KR20240072343A - 라이조박터 엔지모제네스 jck-1421 균주의 배양액 또는 균주 배양액의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물, 이의 제조 방법, 및 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법 - Google Patents
라이조박터 엔지모제네스 jck-1421 균주의 배양액 또는 균주 배양액의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물, 이의 제조 방법, 및 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주, 상기 균주, 이의 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물, 상기 조성물의 제조 방법, 및 상기 조성물을 이용한 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주, 상기 균주, 이의 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물, 상기 조성물의 제조 방법, 및 상기 조성물을 이용한 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법에 관한 것이다.
진균, 세균 및 선충류 등에 의해 발병하는 다양한 식물병은 농업에서 작물의 품질 저하 및 수확량 감소를 일으켜 막대한 경제적 손실을 야기하므로 이를 방제하는 것이 매우 중요하다.
지금까지 식물병을 방제하기 위하여 화학농약을 장기간 반복적으로 사용해 왔으나 화학 농약에 강한 저항성을 갖는 병해충이 발생하였고, 결국 화학농약에 따른 식물병 방제 효과가 낮아지고 있다. 또한, 화학농약의 오남용으로 인해 잔류농약 등의 환경오염 문제가 대두되었고, 화학농약의 사용에 대한 규제가 엄격해지고 있는 실정이다.
따라서 이와 같은 문제를 해결하기 위하여 길항 미생물을 이용한 식물병의 생물학적 방제가 친환경적인 대안으로 떠오르고 있다.
식물 병원균에 대한 생물학적 방제 유형에는 직접적 길항작용, 직간접적 길항작용, 간접적 길항작용이 있다. 직접인 길항작용에는 다양한 진균 및 세균에 의한 중복기생 및 포식 기작이 있으며, 직간접적 길항작용에는 항생제와 분해효소에 의한 방제 등이 있다.
간접적 길항작용에는 경쟁, 유도저항성 기작 등이 있다. 특히 유도저항성은 특정 생물 또는 비생물학적인 인자에 의해 병원체 침입에 대한 기주식물체의 저항성이 유도되는 현상으로서, 미생물 침입이나 유사한 스트레스에 대해 식물 방어 능력을 향상시키며 한 번 발현되면 오랜 기간 유지된다는 특징이 있다. 최근 유도저항성 기작은 농업생태계의 개선 및 다양한 식물병에 대한 생물학적 방제의 측면에서 관심이 증대되고 있다.
라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes)는 그람 음성 세균으로 포자를 형성하지 않으며 막대 모양의 간균 형태로 존재하고, 활주운동(gliding motility)을 통해 이동한다. 콜로니의 형태는 보통 크림색, 분홍색 또는 황갈색을 보이며, 매우 점액질의 특성을 보인다. 라이조박터 엔지모제네스는 프로테아제(protease), 키티나아제(chitinase), β-1,3-글루카나아제(β-1,3-glucanase)와 같은 세포외 효소를 생산하여 진균 및 선충류의 다양한 식물병원성 미생물의 구조성분을 분해시킴으로써 높은 생육억제활성을 가진다.
이처럼 라이조박터 엔지모제네스의 다양한 식물병원성 미생물들에 대한 직접적인 인비트로(in vitro) 향세균활성 연구는 보고된 바 있으나, 유도저항성 기작을 통한 다양한 식물병 방제에 관한 연구는 아직까지 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 조성물을 식물병원성 진균병, 세균병 및 선충병에 처리하였을 때 기주식물에서 저항성 유도활성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 항진균, 향세균 및 항선충 활성을 갖는 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주를 배양하는 배양 단계를 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하는 처리 단계를 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주, 이의 배양액 또는 이의 추출물의 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 용도에 관한 것이다.
본 발명은 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주, 상기 균주, 이의 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물, 상기 조성물의 제조 방법, 및 상기 조성물을 이용한 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 항진균, 향세균 및 항선충 활성을 갖는 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주는 수탁번호 KCTC 15126BP로 기탁된 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주인 것일 수 있다.
본 발명의 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 16S rRNA를 포함하고 있는 것일 수 있다.
본 발명의 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주는 한국생명공학연구원 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 2022년 10월 06일자 수탁번호 KCTC 15126BP로 기탁되었다.
본 발명의 다른 일 양태는 항진균, 향세균 및 항선충 활성을 갖는 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주, 이의 배양물, 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주는 수탁번호 KCTC 15126BP로 기탁된 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주인 것일 수 있다.
본 발명의 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 16S rRNA를 포함하고 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 진균은 푸자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리움(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium), 라이족토니아 솔라니 AG2-2 브라운 패치(Rhizoctonia solani AG2-2 Brown patch), 라이족토니아 솔라니 AG2-2 라지 패치(AG2-2 Large patch), 라이족토니아 솔라니 AG-4(Rhizoctonia solani AG-4), 스크레로티니아 호모에오카파(Sclerotinia homoeocarpa), 및 피티움 아파니더마튬(Pythium aphanidermatum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세균은 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum), 펙토박테리움 카로토보라 서브스페시스 카로토보라(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 잔토모나스 유베지카토리아(Xanthomonas euvesicatoria), 및 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 선충은 멜로이도지네 인코그니타(Meloidogyne incognita), 및 버사펠렌쿠스 자이로필루스(Bursaphelenchus xylophilus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물 진균병은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)가 유발하는 오이모잘록병, 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리눔(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)이 유발하는 오이덩굴쪼김병, 스크레로티니아 호모에오카파(Sclerotinia homoeocarpa)이 유발하는 잔디동전마름병, 피티움 아파니더마튬(Pythium aphanidermatum)이 유발하는 잔디 피시움마름병, 및 푸자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)이 유발하는 벼 붉은곰팡이병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물 세균병은 펙토박테리윰 카로토보라 서브스피시스 카로토보라(Pectobacterium carotovora subsp. carotovora)에 의해 발생하는 배추무름병, 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum)이 유발하는 토마토 풋마름병, 잔토모나스 유베지카토리아(Xanthomonas euvesicatoria)이 유발하는 고추 세균점무늬병, 및 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)가 유발하는 사과 화상병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물 선충병은 멜로이도지네 인코그니타(Meloidogyne incognita)에 의해 발생하는 토마토 뿌리혹선충병, 및 버사펠렌쿠스 자이로필루스(Bursaphelenchus xylophilus)이 유발하는 소나무재선충병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서상의 용어 “배양물”은 미생물을 배양한 후 상기 미생물을 포함한 것을 의미한다.
본 명세서상의 용어 “배양 상층액”은 원심 분리 방법을 통해 배양액으로부터 대부분의 미생물을 제거하고 획득한 상층의 액을 의미하며, “상징액”이라고도 한다.
본 명세서상의 용어 “배양여액”은 원심분리 및 여과를 수행함으로써 배양액으로부터 균체를 여과하여 제거한 뒤에 남은 액체를 의미한다. 배양여액은 미생물이 자라는 과정에서 형성하여 배출한 물질들이 포함되어 있어서 그 물질을 정제하거나 추출할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분인 상기 균주, 이의 배양물, 배양물의 농축물, 배양물의 건조물 및/또는 상기 균주의 배양 상등액 외에 균체를 포함하는 배양물, 균체의 추출물, 이들의 농축액, 농축물, 건조물, 또한 필요에 따라서 희석액, 희석물 등을 포함할 수 있으며, 배양액, 배양물을 처리하여 얻어지는 모든 상태의 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적인 방법으로 제형화할 수 있으며, 건조분말 형태 또는 액상비료 형태로 제조할 수 있는 것이다. 구체적으로, 본 발명에 의한 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
본 발명에서 있어서 조성물은 첨가제, 증량제, 영양제 등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서 첨가제는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 증량제 및 영양제는 skim milk(배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트(bentonite), 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 붕해제는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaoline) 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 라이조박터 엔지모제네스 (Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주를 배양하는 배양 단계를 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주는 수탁번호 KCTC 15126BP로 기탁된 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주인 것일 수 있다.
본 발명의 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 16S rRNA를 포함하고 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 진균은 푸자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리움(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium), 라이족토니아 솔라니 AG2-2 브라운 패치(Rhizoctonia solani AG2-2 Brown patch), 라이족토니아 솔라니 AG2-2 라지 패치(AG2-2 Large patch), 라이족토니아 솔라니 AG-4(Rhizoctonia solani AG-4), 스크레로티니아 호모에오카파(Sclerotinia homoeocarpa), 및 피티움 아파니더마튬(Pythium aphanidermatum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세균은 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum), 펙토박테리움 카로토보라 서브스페시스 카로토보라(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 잔토모나스 유베지카토리아(Xanthomonas euvesicatoria), 및 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 선충은 멜로이도지네 인코그니타(Meloidogyne incognita), 및 버사펠렌쿠스 자이로필루스(Bursaphelenchus xylophilus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물 진균병은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)가 유발하는 오이모잘록병, 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리눔(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)이 유발하는 오이덩굴쪼김병, 스크레로티니아 호모에오카파(Sclerotinia homoeocarpa)이 유발하는 잔디동전마름병, 피티움 아파니더마튬(Pythium aphanidermatum)이 유발하는 잔디 피시움마름병, 및 푸자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)이 유발하는 벼 붉은곰팡이병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물 세균병은 펙토박테리윰 카로토보라 서브스피시스 카로토보라(Pectobacterium carotovora subsp. carotovora)에 의해 발생하는 배추무름병, 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum)이 유발하는 토마토 풋마름병, 잔토모나스 유베지카토리아(Xanthomonas euvesicatoria)이 유발하는 고추 세균점무늬병, 및 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)가 유발하는 사과 화상병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물 선충병은 멜로이도지네 인코그니타(Meloidogyne incognita)에 의해 발생하는 토마토 뿌리혹선충병, 및 버사펠렌쿠스 자이로필루스(Bursaphelenchus xylophilus)이 유발하는 소나무재선충병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배양 단계는 배양액을 원심분리 및 여과하여 배양액으로부터 배양여액을 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배양 단계의 배지는 탈지유, 훼이, 카제인 등의 우유 단백질, 당류, 호모 및 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물의 제조방법은 배양액을 농축하는 농축 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물의 제조방법은 배양액을 희석하는 희석 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물의 제조방법은 균체 내의 성분을 추출하는 추출 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 제조방법은 배양액으로부터 활성 분획을 획득하는 분획 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분획 단계는 하기의 단계를 포함하는 것일 수 있다:
배양액으로부터 배양여액을 얻는 배양여액 수득 단계;
배양여액을 용매로 분획하여 분획물을 얻는 분획 단계;
분획물을 농축하여 농축물을 얻는 농축 단계; 및
농축물을 순화 (purify)하여 활성 분획을 선별하는 정제 단계.
본 발명에 있어서 배양여액 수득 단계는 배양액을 2000 내지 5000 rpm, 2500 내지 5000 rpm, 3000 내지 5000 rpm, 3500 내지 5000 rpm, 4000 내지 5000 rpm, 4500 내지 5000 rpm, 예를 들어, 4500 rpm으로 원심분리하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분획 단계는 용매로 부탄올, 에틸아세테이트, 메탄올, 에탄올 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 분획을 하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 농축 단계는 감압 농축기를 이용하여 분획물을 농축하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 정제 단계는 분취용 HPLC (high-performance liquid chromatography)로 정제하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 라이조박터 엔지모제네스 (Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 조성물 처리 단계는 살포(예를 들어, 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용 등), 토양관주(예를 들어, 혼입, 관주 등), 표면사용(예를 들어, 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 독이, 훈연 시용, 및 종자처리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 “살포”는 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말살포, 과립살포, 수명시용 및 상시용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것일 수 있다.
본 명세서상 용어 “관주”는 토양이나 나무에 구멍을 파서 약액을 주입하는 약제 살포의 한 방법이다.
본 명세서상 용어 “토양 관주”는 작물 재배토양에 약액을 주입 또는 살포하는 방법이다.
본 발명에 있어서 조성물의 사용량은, 그 제형, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
상기 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물의 제조 방법 및 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법에 있어서, 상기 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물과 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.
