기 위해 10배 내지 100배 희석된다. 또한, 본 발명의 과제는 본 발명에 따른 펩타이드-염의 작업 용액을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명의 펩타이드 사용시 전형적으로 펩타이드 염이 비교적 높은 함량/농도로 제공되어야 하므로, 작업 용액은 염석 포인트에서 멀리 떨어져 있지만 상대적으로 작은 부피로 제공되는 것이 전제 조건이다.
중성 펩타이드의 응집에 대한 영향을 확인하기 위해 본원에서 다양한 염을 스크리닝하였으며, 실제 중성 펩타이드가 음이온-특이적이고 농도-의존적인 방식으로 용액에서 "염석"되는 것으로 드러났다. 펩타이드-설페이트 및 펩타이드-말리에이트가 펩타이드-아세테이트 응집과 관련하여 응집 악화를 나타내는 것으로 밝혀진 반면, 놀랍게도 타르트레이트는, 더욱 놀랍게도 펩타이드-사이트레이트는 펩타이드-아세테이트와 비교해 (강하게) 감소된 응집을 나타내었다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 자가포식-저해성 펩타이드-아세테이트 또는 자가포식-저해성 펩타이드-타르트레이트 또는 자가포식-저해성 펩타이드-사이트레이트의 (원액) 용액을 제공하며, 여기서 펩타이드의 농도는 >0.85 mol/L, 더 바람직하게는 >0.9 mol/L, 더 바람직하게는 >1 mol/L, 더 바람직하게는 >1.2 mol/L, 더 바람직하게는 >1.4 mol/L, 더 바람직하게는 >1.6 mol/L, 더 바람직하게는 >1.8 mol/L이다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드의 농도가 2 mol/L 내지 2.5 mol/L 범위인 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드 사이트레이트의 원액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드의 농도가 2.5 mol/L 내지 3 mol/L 범위인 펩타이드 사이트레이트의 원액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드의 농도가 3 mol/L 내지 3.5 mol/L 범위인 펩타이드 사이트레이트의 원액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드의 농도가 3.5 mol/L 내지 4.5 mol/L 범위인 펩타이드 사이트레이트의 원액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드의 농도가 4.5 mol/L 내지 5.5 mol/L 범위인 펩타이드 사이트레이트의 원액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드의 농도가 5.5 mol/L 이상인 펩타이드 사이트레이트의 원액을 제공한다. 바람직하게는, 원액은 수성 용액이다.
따라서, 본 발명은 부상하는 새로운 유형의 구별되는 약물: 자가포식을 선호적으로 저해하고 라파마이신의 기계론적 표적 mTOR의 영양 감지 시스템을 표적화하는 아미노산을 포함하는 소형 자가포식-저해성 펩타이드의 용해성을 개선하는데 기여한다. 전형적으로, 펩타이드는 본 발명의 목적에서 아미노산 50개 이하로 정의되고, 단백질은 아미노산 >50개를 가지는 것으로 정의된다. 본원에서 자가포식-저해성 펩타이드는 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 프롤린 (P), 이소루신 (I) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 함유한 펩타이드 서열을 포함하는, 아미노산 50개 이하로 이루어진 선형, 분지형 또는 원형 가닥으로서 정의된다.
이러한 군의 펩타이드의 분자 작용 방식 (MoA)은 펩타이드의 정확한 서열에 의존하지 않는다. 오히려, 이를 구성하는 아미노산이 mTOR의 영양-감지 시스템에 일반적인 하우스홀드, "무-위험 또는 조직-복구" 신호를 제공하여; 자가포식의 저해를 유발하고 질환의 해소를 달성하게 된다.
AQLPGVI 군
본 발명의 일 측면은 필요로 하는 것으로 간주되는 개체에 가장 편리한 방식으로 자가포식-저해성 아미노산을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진 펩타이드, 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해 펩타이드, 바람직하게는 이의 유기산 염, 예를 들어 말리에이트, 더 바람직하게는 아세테이트, 더 바람직하게는 타르트레이트, 가장 바람직하게는 사이트레이트를 제공한다.
응집 위험을 감안해, 임상 시험에 사용하기 위한 본원에서 상기에서 정의된 AQGV-펩타이드의 (원액) 용액이 수용된 바이얼은 용액에 활성 물질을 (0.8 mol/L) 이하로 함유한다. 본 발명에 기반하여, 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 유기산의 AQGV-염, 특히 새로운 AQGV-펩타이드-말리에이트, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 상기한 원액 용액이, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드 타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트를 적어도 0.85 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 0.9 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.2 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.4 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.6 mol/L, 가장 바람직하게는 적어도 1.8 mol/L로 함유하도록 제공된다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 AQGV-펩타이드의 농도가 2 mol/L 내지 2.5 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 2.5 mol/L 내지 3 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3 mol/L 내지 3.5 mol/L 범위인 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 내지 4.5 mol/L 범위인 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 내지 5.5 mol/L 범위인 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 이상인 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 바람직하게는 상기 원액 용액은 수성 용액이다.
AQLPVG 군
다른 구현예에서, 본 발명은 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 루신 (L), 발린 (V) 글리신 (G) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 펩타이드, 바람직하게는 재조합 또는 합성, 자가포식-저해 펩타이드, 바람직하게는 이의 유기산 염, 예를 들어 말리에이트, 더 바람직하게는 아세테이트, 더 바람직하게는 타르트레이트, 가장 바람직하게는 사이트레이트를 제공한다. 더 바람직하게는, 본 발명은 펩타이드가 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해 펩타이드의 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드 사이트레이트의 원액 용액, 바람직하게는 수성 용액을 제공한다.
응집 위험을 감안해, 임상 시험에 사용하기 위한 본원에서 상기에서 정의된 AQGV-펩타이드의 원액 용액이 수용된 바이얼은 용액에 활성 물질을 (0.8 mol/L) 이하로 함유한다. 본 발명에 기반하여, 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 유기산의 AQGV-염, 특히 현재 AQGV-펩타이드-말리에이트, AQGV-펩타이드-아세테이트 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 상기한 원액 용액이, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드 타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트를 적어도 0.85 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 0.9 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.2 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.4 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.6 mol/L, 가장 바람직하게는 적어도 1.8 mol/L로 함유하도록 제공된다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 AQGV-펩타이드의 농도가 2 mol/L 내지 2.5 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 2.5 mol/L 내지 3 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3 mol/L 내지 3.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 내지 4.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 4.5 mol/L 내지 5.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 5.5 mol/L 이상인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 바람직하게는, 상기 원액 용액은 수성 용액이다.
AQLP 군
다른 구현예에서, 본 발명은 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 펩타이드, 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해 펩타이드, 바람직하게는 이의 유기산 염, 예를 들어 말리에이트, 더 바람직하게는 아세테이트, 더 바람직하게는 타르트레이트, 가장 바람직하게는 사이트레이트를 제공한다. 더 바람직하게는, 본 발명은 펩타이드가 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 바람직하게는 재조합 또는 합성의, 자가포식-저해성 펩타이드의 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드 사이트레이트를 포함하는, 원액 용액, 바람직하게는 수성 용액을 제공한다.
응집 위험을 감안해, 임상 시험에 사용하기 위한 본원에서 상기에서 정의된 AQGV-펩타이드의 원액 용액이 수용된 바이얼은 용액에 활성 물질을 (0.8 mol/L) 이하로 함유한다. 본 발명에 기반하여, 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 루신 (L) 및 프롤린 (P)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 유기산의 AQGV-염, 특히 현재 AQGV-펩타이드-말리에이트, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 상기한 원액 용액이, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드 타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트를 적어도 0.85 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 0.9 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.2 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.4 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.6 mol/L, 가장 바람직하게는 적어도 1.8 mol/L로 함유하도록 제공된다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 AQGV-펩타이드의 농도가 2 mol/L 내지 2.5 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 2.5 mol/L 내지 3 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3 mol/L 내지 3.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 내지 4.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 4.5 mol/L 내지 5.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 5.5 mol/L 이상인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 바람직하게는, 상기 원액 용액은 수성 용액이다.
AQGV 군
다른 구현예에서, 본 발명은 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 펩타이드, 바람직하게는 재조합 또는 합성의 자가포식-저해성 펩타이드, 바람직하게는 이의 유기산 염, 예를 들어 말리에이트, 더 바람직하게는 아세테이트, 더 바람직하게는 타르트레이트, 가장 바람직하게는 사이트레이트를 제공한다. 더 바람직하게는, 본 발명은 펩타이드가 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 바람직하게는 재조합 또는 합성의 자가포식-저해 펩타이드의 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드 사이트레이트의 원액 용액, 바람직하게는 수성 용액을 제공한다.
응집 위험을 감안해, 임상 시험에 사용하기 위한 본원에서 상기에서 정의된 AQGV-펩타이드의 원액 용액이 수용된 바이얼은 용액에 활성 물질을 (0.8 mol/L) 이하로 함유한다. 본 발명에 기반하여, 자가포식-저해성 아미노산 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 유기산의 AQGV-염, 특히 현재 AQGV-펩타이드-말리에이트, AQGV-펩타이드-아세테이트 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 상기한 원액 용액이, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드 타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트를 적어도 0.85 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 0.9 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.2 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.4 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.6 mol/L, 가장 바람직하게는 적어도 1.8 mol/L로 함유하도록 제공된다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 AQGV-펩타이드의 농도가 2 mol/L 내지 2.5 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 2.5 mol/L 내지 3 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3 mol/L 내지 3.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 내지 4.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 4.5 mol/L 내지 5.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 5.5 mol/L 이상인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 바람직하게는, 상기 원액 용액은 수성 용액이다.
LQGV 군
또 다른 구현예에서, 본 발명은 자가포식-저해성 아미노산 루신 (L), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 펩타이드, 바람직하게는 재조합 또는 합성의 자가포식-저해성 펩타이드, 바람직하게는 이의 유기산 염, 예를 들어 말리에이트, 더 바람직하게는 아세테이트, 더 바람직하게는 타르트레이트, 가장 바람직하게는 사이트레이트를 제공한다. 더 바람직하게는, 본 발명은 펩타이드가 자가포식-저해성 아미노산 루신, 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해 펩타이드의 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드 사이트레이트의 원액 용액, 바람직하게는 수성 용액을 제공한다.
응집 위험을 감안해, 임상 시험에 사용하기 위한 본원에서 상기에서 정의된 AQGV-펩타이드의 원액 용액이 수용된 바이얼은 용액에 활성 물질을 (0.8 mol/L) 이하로 함유한다. 본 발명에 기반하여, 자가포식-저해성 아미노산 루신 (L), 글루타민 (Q), 글리신 (G) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 유기산의 AQGV-염, 특히 현재 AQGV-펩타이드-말리에이트, AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 상기한 원액 용액이, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드 타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트를 적어도 0.85 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 0.9 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.2 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.4 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.6 mol/L, 가장 바람직하게는 적어도 1.8 mol/L로 함유하도록 제공된다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 AQGV-펩타이드의 농도가 2 mol/L 내지 2.5 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 2.5 mol/L 내지 3 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3 mol/L 내지 3.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 내지 4.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 4.5 mol/L 내지 5.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 5.5 mol/L 이상인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 바람직하게는, 상기 원액 용액은 수성 용액이다.
