KR20240072269A - 온화한 산화에 의한 변형된 유청 단백질 조성물을 생산하는 방법, 변형된 유청 단백질 조성물, 및 변형된 유청 단백질 조성물의 영양학적 용도 - Google Patents
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-
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Abstract
본 발명은 베타-락토글로불린의 유리 티올 기를 노출시키고 임의로 산화시키는 조건 하에서 온화한 산화에 의해 변형된 유청 단백질 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 생성된 변형된 유청 단백질 생성물은 예를 들어 단백질-풍부한 음료 생성물에서 탁월한 수행성을 갖는 것으로 밝혀졌고 특히 중성 pH에서 멸균 열처리 동안 및 그러한 음료 생성물의 소비 동안 불쾌한 냄새의 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
Description
본 발명은 베타-락토글로불린의 유리 티올 기를 노출시키고 임의로 산화시키는 조건 하에서 온화한 산화에 의해 변형된 유청 단백질 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 생성된 변형된 유청 단백질 생성물은, 예를 들어 단백질-풍부 음료 생성물에서 탁월한 성능을 갖는 것으로 밝혀졌고 특히 중성 pH에서 멸균 열처리 동안 및 그러한 음료 생성물의 소비 동안 불쾌한 냄새의 감소된 수준을 야기하는 것으로 밝혀졌다.
멸균되고, pH-중성인, 유청 단백질-풍부 음료는 열적 처리 동안 썩은 계란의 냄새와 유사한 불쾌한 냄새를 생성하는 경향이 있다. 음료는 전형적으로 생산 직후 병에 담기므로 병을 열 때 소비자가 불쾌한 냄새에 노출되기도 한다.
예를 들어 과산화수소에 의한 유청 단백질 생성물의 산화는 이전에는 유청 단백질 생성물을 표백하고 향상된 시각적 품질 및 허용가능한 미생물학의 유청 단백질 분말을 만들기 위해 사용되었다. 그러나, 산화는 유청 단백질 조성물의 특정 구성요소의 산화적 분해로 인해 저장 동안 불쾌한 냄새의 전개 및 색상 전개와 같은 감각 문제와도 연관되어 있다.
Jervis 등 ("Effect of bleaching whey on sensory and functional properties of 80% whey protein concentrate"; J. Dairy Sci.; 95; 2848-2862 페이지; 2012)은 상승된 온도에서 과산화수소 또는 과산화벤조일로 고단백 유청 단백질 농축물을 표백하는 효과의 연구를 개시한다. 재구성된 산화된 유청 단백질 분말의 비가열된, 10% 수성 용액을 관능 분석하였으며 여기서 증가된 "카드보드 풍미"와 "지방 풍미"가 관찰되었지만 "요리/우유 풍미"에서의 감소가 관찰되었다.
US20160235082A1은 특정 농도의 과산화수소의 존재에서 유청 단백질에 특정 열처리를 적용함에 의해 생산될 수 있는 열 안정성 유청 단백질 성분을 생산하는 방법을 개시한다. WPI, WPC 또는 임의의 기타 형태의 유청 단백질 성분의 열 안정성 액체 보유물과 WPI, WPC 또는 임의의 기타 유청 단백질 분말의 열 안정성 분말을 포함한 유청 단백질 성분은 과산화수소 용액과 혼합된 유청 단백질 용액의 열처리에 의하여 제조될 수 있다. 열 안정성 유청 단백질은 출발 유청 단백질 시스테인이 시스테인 설폰산으로 전환되어, 주요 유청 단백질인 베타-락토글로불린의 유리 설프하이드릴 기가 시스테인 설폰산 및/또는 시스테인산과 같은 화합물로 전환되며, 이는 바람직하지 않은 겔화를 최소화하거나 제거하기 위해 제안될뿐만 아니라 또한 화합물의 타우린 기에 대한 전구체이기도 하다.
본 발명자들은 유청 단백질-함유 음료의 생산 동안 생성된 썩은 계란의 냄새와 유사한 불쾌한 냄새를 감소시키거나 심지어 제거하기 위해 유청 단백질 생성물의 온화한 산화를 사용할 수 있음을 발견했다.
발명의 일 양태는 산화된 유청 단백질 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 6.5-9.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 1% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 10% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w의 단백질 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-160℃의 범위인 온도이고/이거나
ii) 20-4000bar의 범위인 압력으로 가압되고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 상기 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하여, 바람직하게는, 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 15 마이크로몰/g 단백질로 감소시키는 것으로, 여기서 상기 하나 이상의 조건은
I) 0-160℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액, 및/또는
II) 20-4000bar의 범위인 압력으로 가압된 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
c) 임의로, 보다 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물을 적어도 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 임의로, 보다 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급원료를 건조시키는 것.
발명의 또 다른 양태는 다음을 갖는 산화된 유청 단백질 조성물에 관한 것이다:
- 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w의 단백질 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 지방 함량,
- 최대 15 마이크로몰의 유리 티올 기/g 단백질,
- 바람직하게는, 총 단백질에 대해 적어도 0.7% w/w의 트립토판 함량,
- 바람직하게는, 총 단백질에 대해 적어도 0.3% w/w의 메티오닌 함량,
- 바람직하게는, 최대 0.2 마이크로그램/mg 단백질의 키누레닌 함량,
- 바람직하게는, 100-600 마이크로몰/g 단백질의 범위인 단백질 결합 황 함량,
- 바람직하게는, 150-400 마이크로몰/g 단백질의 범위인 이황화 결합을 형성하는 단백질 결합 시스테인 잔기의 함량
- 바람직하게는, 18kDa 내지 10000kDa, 보다 바람직하게는 50-8000kDa, 가장 바람직하게는 80-5000kDa의 범위인 단백질의 중량 평균 분자량, 및
- 바람직하게는, 18kDa 내지 10000kDa 사이, 보다 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w의 분자량을 가지는 적어도 60% w/w의 단백질.
발명의 추가 양태는 다음을 포함하는 식품을 생산하는 공정에 관한 것이다:
- 본 명세서에 기술된 산화된 유청 단백질 조성물을 가공하는 단계, 및/또는
- 기술된 산화된 유청 단백질 조성물 및/또는 가공된 산화된 유청 단백질 조성물을 하나 이상의 추가 성분과 조합하고, 임의로 조합을 가공하는 단계.
식품의 바람직한 예는 pH 5.5-8.5를 갖는 열처리된, 바람직하게는, 열멸균된 음료이다.
따라서, 발명의 더욱 구체적인 양태는 pH 5.5-8.5, 보다 바람직하게는, pH 6.5-7.5를 갖는 열처리된, 바람직하게는, 열멸균된 음료를 생산하는 공정에 관한 것이며, 상기 공정은 다음을 포함한다:
1) 본 명세서에 기술된 산화된 유청 단백질 조성물을 하나 이상의 추가 성분과 조합하여 pH 5.5-8.5, 보다 바람직하게는, pH 6.5-7.5를 가지고, 다음을 포함하는 액체 혼합물을 얻는 단계:
- 적어도 0.5% w/w 단백질로 기여하기에 충분한 양의 산화된 유청 단백질 조성물, 및
- 물,
2) 액체 혼합물을 용기, 바람직하게는, 멸균 용기에 포장하고, 여기서 액체 혼합물은 포장 이전 및/또는 포장 후에 열처리되고, 바람직하게는, 열멸균되는, 단계.
발명의 추가 양태는 바람직하게는 적어도 3% w/w의 유청 단백질 함량을 가지고, 바람직하게는 간접 열처리를 사용하여 열멸균된, 바람직하게는 5.5-8.5의 범위인 pH를 가지는 열멸균된 음료의 썩은 계란의 냄새에 유사한 냄새를 개선하고/하거나 불쾌한 냄새의 수준을 감소시키기 위한 식품 성분으로서의 산화된 유청 단백질 조성물, 바람직하게는 발명의 산화된 유청 단백질 조성물의 용도에 관한 것이다.
발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 식품 성분에 관한 것이다:
- 본 명세서에 기술된 산화된 유청 단백질 조성물의 고형물, 및
- 하나 이상의 추가 성분(들)로 바람직하게는 다음으로부터 선택됨:
- 유제품 성분, 바람직하게는, 비산화된 유제품 성분,
- 식물 기반 성분,
- 비유제품 탄수화물 공급원,
- 향미제, 및/또는
- 감미료(감미 탄수화물/폴리올/HIS).
발명의 또 다른 양태는 바람직하게는 적어도 3% w/w의 유청 단백질 함량을 가지고, 바람직하게는 간접 열처리를 사용하여 열멸균된, 바람직하게는 pH가 5.5-8.5의 범위인 열멸균된 음료의 썩은 계란의 냄새에 유사한 냄새를 개선하고/하거나 불쾌한 냄새의 수준을 감소시키기 위한 식품 성분으로서의 산화된 유청 단백질 조성물, 바람직하게는 발명의 산화된 유청 단백질 조성물의 용도에 관한 것이다.
도 1은 실시예 2b에서 모의 UHT 처리를 거친 음료 샘플의 사진을 보여준다: 샘플 1: WPI-B22(비가열된 참조), 샘플 2: WPI-B30; 샘플 3: WPI-B29; 샘플 4: WPI-B28; 샘플 5: WPI-B27; 샘플 6: WPI-B26; 샘플 7: WPI-B25; 샘플 8: WPI-B24; 샘플 9: WPI-B23.
도 2는 비산화된 WPI 참조(WPI-C24), 발명에 따른 액체 산화된 WPI(WPI-C25) 및 발명에 따른 산화된 WPI 분말(WPI-C26)의 아미노산 프로필의 플롯을 도시한다. 도 2는 본 발명이 유청 단백질 공급원의 아미노산 조성을 손상시키지 않고 베타-락토글로불린의 유리 티올의 선택적인 산화를 허용한다는 것을 입증한다.
도 2는 비산화된 WPI 참조(WPI-C24), 발명에 따른 액체 산화된 WPI(WPI-C25) 및 발명에 따른 산화된 WPI 분말(WPI-C26)의 아미노산 프로필의 플롯을 도시한다. 도 2는 본 발명이 유청 단백질 공급원의 아미노산 조성을 손상시키지 않고 베타-락토글로불린의 유리 티올의 선택적인 산화를 허용한다는 것을 입증한다.
발명의 양태는 산화된 유청 단백질 조성물을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 6.5-9.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 1% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 10% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w의 단백질 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-160℃의 범위인 온도이고/이거나
ii) 20-4000bar의 범위인 압력으로 가압되고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 상기 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하여, 바람직하게는, 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 15 마이크로몰/g 단백질로 감소시키는 것으로, 여기서 상기 하나 이상의 조건은
I) 0-160℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액, 및/또는
II) 20-4000bar의 범위인 압력으로 가압된 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
c) 임의로, 보다 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물을 적어도 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 임의로, 보다 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급원료를 건조시키는 것.
예를 들어, 발명의 바람직한 실시형태는 산화된 유청 단백질 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 6.5-9.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 1% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 10% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w의 단백질 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-65℃의 범위인 온도이고/이거나
ii) 100-4000bar의 범위인 압력으로 가압되고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 상기 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하여, 바람직하게는, 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 15 마이크로몰/g 단백질로 감소시키는 것으로, 여기서 상기 하나 이상의 조건은
I) 0-65℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액, 및/또는
II) 100-4000bar의 범위인 압력으로 가압된 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
c) 임의로, 보다 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물을 적어도 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 임의로, 보다 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급원료를 건조시키는 것.
본 발명의 맥락에서, 생성물과 관련된 용어 "산화된 유청 단백질 조성물"은 최대 15 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 10 마이크로몰/g 단백질의 유리 티올 기의 함량을 가지고, 이는 본 방법으로부터 획득가능하다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "유리 티올 기"는 예를 들어, 아미노산 시스테인에 존재하는 -SH 기에 관한 것이다. 유청 단백질 생성물에서, 유리 티올 기는 전형적으로 단백질의 일부를 형성하고 전형적으로 단백질의 시스테인 잔기에 의해 제공된다. 본 문맥에서, 용어 "유리"는 -SH 기가 이황화 결합(-S-S-)을 형성하도록 다른 -SH 기와 반응하지 않았음을 의미한다. 유리 티올 기의 함량은 분석 E에 따라 측정된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "티올 기의 총량"은 -SH의 형태(즉, 유리 티올로서)로 존재하거나 이황화 결합의 형태(-S-S-)로 존재하는 티올 기의 합계에 관한 것이다. 티올 기의 총량은 분석 E에 따라 측정된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "산화 유청 단백질 용액"은, 예를 들어 시스테인의 유리 티올 기를 산화시킬 수 있는 과산화물과 같은 산화제를 함유하는 수성 유청 단백질 용액에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "베타-락토글로불린" 또는 BLG는, 예를 들어 천연 및/또는 글리코실화된 형태에서의 포유동물 종으로부터의 BLG에 관한 것이고 자연적으로 발생하는 유전적 변이체를 포함한다. 용어 BLG는 또한 재조합 미생물에 의해 생산된 포유동물 BLG를 포괄한다. 본 명세서에 사용된 용어 "BLG" 또는 "베타-락토글로불린"은 펼쳐진 및 응집된 BLG를 제외한다. BLG의 함량은 분석 L에 따라 측정된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제"는 시스테인의 티올 기를 산화시키고, 따라서 유리 티올 기가 접근가능해질 때, BLG의 유리 티올 기를 산화시키는 그 능력을 특징으로 하는 하나 이상의 산화제를 지칭한다. 유용한 예는 예를 들어 식품 생산을 위해 승인된 과산화물이고, 가장 바람직하게는 과산화수소이다.
용어 "유청"은 우유의 카세인이 침전되어 제거된 후 남아 있는 액체상에 관한 것이다. 카세인 침전은 예를 들어 우유의 산성화 및/또는 레넷 효소의 사용에 의하여 달성될 수 있다. 카제인의 레닛-기반 침전에 의해 생성된 유청 생성물인 "단 유청"과 카세인의 산-기반 침전에 의해 생성된 유청 생성물인 "산 유청" 또는 "신 유청"과 같은 여러 유형의 유청이 존재한다. 예를 들어 카제인의 산-기반 침전은 식품 산의 첨가 또는 박테리아 배양의 수단에 의해 달성될 수 있다.
용어 "유장(milk serum)"은 예를 들어 정밀여과 또는 대공극 한외여과에 의해 우유에서 카세인과 유지방 소구체가 제거되었을 때 남아 있는 액체에 관한 것이다. 유장은 "이상적인 유청"이라고도 지칭될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "유청 단백질"은 유청 또는 유장에서 발견되는 단백질에 관한 것이다. 유청 단백질은 유청이나 유장에서 발견되는 단백질 종의 하위집합일 수도 있고, 심지어 단일 유청 단백질 종일 수도 있거나 유청 및/또는 유장에서 발견되는 단백질 종의 전체 집합일 수도 있다.
비분획화된 유청 단백질은 전형적으로 알파-락트알부민(ALA), 베타-락토글로불린(BLG), 소 혈청 알부민, 면역글로불린, 오스테오폰틴, 락토페린 및 락토페록시다제를 함유한다. 레넷 처리된 우유로부터 유래된 유청 단백질은 더욱이 다른 단백질 종에 부가하여 카세인노마크로펩티드(CMP)를 포함한다.
본 명세서에 기술된 분석의 방법은 발명과 관련된 상응하는 매개변수를 결정하는데 사용된다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 과산화물, 오존, 이산소 또는 이의 조합을 포함하거나 심지어 이로 이루어진다.
시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 하나 이상의 과산화물과 산화 유청 단백질 용액에 용해되는 산소를 포함하거나 심지어 이로 이루어지는 것이 특히 바람직하다.
훨씬 더 바람직하게는, 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 과산화수소와 산화 유청 단백질 용액에 용해된 산소를 포함하거나 심지어 이로 이루어진다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 50% mol/mol, 보다 바람직하게는 적어도 70% mol/mol, 보다 더 바람직하게는 적어도 80% mol/mol, 가장 바람직하게는 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물을 포함한다.
훨씬 더 높은 함량의 과산화물이 종종 바람직하고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 92% mol/mol의 양으로 과산화물을 포함하며, 보다 바람직하게는 적어도 94% mol/mol, 보다 바람직하게는 적어도 96% mol/mol, 가장 바람직하게는 적어도 98% mol/mol 과산화물을 포함한다.
시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 과산화수소, 벤조일 과산화물, 과아세트산 또는 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 과산화물을 포함하거나 심지어 이로 이루어지는 것이 종종 바람직하다.
시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 과산화수소를 포함하거나 심지어 이로 이루어지는 것이 특히 바람직하다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 50% mol/mol, 보다 바람직하게는 적어도 70% mol/mol, 보다 더 바람직하게는 적어도 80% mol/mol, 가장 바람직하게는 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화수소를 포함한다.
훨씬 더 높은 함량의 과산화수소가 종종 바람직하고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 92% mol/mol, 보다 바람직하게는 적어도 94% mol/mol, 보다 바람직하게는 적어도 96% mol/mol, 가장 바람직하게는 적어도 98% mol/mol의 양으로 과산화수소를 포함한다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 예를 들어 락토스 산화효소 또는 헥소스 산화효소, 예컨대 예를 들어 글루코스 산화효소의 사용에 의해 효소적으로 생성된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 전기화학적으로 생성된다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액에 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 투여하는 2가지 주요 접근법이 있다.
첫 번째 접근법에서는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 모든 필수 산화제가 단계 a) 동안 첨가되고, 그런 다음 단계 b) 동안 적어도 부분적으로 사용된다. 이 접근법은 구현하기 쉽지만 두 번째 접근법보다 원하지 않는 산화가 종종 발생하기 쉽다.
두 번째 접근법은 단계 a)에서 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 상대적으로 낮은 초기 함량을 사용하지만, 단계 b) 동안 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 연속적으로 또는 별도의 추가(들)에 의해 추가 투여하는 것을 포함한다. 발명자들은 이 접근법이 유리 티올 기의 매우 온화한 산화를 제공하지만 첫 번째 접근법보다 구현하기가 약간 더 복잡하다는 사실을 발견했다.
더욱이 단계 a) 동안 대부분의 산화제를 첨가하고 단계 b) 동안 일부 산화제를 보충하여 방법을 구현하는 것이 가능하다.
첫 번째 접근법에 특히 유용한, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 적어도 1:2, 보다 바람직하게는 적어도 1:1, 가장 바람직하게는 적어도 2:1이다.
종종 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 적어도 3:1, 보다 바람직하게는 적어도 5:1, 가장 바람직하게는 적어도 10:1인 것이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서, 제1 구성요소(A)의 양과 제2 구성요소(B)의 양 사이의 비율은 A를 B로 나눈 것을 의미하며, 이는 A:B로도 표시된다.
첫 번째 접근법에서 바람직하게는, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:2-200:1, 더 바람직하게는 1:1-100:1, 보다 더 바람직하게는 2:1-30:1, 가장 바람직하게는 4:1-15:1이다.
첫 번째 접근법과 관련하여 대안적으로, 그러나 또한 바람직하게는, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:2-15:1, 더 바람직하게는 1:1.5-10:1, 보다 더 바람직하게는 1:1-8:1, 가장 바람직하게는 1:1-3:1이다.
종종 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:2-200:1, 더 바람직하게는 1:1-100:1, 보다 더 바람직하게는 2:1-30:1, 가장 바람직하게는 4:1-15:1인 것이 바람직하다.
대안적으로, 그러나 또한 바람직하게는, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:2-15:1, 더 바람직하게는 1:1.5-10:1, 보다 더 바람직하게는 1:1-8:1, 가장 바람직하게는 1:1-3:1일 수 있다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:1.5-15:1, 더 바람직하게는 1:1.5-10:1, 보다 더 바람직하게는 1:1.5-8:1, 가장 바람직하게는 1:1.5-3:1이다.
더욱이 첫 번째 접근법과 관련하여, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 2:1-30:1, 더 바람직하게는 3:1-25:1, 보다 더 바람직하게는 4:1-20:1, 가장 바람직하게는 5:1-15:1인 것이 바람직하다.
특히 두 번째 접근법에 유용한, 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 최대 5:1, 더 바람직하게는 최대 2:1, 보다 더 바람직하게는 최대 1:1, 가장 바람직하게는 최대 1:2이다.
두 번째 접근법에 대해 바람직하게, 그리고 특히 유용하기로, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 최대 1:4, 보다 바람직하게는 최대 1:10, 보다 더 바람직하게는 최대 1:20, 가장 바람직하게는 최대 1:40이다.
두 번째 접근법에서 바람직하게는, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:100-5:1, 더 바람직하게는 1:60-2:1, 보다 더 바람직하게는 1:40-1:1, 가장 바람직하게는 1:20-1:2이다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 6.5-9.5의 범위인 pH를 갖는다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 7.0-9.5, 더 바람직하게는 7.1-8.5, 보다 더 바람직하게는 7.2-8.5, 가장 바람직하게는 7.4-8.2의 범위인 pH를 갖는다. 발명자들은 이들 pH 범위가 BLG의 유리 티올 기의 신속하고 선택적인 산화에 특히 유익하다는 것을 발견했다.
발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 7.5-9.5, 더 바람직하게는 7.6-8.5, 보다 더 바람직하게는 7.7-8.4, 가장 바람직하게는 7.7-8.3의 범위인 pH를 갖는다. 발명자들은 이들 pH 범위가 BLG의 유리 티올 기의 신속하고 선택적인 산화에 특히 유익하다는 것을 발견했다.
대안적으로, 그러나 또한 바람직하게는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 6.5-8.5, 더 바람직하게는 6.6-8.0, 보다 더 바람직하게는 6.7-7.5, 가장 바람직하게는 6.8-7.3의 범위인 pH를 가질 수 있다.
발명자들은 특히 건조가 필요할 때 생산 능력을 향상시키고 공정의 물 및 에너지 소비를 감소시키기 위해 적어도 1% w/w, 바람직하게는 보다 더 높은 단백질 함량으로 방법을 수행하는 것이 유리하다는 것을 발견했다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 2% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 3% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 5% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 6% w/w의 총 단백질 함량을 갖는다.
바람직하게는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 1-30% w/w, 더 바람직하게는 3-20% w/w, 보다 더 바람직하게는 4-15% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 6-10% w/w의 범위인 총 단백질 함량을 갖는다.
발명자들은 단백질 함량을 12% w/w 이하로 유지하는 것이 종종 유리하다는 것을 관찰했는데 이는 이것이 단계 b) 동안 야기되는 단백질 응집의 수준을 제한하는 것으로 보이기 때문이다. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 1-12% w/w, 더 바람직하게는 3-11% w/w, 보다 더 바람직하게는 4-10% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 5-9% w/w의 범위인 총 단백질 함량을 갖는 것이 종종 바람직하다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 고형물에 대해 적어도 50% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 75% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 85% w/w의 총 단백질 함량을 갖는다.
바람직하게는, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 고형물에 대해 30-99% w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 고형물에 대해 50-97% w/w, 보다 더 바람직하게는 75-96% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 85-95% w/w의 범위인 총 단백질 함량을 갖는다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 총 단백질에 대해 적어도 10% w/w의 BLG 함량을 갖는다.
발명자들은 유청 단백질 BLG가 pH-중성 식품의 열처리 동안 불쾌한 냄새의 형성에 적어도 부분적으로 책임이 있음을 발견했고, BLG의 유리 티올 기가 냄새 형성에 관여하는 것으로 여겨진다. 따라서 본 발명은 일부 BLG, 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 10% w/w BLG를 함유하는 유청 단백질 공급원을 가공하는데 특히 적합하다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 적어도 20% w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 45% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 50% w/w의 BLG 함량을 갖는다.
훨씬 더 바람직하게는, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 적어도 55% w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 적어도 60% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 80% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 BLG 함량을 가질 수 있다.
바람직하게는, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 10-99% w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 45-98% w/w, 보다 더 바람직하게는 80-96% w/w, 가장 바람직하게는 90-95% w/w의 범위인 BLG 함량을 갖는다.
대안적으로, 그러나 또한 바람직하게는, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 10-90% w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 20-80% w/w, 보다 바람직하게는 30-75% w/w, 가장 바람직하게는 45-70% w/w의 범위인 BLG 함량을 가질 수 있다.
유청 단백질 공급원의 단백질 조성물과 관련하여 기술된 특성 및 선호도는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 단백질 조성물에도 동일하게 적용된다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액 및 이를 제조한 유청 단백질 공급원은 또한 전형적으로 적어도 미량의 다른 유청 단백질을 포함한다. 예를 들어, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액 및 이를 제조한 유청 단백질 공급원은 전형적으로 또한 하나 이상의 알파-락트알부민(ALA), 카제이노마크로펩티드(CMP), 소 혈청 알부민, 면역글로불린, 오스테오폰틴, 락토페린 및 락토페록시다제를 함유한다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액 및 이를 제조한 유청 단백질 공급원은 바람직하게는 총 단백질에 대해 최대 20% w/w, 보다 바람직하게는 총 단백질에 대해 최대 10% w/w, 보다 더 바람직하게는 최대 6% w/w, 가장 바람직하게는 최대 2% w/w의 양으로 카세인을 함유한다.
발명자들은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 지방 수준이 바람직하게는, 낮게, 바람직하게는 유청 단백질 농축물 및 고지방 WPI에서 전형적으로 발견되는 수준보다 낮게 유지된다는 것을 발견했다.
바람직하게는, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 총 지방 함량을 갖는다.
훨씬 더 낮은 수준의 지방이 전형적으로 바람직하고, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액이 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 보다 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 0.5% w/w, 보다 더 바람직하게는 최대 0.2% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.1% w/w의 총 지방 함량을 갖는 것이 종종 바람직하다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 다양한 양으로 탄수화물을 함유할 수 있다.
그러나, 종종 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 총 고형물에 대해 최대 65% w/w의 탄수화물 함량을 갖는 것이 바람직하다.
훨씬 더 낮은 수준의 탄수화물이 전형적으로 바람직하고, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액이 총 고형물에 대해 최대 20% w/w, 보다 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 8% w/w, 보다 더 바람직하게는 최대 2% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 탄수화물 함량을 갖는 것이 종종 바람직하다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 바람직하게는 최대 30%, 보다 바람직하게는 최대 25%, 보다 더 바람직하게는 최대 20%, 가장 바람직하게는 최대 15%의 단백질 변성의 정도를 갖는다.
단백질 변성의 정도는 WO 2020/002426의 실시예 1.3에 따라 결정된다.
훨씬 더 낮은 단백질 변성의 정도가 종종 바람직하고, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 바람직하게는 최대 12%, 보다 바람직하게는 최대 10%, 보다 더 바람직하게는 최대 8%, 가장 바람직하게는 최대 5%의 단백질 변성의 정도를 갖는다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 8% w/w, 더 바람직하게는 최대 6% w/w, 보다 더 바람직하게는 최대 5%, 가장 바람직하게는 최대 4.0%의 회분 함량을 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 바람직하게는 총 고형물에 대해 0.4-8% w/w, 더 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 0.5-6% w/w, 보다 더 바람직하게는 0.5-5% w/w, 가장 바람직하게는 0.6-4.0% w/w의 회분 함량을 갖는다.