본 발명은 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주, 상기 균주, 이의 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물, 상기 조성물의 제조 방법, 및 상기 조성물을 이용한 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법에 관한 것으로, 적용시 식물의 생장을 촉진하고 기주식물에서 저항성을 유도하여 다양한 식물병과 선충병을 동시에 효과적으로 방제할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 PR-1 프로모터에 GUS가 표지된 벡터를 형질전환시킨 애기장대 유묘에서의 JCK-1421 균주 처리에 의한 GUS 유전자 발현분석으로 저항성 유도활성 유무를 검정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열에 의한 계통도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 세포외 효소활성을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 식물생장호르몬 IAA 생산 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주 배양액 처리 2주 후 잔디에서의 식물생장 촉진 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 대치배양에 의한 in vitro 항진균 활성을 나타낸 것이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 오이 모잘록병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 오이 모잘록병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 오이 덩굴쪼김병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 오이 덩굴쪼김병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 잔디 동전마름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 잔디 동전마름병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 잔디 피시움마름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 잔디 피시움마름병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 벼 붉은곰팡이병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 벼 붉은곰팡이병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 배추 무름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 배추 무름병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 13a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 14a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 고추 세균점무늬병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 14b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 고추 세균점무늬병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 Chinese pearleaf crabapple 유묘에서의 병원균 접종 10일 후 사과 화상병에 대한 방제효과를 나타낸 것이다.
도 16a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 M9 유묘에서의 병원균 접종 7일 후와 10일 후 사과 화상병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 M9 유묘에서의 병원균 접종 7일 후와 10일 후 사과 화상병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 17a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제효과를 병원균 접종 6주 후 a) 골형성 지수(galling index) 억제효과, b)난낭수(egg masses) 억제효과로 나타낸 것이다.
도 17b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제효과를 병원균 접종 6주 후 뿌리 사진으로 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주를 곰솔 유묘에 처리시 4주 후 소나무재선충병 방제효과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주를 소나무 유묘에 처리시 6주 후 소나무재선충병 방제효과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열에 의한 계통도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 세포외 효소활성을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 식물생장호르몬 IAA 생산 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주 배양액 처리 2주 후 잔디에서의 식물생장 촉진 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 대치배양에 의한 in vitro 항진균 활성을 나타낸 것이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 오이 모잘록병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 오이 모잘록병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 오이 덩굴쪼김병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 오이 덩굴쪼김병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 잔디 동전마름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 잔디 동전마름병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 잔디 피시움마름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 잔디 피시움마름병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 벼 붉은곰팡이병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 벼 붉은곰팡이병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 12a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 배추 무름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 12b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 배추 무름병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 13a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 14a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 고추 세균점무늬병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 14b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 고추 세균점무늬병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 Chinese pearleaf crabapple 유묘에서의 병원균 접종 10일 후 사과 화상병에 대한 방제효과를 나타낸 것이다.
도 16a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 M9 유묘에서의 병원균 접종 7일 후와 10일 후 사과 화상병에 대한 방제효과를 나타낸 그래프이다.
도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 M9 유묘에서의 병원균 접종 7일 후와 10일 후 사과 화상병에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.
도 17a는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제효과를 병원균 접종 6주 후 a) 골형성 지수(galling index) 억제효과, b)난낭수(egg masses) 억제효과로 나타낸 것이다.
도 17b는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제효과를 병원균 접종 6주 후 뿌리 사진으로 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주를 곰솔 유묘에 처리시 4주 후 소나무재선충병 방제효과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주를 소나무 유묘에 처리시 6주 후 소나무재선충병 방제효과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1. 식물에서 저항성 유도 활성 균주의 선발
침엽수에서 분리한 내생균 균주 중 식물에서 저항성을 유도하는 활성을 가지는 균주를 선발하기 위하여 PR-1 프로모터에 GUS가 표지된 벡터를 형질전환시킨 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 이용하여 유도저항성 관련 유전자인 PR-1 유전자 발현을 조사하였다. 살리실산(salicyclic acid) 신호전달계를 통하여 식물에 저항성이 유도되고 그 결과 PR-1 단백질 발현되는 일련의 신호전달계를 활용하여 식물에서 저항성의 유도여부를 검정하는 마커유전자로 PR-1유전자가 사용되고 있다.
형질전환된 애기장대 종자를 70% 에탄올로 30초간 1차 표면살균 후 bleach solution(2% NaOCl + 0.05% tween-20)으로 5분간 2차 표면 살균하였다. 이후 종자 표면에 남아있는 bleach solution을 멸균수로 3-4번 세척하였고, 4℃에 2일간 침지하였다. 침지한 종자를 50 μg/mL Kanamycin이 더해진 1/2 Murashige - Skoog 고체배지(MS, 2.2 g MS salts, 10 g sucrose, 8 g phyto agar/L, Duchefa)에 각각 배치하였고, 3M 테이프로 실링해준 후 25℃ 식물 생장배양기에서 배양하였다(16시간 광주기, 80% 상대습도). 배양 12일 후 시료를 처리하기 위해, 24 well의 각 well에 균주의 배양액, 배양여액, 세포분획을 500, 1,000, 2,000, 4,000배 희석하여 2 mL씩 처리하였고, 각 well 당 2개의 식물체를 넣은 다음 오비탈 쉐이커에 2일간 상온에서 유지시켰다. 2일 후 반응을 고정시키기 위해 -20℃에서 90% 아세톤으로 1시간 담가두었고, 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 7.0)로 2번 세척한 다음, staining solution(100 mM sodium phosphate buffer, 0.1% Triton X-100, 2 mM X-GlcA(Duchefa, X1405), 2.5 mM potassium ferricyanide and 2.5 mM potassium ferrocyanide)에 식물체가 잠기도록 처리하였다. 이후 37℃ 항온 수조에 12시간 유지하였고, 70% 에탄올에 먼저 1시간 반응을 멈춘 다음 90% 에탄올로 여러 번 담가 클로로필 등 불필요한 색소를 제거하였다. 마지막으로 현미경(Stemi 508, Carl Zeiss, Germany)을 통해 푸른색을 띄는지 확인하여 PR-1 유전자 발현을 조사하였다.
소나무를 비롯한 침엽수로부터 분리한 내생균에 대하여 저항성 유도 활성을 가지는 균주를 선발하기 위해 GUS staining assay를 수행한 결과, PR-1 유전자의 발현을 통해 GUS activity를 보이는 JCK-1421 균주를 선발하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, JCK-1421 균주는 배양액(culture broth), 배양여액(culture filtrate), 세포현탁액(cells)의 모든 처리구에서 푸른색을 띄었고, 이 중 배양액이 좀 더 광범위하고 진한 색을 나타냈다. 그에 반해 음성대조구로 사용한 배지성분(medium)에서는 GUS activity를 보이지 않았다. 이를 통해 JCK-1421 균주는 저항성 마커 유전자인 PR-1 유전자를 발현시킴으로써 저항성 유도 활성을 가진다는 사실을 확인하였다.
실시예 2. JCK-1421 균주의 분자생물학적 분석 및 계통도 분석
식물에서 저항성 유도 활성을 가진 균주로 선발한 균주 JCK-1421의 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 분자생물학적으로 동정하였다. 균주는 LB 액채배지(Luria-Bertani, Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD, USA)에 접종한 다음 30℃에서 24시간 150 rpm으로 진탕배양하였으며, 수확한 균주는 iNtRON의 I-genomic BYF DNA Extraction Mini Kit를 이용하여 프로토콜에 따라서 균주의 게놈 DNA(gDNA)를 추출하였다. 균주의 추출된 gDNA와 인트론 바이오테크놀로지(iNtRON Biotechnology)의 PCR-프리믹스(Polymerase chain reaction-premix), 그리고 균주의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 혼합한 후 PCR을 통해 유전자를 증폭하였다.
| 서열번호 | 명명 | 서열목록 (5'-> 3') | 비고 |
| 1 | 16s-9F | GAGTTTGATCCTGGCTCAG | |
| 2 | 16s-1512R | ACGGCTACCTTGTTACGACTT | |
| 3 | 16S rRNA | CAGTCGAACGGCAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACGTCGGAATCTGCCTATTTGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGTGGGGGACCGCAAGGCCTCACGCAGATAGATGAGCCGACGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAAAGCTTAGGGTTAATAACCCTGAGTCATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAATGGCATTGGAAACTGGCTTACTAGAGTGCGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATCGGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGACCAGCACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGGGCAACTTGGCCCTCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGAAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAACCCGCGAGGGCAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGC | 1388 bp |
PCR은 95℃ 5분을 시작으로 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 90초를 30번 반복한 후, 72℃ 10분, 4℃에서 증폭을 끝냈다. 증폭된 16S rRNA 유전자 PCR 산물은 제노텍(대전, 대한민국)에 염기서열 분석을 의뢰하여, 상기 분리 균주인 JCK-1421 균주의 16S rRNA 코딩 염기서열로 총 1388 bp의 염기서열(서열번호 3)을 얻었다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, NCBI의 BlastN 검색을 이용하여 GenBank 데이터베이스의 염기서열을 비교한 결과 JCK-1421 균주는 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes)로 동정되었다. 상기 균주의 16S rRNA 염기서열은 GenBank 데이터베이스에 OP420512로 업로드 되었으며, 선발한 상기 균주는 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주로 명명하였고 2022년 10월 06 한국생명공학연구원 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 15126BP를 부여받았다.
실시예 3. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 세포 외 효소 활성
라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주의 세포 외 효소 활성을 확인하기 위해 프로테아제, 키티나아제, 젤라티나제 및 셀룰라아제에 대해 실험을 수행하였다. 프로테아제 배지(1% skim milk + 1.5% agar, Difco), 키티나아제 배지(1% colloidal chitin + 1.5% agar, Difco), 젤라티나제 배지(10% gelatin + 1.5% agar, Duksan), 셀룰라아제 배지(0.4% carboxymethyl cellulose sodium + 1.5% agar, Sigma-Aldrich)를 제조하였으며, 키티나아제 배지는 XL1 배지(5 g/L peptone (Difco), 5 g/L yeast extract (Difco), 5 g/L NaCl)에 콜로이드성의 키틴을 첨가하여 제조하였으며 이 배지는 XL1+C로 표기하였다. 배지에 첨가된 콜로이드성의 키틴은 먼저, crab shell powder에 hydrochloric acid(HCl)를 넣고(10 g crab shell powder/150 mL HCl), 6시간 동안 교반하였다. 6시간 후 차가운 상태인 1 L의 에탄올 (99.9%)을 넣고 교반기를 이용해 충분히 섞어 주었고, 4℃, 4500 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 이후 상징액은 제거하였고, 키틴 침전물은 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0)를 이용해 3-4번 세척하였다. 제조된 콜로이드성의 키틴은 고압증기멸균 후 사용 전까지 4℃에서 보관하였다. 젤라틴 배지는 LB 고체배지에 10% 젤라틴을 첨가하였고 이외 배지는 1.5% 아가를 더하여 응고시켰다.
제조한 각각의 배지 위에 멸균한 페이퍼 디스크(paper disc, 0.8 cm, Advantec, Japan)를 위치시켰고 JCK-1421 균주 배양여액을 프로테아제는 2.5 μL, 5 μL, 10 μL씩, 키티나아제와 셀룰라아제는 30 μL, 60 μL, 90 μL씩, 젤라티나제는 10 μL, 20 μL, 30 μL씩 각각 분주하였다. 음성대조구로는 멸균한 LB와 배지를 paper disc에 동량 분주하였다. 실험은 3반복 수행되었으며 플레이트는 30℃에서 유지시켜 각각 세포 외 효소 활성에 따른 clear zone 관찰을 수행하였다. 셀룰라아제 배지는 시각화하기 위해 5 mL의 Lugol’s solution(2.5 g/L iodine 및 5 g/L potassium iodide)을 플레이트에 첨가하여 염색하였고 암조건 하에서 10분간 유지시킨 후 clear zone을 관찰하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 효소 활성을 유도하는 배지에 배양여액을 처리하여 클리어존을 관찰한 결과, JCK-1421 균주는 프로테아제는 10 μL 처리 9일 후 클리어존의 직경이 24.61 mm, 키티나아제는 90 μL 처리 7일 후 17.25 mm, 젤라티나제는 30 μL 처리 4일 후 29.42 mm, 셀룰라아제는 90 μL 처리 5일 후, 28.67mm 수준으로 나타났다. 결과적으로 라이조박터 엔지모제네스(Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주는 프로테아제, 키티나아제, 젤라티나제, 셀룰라아제를 모두 생산하였고, 이 중 젤라티나제를 가장 많이 생산하였다.