VLPALP 군
또 다른 구현예에서, 본 발명은 자가포식-저해성 아미노산 루신 (L), 알라닌 (A), 프롤린 (P) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 펩타이드, 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해성 펩타이드, 바람직하게는 이의 유기산 염, 예를 들어 말리에이트, 더 바람직하게는 아세테이트, 더 바람직하게는 타르트레이트, 가장 바람직하게는 사이트레이트를 제공한다. 더 바람직하게는, 본 발명은 펩타이드가 자가포식-저해성 아미노산 루신 (단문자 코드: L), 알라닌 (A), 프롤린 (P) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해 펩타이드의 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드 사이트레이트의 원액 용액, 바람직하게는 수성 용액을 제공한다.
응집 위험을 감안해, 임상 시험에 사용하기 위한 본원에서 상기에서 정의된 AQGV-펩타이드의 원액 용액이 수용된 바이얼은 용액에 활성 물질을 (0.8 mol/L) 이하로 함유한다. 본 발명에 따라, 자가포식-저해성 아미노산 루신 (L), 알라닌 (A), 프롤린 (P) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, AQGV-염, 특히 현재 AQGV-펩타이드-말리에이트, AQGV-펩타이드-아세테이트 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 상기한 원액 용액이, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드 타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트를 적어도 0.85 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 0.9 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.2 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.4 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.6 mol/L, 가장 바람직하게는 적어도 1.8 mol/L로 함유하도록 제공된다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 AQGV-펩타이드의 농도가 2 mol/L 내지 2.5 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 2.5 mol/L 내지 3 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3 mol/L 내지 3.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 내지 4.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 4.5 mol/L 내지 5.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 5.5 mol/L 이상인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 바람직하게는, 상기 원액 용액은 수성 용액이다.
LIVA 군
또 다른 구현예에서, 본 발명은 자가포식-저해성 아미노산 루신 (L), 이소루신, 알라닌 (A) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 펩타이드, 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해성 펩타이드, 바람직하게는 이의 유기산 염, 예를 들어 말리에이트, 더 바람직하게는 아세테이트, 더 바람직하게는 타르트레이트, 가장 바람직하게는 사이트레이트를 제공한다. 더 바람직하게는, 본 발명은 펩타이드가 자가포식-저해성 아미노산 루신 (L), 알라닌 (A), 이소루신 (I) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해 펩타이드의 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드 사이트레이트의 원액 용액, 바람직하게는 수성 용액을 제공한다.
응집 위험을 감안해, 임상 시험에 사용하기 위한 본원에서 상기에서 정의된 AQGV-펩타이드의 원액 용액이 수용된 바이얼은 용액에 활성 물질을 (0.8 mol/L) 이하로 함유한다. 본 발명에 기반하여, 자가포식-저해성 아미노산 루신 (L), 이소루신, 알라닌 (A) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 유기산의 AQGV-염, 특히 현재 AQGV-펩타이드-말리에이트, AQGV-펩타이드-아세테이트 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 상기한 원액 용액이, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드 타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트를 적어도 0.85 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 0.9 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.2 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.4 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.6 mol/L, 가장 바람직하게는 적어도 1.8 mol/L로 함유하도록 제공된다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 AQGV-펩타이드의 농도가 2 mol/L 내지 2.5 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 2.5 mol/L 내지 3 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3 mol/L 내지 3.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 내지 4.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 4.5 mol/L 내지 5.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 5.5 mol/L 이상인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 바람직하게는, 상기 원액 용액은 수성 용액이다.
PIVA 군
또 다른 구현예에서, 본 발명은 자가포식-저해성 아미노산 프롤린 (P), 이소루신 (I), 알라닌 (A) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 펩타이드, 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해성 펩타이드, 바람직하게는 이의 유기산 염, 예를 들어 말리에이트, 더 바람직하게는 아세테이트, 더 바람직하게는 타르트레이트, 가장 바람직하게는 사이트레이트를 제공한다. 더 바람직하게는, 본 발명은 펩타이드가 자가포식-저해성 아미노산 프롤린 (P), 이소루신 (I), 알라닌 (A) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해 펩타이드의 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드 사이트레이트의 원액 용액, 바람직하게는 수성 용액을 제공한다.
응집 위험을 감안해, 임상 시험에 사용하기 위한 본원에서 상기에서 정의된 AQGV-펩타이드의 원액 용액이 수용된 바이얼은 용액에 활성 물질을 (0.8 mol/L) 이하로 함유한다. 본 발명에 따라, 자가포식-저해성 아미노산 프롤린 (P), 이소루신 (I), 알라닌 (A) 및 발린 (V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 적어도 50%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함하는 아미노산 서열을 가진, AQGV-염, 특히 현재 AQGV-펩타이드-말리에이트, AQGV-펩타이드-아세테이트 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 상기한 원액 용액이, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드 타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트를 적어도 0.85 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 0.9 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.2 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.4 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.6 mol/L, 가장 바람직하게는 적어도 1.8 mol/L로 함유하도록 제공된다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 AQGV-펩타이드의 농도가 2 mol/L 내지 2.5 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 2.5 mol/L 내지 3 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3 mol/L 내지 3.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 내지 4.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 4.5 mol/L 내지 5.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 5.5 mol/L 이상인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 바람직하게는, 상기 원액 용액은 수성 용액이다.
바람직한 구현예에서, 바람직하게는, 상기 원액 용액은 다이펩타이드 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV, 트리펩타이드 AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, QLG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG 또는 테트라펩타이드 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV 또는 이들 2 이상의 혼합을 포함하는 자가포식-저해성 아미노산의 수용액이다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드, 바람직하게는 재조합 또는 합성의 자가포식-저해성 펩타이드의 유기산 염, 예를 들어 말리에이트, 더 바람직하게는 아세테이트, 더 바람직하게는 타르트레이트, 가장 바람직하게는 사이트레이트를 제공하며, 이러한 펩타이드는 다이펩타이드 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV, 트리펩타이드 AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, Q0LG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG 또는 테트라펩타이드 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV 또는 이들의 혼합을 적어도 50%로 포함하고, 더 바람직하게는 다이펩타이드 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV, 트리펩타이드 AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, QLG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG 또는 테트라펩타이드 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV 또는 이들의 혼합을 적어도 75%, 가장 바람직하게는 100%로 포함한다. 더 바람직하게는, 본 발명은 바람직하게는 재조합 또는 합성 자가포식-저해 펩타이드의 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드 사이트레이트를 포함하는, 원액 용액, 바람직하게는 수성 용액을 제공하며, 이러한 펩타이드는 다이펩타이드 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV, 트리펩타이드 AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, QLG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG 또는 테트라펩타이드 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV 또는 이들의 혼합을 포함한다.
응집 위험을 감안해, 임상 시험에 사용하기 위한 본원에서 상기에서 정의된 바와 같이 다이펩타이드 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV, 트리펩타이드 AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, QLG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG 또는 테트라펩타이드 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV 또는 이들 2 이상의 혼합을 포함하는 AQGV-펩타이드의 원액 용액이 수용된 바이얼은 용액에 활성 물질을 (0.8 mol/L) 이하로 함유한다. 본 발명에 기반하여, 다이펩타이드 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV, 트리펩타이드 AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, QLG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG 또는 테트라펩타이드 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV 또는 이들 2 이상의 혼합을 포함하는, 유기산의 AQGV-염, 특히 현재 AQGV-펩타이드-말리에이트, AQGV-펩타이드-아세테이트 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 상기한 원액 용액이, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드 타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트를 적어도 0.85 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 0.9 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.2 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.4 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.6 mol/L, 가장 바람직하게는 적어도 1.8 mol/L로 함유하도록 제공된다.
더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 AQGV-펩타이드의 농도가 2 mol/L 내지 2.5 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 2.5 mol/L 내지 3 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3 mol/L 내지 3.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 내지 4.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 4.5 mol/L 내지 5.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 5.5 mol/L 이상인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 바람직하게는, 상기 원액 용액은 수성 용액이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 펩타이드는 아미노산 2-40개, 바람직하게는 3-30개, 바람직하게는 4-20개 길이의 펩타이드 서열을 가진다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 펩타이드는 특히 아미노산 4개 이상이 자가포식을 저해하는 경우에 아미노산을 6개 이상 포함하는 펩타이드를 가진다. 본 발명에 따른 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드 사이트레이트의 최장 길이는 바람직하게는 아미노산 최대 50개, 더 바람직하게는 최대 40개. 더 바람직하게는 최대 30개, 더 바람직하게는 최대 20개, 더 바람직하게는 최대 15개, 더 바람직하게는 최대 12개, 가장 바람직하게는 최대 9개를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 원액 용액을 이용해 조제되는, 수액 소생술에 이용가능하거나 및/또는 환자의 혈관 투과성 문제를 해결하는 수용액을 제공한다. 바람직하게는, 혈관 투과성 문제를 해결하는 수용액에는 아미노산 2-40개, 바람직하게는 3-30개, 바람직하게는 4-20개 길이의 펩타이드 서열을 가진 본 발명에 따른 자가포식-저해성 펩타이드가 제공된다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 수용액에는, 특히 아미노산 4개 이상이 자가포식을 저해하는 경우, 아미노산을 6개 이상 포함하는 펩타이드가 제공된다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 수용액에는, 바람직하게는 아미노산을 최대 50개, 더 바람직하게는 최대 40개, 더 바람직하게는 최대 30개, 더 바람직하게는 최대 20개, 더 바람직하게는 최대 15개, 더 바람직하게는 최대 12개, 가장 바람직하게는 최대 9개를 포함하는, 본 발명에 따른 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드 사이트레이트가 제공된다. 본 발명에 따른 이러한 수용액은 환자가 인간인 경우에, 바람직하게는 환자가 중환자로 간주되는 경우에 유용하며, 전형적으로 혈관 투과성 증가와 관련한 질환을 치료하는데, 특히 증가된 혈관 투과성의 치료에서 승압제의 사용을 지연하거나 또는 이러한 사용을 회피하는데 유용하다. 특히 체액 과부하의 방지 또는 치료에 또는 소생 수액으로서 이용할 경우에, 결정질액로서 간주되는 본 발명에 따른 자가포식-저해성 펩타이드가 포함된 수성 용액이 바람직하며, 더 큰 부피의 초기 수액이 바람직한 경우 처음 6시간 동안 제공되고 이후 적어도 필요시 승압제를 사용하는 것으로 이루어진 자유로운 수액 방식으로 제공된다. 대안적으로, 본원의 상기에서 제공된 자가포식-저해성 펩타이드를 포함하며 제한적인 수액 방식을 허용하는 수성 용액, 선택적으로 콜로이드 용액의 사용은 소생 요법의 승압제 주입 의존성을 지연시키거나 또는 제한할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포, 바람직하게는 표면에 부속된 포르밀-펩타이드-수용체를 가진 세포에 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 제공하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 공급원이 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이고, 아미노산의 50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포골격 재구성을 유도하는 p38 MAPK 키나제 활성을 낮추는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포, 바람직하게는 표면에 부속된 포르밀-펩타이드-수용체를 가진 세포에 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 제공하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 공급원이 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이고, 아미노산의 50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포르밀-펩타이드-수용체 (FPR)에 의해 매개되는 p38 MAPK 키나제 활성의 낮추는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포, 바람직하게는 표면에 부속된 포르밀-펩타이드-수용체를 가진 세포에 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 제공하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 공급원이 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이고, 아미노산의 50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포골격 재구성을 유도하는 PI3K/AKT/mTOR 활성을 낮추는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포, 바람직하게는 표면에 부속된 포르밀-펩타이드-수용체를 가진 세포에 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 제공하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 공급원이 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이고, 아미노산의 50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포르밀-펩타이드-수용체 (FPR)에 의해 매개되는 PI3K/AKT/mTOR의 활성을 낮추는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포, 바람직하게는 표면에 부속된 포르밀-펩타이드-수용체를 가진 세포에 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 제공하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 공급원이 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이고, 아미노산의 50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포골격 재구성을 저하하는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포, 바람직하게는 표면에 부속된 포르밀-펩타이드-수용체를 가진 세포에 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 제공하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 공급원이 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이고, 아미노산의 50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 포르밀-펩타이드-수용체 (FPR)에 의해 매개되는 세포골격 재구성을 저하하는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포, 바람직하게는 표면에 부속된 포르밀-펩타이드-수용체를 가진 세포에 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 제공하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 공급원이 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이고, 아미노산이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 혈관 투과성을 변형하는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포, 바람직하게는 표면에 부속된 포르밀-펩타이드-수용체를 가진 세포에 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 제공하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 공급원이 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이고, 아미노산이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조직 회복을 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 자가포식-저해성 아미노산을 포함하는 펩타이드가 다이펩타이드 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV, 트리펩타이드 AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, Q0LG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG 또는 테트라펩타이드 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV 또는 이들 2 이상의 혼합을 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
본 발명은, 자가포식-저해성 아미노산의 공급원, 바람직하게는 공급원이 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이고, 펩타이드 결합을 통해 항체-유사 분자와 연결된, AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV로 이루어진 군으로부터 선택되는 다이펩타이드, AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, Q0LG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 트리펩타이드 또는 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV로 이루어진 군으로부터 선택되는 테트라펩타이드 또는 이들의 혼합을 포함하는 펩타이드인, 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
본 발명은 AQGV-펩타이드가 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV로 이루어진 군으로부터 선택되는 다이펩타이드, AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, Q0LG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 트리펩타이드 또는 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV로 이루어진 군으로부터 선택되는 테트라펩타이드 또는 이들의 혼합을 포함하는, 본 발명에 따른 방법을 제공한다.