조성물의 회분 함량은 WO 2020/002426의 실시예 1.13에 따라 결정된다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 더 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 0.7% w/w, 보다 더 바람직하게는 최대 0.5% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 마그네슘과 칼슘의 조합된 함량을 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 바람직하게는 총 고형물에 대해 0.01-1% w/w, 보다 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 0.001-0.7% w/w, 보다 더 바람직하게는, 0.01-0.5% w/w, 가장 바람직하게는 0.01-0.2% w/w의 마그네슘과 칼슘의 조합된 함량을 갖는다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 0.5-50% w/w, 보다 바람직하게는 1-35% w/w, 보다 더 바람직하게는 2-20% w/w, 가장 바람직하게는 3-10% w/w의 고형물 함량을 갖는다.
고체로 구성되지 않은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 일부는 바람직하게는 물을 포함한다. 고체로 구성되지 않은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 일부는 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 90% w/w, 보다 더 바람직하게는 95% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 99% w/w의 양으로 물을 포함한다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-160℃의 범위인 온도이고/이거나
ii) 20-4000bar의 범위인 압력으로 가압된다.
이는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액이 다음을 충족해야 함을 의미한다:
i) 0-160℃의 범위인 온도를 갖거나, 또는
ii) 20-4000bar의 범위인 압력으로 가압되거나, 또는
i+ii) 0-160℃의 범위인 온도를 가지고 20-4000bar의 범위인 압력으로 가압된다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)는 조건 i)을 포함한다.
발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 단계 a)는 조건 ii)를 포함한다.
발명의 추가 바람직한 실시형태에서, 단계 a)는 특성 i) 및 ii) 둘 모두를 포함한다.
i)의 온도 범위와 ii)의 압력 범위 둘 모두를 동시에 사용하여 발명을 구현하는 것이 가능하고 발명자들은 상승된 온도와 증가된 압력 둘 모두가 본 명세서에 기술된 조건 하에서 BLG의 유리 티올의 선택적 산화에 유리하다는 것을 발견했다.
바람직하게는, 단계 a)의 조건 i)은 5-65℃, 더 바람직하게는 10-65℃, 보다 더 바람직하게는 30-60℃, 가장 바람직하게는 40-55℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함한다.
발명자들은 pH 6.5에 가까운 가장 낮은 pH 범위가 더 높은 pH 범위보다 효율적인 산화를 위해 더 높은 온도를 필요로 한다는 것을 발견했다.
발명의 일부 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 pH는 6.5-7.0의 범위에 있고 그 온도는 40-65℃, 보다 바람직하게는 45-65℃, 보다 더 바람직하게는 50-65℃, 가장 바람직하게는 55-65℃의 범위에 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 pH는 7.1-9.5 범위에 있고 그 온도는 5-65℃, 보다 바람직하게는 10-65℃, 보다 바람직하게는, 30-60℃, 가장 바람직하게는 40-55℃의 범위에 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 pH는 8.5-9.5 범위에 있고 그 온도는 0-65℃, 보다 바람직하게는, 0-50℃, 보다 더 바람직하게는 0-30℃, 가장 바람직하게는 5-25℃의 범위에 있다.
발명자들은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 pH가 7.5-8.5 범위에 있고 온도가 5-60℃, 보다 바람직하게는 10-60℃, 보다 더 바람직하게는 15-60℃, 가장 바람직하게는 20-60℃의 범위에 있는 것이 특히 바람직하다는 것을 발견했다. 이들 범위는 BLG의 유리 티올의 선택적 산화와 상대적으로 빠른 반응 동역학 둘 모두에 유리한 것으로 보인다.
추가적으로, 발명자들은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 pH가 7.7-8.5 범위에 있고 온도가 25-55℃, 보다 바람직하게는 30-55℃, 보다 더 바람직하게는 35-50℃, 가장 바람직하게는 35-45℃의 범위에 있는 것이 특히 바람직하다는 것을 발견했다. 이들 범위는 또한 BLG의 유리 티올의 선택적 산화와 상대적으로 빠른 반응 동역학 둘 모두에 유리한 것으로 보인다.
발명자들은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액이 6.8-7.5의 범위인 pH를 갖는 것이 생산 관점에서 때때로 유리하다는 것을 발견했는데, 이는 산화 후 pH 조정의 필요성을 감소시키기 때문이다.
발명자들은 보다 더 높은 온도가 단계 a)에서 사용될 수 있고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서 조건 i)은 66-160℃, 보다 바람직하게는 70-145℃, 보다 더 바람직하게는 75-120℃, 가장 바람직하게는 80-100℃의 범위인 온도를 갖는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액을 포함한다는 것을 관찰하였다.
추가적으로, 발명자들은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 pH가 7.5-8.5, 보다 바람직하게는 7.7-8.5 범위에 있고 그 온도가 66-160℃, 더 바람직하게는 70-145℃, 보다 더 바람직하게는 75-120℃, 가장 바람직하게는 80-100℃의 범위에 있는 것이 특히 바람직하다는 것을 발견했다. 이들 범위는 또한 BLG의 유리 티올의 선택적 산화와 BLG의 상대적으로 빠른 반응 동역학 둘 모두에 유리한 것으로 보인다. 실시예 16에서 볼 수 있듯이, 이들 조합은 매우 빠른 단계 b)와 몇 분 이내에 완료되는 산화 공정을 허용한다.
단계 a)가 조건 i)을 사용하는 경우 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 100bar 미만, 전형적으로 0.1-100bar 범위, 보다 바람직하게는, 1-80bar 범위이다.
단계 a)의 조건 i)과 조건 ii)를 조합함에 의해 100bar 이상의 압력이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 단계 a)의 조건 ii)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액이 20-4000bar, 더 바람직하게는 200-3500bar, 보다 더 바람직하게는 300-3000bar, 가장 바람직하게는 500-2500bar의 범위인 압력에 적용되는 것을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 조건 ii)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액이 100-1000bar, 보다 바람직하게는 150-800bar, 보다 더 바람직하게는 200-600bar, 가장 바람직하게는 200-500bar의 범위인 압력에 적용되는 것을 포함한다.
발명의 다른 바람직한 실시형태에서 조건 ii)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액이 25-1000bar, 보다 바람직하게는, 30-500bar, 보다 더 바람직하게는 35-300bar, 가장 바람직하게는 40-200bar의 범위인 압력에 적용되는 것을 포함한다.
조건 ii)가 단계 a)에서 사용되는 경우 온도는 전형적으로 0-65℃, 보다 바람직하게는 5-65℃, 보다 더 바람직하게는 20-60℃, 가장 바람직하게는 40-60℃의 범위와 조건에 있다. 따라서 조건 ii)는 조건 i과 함께 바람직하게 사용되는 반면 조건 i)은 조건 ii) 없이 사용될 수도 있다.
발명자들은 단계 a)가 조건 ii)도 포함하는 경우 더 낮은 온도가 종종 충분하다는 것을 발견했다. 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 a)는 조건 ii)의 사용을 수반하고 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 0-50℃, 보다 바람직하게는, 0-40℃, 보다 더 바람직하게는 0-30℃, 가장 바람직하게는 2-20℃의 범위인 온도를 갖는다.
그러나, 조건 ii)가 단계 a)에서 사용되는 경우 온도는 또한 66-160℃, 보다 바람직하게는 70-145℃, 보다 더 바람직하게는 75-120℃, 가장 바람직하게는 80℃-100℃의 범위일 수 있다.
단계 a)에서 유청 단백질 공급원의 가공에는 전형적으로 유청 단백질 공급원을 시스테인의 티올을 산화시킬 수 있는 산화제와 접촉시키고 단백질 함량, pH, 온도 및/또는 압력을 원하는 수준으로 조정하는 하나 이상의 공정 단계가 포함된다.
바람직하게는, 단계 a)에서 유청 단백질 공급원의 가공은 다음 중 적어도 I 및 II, 임의로 III 및/또는 IV를 포함한다:
I) 유청 단백질 공급원을 시스테인의 티올을 산화시킬 수 있는 적어도 하나의 산화제 및 임의로 추가 성분; 예를 들어 물과, 바람직하게는 조합 또는 혼합함에 의해 접촉시키는 것,
II) 필요한 경우, 원하는 pH 범위, 예를 들어 6.5-9.5의 범위인 pH를 얻기 위한 pH 조정
III) 임의로, 원하는 압력 범위, 예를 들어 20-4000bar, 예컨대 예를 들어 100-4000bar 또는 20-200bar의 범위인 압력을 얻기 위한 가압
IV) 임의로, 원하는 온도 범위, 예를 들어 0-160℃, 예컨대 예를 들어 0-65℃ 또는 66-160℃의 범위인 온도로 온도의 조정.
산화 유청 단백질 용액을 액체 형태로 유지하기 위해 그리고 산화 유청 단백질 용액의 온도가 예를 들어 10℃를 초과하는 경우에 용액이 끓거나 증발하는 것을 피하기 위해 가압될 수 있는 것이 종종 바람직하다.
단계 a)에서, 원하는 특성을 갖는 산화 유청 단백질 용액을 얻는 한 가공 단계 I, II, III, IV에 대한 순서는 덜 중요하다.
가공 단계 II)의 pH 조정은 바람직하게는 가공 단계 I) 이전에 또는 공정 단계 I) 동안 수행된다. 대안적으로, 가공 단계 II)의 pH 조정은 가공 단계 I) 후에 수행될 수 있다. 그러나, 단계 a)에서는 유청 단백질 공급원과 산화제가 접촉하지만 pH와 온도 및/또는 압력이 원하는 범위를 벗어나는 기간을 최소화하는 것이 종종 바람직하다.
가공 단계 III)은 바람직하게는, 가공 단계 I) 후에 수행된다.
가공 단계 IV)는 바람직하게는 가공 단계 I) 이전에, 가공 단계 I) 동안 또는 가공 단계 I) 후에 수행된다.
바람직하게는, 단계 a) 동안 유청 단백질 공급원 및 유청 단백질 공급원을 함유하는 임의의 중간 혼합물은 65℃보다 높은 온도를 갖지 않고 가장 바람직하게는 55℃보다 높지 않다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "유청 단백질 공급원"은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액을 제조하는데 사용되는 유청 단백질 조성물(들)에 관한 것이다. 유청 단백질 공급원은 단일 유청 단백질 조성물, 예를 들어 유청 단백질 분말 또는 수성 유청 단백질 액체일 수 있거나, 또는 여러 하위-공급원, 예를 들어 여러 유청 단백질 분말 및/또는 여러 수성 유청 단백질 액체의 조합일 수 있다. 여러 하위-공급원이 사용되는 경우, 이들은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 제조 이전에 조합되어 단일 조성물을 형성할 수 있거나, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 제조 동안 개별적으로 첨가될 수 있다. 여러 하위-공급원이 사용되는 경우, 용어 "유청 단백질 공급원"은 사용된 하위-공급원의 조합의 특징을 기술한다.
유청 단백질 공급원은 분말 또는 액체일 수 있다. 분말 형태로 제공되는 경우, 유청 단백질 공급원 분말을 물에 재구성하고 추가 가공을 수행하기 전에 적어도 0.5시간 동안 수화시키는 것이 바람직하다.
유청 단백질 공급원은 바람직하게는 유청 단백질 농축물(WPC), 유청 단백질 단리물(WPI) 또는 이의 조합이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "유청 단백질 농축물"(WPC)은 총 고형물에 대해 20-89% w/w의 단백질 총량을 함유하는 건조 또는 수성 조성물에 관한 것이다.
WPC는 바람직하게는:
총 고형물에 대해 단백질 30-85% w/w,
총 단백질에 대해 BLG 15-90%,
총 단백질에 대해 ALA 4-50% w/w, 및
단백질에 대해 CMP 0-40% w/w를 함유한다.
가장 바람직하게는 WPC는:
총 고형물에 대해 단백질 70-85%,
총 단백질에 대해 BLG 30-90%,
총 단백질에 대해 ALA 4-35% w/w, 및
단백질에 대해 CMP 0-25% w/w를 함유한다.
유장 단백질을 기반으로 한 WPC는 전형적으로 CMP를 함유하지 않거나 단지 미량의 CMP만 함유한다.
용어 "유청 단백질 단리물"(WPI)은 총 고형물에 대해 86-100% w/w의 단백질 총량을 함유하는 건조 또는 수성 조성물에 관한 것이다.
WPI는 바람직하게는:
총 고형물에 대해 단백질 86-99%,
총 단백질에 대해 BLG 30-100%,
총 단백질에 대해 ALA 0-35% w/w, 및
총 단백질에 대해 CMP 0-25% w/w를 함유한다.
가장 바람직하게는 WPI는:
총 고형물에 대해 단백질 90-99%,
총 단백질에 대해 BLG 50-99%,
총 단백질에 대해 ALA 0-35% w/w, 및
총 단백질에 대해 CMP 0-25% w/w를 함유한다.
유장 단백질을 기반으로 한 WPI는 전형적으로 CMP를 함유하지 않거나 단지 미량의 CMP만 함유한다.
유청 단백질 공급원이 WPI인 것이 특히 바람직하다.
단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 단백질 조성물, 지방 조성물, 탄수화물 조성물 및 미네랄 조성물과 관련하여 기술된 특성 및 선호도는 유청 단백질 공급원에도 동일하게 적용된다.
유청 단백질 공급원은 바람직하게는 최대 30%, 보다 바람직하게는 최대 25%, 보다 더 바람직하게는 최대 20%, 가장 바람직하게는 최대 15%의 단백질 변성의 정도를 갖는다.
훨씬 더 낮은 단백질 변성의 정도가 종종 바람직하고, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서 유청 단백질 공급원은 최대 12%, 더 바람직하게는 최대 10%, 보다 더 바람직하게는 최대 8%, 가장 바람직하게는 최대 5%의 단백질 변성의 정도를 갖는다.
단계 b)에서, 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 인큐베이션된다.
"하나 이상의 조건"은 특정 온도 조건 및/또는 특정 압력 조건 하를 의미한다.
발명자들은 본 문맥에서 "부분적 산화"로 지칭되는 유리 티올 기의 단지 일부의 산화 조차도 방법이 단계 c)의 열처리를 포함하는 경우 충분할 수 있음을 발견했으며, 이는 산화된 티올 기가 단계 c) 동안 비산화된 유리 티올 기와 반응하여 안정한 분자간 이황화 결합을 형성한다는 증거를 보여주었다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 80%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 76%, 보다 더 바람직하게는 최대 73%, 가장 바람직하게는 최대 70%까지 감소시거나, 감소시키기 위해 수행된다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 20-80%, 보다 바람직하게는 초기 양의 30-80%, 보다 더 바람직하게는 50-75%, 가장 바람직하게는 60-75%로 감소시키거나, 감소시키기 위해 수행된다. 이들 범위는 방법에 c) 단계가 포함된 경우 종종 바람직하다.
단계 c)를 갖거나 갖지 않는 둘 모두와 관련하여 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 30%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 25%, 보다 더 바람직하게는 최대 20%, 가장 바람직하게는 최대 15%까지 감소시키거나, 감소시키기 위해 수행된다.
바람직하게는, 단계 c)를 갖거나 갖지 않는 둘 모두와 관련하여, 단계 b)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 10%, 보다 바람직하게 초기 양의 최대 5%, 보다 더 바람직하게는 최대 3%, 가장 바람직하게는 최대 1%까지 감소시키거나, 감소시키기 위해 수행된다.
유리 티올의 적은 잔여 양이 종종 허용될 수 있고, 더욱이 바람직할 수도 있어 유청 단백질 용액의 다른 구성요소가 불필요한 산화적 손상을 받지 않도록 한다. 바람직하게는, 단계 b)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 0.01-30%, 보다 바람직하게는 초기 양의 0.02-25%, 보다 더 바람직하게는 0.05-20%, 가장 바람직하게는 0.1-10%로 감소시키거나, 감소시키기 위해 수행된다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 15 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 14 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 13 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 12 마이크로몰/g 단백질로 감소시키거나, 감소시키기에 충분한 기간 동안 수행된다.
바람직하게는, 단계 b)는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 0.001-15 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 0.01-14 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.01-13 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 0.01-12 마이크로몰/g 단백질로 감소시키거나, 감소시키기에 충분한 기간 동안 수행된다.
더 낮은 수준이 종종 바람직하고, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서 단계 b)는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 더 바람직하게는 최대 8 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 2 마이크로몰/g 단백질까지 감소시키거나, 감소시키기에 충분한 기간 동안 수행된다.
바람직하게는, 단계 b)는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 0.001-10 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 0.01-8 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.01-5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.01-3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 0.01-2 마이크로몰/g 단백질로 감소시키거나, 감소시키기에 충분한 기간 동안 수행된다.
훨씬 더 낮은 수준의 유리 티올 기가 바람직할 수 있고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서 단계 b)는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 1 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 0.5 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 0.2 마이크로몰/g 단백질로 감소시키거나, 감소시키기에 충분한 기간 동안 수행된다.
발명자들은 단계 b)의 산화가 유청 단백질 용액의 pH에서 약간의 감소를 야기하는 것을 관찰했고, 단계 b) 동안 pH를 조정하여 원하는 pH 간격으로 유지하는 것이 종종 유리하다는 것을 발견했다. 특히, 산화제와 티올 기 사이의 더 높은 비율이 사용되는 경우 그렇다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 산화 동안 pH를 6.5-9.5, 더 바람직하게는 7.0-8.5, 보다 더 바람직하게는 7.2-8.5, 가장 바람직하게는 7.5-8.5의 범위인 pH로 조정하는 것을 포함한다.
발명자들은 pH 7.0-8.5, 보다 더 바람직하게는 7.2-8.5, 가장 바람직하게는 7.5-8.5 범위에서 산화를 수행하는 것은, 예를 들어 메티오닌과 트립토판과 같은 유청 단백질 용액 내의 다른 산화 표적에 대해 유리 티올 기의 선택적 산화를 일어킨다는 것을 발견했다.
바람직하게는, 단계 b)는 산화 동안 pH를 7.5-9.5, 더 바람직하게는 7.6-8.5, 보다 더 바람직하게는 7.7-8.4, 가장 바람직하게는 7.7-8.3의 범위인 pH로 조정하는 것을 포함한다.
단계 b)의 pH 조정은 예를 들어 하나 이상의 별개의 pH 조정, 또는 더 바람직하게는, 예를 들어 pH 자동 온도 조절 장치를 사용한 연속적인 pH 제어를 포함한다. pH 조정은 바람직하게는 하나 이상의 식품에 허용가능한 산 및/또는 염기를 활용한다.
발명자들은 특히 바람직하지 않은 산화 반응을 피하기 위해 단계 b) 동안 소비되는 산화제의 양을 제한하는 것이 유익하다는 것을 발견했다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서:
- 단계 b)의 종료 시 임의의 과잉 산화제의 제거를 제외하지만, 단계 b) 동안 소비된 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 양과
- 단계 a)에서 유리 티올 기의 초기 양 사이의 몰비는 1:2-30:1, 더 바람직하게는 1:2-25:1, 보다 더 바람직하게는 1:2-20:1, 가장 바람직하게는 1:1-15:1이다.
- 단계 b)의 종료 시 임의의 과잉 산화제의 제거를 제외하지만, 단계 b) 동안 소비된 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 양과
- 단계 a)에서 유리 티올 기의 초기 양 사이의 몰비는 2:1-30:1, 더 바람직하게는 3:1-25:1, 보다 더 바람직하게는 4:1-20:1, 가장 바람직하게는 5:1-15:1인 것이 종종 바람직하다.
놀랍게도, 발명자들은 단계 c)의 열처리와 조합된 유리 티올 기의 부분적 산화 조차도 유리 티올 기 함량이 매우 낮은 산화된 유청 단백질 조성물을 생성한다는 것을 발견하였다. 따라서, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서:
- 단계 b)의 종료 시 임의의 과잉 산화제의 제거를 제외하지만, 단계 b) 동안 소비된 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 양과
- 단계 a)에서 유리 티올 기의 초기 양 사이의 몰비는 1:4-15:1, 더 바람직하게는 1:3-10:1, 보다 더 바람직하게는 1:2-5:1, 가장 바람직하게는 1:2-2:1이다.
바람직하게는, 단계 b) 및 그와 같은 발명의 방법은 아황산염의 첨가를 포함하지 않고 아황산용리를 포함하지 않는다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 하나 이상의 조건은 I) 5-65℃, 보다 바람직하게는 10-65℃, 보다 더 바람직하게는 30-60℃, 가장 바람직하게는 40-60℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함한다.
단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 온도의 온도 범위는 바람직하게는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 온도의 온도 범위와 동일하다. 그러나, 발명자들은 또한 예를 들어 단계 a)가 상대적으로 낮은 온도를 제공하는 경우 단계 b) 동안 온도를 증가시키는 것이 유익할 수 있다는 것을 발견했고 단계 b)는 여러 가지 다른 온도 스테이지를 함유할 수 있다는 것을 발견했다.
발명자들은 pH 6.5에 가까운 가장 낮은 pH 범위가 더 높은 pH 범위보다 효율적인 산화를 위해 더 높은 온도를 필요로 한다는 것을 발견했다.
발명의 일부 실시형태에서, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 pH는 6.5-7.0 범위에 있고 그 온도는 40-65℃, 보다 바람직하게는 45-65℃, 보다 더 바람직하게는 50-65℃, 가장 바람직하게는 55-65℃의 범위에 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 pH는 7.1-9.5 범위에 있고 그 온도는 5-65℃, 보다 바람직하게는 10-65℃, 보다 더 바람직하게는 30-60℃, 가장 바람직하게는 40-55℃의 범위에 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 pH는 8.5-9.5 범위에 있고 그 온도는 0-65℃, 보다 바람직하게는 0-50℃, 보다 더 바람직하게는 0-30℃, 가장 바람직하게는 5-25℃의 범위에 있다.
발명자들은 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 pH가 7.5-8.5 범위에 있고 그 온도가 5-60℃, 보다 바람직하게는 10-60℃, 보다 더 바람직하게는 15-60℃, 가장 바람직하게는 20-60℃의 범위에 있는 것이 특히 바람직하다는 것을 발견했다. 이들 범위는 BLG의 유리 티올의 선택적 산화와 상대적으로 빠른 반응 동역학 둘 모두에 유리한 것으로 보인다.
추가적으로, 발명자들은 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 pH가 7.7-8.5 범위에 있고 그 온도가 25-55℃, 보다 바람직하게는 30-55℃, 보다 더 바람직하게는 35-50℃, 가장 바람직하게는 35-45℃의 범위에 있는 것이 특히 바람직하다는 것을 발견했다. 이들 범위는 또한 BLG의 유리 티올의 선택적 산화와 상대적으로 빠른 반응 동역학 둘 모두에 유리한 것으로 보인다.
발명자들은 보다 더 높은 온도가 단계 b)에서 사용될 수 있다는 것을 발견했고 일부 페피에서 조건 I)은 66-160℃, 보다 바람직하게는 70-145℃, 보다 더 바람직하게는 75-120℃, 가장 바람직하게는 80-100℃의 범위인 온도를 갖는 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액을 포함한다.
추가적으로, 발명자들은 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 pH가 7.5-8.5, 보다 바람직하게는 7.7-8.5 범위에 있고 그 온도가 66-160℃, 더 바람직하게는 70-145℃, 보다 더 바람직하게는 75-120℃, 가장 바람직하게는 80-100℃의 범위에 있는 것이 특히 바람직하다는 것을 발견했다. 이들 범위는 또한 BLG의 유리 티올의 선택적 산화와 BLG의 상대적으로 빠른 반응 동역학 둘 모두에 유리한 것으로 보인다. 실시예 16에서 볼 수 있듯이, 이들 조합은 매우 빠른 단계 b) 및 몇 분 이내에 완료되는 산화 공정을 허용한다.
발명자들은 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액이 6.8-7.5의 범위인 pH를 갖는 것이 생산 관점에서 때때로 유리하다는 것을 발견했는데, 이는 산화 후 pH 조정에 대한 필요성을 감소시키기 때문이다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 온도는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 80%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 76%, 보다 더 바람직하게는 최대 73%, 가장 바람직하게는 최대 70%까지 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 이내로 유지된다.
상기에서 언급된 바와 같이, 유리 티올 기의 부분적 산화는 단계 c)의 열처리에 유리할 수 있고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 온도는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 20-80%, 더 바람직하게는 초기 양의 30-80%, 보다 더 바람직하게는 50-75%, 가장 바람직하게는 60-75%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 이내로 유지된다.
바람직하게는, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 온도는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 30%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 25%, 보다 더 바람직하게는 최대 20%, 가장 바람직하게는 최대 15%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 이내로 유지된다.
바람직하게는, 단계 b) 동안 온도는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 10%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 5%, 보다 더 바람직하게는 최대 3%, 가장 바람직하게는 최대 1%까지 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 이내로 유지된다.
바람직하게는, 단계 b) 동안 온도는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 0.01-30%, 보다 바람직하게는 초기 양의 0.02-25%, 보다 더 바람직하게는 0.05-20%, 가장 바람직하게는 0.1-10%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 이내로 유지된다.
바람직하게는, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 온도는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 15 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 14 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 13 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 12 마이크로몰/g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 이내로 유지된다.
종종, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 온도는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 0.001-15 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 0.01-14 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.01-13 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 0.01-12 마이크로몰/g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 이내로 유지된다.
바람직하게는, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 온도는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 8 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 2 마이크로몰/g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 이내로 유지된다.
바람직하게는, 단계 b)는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 0.001-10 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 0.01-8 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 0.01-5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.01-3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 0.01-2 마이크로몰/g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 이내로 유지된다.
휠씬 더 낮은 수준의 유리 티올 기가 바람직할 수 있고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 온도는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 1 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 0.5 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 0.2 마이크로몰/g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 이내로 유지된다.
단계 b)가 조건 I)을 사용하는 경우 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 100bar 미만이고, 전형적으로 0.1-100bar 범위, 보다 바람직하게는 1-80bar 범위에 있다.
단계 b)의 조건 I과 조건 II를 조합함에 의해 100bar 이상의 압력이 사용될 수 있다.
발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 산화 유청 단백질 용액이 20-4000bar, 더 바람직하게는 200-3500bar, 보다 더 바람직하게는 300-3000bar, 가장 바람직하게는 500-2500bar의 범위인 압력에 적용되는 조건 II)를 포함한다.
그러나, 발명의 더욱 바람직한 실시형태에서 조건 II)는 산화 유청 단백질 용액이 20-500bar; 보다 바람직하게는 30-300bar, 가장 바람직하게는 40-200bar의 범위인 압력에 적용되는 것을 포함한다.
단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 압력의 범위는 바람직하게는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 압력의 범위와 동일하다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 압력은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 80%, 더 바람직하게는 초기 양의 최대 76%, 보다 더 바람직하게는 최대 73%, 가장 바람직하게는 최대 70%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 압력 범위 이내로 유지된다.
상기에 언급된 바와 같이, 유리 티올 기의 부분적 산화는 단계 c)의 열처리에 유리할 수 있고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 압력은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 20-80%, 더 바람직하게는 초기 양의 30-80%, 보다 더 바람직하게는 50-75%, 가장 바람직하게는 60-75%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 압력 범위 이내로 유지된다.
바람직하게는, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 30%, 바람직하게는 초기 양의 최대 25%, 보다 더 바람직하게는 최대 20%, 가장 바람직하게는 최대 15%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 압력에 적용된다.