실시예 4. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 Indole-3-acetic acid (IAA) 생산
라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 식물생장호르몬인 IAA 생산을 확인하기 위하여 먼저, L-tryptophan(150 mg/L)이 첨가된 3종의 배지(LB, TSB, XL1+C)에 JCK-1421 균주 배양액을 1% 접종하여 30℃, 150 rpm에서 24시간 진탕 배양하였다. 이후 배양액을 4℃, 10,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 0.2 μm 무균필터로 여과하여 얻은 1 mL의 배양여액을 2 mL의 Salkowski’s reagent(150 mL H2SO4, 250 mL 멸균수, 7.5 mL 0.5 M FeCl3·6H2O)와 혼합하였다. 상온 암조건 하에서 20분간 유지시킨 후 혼합액이 핑크색을 나타내는지 확인하였다. 음성대조구는 L-tryptophan(150 mg/L)이 첨가된 LB, TSB, XL1+C배지 3종을 이용하였고 실험은 3반복 수행되었다.
도 4에서 확인할 수 있듯이, JCK-1421 균주의 식물생장호르몬인 IAA를 생산을 확인하기 위하여 실험을 수행한 결과, JCK-1421 균주 배양여액 처리구는 시험관 내에서 핑크컬러를 나타내었고, 대조구인 LB, TSB, XL1+C 처리구는 배지 본연의 색을 나타내었다. 따라서 JCK-1421 균주가 식물생장호르몬인 IAA를 생산한다는 사실을 확인하였다.
실시예 5. 잔디에서 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 식물생장 촉진 효과
라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 식물생장호르몬 IAA의 생성 능력을 확인한 후 식물에서의 생장 촉진효과와의 연계 유무를 확인하기 위하여 잔디를 이용하여 검정하였다. 한지형 잔디의 한 종류인 크리핑 벤트그라스(Creeping bentgrass, Agrostis stolonifera. cv. Penncross) 종자 2 g을 4℃에서 2일간 증류수에 침지시켰다. 이후 상토와 모래(선인종합개발(유))의 혼합토양(모래:상토, 1:1, v/v)으로 플라스틱 포트 (직경 7 cm, 높이 6 cm)에 상토와 골고루 혼합한 크리핑 벤트그라스 종자를 파종하였다(2 g 종자/500 mL 상토). 파종 후 암조건의 25℃ 항온항습실에서 3일간 생장시킨 뒤 하루에 광주기를 16시간 조사하여 3주간 배양시켜 사용하였다. 약제처리전 동일한 조건을 만들어주기 위해 잔디를 일정한 길이로 잘랐고, JCK-1421 균주 배양액을 500배, 1,000배, 2,000배 희석하여 포트당 20 mL씩 토양관주 처리하였다. 대조구로는 호리쿠어(a.i. 25% Tebuconazole EC, 팜한농)를 상용농도인 2,000배 희석하여 사용하였다. 이후 25℃ 항온항습실에서 하루에 광주기를 16시간 조사하였고, 실험은 처리구 당 2개씩으로 3반복 수행하였으며, 처리 2주 후 잔디의 생육정도를 육안으로 검정하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 크리핑 벤트그라스에서 식물생장촉진효과를 조사한 결과, JCK-1421 균주 배양액 처리시 무처리구 대비 더 높은 생장효과를 보였으며, 트리아졸계 살균제인 호리쿠어 처리시에는 오히려 식물생장이 억제되는 현상을 확인하였다.
실시예 6. 식물병원성 곰팡이에 대한 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의
in vitro
항진균 활성
JCK-1421 균주의 다양한 식물병원성 곰팡이에 대한 대치배양(Dual culture) 및 MIC(Minimum Inhibitory Concentration) 시험을 수행하여 곰팡이 균사의 생육 억제활성을 조사함으로서 직접적인 항진균활성을 조사하고자 하였다. 직접적인 항진균활성을 조사하는 in vitro 실험에는 Rhizoctonia solani AG-4(오이 모잘록병), Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum(오이 덩굴쪼김병), Sclerotinia homoeocarpa(잔디 동전마름병), Rhizoctonia solani AG2-2(LP, 잔디 라지패치병), Rhizoctonia solani AG2-2(BP, 잔디 브라운패치병), Pythium aphanidermatum(잔디 피시움마름병), Fusarium graminearum(벼 붉은곰팡이병) 총 7종의 식물병원성 곰팡이를 사용하였다. 이들의 배양을 위해 P. aphanidermatum은 corn meal agar(CMA, Sigma-Aldrich, India) 배지에, 나머지 균주는 potato dextrose agar(PDA, Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD, USA) 배지에 접종하였고, 25℃ 배양기에서 정치배양하였다.
대치배양은 25℃에서 자란 식물병원균의 agar plug를 코르크보러(직경 0.6 cm)를 이용해 분리하였고, PDA 가장자리에서 2 cm 떨어진 지점에 분리한 agar plug를 접종하였다. LB 고체배지에서 정치배양한 JCK-1421 균주의 콜로니를 agar plug와 대치하여 접종하였다(길이 5 cm). 이후 25℃ 인큐베이터에서 정치배양하였으며, 2-7일 후 병원균의 균사생장 정도를 관찰하였다.
MIC test는 25℃에서 자란 병원균을 코르크보러(직경 0.5 cm)를 이용해 agar plug를 분리하였고, 48 well plate에 접종 후 균주 배양여액의 최종농도가 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625%가 되도록 처리하였다. 음성대조구로는 PDB 배지를 이용하였고, 25℃에 정치배양하였다. 실험은 3반복으로 수행하였고, 균사생육을 완전히 억제하는 MIC를 확인하였다.
| 번호 | 식물병원성 곰팡이 | MIC (%) |
| JCK-1421 균주 처리구 | ||
| 1 | Fusarium graminearum | - |
| 2 | Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum | - |
| 3 | Sclerotinia homoeocarpa | - |
| 4 | Rhizoctonia solani AG2-2(LP) | - |
| 5 | Rhizoctonia solani AG2-2(BP) | - |
| 6 | Rhizoctonia solani AG-4 | - |
| 7 | Pythium aphanidermatum | - |
도 6 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, JCK-1421균주의 항진균 활성을 조사하기 위하여 다양한 식물병원성 곰팡이에 대하여 대치배양 및 MIC test를 수행한 결과, 실험에 사용된 모든 식물병원성 곰팡이에서 항진균활성을 전혀 보이지 않았다. 따라서 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주는 실험에 사용된 7종의 식물병원성 곰팡이에 대하여 직접적인 항진균 활성은 없는 것으로 확인되었다.
실시예 7. 식물병원성 세균에 대한 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의
in vitro
항세균 활성
JCK-1421 균주의 다양한 식물병원성 세균에 대한 MIC (Minimum Inhibitory Concentration) 시험을 수행하여 세균의 생육 억제활성을 조사함으로서 직접적인 항세균활성을 조사하고자 하였다. 직접적인 항세균활성을 조사하기 위하여 Ralstonia solanacearum(Rs, 토마토 풋마름병), Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum(Pcc, 배추 무름병), Xanthomonas euvesicatoria(Xe, 고추 세균점무늬병) 등 총 3종의 식물병원성 세균을 사용하였다. Tryptic soy agar(TSA, Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD, USA) 배지에서 자란 병원균의 단일 콜로니를 tryptic soy broth(TSB, Becton, Dickinson and Co., Sparks, MD, USA) 배지 접종하였고, 30℃, 150 rpm에서 Rs는 3일, Xe는 2일, Pcc는 1일간 진탕배양하였다. 이후 병원균의 배양액을 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 600 nm에서 광학밀도를 측정하여 O.D600 값이 0.1(1.0 x 108 CFU/mL)이 되도록 조정하였다. 조정한 세균 현탁액을 96 well plate의 각 well에 주입시키고, 시료의 최종농도가 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625%가 되도록 하였다. 양성대조구는 streptomycin sulfate를 이용하였으며, 음성대조구로는 세균 현탁액만을 처리한 무처리구를 이용하였다. 모든 플레이트는 30℃ 인큐베이터에 정치배양하여 균의 생장을 조사하였고, 실험은 각각 3반복으로 수행하였다.
| 번호 | 식물병원성 세균 | 수분 함량(%) | |
| JCK-1421 균주 처리구 |
Streptomycin sulfate |
||
| 1 | Ralstonia solanacearum | - | 7.4 |
| 2 | Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum | - | 6.3 |
| 3 | Xanthomonas euvesicatoria | - | 12.5 |
표 3에서 확인할 수 있듯이, JCK-1421균주의 직접적인 항세균 활성을 조사하기 위하여 다양한 식물병원성 세균에 대하여 MIC test를 수행한 결과, 실험에 사용된 모든 식물병원성 세균에서 항세균활성을 전혀 보이지 않았다. 따라서 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주는 3종의 식물병원성 세균에 대하여 직접적인 항세균 활성은 없는 것으로 확인되었다.
실시예 8. 식물병원성 선충에 대한 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의
in vitro
살선충 활성
JCK-1421 균주의 다양한 식물병원성 선충에 대한 in vitro 검정을 수행하여 선충의 생육 억제활성을 조사함으로서 직접적인 살선충활성을 조사하고자 하였다. 직접적인 살선충활성을 조사하기 위하여 고구마 뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)과 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 총 2종의 식물병원성 선충을 사용하였다.
JCK-1421 균주의 고구마 뿌리혹선충(M. incognita)에 대한 in vitro 살선충 활성은 알부화 억제 및 살선충 효과를 측정하여 검정하였다. 고구마뿌리혹선충은 감수성 종인 서광 토마토(Lycopersicon esculentum Mill. cv. Seokwang, 팜한농, 대한민국)를 기주식물로 하여 25℃ 항온항습실에서 2-3달간 증식시켰다. 먼저, 뿌리혹선충에 인위적으로 감염된 토마토 뿌리를 흐르는 물에 세척한 후 분쇄기(HM-2100S; Hanil, 대한민국)에 1 cm 크기로 잘라 넣었다. 이후 1% NaOCl(sodium hypochlorite, v/v)넣고 1분 간 마쇄하였고, 45 μm 체에 이어 25 μm 체를 이용해 뿌리혹선충알을 수집하였다. 수집된 선충알은 in vitro 알부화 억제 활성 실험에 사용하였다. 선충알 부화를 위해 변형된 Baermann funnel 방법을 이용하여 28℃에서 3일간 부화시켜 2령 유충을 분리하였다. 수집한 선충알 현탁액 및 유충 현탁액은 100 μL당 각각 선충알 150개와 2령 유충 50마리가 되도록 조정하였고, 96 well plate의 각 well에 주입하였다. 배양여액의 최종농도는 20%와 10%가 되도록 처리하였다. 실험은 3반복 수행하였고, 처리 후 상온의 암조건 하에서 상대습도 100%로 3일간 유지하였다. 이후 현미경(LeicaDM IL LED; Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Germany)을 이용해 관찰하였고, 선충의 몸체가 곧게 뻗어 움직임이 없는 상태면 죽은 것으로 간주하였다. 실험은 각각 3반복으로 수행하였고, 고구마 뿌리혹선충의 살선충율(mortality, %)과 알부화 억제율은 하기 기술한 식에 따라 계산하였다.