본 발명은 바람직하게는 포르밀-펩타이드-수용체 (FPR)에 의해 매개되는 p38 MAPK 키나제 및/또는 PKB 활성 및/또는 세포골격 재구성 활성을 낮추는데 이용하기 위한 AQGV-펩타이드를 제공하며, 이러한 분자는 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 포함하고, 바람직하게는 상기 공급원은 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이다.
본 발명은 조직 회복을 개선하는데 이용하기 위한 AQGV-펩타이드를 제공하며, 이러한 분자는 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 포함하고, 바람직하게는 이러한 공급원은 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이다.
본 발명은 혈관 투과성을 변형하는데 이용하기 위한 AQGV-펩타이드를 제공하며, 이러한 분자는 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 포함하고, 바람직하게는 이러한 공급원은 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이다.
본 발명은 자가포식-저해성 아미노산의 공급원, 바람직하게는 공급원이 본원에 제공된 바와 같은 AQGV-펩타이드이고, AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV로 이루어진 군으로부터 선택되는 다이펩타이드, AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, Q0LG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 트리펩타이드 또는 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, AGV, LGGV, LPGV, LVGV로 이루어진 군으로부터 선택되는 테트라펩타이드 또는 이들의 혼합을 포함하는 펩타이드인, 본 발명에 따라 이용하기 위한, 바람직하게는 포르밀-펩타이드-수용체 (FPR)에 의해 매개되는, p38 MAPK 키나제 및/또는 PKB 활성 및/또는 세포골격 재구성 활성을 낮추는데 이용하기 위한, AQGV-펩타이드를 제공한다.
바람직하게는 포르밀-펩타이드-수용체 (FPR)에 의해 매개되는 p38 MAPK 키나제 및/또는 PKB 활성 및/또는 세포골격 재구성 활성을 낮추는데 이용하기 위한, xGxxPG를 포함하는 펩타이드, 및 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV로 이루어진 군으로부터 선택되는 다이펩타이드, AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, Q0LG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 트리펩타이드 또는 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, AGV, LGGV, LPGV, LVGV로 이루어진 군으로부터 선택되는 테트라펩타이드 또는 이들의 혼합으로부터 선택되는 펩타이드.
본 발명은 바람직하게는 포르밀-펩타이드-수용체 (FPR)에 의해 매개되는 p38 MAPK 키나제 및/또는 PKB 활성 및/또는 세포골격 재구성 활성을 낮추는데 이용하기 위한, 식 φn xGxxPG 또는 xGxxPG φn 또는 φn xGxxPG φm의 서열을 포함하는, 아미노산 7개 이상 최대 30개를 포함한 AQGV-펩타이드를 제공하며, 여기서 x는 자연 생성 아미노산이고, φ는 자가포식-저해성 아미노산이며, n = 1-24의 정수이고 m은 1-23의 정수이되 n+m은 24 이하이다.
본 발명은 φn 및/또는 φm이 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV, AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, Q0LG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG, AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV 또는 이들의 다양한 혼합을 포함하는, 본 발명에 따른 AQGV-펩타이드를 제공한다.
아울러, 본 발명은 바람직하게는 포르밀-펩타이드-수용체 (FPR)에 의해 매개되는 p38 MAPK 키나제 및/또는 PKB 활성 및/또는 세포골격 재구성 활성을 낮추는데 이용하기 위한, AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV로 이루어진 군으로부터 선택되는 다이펩타이드 및/또는 AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, Q0LG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG로 이루어진 군으로부터 선택되는 트리펩타이드 및/또는 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV로 이루어진 군으로부터 선택되는 테트라펩타이드 또는 이들의 혼합을 포함하는 펩타이드 및 AQGV-펩타이드와 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 제형을 제공한다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 제형을 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 펩타이드를 자동 펩타이드 합성기로 합성하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 AQGV-펩타이드의 제조 방법을 제공한다.
더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명은 AQGVLPG, AQGVLP, AQLP, AQGV 또는 LQGV의 타르트레이트 또는 사이트레이트를 포함하는 본 발명에 따른 펩타이드-타르트레이트 또는 펩타이드-사이트레이트를 제공한다. 가장 바람직한 구현예에서, 본 발명은 테트라펩타이드가 AQGV 또는 LQGV인, 테트라펩타이드의 타르트레이트를 제공한다. 이러한 본 발명에 따른 펩타이드의 타르트레이트 또는 사이트레이트는 펩타이드의 타르트레이트 또는 사이트레이트 염 또는 에스테르일 수 있으며, 타르트레이트 또는 사이트레이트 염이 바람직하다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 염을 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 정맥내 용도로 바람직한 부형제는 0.9% NaCl이다.
또한, 본 발명은 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 포함하되, 아미노산의 50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수성 용액을 제공하며, 여기서 상기한 공급원은 상기한 아미노산을 적어도 50%로 포함하는 펩타이드 하나 이상을 포함하고, 상기한 펩타이드는 유기산의 염으로서, 바람직하게는 말레산의 염으로서, 더 바람직하게는 타르타르산의 염으로서, 가장 바람직하게는 구연산의 염으로서 존재한다.
도 1 세포 및 조직 외상 후 포르밀-펩타이드-수용체에 의해 매개되는 혈관 투과성.
외상/세포 손상으로 방출된 미토콘드리아 N-포르밀 펩타이드 (F-MIT)가 포르밀 펩타이드 수용체 (FPR)를 활성화하여 내피 세포의 세포골격에 변화가 유발되고, 이후 내피 수축 및 혈관 투과성, 백혈구 혈관외유출 및 저혈압이 유도된다. N-포르밀 펩타이드는 박테리아 및 미토콘드리아의 공통적인 분자 시그니처로서, 포르밀 펩타이드 수용체 (FPR)를 활성화한다. 미토콘드리아 N-포르밀 펩타이드 (F-MIT)에 의한 FPR 활성화는 내피 세포에서 세포골격-조절 단백질에 변화를 유발하여, 혈관 누출 및 백혈구의 혈관외유출 증가와 더불어 내피 세포의 수축성이 증가하게 된다. 외상과 같은 상해 후 조직 손상으로부터 기원하는 미토콘드리아 N-포르밀 펩타이드 (F-MIT)에 의한 FPR 활성화가 세포 및 조직 상해 또는 외상 후 장벽 기능 손상에 대한 주요 기여인자로서, 부종, 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압과 더불어 유해한 혈관 투과성과 같은 유래한 혈관 작용을 발휘한다.
도 2
내피 세포-세포골격 조직화를 조절하는데 참여하는 p38-MK2-HSP27 경로 (좌) 및 PI13K/AKT/mTOR 경로 (우)에 대한 기술적 도표.
도 3
포르밀-펩타이드-수용체 매개 펩타이드 효과.
FPR-발현 세포의 프로토타입 FPR-리간드 fMLP를 이용한 FPR-활성화는 PKB (AKT라고도 함)(도 3a) 및 p38 MAPK 키나제 (도 3c)의 인산화 상태에 대해 신속하고 현저한 변화를 유도하지만 (p < 0.05; p38 60-600초, PKB 600초), STAT3, JNK (도 3b) 및 P42/p44MAPK/ERK1,2 (도 3d) 키나제에서는 그렇지 않다 (또는 검출되지 않음). p38 MAPK에 대한 AQGV-펩타이드 효과 (도 3c)는 FPR-자극 후 30초에 이미 검출되고, PKB(AKT)에 대한 AQGV-펩타이드 효과 (도 3a)는 300초 시점에 2-상 패턴 (bi-phasic pattern)으로 뒤따른다. p38 및 PKB-매개 신호전달에 대한 AQGV-펩타이드 효과는 검사한 전체 600초 동안 지속되는 반면, 검사한 다른 키나제는 전반적으로 영향을 받지 않았다. 이러한 치료에 대한 급성의 특이적인 반응은 PI3K/AKT/mTOR 경로의 조절 맥락에서 p38 신호전달에 대한 자가포식-저해성-AQGV-펩타이드의 특이적이고 신속한 영향을 나타낸다. 이러한 경로는 단백질 분해와 단백질 생성 사이에 균형을 좌우하여 세포골격 변화를 조절함으로써 혈관 투과성에 영향을 미친다. AQGV-펩타이드는 p38 MAPK 키나제 활성화된 변화를 낮출 뿐 아니라 내피 세포 수축과 유해한 혈관 투과성에 영향을 미치는 세포의 세포골격의 재구성에서의 PI3K/AKT/mTOR 활성화된 유도된 변화를 감소시키는 것으로 확인된다. AQGV-펩타이드는 인간 개체에서 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압을 동반한 부종으로 나타나는 바와 같이 유해한 혈관 투과성에 유용하며, 이를 해결할 수 있다.
도 4
용해성 실험에 대한 개괄 및 결과.
도 5
도 4에 개시된 결과를 토대로, 응집된 펩타이드-염을 대상으로 스크리닝한 중성-펩타이드 염이 해리되는 경향이 관찰되기 전 농도를 결정하였다 (응집점). 음이온 변화가 AQGV의 용해성 특징에 현저하게 영향을 미치는 것으로 결론 내릴 수 있다. AQGV-구연산 (AQGV-사이트레이트) 및 -타르타르산 (AQGV-타르트레이트) 염에서 더 높은 용해성 (0.9% NaCl에서의 용해성)과 더 높은 응집점이 관찰된 반면, 말레산 및 KHSO4 염은 AQGV-Ac와 비교해 낮은 용해성을 나타내었다. 아데노신-모노포스페이트 또는 아데노신의 사용은 가용성을 제공하지 않았다. 구연산은 특수 사례인 것으로 보인다. 고 농축 용액은 결정화 또는 응집되지 않지만, 고 점성의 용액을 형성하는 경향이 관찰된다.