바람직하게는, 단계 b) 동안, 압력은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 10%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 5%, 보다 더 바람직하게는 최대 3%, 가장 바람직하게는 최대 1%까지 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 압력 범위 이내로 유지된다.
바람직하게는, 단계 b) 동안, 압력은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 0.01-30%, 보다 바람직하게는 초기 양의 0.02-25%, 보다 더 바람직하게는 0.05-20%, 가장 바람직하게는 0.1-10%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 압력 범위 이내로 유지된다.
바람직하게는, 그리고 단계 c)를 갖거나 갖지 않는 실시형태 둘 모두와 관련하여, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 압력은 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 15 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 14 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 13 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 12 마이크로몰/g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 압력 범위 이내로 유지된다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 압력은 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 0.001-15 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 0.001-14 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.001-13 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 0.001-12 마이크로몰/g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 압력 범위 이내로 유지된다.
바람직하게는, 그리고 단계 c)를 갖거나 갖지 않는 실시형태 둘 모두와 관련하여, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 압력은 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 8 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 2 마이크로몰/g g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 압력 범위 이내로 유지된다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 압력은 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 0.001-10 마이크로몰/g 단백질, 더 바람직하게는 0.01-8 마이크로몰/g 단백질, 더 바람직하게는 0.01-5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.01-3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 0.01-2 마이크로몰/g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 압력 범위 이내로 유지된다.
훨씬 더 낮은 수준의 유리 티올 기가 바람직할 수 있고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 압력은 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 1 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 0.5 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 0.2 마이크로몰/g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 압력 범위 이내로 유지된다.
조건 II가 단계 b)에서 사용되는 경우 온도는 전형적으로 0-65℃, 보다 바람직하게는 5-65℃, 보다 더 바람직하게는 20-60℃, 가장 바람직하게는 40-60℃의 범위 및 상태에 있다. 따라서 조건 II는 전형적으로 조건 I과 함께 사용되는 반면, 조건 I은 조건 II 없이 사용될 수 있다.
발명자들은 단계 b)가 또한 조건 II를 포함하는 경우 더 낮은 온도가 종종 충분하다는 것을 발견했다. 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 조건 II의 사용을 포함하며, 산화 유청 단백질 용액은 0-50℃, 더 바람직하게는 0-40℃, 보다 더 바람직하게는 0-30℃, 가장 바람직하게는 2-20℃의 범위인 온도를 갖는다.
그러나, 발명의 일부 실시형태에서, 단계 b)는 조건 II의 사용을 포함하며, 산화 유청 단백질 용액은 66-160℃, 더 바람직하게는 70-145℃, 보다 더 바람직하게는 75-120℃, 가장 바람직하게는 80-100℃의 범위인 온도를 갖는다.
발명자들은 단계 b) 동안 온도를 천천히 증가시키면 유청 단백질의 유리 티올 기가 효율적으로 산화될 수 있다는 징후를 확인했다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 단계 b) 동안 산화 유청 단백질 용액의 온도를 분당 최대 2℃, 더 바람직하게는 분당 최대 1℃, 보다 바람직하게는 분당 최대 0.3℃, 가장 바람직하게는 분당 최대 0.1℃의 가열 속도로 최대 산화 온도까지 증가시키는 것을 포함한다.
온도를 증가시키면서 단계 b)를 작동시키는 것은 단계 b)의 산화 유청 단백질이 6.5-7.5의 범위인 pH를 가질 때 특히 유용하다.
온도는 지속적으로 또는 단계적으로 증가될 수 있다.
pH는 분석 B에 따라 측정된다.
더욱이 발명자들은 특히 pH가 7.5-9.5, 보다 바람직하게는 7.7-8.5의 범위에 있는 경우 단계 b) 동안 온도를 휠씬 빠르게 증가시키는 것이 유리할 수 있음을 발견했다.
발명의 이들 바람직한 실시형태에서, 산화 유청 단백질 용액의 온도는 단계 b)가 시작될 때 0-65℃의 범위에 있고 단계 b) 동안 산화 유청 단백질 용액의 온도는 66-160℃, 보다 바람직하게는 70-145℃, 보다 더 바람직하게는 75-120℃, 가장 바람직하게는 80-100℃의 범위인 온도로 증가된다. 이 접근법의 이점은 실시예 16에 예시되어 있다.
상기에 언급된 첫 번째 접근법에 특히 유용한 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 단계 b) 동안 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 추가적인 산화제를 첨가하거나 생성하는 것을 포함하지 않는다.
이는 필요한 모든 산화제가 단계 a)에서 첨가됨을 의미한다.
상기에 언급된 두 번째 접근법에 특히 유용한 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 단계 b) 동안 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 추가적인 산화제를 첨가 및/또는 생성하는 것을 포함한다.
발명의 이러한 바람직한 실시형태에서:
- 단계 b) 동안 단백질 용액으로 산화에 존재하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 최대량과
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기량 사이의 몰비는 바람직하게는 최대 5:1, 더 바람직하게는 최대 2:1, 보다 더 바람직하게는 최대 1:1, 가장 바람직하게는 최대 1:2이다.
바람직하게는, 그리고 특히 두 번째 접근법과 관련하여:
- 단계 b) 동안 단백질 용액으로 산화에 존재하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 최대량과
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기량 사이의 몰비는 최대 1:5, 더 바람직하게는 최대 1:10, 보다 더 바람직하게는 최대 1:20, 가장 바람직하게는 최대 1:50이다.
바람직하게는, 그리고 특히 두 번째 접근법과 관련하여:
- 단계 b) 동안 단백질 용액으로 산화에 존재하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 최대량과
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기량 사이의 몰비는 1:1000-1:1, 더 바람직하게는 1:100-1:2, 보다 더 바람직하게는 1:70-1:5, 가장 바람직하게는 1:60-1:15이다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 기간은 최대 48시간, 보다 바람직하게는 최대 36시간, 보다 더 바람직하게는 최대 30시간, 가장 바람직하게는 최대 25시간이다.
바람직하게는, 단계 b)의 기간은 0.1-48시간, 더 바람직하게는 3-36시간, 보다 더 바람직하게는 5-30시간, 가장 바람직하게는 10-25시간이다.
훨씬 더 빠른 산화 단계가 가능하고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 기간은 최대 12시간, 더 바람직하게는 최대 6시간, 보다 더 바람직하게는 최대 3시간, 가장 바람직하게는 최대 1시간이다.
바람직하게는, 단계 b)의 기간은 0.1-12시간, 보다 바람직하게는 0.1-6시간, 보다 더 바람직하게는 0.1-3시간, 가장 바람직하게는 0.1-1시간이다.
유리 티올의 빠른 환원은 예를 들어 방법을 연속 공정으로 구현하고/하거나 단계 a) 및 b)의 매개변수를 선택하여 최적의 조건에 가깝게 함에 의해 달성된다.
발명자들은 단계 b)를 30분 이하로 수행하는 것도 가능하다는 것을 발견했다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 기간은 최대 40분, 보다 바람직하게는 최대 30분, 보다 더 바람직하게는 최대 20분, 가장 바람직하게는 최대 10분이다.
훨씬 더 빠른 산화 단계가 가능하고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)의 기간은 최대 10분, 보다 바람직하게는 최대 8분, 보다 더 바람직하게는 최대 4분, 가장 바람직하게는 최대 2분이다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화 유청 단백질 용액은 단계 b) 동안 65℃보다 높은 온도를 갖지 않고, 보다 바람직하게는 60℃보다 높지 않다.
그러나, 상기에 언급된 바와 같이 그리고 실시예 16에 나타낸 바와 같이 발명자들은 특히 산화의 조건과 산화제의 투여량이 제어되는 경우 더 높은 온도가 사용될 수도 있다는 것을 발견했다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제 모두가 실질적으로 소모될 때까지 산화가 진행되도록 하는 것을 포함한다.
발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 단계 b)는 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액을, 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 잔류 산화제를 제거하는 구성요소, 예를 들어 효소, 촉매제 또는 반응물과 접촉시킴에 의해 산화를 중단시키는 것을 포함한다.
적합한 효소에는 과산화물을 분해할 수 있는 카탈라아제가 포함된다.
적합한 반응물에는 항산화제가 포함된다.
발명의 추가 실시형태에서, 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액은 단계 b)의 종단에서 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 일부 산화제를 여전히 함유한다. 그러나, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액의 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 함량을 매우 낮게 유지하는 것이 종종 바람직하다.
바람직하게는,
- 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액의 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 양과
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기량 사이의 몰비는 최대 1:50, 보다 바람직하게는 최대 1:100, 가장 바람직하게는 최대 1:200이다.
훨씬 더 바람직하게는,
- 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액의 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 양과
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기량 사이의 몰비는 최대 1:500, 보다 바람직하게는 최대 1:1000, 가장 바람직하게는 최대 1:2000이다.
가장 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액은 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 검출가능한 수준으로 함유하지 않는다.
시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제가 주로 과산화물을 포함하는 경우, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청단백질 용액에서 과산화물의 함량이 낮은 것이 바람직하다.
바람직하게는,
- 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액의 과산화물의 양과
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기량 사이의 몰비는 최대 1:50, 보다 바람직하게는 최대 1:100, 가장 바람직하게는 최대 1:200이다.
훨씬 더 바람직하게는,
- 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액의 과산화물의 양과
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기량 사이의 몰비는 최대 1:500, 보다 바람직하게는 최대 1:1000, 가장 바람직하게는 최대 1:2000이다.
가장 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액은 검출가능한 수준의 과산화물을 함유하지 않는다.
시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제가 주로 과산화수소를 포함하는 경우, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액에서 과산화수소의 함량이 낮은 것이 바람직하다.
바람직하게는,
- 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액의 과산화수소의 양과
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기량 사이의 몰비는 최대 1:50, 보다 바람직하게는 최대 1:100, 가장 바람직하게는 최대 1:200이다.
훨씬 더 바람직하게는,
- 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액의 과산화수소의 양과
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기량 사이의 몰비는 최대 1:500, 보다 바람직하게는 최대 1:1000, 가장 바람직하게는 최대 1:2000이다.
가장 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액은 검출가능한 수준의 과산화수소를 함유하지 않는다.
단계 b)는 바람직하게는 효율적인 산화를 촉진하는 하나 이상의 조건 하에서 단일 인큐베이션 단계로 실행되지만 또한, 예를 들어 인큐베이션 단계가 예를 들어 추가된 산화제가 소모되는 경우 중단되고 추가 산화제를 추가되는 경우 다시 시작되는, 하나 이상의 조건 하에서 일련의 인큐베이션 단계로 실행될 수도 있다.
단계 c)는 발명의 일부 실시형태가 단계 c)의 열처리를 포함하지 않는다는 점에서 임의적이다. 그러나, 단계 c)는 또한 바람직하고 발명의 바람직한 방법은 종종 단계 c)를 함유한다.
따라서, 방법은 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을, 바람직하게는, 냉각에 이어서 열처리 단계에 적용시키는 것을 포함하는 것 c)도 포함하는 것이 종종 바람직하다. 단계 c)의 열처리는 예를 들어 효소가 예를 들어 산화제를 생성하고/하거나 잔류 산화제를 제거하기 위해 미리 첨가된 경우 바람직하다.
열처리는 그 다음 효소(들)를 비활성화하는 목적으로 작용할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 열처리는 잔류 산화제를 소모시킬 수 있다.
단계 c)의 열처리는 더욱이 단계 b)가 유리 티올 기의 부분적 산화만을 얻기 위해 수행되었을 때 바람직하며 이는 단계 b)가 단지 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 함량을 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양의 20-80%까지 감소시켰음을 의미한다.
발명자들은 부분적으로 산화된 유청 단백질 용액의 후속 열처리가 유리 티올 기의 함량을 더욱 감소시킨다는 것을 발견했다. 따라서 부분적 산화 접근법은 유리 티올 기의 초기 함량에 대해 산화제를 덜 첨가해야 하므로 유청 단백질의 산화적 손상 위험을 감소시킨다.
단계 c)의 열처리는 바람직하게는 단계 b)로부터 얻어진 산화된 유청 단백질 용액을 60-160℃, 보다 바람직하게는 65-95℃, 보다 더 바람직하게는 70-95℃, 가장 바람직하게는 80-90℃의 온도로 5초-20분 동안 가열하는 것을 포함한다.
단계 b)의 산화가 효소, 예컨대 예를 들어 카탈라아제의 첨가에 의해 종료되는 경우, 열처리는 바람직하게는 70-160℃, 가장 바람직하게는 80-150℃의 범위인 온도를 사용하여 효소를 불활성화하기에 충분한 기간 동안 바람직하게 수행된다.
발명자들은 열멸균이 단계 c)로서 유용할 수 있으며, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서 단계 c)는 단계 b)의 산화된 유청 단백질 용액을 적어도 100℃의 온도로 멸균을 얻기에 충분한 기간 동안 가열하는 것을 포함한다는 것을 발견했다. 바람직하게는, 이 열처리는 단계 b)의 산화된 유청 단백질 용액을 0.1-10초의 기간 동안 140-160도의 범위인 온도로 가열하는 것을 포함한다.
산화된 유청 단백질 용액이 차후에 그 자체로 음료로서 사용될 때 단계 c)는 열멸균을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 이러한 실시형태에서 멸균 산화된 유청 단백질 용액은 바람직하게는 무균 충전에 의해 적합한 용기 안으로 충전되어 멸균 산화된 유청 단백질 용액으로 구성된 포장된 멸균 음료를 제공한다.
발명의 다른 실시형태에서, 단계 c)의 열처리는 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을 1초-1시간 동안 60-100℃, 보다 바람직하게는 2초-50분 동안 65-95℃, 보다 바람직하게는 2초-40분 동안 70-95℃, 가장 바람직하게는 5초-20분 동안 80-90℃의 온도로 가열하는 것을 포함한다.
단계 d)는 발명의 일부 실시형태가 건조 단계를 포함하지 않는다는 점에서 임의적이다. 그러나, 바람직한 실시형태는 종종 그렇다.
따라서, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 방법은 더욱이 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조하는 단계 d)를 추가로 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질"은 액체 공급물의 단백질이 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액의 단백질이거나 대안적으로는 방법이 단계 c)를 포함하는 경우 단계 c)의 열처리로부터 생성된 단백질이다는 것을 의미한다.
바람직하게는, 건조용 액체 공급물은 다음을 포함하거나 심지어는 이로 이루어진다:
- 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물, 또는
- 단계 c)로부터 얻은 열처리된 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물.
본 발명의 맥락에서, 첫 번째 액체의 "단백질 농축물"은 적어도 단백질이 첫 번째 액체에서 유래하지만 첫 번째 액체보다 전체 고형물에 대해 더 높은 단백질 함량을 갖는 두 번째 액체이다. 바람직하게는, 단백질 농축물의 실질적으로 모든 고형물은 제1 액체로부터 유래된다. 제1 액체의 "단백질 농축물"은 바람직하게는 한외여과, 나노여과, 역삼투 및/또는 증발에 의해 제조된다. 예를 들어 단백질 농축 한외여과 및/또는 나노여과가 작은 비-단백질 고형물의 일부를 씻어내기 위해 정용여과와 함께 구현될 수 있다. "단백질 농축물"은 동일한 단백질 종을 함유하고, 바람직하게는 제1 액체와 총 단백질에 대한 유청 단백질 종의 동일한 중량 백분율을 갖는다. 단백질 농축물의 제공은 또한 하나 이상의 pH 조정을 포함할 수도 있다.
단계 d)의 액체 공급물의 제조는 더욱이 바람직하게는 액체 공급물에 6.0-8.0, 더 바람직하게는 6.5-7.7, 보다 더 바람직하게는 6.7-7.5, 가장 바람직하게는 6.8-7.3의 범위인 pH를 제공하기 위해 pH 조정을 포함할 수 있다.
따라서, 액체 공급물은 바람직하게는 6.0-8.0, 더 바람직하게는 6.5-7.7, 보다 더 바람직하게는 6.7-7.5, 가장 바람직하게는 6.8-7.3의 범위인 pH를 갖는다.
단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질은 바람직하게는 액체 공급물의 총 단백질의 적어도 50% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 70% w/w, 보다 더 바람직하게는 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w를 차지한다.
액체 공급물은 바람직하게는 단계 b)의 산화된 유청 단백질 용액 또는 단계 c)로부터 얻은 열처리된 산화된 유청 단백질 용액의 단백질 농축물이다. 액체 공급물은 생산된 직후 건조를 거칠 수 있다. 대안적으로 건조될 때까지 저장 탱크에 보관했다.
단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질이 액체 공급물의 유일한 단백질인 것이 특히 바람직하다.
단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 고형물은 바람직하게는 액체 공급물의 고형물의 적어도 50% w/w, 더 바람직하게는 적어도 70% w/w, 보다 더 바람직하게는 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w를 차지한다.
단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 고형물이, 가능하기로는 pH 조정 동안 첨가된 미네랄의 예외로, 액체 공급물의 유일한 단백질인 것이 특히 바람직하다.
건조용 액체 공급물은 바람직하게는 8-22% w/w, 보다 바람직하게는 10-18% w/w의 범위인 단백질 함량을 갖는다.
건조용 액체 공급물은 바람직하게는 8-50% w/w, 보다 바람직하게는 10-25% w/w의 범위인 고형물 함량을 갖는다.
단계 d)의 건조는 바람직하게는 액체 공급물을 분말로 전환시킨다.
단계 d)의 건조는 바람직하게는 분무 건조를 포함한다.
더욱이, 방법은 전형적으로 단계 d)로부터 얻은 건조된 생성물, 전형적으로 분말을 포장하는 단계를 함유한다.
방법에 의해 얻은 산화된 유청 단백질 조성물은 방법의 최종 생성물이고, 바람직하게는 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액, 단계 c)로부터 얻은 열처리된 산화된 유청 단백질 용액, 또는 단계 d)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 분말이다.
발명의 방법은 배치 방법, 반-배치 방법 및 연속 방법으로 구현될 수 있다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서 방법은 연속적인 방법으로 구현된다. 적어도 단계 a) 및 b), 또는 단계 a), b) 및 c)가 연속 방법으로 수행되는 것이 특히 바람직하다.
단계 b)의 기간이 상대적으로 짧은, 예를 들어 최대 2시간, 더 바람직하게는 최대 1시간, 보다 더 바람직하게는 최대 30분, 보다 더 바람직하게는 최대 20분, 가장 바람직하게는 최대 10분인 연속적인 구현이 발명의 실시형태에 대해 종종 바람직하다.
발명의 다른 바람직한 실시형태에서 방법은 반-배치 방법으로 구현된다.
방법의 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로서, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 20-65℃, 가장 바람직하게는 30-65℃의 범위인 온도를 갖고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 상기 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 20-65℃, 가장 바람직하게는 30-60℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 산화 유청 단백질 용액의 pH를 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위에 있도록 조정하는 것,
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 30-80%, 가장 바람직하게는 초기 양의 50-75%로 감소시키기 위해 단계 b)를 작동시키는 것,
- 단계 b) 동안 추가적인 산화제가 첨가되지 않음,
- 카탈라아제의 첨가에 의해 단계 b)의 산화를 종료시킴,
c) 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을 카탈라아제를 비활성화하기에 충분한 기간 동안 적어도 75℃, 가장 바람직하게는 카탈라아제를 비활성화하기에 충분한 기간 동안 80-95℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 단계 b)의 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조시키는 것으로서, 여기서:
- 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질은 바람직하게는 액체 공급물의 단백질의 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w를 차지하고,
- 액체 공급물은 8-22% w/w, 가장 바람직하게는 10-18% w/w의 범위인 단백질 함량을 가지고
- 6.7-7.5, 가장 바람직하게는 6.8-7.3의 범위인 pH를 갖는 액체 공급물이고,
여기서 건조는 분무 건조를 포함하는 것.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
건조하는 대신, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 직접적으로 충전될 수 있다. 대안적으로, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물이 아직 멸균되지 않은 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이 열멸균을 거칠 수 있다.
방법의 또 다른 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 20-65℃, 가장 바람직하게는 30-65℃의 범위인 온도를 갖고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 상기 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 20-65℃, 가장 바람직하게는 30-60℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서:
- 단계 b) 동안 소비되지만 단계 b)의 종료 시 제거된 임의의 과잉 산화제는 제거시킨, 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 양과,
- 단계 a)에서 유리 티올 기의 초기 양 사이의 몰비는 4:1-20:1, 가장 바람직하게는 5:1-15:1이고
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 산화 유청 단백질 용액의 pH를 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위에 있도록 조정하는 것,
- 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것,
- 단계 b) 동안 추가적인 산화제가 첨가되지 않음,
- 카탈라아제의 첨가에 의해 단계 b)의 산화를 종료시킴,
c) 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을 카탈라아제를 비활성화하기에 충분한 기간 동안 적어도 75℃, 가장 바람직하게는 카탈라아제를 비활성화하기에 충분한 기간 동안 80-95℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 단계 b)의 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조시키는 것으로서, 여기서:
- 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질은 바람직하게는 액체 공급물의 단백질의 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w를 차지하고,
- 액체 공급물은 8-22% w/w, 가장 바람직하게는 10-18%/w의 범위인 단백질 함량을 가지고
- 6.7-7.5, 가장 바람직하게는 6.8-7.3의 범위인 pH를 갖는 액체 공급물이고,
여기서 건조는 분무 건조를 포함하는 것.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
건조하는 대신, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 직접적으로 충전될 수 있다. 대안적으로, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물이 아직 멸균되지 않은 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이 열멸균을 거칠 수 있다.
방법의 더욱 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-65℃, 가장 바람직하게는 30-65℃의 범위인 온도를 갖는 단계,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 20-65℃, 가장 바람직하게는 30-60℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서:
- 단계 b)의 종료 시 임의의 과잉 산화제의 제거를 제외하지만 단계 b) 동안 소비된 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 양과,
- 단계 a)에서 유리 티올 기의 초기 양 사이의 몰비는 1:1-10:1, 가장 바람직하게는 1:1-5:1이고
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것,
- 카탈라아제의 첨가에 의해 단계 b)의 산화를 종료시킴,
c) 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을 카탈라아제를 비활성화하기에 충분한 시간 동안 적어도 75℃, 가장 바람직하게는 카탈라아제를 비활성화하기에 충분한 기간 동안 80-95℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 바람직하게는, 단계 b)의 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조시키는 것으로서, 여기서 건조는 분무 건조를 포함하는 것.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
건조하는 대신, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 직접적으로 충전될 수 있다. 대안적으로, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물이 아직 멸균되지 않은 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이 열멸균을 거칠 수 있다.
방법의 더욱 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-65℃, 가장 바람직하게는 30-65℃의 범위인 온도를 가지고,
그리고 여기서:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 2:1-30:1, 가장 바람직하게는 4:1-15:1인 것,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 20-65℃, 가장 바람직하게는 30-60℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것, 및
- 카탈라아제의 첨가에 의해 단계 b)의 산화를 종료시키는 것,
c) 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을 카탈라아제를 비활성화하기에 충분한 시간 동안 적어도 75℃, 가장 바람직하게는 카탈라아제를 비활성화하기에 충분한 기간 동안 80-95℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 바람직하게는, 단계 b)의 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조시키는 것으로서, 여기서 건조는 분무 건조를 포함하는 것.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
건조하는 대신, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 직접적으로 충전될 수 있다. 대안적으로, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물이 아직 멸균되지 않은 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이 열멸균을 거칠 수 있다.
방법의 여전히 또 다른 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-65℃, 가장 바람직하게는 30-65℃의 범위인 온도를 가지고,
그리고 여기서:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 2:1-30:1, 가장 바람직하게는 4:1-15:1인, 단계,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 20-65℃, 가장 바람직하게는 30-60℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것, 및
d) 바람직하게는, 단계 b)의 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조시키는 것으로서, 여기서 건조는 분무 건조를 포함하는 것.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
건조하는 대신, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 직접적으로 충전될 수 있다. 대안적으로, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물이 아직 멸균되지 않은 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이 열멸균을 거칠 수 있다.
방법의 또 다른 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:1.5-10:1, 보다 바람직하게는 1:1-8:1, 가장 바람직하게는 1:1-3:1이고,
- 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-65℃, 가장 바람직하게는 30-65℃의 범위인 온도를 가지고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 20-65℃, 가장 바람직하게는 30-60℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 초기 양의 30-80%, 가장 바람직하게는 초기 양의 50-75%로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것,
- 임의로, 카탈라제의 첨가에 의해 단계 b)의 산화를 종료하는 것,
c) 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을 70-95℃의 온도로 2초-40분 동안 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 바람직하게는, 단계 b)의 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조시키는 것으로서, 여기서 건조는 분무 건조를 포함하는 것.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
건조하는 대신, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 직접적으로 충전될 수 있다. 대안적으로, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물이 아직 멸균되지 않은 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이 열멸균을 거칠 수 있다.
방법의 여전히 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:1.5-10:1, 보다 바람직하게는 1:1.5-8:1, 가장 바람직하게는 1:1.5-3:1이고,
- 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-65℃, 가장 바람직하게는 30-65℃의 범위인 온도를 가지고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 20-65℃, 가장 바람직하게는 30-60℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 30-80%, 가장 바람직하게는 초기 양의 50-75%로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것,
- 임의로, 카탈라제의 첨가에 의해 단계 b)의 산화를 종료하는 것,
c) 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을 70-95℃의 온도로 2초-40분 동안 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 바람직하게는, 단계 b의 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조시키는 것으로서, 여기서 건조는 분무 건조를 포함하는 것.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
건조하는 대신, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 직접적으로 충전될 수 있다. 대안적으로, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물이 아직 멸균되지 않은 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이 열멸균을 거칠 수 있다.
방법의 여전히 또 다른 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:1.5-10:1, 보다 바람직하게는 1:1-8:1, 가장 바람직하게는 1:1-3:1이고,
- 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-65℃, 가장 바람직하게는 30-65℃의 범위인 온도를 가지고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 20-65℃, 가장 바람직하게는 30-60℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 30-80%, 가장 바람직하게는 초기 양의 50-75%로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것,
- 임의로, 카탈라제의 첨가에 의해 단계 b)의 산화를 종료하는 것,
c) 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 70-95℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 바람직하게는, 단계 b의 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조시키는 것으로서, 여기서 건조는 분무 건조를 포함하는 것.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
건조하는 대신, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 직접적으로 충전될 수 있다. 대안적으로, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물이 아직 멸균되지 않은 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이 열멸균을 거칠 수 있다.
방법의 더욱 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:1.5-10:1, 보다 바람직하게는 1:1.5-8:1, 가장 바람직하게는 1:1.5-3:1이고,
- 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-65℃, 가장 바람직하게는 30-65℃의 범위인 온도를 가지고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 20-65℃, 가장 바람직하게는 30-60℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 30-80%, 가장 바람직하게는 초기 양의 50-75%로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것,
- 임의로, 카탈라제의 첨가에 의해 단계 b)의 산화를 종료하는 것,
c) 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질로 감소시키기에 충분한 기간 동안 70-95℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 바람직하게는, 단계 b의 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조시키는 것으로서, 여기서 건조는 분무 건조를 포함하는 것.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
건조하는 대신, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 직접적으로 충전될 수 있다. 대안적으로, 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물이 아직 멸균되지 않은 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이 열멸균을 거칠 수 있다.