[계산식 1]
살선충율(mortality, %) = [(대조구의 치사율 - 처리구의 치사율)/(대조구의 치사율)] × 100
[계산식 2]
알부화 억제율(Egg hatch inhibition, %) = [(대조구의 알부화율 - 처리구의 알부화율)/대조구의 알부화율] × 100
JCK-1421 균주의 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 in vitro 살선충 활성을 검정하기 위하여 병원성을 가진 소나무재선충을 실험실에서 인공배양하였다. PDA 배지에 소나무재선충이 먹이로 하는 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)를 접종하고 25℃ 배양기에서 7일 동안 정치배양한 후 배양된 보트리티스 시네레아 위에 소나무재선충(B. xylophilus, 국립산림과학원)을 접종한 뒤 25℃ 배양기에서 7일 동안 정치배양하였다. 배양된 소나무재선충은 깔대기법(Baermann funnel method)을 이용하여 수확한 후 광학현미경 하에서 수를 조사하여 100 μL당 선충 50마리가 되도록 조정하였고, 96 well plate의 각 well에 주입하였다. 배양여액의 최종농도는 20%와 10%가 되도록 처리하였다. 실험은 3반복 수행하였고, 처리 후 상온의 암조건 하에서 상대습도 100%로 3일간 유지하였다. 이후 현미경(LeicaDM IL LED; Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Germany)을 이용해 관찰하였고, 선충의 몸체가 곧게 뻗어 움직임이 없는 상태면 죽은 것으로 간주하였다. 실험은 각각 3반복으로 수행하였고, 소나무재선충의 살선충율(mortality, %)은 하기 기술된 식에 따라 계산하였다.
[계산식 3]
살선충율(mortality, %) = [(대조구의 치사율 - 처리구의 치사율)/(대조구의 치사율)] × 100
| 번호 | 식물병원성 선충 | Mortality(%) | |
| 배양여액20% | 배양여액10% | ||
| 1 | Meloidogyne incognita (알부화) | - | - |
| 2 | Meloidogyne incognita (유충) | - | - |
| 3 | Bursaphelenchus xylophilus (유충 및 성충) | - | - |
표 4에서 확인할 수 있듯이, JCK-1421 균주의 고구마뿌리혹선충 알부화억제 및 살선충 활성과 소나무재선충 살선충 활성에 대하여 조사한 결과, 고구마뿌리혹선충 알부화억제와 살선충 활성 및 소나무재선충 살선충활성을 보이지 않았다. 따라서 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주는 2종의 식물병원성 선충에 대하여 직접적인 살선충 활성은 없는 것으로 확인되었다.
실시예 9. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 다양한 식물병 방제를 위한 배양 및 제제 제조
JCK-1421 균주의 저항성 유도 활성에 의한 다양한 식물병에서의 병방제활성을 조사하기 위해 JCK-1421 균주의 배양액 및 배양액의 분무건조물 20%를 첨가하여 제조한 JCK-1421 20 SC(Suspension concentrate, 액상수화제)를 본 실험에 사용하였다. 균주 배양은 일회용 루프를 이용해 균주의 보관균주를 LB agar배지에 접종한 후 30℃에서 2일간 배양하였다. 배양한 균주의 단일 콜로니를 5 mL의 LB 액체배지에 접종하였고 30℃, 150 rpm에서 24시간 진탕배양한 후 전배양액을 UV-VIS spectrophotometer를 이용해 600 nm에서 광학밀도를 측정하였고, OD600의 값이 0.1(1.0 x 108 CFU/mL)이 되도록 조정한 균주 현탁액을 LB 액체배지에 1% 접종하였다. 이후 30℃, 150 rpm에서 24시간 진탕배양하여 본배양액으로 사용하였다.
JCK-1421의 제제화를 위하여 30℃, 150 rpm에서 24시간 진탕배양한 JCK-1421 균주의 본배양액 총 3 L의 배양액을 분무건조하였다. 제조공정은 배양액 3 L에 600 g의 부형제(산환전분:말토덱스트린=3:1)를 혼합한 후, 분무건조하였다. 분무건조기의 주입 온도는 195℃, 방출 온도 93℃ 이상의 조건으로 제조하였다. 이후 분무건조공정을 수행한 분무건조물을 이용해 JCK-1421 균주의 배양액 분무건조물이 20% 함유된 JCK-1421 20 SC 형태로 제제화하였다.
실시예 10. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 오이 모잘록병에 대한 방제효과
JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 오이 모잘록병에 대한 in vivo 방제효과를 조사하기 위하여 ‘네박자’종자(Cucumis sativus L. cv. Nebakja, 신젠타코리아)를 증류수가 포함된 여과지(직경 9 cm의 페트리디쉬)에 침지하여 28℃ 인큐베이터에서 24시간 발아시킨 후 원예용 상토를 플라스틱 포트(직경 6 cm, 높이 6.5 cm)에 담아 오이 종자를 파종하였고, 25℃ 항온항습실에서 하루에 16시간 광을 조사하여 6일간 생장시켰다.
오이 모잘록병의 병원균인 R. solani AG-4는 24시간 증류수에 불린 후 3회 고압 증기 멸균한 현미(농업회사법인등대, Jeollanam-do, Korea)에 접종하였고 25℃에서 3주간 정치배양 하였다. 3주간 배양한 병원균을 알루미늄 접시에 담은 후 거즈로 덮어 상온에서 3일간 건조시켰다. 건조물을 블렌더로 마쇄하여 0.5 ~ 0.85 mm 체로 걸러 접종원으로 사용하였다. 병원균 접종은 파종 6일 후에 1 L 부피의 원예용 상토에 접종원 0.75 g을 고르게 혼합하여 플라스틱 포트(직경 7 cm, 높이 6 cm)에 담고, 파종 후 6일 동안 재배한 오이 유묘를 이식하였다.
JCK-1421 균주 배양액의 유도저항성에 의한 오이 모잘록병에 대한 방제효과를 조사하기 위한 in vivo 포트실험을 수행하고자 JCK-1421 균주의 배양액 및 제제(JCK-1421 20 SC)를 실시예 9에서 기술한 방법으로 준비하였다. JCK-1421 균주 배양액은 Tween 20(Duksan science, Seoul, Korea) 250 ppm을 포함한 증류수에 희석하여 각각 500배, 1,000배, 2,000배가 되도록 약제를 제조하였으며 JCK-1421 20 SC 제제는 JCK-1421 균주 배양액의 희색배율과 동일한 배율로 희석하여 제조하였다. 양성대조구로는 잘록엔(분산성액제 dispensible concentrate(DC): a.i. 30% Hymexazol + 5% Penthiopyrad, 한국삼공)과 가지란(WP: a.i. 10% Etridiazole + 55% Thiophanate-methyl, 팜한농)을 1,000배, 2,000배 희석하여 병원균 접종 1시간 후 10 mL 토양관주 처리하여 사용하였다. JCK-1421 균주의 배양액 및 JCK-1421 20 SC 시료는 오이 모잘록병의 병원균 접종 4일 전 포트 당 10 mL씩 토양관주 처리하였다. 병원균 접종과 약제처리를 마친 포트는 25℃ 항온항습실에서 하루에 광원을 12시간 조사하였다. 실험은 처리구당 3개씩 3반복 수행하였으며 접종 4일 후 오이모잘록병의 발병률(Disease incidence, %)을 조사하였고 무처리구 대비 방제가(Control value, %)를 다음 식에 따라 계산하였다.
[계산식 4]
방제가(Control value, %) = 100 × [(무처리구 발병률-처리구 발병률) / 무처리구 발병률]
도 7에서 확인할 수 있듯이, JCK-1421 균주 배양액은 500배, 1,000배, 2,000배 희석액에서 무처리구 대비 각각 67%, 83%, 79%의 방제가를 보였다. 또한 JCK-1421 20 SC는 500배, 1,000배, 2,000배 희석액에서 각각 75%, 88%, 75%의 방제가를 나타냈다. 대조약제로 사용한 잘록엔은 1,000배와 2,000배 희석액에서 100%, 83%의 방제가를 가지란은 1,000배와 2,000배 희석액에서 92%, 75%의 방제가를 각각 보였다. JCK-1421 균주 배양액과 JCK-1421 20 SC제제는 1,000배 희석액에서 가장 높은 방제효과를 보였으며, 특히 JCK-1421 20 SC 1,000배 희석액은 대조약제인 가지란과 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 따라서 오이 모잘록병 원인균 R. solani AG-4에 직접적인 항진균활성이 없는 JCK-1421 균주는 오이에서 저항성을 유도하여 오이 모잘록병을 방제하였다고 할 수 있다. 향후 이를 이용한 고효능의 오이 모잘록병 방제제 개발이 가능하다고 판단된다.
실시예 11. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 오이 덩굴쪼김병에 대한 방제효과
JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 오이 덩굴쪼김병에 대한 in vivo 방제효과를 조사하기 위하여 ‘중복삼척’종자(Cucumis sativus L. cv. Jungboksamcheok, 신젠타코리아)를 증류수가 포함된 여과지(직경 9 cm의 페트리디쉬)에 침지하여 28℃ 인큐베이터에서 24시간 발아시킨 후 긴 사각 슬릿 포트(직경 7 cm, 높이 9.5 cm)에 상토(원예용 상토 2호, 부농)를 이용하여 파종하였다. 이후 25℃ 항온항습실에서 하루에 16시간 광을 조사하여 7일간 생장시켰다.
오이 덩굴쪼김병을 유발하기 위하여 병원균인 F. oxysporum f. sp. cucumerinum의 배양된 균사를 코르크보러(직경 0.6 cm)를 이용해 절단하고 5개의 agar plug를 PDB 배지에 접종하여 25℃, 150 rpm에서 7일간 진탕배양 하였다. 이후 배양액을 수확하여 4겹의 거즈로 걸러 균사를 제거하고 hemocytometer를 이용하여 현미경(Axio Imager.A2, Carl Zeiss, Germany) 하에서 2.5 × 106 spore/mL 농도가 되도록 병원균 포자 현탁액을 제조하였다. 제조한 포자현탁액은 오이 덩굴쪼김병 방제효과 조사를 위하여 접종원으로 이용하였다. 병원균 접종은 파종 7일 후에 제조한 병원균 포자 현탁액 접종원을 포트 당 10 mLl씩 토양관주 접종하였다.
JCK-1421 균주 배양액의 유도저항성에 의한 오이 덩굴쪼김병에 대한 방제효과를 조사하기 위한 in vivo 포트실험을 수행하고자 JCK-1421 균주의 배양액 및 제형(JCK-1421 20 SC)은 실시예 9에서 기술한 방법으로 준비하였다. JCK-1421 균주 배양액은 Tween 20(Duksan science, Seoul, Korea) 250 ppm을 포함한 증류수에 희석하여 각각 500배, 1,000배, 2,000배, 4,000배, 8,000배가 되도록 약제를 제조하였으며 JCK-1421 20 SC제제는 JCK-1421 균주 배양액의 희색배율과 동일한 배율로 희석하여 제조하였다. 양성대조구로는 잘록엔(분산성액제 dispensible concentrate(DC): a.i. 30% Hymexazol + 5% Penthiopyrad, 한국삼공)과 가지란(WP: a.i. 10% Etridiazole + 55% Thiophanate-methyl, 팜한농)을 1000배 희석하여 병원균 접종 1시간 후 10 mL 토양관주 처리하여 사용하였다. 제조한 JCK-1421 균주 배양액과 제제 약제들을 병원균 접종 4일 전에 포트 당 10 ml씩 토양관주 처리하였다. 접종과 약제처리를 모두 마친 포트는 25℃ 항온항습실에서 하루에 12시간 광을 조사하였다. 실험은 처리구당 3개씩 3반복 수행하였으며, 병원균 접종 30일 후 발병 정도에 따라 0에서 4까지의 발병지수(disease index)로 평가하였다. 발병지수(disease index)는 0 = 건전, 1 = 뿌리나 잎이 갈변되고 유묘의 생육이 약간 억제된 것, 2 = 유묘의 생육이 현저히 억제된 것, 3 = 유묘의 생육이 심하게 억제된 것, 4 = 고사 등의 5단계로 조사하였고, 이에 따라 방제효과를 산출하였다.