외상/세포 손상으로 방출된 미토콘드리아 N-포르밀 펩타이드 (F-MIT)가 포르밀 펩타이드 수용체 (FPR)를 활성화하여 내피 세포의 세포골격에 변화가 유발되고, 이후 내피 수축 및 혈관 투과성, 백혈구 혈관외유출 및 저혈압이 유도된다. N-포르밀 펩타이드는 박테리아 및 미토콘드리아의 공통적인 분자 시그니처로서, 포르밀 펩타이드 수용체 (FPR)를 활성화한다. 미토콘드리아 N-포르밀 펩타이드 (F-MIT)에 의한 FPR 활성화는 내피 세포에서 세포골격-조절 단백질에 변화를 유발하여, 혈관 누출 및 백혈구의 혈관외유출 증가와 더불어 내피 세포의 수축성이 증가하게 된다. 외상과 같은 상해 후 조직 손상으로부터 기원하는 미토콘드리아 N-포르밀 펩타이드 (F-MIT)에 의한 FPR 활성화가 세포 및 조직 상해 또는 외상 후 장벽 기능 손상에 대한 주요 기여인자로서, 부종, 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압과 더불어 유해한 혈관 투과성과 같은 유래한 혈관 작용을 발휘한다.
도 2
내피 세포-세포골격 조직화를 조절하는데 참여하는 p38-MK2-HSP27 경로 (좌) 및 PI13K/AKT/mTOR 경로 (우)에 대한 기술적 도표.
도 3
포르밀-펩타이드-수용체 매개 펩타이드 효과.
FPR-발현 세포의 프로토타입 FPR-리간드 fMLP를 이용한 FPR-활성화는 PKB (AKT라고도 함)(도 3a) 및 p38 MAPK 키나제 (도 3c)의 인산화 상태에 대해 신속하고 현저한 변화를 유도하지만 (p < 0.05; p38 60-600초, PKB 600초), STAT3, JNK (도 3b) 및 P42/p44MAPK/ERK1,2 (도 3d) 키나제에서는 그렇지 않다 (또는 검출되지 않음). p38 MAPK에 대한 AQGV-펩타이드 효과 (도 3c)는 FPR-자극 후 30초에 이미 검출되고, PKB(AKT)에 대한 AQGV-펩타이드 효과 (도 3a)는 300초 시점에 2-상 패턴 (bi-phasic pattern)으로 뒤따른다. p38 및 PKB-매개 신호전달에 대한 AQGV-펩타이드 효과는 검사한 전체 600초 동안 지속되는 반면, 검사한 다른 키나제는 전반적으로 영향을 받지 않았다. 이러한 치료에 대한 급성의 특이적인 반응은 PI3K/AKT/mTOR 경로의 조절 맥락에서 p38 신호전달에 대한 자가포식-저해성-AQGV-펩타이드의 특이적이고 신속한 영향을 나타낸다. 이러한 경로는 단백질 분해와 단백질 생성 사이에 균형을 좌우하여 세포골격 변화를 조절함으로써 혈관 투과성에 영향을 미친다. AQGV-펩타이드는 p38 MAPK 키나제 활성화된 변화를 낮출 뿐 아니라 내피 세포 수축과 유해한 혈관 투과성에 영향을 미치는 세포의 세포골격의 재구성에서의 PI3K/AKT/mTOR 활성화된 유도된 변화를 감소시키는 것으로 확인된다. AQGV-펩타이드는 인간 개체에서 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압을 동반한 부종으로 나타나는 바와 같이 유해한 혈관 투과성에 유용하며, 이를 해결할 수 있다.
도 4
용해성 실험에 대한 개괄 및 결과.
도 5
도 4에 개시된 결과를 토대로, 응집된 펩타이드-염을 대상으로 스크리닝한 중성-펩타이드 염이 해리되는 경향이 관찰되기 전 농도를 결정하였다 (응집점). 음이온 변화가 AQGV의 용해성 특징에 현저하게 영향을 미치는 것으로 결론 내릴 수 있다. AQGV-구연산 (AQGV-사이트레이트) 및 -타르타르산 (AQGV-타르트레이트) 염에서 더 높은 용해성 (0.9% NaCl에서의 용해성)과 더 높은 응집점이 관찰된 반면, 말레산 및 KHSO4 염은 AQGV-Ac와 비교해 낮은 용해성을 나타내었다. 아데노신-모노포스페이트 또는 아데노신의 사용은 가용성을 제공하지 않았다. 구연산은 특수 사례인 것으로 보인다. 고 농축 용액은 결정화 또는 응집되지 않지만, 고 점성의 용액을 형성하는 경향이 관찰된다.
자가포식
-
저해성
펩타이드
단문자 코드
본원에서 단백질 또는 펩타이드 조성, 구조 및 기능을 기술함에 있어, 아미노산을 참조한다. 본 명세서에서, 아미노산 잔기는 다음과 같은 약어를 이용해 식별된다. 또한, 달리 명확하게 언급되지 않은 한, 펩타이드 및 단백질의 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로, 좌측 말단에서 우측 말단으로 표시되며, N-말단은 제1 잔기로 식별된다. Ala: 알라닌 잔기; Asp: 아스파르테이트 잔기; Glu: 글루타메이트 잔기; Phe: 페닐알라닌 잔기; Gly: 글리신 잔기; His: 히스티딘 잔기; Ile: 이소루신 잔기; Lys: 라이신 잔기; Leu: 루신 잔기; Met: 메티오닌 잔기; Asn: 아스파라긴 잔기; Pro: 프롤린 잔기; Gln: 글루타민 잔기; Arg: 아르기닌 잔기; Ser: 세린 잔기; Thr: 트레오닌 잔기; Val: 발린 잔기; Trp: 트립토판 잔기; Tyr: 티로신 잔기; Cys: 시스테인 잔기. 아미노산은 또한 이의 통상적인 단문자 코드 약어로 언급될 수 있다; A=Ala; T=Thr; V=Val; C=Cys; L=Leu; Y=Tyr; I=Ile; N=Asn; P=Pro; Q=Gln; F=Phe; D=Asp; W=Trp; E=Glu; M=Met; K=Lys; G=Gly; R=Arg; S=Ser; 및 H=His.
펩타이드
펩타이드는 본원에서 펩타이드 (아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체들로 이루어진 천연적인 생물학적 또는 인공 제작된 (합성) 짧은 사슬을 의미할 것이다. 글루타민 펩타이드는 본원에서 펩타이드 (아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체들로 이루어지되 아미노산 단량체 중 하나가 글루타민인, 천연적인 생물학적 또는 인공 제작된 (합성) 짧은 사슬을 의미할 것이다. 화학 합성 펩타이드는 일반적으로 유리 (free) N-말단 및 C-말단을 가진다. N-말단 아세틸화 및 C-말단 아미드화는 펩타이드의 전체 전하를 감소시키며, 따라서 이의 전체 용해성이 감소할 것이다. 그러나, 펩타이드의 안정성은, 말단 아세틸화/아미드화가 본래의 단백질과 더 비슷한 모방체를 생성하므로, 증가될 수 있다. 이러한 변형은 펩타이드의 생물학적 활성을 높일 수 있으며, 또한 본원에서 제공된다.
펩타이드 합성
펩타이드는, 활용시 고전적으로 공지된 고상 지지체에서의 화학적 합성 (Ansynth BV, Roosendaal, The Netherlands)에 의해 또는 용액 중의 화학 합성 (Syncom BV, Groningen, The Netherlands and Diosynth BV, Oss, The Netherlands)에 의해 합성한다. 약학적 펩타이드 조성물은 트리플루오로아세테이트를 반대-이온 또는 염으로서 이용해 합성할 수 있으며, 이후 트리플루오로아세테이트는 (말레산으로부터) 말리에이트, (아세트산으로부터) 아세테이트, (타르타르산으로부터) 타르트레이트 또는 (구연산으로부터) 사이트레이트 등의 반대-이온으로 교환한다. 전임상 및 임상 인간 실험에서 이용하기 위한 약물 물질 AQGV (EA-230)는 Organon N.V 사 (종래에 Diosynth B.V.), (Oss, The Netherlands)에서 제조하였으며, 최종 제품의 충진 및 마무리는 Octoplus Development, Leiden 사 (The Netherlands)에서 수행되었다. EA-230 (AQGV)의 분자량은 373g/mol이다.
화학주성 활성 (chemotactic activity) 확인.
인간 U937 단핵구 세포는 ATCC (American Type Culture Collection, ATCC 카탈로그 번호 CRL-1593.2, Manassas, Va)에서 구입한다. 세포는 10% 소 태아 혈청과 항생제가 첨가된 RPMI 1640 배지가 든 T-75 플라스크에서 현탁 배양으로 유지시키고, 배양물은 3-5일마다 분할한다. 화학주성 분석에 이용하기 3일 전, 기술된 바와 같이 1 mmol/L 다이부티릴 사이클릭 아데노신 모노포스페이트 (dbcAMP; Sigma Chemical Co)에 노출하여 U937 세포를 자극함으로써 대식세포 계통을 따라 분화시킨다. 세포를 3번 헹궈 배양 배지를 제거한 다음 화학주성 매질 (1% 락트알부민 가수분해물 1%가 첨가된 둘베코의 변형된 기본 배지)에 재현탁하여 최종 농도 2.5 x 106 세포/mL로 분석 챔버에 접종한다. 화학주성 분석은 48웰 미세화학주성 챔버 (Neuro Probe, Cabin John, Md)에서 수행한다. 챔버의 바닥 웰에 화학주성 자극물질 (또는 매질 단독) 25 mL을 3세트로 충진한다. 기공 크기 5 mm의 비-코팅된 10-mm-두께의 폴리비닐피롤리돈-프리 폴리카보네이트 필터를 샘플 (Neuro Probe) 위에 배치한다. 실리콘 개스킷 및 상부 챔버 피스를 적용하고, 단핵구 세포 현탁물 50 mL을 상부 웰에 넣는다. 챔버를 가습 5% CO2 분위기 하에 3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 비-이동 세포는 필터의 상부 표면으로부터 부드럽게 닦아낸다. 필터를 30초간 메탄올계 고정제에 침지하고, 변형된 Wright-Giemsa 기법 (Protocol Hema 3 stain set; Biochemical Sciences, Inc, Swedesboro, NJ)으로 염색한 다음 유리 슬라이드 위에 탑재한다. 필터를 통해 완전히 이동한 세포는 광 현미경에서 계수하였으며, 웰 당 랜덤 하이-파워 필드 (HPF; 오리지널 배율 x 400) 3개를 계수한다. 건강한 자원자에서 신선하게 채혈한 혈액으로부터 연속 Ficoll/Pelastin 수용체 복합체 (ERC)oll 농도 구배 원심분리를 이용하여 인간 단핵구를 도처에 기술된 바와 같이 단리한다. 세포는 0.5% 인간 혈청이 첨가된 RPMI-1640 배지에서 16시간 동안 배양하여 단리 후 휴지 상태로 만든다. 세포의 순도는 유세포 측정 분석으로 결정한 바에 따르면 >95%이다. 단핵구 화학주성은 48웰 미세화학주성 챔버 (Neuroprobe, Gaithersburg, MD)에서 무혈청 배지 하에 분석한다. 상부 챔버 및 하부 챔버에서 웰들은 폴리비닐피롤리돈-프리 폴리카보네이트 부재 (기공 크기 5 ㎛; Costar)에 의해 분리된다. 신선하게 단리한 단핵구는 밀도 5x105/mL에서 재조합 C-펩타이드 (Sigma)와 함께 2.5시간 동안 인큐베이션한 다음 필터 바닥면 상의 이동한 세포를 염색하여 광 현미경에서 계수한다. 최대 화학주성 활성은 0.1 mmol/L N -포르밀-메티오닐-루실-페닐알라닌 (f-MLF; Sigma Chemical Co)을 이용해 측정하고, 바둑판 분석으로 화학주성을 화학운동성 (chemokinesis)과 구분한다.