방법의 더욱 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:1.5-10:1, 보다 바람직하게는 1:1-8:1, 가장 바람직하게는 1:1-3:1이고,
- 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-160℃, 가장 바람직하게는 0-65℃의 범위인 온도를 가지고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 70-160℃, 가장 바람직하게는 75-100℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것,
- 바람직하게는, 여기서 단계 b)의 기간은 최대 1시간, 가장 바람직하게는 최대 10분임,
d) 바람직하게는, 단계 b)의 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조시키는 것으로서, 여기서 건조는 분무 건조를 포함하는 것.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
건조하는 대신, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 직접적으로 충전될 수 있다. 대안적으로, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물이 아직 멸균되지 않은 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이 열멸균을 거칠 수 있다.
방법의 또 다른 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:1.5-10:1, 보다 바람직하게는 1:1.5-8:1, 가장 바람직하게는 1:1.5-3:1이고,
- 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-160℃, 가장 바람직하게는 0-65℃의 범위인 온도를 가지고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 70-160℃, 가장 바람직하게는 75-100℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것,
- 바람직하게는, 여기서 단계 b)의 기간은 최대 1시간, 가장 바람직하게는 최대 10분임,
d) 바람직하게는, 단계 b)의 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물을 건조시키는 것으로서, 여기서 건조는 분무 건조를 포함하는 것.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
건조하는 대신, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 직접적으로 충전될 수 있다. 대안적으로, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물이 아직 멸균되지 않은 경우, 본 명세서에 기술된 바와 같이 열멸균을 거칠 수 있다.
방법의 더욱 더 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:1.5-10:1, 보다 바람직하게는 1:1-8:1, 가장 바람직하게는 1:1-3:1이고,
- 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-160℃, 가장 바람직하게는 0-65℃의 범위인 온도를 가지고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 바람직하게는 멸균 산화된 유청 단백질 용액을 제공하기에 충분한 기간 동안 100-160℃, 가장 바람직하게는 130-150℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것,
- 바람직하게는, 여기서 단계 b)의 기간은 최대 1시간, 가장 바람직하게는 최대 10분임,
그리고 여기서 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 충전되어 멸균 포장된 액체 산화된 유청 단백질 용액을 제공함.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
방법의 여전히 특히 바람직한 실시형태는 다음을 포함한다:
a) WPI인 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 총량에 대해 적어도 90% mol/mol의 양으로 과산화물, 가장 바람직하게는 과산화수소를 포함하는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고:
- 7.5-9.5, 가장 바람직하게는 7.7-8.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 3-8% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 50% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 단백질 함량
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서:
- 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량
사이의 몰비는 1:1.5-10:1, 보다 바람직하게는 1:1.5-8:1, 가장 바람직하게는 1:1.5-3:1이고,
- 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-160℃, 가장 바람직하게는 0-65℃의 범위인 온도를 가지고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 바람직하게는 멸균 산화된 유청 단백질 용액을 제공하기에 충분한 기간 동안 100-160℃, 가장 바람직하게는 130-150℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
여기서 단계 b)는 추가로 다음을 포함함:
- 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질로 감소시키도록 단계 b)를 작동하는 것,
- 바람직하게는, 여기서 단계 b)의 기간은 최대 1시간, 가장 바람직하게는 최대 10분임,
그리고 여기서 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물은 무균 충전 및 기밀함에 의해 용기, 바람직하게는 멸균 용기 안으로 충전되어 멸균 포장된 액체 산화된 유청 단백질 용액을 제공함.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서 산화 유청 단백질 용액의 압력은 전형적으로 0.5-99bar, 가장 바람직하게는 1-30bar이다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에 의해 얻을 수 있다.
발명의 또 다른 양태는 다음을 갖는 산화된 유청 단백질 조성물에 관한 것이다:
- 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w의 단백질 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 지방 함량,
- 최대 15 마이크로몰 유리 티올 기/g 단백질,
- 바람직하게는, 총 단백질에 대해 적어도 0.7% w/w의 트립토판 함량,
- 바람직하게는, 총 단백질에 대해 적어도 0.3% w/w의 메티오닌 함량,
- 바람직하게는, 최대 0.2 마이크로그램/mg 단백질의 키누레닌 함량,
- 바람직하게는, 100-600 마이크로몰/g 단백질의 범위인 단백질 결합 황의 함량,
- 바람직하게는, 150-400 마이크로몰/g 단백질의 범위인 이황화 결합을 형성하는 단백질 결합 시스테인 잔기의 함량
- 바람직하게는, 18kDa 내지 10000kDa 범위, 보다 바람직하게는 50-8000kDa, 가장 바람직하게는 80-5000kDa의 범위인 단백질의 중량 평균 분자량, 및
- 바람직하게는, 단백질의 적어도 60% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w는 18kDa 내지 10000kDa 사이의 분자량을 가짐.
산화된 유청 단백질 조성물은 전형적으로 5.5-9.5의 범위인 pH를 갖는다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 5.5-9.5, 더 바람직하게는 6.0-8.5, 보다 더 바람직하게는 6.2-8.0, 가장 바람직하게는 6.5-7.5의 범위인 pH를 갖는다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 산화된 유청 단백질 조성물의 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w, 보다 바람직하게는 산화된 유청 단백질 조성물의 총 고형물에 대하여 적어도 50% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 75% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 85% w/w의 총 단백질 함량을 갖는다.
바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물은 산화된 유청 단백질 조성물의 총 고형물에 대해 30-99% w/w, 더 바람직하게는 산화된 유청 단백질 조성물의 총 고형물에 대해 50-97% w/w, 보다 더 바람직하게는 75-96% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 85-95% w/w의 범위인 총 단백질 함량을 갖는다.
바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물은 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 총 지방 함량을 갖는다.
훨씬 더 낮은 수준의 지방이 전형적으로 바람직하고, 산화된 유청 단백질 조성물이 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 보다 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 0.5% w/w, 보다 더 바람직하게는 최대 0.2% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.1% w/w의 총 지방 함량을 갖는 것이 종종 바람직하다.
산화된 유청 단백질 조성물은 다양한 양으로 탄수화물을 함유할 수 있다.
그러나, 산화된 유청 단백질 조성물은 총 고형물에 대해 최대 65% w/w의 탄수화물 함량을 갖는 것이 종종 바람직하다.
훨씬 더 낮은 수준의 탄수화물이 전형적으로 바람직하고, 산화된 유청 단백질 조성물이 총 고형물에 대해 최대 20% w/w, 더 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 8% w/w, 보다 더 바람직하게는 최대 2% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2% w/w의 탄수화물 함량을 갖는 것이 종종 바람직하다.
산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 8% w/w, 더 바람직하게는 최대 6% w/w, 보다 더 바람직하게는 최대 5%, 가장 바람직하게는 최대 4.0%의 회분 함량을 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 총 고형물에 대해 0.4-8% w/w, 더 바람직하게는 총 고형물에 대해 0.5-6% w/w, 보다 더 바람직하게는 0.5-5% w/w, 가장 바람직하게는 0.6-4.0% w/w의 회분 함량을 갖는다.
산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 보다 바람직하게는 최대 0.7% w/w, 보다 더 바람직하게는 최대 0.5%, 가장 바람직하게는 최대 0.2%의 마그네슘과 칼슘의 조합된 함량을 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 총 고형물에 대해 0.01-1% w/w, 더 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 0.001-0.7% w/w, 보다 더 바람직하게는 0.01-0.5% w/w, 가장 바람직하게는 0.01-0.2% w/w의 마그네슘과 칼슘의 조합된 함량을 갖는다.
발명자들은 최대 15 마이크로몰의 유리 티올 기/g 단백질을 함유하는 산화된 유청 단백질 조성물이 3% 유청 단백질을 함유하는 열처리된 유청 단백질 음료에서, 비산화된 유청 단백질에 비해 불쾌한 냄새의 감소된 수준을 제공할 수 있다는 징후를 확인했다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 최대 15 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 14 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 13 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 12 마이크로몰/g 단백질의 양으로 유리 티올 기를 포함한다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 0.001-15 마이크로몰/g 단백질, 더 바람직하게는 0.01-14 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.01-13 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 0.01-12 마이크로몰/g 단백질의 양으로 유리 티올 기를 포함한다.
그러나, 특히 산화된 유청 단백질 조성물이 열처리된, 예를 들어 6% 이상의 유청 단백질을 함유하는 고단백질 음료에 사용되는 경우에, 산화된 유청 단백질 조성물이 더 낮은 수준의 유리 티올 기를 함유하는 것이 종종 바람직하다. 따라서, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서 산화된 유청 단백질 조성물은 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 8 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 2 마이크로몰/g 단백질의 양으로 유리 티올 기를 포함한다.
바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물은 0.01-10 마이크로몰/g 단백질, 더 바람직하게는 0.01-8 마이크로몰/g 단백질, 더 바람직하게는 0.01-5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.01-3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 0.01-2 마이크로몰/g 단백질의 양으로 유리 티올 기를 포함한다.
훨씬 더 낮은 수준의 유리 티올 기가 바람직할 수 있고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서 산화된 유청 단백질 조성물은 최대 1 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 0.5 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 0.2 마이크로몰/g 단백질의 양으로 유리 티올 기를 포함한다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 총 단백질에 대해 적어도 0.7% w/w, 더 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 0.8% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 0.9% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 1.0% w/w의 트립토판 함량을 갖는다.
바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물은 총 단백질에 대해 0.7-3% w/w, 더 바람직하게는 총 단백질에 대해 0.8-2.6% w/w, 보다 더 바람직하게는 0.9-2.4% w/w, 가장 바람직하게는 1.0-2.2% w/w의 트립토판 함량을 갖는다.
대안적으로, 그러나 또한 바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물은 종종 총 단백질에 대해 0.7-3% w/w, 더 바람직하게는 총 단백질에 대해 0.8-3% w/w, 보다 더 바람직하게는 0.9-3% w/w, 가장 바람직하게는 1.0-3% w/w의 트립토판 함량을 갖는다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 총 단백질에 대해 적어도 0.3% w/w, 더 바람직하게는 총 단백질에 대해 적어도 0.4% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 0.5% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 0.6% w/w의 메티오닌 함량을 갖는다.
바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물은 총 단백질에 대해 0.3-3.3% w/w, 더 바람직하게는 총 단백질에 대해 0.4-3.2% w/w, 보다 더 바람직하게는 0.5-3.2% w/w, 가장 바람직하게는 0.6-3.2% w/w의 메티오닌 함량을 갖는다.
메티오닌의 증가된 하한이 종종 바람직하고, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서 산화된 유청 단백질 조성물은 총 단백질에 대해 1.0-3.3% w/w, 보다 바람직하게는 총 단백질에 대해 1.3-3.2% w/w, 보다 더 바람직하게는 1.6-3.2% w/w, 가장 바람직하게는 1.8-3.2% w/w의 메티오닌 함량을 갖는다.
바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물은 최대 0.2 마이크로그램/mg 단백질, 보다 바람직하게는 최대 0.05 마이크로그램/mg 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 0.01 마이크로그램/mg 단백질, 가장 바람직하게는 최대 0.001 마이크로그램/mg 단백질의 키누레닌 함량을 갖는다. 산화된 유청 단백질 조성물이 검출가능한 키누레닌을 함유하지 않는 것이 특히 바람직하다.
키누레닌의 함량은 Poojary 등; "Selective and sensitive UHPLC-ESI-Orbitrap MS method to quantify protein oxidation markers"; Talanta, Volume 234, 1 November 2021 (2021년 7월 온라인 이용가능)에 따라 정량화된다.
키누레닌은 트립토판 산화의 유용한 지표이고, 발명자들은 그것이 과도한 산화를 거친 단백질을 기반으로 한 열멸균된 유청 단백질 음료에서의 노란 색상의 발생에 부분적으로 책임이 있고 더욱이 건강적인 관점에서 바람직하지 않다고 믿고 있다.
바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물은 100-600 마이크로몰/g 단백질의 범위, 보다 바람직하게는 200-500 마이크로몰/g 단백질의 범위, 가장 바람직하게는 250-500 마이크로몰/g 단백질의 범위로 단백질 결합 황의 함량을 갖는다.
바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물은 150-400 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 160-350, 가장 바람직하게는 170-300 마이크로몰/g 단백질의 범위로 이황화 결합을 형성하는 단백질 결합 시스테인 잔기의 함량을 갖는다.
발명자들은 산화된 유청 단백질 조성물의 단백질의 입자 크기가 투명한 음료 적용에서 불투명성의 발달을 피하고 더욱이 산화된 유청 단백질의 농축 및 건조 동안 점도 증가를 피하기 위해 10000kDa 이하이고, 바람직하게는 더 작은 것이 유리하다는 것을 발견했다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 18kDa 내지 10000kDa, 보다 바람직하게는 30-9000kDa, 보다 더 바람직하게는 50-8000kDa, 가장 바람직하게는 80-5000kDa의 범위인 단백질의 중량 평균 분자량을 갖는다.
바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물의 단백질의 적어도 60% w/w, 더 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w는 18kDa 내지 10000kDa 사이의 분자량을 갖는다.
더 바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물의 단백질의 적어도 60% w/w, 더 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w는 50kDa 내지 8000kDa 사이의 분자량을 갖는다.
보다 더 바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물의 단백질의 적어도 60% w/w, 더 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w는 80kDa 내지 5000kDa 사이의 분자량을 갖는다.
발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 18kDa 내지 200kDa, 보다 바람직하게는 30-150kDa, 가장 바람직하게는 30-100kDa 사이의 범위인 단백질의 중량 평균 분자량을 갖는다.
발명자들은 단백질의 중량 평균 분자량이 작을수록, 예를 들어 분무 건조 이전에 한외여과 또는 나노여과에 의한 농축 동안 총 단백질 농도가 더 높아질 수 있음을 발견했다.
바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물의 단백질의 적어도 60% w/w, 더 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w는 18kDa 내지 200kDa 사이의 분자량을 갖는다.
더 바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물의 단백질의 적어도 60% w/w, 더 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w는 18kDa 내지 150kDa 사이의 분자량을 갖는다.
보다 더 바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물의 단백질의 적어도 60% w/w, 더 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w는 18kDa 내지 100kDa 사이의 분자량을 갖는다.
발명자들은 산화된 유청 단백질 조성물의 상당한 단백질이 적어도 30kDa의 분자량을 갖는 것이 유익할 수 있다는 징후를 확인했는데, 이는 산화된 BLG의 이량체화로 인한 것일 수 있다.
따라서, 바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물의 단백질의 적어도 60% w/w, 더 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w는 30kDa 내지 200kDa 사이의 분자량을 갖는다.
보다 바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물의 단백질의 적어도 60% w/w, 더 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w는 30kDa 내지 150kDa 사이의 분자량을 갖는다.
보다 더 바람직하게는, 산화된 유청 단백질 조성물의 단백질의 적어도 60% w/w, 더 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w는 30kDa 내지 100kDa 사이의 분자량을 갖는다.
산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 유청 단백질 공급원, 바람직하게는 유청 단백질 공급원의 수성 용액의 산화를 포함하는 방법에 의해 제조된다. 유청 단백질 공급원의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 기술되어 있다. 유청 단백질 단리물인 유청 단백질 공급원이 특히 바람직하다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 본 명세서에 기술된 방법에 의해 얻을 수 있다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 액체, 바람직하게는, 수성 액체의 형태로 된다. 액체 형태인 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는, 최대 0.1-50% w/w, 더 바람직하게는 1-35% w/w, 보다 더 바람직하게는 5-30% w/w, 가장 바람직하게는 10-30% w/w의 고형물 함량을 갖는다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 고체의 형태로 되고, 바람직하게는 분무 건조에 의해 제조된 바람직하게는 분말이다. 분말의 형태인 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 적어도 90%w/w, 더 바람직하게는 적어도 93%w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 94%w/w, 가장 바람직하게는 적어도 95%w/w의 고형물 함량을 갖는다.
고형물 함량에 기여하지 않는 산화된 유청 단백질 조성물 및 산화 유청 단백질 용액의 일부는 바람직하게는 물이다.
고형물 함량에 기여하지 않는 산화된 유청 단백질 조성물의 일부는 바람직하게는 적어도 80% w/w, 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 보다 더 바람직하게는 95% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 99% w/w의 양으로 물을 포함한다.
발명의 특히 바람직한 실시형태에서 산화된 유청 단백질 조성물은 다음을 갖는다:
- 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 총 고형물에 대해 적어도 90%의 단백질 함량,
- 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2%의 지방 함량,
- 최대 10 마이크로몰 유리 티올 기/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰 유리 티올 기/g 단백질,
- 총 단백질에 대해 0.7-3% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 1.0-3% w/w의 트립토판 함량,
- 총 단백질에 대해 0.3-3.3% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 1.3-3.2% w/w의 메티오닌 함량,
- 최대 0.2 마이크로그램/mg 단백질, 가장 바람직하게는 최대 0.01 마이크로그램/mg 단백질의 키누레닌 함량.
발명의 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 하기를 갖는다:
- 100-600 마이크로몰/g 단백질의 범위인 단백질 결합 황의 함량, 및
- 150-400 마이크로몰/g 단백질의 범위인 이황화 결합을 형성하는 단백질 결합 시스테인 잔기의 함량.
추가로, 발명의 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 하기를 갖는다:
- 100-600 마이크로몰/g 단백질의 범위인 단백질 결합 황의 함량, 및
- 150-400 마이크로몰/g 단백질의 범위인 이황화 결합을 형성하는 단백질 결합 시스테인 잔기의 함량.
상기 언급된 특히 바람직한 실시형태의 산화된 유청 단백질 조성물의 단백질의 적어도 60% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 80% w/w w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w가 30kDa 내지 9000kDa의 분자량을 갖는 것이 더욱 종종 바람직하다.
산화된 유청 단백질 조성물의 상기 언급된 특히 바람직한 실시형태의 pH는 바람직하게는 6.2-8.0, 가장 바람직하게는 6.5-7.5의 범위에 있다.
일부 pepi에서 산화된 유청 단백질 조성물은 멸균 산화된 유청 단백질 조성물, 바람직하게는 포장된 멸균 산화된 유청 단백질 조성물이다. 바람직하게는 멸균 액체 산화된 유청 단백질 조성물 또는 멸균 분말의 산화된 유청 단백질 조성물의 형태이다.
발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 식품을 생산하는 공정에 관한 것이다:
- 본 명세서에 기술된 산화된 유청 단백질 조성물을 가공하는 단계, 및/또는
- 기술된 산화된 유청 단백질 조성물 및/또는 가공된 산화된 유청 단백질 조성물을 하나 이상의 추가 성분과 조합하고 임의로 조합을 가공하는 단계.
식품의 바람직한 예는 pH 5.5-8.5를 갖는 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료이다.
따라서, 발명의 더욱 구체적인 양태는 pH 5.5-8.5, 보다 바람직하게는 6.5-7.5를 갖는 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료를 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
1) 본 명세서에 기술된 산화된 유청 단백질 조성물을 하나 이상의 추가 성분과 조합하여 pH 5.5-8.5, 보다 바람직하게는 6.5-7.5를 가지고 다음을 포함하는 액체 혼합물을 얻는 단계:
- 적어도 0.5% w/w 단백질을 차지하기에 충분한 양으로 산화된 유청 단백질 조성물, 및
- 물,
2) 액체 혼합물을 용기, 바람직하게는 멸균 용기에 포장하는 단계로,
여기서 액체 혼합물은 포장 이전 및/또는 포장 후에 열처리되고, 바람직하게는 열멸균되는, 단계.
본 명세서에 기술된 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 식품 또는 열멸균된 음료, 따라서 또한 액체 혼합물의 유일한 단백질 공급원이다.
발명자들은 썩은 계란의 냄새와 유사한 불쾌한 냄새의 형성을 방지하기 위해 열 처리 이전에 액체 혼합물의 유리 티올 기의 함량을 낮게 유지하는 것이 유리하다는 것을 발견했다.
따라서, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 액체 혼합물은 열멸균 이전에 최대 60 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 보다 바람직하게는 최대 40 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 보다 더 바람직하게는 최대 30 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 가장 바람직하게는 최대 30 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물을 함유한다.
훨씬 더 낮은 함량의 유리 티올 기가 종종 요구되고, 발명의 일부 바람직한 실시형태에서 액체 혼합물은 열멸균 이전에 최대 20 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 보다 바람직하게는 최대 15 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 보다 더 바람직하게는 최대 10 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물을 함유한다.
액체 혼합물은 바람직하게는 액체 혼합물의 중량에 대해 0.5-15% w/w, 보다 바람직하게는 액체 혼합물의 중량에 대해 1-10% w/w, 보다 더 바람직하게는 액체 혼합물의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 액체 혼합물의 중량에 대해 3-8% w/w의 범위인 단백질의 총량을 포함한다.
대안적으로, 또한 바람직하게는, 액체 혼합물은 액체 혼합물의 중량에 대해 4-15% w/w, 더 바람직하게는 액체 혼합물의 중량에 대해 5-14% w/w, 보다 더 바람직하게는 액체 혼합물의 중량에 대해 6-13% w/w, 가장 바람직하게는 액체 혼합물의 중량에 대해 8-12% w/w의 범위인 단백질의 총량을 포함할 수 있다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 액체 혼합물의 총 단백질의 적어도 30% w/w, 더 바람직하게는 총 단백질의 적어도 50% w/w, 보다 더 바람직하게는 총 단백질의 적어도 70% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질의 적어도 80% w/w를 차지한다.
훨씬 더 높은 기여도가 종종 바람직하고, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 액체 혼합물의 총 단백질의 적어도 90% w/w, 더 바람직하게는 총 단백질의 적어도 95% w/w, 보다 더 바람직하게는 총 단백질의 적어도 99% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질의 100% w/w를 차지한다.
산화된 유청 단백질 조성물이 다른 단백질 공급원과 조합하여 사용된 경우. 유리 티올 기의 함량이 상대적으로 낮은 공급원을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 액체 혼합물은 총 고형물에 대해 적어도 15% w/w, 보다 바람직하게는 총 고형물에 대해 적어도 20% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 25% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 30% w/w의 양으로 총 단백질을 포함한다.
총 단백질은, 예를 들어 음료가 스포츠 단백질 음료로 의도된 경우 총 고형물의 휠씬 더 큰 부분을 차지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 액체 혼합물은 총 고형물에 대해 적어도 80% w/w, 보다 바람직하게는 총 고형물에 대해 적어도 90% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 92% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 94% w/w의 양으로 총 단백질을 포함한다.
액체 혼합물은 전형적으로 0.5-50% w/w, 더 바람직하게는 1-35% w/w, 보다 더 바람직하게는 2-20% w/w, 가장 바람직하게는 3-10% w/w의 고형물 함량을 갖는다.
고형물로 구성되지 않은 액체 혼합물의 부분은 바람직하게는 물을 포함한다. 고형물로 구성되지 않은 액체 혼합물의 부분은 바람직하게는 적어도 80% w/w, 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 보다 더 바람직하게는 95% w/w, 더 바람직하게는 적어도 99% w/w의 양으로 물을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 액체 혼합물은 최대 100kcal/100g, 보다 바람직하게는 최대 80kcal/100g, 보다 더 바람직하게는 최대 70kcal/100g, 가장 바람직하게는 최대 60kcal/100g의 칼로리 함량을 갖는다. 바람직하게는, 액체 혼합물은 2-100kcal/100g, 더 바람직하게는 4-80kcal/100g, 보다 더 바람직하게는 8-70kcal/100g, 가장 바람직하게는 12-60kcal/100g의 칼로리 함량을 가질 수 있다. 이들 실시형태는 예를 들어 단백질 공급원이 주요 에너지 공급원인 스포츠 적용에 바람직하다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 액체 혼합물은 100kcal/100g 초과, 더 바람직하게는 적어도 120kcal/100g, 보다 더 바람직하게는 적어도 140kcal/100g, 가장 바람직하게는 적어도 150kcal/100g의 칼로리 함량을 갖는다. 바람직하게는, 액체 혼합물은 101-300kcal/100g, 더 바람직하게는 120-280kcal/100g, 보다 더 바람직하게는 140-270kcal/100g, 가장 바람직하게는 150-260kcal/100g의 칼로리 함량을 가질 수 있다. 이들 실시형태는 예를 들어 단백질 공급원에 상당한 양의 탄수화물과 지방이 수반되는 임상적 영양에 대해 바람직하다.
열처리된 음료의 맥락에서 기술된 구성적 특징과 선호도는 액체 혼합물에도 동등하게 적용된다.
액체 혼합물의 pH는 약산성에서 약알칼리성에 걸쳐있을 수 있다.
pH가 중성에 가까운(Near-pH-neutral) 액체 혼합물은 pH가 중성에 가까운 음료의 생산에 특히 바람직하다. 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 액체 혼합물은 5.5-8.0, 더 바람직하게는 6.0-7.5, 보다 더 바람직하게는 6.2-7.3, 가장 바람직하게는 6.3-7.2의 범위인 pH를 갖는다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 액체 혼합물은 6.0-7.5, 더 바람직하게는 6.2-7.5, 가장 바람직하게는 6.3-7.5의 범위인 pH를 갖는다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시형태에서, 액체 혼합물은 6.0-8.0, 더 바람직하게는 6.6-7.7, 보다 더 바람직하게는 6.7-7.6, 가장 바람직하게는 6.8-7.5의 범위인 pH를 갖는다.
일반적으로, 액체 혼합물의 pH를 조정하기 위해 임의의 적합한 식품 산 또는 식품 염기를 사용할 수 있다. 당업자는 pH를 조정하기 위한 적합한 수단을 인식할 것이다. 적합한 식품 염기에는 탄산나트륨 또는 칼륨, 탄산수소나트륨 또는 칼륨, 또는 수산화암모늄이 포함된다. 대안적으로, KOH 또는 NaOH를 이용하여 pH를 조정할 수 있다. 적합한 식품 산에는 예를 들어 구연산, 염산, 말산 또는 타르타르산 또는 인산이 포함된다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 액체 혼합물은 20℃ 및 300 s-1의 전단 속도에서 최대 200 cP, 보다 바람직하게는 20℃ 및 300 s-1의 전단 속도에서 최대 100 cP, 보다 더 바람직하게는 20℃ 및 300 s-1의 전단 속도에서 최대 50 cP, 가장 바람직하게는 20℃ 및 300 s-1의 전단 속도에서 최대 20 cP의 점도를 갖는다.
액체 혼합물은 전형적으로 적절한 성분을 산화된 유청 단백질 조성물과 혼합함에 의해 제조된다. 분말 성분이 사용되는 경우, 열처리 이전에 이들을 수화시키는 것이 종종 바람직하고, 유사하게는 열처리 이전에 액체 혼합물을 균질화하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 분말의 형태로 제공되고, 바람직하게는 혼합된 물 또는 수성 액체이고 열처리 이전에 수화되도록 한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 액체의 형태, 예를 들어 단계 b) 또는 단계 c)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액의 형태로 제공된다. 일부 바람직한 실시형태에서, 산화된 유청 단백질 조성물은 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액이고, 잔류 과산화물 산화제를 제거하기 위해 사용된 카탈라아제를 함유한다. 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액은 단계 c)에 적용되지 않지만:
- 음료를 생산하는데 필요한 하나 이상의 추가 성분과 혼합되고,
- 임의로 균질화를 거치고,
- 140-150도의 범위인 온도로 1-10초 동안 가열함에 의해 열멸균을 거치고,
- 열멸균된 음료를 냉각시키고,
- 멸균 음료를 적절한 멸균 용기 안으로 무균적으로 충전되고 후속적으로 밀봉된다.