도 8에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 오이 덩굴쪼김병에 대한 방제효과를 검정한 결과, JCK-1421 균주 배양액 2,000배 희석액과 JCK-1421 20 SC에서 500배 희석액이 각각 77%, 88%의 방제가로 가장 높은 방제활성을 보였다. 또한, JCK-1421 균주 배양액 1,000배 희석액은 69%의 방제가를 JCK-1421 20 SC 제제의 1,000배와 2,000배 희석액은 동일한 77%의 방제가를 보였다. 결과적으로 JCK-1421 균주가 오이 덩굴쪼김병에 대하여 우수한 방제효과를 보임을 확인할 수 있었으며 이 역시 오이 모잘록병에서와 마찬가지로 오이 덩굴쪼김병 원인균 F. oxysporum f. sp. cucumerinum에 직접적인 항진균활성이 없는 JCK-1421 균주가 오이에서 저항성을 유도하여 오이 덩굴쪼김병을 방제하였다고 할 수 있다. 향후 JCK-1421 균주의 유도저항성을 이용한 효능이 우수한 오이 덩굴쪼김병 방제제 개발이 가능하다고 판단된다.
실시예 12. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 잔디 동전마름병에 대한 방제효과
JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 잔디 동전마름병의 in vivo 방제활성을 조사하기 위하여 한지형 잔디의 한 종류인 크리핑 벤트그라스(Creeping bentgrass, Agrostis stolonifera. cv. Penncross) 종자를 증류수에 4℃에서 2일간 침지시켰다. 침지한 종자는 모래와 원예용 상토의 혼합토양(모래:상토, 1:1, v/v)이 60% 담긴 플라스틱 포트(직경 7 cm, 높이 6 cm)에 파종하였다. 파종 후 25℃ 암조건 하에 상대습도 50%에서 2일간 생장시킨 후 16/8시간 광/암조건으로 25℃, 상대습도 50%에서 3주간 생장시켰다.
잔디 동전마름병의 병원균인 Sclerotinia homoeocarpa를 2회 고압 증기 멸균한 밀기울-왕겨 배지(9 g 밀기울, 1.5 g 왕겨, 10 mL 증류수; 250 mL Erlenmeyer flask)에 접종하여 25℃에서 7일간 정치배양 하였다. 배양 후 200 ppm streptomycin sulfate를 함유한 증류수 110 mL을 첨가하여 균체를 마쇄하였다. 제조한 균체 현탁액을 잔디 동전마름병 방제효과 조사를 위하여 접종원으로 사용하였다. S. homoeocarpa 접종원을 포트 가운데에 1 cm의 깊이의 구멍을 만들고 포트 당 3.5 ml씩 접종하였다.
JCK-1421 균주 배양액의 유도저항성에 의한 잔디 동전마름병에 대한 방제효과를 조사하고자 JCK-1421 균주의 배양액 및 JCK-1421 20 SC는 실시예 9에서 기술한 방법으로 준비하였다. JCK-1421 균주 배양액은 Tween 20(Duksan science, Seoul, Korea) 250 ppm을 포함한 증류수에 희석하여 각각 500배, 1,000배, 2,000배가 되도록 약제를 제조하였으며 JCK-1421 20 SC 제제는 JCK-1421 균주 배양액의 희색배율과 동일한 배율로 희석하여 제조하였다. 양성대조구로는 호리쿠어(Horikuo, EC: a.i. 25% Tebuconazole, 팜한농)를 2000배 희석하여 병원균 접종 1시간 후 포트 당 20 mL씩 토양관주 처리하였다. 제조한 JCK-1421 균주 배양액과 제제 약제들을 병원균 접종 4일 전에 포트 당 20 mL씩 토양관주 처리하였다. JCK-1421 균주의 처리는 파종 후 3주 된 크리핑 벤트그라스에 대하여 제조한 JCK-1421 균주 배양액과 제제 약제들을 포트 당 20 ml씩 토양관주 처리하였으며 약제 처리 4일 후 제조한 S. homoeocarpa 균사 현탁액을 포트 당 3.5 mL씩 접종하였다. 병원균 접종과 약제처리를 마친 포트는 트레이에 물을 채운 후 플라스틱 챔버(가로 35 cm, 세로 28 cm, 높이 16 cm)를 덮어 상대습도 100%를 유지하였고, 25℃ 항온항습실에서 하루에 12시간 광을 조사하였다. 실험은 처리구 당 3개씩 2반복 수행하였다. 접종 13일 후 발병 면적율를 조사하였고 무처리구 대비 방제가를(Control value, %)를 다음 식에 따라 계산하였다.
[계산식 5]
방제가(Control value, %) = 100 × [(무처리구 발병도-처리구 발병도) / 무처리구 발병도]
도 9에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 잔디 동전마름병에 대한 방제효과를 병원균 접종 13일 후 조사한 결과, JCK-1421 균주 배양액은 500배, 1000배, 2000배 희석액에서 무처리구 대비 각각 86%, 92%, 85%의 방제가를 보였다. JCK-1421 20 SC는 500배, 1,000배, 2,000배 희석액에서 각각 66%, 83%, 55%의 방제가를 나타냈다. 대조약제로 사용한 호리쿠어는 2,000배 희석액에서 94%의 방제가를 보였다. JCK-1421 균주 배양액 및 JCK-1421 20 SC는 각각 1,000배 희석액에서 가장 높은 방제효과를 보였으며, 특히 실험에 사용된 JCK-1421 균주 배양액 모든 희석 처리구과 JCK-1421 20 SC 1,000배 희석 처리구는 잔디 동전마름병 방제에 우수한 활성을 보였으며 대조약제인 호리쿠어와 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 따라서 JCK-1421 균주가 잔디 동전마름병에 대하여 우수한 방제효과를 보임을 확인할 수 있었으며 잔디 동전마름병의 원인균 S. homoeocarpa에 직접적인 항진균활성이 없었기에 잔디에서 저항성을 유도하여 잔디 동전마름병을 방제하였다고 할 수 있다. 향후 JCK-1421 균주의 유도저항성을 이용하여 효능이 우수한 잔디 동전마름병 방제제 개발이 가능하다고 판단된다.
실시예 13. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 잔디 피시움마름병에 대한 방제효과
JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 잔디 피시움마름병의 in vivo 방제활성을 조사하기 위하여 한지형 잔디의 한 종류인 크리핑 벤트그라스(Creeping bentgrass, Agrostis stolonifera. cv. Penncross) 종자를 증류수에 4℃에서 2일간 침지시켰다. 침지한 종자는 모래와 원예용상토의 혼합토양(모래:상토, 1:1, v/v)이 60% 담긴 플라스틱 포트(직경 7 cm, 높이 6 cm)에 파종하였다. 파종 후 25℃ 암조건 하에 상대습도 50%에서 2일간 생장시킨 후 16/8시간 광/암조건으로 25℃, 상대습도 50%에서 3주간 생장시켰다.
잔디 피시움마름병 병원균인 Pythium aphanidermatum 균주를 Corn Meal agar 배지(CMA, Sigma-Aldrich, India)에 접종하였고, 30℃에서 3일 간 정치배양하였다. 배양된 P. aphanidermatum의 균사를 코르크보러 (직경 0.5 cm)를 이용해 agar plug를 분리하였고, 분리한 agar plugs (2 개/pot)를 접종원으로 사용하였다.
JCK-1421 균주 배양액의 유도저항성에 의한 잔디 피시움마름병에 대한 방제효과를 조사하고자 JCK-1421 균주의 배양액 및 JCK-1421 20 SC는 실시예 9에서 기술한 방법으로 준비하였다. JCK-1421 균주 배양액은 Tween 20(Duksan science, Seoul, Korea) 250 ppm을 포함한 증류수에 희석하여 각각 500배, 1,000배, 2,000배가 되도록 약제를 제조하였으며 JCK-1421 20 SC제제는 JCK-1421 균주 배양액의 희색배율과 동일한 배율로 희석하여 제조하였다. 양성대조구로는 헤리티지(Heritiji, a.i. Azoxystrobin 50% WG))를 10,000배 희석하여 병원균 접종 1시간 후 포트 당 10 ml씩 토양관주 처리하였다. JCK-1421 균주의 처리는 파종 후 3주 된 크리핑 벤트그라스에 대하여 제조한 JCK-1421 균주 배양액과 제제 약제들을 포트 당 10 ml씩 토양관주 처리하였으며 약제 처리 4일 후 포트 당 병원균 agar plug를 2개씩 잔디표면에 균사가 맞닿도록 뒤집어 접종하였다. 병원균 접종과 약제처리를 마친 포트는 트레이에 물을 채운 후 플라스틱 챔버(가로 35 cm, 세로 28 cm, 높이 16 cm)를 덮어 상대습도 100%를 유지하였고, 25℃ 항온항습실에서 하루에 12시간 광을 조사하였다. 실험은 처리구 당 3개씩 2반복 수행하였다. 접종 7일 후 발병 면적율를 조사하였고 무처리구 대비 방제가를(Control value, %)를 다음 식에 따라 계산하였다.
[계산식 6]
방제가(Control value, %) = 100 × [(무처리구 발병도-처리구 발병도) / 무처리구 발병도]
도 10에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 잔디 피시움마름병에 대한 방제효과를 병원균 접종 7일 후 조사한 결과, JCK-1421 균주 배양액은 500배, 1,000배, 2,000배 희석액에서 무처리구 대비 각각 71%, 84%, 59%의 방제가를 보였다. JCK-1421 20 SC제제는 500배, 1,000배, 2,000배 희석액에서 각각 53%, 78%, 56%의 방제가를 나타냈다. 대조약제로 사용한 헤리티지는 10,000배 희석액에서 88%의 방제가를 보였다. JCK-1421 균주 배양액 및 JCK-1421 20 SC는 각각 1,000배 희석액에서 가장 높은 방제효과를 보였으며, 특히 실험에 사용된 JCK-1421 균주 배양액 모든 희석 처리구과 JCK-1421 20 SC제제 1,000배 희석 처리구는 대조약제인 헤리티지와 통계적으로 유의한 차이가 없이 잔디 피시움마름병에 우수한 방제효과를 보여주었다. 결과적으로 JCK-1421 균주가 잔디 피시움마름병에 대하여 우수한 방제효과를 보임을 확인할 수 있었으며 잔디 피시움마름병의 원인균 P. aphanidermatum에 직접적인 항진균활성이 없었기에 잔디에서 저항성을 유도하여 잔디 피시움마름병을 방제하였다고 할 수 있다. 따라서 JCK-1421 균주의 유도저항성을 이용하여 잔디 동전마름병 방제제 개발뿐 만 아니라 효능이 우수한 잔디 피시움마름병 방제제 개발도 가능하다고 판단된다.
실시예 14. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 벼 붉은곰팡이병에 대한 방제효과
JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 벼 붉은곰팡이병의 in vivo 방제활성을 조사하기 위하여 삼광벼 종자를 사용하였다. 농촌진흥청 국립식량과학원에서 분양받은 10 g의 ‘삼광벼’ 종자(Oryza sativa cv. Samkwang)를 플라스틱 통에 넣고, 스포탁 유제(25% prochloraz, ㈜경농)를 2,000배 희석하여 1일 간 종자소독 후 암조건 하에 2일 간 물에 침지하였다. 2일 간 최아한 볍씨를 80% 수도용 상토(중량토, 부농)를 채운 플라스틱 포트(직경 6 cm, 높이 6.5 cm)에 포트당 10개의 종자를 파종하였다. 파종 후 하단에 구멍이 뚫린 노란색 트레이에 포트를 배치하여 포트 하단이 물에 잠기도록 하였고, 30℃ 항온항습실에서 못자리용 부직포를 덮어 배양하였다. 벼가 1 cm 정도 발아하면 부직포를 벗겨주었고, 하루에 광주기를 16시간 조사하여 4주 생장시킨 뒤 와그너포트(상경 17.5 cm, 하경 16 cm, 높이 19.8 cm, NF-5)로 이앙하였다. 이앙 7일 전, 밑거름용 복합비료(흙사랑 21, 남해화학)를 물에 녹여 물을 댄 논흙에 골고루 시비하였다. 이후 항온항습실에서 생장시킨 어린모를 70% 논흙이 채워진 와그너포트 중앙에 이앙하였다. 포트이앙 전, 포트 하단의 배수구를 실리콘 마개로 막은 후 포트에 스티로폼 공(직경 4 cm, 10개/포트)과 화분 깔망(직경 14 cm)을 깔아 준비하였다. 이앙 후 와그너포트에 물을 채워주었고, 유리온실(최저 20-25℃, 최고 30-35℃)에서 생장시켜 실험에 이용하였다. 포트이앙 20일 후, 슈퍼알알이(14 kg/10 a, 남해화학)로 1차 추비하였고, 포트이앙 2달 후 엔케이 24(N:P:K, 24-0-12, 팜한농)로 2차 추비를 진행하였다.