세포 단리
건강한 자원자로부터 채혈하여 항응고제로서 사이트레이트가 함유된 관에 수집한다. 호중구는 Polymorphprep kit (Nicomed, Oslo, Norway)를 제조사의 지침에 따라 사용해 단리하고; 단핵구는 자기 비드 (Miltenyi Biotech)를 이용해 정제한다. 세포의 순도는 유세포 측정 (anti-CD45, 14, DR 및 CD66b)에 의해 평가한 바에 따르면 >93%이다. 각각의 세포 유형들에 대해 2명의 기증자로부터 수득한 샘플을 조사한다.
마우스에서 정맥내 주사한 [14C]-AQGV의 분포 및 소거
본 시험은 네덜란드 우트레히츠백에 위치한 TNO Biosciences 사에서 수행하였으며, 50 mg/kg을 정맥내 1회 용량으로 투여한 후 CD-1 수컷 마우스에서 [14C]-AQGV (Ala-Gln-[1-14C]Gly-Val)의 분포 및 대사 데이터를 제공하기 위해 고안되었다. 이를 위해, 방사성 표지된 AQGV를 투여한 후 10분, 30분, 60분, 6시간 및 24시간 경과 시점에 마우스를 희생시키고, 다양한 조직에서 수치를 확인하였으며, 뇨 및 혈장에 존재하는 방사능을 HPLC에 의해 분석하였다.
방사성 표지된 펩타이드를 주사한 후 10분 경과시 혈중 방사능은 비교적 낮았다. 모든 카운트가 온전한 펩타이드에 대한 것이라면, 존재하는 양은 17.2 ㎍/g일 것이다. 그러나 10분 후 혈장에서는 모 화합물을 검출할 수 없었으며, [14C]-AQGV는 매우 빨리 가수분해되는 것으로 나타났다. 모 화합물은 뇨에서도 검출되지 않았다. 소변에서 방사능은 대부분 HPLC 컬럼의 데드 부피 (dead volume)에 또는 그 직후에 용출되는 친수성 화합물로서 존재한다.
다양한 장기들에 존재하는 방사능은 혈중 방사능을 초과하였다. 10분 후 "펩타이드"의 최고 농도는 신장 (362 ㎍/g), 간 (105 ㎍/g), 고환 (85.7 ㎍/g), 폐 (75.2 ㎍/g) 및 비장 (74.7 ㎍/g)에서 확인되었다. 일반적으로, 이후에 점차적인 방사능 감소가 관찰되었다. 24시간 후, 최고 농도는 신장 (61.9 ㎍/g), 흉선 (43.1 ㎍/g), 비장 (39.3 ㎍/g), 간 (37.6 ㎍/g) 및 피부 (37.5 ㎍/g)에서 확인되었다.
용량 투여 후 10분, 30분, 60분, 6시간 및 24시간 경과시 방사능의 평균 총 회수율은 각각 83.2%, 70.5%, 62.9%, 52.6% 및 50.8%였다. 이들 결과는, 용량 투여 후 [14C]-휘발성 물질, 아마 대부분 14C-CO2가 빠르게 생성되어, 날숨을 통해 배출됨을 명백하게 보여준다. 24시간 후 투여된 방사능은 10.2%가 소변으로, 2.6%는 대변으로 배출된다.
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결론
정맥내 주사 후, [14C]-AQGV는 혈액으로부터 빠르게 제거되었다. 이는 아래 제시된 약동학 실험의 결과와 일치한다. 혈액 혈장 및 뇨 내 대사산물 프로파일에서는 모 화합물이 발견되지 않았으며, 이는 [14C]-AQGV의 빠른 대사를 의미한다. 투여된 방사능의 약 50%는 휘발성 물질로서, 아마 대부분 14C-CO2로 최대 24시간 이내에 배출된다. 본 실험의 결과는 [14C]-AQGV가 빠르게 가수분해되어 [1-14C]-글리신이 생성되고 이후 14C-CO2로 대사되어 호기시 배출됨을 보여준다. 혈장 및 뇨 내 모화합물의 부재는, 조직 및 장기에 존재하는 방사능이 [14C]-AQGV 대사의 가수분해 생성물로만 존재할 수 있음을 시사해준다.
펩타이드 가수분해
본 발명은, 펩타이드 AQGV와 같은 자가포식-저해성 아미노산을 함유한 펩타이드가 세포와 접촉하게 되면, 펩타이드가 세포의 표면에서 세포외 가수분해되거나, 또는 혈관 세포의 경우에는 엔도사이토시스 후 예를 들어 파고리소좀 (phagolysosome)에서 세포에 의한 펩타이드의 엘라스틴 수용체 매개 엔도사이토시스에 의해 가수분해됨을, 제시한다. 펩타이드를 빨리 가수분해할 수 있는 다수의 펩티다제들이 세포 상 또는 세포 내에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 계속적인 가수분해로 트리펩타이드 및 다이펩타이드가 늘 생성된다. 마찬가지로, 리소좀에서 트리펩티딜 및 다이펩티딜 펩티다제에 의한 가수분해는 동일하게 단일 아미노산을 생성시킬 것이다. 14C 표지된 AQGV를 이용한 연구에서 실제 마우스에 투여한 후 15분 이내에 펩타이드가 완전히 가수분해되는 것으로 밝혀졌다. 세포에 제시되었을 경우, AQGV 또는 이의 유사 화합물 LQGV의 가수분해로부터, 또는 이런 점에서 임의의 다른 적합한 올리고펩타이드로부터 트리펩타이드, 다이펩타이드 및 단일 아미노산이 만들어질 것이다.
펩타이드 수송
마찬가지로, 몇몇 연구들이 여러가지 타입의 성숙한 과립구 생존에서 p38 MAPK의 역할을 발표하였다. 과립구 (예, 호중구, 호산구, 호염구)는 공통적인 최종 분화 단계를 가진다. 이들 세포는 단편화된 핵 (fragmented nuclei)을 가지고 있으며, 사전 형성된 분비 인자를 함유한 과립들이 축적되어 있다. 본원에서, p38 MAPK는 호중구 생존에 필수적이고, p38 MAPK의 비활성화는 이들 세포의 사멸 및 소거에 필요할 뿐 아니라, p38 MAPK는 내피 세포의 수축에 필요하고 p38 MAPK의 비활성화는 혈관 벽 온전성을 회복할 수 있도록 혈관 세포를 이완하는데 필요한 것으로 제안되었으며, 또한 p38 MAPK 활성의 비활성화는 혈관 내피 혈관벽의 혈관 투과성을 탐색하는 호중구 및 기타 백혈구를 진정시키는데 필수적이다.
다이펩타이드 및 트리펩타이드는 PEPT1/2 수송체를 통해 선택적으로 수송된다. 트리펩타이드, 다이펩타이드 및 단일 아미노산은 세포막을 통해 능동적으로 수송되며, 다이펩타이드와 트리펩타이드의 흡수는 단일 아미노산의 흡수와는 별개의 기전을 통해, 즉 PEPT1 및 PEPT2 수송체를 통해 이루어진다. 잠재적으로, 모든 400종의 다이펩타이드와 8,000종의 트리펩타이드가 PepT1 및 PEPT2가 수송될 수 있다. 아미노산을 펩타이드 형태로 장 세포로 수송하는 것이 이를 구성하는 아미노산의 유리 형태보다 단위 시간 당 더 빨리 흡수되는 경로인 것으로 입증되어 있다 (J Anim Sci, 2008; 9, 2135-2155에서 검토됨).
mTOR 참여.
마지막으로, 본 발명자들은 라파마이신의 기계론적 표적, mTOR의 관여를 제안한다. 이러한 관점에서, 펩타이드는 PEPT1/2를 통해 또는 능동적인 엔도사이토시스 또는 식세포 과정을 통해 세포에 들어간 다음 펩타이드는 파고리소좀에서 완전히 가수분해되고, 생성된 자가포식-저해성 아미노산은 mTOR 복합체에 제시되어 세포의 자가포식을 저해하게 된다. 테트라펩타이드, 트리펩타이드 및 다이펩타이드 활성은 아미노산 A, Q, G, V, L 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단일 아미노산 A, Q, G, V의 최종적인 인과 활성 (causal activity)을 모두 반영할 수 있다. 이런 방식으로, 아미노산 A, Q, G, V, L 및 P가 mTOR에 대한 기질 (food)이다. 실제, 예비 결과는 FPR-신호전달 분석에서 AQGV로부터 유래한 여러가지 트리펩타이드 및 다이펩타이드를 이용하였을 때 p38 경로에 대한 유사한 저해 효과를 보여준다. 개개 아미노산이 세포질을 통해 mTOR에 접근할 수 있지만, 아미노산은 펩타이드 단편 (AQGV와 같은 가닥) 형태로 파고리소좀을 통해 mTOR 기구에 들어갈 가능성이 더 높다. 아미노산에 의한 mTOR의 활성화는 따라서 2가지 관점으로 설명할 수 있다, 1) 펩타이드 가닥의 엔도사이토시스는 호중구 및 단핵구와 같은 모든 식세포에 가장 중요하고, 2) 펩타이드 단편은 PEPT1/2를 통해 도입된다.
아미노산은 mTOR 경로를 활성화하고, 자가포식을 저해한다.
자가포식은 영양소가 부족할 경우에 세포 생존을 위해 아미노산을 생산하는 역할을 하며, 아미노산이 자가포식에 대한 효과적인 저해제이다. mTOR (Mechanistic-target-of-rapamicin)은 자가포식 유도의 중요한 조절인자로서, 활성화된 mTOR은 자가포식을 억제하고, mTOR의 네거티브 조절은 이를 촉진한다. 아미노산은 실제 세포 증식, 단백질 합성, 자가포식 및 생존에 영향을 미치는, mTOR 복합체 1 또는 2 활성화에 중요한 조절인자인 것으로 간주된다. 이러한 사실들로 아미노산에 의해 이용되는 새로운 신호전달 경로를 동정하게 되어, 세포 대사에서 이들 영양소의 결정적인 중요성을 부각시키고 약제학적 활성 펩타이드 개발에 새로운 기계론적 통찰력을 제공해준다.
mTOR 경로에 대한 아미노산의 차등 신호전달 (differential signaling).
일부 아미노산은 특히 단백질 생성 (mTOR 키나제) 또는 단백질 분해 (자가포식)를 조절하는 것으로 알려져 있다. 최근 데이터와 과거 데이터 (2011년 11월 문헌 검색)에서, 효과가 없거나 또는 반대 효과를 가진 것으로 발표된 글루타메이트 (E), 트레오닌 (T), 세린 (S), 라이신 (K), 트레오닌 (T), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y) 및 메티오닌 (M)과 같은 다른 아미노산에 비해, mTOR에 대한 강력한 활성인자로서 또는 자가포식의 저해제로서, 단독으로 또는 조합 형태로서, 루신 (L), 발린 (V), 이소루신 (I), 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 아르기닌 (R), 글리신 (G), 프롤린 (P)가 동정되었다. 아미노산 루신 (L), 알라닌 (A), 글루타민 (Q) 및 프롤린 (P)은 인간 세포에서 가장 현저한 자가포식 효과를 가진 것으로 보고되어 있다 (AJ Meijer et al Amino Acids 2015, 47, 2037-2063).