발명자들은 이러한 음료 공정에서의 열멸균이 본 명세서에 언급된 방법의 단계 c)를 대체할 수 있고 둘 모두 카탈라제를 불활성화하고 유리 티올 기의 함량에서의 추가적인 감소에 기여한다는 것을 발견했다.
단계 2)의 포장은 임의의 적합한 포장 기술일 수 있고, 액체 혼합물을 포장하기 위해 임의의 적합한 용기가 사용될 수 있다.
그러나, 발명의 바람직한 실시형태에서, 단계 2)의 포장은 무균 포장이며, 즉 액체 혼합물은 무균 조건 하에 포장된다. 예를 들어, 무균 포장은 무균 충전 시스템을 사용하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 액체 혼합물을 하나 이상의 무균 용기(들)에 충전하는 것을 포함한다.
액체 혼합물이 충전 이전에 이미 무균 상태이거나 미생물이 매우 낮은 경우에는 무균 충전 및 밀봉이 특히 바람직하다.
유용한 용기의 예로는 병, 판지상자, 브릭 및/또는 백이 있다.
공정의 열처리는 바람직하게는 액체 혼합물을 적어도 70℃의 온도에 적용시킨다.
발명 공정의 일부 바람직한 실시형태에서, 단계 1)의 액체 혼합물은 적어도 저온살균을 포함하는 열처리를 거친 다음 단계 2)에서 포장된다.
발명 공정의 또 다른 실시형태에서, 단계 2)의 포장된 액체 혼합물은 적어도 저온살균을 포함하는 열처리를 거친다.
일부 바람직한 실시형태에서, 열처리는 액체 혼합물을 70-80℃의 범위인 온도로 가열하는 것을 포함한다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리의 온도는 70-80℃의 범위, 바람직하게는 70-79℃의 범위, 보다 바람직하게는 71-78℃의 범위, 보다 더 바람직하게는 72-77℃의 범위, 가장 바람직하게는 73-76℃의 범위, 예컨대 대력 75℃이다.
바람직하게는, 열처리의 기간은 70-80℃ 온도 범위에서 1초에서 60분 동안 수행된다. 가장 높은 노출 시간은 온도 범위 중 가장 낮은 온도에 대해 가장 적합하며 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 열처리의 온도는 70℃에서 적어도 60분 동안, 또는 바람직하게는 75℃에서 적어도 45분 동안, 또는 바람직하게는 80℃에서 적어도 30분 동안, 또는 바람직하게는 85℃에서 적어도 22분 동안, 또는 바람직하게는 90℃에서 적어도 10분 동안이다.
발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 열처리는 70-78℃에서 1초 내지 30분 동안, 보다 바람직하게는 71-77℃에서 1분 내지 25분 동안, 보다 바람직하게는 72-76℃에서 2분 내지 20분 동안 제공한다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리의 공정은 1 내지 30분 동안 85℃-95℃의 온도로 가열하는 것을 포함한다.
예를 들어, 열처리 온도는 적어도 81℃, 바람직하게는 적어도 91℃, 바람직하게는 적어도 95℃, 보다 바람직하게는 적어도 100℃, 보다 더 바람직하게는 적어도 120℃, 가장 바람직하게는 적어도 140℃에서 될 수 있다.
발명의 일부 특히 바람직한 실시형태에서, 열처리는 액체 혼합물을 멸균하기에 충분한 기간 동안 100-160℃의 범위인 온도로 액체 혼합물을 가열하는 것을 포함한다. 이는 바람직하게는 액체 혼합물을 멸균성을 획득하기에 충분한 기간 동안 120 내지 155℃의 범위인 온도로, 전형적으로 0.1초 내지 10분, 보다 바람직하게는 멸균성을 획득하기에 충분한 기간 동안 140 내지 155℃로, 전형적으로 0.1-30초 동안 가열하는 것을 포함한다. 액체를 멸균 상태로 만드는 액체의 열처리는 또한 열멸균으로 지칭된다.
또 다른 바람직한 열처리는 전형적으로 135-146℃의 범위인 온도와 멸균성을 얻기에 충분한 기간, 전형적으로 1-10초의 범위인 기간 동안을 포함하는 멸균 UHT-유형 처리이다.
대안적으로, 그러나 또한 바람직하게는, 열처리는 145-180℃의 범위인 온도 및 멸균성을 얻기에 충분한 기간, 전형적으로 0.01-2초의 범위인 기간, 더 바람직하게는 150-180℃의 범위인 온도 및 0.01-0.3초의 범위인 기간 동안을 포함할 수 있다.
열처리의 구현에는 판형 또는 관형 열 교환기, 긁힌 표면 열 교환기 또는 레토르트 시스템과 같은 장비의 사용이 포함될 수 있다. 대안적으로, 특히 95℃ 이상의 열처리에 바람직하게는, 예를 들어 직접 증기 주입, 직접 증기 유입 또는 스프레이-쿠킹를 사용한 직접 증기-기반 가열이 이용될 수 있다. 추가적으로, 이러한 직접적인 증기-기반 가열은 바람직하게는 순간 냉각과 조합하여 사용된다. 스프레이-쿠킹 구현의 적합한 예는 모든 목적을 위해 본 명세서에 포함된 WO2009113858A1에서 찾을 수 있다. 직접 증기 주입 및 직접 증기 유입 구현의 적합한 예는 모든 목적을 위해 본 명세서에 포함된 WO2009113858A1 및 WO 2010/085957 A3에서 찾을 수 있다. 고온 처리의 일반적인 양태는 모든 목적을 위해 본 명세서에 참고로 포함된 "Thermal technologies in food processing" ISBN 185573558 X에서 찾을 수 있다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리는 바람직하게는 적어도 80℃의 온도, 보다 바람직하게는 적어도 95℃의 온도, 보다 더 바람직하게는 적어도 100℃, 가장 바람직하게는 적어도 120℃에서, 그리고 바람직하게는 처리된 액체를 멸균 상태로 만드는데 충분한 기간 동안 레토르트 열처리를 포함하거나 심지어 그것으로 구성된다.
발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 열처리는 바람직하게는 적어도 100℃의 온도, 보다 바람직하게는 적어도 120℃의 온도, 보다 더 바람직하게는 적어도 130℃, 가장 바람직하게는 적어도 140℃에서, 그리고 바람직하게는 처리된 액체를 멸균 상태로 만드는데 충분한 기간 동안 증기 주입 또는 스프레이 쿠킹을 포함하거나 심지어 이로 이루어진다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 저온살균은 물리적 미생물 감소와 조합된다.
물리적 미생물 감소의 유용한 예에는 세균 여과, UV 방사선, 고압 처리, 펄스 전기장 처리 및 초음파 중 하나 이상이 포함된다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리는 멸균 열처리이므로 멸균 액체 혼합물과 따라서 멸균 음료가 생성된다. 이러한 멸균은 예를 들어 세균 여과와 저온살균을 조합하거나 적어도 100℃에서 멸균을 얻기에 충분한 기간 동안 열처리를 수행함에 의해 얻을 수 있다.
열처리 후에 액체 혼합물은 냉각을 거치는 것이 유리하다. 발명 공정의 바람직한 실시형태에 따르면, 열처리 후, 열처리된 액체 혼합물은 바람직하게는 0 내지 70℃, 바람직하게는 0 내지 60℃, 보다 더 바람직하게는 0 내지 30℃, 가장 바람직하게는 0-20℃로 냉각된다.
열처리가 액체 혼합물을 멸균시키지 않는 경우, 열처리된 액체 혼합물은 바람직하게는 열처리 후 0 내지 15℃, 보다 바람직하게는 1 내지 10℃, 가장 바람직하게는 1-5℃로 냉각된다.
냉각은 충전 단계 이전에 또는 충전 단계 후에 발생할 수 있다.
냉각에는 전형적으로 순간 냉각 및/또는 기존 열교환기가 포함된다.
특히 열멸균 열처리 후에 순간 냉각에 의한 적어도 부분 냉각이 종종 바람직하다. 순간 냉각은 전형적으로 냉각된 액체의 휘발성 화합물 중 일부를 제거한다. pH가 5.5-8.5 범위인 유청 단백질 음료는 특히 열처리 동안 불쾌한 냄새가 발생하기 쉬우며 이들 불쾌한 냄새는 열처리된 액체에서 부분적으로 제거되어 순간 냉각 시스템 근처에서 방출된다. 이는 열처리 시스템을 작동하는 직원이 거슬리는 냄새에 노출되고 더욱이 건강 문제와도 연관될 수 있으므로 단점이 된다.
발명자들은 유리하게는 본 산화된 유청 단백질 조성물에 기반한 열처리된 음료의 순간-냉각이 그러한 불쾌한 냄새를 훨씬 적게 방출하고 때로는 심지어 전혀 방출하지 않는다는 것을 발견했다.
발명의 공정은 배치 공정, 반-배치 공정, 또는 연속 공정으로 구현될 수 있다.
발명의 또 다른 구체적인 양태는 산화된 유청 단백질 조성물을 얻기 위해 본 명세서에 기술된 방법의 단계 a), 단계 b) 및 임의로 단계 c)를 수행하고 후속적으로 본 명세서에 기술된 단계 2)에 따라 산화된 유청 단백질 조성물을 포장하는 것을 포함하는, 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료를 생산하는 방법에 관한 것이다.
산화된 유청 단백질 조성물이 음료로 직접적으로 사용되는 경우, 단계 b) 및/또는 c)는 열멸균 열처리, 즉 처리된 액체를 멸균 상태로 만드는 열처리를 포함하는 것이 바람직하다.
상기에 언급된 바와 같이, 열처리 등은 전형적으로 처리되어 지는 액체를 액체를 살균하기에 충분한 기간 동안 100-160℃의 범위인 온도로 가열되는 것이 필요하다. 열처리 등을 위한 적절한 시간/온도 조합이 본 명세서에 기술되어 있다.
발명의 또 다른 양태는 발명의 산화된 유청 단백질 조성물을, 바람직하게는 식품의 중량에 대해 적어도 0.5% w/w의 양으로 단백질에 기여하는 양으로 포함하는 식품에 관한 것이다. 식품은 바람직하게는 적어도 하나의 비-유청 구성요소를 추가로 함유한다.
"비-유청 구성요소"라는 용어는 산화된 유청 단백질 조성물에도, 비산화된 유청 단백질 농축물에도 존재하지 않는 구성요소를 의미한다.
발명의 보다 좁은 양태는 pH 5.5-8.5를 갖는 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료에 관한 것이며, 상기 음료는 본 명세서에 기술된 산화된 유청 단백질 조성물을 적어도 0.5% w/w 단백질에 기여하기에 충분한 양으로 포함한다.
본 열처리된 음료의 이점은 비교가능한 선행 기술 음료보다 더 좋은 냄새를 갖는다는 것이고 발명자들은 본 음료가 놀랍게도 낮은 H2S의 함량을 갖는다는 것을 관찰했다.
열처리된 음료는 바람직하게는 5.5-8.5, 더 바람직하게는 6.0-8.0, 보다 더 바람직하게는 6.3-7.5, 가장 바람직하게는 6.5-7.5의 pH를 갖는다.
바람직하게는 5.5-8.5의 pH를 갖는 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료는 최대 5 마이크로몰/L, 더 바람직하게는 3 마이크로몰/L, 보다 더 바람직하게는 1.0 마이크로몰/L, 가장 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/L의 H2S 함량을 갖는다.
5.5-8.5의 pH를 갖는 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료는 생성 후 1시간에 최대 5 마이크로몰/L, 더 바람직하게는 3 마이크로몰/L, 보다 더 바람직하게는 1.0 마이크로몰/L, 가장 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/L의 H2S 함량을 갖는 것이 특히 바람직하다.
5.5-8.5의 pH를 갖는 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료는 생성 후 7일에 최대 5 마이크로몰/L, 보다 바람직하게는 3 마이크로몰/L, 보다 더 바람직하게는 1.0 마이크로몰/L, 가장 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/L의 H2S 함량을 갖는 것이 더욱 바람직하다.
발명자들은 상기 언급된 열처리된 음료가 종래 기술의 비교가능한 열처리된 pH-중성 유청 단백질-함유 음료에 비해 특히 호의적인 냄새를 갖는다는 것을 발견했다.
열처리된 음료는 멸균되는 것이 특히 바람직하다.
열처리된 음료는 바람직하게는 포장된 열처리된 음료이고, 바람직하게는 밀폐된 용기, 예컨대 예를 들어 병에 포장된다. 이러한 포장되고 열처리된 음료는 소비자가 매우 선호하고 전형적으로 주변 온도에서 저장-수명이 길고 소비자가 원하는 곳으로 운송되고 섭취될 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 주변 온도에서 적어도 6개월, 더 바람직하게는 적어도 1년, 보다 더 바람직하게는 적어도 2년의 저장-수명을 갖는다.
열처리된 음료는 바람직하게는 음료의 중량에 대해 0.5-15% w/w, 보다 바람직하게는 음료의 중량에 대해 1-10% w/w, 보다 더 바람직하게는 음료의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 음료의 중량에 대해 3-8% w/w의 범위인 단백질의 총량을 포함한다.
대안적으로, 그러나 또한 바람직하게는, 열처리된 음료는 열처리된 음료의 중량에 대해 4-15% w/w, 보다 바람직하게는 열처리된 음료의 중량에 대해 5-14% w/w, 보다 더 바람직하게는 액체 혼합물의 중량에 대해 6-13% w/w, 가장 바람직하게는 열처리된 음료의 중량에 대해 8-12% w/w의 범위인 단백질의 총량을 포함할 수 있다.
발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 바람직하게는 열처리된 음료의 총 단백질의 적어도 30% w/w, 더 바람직하게는 총 단백질의 적어도 50% w/w, 보다 더 바람직하게는 총 단백질의 적어도 70% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질의 적어도 80% w/w를 차지한다.
휠씬 더 높은 기여도가 종종 바람직하고, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 발명의 산화된 유청 단백질 조성물은 열처리된 음료의 총 단백질의 적어도 90% w/w, 보다 바람직하게는 총 단백질의 적어도 95% w/w, 보다 더 바람직하게는 총 단백질의 적어도 99% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질의 100% w/w를 차지한다.
산화된 유청 단백질 조성물을 다른 단백질 공급원과 조합하여 사용하는 경우, 유리 티올 기의 함량이 상대적으로 낮은 공급원을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 바람직하게는 총 고형물에 대해 적어도 15% w/w, 더 바람직하게는 총 고형물에 대해 적어도 20% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 25% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 30% w/w의 양으로 총 단백질을 포함한다. 이들 범위의 낮은 말단은 종종 단백질에 부가하여 상당한 양의 지방과 탄수화물을 함유하는 임상적 영양용 음료에 특히 바람직하다.
총 단백질은 예를 들어 음료가 스포츠 단백질 음료로 의도된 경우, 총 고형물의 훨씬 더 큰 부분을 차지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 총 고형물에 대해 적어도 80% w/w, 더 바람직하게는 총 고형물에 대해 적어도 90% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 92% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 94% w/w의 양으로 총 단백질을 포함한다.
열처리된 음료는 바람직하게는 0.5-50% w/w, 더 바람직하게는 1-35% w/w, 보다 더 바람직하게는 2-20% w/w, 가장 바람직하게는 3-10% w/w의 고형물 함량을 갖는다.
고형물로 구성되지 않은 열처리된 음료의 부분은 바람직하게는 물을 포함한다. 고형물로 구성되지 않은 열처리된 음료의 부분은 바람직하게는 적어도 80% w/w, 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 보다 더 바람직하게는 95% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 99% w/w의 양으로 물을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태, 열처리된 음료는 최대 100kcal/100g, 더 바람직하게는 최대 80kcal/100g, 보다 더 바람직하게는 최대 70kcal/100g, 가장 바람직하게는 최대 60kcal/100g의 칼로리 함량을 갖는다. 바람직하게는, 열처리된 음료는 2-100kcal/100g, 더 바람직하게는 4-80kcal/100g, 보다 더 바람직하게는 8-70kcal/100g, 가장 바람직하게는 12-60kcal/100g의 칼로리 함량을 가질 수 있다. 이들 실시형태는 예를 들어 단백질 공급원이 주요 에너지 공급원인 스포츠 적용에 바람직하다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 100kcal/100g 초과, 보다 바람직하게는 적어도 120kcal/100g, 보다 더 바람직하게는 적어도 140kcal/100g, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 150kcal/100g의 칼로리 함량을 갖는다. 바람직하게는, 열처리된 음료는 101-300kcal/100g, 보다 바람직하게는 120-280kcal/100g, 보다 더 바람직하게는 140-270kcal/100g, 가장 바람직하게는 150-260kcal/100g의 칼로리 함량을 가질 수 있다. 이들 실시형태는 예를 들어 단백질 공급원에 상당한 양의 탄수화물과 지방이 동반되는 임상적 영양에 바람직하다.
본 발명의 열처리된 음료는 단백질 이외의 다른 다량 영양소, 예컨대 예를 들어 탄수화물 및/또는 지질을 포함할 수 있다.
발명의 일부 실시형태에서, 열처리된 음료는 탄수화물을 추가로 포함한다. 발명의 열처리된 음료에서 총 탄수화물 함량은 열처리된 음료의 의도된 용도에 따라 달라진다.
포장된 열처리된 음료의 탄수화물은 바람직하게는 하나 이상의 탄수화물의 공급원에 의해 제공된다.
유용한 탄수화물 공급원은 수크로스, 말토스, 덱스트로스, 갈락토스, 말토덱스트린, 옥수수 시럽 고형물, 수크로말트, 글루코스 중합체, 옥수수 시럽, 변성된 전분, 저항성 전분, 쌀-유래된 탄수화물, 이소말툴로스, 백당, 글루코스, 프럭토스, 락토스, 고과당 옥수수 시럽, 꿀, 당 알코올, 프럭토올리고당, 대두 섬유, 옥수수 섬유, 구아 검, 곤약 가루, 폴리덱스트로스, 파이버졸 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 발명의 일부 실시형태에서, 포장된 열처리된 음료는 프럭탄과 같은 비-소화성 당을 포함하고, 프럭탄은 이눌린 또는 프럭토-올리고당을 포함한다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 음료의 총 에너지 함량의 0 내지 95%, 보다 바람직하게는 음료의 총 에너지 함량의 10 내지 85%의 범위, 보다 더 바람직하게는 음료의 총 에너지 함량의 20 내지 75%의 범위, 가장 바람직하게는 음료의 총 에너지 함량의 30 내지 60%의 범위로 탄수화물을 포함한다.
영양 제품에서 영양소의 에너지 기여도의 결정은 당업자에게 잘 알려져 있고, 총 에너지 함량에 대한 각 영양소 그룹의 에너지 기여도를 계산하는 것을 포함한다. 예를 들어, 탄수화물은 4.0kcal/g 탄수화물로 기여하는 것으로 알려져 있고, 단백질은 4.0kcal/g 단백질로 기여하는 것으로 알려져 있고, 지방은 9.0kcal/g 지방으로 기여하는 것으로 알려져 있다. 총 에너지 함량은 문제의 조성물을 봄 열량계에서 연소시킴에 의해 결정된다.
훨씬 더 낮은 탄수화물 함량이 종종 바람직하고, 따라서 발명의 일부 바람직한 실시형태에서 바람직하게는 음료의 총 에너지 함량의 0 내지 30% 범위, 보다 바람직하게는 음료의 총 에너지 함량의 0 내지 20%의 범위, 보다 더 바람직하게는 음료의 총 에너지 함량의 0 내지 10%의 범위로 된다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 음료는 스포츠 음료로서 특히 유용하고, 예를 들어 음료의 총 에너지 함량(E%)의 최대 75%, 더 바람직하게는 최대 40E%, 보다 더 바람직하게는 최대 10E%, 가장 바람직하게는 최대 5E%의 탄수화물의 총량을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 포장된 열처리된 음료는 영양학적으로 불완전한 영양 보충으로서 특히 유용하고, 예를 들어 음료의 총 에너지 함량(E%)의 70-95%의 범위, 바람직하게는 80-90E%의 범위인 탄수화물의 총량을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 음료의 총 에너지 함량의 30-60%의 범위, 가장 바람직하게는 35-50E%의 범위로 탄수화물의 총량을 포함한다. 이러한 음료는 영양적으로 완전한 음료에 특히 유용하다.
발명의 일부 실시형태에서, 열처리된 음료는 더욱이 비타민, 향미제, 미네랄, 감미료, 항산화제, 식품산, 지질, 탄수화물, 프리바이오틱스, 프로바이오틱스 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 성분을 포함한다.
추가 성분을 사용하여 음료의 영양 기여도와 맛 및 풍미 특징을 조정할 수 있다.
발명의 일 실시형태에서, 음료는 적어도 하나의 고강도 감미료(HIS)를 포함한다. 적어도 하나의 HIS는 바람직하게는 아스파탐, 시클라메이트, 수크랄로스, 아세설팜염, 네오탐, 사카린, 스테비아 추출물, 스테비올 글리코시드 예컨대 예를 들어 레바우디오사이드 A, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
발명의 일부 실시형태에서, 감미료는 하나 이상의 고강도 감미료를 포함하거나 심지어 이로 이루어지는 것이 특히 바람직하다.
HIS는 천연 감미료와 인공 감미료 둘 모두 중에서 발견되고 전형적으로 수크로스의 적어도 10배에서의 감미 강도를 갖는다.
사용되는 경우 음료의 HIS 총량은 전형적으로 0.001-2% w/w의 범위로 된다. 바람직하게는, HIS의 총량은 0.005-1% w/w의 범위로 된다. 가장 바람직하게는, HIS의 총량은 0.01-0.5% w/w의 범위로 된다.
감미료의 선택은 생산할 음료에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 고강도 감미료(예를 들어 아스파탐, 아세설팜-K 또는 수크랄로스)는 감미료의 에너지 기여가 바람직하지 않은 음료에 사용될 수 있는 반면, 천연 프로파일을 가진 음료의 경우 천연 감미료(예를 들어 스테비올 글리코시드, 소르비톨 또는 수크로스)가 사용될 수 있다.
감미료가 하나 이상의 폴리올 감미료(들)를 포함하거나 심지어 이로 이루어지는 것이 더욱 바람직할 수 있다. 유용한 폴리올 감미료의 비-제한적 예는 말티톨, 만니톨, 락티톨, 소르비톨, 이노시톨, 자일리톨, 트레이톨, 갈락티톨 또는 이의 조합이다. 사용되는 경우, 음료의 폴리올 감미료의 총량은 전형적으로 1-20% w/w의 범위로 된다. 보다 바람직하게는 음료의 폴리올 감미료의 총량은 2-15% w/w의 범위로 된다. 보다 바람직하게는, 폴리올 감미료의 총량은 4-10% w/w의 범위로 될 수 있다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 다음을 포함한다:
- 최대 1% w/w, 보다 바람직하게는, 최대 0.5% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.1% w/w의 탄수화물의 총량, 및
- 0.001-2% w/w의 범위, 보다 바람직하게는 0.005-1% w/w의 범위, 가장 바람직하게는 0.01-0.5% w/w의 범위인 HIS의 총량.
발명의 일부 실시형태에서, 열처리된 음료는 지질을 추가로 포함한다. 발명의 열처리된 음료에서 총 지질 함량은 열처리된 음료의 의도된 용도에 따라 달라진다.
발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 음료의 총 에너지 함량의 0 내지 50%, 또는 바람직하게는 음료의 총 에너지 함량의 0 내지 40%의 범위, 또는 바람직하게는 음료의 총 에너지 함량의 0 내지 30%의 범위, 또는 바람직하게는 음료의 총 에너지 함량의 0 내지 20%의 범위 또는 바람직하게는 음료의 총 에너지 함량의 0 내지 10%의 범위 또는 바람직하게는 음료의 총 에너지 함량의 0 내지 5%의 범위인 지질 함량을 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 음료는 최대 10E%, 보다 바람직하게는 최대 5E%, 가장 바람직하게는 최대 1E%의 지질의 총량을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 영양적으로 불완전한 영양 보충으로서 특히 유용하고, 예를 들어 음료의 총 에너지 함량의 최대 10%, 바람직하게는 최대 1E%의 지질의 총량을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 음료는 최대 10E%, 보다 바람직하게는 최대 5E%, 가장 바람직하게는 최대 1E%의 탄수화물의 총량을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 20℃ 및 300 s-1의 전단 속도에서 최대 200 cP, 보다 바람직하게는 20℃ 및 300 s-1의 전단 속도에서 최대 100 cP, 보다 더 바람직하게는 20℃ 및 300 s-1의 전단 속도에서 최대 50 cP, 가장 바람직하게는 20℃ 및 300 s-1의 전단 속도에서 최대 20 cP의 점도를 갖는다.
발명자들은 발명의 산화된 유청 단백질 조성물이 투명한 음료에 유용하다는 것을 발견했으며, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 최대 400 NTU, 보다 바람직하게는 최대 100 NTU, 보다 더 바람직하게는 최대 50 NTU, 가장 바람직하게는 최대 20 NTU의 탁도를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 예를 들어, 스포츠 음료의 형태에서의 음료는 다음을 포함한다:
- 음료의 중량에 대해 0.5-15% w/w, 더 바람직하게는 음료의 중량에 대해 1-10% w/w, 보다 더 바람직하게는 음료의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 음료의 중량에 대해 3-8% w/w의 범위인 단백질의 총량,
- 음료의 총 에너지 함량(E%)의 최대 75%, 더 바람직하게는 최대 40E%, 보다 더 바람직하게는 최대 10E%, 가장 바람직하게는 최대 5E%의 탄수화물의 총량, 및
- 최대 10E%, 보다 바람직하게는 최대 6E%, 보다 더 바람직하게는 최대 3E%, 가장 바람직하게는 최대 1E%의 지질의 총량.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 예를 들어, 저탄수화물 스포츠 음료의 형태에서의 음료는 다음을 포함한다:
- 음료의 중량에 대해 0.5-15% w/w, 더 바람직하게는 음료의 중량에 대해 1-10% w/w, 보다 더 바람직하게는 음료의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 음료의 중량에 대해 3-8% w/w의 범위인 단백질의 총량,
- 최대 10E%, 보다 바람직하게는 최대 6E%, 보다 더 바람직하게는 최대 3E%, 가장 바람직하게는 최대 1E%의 탄수화물의 총량,
- 최대 5E%, 보다 바람직하게는 최대 4E%, 보다 더 바람직하게는 최대 3E%, 가장 바람직하게는 최대 1E%의 지질의 총량, 및
- 0.001-2% w/w의 범위, 보다 바람직하게는 0.005-1% w/w의 범위, 가장 바람직하게는 0.01-0.5% w/w의 범위인 HIS의 총량.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 예를 들어 영양적으로 완전한 음료 형태에서의 포장된 열처리된 음료는 다음을 포함한다:
- 음료의 중량에 대해 0.5-15% w/w, 더 바람직하게는 음료의 중량에 대해 1-10% w/w, 보다 더 바람직하게는 음료의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 음료의 중량에 대해 3-8% w/w의 범위인 단백질의 총량,
- 음료의 총 에너지 함량의 30-60%의 범위, 가장 바람직하게는 35-50E%의 범위인 탄수화물의 총량 및
- 전체 에너지 함량의 20-50%의 범위, 보다 바람직하게는 25-45E%, 가장 바람직하게는 30-40E%의 범위인 지질의 총량.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 6.2-7.5, 가장 바람직하게는 6.8-7.5의 범위인 pH를 가지고:
- 음료 중량에 대해 0.5-15% w/w, 더 바람직하게는 음료의 중량에 대해 1-10% w/w, 보다 더 바람직하게는 음료의 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 음료의 중량에 대해 3-8% w/w의 범위인 단백질의 총량을 포함하고,
여기서 산화된 유청 단백질 조성물로부터의 단백질은 열처리된 음료의 총 단백질의 적어도 50% w/w, 더 바람직하게는 열처리된 음료의 총 단백질의 적어도 70% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 100% w/w를 제공한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 열처리된 음료는 6.2-7.5, 가장 바람직하게는 6.8-7.5의 범위인 pH를 가지고:
- 음료 중량에 대해 4-15% w/w, 더 바람직하게는 음료의 중량에 대해 5-14% w/w, 보다 더 바람직하게는 음료의 중량에 대해 6-13% w/w, 가장 바람직하게는 음료의 중량에 대해 8-12% w/w의 범위인 단백질의 총량을 포함하고,
여기서 산화된 유청 단백질 조성물로부터의 단백질은 열처리된 음료의 총 단백질의 적어도 50% w/w, 더 바람직하게는 열처리된 음료의 총 단백질의 적어도 70% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 100% w/w를 제공한다.