벼 붉은곰팡이병 병원균 접종원을 준비하기 위하여 벼 붉은곰팡이병 원인균인 Fusarium graminearum 균주를 PDA 배지에 접종하였고, 25℃에서 6일간 정치배양하였다. 배양된 F. graminearum의 균사로 덮인 5개의 agar plug(0.1 cm × 0.1 cm)를 잘라 carboxymethylcellulose 배지(CMC, 15 g carboxymethylcellulose(Sigma-Aldrich), 1 g yeast extract, 0.5 g MgSO4·7H2O, 1 g NH4NO3, and 1 g KH2PO4, 1 L 증류수)에 접종하였고, 25℃ 150 rpm에서 4일간 진탕배양하였다. 이후 병원균 배양액을 4겹의 거즈로 걸러 균사를 제거하였고, 걸러진 포자 현탁액을 hemacytometer를 이용하여 현미경 (Axio Imager.A2, Carl Zeiss, Germany) 하에서 5 × 105 spore/mL 농도로 조정하였다. 조정한 포자 현탁액은 4℃, 4,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 배지성분을 제거하기 위하여 상징액을 버린 다음 동일한 양의 0.05% Tween-80으로 현탁시켜 본 실험의 접종원으로 사용하였다.
F. graminearum에 의해 발병하는 벼 붉은곰팡이병에 대하여 JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 병방제효과를 조사하고자 하였다. JCK-1421 균주의 처리는 포트이앙 후 11주 된 벼에 대하여 병원균 접종 2주 전과 1주 전에 JCK-1421 균주 배양액 및 JCK-1421 20 SC제제를 1,000배와 2,000배 희석하여 벼 이삭 및 줄기를 흠뻑 적시도록 엽면살포 처리하였다. JCK-1421 균주 배양액은 Tween 20(Duksan science, Seoul, Korea) 250 ppm을 포함한 증류수에 희석하였다. 대조약제는 병원균 접종 1일 전 벼 붉은곰팡이병에 대한 공시약제인 논브라(Nonbra, a.i. 30% Ferimzone + 10% Tricyclazole WP, 경농)를 2,000배 희석하여 사용하였다. 병원균 접종은 2차 약제처리 7일 후, F. graminearum 포자 현탁액(5 × 105 spore/mL)을 처리구마다 동일한 양으로 골고루 엽면살포하여 접종하였다. 약제 제조 시 전착제인 Tween-20을 JCK-1421 균주 배양액에는 500 μg/mL 수준으로 첨가하였다. 접종 직후 비닐팩을 이용해 3일간 습실처리하였고 실험은 처리구 당 5반복으로 수행하였으며, 접종 7일 후 벼 붉은곰팡이병의 발병 면적율에 따른 발병도 및 무처리구 대비 방제가를 계산하였다.
[계산식 7]
방제가(Control value, %) = 100 × [(무처리구 발병도-처리구 발병도) / 무처리구 발병도]
도 11에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 벼 붉은곰팡이병에 대한 방제효과를 병원균 접종 7일 후 조사한 결과, JCK-1421 균주 배양액은 1,000배와 2,000배 희석액에서 무처리구 대비 각각 92% 및 21%의 방제가를 보였다. JCK-1421 20 SC제제는 1,000배와 2,000배 희석액에서 각각 34% 및 47%의 방제가를 나타냈다. 대조약제로 사용한 논브라는 1,000배 희석액에서 46%의 방제가를 보였다. JCK-1421 균주 배양액은 1,000배, JCK-1421 20 SC는 2,000배 희석액에서 각각 가장 높은 방제효과를 보였다. 특히 JCK-1421 균주 배양액 1,000배 희석액은 대조약제인 합성농약 논브라보다 더 높은 방제활성을 나타내었다. 결과적으로 JCK-1421 균주가 벼 붉은곰팡이병에 대하여 우수한 방제효과를 보임을 확인할 수 있었으며 벼 붉은곰팡이병의 원인균 F. graminearum에 직접적인 항진균활성이 없었기에 벼에서 저항성을 유도하여 벼 붉은곰팡이병을 방제하였다고 할 수 있다. 따라서 향후 JCK-1421 균주의 저항성 유도 활성을 이용하여 효능이 우수한 벼 붉은곰팡이병 방제제를 개발할 수 있음을 확인하였다.
실시예 15. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 배추 무름병에 대한 방제효과
JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 배추 무름병의 in vivo 방제활성을 조사하기 위하여 춘광봄배추 종자(Brassica campestris L. ssp. pekinensis (Lour.) Rupr. cv. Chungwang, 사카타 코리아)를 사용하였다. 검은색 사각 연결포트, (사각 4 x 8; 32구, 하경 4.2 cm, 상경 5.8 cm, 높이 6.3 cm, 범농)에 상토를 가득 채워주었고, 밑에는 삽목 트레이를 배치한 후 핀셋을 이용해 춘광봄배추 종자를 파종하였다. 파종 후 25℃ 항온항습실에서 하루에 광주기를 16시간 조사하여 3주간 생장시킨 뒤 5엽기나 6엽기의 배추를 시료 처리 24시간 전에 더 큰 포트(직경 7 cm, 높이 6 cm)로 식물체를 이식하여 사용하였다.
JCK-1421 균주 배양액의 유도저항성에 의한 배추 무름병에 대한 방제효과를 조사하고자 JCK-1421 균주의 배양액 및 JCK-1421 20 SC는 실시예 9에서 기술한 방법으로 준비하였다. JCK-1421 균주 배양액은 Tween 20(Duksan science, Seoul, Korea) 250 ppm을 포함한 증류수에 희석하여 각각 500배, 1,000배, 2,000배, 4,000배가 되도록 약제를 제조하였으며 JCK-1421 20 SC제제는 JCK-1421 균주 배양액의 희색배율과 동일한 배율로 희석하여 제조하였다. 양성대조구는 성보싸이클린(Sungbocycline, a.i. Oxytetracycline 17% WP, 성보화학) 농약을 병원균 접종 1일전에 1,000배로 희석한 후 포트당 10 ml씩 토양관주 처리하였다. JCK-1421 균주의 처리는 파종 후 3주 된 5엽기나 6엽기의 배추를 더 큰 포트로 이식한 후 24시간이 지난 다음 제조한 JCK-1421 균주 배양액과 제제 약제들을 포트 당 10 ml씩 토양관주 처리하였으며 약제 처리 4일 후 포트 당 병원균 10 ml을 접종하였다.
배추 무름병 병원균인 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum(Pcc) 균주를 TSA 배지에 접종하였고, 30℃에서 24시간 정치배양하였다. 배양된 Pcc의 콜로니를 증류수와 셀 스크레이퍼를 이용해 50 mL 코니칼 튜브에 수확하였다. 이후 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 600 nm에서 광학밀도를 측정하여 OD600값이 0.1 (1.0 x 107 CFU/mL)이 되도록 조절한 다음, 10 mM의 염화마그네슘을 첨가한 균 현탁액을 포트 당 10 ml씩 토양관주 접종하였다. 접종한 식물체를 30℃의 항온 항습실에 두어 24시간 동안 암조건을 유지시켜주었다 그 후 광주기 12시간, 상대습도 100%를 유지시켜주었고 10일 후 발병도를 조사하였다.
발병도는 0부터 5까지의 지수(0: 증상이 나타나지 않은 것, 1: 한 개 또는 두 개의 가느다란 병반이 생긴 것, 2: 2개 이상의 가느다란 병반이 생긴 것, 3: 잎에 백화현상이 발생한 것, 4: 잎의 괴사가 발생한 것, 5: 완전히 고사한 것)로 나타내었고, 무처리구 대비 방제가(Control value, %)를 다음 식에 따라 계산하였다.
[계산식 8]
방제가(Control value, %) = 100 × [(무처리구 발병률-처리구 발병률) / 무처리구 발병률]
도 12에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 배추 무름병에 대한 방제효과를 병원균 접종 10일 후 조사한 결과, JCK-1421 균주 배양액은 500배, 1,000배, 2,000배, 4,000배 희석액에서 무처리구 대비 각각 65%, 25%, 0%, 38%의 방제가를 보였다. JCK-1421 20 SC 제제는 500배, 1,000배, 2,000배, 4,000배 희석액에서 각각 70%, 95%, 93%, 7%의 방제가를 나타냈다. 대조약제로 사용한 성보싸이클린은 1,000배 희석액에서 27%의 방제가를 보였다. 따라서 JCK-1421 균주 배양액은 500배 희석액, JCK-1421 20 SC제제는 1,000배 희석액에서 각각 가장 높은 방제효과를 보였으며, JCK-1421 균주 배양액은 500배와 4,000배 희석액에서 JCK-1421 20 SC제제는 4,000배를 제외한 모든 처리구에서 대조약제인 성보싸이클린보다 높은 방제활성을 나타냈다. 결과적으로 JCK-1421 균주가 배추 무름병에 대하여 뛰어난 방제효과를 보임을 확인할 수 있었으며 배추 무름병의 원인균 P. carotovorum subsp. carotovorum에 직접적인 항세균활성이 없었기에 배추에서 저항성을 유도하여 배추 무름병을 방제하였다고 할 수 있다. 따라서 향후 JCK-1421 균주의 저항성 유도 활성을 이용하여 효능이 우수한 배추 무름병 방제제를 개발할 수 있음을 확인하였다.
실시예 15. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과
JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 토마토 풋마름병의 in vivo 방제활성을 조사하기 위하여 토마토 삼광종자를 사용하였다. 사각 연결포트에 상토를 가득 채워주었고, 핀셋을 이용해 토마토 종자(Lycopersicon esculentum Mill. cv. Seokwang, Farhannong Co., Seoul, Korea)를 파종한 후 25℃ 항온항습실에서 하루에 광주기를 16시간 조사하여 4주간 생장시켰다. 이후 풋마름병에 사용하는 식물체는 상토를 이용해 포트(직경 7 cm, 높이 6 cm)로 이식하여 사용하였다.
토마토 풋마름병 병원균 접종을 준비하기 위하여 토마토 풋마름병 원인균인 Ralstonia solanacearum 균주를 TSA 배지에 접종하였고, 2-3일간 30℃에서 정치배양하였다. 배양된 R. solanacearum의 콜로니를 증류수와 셀 스크레이퍼를 이용해 50 mL 코니칼 튜브에 수확하였다. 이후 UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 600 nm에서 광학밀도를 측정하여 OD600값이 0.1(1.0 x 108 CFU/mL)이 되도록 조정하였고, 제조한 현탁액을 접종원으로 사용하였다.