표
자가포식을 저해하는 아미노산으로 농화된 펩타이드
전술한 아미노산으로 농화되고 질환을 하향-조절하는 펩타이드에 대한 예는, 예를 들어, 다이펩타이드 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV, 트리펩타이드 AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, Q0LG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG 또는 테트라펩타이드 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV, 및 이들의 혼합, 예를 들어 AQ + GV, AQ + VG, LQ + GV 및 LQ + VG이며, 이는 본원에서 다이펩타이드 AQ, QQ, LQ, GQ, PQ, VQ, AL, LL, QL, GL, PL, VL, QA, QL, QG, QP, QV, LA, LG, LP, LV, 트리펩타이드 AQG, QQG, LQG, GQG, PQG, VQG, ALG, LLG, QLG, GLG, PLG, VLG, QAG, Q0LG, QGG, QPG, QVG, LAG, LGG, LPG, LVG 또는 테트라펩타이드 AQGV, QQGV, LQGV, GQGV, PQGV, VQGV, ALGV, LLGV, QLGV, GLGV, PLGV, VLGV, QAGV, QLGV, QGGV, QPGV, QVGV, LAGV, LGGV, LPGV, LVGV 또는 이들의 혼합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로서 제공된다. 다른 펩타이드는 바람직하게는 mTOR을 선호적으로 활성화하거나 또는 자가포식을 선호적으로 저해하는 아미노산을, 바람직하게는 A, G, L, V, Q 및 P로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 펩타이드 가닥으로 조합하여 소형 펩타이드를 생성 또는 합성함으로써 쉽게 수득한다.
추정의 작용 방식
투여된 펩타이드 또는 이의 아미노산 단편은 예를 들어 아미노산 수송, PEPT1/2 수송, 공통적인 엔도사이토시스, 혈관 세포의 경우에는 엘라스틴 수용체 매개 엔도사이토시스 또는 공통적인 식세포 작용에 의해 흡수된다. 내재화된 펩타이드는 가수분해되고, 이의 아미노산이 mTOR의 영양-감지 시스템에 제시된다. 본원에서 드러난 바와 같이, 이들 펩타이드는 바람직하게는 mTOR의 영양소-감지-시스템에 작용할 수 있기 전에 개별 아미노산으로 가수분해되어야 하며, 따라서 수용체 매개 활성이 명확하게 입증되지 않은 이유를 이해할 수 있다. 세포 전달과 관련하여, 대부분의 다이펩타이드 및 트리펩타이드는 장 상피 세포, 신세뇨관 세포 및 기타 세포에 존재하는 PEPT1/2 수송체에 의해 쉽게 흡수된다. 또한, 테트라펩타이드 내지 헥사펩타이드 흡수는 공통적인 엔도사이토시스에 의해, 혈관 세포의 경우 엘라스틴 수용체 매개 엔도사이토시스에 의해 정기적으로 달성되어, 세포가 이를 식세포 작용에 의해 흡수하도록 표적화 된다. 내재화된 펩타이드는 가수분해되고, 이의 아미노산이 mTOR의 영양소-감지-시스템에 제시된다. 본원에 제시된 광범위한 작용 방식을 고려하면, 본원에 제공된 조직-복구 신호 분자 펩타이드는 다수의 생물학적 요법과의 병용 치료에 유리하게 이용할 수 있다.
합리적인 설계
새로운 유형의 자가포식-저해성 펩타이드 (본원에서 자가포식-저해성 분자로도 지칭됨)의 상당한 이점은 합성, 안정화 및 변형 용이성이며, 주요 요건은 mTOR의 영양소 감지 시스템을 표적화하고 자가포식을 선호적으로 저해하는 아미노산을 포함한다는 것이다.
인간 시험
새로운 화합물 AQGV의 약동학, 안전성 및 내약성
배경 및 목적
AQGV의 약리학, 약동학 및 독성에 대해 수행된 광범위한 연구는 처음에 인간 연구에서 AQGV의 용량을 높이면서 1회 투여로 이전에 수행되었으며, AQGV는 3일간 최대 i.v. 용량 30 mg/kg을 매일 3회 (일일 용량 90 mg/kg) 투여시 내약성이 양호하였으며, 실험 치료와 관련한 이상 사례는 나타나지 않은 것으로 확인되었다.
I상 실험의 목적은 인간에서 AQGV의 약동학 (PK), 안전성 및 내약성을 평가하는 것이었다.
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방법
건강한 개체를 대상으로 한 이중-맹검, 무작위, 위약-대조, 용량-증량형 I상 실험 3가지를 수행하여 AQGV의 안전성, 내약성 및 약동학을 평가하였다. 첫번째 단일 용량 실험에서는, 개체 32명을 단일 투여량 군 4종 (1, 3, 10 또는 30 mg/kg)으로 할당하였다. 2번째 다중 투여 실험에서는 개체 24명을 투여 군 3종 (10, 20 또는 30 mg/kg)으로 할당하여, 3일간 매일 3회 시험 약물을 제공하였다. 3번째 연속 투여 실험에서는 개체 24명을 투여 군 3종 (15, 30 또는 90 mg/kg/hour)으로 할당하여, 2시간 연속 IV 주입으로 시험 약물을 투여하였다. 약동학 (PK), 안전성 및 내약성 평가를 최대 14일간 수행하였다.
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결과
AQGV의 PK는 최고 투여량 (범위: 126-137%), 최고 투여 부피 (범위: 4-33 L/kg), 신속 청소율 (fast clearance rate)(범위: 26-61 L/h/kg) 및 단기 추정 반감기 (범위: 2-22분)에 대해 노출시 비례 증가를 능가하는 증가를 보였다. AQGV는 내약성이 양호하고 안전성 문제는 관찰되지 않았으며; 심각한 이상 사례 (SAE) 또는 이상 사례 (AE)로 인한 투여 중단은 보고되지 않았다. AE 1건을 제외한 모든 사례가 경미하였으며, 6명만 시험 약물 치료와 관련 가능성 있는 AE가 관찰되었으며, 3명은 AQGV를 3명은 위약을 투여받은 개체였다. 그외 발생한 AE 사례들 모두 시험 약물 치료와 관련있지 않거나 또는 가능성이 없는 것으로 간주되었다.
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결론
여러가지 투여 전략을 이용한 용량-증량식 I상 실험에서 투여 부피가 크고 반감기가 짧은 AQGV의 PK 프로파일이 드러났다. 아울러, AQGC의 i.v. 투여는 내약성이 양호하였으며, 안전성 문제는 발생하지 않았다.
용해성 실험
펩타이드 투여
임상 시험 프로토콜 (Groenendael et al., JMIR Res Protoc 2019 Feb; 8(2): e11441)에서 확인된 시험 약물 EA-230 제형은 무균 5 mL 유리 바이얼에 1500 mg/바이얼로 충진 및 제공되며, 최종 농도 300 mg/mL 및 삼투질 농도 800 내지 1000 mOsm/kg로 주사용수에 용해된다. 위약 제형은 동일한 무균 5 mL 유리 바이얼에, 용액이 동일한 삼투질 농도를 가지도록 29 mg/mL을 함유한, 주사용수에 희석되는 염화나트륨으로 구성된다. EA-230 및 위약은 적량의 EA-230 또는 위약을 생리 식염수 (normal saline) 1000 mL에 무균 조건 하에 첨가함으로써, 삼투질농도 <400 mOsm/kg으로 정맥내 연속 주입하기 위해 준비된다.
활성 물질을 더 고 농도로 함유한 원액 용액에 대한 요구성.
본원에 언급된 임상 실험에서 이용한 EA-230 제형 (원액 용액)이 든 바이얼은 EA-230 1.5 g을 포함하며, 각 바이얼에는 5 ml, 300mg/ml [(300g/L = 0.8 mol/L) AQGV, 분자량 373 g/mol]이 수용된다. 시험에서, 활성 물질의 주입을 적어도 1.5시간, 바람직하게는 적어도 2.5시간, 바람직하게는 적어도 3.5시간, 더 바람직하게는 적어도 4.5시간 동안 시간 당 90 mg/kg으로 지속할 경우에 최상의 치료 실무가 확립되었다. 그 결과, 또한 체중에 따라, 필요한 관리를 위해 수술실 또는 ICU에서 (훨씬) 많은 노동을 소모하게 되는 투여 요건인, 효과적인 치료를 지속하기 위해 종종 바이얼 12-17개 이상이 필요하였다. 이렇듯 EA-230 제형의 원액을 매우 적은 양으로 이용하는 치료의 문제는 이용가능한 제형보다 더 많은 더 나은 농축된 원액 용액을 제공할 필요성을 제기한다.
응집점 결정
본원에서, 다수의 약물-유사 분자들이 수성 매질에서 자가-응집할 수 있으며, 응집물이 실험 결과와 임상 결정을 왜곡하는 물리화학적 특성을 가질 수 있는 것으로 이해된다. 펩타이드 약물의 응집은 생물학적 약물 개발의 거의 모든 단계에서 직면하는 가장 일반적이고 문제가 되는 과정 중 하나이다. 응집은 몇몇 여러 형태를 취할 수 있으며, 이 용어는 여러가지 다수의 공정 중에 펩타이드 분자가 복수의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 더 큰 종으로 결합하는 것을 기술하기 위해 사용된다. 응집물은 비결정성이거나 또는 고도로 정렬된 형태, 예를 들어 아밀로이드 원섬유일 수 있으며, 흡착으로 인해 표면 상에 또는 용액 중에 형성될 수 있다. 이는 폴리펩타이드 사슬의 비-공유 결합의 결과로서 생기거나 또는 사슬들의 공유 결합으로 생길 수 있다. 일부 경우에, 응집은 가변적이며, 다른 경우에는 효과적으로 비가역적이다. 어떤 경우에, 대상 펩타이드의 물리적 안정성을 감소시켜, 활성 감소뿐 아니라 독성 및 면역원성과 같은 다른 중대한 문제를 야기한다.
염은 입체형태 및 콜로이드 안정성 둘다에 영향을 미치는 생체분자의 물리적 안정성에 복잡한 영향을 미친다. 이러한 영향은 흔히 펩타이드 상의 표면 전하에 따라 다양하며, 물리적 안정성에 미치는 염의 전반적인 영향은 염이 물 및 생체분자와 상호작용하는 서로 다른 다양한 기전들의 균형이다. 다양한 염들이 펩타이드-용매 시스템의 특성 (Hofmeister 효과) 및 정전기 상호작용 (Debye-Huckel 효과)을 변형함으로써 물리적 안정성에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명자들은 변형된 진탕 플라스크 방법을 이용해 프로토타입 자가포식-저해성 펩타이드 AQGV을 대상으로 염 7종의 용해성을 조사하고자 하였다. 먼저, AQGV-Ac 염을 유리 염기로 변환하고, 이를 유기 용매로 추출한 다음 진공 농축한다. 그런 후, 사이트레이트, 말리에이트, 설페이트 (KHSO4), 아데노신 모노-포스페이트, 아데노신, 아세테이트 및 타르타르산 염을 준비하고, 추후 이의 용해성을 스크리닝한다.
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결과
유리 염기로의 변환.