열처리된 음료의 탄수화물과 지방의 함량은 다양할 것이고 적용에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 예를 들어 스포츠 음료의 형태로 되는 열처리된 음료는 다음을 포함한다:
- 음료의 총 에너지 함량(E%)의 최대 75%, 더 바람직하게는 최대 40E%, 보다 더 바람직하게는 최대 10E%, 보다 더 바람직하게는 최대 5E%, 가장 바람직하게는 최대 1E%의 탄수화물의 총량,
- 최대 10E%, 보다 바람직하게는 최대 6E%, 보다 더 바람직하게는 최대 3E%, 가장 바람직하게는 최대 1E%의 지질의 총량.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 예를 들어 영양적으로 완전한 음료의 형태로 되는 포장된 열처리된 음료는 다음을 포함한다:
- 음료의 총 에너지 함량의 30-60%의 범위, 가장 바람직하게는 35-50E%의 범위인 탄수화물의 총량 및
- 총 에너지 함량의 20-50%의 범위, 보다 바람직하게는 25-45E%, 가장 바람직하게는 30-40E%의 범위인 지질의 총량.
식품, 그리고 특히 열처리된 음료는 바람직하게는 발명의 공정에 의해 얻을 수 있다.
발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 식품 성분에 관한 것이다:
- 본 명세서에 기술된 산화된 유청 단백질 조성물의 고형물, 및
- 바람직하게는 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분(들):
- 유제품 성분, 바람직하게는 비산화된 유제품 성분,
- 식물 기반 성분,
- 비유제품 탄수화물 공급원,
- 향미제, 및/또는
- 감미료(감미 탄수화물/폴리올/HIS).
식품 성분에 관한 추가 세부사항은 아래에 있는 번호가 매겨진 실시형태에 기술되어 있다.
발명의 또 다른 양태는 바람직하게는 5.5-8.5의 범위인 pH를 가지고, 바람직하게는 적어도 3% w/w의 유청 단백질 함량을 가지고, 바람직하게는 간접 열처리를 사용하여 열멸균된, 열멸균된 음료의 냄새를 개선하고/하거나 썩은 계란의 냄새와 유사한 불쾌한 냄새의 수준을 감소시키기 위한 산화된 유청 단백질 조성물, 바람직하게는 발명의 산화된 유청 단백질 조성물의 식품 성분으로서의 용도에 관한 것이다.
발명의 일부 특히 바람직한 실시형태는 다음의 번호가 매겨진 실시형태에서 기술된다.
번호가 매겨진 실시형태 1. 산화된 유청 단백질 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는, 방법:
a) 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고
- 6.5-9.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 1% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 10% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w의 단백질 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-160℃의 범위인 온도이고/이거나
ii) 20-4000bar의 범위인 압력으로 가압되고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하여, 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 15 마이크로몰/g 단백질로 감소시키는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 0-160℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액, 및/또는
II) 20-4000bar의 범위인 압력으로 가압되는 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
c) 임의로, 여전히 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물을 적어도 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 임의로, 여전히 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물를 건조시키는 것.
번호가 매겨진 실시형태 1a. 산화된 유청 단백질 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 다음을 포함하는, 방법
a) 유청 단백질 공급원을 가공하여 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고
- 6.5-9.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 1% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 10% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w의 단백질 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-65℃의 범위인 온도이고/이거나
ii) 100-4000bar의 범위인 압력으로 가압되고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하여, 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 15 마이크로몰/g 단백질로 감소시키는 하나 이상의 조건 하에서 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하는 것으로서, 상기 하나 이상의 조건은:
I) 0-65℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액, 및/또는
II) 100-4000bar의 범위인 압력으로 가압되는 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
c) 임의로, 여전히 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물을 적어도 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 임의로, 여전히 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급물를 건조시키는 것.
번호가 매겨진 실시형태 2. 상기 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 과산화물, 오존, 이산소, 또는 이의 조합을 포함하거나 심지어 이로 이루어지는, 번호가 매겨진 실시형태 1에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 3. 상기 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 과산화수소, 벤조일 퍼옥사이드 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 과산화물인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 4. 상기 산화제는 전기화학적으로 생성되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 5. 상기 산화제는 효소적으로 생성되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 6. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량 사이의 몰비는 적어도 1:2, 보다 바람직하게는 적어도 1:1, 보다 더 바람직하게는 적어도 2:1, 가장 바람직하게는 적어도 3:1인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 7. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의:
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량 사이의 몰비는 1:2-200:1, 더 바람직하게는 1:2-100:1, 보다 더 바람직하게는 1:1-30:1, 가장 바람직하게는 1:1-15:1인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 8. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 7.0-9.5, 보다 바람직하게는 7.1-8.5, 보다 더 바람직하게는 7.2-8.5, 가장 바람직하게는 7.4-8.2의 범위인 pH를 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 9. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 6.5-8.5, 보다 바람직하게는 6.6-8.0, 보다 더 바람직하게는 6.7-7.5, 가장 바람직하게는 6.8-7.3의 범위인 pH를 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 10. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 2% w/w, 보다 바람직하게는 적어도 3% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 5% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 6% w/w의 총 단백질 함량을 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 11. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 1-30% w/w, 보다 바람직하게는 3-20% w/w, 보다 더 바람직하게는 4-15% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 6-10% w/w의 범위인 총 단백질 함량을 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 12. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 1-12% w/w, 보다 바람직하게는 3-11% w/w, 보다 더 바람직하게는 4-10% w/w, 가장 바람직하게는 5-9% w/w의 범위인 총 단백질 함량을 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 13a. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 고형물에 대해 적어도 50% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 75% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 85% w/w의 총 단백질 함량을 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 13b. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 고형물에 대해 30-99% w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 고형물에 대해 50-97% w/w, 보다 더 바람직하게는 75-96% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 85-95% w/w의 범위인 총 단백질 함량을 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 14. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 적어도 20%w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 적어도 40% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 45% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 50% w/w의 BLG 함량을 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 15. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 적어도 55%w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 적어도 60% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 80% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 90% w/w의 BLG 함량을 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 16. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 10-99% w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 45-98% w/w, 보다 더 바람직하게는 80-96% w/w, 가장 바람직하게는 90-95% w/w의 범위인 BLG 함량을 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 17. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 10-90% w/w, 보다 바람직하게는 산화 유청 단백질 용액의 총 단백질에 대해 20-80% w/w, 보다 더 바람직하게는 30-75% w/w, 가장 바람직하게는 45-70% w/w의 범위인 BLG 함량을 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 18. 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 보다 바람직하게는 총 고형물에 대해 최대 0.5% w/w, 보다 더 바람직하게는 최대 0.2% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.1% w/w의 총 지방 함량을 갖는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 19. 조건 i)은 5-65℃, 더 바람직하게는 10-65℃, 보다 바람직하게는 30-60℃, 가장 바람직하게는 40-55℃의 범위인 온도를 갖는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 19a. 조건 i)은 66-160℃, 더 바람직하게는 70-145℃, 보다 더 바람직하게는 75-120℃, 가장 바람직하게는 80-100℃의 범위인 온도를 갖는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 20. 조건 ii)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액에 100-4000bar, 더 바람직하게는 200-3500bar, 보다 더 바람직하게는 300-3000bar, 가장 바람직하게는 500-2500bar의 범위인 압력을 적용하는 것을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 20a. 조건 ii)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액에 25-1000bar, 보다 바람직하게는 30-500bar, 보다 더 바람직하게는 35-300bar, 가장 바람직하게는 40-200bar의 범위인 압력을 적용하는 것을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 21. 단계 a)는 조건 i)를 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 22. 단계 a)는 조건 ii)를 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 23. 단계 a)는 i)과 ii)의 특성 둘 모두를 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 24. 단계 a)에서 유청 단백질 공급원을 가공하는 단계는 다음을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법:
I) 바람직하게는, 유청 단백질 공급원을 적어도 시스테인의 티올을 산화시킬 수 있는 산화제 및 임의로 추가 성분과 조합하거나 혼합함에 의해 접촉시키는 단계,
II) 필요한 경우, 6.5-9.5의 범위인 pH를 얻기 위한 pH 조정
III) 임의로, 20-4000bar의 범위인 압력을 얻기 위한 가압
IV) 임의로, 0-160℃의 범위인 온도로 온도의 조정.
번호가 매겨진 실시형태 24a. 단계 a)에서 유청 단백질 공급원을 가공하는 단계는 다음을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법:
I) 바람직하게는, 유청 단백질 공급원을 적어도 시스테인의 티올을 산화시킬 수 있는 산화제 및 임의로 추가 성분과 조합하거나 혼합함에 의해 접촉시키는 단계,
II) 필요한 경우, 6.5-9.5의 범위인 pH를 얻기 위한 pH 조정
III) 임의로, 100-4000bar의 범위인 압력을 얻기 위한 가압
IV) 임의로, 0-65℃의 범위인 온도로 온도의 조정.
번호가 매겨진 실시형태 25. 단계 b)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 80%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 76%, 보다 더 바람직하게는 최대 73%, 가장 바람직하게는 최대 70%로 감소시키거나 감소시키기 위해 수행되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 26. 단계 b)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 20-80%, 보다 바람직하게는 초기 양의 30-80%, 보다 더 바람직하게는 50-75%, 가장 바람직하게는 최대 60-75%로 감소시키거나 감소시키기 위해 수행되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 27. 단계 b)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 30%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 25%, 보다 더 바람직하게는 최대 20%, 가장 바람직하게는 최대 15%로 감소시키거나 감소시키기 위해 수행되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 28. 단계 b)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 10%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 5%, 보다 더 바람직하게는 최대 3%, 가장 바람직하게는 최대 1%로 감소시키거나 감소시키기 위해 수행되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 29. 단계 b)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 0.01-30%, 보다 바람직하게는 초기 양의 0.02-25%, 보다 더 바람직하게는 0.05-20%, 가장 바람직하게는 0.1-10%로 감소시키거나 감소시키기 위해 수행되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 30. 단계 b)는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 8 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 2 마이크로몰/g 단백질로 감소시키거나 감소시키기 위해 수행되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 31. 단계 b)는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 1 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 0.5 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 0.2 마이크로몰/g 단백질로 감소시키거나 감소시키기 위해 수행되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 32. 단계 b)는 산화 동안 pH를 6.5-9.5, 더 바람직하게는 7.0-8.5, 보다 더 바람직하게는 7.2-8.5, 가장 바람직하게는 7.5-8.5의 범위인 pH로 조정하는 것을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 33.
- 단계 b) 동안 소비되지만 단계 b)의 종료 시 임의의 과잉 산화제의 제거를 배제한 산화제의 양과
- 단계 a)에서 유리 티올 기의 초기 양 사이의 몰비는 1:2-30:1, 더 바람직하게는 1:2-25:1, 보다 더 바람직하게는 1:1-20:1, 가장 바람직하게는 1:1-15:1인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 34.
- 단계 b) 동안 소비되지만 단계 b)의 종료 시 임의의 과잉 산화제의 제거를 배제한 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 양과
- 단계 a)에서 유리 티올 기의 초기 양 사이의 몰비는 2:1-30:1, 더 바람직하게는 3:1-25:1, 보다 더 바람직하게는 4:1-20:1, 가장 바람직하게는 5:1-15:1인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 35.
- 단계 b) 동안 소비되지만 단계 b)의 종료 시 임의의 과잉 산화제의 제거를 배제한 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 양과
- 단계 a)에서 유리 티올 기의 초기 양 사이의 몰비는 1:4-15:1, 더 바람직하게는 1:3-10:1, 보다 더 바람직하게는 1:2-5:1, 가장 바람직하게는 1:2-2:1인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 36. 발명의 방법은 아황산염의 첨가를 포함하지 않고/않거나 아황산염 용리를 포함하지 않는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 37. 단계 b)의 하나 이상의 조건은 I) 5-65℃, 보다 바람직하게는 10-65℃, 보다 더 바람직하게는 30-60℃, 가장 바람직하게는 40-60℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 37a. 단계 b)의 하나 이상의 조건은 I) 66-160℃, 보다 바람직하게는 70-145℃, 보다 더 바람직하게는 75-120℃, 가장 바람직하게는 80-100℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 38. 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 온도는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 80%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 76%, 보다 더 바람직하게는 최대 73%, 가장 바람직하게는 최대 70%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 내로 유지되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 39. 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 온도는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 20-80%, 보다 바람직하게는 초기 양의 30-80%, 보다 더 바람직하게는 50-75%, 가장 바람직하게는 60-75%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 내로 유지되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 40. 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 온도는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 30%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 25%, 보다 더 바람직하게는 최대 20%, 가장 바람직하게는 최대 15%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 온도 범위 내로 유지되는, 번호가 매겨진 실시형태 38에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 41. 단계 b)의 조건은 II) 산화 유청 단백질 용액에 100-4000bar, 보다 바람직하게는 200-3500bar, 보다 더 바람직하게는 300-3000bar, 가장 바람직하게는 500-2500bar의 범위인 압력을 적용하는 것을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 41a. 단계 b)의 조건은 II) 산화 유청 단백질 용액에 25-1000bar, 더 바람직하게는 30-500bar, 보다 더 바람직하게는 35-300bar, 가장 바람직하게는 40-200bar의 범위인 압력을 적용하는 것을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 42. 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 압력은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 80%, 보다 바람직하게는 초기 양의 최대 76%, 보다 더 바람직하게는 최대 73%, 가장 바람직하게는 최대 70%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 압력 범위 내에서 유지되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 43. 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액의 압력은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 20-80%, 더 바람직하게는 초기 양의 30-80%, 보다 더 바람직하게는 50-75%, 가장 바람직하게는 60-75%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 원하는 압력 범위 내에서 유지되는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 44. 단계 b)의 산화 유청 단백질 용액은 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을 초기 양의 최대 30%, 더 바람직하게는 초기 양의 최대 25%, 보다 더 바람직하게는 최대 20%, 가장 바람직하게는 최대 15%로 감소시키기에 충분한 기간 동안 압력에 적용시키는, 번호가 매겨진 실시형태 42에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 45. 단계 b)는 최대 분당 2℃, 더 바람직하게는 분당 최대 1℃, 보다 더 바람직하게는 분당 최대 0.3℃, 가장 바람직하게는 분당 최대 0.1℃의 가열 속도로 단계 b) 동안 산화 유청 단백질 용액의 온도를 최대 산화 온도로 증가시키는 것을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 46. 단계 b)는 단계 b) 동안 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 추가의 산화제를 첨가하거나 생성하는 것을 포함하지 않는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 47. 단계 b)는 단계 b) 동안 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 추가의 산화제를 첨가하거나 생성하는 것을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 48. 단계 b)의 기간은 최대 48시간, 보다 바람직하게는 최대 36시간, 보다 더 바람직하게는 최대 30시간, 가장 바람직하게는 최대 25시간인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 49. 단계 b)의 기간은 0.1-48시간, 보다 바람직하게는 3-36시간, 보다 더 바람직하게는 5-30시간, 가장 바람직하게는 10-25시간인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 50. 단계 b)의 기간은 최대 12시간, 더 바람직하게는 최대 6시간, 보다 더 바람직하게는 최대 3시간, 가장 바람직하게는 최대 1시간인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 50a. 단계 b)의 기간은 최대 10분, 보다 바람직하게는 최대 6분, 보다 더 바람직하게는 최대 3분, 가장 바람직하게는 최대 2분인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 51. 단계 b)의 기간은 0.1-12시간, 보다 바람직하게는 0.1-6시간, 보다 더 바람직하게는 0.1-3시간, 가장 바람직하게는 0.1-1시간인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 51a. 단계 b)의 기간은 0.1초 - 10분, 보다 바람직하게는 1초 - 6분, 보다 더 바람직하게는 5초 - 3분, 가장 바람직하게는 10초 - 2분인, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 52. 단계 b)는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제가 실질적으로 모두 사용될 때까지 산화를 진행시키는 것을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 53. 단계 b)는 산화 유청 단백질 용액을 구성요소, 바람직하게는 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 잔류 산화제를 제거하는 카탈라아제와 접촉시킴에 의해 산화를 중단시키는 것을 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 54. 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을 열처리 단계에 적용시키는 것을 포함하는 c)를 추가로 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
번호가 매겨진 실시형태 55. 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 적어도 단백질을 포함하는 액체 공급물을 건조하는 단계 d)를 추가로 포함하는, 이전 번호가 매겨진 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법.
실시형태 56. 다음을 갖는 산화된 유청 단백질 조성물:
- 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w의 단백질 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 지방 함량,
- 최대 15 마이크로몰의 유리 티올 기/g 단백질,
- 바람직하게는, 총 단백질에 대해 적어도 0.7% w/w의 트립토판 함량,
- 바람직하게는, 총 단백질에 대해 적어도 0.3% w/w의 메티오닌 함량,
- 바람직하게는, 최대 0.2 마이크로그램/mg 단백질의 키누레닌 함량,
- 바람직하게는, 100-600 마이크로몰/g 단백질의 범위인 단백질 결합 황의 함량, 및
- 바람직하게는, 150-400 마이크로몰/g 단백질의 범위인 이황화 결합을 형성하는 단백질 결합 시스테인 잔기의 함량.
번호가 매겨진 실시형태 57. 본 명세서에 기술된 유청 단백질 공급원의 산화, 바람직하게는 번호가 매겨진 실시형태 1-49 중 하나 이상에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는, 번호가 매겨진 실시형태 56에 따른 산화된 유청 단백질 조성물.
번호가 매겨진 실시형태 58. 액체 또는 고체, 그리고 바람직하게는 분말의 형태로 되는, 번호가 매겨진 실시형태 56-57 중 어느 하나에 따른 산화된 유청 단백질 조성물.
번호가 매겨진 실시형태 59. 다음을 포함하는 식품을 생산하는 공정:
- 산화된 유청 단백질 조성물을 가공하는 단계, 및/또는
- 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물 또는 가공된 산화된 유청 단백질 조성물을 하나 이상의 추가 성분과 조합하고, 임의로 조합을 가공하는 단계.
번호가 매겨진 실시형태 60. pH가 5.5-8.5, 보다 바람직하게는 6.5-7.5인 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료를 생산하는 공정으로서, 상기 공정은 다음을 포함하는, 공정:
1) 번호가 매겨진 실시형태 50-52 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물을 하나 이상의 추가 성분과 조합하여 pH가 5.5-8.5인 액체 혼합물을 얻고, 액체 혼합물은 다음을 포함하는 단계:
- 적어도 0.5% w/w 단백질을 차지하기에 충분한 양으로 산화된 유청 단백질 조성물,
- 바람직하게는, 감미료 및/또는 향미료, 및
- 물,
2) 액체 혼합물을 용기에 포장하는 것으로서,
여기서 액체 혼합물은 포장 이전 및/또는 포장 후에 열멸균 처리되는, 단계.
번호가 매겨진 실시형태 61. 열멸균 이전 액체 혼합물은 최대 60 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 보다 바람직하게는 최대 40 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 보다 더 바람직하게는 최대 30 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 가장 바람직하게는 최대 30 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물을 함유하는, 번호가 매겨진 실시형태 60에 따른 공정.
번호가 매겨진 실시형태 62. 열멸균 이전 액체 혼합물은 최대 20 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 보다 바람직하게는 최대 15 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 보다 더 바람직하게는 최대 10 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰 유리 티올 기/100g 액체 혼합물을 함유하는, 번호가 매겨진 실시형태 60 또는 61에 따르는 공정.
번호가 매겨진 실시형태 63. 번호가 매겨진 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화 유청 단백질 조성물을 바람직하게는 식품의 중량에 대해 적어도 0.5% w/w의 양으로 단백질을 차지하는 양으로 포함하는 식품.
번호가 매겨진 실시형태 64. pH가 5.5-8.5, 보다 바람직하게는 6.5-7.5인 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료로서, 상기 음료는 번호가 매겨진 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물을 적어도 0.5% w/w 단백질을 차지하기에 충분한 양으로 포함하는, 음료.
번호가 매겨진 실시형태 65. 최대 5 마이크로몰/L, 보다 바람직하게는 3 마이크로몰/L, 보다 더 바람직하게는 1.0 마이크로몰/L, 가장 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/L의 H2S의 함량을 갖는 번호가 매겨진 실시형태 64에 따른 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료.
번호가 매겨진 실시형태 66. 생성 1시간 후에 최대 5 마이크로몰/L, 더 바람직하게는 3 마이크로몰/L, 보다 더 바람직하게는 1.0 마이크로몰/L, 가장 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/L의 H2S의 함량을 갖는 번호가 매겨진 실시형태 64 또는 65에 따른 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료.
번호가 매겨진 실시형태 67. 생성 7일 후에 최대 5 마이크로몰/L, 보다 바람직하게는 3 마이크로몰/L, 보다 더 바람직하게는 1.0 마이크로몰/L, 가장 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/L의 H2S의 함량을 갖는 번호가 매겨진 실시형태 64-66 중 어느 하나에 따른 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료.
번호가 매겨진 실시형태 68. 음료의 중량에 대해 0.5-15% w/w, 보다 바람직하게는 음료 중량에 대해 1-10% w/w, 보다 더 바람직하게는 음료 중량에 대해 2-9% w/w, 가장 바람직하게는 음료의 중량에 대해 3-8% w/w의 범위인 단백질의 총량을 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 64-67 중 어느 하나에 따른 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료.
번호가 매겨진 실시형태 69. 열처리된 음료의 총 단백질의 적어도 30% w/w, 보다 바람직하게는 총 단백질의 적어도 50% w/w, 보다 더 바람직하게는 총 단백질의 적어도 70% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질의 적어도 80% w/w를 차지하기에 충분한 양으로 번호가 매겨진 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물을 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 64-68 중 어느 하나에 따른 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료.
번호가 매겨진 실시형태 70. 열처리된 음료의 총 단백질의 적어도 90% w/w, 보다 바람직하게는 총 단백질의 적어도 95% w/w, 보다 더 바람직하게는 총 단백질의 적어도 99% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질의 100% w/w를 차지하기에 충분한 양으로 번호가 매겨진 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물을 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 64-69 중 어느 하나에 따른 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료.
번호가 매겨진 실시형태 71. 총 고형물에 대해 적어도 50% w/w, 보다 바람직하게는 총 고형물에 대해 적어도 60% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 70% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 80% w/w의 양으로 총 단백질을 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 64-70 중 어느 하나에 따른 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료.
번호가 매겨진 실시형태 72. 총 고형물에 대해 적어도 80% w/w, 보다 바람직하게는 총 고형물에 대해 적어도 90% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 92% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 94% w/w의 양으로 총 단백질을 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 64-71 중 어느 하나에 따른 열처리된, 바람직하게는 열멸균된 음료.
번호가 매겨진 실시형태 73. 0.5-50% w/w, 보다 바람직하게는 1-35% w/w, 보다 더 바람직하게는 2-20% w/w, 가장 바람직하게는 3-10% w/w의 고형물 함량을 갖는 번호가 매겨진 실시형태 64-72 중 어느 하나에 따른 열처리된, 바람직하게는, 열멸균된 음료.
번호가 매겨진 실시형태 74. 번호가 매겨진 실시형태 60-62 중 하나 이상에 따른 공정에 따라 얻을 수 있는 번호가 매겨진 실시형태 63-73 중 어느 하나에 따른 식품.
번호가 매겨진 실시형태 75. 다음을 포함하는 식품 성분:
- 번호가 매겨진 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물의 고형물, 및
- 바람직하게는 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분(들):
- 유제품 성분, 바람직하게는 비산화된 유제품 성분,
- 식물 기반 성분,
- 비유제품 탄수화물 공급원,
- 향미제, 및/또는
- 감미료(감미 탄수화물/폴리올/HIS).
번호가 매겨진 실시형태 76. 하나 이상의 추가 성분(들)은 미셀 카세인, 비산화된 유청 단백질, 카세인마크로펩티드, 우유 또는 유청의 한외여과 투과물, 변성된 유청 단백질 및 이의 조합 중 하나 이상을 포함하는 유제품 성분을 포함하는, 번호가 매겨진 실시형태 75에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 77. 하나 이상의 추가 성분(들)은 바람직하게는 대두 단백질, 완두콩 단백질, 식물 기반 식이섬유 및 이의 조합 중 하나 이상을 포함하는 식물 기반 성분을 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 75 또는 76에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 78. 하나 이상의 추가 성분(들)은 바람직하게는 수크로스, 말토덱스트린, 비유제품 올리고당, 비유제품 다당류 중 하나 이상을 포함하는 비유제품 탄수화물 공급원을 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 75-77 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 79. 하나 이상의 추가 성분(들)은 바람직하게는 탄수화물 감미료, 폴리올, 고강도 감미료 및 이의 조합 중 하나 이상을 포함하는 감미료를 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 75-78 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 80. 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물의 고형물은 식품 성분의 중량의 0.5-95% w/w, 더 바람직하게는 식품 성분의 중량의 1-90% w/w, 보다 더 바람직하게는 5-85% w/w, 가장 바람직하게는 10-80% w/w를 차지하는 번호가 매겨진 실시형태 75-79 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
본 발명의 맥락에서, 용어 "산화된 유청 단백질 조성물의 고형물"은 산화된 유청 단백질 조성물로부터 모든 물이 제거되는 경우 남아 있는 고형 물질(단백질, 탄수화물, 지질 및 미네랄 포함)에 관한 것이다. "산화된 유청 단백질 조성물의 고형물"은 예를 들어 분말의 형태 또는 액체의 형태에서의 산화된 유청 단백질 조성물로 제공될 수 있다.