R. solanacearum에 의해 발병하는 토마토 풋마름병에 대하여 JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 방제효과를 조사하고자 JCK-1421 균주의 배양액 및 제형(JCK-1421 20 SC)은 실시예 9에서 기술한 방법으로 준비하였다. JCK-1421 균주의 처리는 파종 후 4주 된 서광 토마토 모종에 대하여 JCK-1421 균주 배양액 및 JCK-1421 20 SC제제를 500배, 1,000배, 2,000배, 4,000배 희석하여 포트 당 각각 20 mL씩 토양관주 처리하였다. JCK-1421 균주 배양액은 Tween 20(Duksan science, Seoul, Korea) 250 ppm을 포함한 증류수에 희석하였다. 대조약제는 성보 싸이클린(Sungbocycline, a.i. Oxytetracycline 17% WP, 성보화학)을 2,000배와 4,000배 희석하여 병원균 접종 1일전에 포트당 10 ml씩 토양관주 처리하여 사용하였다. 제조한 JCK-1421 균주 배양액과 제제 약제 처리구의 경우는 약제 처리 4일 후 포트 당 R. solanacearum 세균 현탁액 (O.D600 0.1, 1.0 x 108 CFU/mL) 10 mL을 병원균 접종원으로 접종하였다. 접종한 포트는 하단이 막힌 노란 트레이 안에 배치하였고, 트레이 안에 물을 채운 후 30℃ 항온항습실에서 하루에 광주기를 12시간 조사하였다. 실험은 처리구 당 3개씩 3반복 수행하였으며, 접종 9일 후 병징을 확인하여 발병도를 조사하였다. 발병도는 병징 정도에 따라 0에서 5까지의 발병지수 (disease index)로 평가하였다. 발병지수(disease index)는 0 = 증상 없음, 1 = 1-2개 잎 시들음, 2 = 3-4개 잎 시들음, 3 = 5~6개 잎 시들음, 4 = 대부분의 잎 시들음, 5 = 고사 등의 6단계로 조사하였고, 이에 따라 방제효과를 산출하였다. 무처리구 대비 방제가(Control value, %)를 다음 식에 따라 계산하였다.
[계산식 9]
방제가(Control value, %) = 100 × [(무처리구 발병률-처리구 발병률) / 무처리구 발병률]
도 13에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 병원균 접종 9일 후 조사한 결과, JCK-1421 균주 배양액은 500배, 1,000배, 2,000배, 4,000배 희석액에서 무처리구 대비 각각 15%, 76%, 59%, 29%의 방제가를 보였다. JCK-1421 20 SC 제제는 500배, 1,000배, 2,000배, 4,000배 희석액에서 각각 54%, 66%, 88%, 78%의 방제가를 나타냈다. 대조약제로 사용한 성보싸이클린은 2,000배와 1,000배 희석액에서 각각 80% 및 54%의 방제가를 보였다. JCK-1421 균주 배양액은 1,000배 희석액, JCK-1421 20 SC제제는 2,000배 희석액에서 각각 가장 높은 방제효과를 보였으며, JCK-1421 균주 배양액 1,000배와 2,000배 희석처리구와 500배를 제외한 JCK-1421 20 SC제제의 실험에 사용된 모든 희석액 처리구에서 대조약제인 성보싸이클린 2,000배 희석액 처리구와 통계적으로 유의한 차이가 없었기에 화학농약만큼이나 우수한 항세균활성을 확인할 수 있었다. 결과적으로 JCK-1421 균주가 토마토 풋마름병에 대하여 뛰어난 방제효과를 보임을 확인할 수 있었으며 토마토 풋마름병의 원인균 R. solanacearum에 직접적인 항세균활성이 없었기에 토마토에서 저항성을 유도하여 토마토 풋마름병을 방제하였다고 할 수 있다. 따라서 향후 JCK-1421 균주의 저항성 유도 활성을 이용하여 효능이 우수한 토마토 풋마름병 방제제 개발이 가능함을 확인하였다.
실시예 16. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 고추 세균점무늬병에 대한 방제효과
JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 고추 세균점무늬병의 in vivo 방제활성을 조사하기 위하여 고추 조생신탑(농우바이오, 대한민국)종자를 사용하였다.
실험에 사용할 식물체를 준비하기 위하여 조생신탑(농우바이오, 대한민국) 고추 씨앗을 부농(경주, 대한민국)에서 제조한 상업용 원예 상토로 채워진 플라스틱컵(직경 6 cm)에 파종하여 광주기 12시간을 주어 재배하였다. 5엽기나 6엽기의 고추를 처리 24시간 전에 직경 7.5 cm의 플라스틱 컵에 이식하였다.
Xanthomonas euvesicatoria에 의해 발병하는 고추 세균점무늬병에 대하여 JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 방제효과를 조사하고자 JCK-1421 균주의 배양액 및 JCK-1421 20 SC는 실시예 9에서 기술한 방법으로 준비하였다. JCK-1421 균주의 처리는 파종 후 5엽기나 6엽기의 고추 유묘에 대하여 이식 후 24시간이 지난 다음 JCK-1421 균주 배양액 및 JCK-1421 20 SC제제를 2,000배, 4,000배 희석하여 유묘 당 각각 5 mL씩 엽면살포 처리하였다. JCK-1421 균주 배양액은 Tween 20(Duksan science, Seoul, Korea) 250 ppm을 포함한 증류수에 희석하였다. 대조약제로는 성보 싸이클린(Sungbocycline, a.i. Oxytetracycline 17% WP, 성보화학)을 2,000배 희석하여 병원균 접종 1일전에 유묘당 5 mL씩 엽면살포 처리하여 사용하였다. 제조한 JCK-1421 균주 배양액과 제제 약제 처리구의 경우는 약제 처리 4일 후 포트 당 X. euvesicatoria 세균 현탁액(OD600 0.1, 1.0 x 107 CFU/mL) 5 mL을 병원균 접종원으로 엽면살포하여 접종하였다. 접종한 식물체는 플라스틱 커버를 덮어 상대습도 100%를 유지시켜 주었으며, 25℃의 항온 항습실에 두어 24시간 동안 암조건을 유지시켜준 후 광주기 12시간을 주어 11일 후에 발병도를 조사하였다.
발병도는 0부터 7까지의 지수로 나타냈다. 0: 증상이 나타나지 않은 것, 1: 무병징, 2: 일부 소엽에 괴사성 병반이 나타난 것, 3: 일부 잎에 병반이 합쳐진 것, 4: 많은 잎에 병반이 합쳐진 것, 5: 많은 소엽에 병반이 발생한 것, 6: 심각한 병반과 낙엽이 발생한 것, 7: 식물체가 고사한 것으로 나타냈다. 병 방제가는 하기 식을 사용하여 계산하였다.
[계산식 10]
방제가(Control value, %) = 100 × [(무처리구 발병률-처리구 발병률) / 무처리구 발병률]
도 14에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 고추 세균점무늬병에 대한 방제효과를 병원균 접종 11일 후 조사한 결과, JCK-1421 균주의 배양액은 고추 세균점무늬병 발생을 감소시켰으며, JCK-1421 20 SC 제제 4,000배 처리구(방제가 60%)는 대조약제인 성보싸이클린(방제가 55%)과 비슷한 방제효과를 나타냈다. 본 발명은 JCK-1421 균주가 고추에서 저항성을 유도하여 X. euvesicatoria가 유발하는 고추 세균점무늬병에 대하여 우수한 병방제 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.
실시예 17. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 사과 화상병에 대한 방제효과
JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 사과 화상병의 in vivo 방제활성을 조사하기 위하여 사과 유묘(M9과 Chinese pearleaf crabapple, 높이 15±5 cm)를 사용하였다.
사과 유묘의 엽면에 시료를 5 mL 엽면분무 처리하였으며 이어 사과화상병 병원균(Erwinia amylovora TS3128, 5 mL)을 시료가 선처리된 유묘에 접종하였다. E. amylovora TS3128에 의해 발병하는 사과 화상병에 대하여 JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 방제효과를 조사하고자 JCK-1421 균주의 제제 JCK-1421 20 SC은 실시예 9에서 기술한 방법으로 준비하였다. JCK-1421 균주 제제의 처리는 높이가 약 15 cm 사과 유묘에 1,000배로 희석한 JCK-1421 20 SC 제제를 유묘 당 각각 5 mL씩 엽면살포 처리하였다. 대조약제로는 스트렙토마이신 설페이트를 100 μg/ml로 희석하거나 세리펠 생물농약(활성성분: Bacillus amyloliquefaciens MBI600(11%) WP, 팜한농, 대한민국)을 상용농도인 2,000배 희석하여 유묘 당 각각 5 mL씩 엽면살포 처리하였다. 제조한 JCK-1421 균주 제제와 대조 약제 처리구의 경우는 병원균 접종 10일 전과 3일 전에 2회에 거쳐 엽면살포했으며 2차 약제 처리 3일 후 사과화상병 유발 접종원으로 사과유묘 당 E. amylovora TS3128 세균 현탁액(O.D600 0.3, 3.0 x 107 CFU/mL) 5 mL을 엽면살포하여 접종하였다. 스트렙토마이신 설페이트의 경우 접종 1일전 1회 처리하였으며, 세리펠의 경우 접종 10일전과 3일전 2회 처리하였다. 접종한 식물체는 플라스틱 커버를 덮어 상대습도 100%를 유지시켜 주었으며, 25℃의 항온 항습실에 두어 2일 동안 암조건을 유지시켜준 후 광주기 12시간과 상대습도를 75% 유지하면서 발병도를 조사하였다. 각 처리당 3반복이며, 각 반복은 3개의 포트로 구성되며, 동일한 실험을 3회 반복하여 효능을 평가하였다. 병발병 지수는 4로 나누어 검사하였다. 병발병도는 다음과 같은 지수로 확산하였다.
지수 0 = 병징없음,
지수 1 = 줄기생장분열조직인 경단부위의 부분적인 괴사
지수 2 = 경단부위의 완전한 괴사
지수 5 = 말단잎의 잎자루 괴사
지수 10 = 잎과 줄기의 잎자루 괴사
병 방제가는 하기 기술된 식을 사용하여 계산하였다.
[계산식 11]
방제가 (%) = (무처리구 발병도-처리구 발병도)/ 무처리구 발병도 × 100%.
도 15에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 사과 화상병에 대한 방제효과를 Chinese pearleaf crabapple 유묘에서 병원균 접종 10일 후 조사한 결과, JCK-1421 20 SC제제 1,000배 희석액에서 무처리구 대비 90%의 방제가를 보여 우수한 병방제활성을 확인할 수 있었다. 대조약제로 사용한 streptomycin sulfate(100 ppm)은 100%의 방제가를 나타내었다.
또한, 도 16에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 사과 화상병에 대한 방제효과를 M9 유묘에서 병원균 접종 7일 후와 10일 후 조사한 결과, JCK-1421 20 SC 제제 1,000배 희석액 처리구에서 무처리구 대비 100%의 방제가를 병원균 접종 7일 후와 10일 후 모두 보여 주었으며, 이에 JCK-1421 20 SC제제 1,000배 희석액 처리구는 생물농약 대조약제 처리구 세리펠의 방제활성(접종 7일후 48%, 접종 10일 후 40% 방제가)보다 훨씬 우수한 병방제효과를 가짐을 확인할 수 있었다. 결과적으로 JCK-1421 균주가 병원균 접종전 선처리에 의하여 저항성이 유도되어 사과 화상병에 대하여 뛰어난 방제효과를 보임을 확인할 수 있었다. 따라서 향후 JCK-1421 균주의 방제활성을 이용하여 효능이 우수한 과수 화상병 방제제 개발이 가능함을 확인하였다.
실시예 18. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제효과
JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 토마토 뿌리혹선충병의 in vivo 방제활성을 조사하기 위하여 토마토 ‘삼광’ 종자를 사용하였다. 사각 연결포트에 상토를 가득 채워주었고, 핀셋을 이용해 토마토 종자(Lycopersicon esculentum Mill. cv. Seokwang, Farhannong Co., Seoul, Korea)를 파종한 후 25℃ 항온항습실에서 하루에 광주기를 16시간 조사하여 4주간 생장시켰다. 이후 뿌리혹선충병에 사용하는 식물체는 혼합토양(모래:상토, 1:1, v/v)을 이용해 포트 (직경 12 cm, 높이 11 cm)로 이식하여 사용하였다.