AQGV-Ac는 중성 용액 (pH= 6-7)으로부터 구성된 용매로 추출하기 불가능한 것으로 판명되었다. 이에, 수중 AQGV-Ac 용액을 이온 교환 컬럼 (Amberlite, 대략 100 mL; IR120, H 수지)에 투입하였다. 컬럼은 탈염수 (demi-water)로 헹군 다음 1N 암모니아-용액을 주입하였다. 처음 염기성 분획 3개를 농축하여, 유리 염기 AQGV 4.7 g (1H-NMR)을 수득하였다.
용해성 측정.
염의 농축 DMSO 용액을 제조하기 위해 유리 염기의 용액과 산을 먼저 혼합하고자 시도한 다음 용해성을 결정하기 위해 물에 이를 희석하였다. 그러나, 시도한 염 (아데노신 및 구연산)이 DMSO에 전혀 용해되지 않았다. 실제, 혼합물은 약간의 물 첨가 후 투명해졌다. 즉, 용해성 결정은 원래 계획한 대로 수행할 수 없었다. 기지량의 염 (비-용해성)을 맑은 용액이 수득될 때까지 희석함으로써 필요한 염의 용해도를 결정하고자 하였다.
구연산의 경우, 1 mmol AQGV 및 1 mmol 구연산을 0.9% NaCl 0.5 mL 중에 혼합하였다. 이로써 맑은 용액이 수득되었다. AQGV와 구연산을 추가로 (0.5 및 0.25 mmol) 첨가하여, 총 2.75 mmol을 0.9% NaCl 0.5 mL에 용해하였다. 이 혼합물은 맑게 유지되었지만, 매우 진하고/끈적하였다. 나머지 실험은 다르게 수행하였다: 염 1 또는 0.5 mmol을 4 ml 바이얼에 칭량하고, 1주일 이상 맑게 유지되는 맑은 용액이 수득될 때까지 0.9% NaCl을 첨가하였다. 아데노신 및 아데노신-모노포스페이트의 경우에는 맑은 용액을 수득할 수 없었다.
표 1에 나타낸 결과에 따르면, 응집된 펩타이드-염을 대상으로 스크리닝한 중성의 자가포식-저해성 펩타이드-염이 해리되는 경향이 관찰되기 직전 농도 (응집점, 표 2 참조)를 결정하였다. 음이온 변화가 AQGV의 용해도 특징에 현저하게 영향을 미치는 것으로 결론 내릴 수 있다. AQGV-구연산 (AQGV-사이트레이트, > 5.5mol/L) 및 -타르타르산 (AQGV-타르트레이트) 염에서는 더 높은 용해도 (0.9% NaCl에서의 용해도) 및 더 높은 응집점이 관찰된 반면, 말레산 및 KHSO4 염은 AQGV-Ac (2mol/L)와 비교해 더 낮은 용해도를 나타내었다. 아데노신-모노포스페이트 또는 아데노신을 이용한 경우 용해도를 구하지 못하였다. 구연산은 특수 사례인 것으로 보인다. 고도 농축된 용액은 결정화되거나 또는 응집되진 않았지만, 점성이 높은 용액을 형성하는 경향이 관찰되었다.
응집 위험을 감안해, 임상 시험에 사용하기 위한 AQGV-펩타이드의 원액 용액이 든 바이얼은 용액에 활성 물질을 (0.8 mol/L) 이하로 함유하였다. 본 발명에 기반하여, 유기산의 AQGV-염, 특히 현재 AQGV-펩타이드-말리에이트, AQGV-펩타이드-아세테이트 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액은, AQGV-펩타이드-아세테이트, AQGV-펩타이드 타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트를 적어도 0.85 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 0.9 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.2 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.4 mol/L, 더 바람직하게는 적어도 1.6 mol/L, 가장 바람직하게는 적어도 1.8 mol/L로 함유하도록 제공되거나 또는 제조된다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 AQGV-펩타이드의 농도가 2 mol/L 내지 2.5 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-타르트레이트 또는 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 2.5 mol/L 내지 3 mol/L 범위인 AQGV-펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3 mol/L 내지 3.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 3.5 mol/L 내지 4.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 4.5 mol/L 내지 5.5 mol/L 범위인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 더 바람직한 구현예에서, 본 발명은 펩타이드-사이트레이트의 농도가 5.5 mol/L 이상인 상기한 펩타이드-사이트레이트의 원액 용액을 제공한다. 바람직하게는, 상기 원액 용액은 수성 용액이다.
타르타르산은 2,3-다이하이드록시부탄다이온산으로도 알려져 있는, 이양자성 알다르산 (diprotic aldaric acid)이다. 이는 다수의 식물, 특히 포도, 바나나 및 타마린드에서 자연적으로 생성되며, 일반적으로 레시피에서 베이킹 소다와 조합하여 팽창제 (leavening agent)로서 기능하며, 와인에서 발견되는 주요 산 중 하나이다. 이는 신맛을 내기 위해 다른 식품에 첨가되며, 항산화제로도 이용된다. 타르트레이트는 타르타르산의 염 또는 에스테르이다. 타르타르산의 염은 타르트레이트로 알려져 있다. 타르타르산은 숙신산의 다이하이드록실 유도체이다. 소듐 타르트레이트는 투명한 무색 무취 결정으로 생성되는 (+)-타르타르산의 다이소듐 염이다. 이는 와인 생산의 부산물로서 수득된다. 소듐 타르트레이트는 일반적으로 직접적인 인간 식품 성분으로서 안전한 (GRAS) 것으로 인정된다. 이는 식품 제품에서 유화제 및 pH 조절제로서 작용한다. 이는 메토프로놀 (Am J Kidney Dis. 2014 Dec;64(6):883-91) 및 에르고타민 (Can Med Assoc J. 1935 Dec;33(6):664-5)의 경구 흡수 증가를 돕는 것으로 알려져 있다. 타르트레이트를 약학적 부형제로서 포함하는 단백질 조성물이 비강용 약학적 제제에 안정성을 제공하는 것으로 발표되어 있다 (US07716390). 최근 데이터에서 실데나필의 사이트레이트 염 및 타르트레이트 염 둘다의 다형체 형태들이 동일한 것으로 드러났으며, 이는 타르트레이트가 사이트레이트에 대한 대안적인 부형제로서 이용할 수 있음을 의미한다 (Research J. Pharm. and Tech 2018; 11(5):2086-2093. doi: 10.5958/0974-360X.2018.00387.6).
구연산은 2-하이드록시프로판-1,2,3-트리카르복시산이라고도 알려져 있는, 시트러스 열매에서 발견되는 트리카르복시산이다. 구연산은 이의 항산화 특성으로 인해 약학적 제제에 부형제로서 흔히 사용된다. 이것은 활성 성분의 안정성을 유지시키고, 보존제로서 이용된다. 이는 또한 pH를 조절하기 위한 산매제로서 사용되고, 혈중 칼슘을 킬레이팅함으로써 항응고제로서 작용한다. 사이트레이트는 구연산의 염 또는 에스테르이다. 구연산 염이 사이트레이트이다. 소듐 사이트레이트는 흡수되면 소듐 양이온과 사이트레이트 음이온으로 해리되고; 유기 사이트레이트 이온이 바이카보네이트 이온으로 대사되어 혈중 바이카보네이트 농도 증가로 이어져 과도한 수소 이온을 완충시키고, 혈중 pH를 증가시키며, 잠재적으로 산증을 역전시킨다. 아울러, 소듐 사이트레이트 투여로 인한 유리 소듐 부하 증가는 혈관내 혈액량을 증가시켜, 바이카보네이트 화합물의 배출 및 항-결석 효과를 촉진할 수 있다. 사이트레이트는 혈장사혈 (plasmophoresis)시 항응고제로뿐 아니라 배탈 및 산성 뇨의 치료시 중화제로서 사용된다. 소듐 사이트레이트는 일반적으로 직접적인 인간 식품 성분으로서 안전한 (GRAS) 것으로 인정된다. 사이트레이트는 사이트레이트-항응고 처리된 CVVH (continuous venovenous haemofiltration) 시술 중인 중환자에게 사용된다. 구연산은 약학적 부형제로서 여러 기전을 통한 소분자 및 단백질의 경구 흡수를 개선하는 것으로 발표된 바 있다. 단백질 저해와 비교해 장 투과성 강화와 이의 칼슘 킬레이션 관련 특성 간의 균형이 이전에 인슐린을 이용해 조사되었다 (Eur J Pharm Biopharm. 2014 Apr;86(3):544-51). 사이트레이트는 또한 실데나필의 경구 흡수 증가를 돕는 것으로 알려져 있으며 (Int J Impot Res. 1996 Jun;8(2):47-52), 기침 시럽에 부타미레이트 사이트레이트로서 함유된다 (Rev Med Suisse Romande. 990 Nov;110(11):983-6).
FPR
매개 혈관 투과성 및 저혈압
내피 세포의 능동 수축이 혈관 투과성을 조절한다는 개념은 1961년에 Majno (J Biophys Biochem Cytol (1961) 11:571.10.1083/jcb.11.3.571)에 의해 처음으로 제안되었지만, 현재 내피 수축 활성을 조절하는 세포내 현상은 여전히 비교적 알려져 있지 않다. N-포르밀 펩타이드는 포르밀 펩타이드 수용체 (FPR)를 활성화하는 미토콘드리아 및 박테리아의 공통적인 분자 시그니처이다. N-포르밀-메티오닐-루실-페닐알라닌 등의 미토콘드리아 N-포르밀 펩타이드 (F-MIT)에 의한 또는 박테리아 N-포르밀 펩타이드 (F-MLP)에 의한 FPR 활성화는, 혈관 누출 및 백혈구 혈관외유출 증가와 더불어 내피 세포 수축성 증가로 이어지는, 세포골격-조절 단백질의 변화를 내피 세포에서 유발한다. FPR 활성화는 외상 후 손상된 장벽 기능에 대한 핵심적인 기여인자이다. 환자에서 손상된 조직으로부터 유래한 미토콘드리아 성분이 혈관 누출 발생을 개시할 수 있는 것으로 제안된 바 있다 (Wenceslau et al., Front Immunol. 2016; 7: 297). 진화적인 이유로, 미토콘드리아는 박테리아와 몇가지 특징들을 공유하는데, 미토콘드리아의 단편들이 순환계로 방출되면 이는 포르밀-펩타이드-수용체 (FPR)를 가진 세포에 의해 인지된다. 박테리아 및 미토콘드리아에서 포르밀-메티오닌에 의한 단백질 번역 개시로 인해, N-포르밀 펩타이드가 박테리아와 미토콘드리아의 공통된 분자 시그니처이고, 포르밀 펩타이드 수용체 (FPR)를 활성화함으로써 혈관 누출을 개시하는데 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.