번호가 매겨진 실시형태 81. 번호가 매겨진 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물의 고형물은 식품 성분의 중량의 0.5-60% w/w, 더 바람직하게는 식품 성분의 중량의 1-50% w/w, 보다 더 바람직하게는 5-40% w/w, 가장 바람직하게는 10-30% w/w를 차지하는 번호가 매겨진 실시형태 75-80 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 82. 번호가 매겨진 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물의 고형물은 식품 성분의 단백질의 0.5-95% w/w, 더 바람직하게는 식품 성분의 단백질의 1-90% w/w, 보다 더 바람직하게는 5-85% w/w, 가장 바람직하게는 10-80% w/w를 차지하는 번호가 매겨진 실시형태 75-81 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 83. 번호가 매겨진 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물의 고형물은 식품 성분의 단백질의 0.5-60% w/w, 더 바람직하게는 식품 성분의 단백질의 1-50% w/w, 보다 더 바람직하게는 5-40% w/w, 가장 바람직하게는 10-30% w/w를 차지하는 번호가 매겨진 실시형태 75-82 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 84. 최대 15 마이크로몰/g 단백질, 더 바람직하게는 최대 14 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 13 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 12 마이크로몰/g 단백질의 양으로 유리 티올 기를 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 75-83 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 85. 0.001-15 마이크로몰/g 단백질, 더 바람직하게는 0.01-14 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.01-13 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 0.01-12 마이크로몰/g 단백질의 양으로 유리 티올 기를 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 75-84 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 86. 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 8 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 2 마이크로몰/g 단백질의 양으로 유리 티올 기를 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 75-85 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 87. 0.01-10 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 0.01-8 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 0.01-5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 0.01-3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 0.01-2 마이크로몰/g 단백질의 양으로 유리 티올 기를 포함하는 번호가 매겨진 실시형태 75-86 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 88. 바람직하게는 주 용매로서 물을 사용하고, 보다 바람직하게는 물을 유일한 용매로 사용하는, 액체의 형태로 되는 번호가 매겨진 실시형태 75-87 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 89. 바람직하게는 최대 6% w/w의 양으로 물을 포함하는, 분말의 형태로 되는 번호가 매겨진 실시형태 75-87 중 어느 하나에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 90. 분말은 분말의 형태인 번호가 매겨진 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물과 분말 형태인 하나 이상의 추가 성분(들)과의 건식-블렌딩에 의해 제조되는 번호가 매겨진 실시형태 89에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 91. 분말은 번호가 매겨진 실시형태 88에 따라 액체를 건조함에 의해, 바람직하게는 분무 건조에 의해 제조되는 번호가 매겨진 실시형태 89에 따른 식품 성분.
번호가 매겨진 실시형태 100. 바람직하게는 냄새를 개선하고/하거나, 5.5-8.5의 범위인 pH를 가지고 바람직하게는 적어도 3% w/w의 유청 단백질 함량을 갖는 열멸균된 음료의 썩은 계란의 냄새와 유사한 불쾌한 냄새를 감소시키기 위한, 그리고 바람직하게는 간접 열처리를 사용하여-열 멸균된, 식품 성분으로서의 산화된 유청 단백질 조성물, 바람직하게는 번호가 매겨진 실시형태 56-58 중 하나 이상에 따른 산화된 유청 단백질 조성물의 용도.
본 발명은 특정 실시형태를 참조하여 상기에 기술되었다. 그러나, 상기에 기술된 것 이외의 다른 실시형태도 발명의 범주 내에서 동일하게 가능하다. 발명의 다양한 실시형태 및 양태의 다양한 특성 및 단계는 달리 언급되지 않는 한 본 명세서에 기술된 것과 다른 방식으로 조합될 수 있다.
실시예
분석의 방법
분석 A: 총 단백질
샘플의 총 단백질 함량(진성 단백질)은 다음에 의해 결정된다:
1) ISO 8968-1/2|IDF 020-1/2-우유-질소 함량의 측정에 따른 샘플의 총 질소 측정 - 파트 1/2: 킬달 방법을 사용한 질소 함량의 측정.
2) ISO 8968-4|IDF 020-4-우유-질소 함량의 측정에 따른 샘플의 비-단백질 질소 측정 - 파트 4: 비-단백질-질소 함량의 측정.
3) (m총질소 - m비-단백질-질소)*6.38로 총 단백질량 계산.
분석 B: pH
모든 pH 값은 pH 유리 전극을 사용하여 측정되고 25℃로 정규화된다. pH 유리 전극(온도 보상을 가짐)은 사용하기 전에 조심스럽게 헹구어지고 보정된다.
샘플이 액체 형태인 경우 pH는 액체 용액에서 직접적으로 측정되고 25℃로 정규화된다.
샘플이 분말인 경우, 10g의 분말이 탈염수 90ml에 실온에서 세게 저으면서 용해된다. 그런 다음 용액의 pH가 측정되고 25℃로 정규화된다.
분석 C: 점도
점도는 Gilson에 의한 Viscoman을 사용하여 22℃에서 추정되었고 약 300s-1의 전단 속도에서 보고되었다.
분석 D: H
2
S 센서를 사용한 H
2
S 정량화
H2S의 수준은 단일 채널 증폭기(Monometer-9514, Unisense A/S, 덴마크 소재)에 연결된 마이크로센서(SULF-NPLR, 바늘형, Unisense A/S, 덴마크 소재)에 의해 측정되었다. 획득된 H2S 신호는 샘플에서 H2S 수준의 지표로 사용될 수 있는 밀리 볼트로 표시되고 Unisense A/S에서 제공하는 소프트웨어 "LOGGER"에 로깅된다. 마이크로센서는 사용 전에 제조업체(Calkit-H2S, Unisense A/S, 덴마크 소재)에서 제공한 H2S 보정 키트로 매일 보정되었다. 보정 키트에서 가장 높은 농도의 H2S는 설명서(2020년 11월 버전, Unisense A/S)의 섹션 7에 따라 10배수 더 희석되었다. H2S의 농도는 소프트웨어에 의해 자동적으로 μM의 단위로 변환될 수 있다.
시뮬레이션 또는 파일럿-규모 UHT에서 샘플을 측정하기 위해, 샘플을 20℃에서 30분 동안 평형화하고 센서 바늘을 실리콘 밀봉을 통해 샘플의 액상 안으로 뚫었다. 각 샘플에 대해 삼중 실험을 수행했다.
분석 E: 유리 티올 기 및 총 티올 기
유청 단백질 샘플에서 유리 및 총 티올 기의 함량은 저자가 사용하는 것과 동일한 장비를 사용하여 Kurz 등(2020)에 의해 기술된 방법을 사용하여 정량화되었다. 샘플에서 유리 티올(SH) 함량은 전형적으로 단백질의 그램당 마이크로몰로 보고되며 단백질 함량은 분석 A의 총 단백질 방법에 의해 결정된다.
Kurz, F., Hengst, C., & Kulozik, U. (2020). 천연 유청 단백질과 열응집된 유청 단백질에서 유리 및 총 티올 기의 동시적 정량화를 위한 RP-HPLC 방법. MethodsX, 101112.
분석 F1: 아미노산의 정량화
아미노산은 Zainudin MAM, Poojary MM, Jongberg S, Lund MN. Light exposure accelerates oxidative protein polymerization in beef stored in high oxygen atmosphere. Food Chem. 299 (2019) 125132에 기술된 방법으로 정량화되었다.
모두 준비 후 즉시 -80℃로 동결하고 드라이아이스로 운반한 후 분석할 때까지 다시 -80℃에서 보관했다.
0.5mg 단백질을 진공에서 Pico Tag 가수분해 바이알에서 탈기된 4M 메탄설폰산(0.2% w/v 트립타민을 가짐)을 사용하여 110℃에서 17시간 30분 동안 가수분해했다.
중화된 건조 가수분해물을 아미노아크프로산(내부 표준)과 혼합하고 o-프탈알데히드/3-머캅토프로피온산 및 플루오레닐메틸옥시카르보닐 클로라이드로 유도체화했다. Agilent AdvanceBio AAA 컬럼이 장착된 UHPLC-FLD 시스템을 사용하여 유도체화된 아미노산을 분석했다. 각 아미노산의 정량화(내부 표준 보정)는 실제 표준을 사용하여 구성된 8점 보정 곡선을 기반으로 수행되었다.
분석 F2: 아미노산 산화의 정량화
단백질 산화 생성물은 Mahesha M. Poojary, Brijesh K. Tiwari, Marianne N. Lund, Selective and sensitive UHPLC-ESI-Orbitrap MS method to quantify protein oxidation markers, Talanta Volume 234 (2021), 122700에 기술된 방법에 의해 측정되었다.
분석에 의해 분석된 모든 샘플은 준비 직후 -80℃로 동결하고 드라이아이스로 운반한 후 분석할 때까지 다시 -80℃에서 보관했다.
0.5mg의 단백질을 진공에서 Pico Tag 가수분해 바이알에서 탈기된 4M 메탄설폰산(0.2% w/v 트립타민을 가짐)을 사용하여 110℃에서 17시간 30분 동안 가수분해했다.
중화된 건조 가수분해물을 5-메틸트립토판(내부 표준)과 혼합하고 Waters Aquity HSS T3 컬럼이 장착된 UHPLC-FLD 시스템을 사용하여 분석했다.
각 아미노산의 정량화(내부 표준 보정)는 실제 표준을 사용하여 구성된 8점 보정 곡선을 기반으로 수행되었다.
분석 G: GPC 분석에 의한 산화 후의 분자량 및 고유 점도의 결정
유청 단백질 샘플에서 단백질 종의 분자량은 Thermo ISO.3100SD 펌프, WPS-3000TSL 자동샘플러 및 Refractomax 521 굴절률 검출기로 본질적으로 이루어진 SEC-MALS-IV-RI HPLC 시스템을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 시스템에는 Wyatt miniDawn TREOS II 광 산란 검출기 및 Wyatt Viscostar 온라인 점도계가 추가로 장착되었다.
모든 샘플은 용리액(10mM 인산염, 30mM NaCl pH 7.0 및 0.1% 프로클린)에서 1% 단백질로 희석되었고 1x Bio-SEC-5 가드 + 2x300Å BioSEC-5를 사용하여 0.75ml/분의 속도로 용리액에서 10μl가 분리되었다.
기기는 aLA, BLG 및 BSA 표준의 10% 이내에서 결과를 잘 제공한다.
데이터 분석: 중량-평균 분자량 및 중량-평균 고유 점도는 Astra 소프트웨어[v7.3.2.19]를 사용하여 공극 부피 앞에서 용리되는 모든 신호, 즉 단량체, 올리고머 둘 모두와 더 큰 응집체 종의 통합에 의해 결정되었다.
분석 H: 잔류 과산화수소의 결정
잔류 과산화수소는 Synergy Mx 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 제조업체 설명(Abcam ab102500 과산화수소 검정 키트(색도계/형광계; 버전 6 최종 업데이트 2019년 1월 8일)에 따른 정량적 비색 검정을 사용하여 결정되었다.
모든 샘플은, 검정 키트로 공급된 H2O2 표준을 사용하여, 50μl 샘플에서 잔류 H2O2 농도가 검정의 선형 범위, 예를 들어 0-5nmol H2O2/웰 내에 있도록 하기 위해 처음에 첨가된 H2O2의 양에 비례하여 10mM 인산 pH 7.0에서 희석되었다.
0-5nmol H2O2/웰을 함유하는 검량 곡선은 검정 키트로 공급된 H2O2 표준을 사용하여 제조업체의 설명에 따라 설정되었다.
샘플에서 H2O2의 농도는 검량 곡선과 샘플 희석으로부터 결정되었다.
분석 I: 유청 단백질 샘플에서 비-환원가능 란티오닌과 리시노알라닌 교차-결합의 정량화
WPI 샘플에서 란티오닌의 양은 Mahesha M. Poojary 등, "Liquid chromatography quadrupole-Orbitrap mass spectrometry for the simultaneous analysis of advanced glycation end products and protein-derived cross-links in food and biological matrices," Journal of Chromatography A, Volume 1615, 2020 with the modification of using columns and solvents from analysis F2에 기술된 바와 같이 결정되었다.
분석 I에 의해 분석된 모든 샘플은 준비 직후 -80℃로 동결하고 드라이아이스로 운반한 후 분석할 때까지 다시 -80℃에서 보관했다.
간단히 말하면, 0.5mg 단백질에 상응하는 샘플을 진공에서 Pico Tag 가수분해 바이알에서 탈기된 6M 염산(티오글리콜산을 가짐)을 사용하여 110℃에서 22시간 동안 가수분해했다.
건조된 가수분해물을 라이신-d4(내부 표준)와 혼합하고 Waters Aquity HSS T3 컬럼이 장착된 LC-MS 시스템을 사용하여 분석했다. LAL 및 LAN의 정량화(내부 표준 보정)는 실제 표준을 사용하여 구성된 8점 보정 곡선을 기반으로 수행되었다.
분석 J: 열적으로 처리된 샘플에서 비-H2S 냄새의 결정
가스 크로마토그래피를 사용한 분리와 질량 분광학을 사용한 식별을 조합한 Dynamic Headspace 샘플링 방법을 사용하여 유청 단백질 음료에서 비-H2S 냄새에 대해 분석되었다. 음료에서 비-H2S 냄새는 모두 3회 측정되었다.
샘플은 실시예 1에 기술된 대로 UHT 처리를 거치고 분석 D에 따라 H2S의 함량이 결정되었다. 여러 개의 열적으로 처리된 바이알에서 샘플을 수집하여 5mL 샘플을 100mL 파란색-캡 플라스크로 옮겼다. 100ppm 2-헥사논-5-메틸 내부 표준 용액 1.5uL를 최종 농도 30ppb에 도달하도록 첨가했다.
흡착 트랩(Tenax TA/Graphitized Carbon/Carboxen 1000, Restek Corporation)을 병에 부착하고 음료를 자동 온도 조절이 가능한 20℃ 수조에 넣고 교반하면서 100ml/분 질소로 1시간 동안 스파링했다.
흡착 트랩은 Tenax TA 60/80(Sigma-Aldrich) 및 Carbopack X(Sigma Aldrich)가 충전된 콜드 트랩(Perkin Elmer)으로 50ml/분 수소 흐름을 사용하여 15분 동안 300℃에서 탈착되었다(Turbomatrix ATD 350, Perkin Elmer). 탈착된 휘발성물질을 4℃에서 15분 동안 집중시킨 다음 3:1 분할을 사용하여 트랩의 온도를 300℃로 올려 이송 라인을 통해 가스 크로마토그래프 컬럼 상에 주입했다. 가스 크로마토그래프(Agilent Technologies, 7890A GC-MS)에는 DB-Wax 컬럼(30m × 250um, 필름 두께 0,25um, Agilent Technologies)이 장착되었다.
구배 프로그램에는 35℃에서 10분 동안 등온 단계, 8℃/분으로 240℃까지 상승한 후 5분 등온 단계가 포함되었다. GC는 단일 사중극 질량 분석기(5975C Agilent Technologies)에 연결되었다. MS 이송 라인 온도는 250℃이고 이온 공급원 온도는 200℃였다. 질량 분석기는 20-400의 질량 대 전하(m/z) 범위에 걸쳐 스캔되었고 스펙트럼은 70eV의 단편화 전압을 사용하여 얻어졌다.
MS 데이터베이스(NIST MS 검색 버전 2.0)를 사용하여 휘발성 화합물을 식별했다. 부가하여, 모든 화합물은 실제 참조 화합물과 질량 스펙트럼 데이터 및 체류 시간의 비교에 의해 검증되었다. 식별된 휘발성 화합물의 양은 내부 표준인 2-헥사논-5-메틸의 농도와 피크 면적을 사용하는 반-정량적 접근법을 사용하여 계산되었다.
분석 K: UHT 처리된 유청 단백질 단리물의 관능 평가
UHT 처리된 음료의 관능 분석은 오르후스 대학교 식품과학과에서 수행되었다.
최종 시음/방향 세션 이전에 속성 목록이 작성되었다. 속성은 0 = 낮은 강도, 15 = 높은 강도로 15cm 규모로 등급되었다.
냄새 평가:
생성물의 냄새 화합물의 휘발성으로 인해 샘플은 원래의 병에 담겨 제공되었다. 패널리스트들은 스스로 병을 개봉하고 냄새를 평가해야 했다. 모든 패널리스트와 매번 다른 반복에 대해 새로운 병이 사용되었다.
풍미 및 식감 평가:
음료의 풍미는 비강 냄새 효과를 배제하여 평가되었다. 이 노력의 일환으로 평가 중에 휘발성 물질이 가능한 한 적게 존재하는 것을 확실히 하기 위해 샘플을 한 시간 동안 열어 두었다. 부가하여, 샘플은 빨대가 있는 작은 플라스틱 컵에 제공되었다. 이 방식으로 패널리스트들이 시음할 때 샘플의 냄새를 직접적으로 맡지 않게 되었다. 부가하여 패널리스트는 샘플의 이 풍미 평가를 위해 타구/스피팅 컵을 사용했다.
통계 분석은 30개의 다중 반복에 대해 'Panelcheck' 소프트웨어에서 3-원 ANOVA 테스트를 사용하여 수행되었다. 샘플은 고정되었고 패널은 무작위로 설정되었다.
최소 유의차 값(문자와 연관된 그룹의 쌍별 비교)을 암시하는 Duncan 테스트(사용된 소프트웨어: XLSTAT)를 사용하여 샘플 간의 유의한 차이를 평가했다.
분석 L: RP-HPLC 분석에 의한 천연 BLG/ALA/CMP의 정량화
단백질 샘플/분말은 MQ 물에 단백질을 2%로 희석하여 준비했다. 용액을 0.22μm 필터를 통해 여과하여 단백질 덩어리를 제거한다. 각 샘플에 대해 UPLC 컬럼(단백질 BEH C4; 300Å; 1.7μm; 150 × 2.1mm)이 있는 UPLC 시스템(ACQUITY UPLC H-Class, WATERS) 상에 동일한 부피를 장입하고 214nm에서 검출했다.
샘플은 다음 조건을 사용하여 실행되었다:
완충액 A: Milli-Q 물, 0.1%w/w TFA
완충액 B: HPLC 등급 아세토니트릴, 0.1%w/w TFA
흐름: 0.4ml/분
구배: 0-6.00분 24-45%B; 6.00-6.50분 45-90%B; 6.50-7.00분 90%B; 7.00-7.50분 90-24%B 및 7.50-10.00분 24%B.
BLG/ALA/CMP 피크의 면적은 순수 BLG/ALA/CMP 단백질 표준(BLG Sigma L0130)을 사용하여 준비된 표준 곡선을 사용하여 BLG/ALA/CMP 단백질의 양을 정량화하는데 사용되었다. 샘플을 추가로 희석하고 선형 범위를 벗어나면 재주입했다.
분석 M: 총 고형물의 정량화
용액의 총 고형물은 NMKL 110 2 Edition, 2005(총 고형물(물) ― 우유 및 유제품에서의 중량 결정)에 따라 결정될 수 있다. NMKL은 "Nordisk Metodikkomite for "에 대한 약어이다.
용액의 물 함량은 100% 마이너스 총 고형물의 상대적 양으로 계산될 수 있다(% w/w).
분석 N: 지방 함량의 정량화
지질의 양은 ISO 1211:2010(지방 함량의 결정 - 중량측정 방법)에 따라 결정된다.
분석 O: 락토스 함량의 정량화
락토스의 총량은 ISO 5765-2:2002(IDF 79-2: 2002) "분유, 건조 얼음-혼합물 및 가공 치즈 - 락토스 함량의 결정 - 파트 2: 락토스의 갈락토스 모이어티를 활용한 효소적 방법"에 따라 결정된다.
분석 P: 미네랄 조성의 특성화
칼슘, 마그네슘, 나트륨, 칼륨, 인의 총량은 샘플을 마이크로웨이브 단리를 사용하여 먼저 분해한 다음 ICP 장치를 사용하여 미네랄(들)의 총량을 결정하는 절차를 사용하여 결정된다.
장치:
전자레인지는 Anton Paar로부터의 것이고 ICP는 PerkinElmer Inc.로부터의 Optima 2000DV이다.
재료:
1M HNO3
2% HNO3 중 이트륨
5% HNO3 중 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 칼륨 및 인에 대한 적합한 표준
전처리:
0.2 그램의 분말 샘플 또는 1g의 액체 샘플을 칭량하고 분말을 마이크로파 분해 튜브로 옮긴다. 1M HNO3 5mL를 추가한다. 마이크로파 지침에 따라 마이크로파에서 샘플을 분해한다. 분해된 튜브를 증기 찬장에 넣고 뚜껑을 제거하고 휘발성 증기가 증발하도록 한다.
측정 절차:
알려진 양의 Milli-Q 물을 사용하여 전처리된 샘플을 DigiTUBE로 옮긴다. 2% HNO3에서 이트륨의 용액을 분해 튜브에 추가하고(50mL 희석된 샘플당 약 0.25mL) Milli-Q 물을 사용하여 알려진 부피로 희석한다. 제조업체에 의해 기술된 절차를 사용하여 ICP에서 샘플을 분석한다.
Milli-Q 물을 사용하여 1M HNO3 10mL와 2% HNO3에서 이트륨의 용액 0.5mL의 혼합물을 최종 부피 100mL로 희석하여 블라인드 샘플을 제조한다.
예상된 샘플 농도를 괄호에 넣은 농도를 갖는 적어도 3개의 표준 샘플을 제조한다.
액체 샘플의 검출 한계는 Ca, Na, K 및 인의 경우 0.005g/100g 샘플이고 Mg의 경우 0.0005g/100g 샘플이다. 분말 샘플의 검출 한계는 Ca, Na, K 및 Pho의 경우 0.025g/100g 샘플이고 Mg의 경우 0.0005g/100g 샘플이다.
분석 Q: 탁도의 결정
탁도는 공기에서의 연기와 유사하게 일반적으로 육안으로 볼 수 없는 많은 수의 입자에 의해 야기되는 유체의 흐림 또는 탁함이다.
탁도는 네펠로메트릭 탁도 단위(NTU)로 측정된다.
20mL 음료/샘플을 NTU-유리에 추가하고 Turbiquant® 3000 IR 탁도계에 넣었다. NTU-값은 안정화 후 측정되었고 2회 반복되었다.
실시예 1: pH 8.0 및 저온에서 온화한 티올 산화
이 실험에서, 발명자들은 초기 발견을 문서화하고 pH 8.0에서 유청 단백질의 유리 티올의 온화한 저온 산화에 의해 pH-중성, UHT 처리된 유청 단백질 음료의 썩은 계란 냄새와 유사한 불쾌한 냄새를 줄이거나 제거할 수 있는 가능성을 입증했다.
본 실시예 및 다음 실시예에서 "불쾌한 냄새"에 대한 언급은 썩은 계란 냄새와 유사한 불쾌한 냄새를 의미한다.
재료 및 방법:
분말 WPI-A(99.6% 천연 BLG) 및 WPI-B(50% BLG)를 각각 기반으로 10 또는 6% w/w 단백질을 함유한 용액이 분말을 초순수(18.2MOhm)와 혼합하고 후속적으로 약 20℃에서 1시간 동안 온화한 교반 하에서 혼합물을 수화시킴에 의해 제조되었으며 그 후 발명자들은 남은 분말 입자가 없음을 관찰하였고 용액은 투명해졌다. 조사에 사용된 분말의 특성은 표 1에 기술되어 있다.
표 1 예시적인 유청 단백질 단리물의 조성(BLG = 베타-락토글로불린; SH = 유리 티올; BDL = 검출 한계 미만; TS = 총 고형물)
유청 단백질 용액의 pH는 참조용으로 보관된 분취액과 함께 나사-캡 뚜껑이 있는 20mL Duran GL 18 시약 유리에 3M NaOH와 15mL 샘플을 사용하여 20℃에서 8.0으로 조정 및 측정되었다. 시약 유리에서의 WPI 샘플은 수조에서 10, 25, 40, 50 또는 60℃로 열적으로 평형화되었다. 밀도 1.11g/mL 및 34.01g/mol의 9.79M의 분자량 및 분석 L에서 얻을 수 있는 BLG의 몰 농도 및 18.4kDa의 BLG의 분자량을 갖는 30% w:w H2O2 용액의 몰농도를 기준으로 표 2에 기술된 대로 과산화수소(H2O2)를 H2O2:BLG 몰비 5:1 또는 8:1로 첨가했다. pH 6.5로 조정되고 8:1 H2O2:BLG의 존재에서 10℃와 25℃에서 인큐베이션된 유사한 6% WPI-B 샘플 세트가 생성되었다.
BLG는 전형적으로 유청 단백질의 단백질 중 약 50% 이상을 구성하고, 더욱이 유청 단백질의 유리 티올의 주요 공급원이다(BLG는 분자당 하나의 유리 티올 기를 함유함). 따라서 유청 단백질 조성물에서 천연 BLG의 몰 농도는 유청 단백질 조성물의 유리 티올 기의 몰 함량에 대한 양호한 근사치이다. 따라서, 유청 단백질 조성물의 천연 BLG의 함량에 대해 산화제의 투여량을 선택하는 것이 합리적이다.
표 2는 그 후 잔류 H2O2의 분석(분석 H에 따름)을 위해 샘플을 채취한 후 카탈라제(150L 액체 생성물당 3.65mL Catazyme 25L)를 첨가하여 H2O2의 불균등화에 의해 WPI 샘플의 추가 H2O2 산화를 중단하는, 18시간 동안 인큐베이션의 시작 시 반응 조건에 대한 개요를 제공한다.
단백질 내 잔류 유리 티올 기와 처리의 결과로서 산화된 유청 단백질 조성물의 잠재적인 응집은 각각 분석 E와 G에 따라 GPC-MALS에 의해 분석되었다.
UHT-시뮬레이션:
불쾌한 냄새의 발생에 대한 산화 처리의 영향을 평가하기 위해 샘플을 아래 기술된 대로 UHT-유사 처리에 적용했다:
샘플의 pH를 7.0으로 조정하고 6% 단백질로 희석했다. 산화된 유청 단백질 용액 1.0mL를 2mL GC 바이알(Mikrolab no ML 33003VU)에 옮기고 알루미늄 뚜껑(Mikrolab ML 33032)과 전자 크림퍼(Thermo Scientific CRMA60180-ECRH11KI)를 사용하여 크림프-밀봉했다. 샘플을 흐릿함의 징후에 대해 육안으로 검사하고 흐름 특성의 표시를 위해 첫 번째 프로브로 반전하면서 모니터링했다.
밀봉된 바이알(실온)을 제조업체가 바이알 2mL GC 바이알의 치수와 일치하도록 구멍을 뚫은 Mikrolab supertherm 시스템(제어 장치 ML 306228 및 가열 장치 ML3062409, Mikrolab A/S, 덴마크 소재)의 알루미늄 가열 블록으로 옮겼다. 블록을 160℃로 예열하고 샘플을 160초 동안 블록에서 유지했다. 온도는 약 40초 만에 100℃에 도달했고, 65초 만에 약 120℃에 도달했으며, 100초 인큐베이션 후 140℃ 및 160초 후에 150℃에 도달했다. 가열 블록에서 인큐베이션 후 샘플을 얼음-수조로 옮겨서 반응을 빠르게 켄칭시켜 불쾌한 냄새가 발생하도록 했다. H2S는 분석 D에 따라 밀봉된 바이알 내에서 직접적으로 측정되었다.