토마토에 뿌리혹선충 접종하기 위하여 병원충인 고구마뿌리혹선충(M. incognita)을 감수성 종인 서광 토마토(Lycopersicon esculentum Mill. cv. Seokwang)를 기주식물로 하여 25℃ 항온항습실에서 2-3달간 증식시켰다. 먼저, 뿌리혹선충에 인위적으로 감염된 토마토 뿌리를 흐르는 물에 세척한 후 분쇄기(HM-2100S; Hanil, Gimpo, Korea)에 1 cm 크기로 잘라 넣었다. 이후 1% NaOCl(Sodium hypochlorite, v/v)넣고 1분 간 마쇄하였고, 45 μm 체에 이어 25 μm 체를 이용해 뿌리혹선충알을 수집하였다. 수집한 뿌리혹 선충알을 10 mL의 선충알 현탁액 당 8,000개 선충알이 되도록 조정한 뒤 접종원으로 사용하였다.
M. incognita에 의해 발병하는 토마토 뿌리혹선충병에 대하여 JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 방제효과를 조사하고자 JCK-1421 균주의 배양액 및 제형(JCK-1421 20 SC)은 실시예 9에서 기술한 방법으로 준비하였다. JCK-1421 균주의 처리는 파종 후 4주 된 서광 토마토 모종에 대하여 JCK-1421 균주 배양액 및 JCK-1421 20 SC를 500배, 1,000배, 2,000배 희석하여 포트 당 각각 20 mL씩 토양관주 처리하였다. 대조약제는 뿌리혹선충병에 대한 공시약제인 테라노바(Terranoba, a.i. 1.68% Abamectin SC, 신젠타코리아)를 상용농도인 5,000배 희석하여 병원균 접종 1일전에 포트당 10 mL씩 토양관주 처리하여 사용하였다. 제조한 JCK-1421 균주 배양액과 제제 약제 처리구의 경우는 약제처리 4일 후, M. incognita 선충알 현탁액을 병원성 선충으로 포트 당 10 mL씩 접종하였다. 접종한 포트는 25℃ 항온항습실에서 하루에 광주기를 12시간 조사하였다. 실험은 처리구 당 2개씩 3반복 수행하였으며, 접종 6주 후 토마토 뿌리의 골형성 정도에 따라 0에서 5까지의 골형성 지수(Galling index)로 평가하였다. 골형성 지수(Galling index; GI)는 0 = 0-10% 골 형성, 1 = 11-20%, 2 = 21-50%, 3 = 51-80%, 4 = 81-90%, 5 = 91-100% 등의 6단계로 조사하였고(Kim 등, 2018), 난낭 수(Egg masses)는 0.0015% phloxine B(대정화금㈜)에 토마토 뿌리를 1시간 담가 염색한 후 측정하였으며, 이에 따라 방제효과를 산출하였다.
[계산식 12]
방제가(Control value, %) = 100 × [(무처리구 발병률-처리구 발병률) / 무처리구 발병률]
도 17에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 토마토 뿌리혹선충병에 대한 방제효과를 병원균 접종 6주 후 조사한 결과, JCK-1421 균주 배양액 및 JCK-1421 20 SC는 500배, 1,000배, 2,000배 희석액에서 무처리구 대비 galling index(%) 각각 65%, 39%, 17% 및 58%, 61%, 70%의 방제효과를 보였고, egg masses(%) 각각 72%, 39%, 0% 및 74%, 67%, 78%의 방제가를 보였다. 대조약제로 사용한 테라노바는 5,000배 희석액에서 galling index(%)와 egg masses(%) 각각 87% 및 96%의 방제가를 보였다. 따라서 JCK-1421 20 SC제제는 2,000배 희석액에서 각각 가장 높은 알부화 억제 및 골형성 억제 효과를 보였으며, 특히 JCK-1421균주 배양액 500배 희석액 처리구와 모든 JCK-1421 20 SC제제 처리구에서 대조약제인 테라노바와 통계적으로 유의한 차이가 없는 우수한 토마토 뿌리혹선충병 방제활성을 보였다. 따라서 JCK-1421 균주가 토마토 뿌리혹선충병의 원인선충인 M. incognita에 직접적인 살선충활성이 없었기에 토마토에서 저항성을 유도하여 토마토 뿌리혹선충병을 방제하였다고 할 수 있다. 따라서 향후 JCK-1421 균주의 저항성 유도 활성을 이용하여 효능이 우수한 토마토 뿌리혹선충병 방제제 개발이 가능함을 확인하였다.
실시예 19. 라이조박터 엔지모제네스(
Lysobacter enzymogenes
) JCK-1421 균주의 소나무재선충병에 대한 방제효과
JCK-1421 균주의 유도저항성에 의한 소나무재선충병의 in vivo 방제효과를 조사하기 위하여, 서로 다른 감수성 수종인 소나무(Pinus densiflora) 및 곰솔 (Pinus thunbergii) 2년생 유묘(직경 5.5 mm 내외, 신장이 토양으로부터 약 35 내지 45 cm)를 이용하여 유묘검정을 수행하였다.
시료처리를 위한 JCK-1421 균주의 배양액은 실시예 9에서 기술한 방법으로 준비하였다. 준비한 JCK-1421 균주의 배양액은 250 μg/mL Tween 20을 포함한 수용액에 광학밀도의 값이 0.8 수준이 되도록 용해한 후, 미세분사기에 넣어 소나무당 5 mL씩 소나무재선충 접종 2주 전, 1주 전 2회 엽면살포하였다. 이때, 양성대조구으로는 살선충 물질인 에마멕틴 벤조에이트(Emamectin benzoate, EB)를 10% 메탄올을 포함하는 수용액에 10 mg/mL 수준으로 용해한 후 100 μL를 소나무재선충 접종 1주 전 수간주입하였다.
소나무와 곰솔 유묘에 소나무재선충병을 유발하기 위하여 소나무재선충을 하기와 같이 배양하였다. 우선적으로 소나무재선충이 먹이로 하는 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea)를 접종하고 25℃ 배양기에서 7일 동안 정치배양하였다. 배양된 보트리티스 시네레아 위에 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus, 국립산림과학원)을 접종한 뒤 25℃ 배양기에서 7일 동안 정치배양하였다. 배양된 소나무재선충은 깔대기법 (Baermann funnel method)을 이용하여 수확한 후 광학현미경 하에서 수를 조사하여 20,000 마리/ml 수준으로 조정하였다. 접종원을 준비한 후 JCK-1421 균주의 배양액과 대조구 약제가 처리된 소나무와 곰솔의 목질부 1 cm 정도를 멸균된 칼로 내피 심층부위까지 절개한 후, 멸균된 탈지면을 가로 0.5 cm, 세로 1 cm로 만들어 절개부위에 삽입하고 분리한 소나무재선충을 100 μL씩 2,000 마리 접종(JCK-1421 균주 배양액과 양성대조구 처리 1주일 후 접종)하였으며, 접종된 부위는 파라필름으로 밀봉하여 건조되지 않도록 하였다(수피박피접종법). 소나무 유묘에서는 소나무재선충 6주 후, 곰솔에서는 소나무재선충 접종 4주 후 마름정도를 관찰하였다.
| 수종 | 시료 | 발병도(%) | 방제가(%) |
| 곰솔 | JCK-1421배양액 | 34 | 56.96 |
| 양성대조구(EB) | 20 | 74.68 | |
| 무처리구 | 79 | - | |
| 무접종구 | - | - |
표 5 및 도 18에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 곰솔에서의 소나무재선충병에 대한 방제효과를 병원충 접종 후 조사한 결과, 병원충 접종 6주 후 JCK-1421 균주 배양액은 소나무재선충병 방제가가 57%에 달하는 우수한 병방제 활성을 보여주었다.
| 수종 | 시료 | 발병도(%) | 방제가(%) |
| 소나무 | JCK-1421배양액 | 16 | 79.49 |
| 양성대조구(EB) | 10 | 87.18 | |
| 무처리구 | 78 | - | |
| 무접종구 | - | - |
또한, 표 6 및 도 19에서 확인할 수 있듯이, 라이조박터 엔지모제네스 JCK-1421 균주의 소나무에서의 소나무재선충병에 대한 방제효과를 병원충 접종 4주 후 조사한 결과, JCK-1421 균주 배양액은 소나무재선충병 방제가가 79%에 달하는 우수한 병방제 활성을 보여주었다. 따라서 JCK-1421 균주가 소나무재선충병의 원인선충인 B. xylophilus에 직접적인 살선충활성이 없었기에 소나무와 곰솔에서 저항성을 유도하여 소나무재선충병을 방제하였다고 할 수 있다. 따라서 향후 JCK-1421 균주의 저항성 유도 활성을 이용하여 효능이 우수한 소나무재선충병 방제제 개발이 가능함을 확인하였다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (11)
- 항진균, 향세균 및 항선충 활성을 갖는 수탁번호 KCTC 15126BP로 기탁된 라이조박터 엔지모제네스 (Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주.
- 수탁번호 KCTC 15126BP로 기탁된 라이조박터 엔지모제네스 (Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 진균은 푸자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리움(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium), 라이족토니아 솔라니 AG2-2 브라운 패치(Rhizoctonia solani AG2-2 Brown patch), 라이족토니아 솔라니 AG2-2 라지 패치(AG2-2 Large patch), 라이족토니아 솔라니 AG-4(Rhizoctonia solani AG-4), 스크레로티니아 호모에오카파(Sclerotinia homoeocarpa), 및 피티움 아파니더마튬(Pythium aphanidermatum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 세균은 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum), 펙토박테리움 카로토보라 서브스페시스 카로토보라(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 잔토모나스 유베지카토리아(Xanthomonas euvesicatoria), 및 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 선충은 멜로이도지네 인코그니타(Meloidogyne incognita), 및 버사펠렌쿠스 자이로필루스(Bursaphelenchus xylophilus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물.
- 수탁번호 KCTC 15126BP로 기탁된 라이조박터 엔지모제네스 (Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주를 배양하는 배양 단계를 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물의 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 진균은 푸자리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸자리움 옥시스포름 에프. 에스피. 쿠쿠머리움(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium), 라이족토니아 솔라니 AG2-2 브라운 패치(Rhizoctonia solani AG2-2 Brown patch), 라이족토니아 솔라니 AG2-2 라지 패치(AG2-2 Large patch), 라이족토니아 솔라니 AG-4(Rhizoctonia solani AG-4), 스크레로티니아 호모에오카파(Sclerotinia homoeocarpa), 및 피티움 아파니더마튬(Pythium aphanidermatum)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물의 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 세균은 랄스토니아 솔라나세아륨(Ralstonia solanacearum), 펙토박테리움 카로토보라 서브스페시스 카로토보라(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 잔토모나스 유베지카토리아(Xanthomonas euvesicatoria), 및 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물의 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 선충은 멜로이도지네 인코그니타(Meloidogyne incognita), 및 버사펠렌쿠스 자이로필루스(Bursaphelenchus xylophilus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물의 제조방법.
- 수탁번호 KCTC 15126BP로 기탁된 라이조박터 엔지모제네스 (Lysobacter enzymogenes) JCK-1421 균주의 배양액 또는 이의 추출물을 처리하는 조성물 처리 단계를 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 조성물 처리 단계는 살포, 토양관주, 침지, 독이, 훈연 시용, 및 종자처리로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방식으로 수행되는 것인, 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법.
Priority Applications (2)
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| KR1020220151546A KR20240072343A (ko) | 2022-11-14 | 2022-11-14 | 라이조박터 엔지모제네스 jck-1421 균주의 배양액 또는 균주 배양액의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물, 이의 제조 방법, 및 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법 |
| PCT/KR2023/015634 WO2024106754A1 (ko) | 2022-11-14 | 2023-10-11 | 라이조박터 엔지모제네스 jck-1421 균주의 배양액 또는 균주 배양액의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물, 이의 제조 방법, 및 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020220151546A KR20240072343A (ko) | 2022-11-14 | 2022-11-14 | 라이조박터 엔지모제네스 jck-1421 균주의 배양액 또는 균주 배양액의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물, 이의 제조 방법, 및 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법 |
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| KR1020220151546A KR20240072343A (ko) | 2022-11-14 | 2022-11-14 | 라이조박터 엔지모제네스 jck-1421 균주의 배양액 또는 균주 배양액의 추출물을 포함하는 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제용 조성물, 이의 제조 방법, 및 식물 진균병, 세균병 또는 선충병 방제 방법 |
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