FPR은 G-단백질 커플링된 수용체의 서브패밀리로 동정되었다. 최근 증거는, 또한, FPR이 혈관 시스템의 기계적 유체 응력을 감지하여 세포내 캐스케이드 신호를 전달하는 막 기계센서인 것으로 보인다. 또한, 미토콘드리아 N-포르밀 펩타이드 (미토콘드리아 NADPH 데하이드로게나제 서브유닛 6의 NH2-말단에 해당하는 포르밀화된 펩타이드; F-MIT) 및 fMLP (박테리아 유래) 둘다 저항 동맥 (resistance artery)에서 혈관 확장 악화 및 혈관 누출을 유도하고, FPR 길항제가 이러한 반응을 저해하는 것으로도 관찰된 바 있다. 비-포르밀화된 펩타이드 또는 미토콘드리아 DNA는 그렇지 않지만, F-MIT 역시 FPR 활성화 및 히스타민 방출을 통해 중증 저혈압을 유도하였다 (Wenceslau et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2015 Apr 1; 308(7):H768-77). 미토겐-활성화된 단백질 (MAP) 키나제는 상해 등의 여러 자극에 반응하여 신호전달 캐스케이드를 개시하는 스트레스 활성화된 효소 패밀리이다. p38 MAPK 키나제가 액틴 세포골격의 재구성을 유도하여 스트레스 섬유를 형성시키고 혈관 투과성을 높이는 것으로, 이전에 밝혀진 바 있다 (Kayyali et al., J Biol Chem (2002) 277(45): 42596-602.10.1074/ jbc.M205863200). 아울러, 최근에는, p38 MAPK 경로의 저해가 내피 세포 수축을 현저하게 낮춤으로써 발생하는 혈관 기능장애를 개선하는 것으로 입증되었다 (Wang et al, APMIS (2014) 122(9):832-41.10.1111/apm.12226). 결론적으로 외상/세포 손상으로부터 방출된 미토콘드리아 N-포르밀 펩타이드 (F-MIT)가 포르밀 펩타이드 수용체 (FPR)를 활성화한다. 이러한 현상은 내피 세포 세포골격에 p38 MAPK 키나제 활성화된 변화를 유발하며, 이후 내피 수축으로 이어지며 부종, 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압을 동반한 혈관 투과성 등의 유해한 혈관 효과를 유발한다.
자가포식
-
저해성
펩타이드는
FPR
-투과성 및 혈관 누출을
세포골격
변화를 저해함으로써 조절한다.
본 발명자들은, AQGV 및 기능성 유사체와 같은 자가포식-저해성 펩타이드가 내피 세포 세포골격에 p38 MAPK 키나제 활성화된 변화를 조절하여, 이후 내피 세포 수축을 조절하고 혈관 투과성, 백혈구 혈관외유출 및 저혈압을 개선함을, 기술한다. 미토겐-활성화된 단백질 (MAP) 키나제는 상해 등의 여러 자극에 반응하여 신호전달 캐스케이드를 개시하는 스트레스 활성화되는 효소 패밀리이다. 이전에 밝혀진 바와 같이, p38 MAPK 키나제는 내피 세포에서 액틴 세포골격의 재구성을 유도하여 스트레스 섬유를 형성시키고 혈관 투과성을 높인다 (Kayyali et al., J Biol Chem (2002) 277(45):42596-602.10.1074/ jbc.M205863200). 아울러, 손상되거나 스트레스 받은 내피 세포는 내피 세포에서 PI3K/Akt/mTOR 경로에 대한 p38 신호전달 효과를 통해 액틴 세포골격의 긴급한 재구성을 활성화하는 것으로 보인다. 이러한 내피 세포의 스트레스에 대한 급성 반응은 PI3K/AKT/mTOR 경로의 하향 조절 및 자가포식의 상향 조절 맥락에서 발생하여, 이러한 세포에서 단백질 생성에서 단백질 분해 쪽으로 균형이 이동한다. 또한, 최근 밝혀진 바와 같이, p38 MAPK 경로의 저해는 내피 세포 수축을 현저하게 낮춤으로써 발생하는 혈관 기능장애를 개선한다 (Wang et al, APMIS (2014) 122(9):832-41.10.1111/apm.12226).
FPR-발현의 프로토타입 세포-시스템으로서 인간-유래 말초혈 단핵구를 네덜란드 흐로닝언 대학 의학센터에서 일반적인 공정1에 따라 건강한 자원자 (hPBMC)로부터 단리하였다. 이후, AQGVPMBC를 Biotempt-공급 펩타이드 (이는 이차 증류수 중의 20 mg/ml 원액으로서 신선하게 준비됨)와 함께 인큐베이션하거나 또는 비히클로 10분간 처리하였다. 그 후, hPMBC에 1 μM fMLP를 다양한 시간 동안 챌린지하였다 (결과 도 4a, b, 4c 및 4d 참조). 각 자극 물질 0, 30, 60, 300 및 600초, AQGV 농도 2종 20ng/ml 및 50ng/ml, 6배, 지정된 시간 동안 fMLP로 자극한 후, p38MAPK, JNK, PKB, P42/p44MAPK/ERK1,2 및 STAT3의 인산화 상태를 분석하였다3. STAT3, JNK 및 P42/p44MAPK/ERK1,2에서는 검출가능하지 않았다.
그 결과 (도 4 참조), 프로토타입 FPR-리간드 fMLP를 이용한 FPR-발현 세포의 FPR-활성화가 빠르게 유발되고, PKB (AKT로도 알려짐)(도 4a) 및 p38 MAPK 키나제 (도 4c)의 인산화 상태가 현저하게 (p < 0.05; p38 60-600초, PKB 600초) 변경되었지만, STAT3, JNK (도 4b) 및 P42/p44MAPK/ERK1,2 (도 4d) 키나제에서는 그렇지 않은 (또는 검출되지 않는) 것으로 밝혀졌다. p38 MAPK에 대한 AQGV 효과 (도 4c)는 FPR-자극 후 30초에 이미 검출되었으며, PKB(AKT)에 대한 AQGV 효과 (도 4a)는 300초 시점에 2-상 패턴 (bi-phasic pattern)으로 후속되었다. p38 및 PKB-매개 신호전달에 대한 AQGV 효과는 검사한 전체 600초 동안 지속된 반면, 검사한 다른 키나제는 전반적으로 영향을 받지 않았다. 이러한 치료에 대한 급성의 특이적인 반응은 PI3K/AKT/mTOR 경로의 조절 맥락에서 p38 신호전달에 대한 자가포식-저해성-AQGV-펩타이드의 특이적이고 신속한 영향을 나타낸다. 이러한 경로는 단백질 분해와 단백질 생성 간에 균형의 좌우하여 세포골격 변화를 조절함으로써 혈관 투과성에 영향을 미친다. AQGV-펩타이드는 p38 MAPK 키나제 활성화된 변화를 낮출 뿐 아니라 내피 세포 수축과 유해한 혈관 투과성에 영향을 미치는 세포의 세포골격의 재구성에서의 PI3K/AKT/mTOR 활성화에 의해 유도되는 변화를 감소시키는 것으로 확인된다. AQGV-펩타이드는 인간 개체에서 혈관 누출, 유해한 백혈구 혈관외유출 및 저혈압을 동반한 부종으로 나타나는 바와 같이 유해한 혈관 투과성에 유용하며, 이를 해결할 수 있다.
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실시예 29
AQGV-사이트레이트
조성물 1 L를 제조하기 위해 혼합
AQGV-사이트레이트 -- 1.8 mol
0.9% NaCl -- 1 L
실시예 30
LQGVL-사이트레이트
조성물 1 L를 제조하기 위해 혼합
LQGVL-사이트레이트 -- 1.8 mol
0.9% NaCl -- 1 L
실시예 31
AQGLQ-사이트레이트
조성물 1 L를 제조하기 위해 혼합
AQGLQ-사이트레이트 -- 1.8 mol
0.9% NaCl -- 1 L
실시예 32
LQGLQ-사이트레이트
조성물 1 L를 제조하기 위해 혼합
LQGLQ-사이트레이트 -- 1.8 mol
0.9% NaCl -- 1 L
Claims (25)
- p38 MAPK 키나제 활성을 낮추는 방법으로서,
세포에 아미노산들의 공급원을 제공하는 단계를 포함하고,
상기 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - PI3K/AKT/mTOR 활성을 낮추는 방법으로서,
세포에 아미노산들의 공급원을 제공하는 단계를 포함하고,
상기 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - 세포골격의 재구성을 저하하는 방법으로서,
세포에 아미노산들의 공급원을 제공하는 단계를 포함하고,
상기 아미노산은 적어도 50%가 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법. - p38 MAPK 키나제 활성을 낮출 수 있는 펩타이드를 식별하는 방법으로서,
50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산들로 이루어진 펩타이드를 세포에 제공하는 단계;
상기 세포에 fMLP를 제공하고, fMLP 제공 후 30초 내지 600초 경과 시점에 상기 펩타이드의 부재 및 존재하에 p38 MAPK의 인산화를 검출하는 단계; 및
결과를 비교하여 인산화에 대한 펩타이드의 효과를 확인하는 단계
를 포함하는, 방법. - PI3K/AKT/mTOR 활성을 낮출 수 있는 펩타이드를 식별하는 방법으로서,
50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산들로 이루어진 펩타이드를 세포에 제공하는 단계;
상기 세포에 fMLP를 제공하고, fMLP 제공 후 300초 내지 600초 경과 시점에 상기 펩타이드의 부재 및 존재하에 PKB (AKT)의 인산화를 검출하는 단계; 및
결과를 비교하여 인산화에 대한 펩타이드의 효과를 확인하는 단계
를 포함하는, 방법. - 세포골격 재구성을 저하할 수 있는 펩타이드를 식별하는 방법으로서,
50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산들로 이루어진 펩타이드를 세포에 제공하는 단계;
상기 세포에 fMLP를 제공하고, fMLP 제공 후 30초 내지 600초 경과 시점에 상기 펩타이드의 부재 및 존재하에 p38 MAPK 및/또는 PKB (AKT)의 인산화를 검출하는 단계; 및
결과를 비교하여 인산화에 대한 펩타이드의 효과를 확인하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산은 적어도 75%가 자가포식-저해성 아미노산들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산은 자가포식-저해성 아미노산들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 유기산의 염으로서 제공되는, 방법.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 말레산, 타르타르산 및 구연산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기산의 염으로서 제공되는, 방법.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 바람직하게는 말레산의 염으로서, 더 바람직하게는 아세트산의 염으로서, 더 바람직하게는 타르타르산의 염으로서, 가장 바람직하게는 구연산의 염으로서 제공되는, 방법.
- 50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 포함하는 원액 용액.
- 제12항에 있어서, 상기 아미노산은 적어도 75%가 자가포식-저해성 아미노산들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 원액 용액.
- 제12항에 있어서, 상기 아미노산은 자가포식-저해성 아미노산들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 원액 용액.
- 50% 이상이 알라닌 (단문자 코드: A), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 프롤린 (P) 및 아르기닌 (R)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가포식-저해성 아미노산들의 공급원을 포함하고,
상기 공급원이 상기 아미노산을 적어도 50%로 포함하는 하나 이상의 펩타이드를 포함하고,
상기 펩타이드가 유기산의 염으로서, 바람직하게는 말레산의 염으로서, 더 바람직하게는 타르타르산의 염으로서, 가장 바람직하게는 구연산의 염으로서 존재하는, 원액 용액. - 제15항에 있어서, 아미노산의 적어도 75%가 자가포식-저해성 아미노산들로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 적어도 포함하는, 원액 용액.
- 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 이용하기 위한 것인, 원액 용액.
- 수액 소생 (fluid resuscitation)에 이용가능하거나 및/또는 환자의 혈관 투과성 문제를 해결하는데 이용가능한, 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 원액 용액으로 제조된, 수성 용액.
- 제18항에 있어서, 상기 환자가 인간인, 수성 용액.
- 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 환자가 중증 질환인 것으로 간주되는, 수성 용액.
- 제12항 내지 제17항 또는 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 투과성 증가와 관련한 질환을 치료하는데 이용하기 위한 것인, 원액 용액 또는 수성 용액.
- 제21항에 있어서, 혈관 투과성 증가를 치료하는데 이용하기 위한 것인, 용액.
- 제22항에 있어서, 체액 과부하를 방지 또는 치료하는데 이용하기 위한 것인, 용액.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 소생 수액 (resuscitation fluid)인, 용액.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 결정질액 (crystalloid)인, 용액.
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