알루미늄 블록에서 160℃에서 160초 동안 샘플의 인큐베이션에 의한 UHT-시뮬레이션은 판형-열교환기를 이용한 간접 가열을 사용하여 143℃에서 4초 동안 전통적인 UHT 처리를 밀접하게 시뮬레이션하는 것으로 발명자들에 의해 나타났다. 발명자들은 더욱이 160℃에서 160초 동안 알루미늄 블록이 143℃에서 4초 동안 간접 UHT 처리로서 H2S의 함량에 의해 결정된 것과 동등한 양의 불쾌한 냄새를 초래한다는 것을 발견했다.
발명자들은 시뮬레이션된 UHT 처리 24시간 후 샘플로부터의 관능 평가에 의해 불쾌한 유황/썩은 냄새에 대한 인식의 순위를 매겼다. 평가 직전에 바이알의 뚜껑을 열고 "불쾌한 유황 냄새"를 0-15의 규모로 평가했으며 여기서 0은 물의 낮은 강도, 15는 분석 D에 따라 제조된 10μM H2S 표준의 높은 강도에 상응한다.
표 2 변형된 WPI 샘플의 상세한 공정.
결과:
발명자들은 143℃에서 2-16초 동안 처리와 같은 중성 pH에서 가혹한 열 처리를 거친 유청 단백질 단리물(WPI)에서 불쾌한 냄새의 발생을 연구하였고 놀랍게도 H2S 선택 전극을 사용하여 이러한 유청 단백질 단리물 음료 조성물에서 발생하는 강한 유황 발산-향이 주로 황화수소 및 데하이드로알라닌으로 시스테인의 베타-제거에서 유래하기 쉬운 황화수소로 이루어진 것을 발견했다. 실제로, 발명자들은 가스 크로마토그래피/질량 분광법 및 가스 크로마토그래피/화염 광도 검출을 사용하여 불쾌한 냄새가 주로 H2S로 이루어져 있음을 확인했다.
표 3에 나타난 바와 같이, 발명자들은 놀랍게도 유청 단백질 단리물의 산화를 허용하는 그 특정 조건을 발견하였고 공정에서 과산화수소 소비 및 잔류 티올 감소와 UHT 처리된 샘플에서 썩은 계란의 냄새와 유사한 불쾌한 냄새의 결과적인 발생의 감소 사이의 직접적인 관계를 발견했다.
발명자들은 예시적인 WPI 샘플(표 2에서 WPI-A 및 WPI-B)을 40℃와 같은 주변 온도 이상으로 가열하여 최대 적어도 18시간 동안 8.0의 상승된 pH에서 인큐베이션할 때에도 유리 티올과 과산화수소 사이의 반응이 진행되도록 허용할 필요가 있다는 사실에 특히 놀랐다. 실제로, 발명자들은 10 또는 25℃에서 pH 6.5에서 8:1 H2O2:BLG로 인큐베이션된 6% WPI WPI-B 샘플의 유리 티올 함량에서의 무 감소를 관찰했고 따라서 티올의 산화는 미생물 성장을 억제하기 위해 저온이 바람직한 전형적인 산업 공정 조건 하에서 효율적으로 발생할 것으로 예측될 수 없었다.
UHT 처리된 비산화된 샘플 WPI-A1에서 강한 H2S 냄새가 검출되었고, 발명자들은 썩은 계란과 유사한 강하게 인지된 냄새(관능 점수 10)가 92mV의 높은 측정된 전극 전위와 추가로 연관되어 있음을 발견했다.
이와 대조적으로, 40℃에서 pH 8.0에서 5:1 H2O2:BLG로 처리를 거친 샘플 WPI-A4는 첨가된 H2O2를 93% 소비하여 유리 티올에서 81% 감소를 초래했다. 산화는 UHT 시뮬레이션 후 불쾌한 냄새를 4점으로 유의하게 감소시켰으며 이는 비가열된 6% WPI-A 샘플의 수준과 유사한 것으로 밝혀졌다. UHT 시뮬레이션 후, 샘플 WPI-A4는 더욱이 H2S 전극 전위가 9mV에 불과하여 H2S의 발생과 따라서 불쾌한 냄새의 유의한 감소를 확인했다. 10-25℃에서 처리된 샘플(각각 샘플 WPI-A2 및 WPI-A3)에서는 불쾌한 냄새가 측정되거나 평가되지 않았다. 그러나, H2O2의 소비 및 이에 따른 잔류 유리 티올의 감소에 기반하여, 발명자들은 더 높은 온도를 사용하면 더 효율적으로 티올을 제거하므로, 이에 의해 UHT 처리 후 H2S를 감소시키는 데 있어서 바람직하다는 것을 발견했다.
8:1 H2O2:BLG 몰비로 10 내지 60℃에서 산화제에 노출된 WPI-B 샘플(각각 샘플 WPI-B2 내지 WPI-B6)에서도 동일한 패턴이 관찰되었다. 비산화된 샘플은 또한 10.4μM의 농도에 동등한 것으로 밝혀진 214mV의 높은 전극 전위에 의해 입증된 바와 같이 썩은 계란 냄새와 유사한 강하고 불쾌한 냄새를 생성했다(관능 점수 9). 인큐베이션 온도를 10℃에서 60℃까지 점차적으로 증가시키면(WPI-B2에서 WPI-B6, 표 3 참조), 인지된 불쾌한 냄새는 4점으로 감소했으며 샘플 WPI-B4 내지 WPI-B5에서 비가열된 6% WPI-B와 비슷한 것으로 나타났다. 마찬가지로, 이들 샘플은 측정된 H2S 수준이 낮았다. WPI-A를 기반으로 한 샘플과 유사하게, WPI-B를 기반으로 한 샘플에서도 소비된 H2O2, 잔류 티올 및 후속 UHT 처리로부터 불쾌한 냄새 사이의 관계가 관찰되었다.
상승된 온도를 사용해야 하는 요건에 부가하여, 발명자들은 샘플 WPI-B4에서 WPI-B6까지 관찰된 것과 같은 효율적인 산화가, 표 3을 참조하여, 40-60℃로 온도를 증가시키면 75 내지 5590kDa(약 4 내지 약 300 BLG 분자의 Mw에 상응함)의 중량-평균 분자량(Mw)에서의 증가로 나타난 바와 같이 단백질의 응집을 유도한다는 사실에 놀랐다. 샘플 WPI-B6에서의 고분자량 단백질은 샘플의 전도 동안 약간의 안개와 점성 거동을 통해 시각적으로 검출가능하였다.
발명자들은 더 낮은 온도에서 처리된 샘플 WPI-B2(29.3kDa) 및 WPI-B3(44.1kda)에서 응집이 전혀 또는 거의 나타나지 않음을 추가로 관찰했으며 이는 산화 공정이 진행하도록 허용하기 위해 특정 수준의 단백질 풀림이 필요함을 분명히 뒷받침한다. 충분한 풀림이 달성되면(예컨대 WPI-A4 및 WPI-B4), 최소한의 응집으로 산화가 진행되는 반면 증가된 풀림은 증가된 또는 과잉의 응집을 야기한다(예를 들어, WPI-B5 및 WPI-B6).
발명자들은, 표 3을 참조하여, 각각 샘플 WPI-A4, WPI-B4 내지 WPI-B6에 의해 예시된 총 단백질에 대해 약 100% 내지 약 50%의 범위인 BLG 함량을 갖는 광범위한 유청 단백질 단리 조성물 전반에서 WPI 제제의 산화에 의해 불쾌한 냄새가 감소되고 제거될 수 있음을 여기서 입증했다.
표 3 H2O2로 처리 동안 유리 티올 산화에 대한 온도의 영향과 UHT 처리 동안 및 처리 후 불쾌한 냄새의 발생.
결론:
발명자들은 유리 티올이 유의하게 감소되는 조건 하에서 이전에 산화를 거친 샘플의 UHT 처리가 썩은 계란의 냄새와 유사한 불쾌한 냄새의 감소된 수준을 나타낸다는 것을 발견했다.
불쾌한 냄새의 유의하게 감소된 수준이 6% 유청 단백질 음료 조성물에서 10 마이크로몰 SH/g 단백질의 유리 티올 함량을 특징으로 하는 샘플에서 감지되었고, H2S 5.0 마이크로몰 이하의 불쾌한 냄새의 수준은 관능 테스트에 의해 비산화된 참조에 대해 유의하게 감소된 것으로 감지되었고 H2S 2 마이크로몰 미만의 불쾌한 냄새 수준은 관능 테스트에 의해 거의 감지되지 않거나 전혀 감지되지 않았다.
발명자들은 유청 단백질 및 특히 유청 단백질에서 유리 티올 기의 주요 공급원인 BLG에서 유리 티올의 산화가 제어된 조건 하에서 감소될 수 있음을 입증했다.
발명자들은 더욱이 특정 pH 범위와 온도 범위의 조합이 유청 단백질의 유리 티올의 효율적인 산화에 유익하다는 것을 발견했다.
실시예 2a: 사용된 산화제 수준의 영향 조사
이들 실시예에 기술된 실험에서, 발명자들은 인큐베이션 온도 40℃ 및 인큐베이션 기간 20시간 동안 산화제 사용량의 영향을 조사하였다.
방법:
43.2g/L BLG(약 2.35mM)를 포함하는 8.6% WPI 용액 pH 8.0(20℃)을, 투여된 H2O2가 30% H2O2의 첨가 후 혼합에 의해 0:1부터 178:1 몰비(H2O2:BLG)로 다양하였다는 것을 제외하고 실시예 1에 개요된 대로 WPI-B로부터 제조했다. 모든 용액을 40℃에서 20시간 동안 인큐베이션했다.
인큐베이션 후, 잔류 H2O2가 분석 H에 따라 측정되었다.
추가 분석을 위해 그리고 후속 처리 단계에서 과도한 산화를 피하기 위해, 카탈라아제(액체 유청 단백질 생성물 150L당 3.65mL Catazyme 25L)를 샘플에 첨가하여 잔류 H2O2를 제거했다. 잔류 유리 티올은 분석 E에 따라 측정되었다.
산화에 의한 개별 아미노산의 손실이 측정되고 분석 F1 및 F2에 따라 산화된 유청 단백질 샘플에서 아미노산의 존재 여부가 평가되었다.
H2S-관련된 냄새의 발생은 실시예 1에 기술된 대로 열적 처리(160초 동안 160℃의 알루미늄 블록 사용) 후에 평가되었다. 모든 샘플은 H2S 분석 전 24시간 동안 실온에서 보관되었다.
베타-제거를 통한 시스테인의 데하이드로알라닌으로의 전환과 라이신 또는 시스테인 잔기와의 추가 반응으로 인해 발생하는 비-천연 가교의 수준은 산화된 샘플의 UHT 처리와 디캐퍼 조가 장착된 전자 크림퍼(Thermo Scientific CRMA60180-ECRH11KI)를 사용하여 바이알의 캡핑을 해제한 후 분석 I에 의해 평가되었다.
불쾌한 냄새의 감지는 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가되었다.
결과
표 4에서 볼 수 있듯이, 발명자들은 투여량이 증가함에 따라 잔류 H2O2의 양이 증가한다는 것과 처음에 첨가된 H2O2의 29-49% 만큼이 일정한 온도 40℃ 및 17:1 내지 178:1의 몰비에서 20시간 동안 인큐베이션 후에 남아 있어(샘플 WPI-B18 내지 WPI-B21) 초기에 첨가된 양에 대한 잔류 과산화물의 분획이 10:1 화학양론(샘플 WPI-B16) 이상으로 가파르게 증가한다는 것을 발견했다.
추가로 유리 티올은 H2O2:BLG 몰비 8:1(샘플 WPI-B15) 및 그 이상(샘플 WPI-B16 내지 WPI-B21)에서 대략적으로 2.2 마이크로몰 SH/g 단백질 이하에 의해 입증된 바와 같이 산화 단계를 통해 본질적으로 고갈된다는 것이 밝혀졌고, 이는 썩은 계란의 냄새와 비슷한 불쾌한 냄새의 발생에 대한 원인이 되는 잔류물이 효율적으로 제거된다는 것을 시사한다.
그러나, 발명자들은 시뮬레이션된 UHT 처리 후 샘플 WPI-B12에서 1.35 마이크로몰 H2S를 초래하는 것으로 밝혀진 7.5 마이크로몰 SH/g 단백질로의 감소조차도 0-15의 규모에서 4점을 갖는 6% 비가열된 비산화된 WPI-B 참조에 유사한 것으로 감지된다는 것을 발견했다. 높은 수준의 H2S를 생성하는 비산화된 6% WPI-B9 샘플은 9점으로 랭킹되었다.
현저하게도, 샘플 WPI-B12 내지 WPI-B21은 최대 10 마이크로몰/g 단백질의 유리 티올 기의 함량이 시뮬레이션된 UHT 후에 최대 약 5 마이크로몰 H2S로 이어져 열처리된 참조 WPI-B9에 대해 유의하게 감소되었지만 6% 비가열된, 비산화된 WPI-B 참조와 유사한 수준에서 불쾌한 냄새의 수준을 초래했음을 입증한다.
표 4 40℃의 일정한 저온에서 인큐베이션 동안 산화제의 최소 충분한 양 결정. <LOD = 검출 수준 미만; n.d. = 결정되지 않음
결론:
발명자들은 유청 단백질 음료의 UHT 처리 동안 및 처리 후 썩은 계란의 냄새와 유사한 불쾌한 냄새의 발생 및 감지에서 눈에 띄는 감소를 얻기 위해 유리 티올을 충분히 제거하려면 특정 수준의 산화가 필요하다는 것을 발견했다. 발명자들은 분석적으로 그리고 감지된 냄새 둘 모두로서 평가된 불쾌한 냄새의 감소된 수준이 약 10 마이크로몰 SH/g 단백질 이하의 잔류 유리 티올 함량과 지속적으로 연관되어 약 5μM H2S 이하를 초래한다는 것을 발견했다.
실시예 2b: 산화적 손상 조사
발명자들은 선행 기술의 음료 생산을 위한 유청 단백질 산화 공정(US2016/0235082 A1 참조)이 시각적 품질이 좋지 않은 음료, 특히 탁도 및/또는 황색이 발생하는 것을 관찰했다.
발명자들은 이들 바람직하지 않은 특징이 고농도의 산화제의 존재에서 UHT와 같은 가혹한 열 처리의 결과로 발생한다고 추측했다.
방법:
13.5% w/w WPI 용액은 WPI-B 분말을 MilliQ 물과 혼합하여 제조되었으며, pH는 5% HCl을 사용하여 6.5로 조정된 후 MQ 물에 희석하여 최종 단백질 농도 13% w/w에 도달되었다. 분석 L에 따라 65g/L(대략 3.54mM)의 BLG 함량이 측정되었다. 13% WPI-B pH 6.5 샘플의 분취량은 참고 목적으로 보관되었다. 30% 과산화수소(H2O2)는 0:1-174:1 H2O2:BLG의 몰비에 상응하는 다양한 양으로 WPI 용액에 혼합되었다(표 5 참조).
13% WPI 샘플의 1.0mL 분취량이 실시예 1에 기술된 바와 같은 UHT 시뮬레이션에 적용되었다(알루미늄 블록을 160℃에서 160초 동안 사용). 냉각 후, 바이알을 육안으로 검사하고 캡을 제거하고 분석 H를 사용하여 잔류 비-반응된 H2O2를 측정했다. 분석 E를 사용하여 잔류 티올을 측정했다. 공정에서 개별 아미노산의 손실을 측정하고 아미노산 산화 생성물의 존재는 각각 분석 F1과 F2에 따라 평가하였다. 베타-제거를 통한 시스테인의 데하이드로알라닌으로의 전환과 시스테인 잔류물과의 추가 반응으로 인해 발생하는 비-천연 란티오닌 가교의 수준은 산화된 샘플의 UHT 처리 후 분석 I에 따라 평가하였다.
결과:
실험의 결과는 표 5에 요약되어 있고, 샘플 WPI-B22 내지 WPI-B30의 사진은 추가로 도 1에 나타나 있다.
발명자들은 대부분의 샘플에서 불투명도의 발생을 관찰했으며, 더욱이 높은 수준의 H2O2로 UHT 처리를 거친 샘플, 특히 샘플 WPI-B26, WPI-B27, WPI-B29 및 WPI-B30에서 황색의 발생을 확인했다. 이는 UHT 처리와 조합된 과잉의 H2O2 투여량이 바람직하지 않은 과잉의 아미노산 산화로 이어져, 예를 들어 그러한 색상 변화를 초래한다는 것을 나타낸다.
부가적으로, 발명자들은, 표 7을 참조하여, 13% WPI-B(WPI-B29)의 UHT 처리 동안 85:1 H2O2:BLG의 존재로 인해 트립토판 잔기의 유의한 원치 않는 손실이 발생하고 더 나아가 티로신과 트립토판 잔기 둘 모두에서 산화 생성물이 발생한다는 사실을 발견했다. 발명자들은 검출된 트립토판 산화 생성물인 디옥신돌릴알라닌(DiOia) 및 키누레닌(kyn)에 의해 황색이 유발된다는 징후를 확인했다. 더욱이, 산화된 티로신(o-Tyr)과 디-티로신(Di-Tyr)으로 티로신의 산화는 과잉 산화의 지표로 간주된다.
샘플 WPI-B29와 대조적으로, 표 7은 8:1 몰비(H2O2:BLG)로 40℃에서 보다 온화한 산화 단계와 카탈라아제에 의한 과잉 산화제의 후속 불균등화 후 WPI-B15(실시예 2A)에 대한 티로신 또는 트립토판 잔기에서 유의한 변화가 없음을 보여준다. 샘플 WPI-B22(비처리된 WPI-B) 또는 WPI-B9(첨가된 H2O2 없음)에서는 티로신(예를 들어 di-tyr 및 o-tyr) 또는 트립토판(예를 들어 키누레닌 및 DiOia-2)의 산화 생성물이 관찰되지 않았다. WPI-B15는 더욱이 WPI-B9(비산화됨) 및 WPI-B29(H2O2의 존재에서 UHT) 둘 모두에 비해 UHT 처리 후 란티오닌의 유의하게 더 낮은 수준을 나타냈다. 그 값은 놀랍게도 비변형된 비가열된 WPI-B의 수준에 가깝다(표 7). 이는 산화 공정이 단백질 분해 산물의 형성을 감소시키고 그렇지 않으면 비-천연 란티오닌 가교결합의 형성을 초래한다는 것을 명백히 시사한다.
흥미롭게도, 샘플 WPI-B20(40℃/20hr, 89:1)은 UHT 처리 전 카탈라아제를 첨가한 결과일 가능성이 가장 높은 티로신과 트립토판의 분해를 나타내지 않아, 고온에서 H2O2의 높은 수준은 바람직하지 않다는 것을 나타낸다. 그러나, 트립토판 분해 산물인 키누레닌의 원치 않는 형성이 검출되었고 이는 H2O2 투여량 조절의 필요성을 강조한다.
표 5 과산화수소의 존재에서 샘플의 UHT 처리(160C/160초).
표 6 산화 단계 및 UHT 처리가 있는/없는 본 실시예로부터 예시적인 WPI 샘플의 개요.
표 7 산화 공정 후 WPI 샘플의 특징. LLOQ = 가장 낮은 정량화 수준. 샘플의 Tyr 함량에서 통계적으로 유의한 차이가 발견되지 않았지만 WPI-B29는 다른 산화된 WPI 샘플보다 Tyr 분해 산물의 유의하게 더 높은 수준을 갖는다.
결론:
발명자들은 높은 수준에서 H2O2의 존재에서 WPI-용액의 직접 UHT 처리에 이어서 병입하는 것을 포함하는 공정이 트립토판과 같은 아미노산의 원치 않는 산화를 초래하고 키누레닌 및 DiOia와 같은 분해 산물의 형성을 야기한다는 것을 관찰했다. 추가로, 발명자들은 이러한 용액에서 불투명 또는 황색의 형성을 관찰하였고 색상 형성이 아미노산 분해 산물의 형성과 연관될 수 있다는 징후를 확인했다.
대조적으로 실시예 2A에 기록된 바와 같이, BLG에서 유리 티올이 노출되고 임의로 산화될 수 있도록 올바른 pH와 온도 범위를 주의 깊게 선택하면, 산화 손상 수준이 훨씬 낮은 유리 티올 기의 감소된 함량을 갖는, 변형된 유청 단백질 조성물과 이를 함유하는 음료 생성물을 생산하는 것을 실현 가능하게 한다.
실시예 3: 티올 산화를 가능하게 하는 pH의 영향
이 실험에서, 발명자들은 유청 단백질의 유리 티올의 산화를 가능하게 하는 pH의 영향을 조사했다.
재료 및 방법:
실시예 1에 기술된 바와 같이 분말을 탈염수와 혼합함에 의해 용해된 WPI-B(8.4% w/w의 단백질 함량을 제공하기에 충분한 WPI-B 분말 함유)의 수성 샘플을 제조했다. 샘플의 pH를 각각 10% HCl 또는 3M NaOH를 사용하여 각각 pH 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 및 8.5로 조정했다. 달리 명시되지 않는 한, pH 조정된 WPI-B 샘플을 8:1 H2O2:BLG 몰비로 H2O2의 첨가 후 40 내지 55℃에서 20시간 동안 인큐베이션했다(표 8 참조). 인큐베이션 후 분석 H를 사용하여 잔류 H2O2를 측정했다.
카탈라제(액체 생성물 150L 당 3.65mL Catazyme 25L)를 첨가하고 잔류 H2O2를 제거하도록 했다.
샘플을 분석 G에 따라 겔 투과 크로마토그래피(GPC)로 분석하여 생성된 생성물의 평균 분자량 및 고유 점도를 추정했다. 잔류 유리 티올은 분석 E에 따라 측정했다.
하위-샘플을 실시예 1에 기술된 UHT-유사 열 처리(160초 동안 160℃의 온도로 알루미늄 블록 사용)에 적용하고 H2S의 함량은 분석 D에 따라 결정했다.
감지된 불쾌한 냄새는 실시예 1에 기재된 바와 같이 평가하였다.
결과:
표 8은 유리 티올의 산화를 가능하게 하기 위한 특정 온도/pH 조합에 대한 필요성을 입증한다.
첨가된 H2O2의 부재에서 40℃에서 pH 8.0에서 인큐베이션된 비처리된 WPI-B31 및 WPI-B32는 WPI-B31에 대해 표시된 바와 같이 UHT 처리 후 높은 수준의 불쾌한 냄새로 21.6 및 21.5μmol SH/g 단백질에서의 높은 수준의 유리 SH를 나타냈다.
그러나, 발명자들은 온도를 증가시키면 H2O2의 소비가 점진적으로 증가하고 결과적으로 유리 티올이 감소하여 pH 8.0에서 2.2μmol SH/g 단백질에 도달한다는 것을 발견했다. UHT 처리 동안 생성된 H2S 수준은 그에 따라서 감소했다.
반응에는 40℃에서 약 8.0의 pH가 필요하지만, 발명자들은 더욱이 단백질의 부분적인 풀림을 촉진하기 위해 온도를 동시에 증가시키면 8.0보다 낮은 pH 값에서 반응이 진행될 수 있음을 발견했으며, 이는 특정 pH 수준에는 특정 온도가 필요하다는 것을 의미한다.
실제로, pH 7.0에서 불쾌한 냄새를 효율적으로 제거하려면 샘플 WPI-B38에서 볼 수 있듯이 적어도 약 50℃의 인큐베이션 온도가 필요하고 pH 6.5에서는 적어도 약 55℃의 온도가 필요한 것으로 밝혀졌다.
샘플 WPI-B35 내지 WPI-B39에서 입증된 바와 같이, 발명자들은 효율적인 산화 및 불쾌한 냄새의 제거의 결과는 비처리된 WPI-B 원료에 대한 22.4kDa에 비하여 51(WPI-B35) 내지 1142kDa(WPI-B39)의 변형된 WPI 생성물의 중량-평균 분자량에서의 증가라는 것을 추가로 지적한다.
발명자들은 7.4 마이크로몰 SH/g 단백질 이하의 유리 티올 함량을 특징으로 하는 샘플의 UHT 처리로 인한 측정된 불쾌한 냄새의 수준이 결정된 관능 역치 1-2 마이크로몰 H2S를 상회하는 것으로 발견되었지만, WPI-B35의 불쾌한 냄새는 이미 그 다음날(주변 온도에서 24시간) 비가열된, 비산화된 6% WPI-B 샘플과 비슷한 것으로 밝혀진 수준으로 감소했다는 것을 추가로 지적했다. 샘플 WPI-B36 내지 WPI-B39에서는 불쾌한 냄새가 검출되지 않았다.
표 8 UHT 처리 후 유리 티올의 접근성, H2O2의 소비 및 발산-냄새 발생에 대한 pH의 영향.
결론:
발명자들은 증가된 pH가 유청 단백질의 유리 티올의 감소를 증가시킨다는 것을 관찰했다. 표 8로부터, 소비된 H2O2의 양당 "단백질 g당 SH-기"에서의 감소가 pH 6.5에서 pH 7.0으로, 그리고 다시 pH 7.0에서 pH 7.5로 극적으로 증가한다는 것이 더욱 분명해졌다. 이론에 얽매이지 않고, 발명자들은 증가된 pH가 BLG의 분자 구조를 느슨하게 하여 BLG의 유리 티올에 대한 산화제의 접근을 용이하게 하고 따라서 산화 반응의 특이성을 증가시킨다고 추정한다.
발명의 방법은 또한 pH 6.5에서 실행될 수 있지만 유리 티올에 대한 산화제의 더 용이한 접근을 허용하는 단백질의 부분적인 풀림에 의해 공정 속도를 높이기 위해 더 긴 인큐베이션 시간, 바람직하게는 더 높은 온도(예를 들어 50℃)가 필요할 것이다.
발명자들은 더욱이 열처리 동안 온도가 증가하면 평균 분자량이 증가하는 경향을 관찰했다. 산화된 유청 단백질의 분말의 생산을 위해, 발명자들은 증가된 점도를 갖는 문제 없이 더 높은 단백질 농도의 액체 스트림을 처리할 수 있도록 응집체 크기를 가능한 한 작게 유지하는 것이 유리하다는 것을 발견했다.
실시예 4: 스포츠 영양을 위한 pH-중성, UHT-처리된 유청 단백질 음료의 생산
본 실시예에서 발명자들은 중성 pH에서 UHT 처리 후 놀라울 정도로 낮은 수준의 불쾌한 냄새를 갖는, 산화된 유청 단백질 단리물을 포함하는 즉석 음료 생성물을 제조하기 위한 공정을 파일럿 규모로 확장하는 타당성을 입증했다.
재료 및 방법:
중성 pH에서 UHT 처리 후 낮은 수준의 불쾌한 냄새를 갖는 즉석 음료를 WPI-B 또는 WPI-C 유형의 분말을 원료로 사용하여 파일럿 플랜트에서 생산했다. WPI-B의 분말 조성은 실시예 1에, WPI-C는 표 9에 나타나 있다.
표 9 예시적인 유청 단백질 단리물의 조성(BLG = 베타-락토글로불린; SH = 티올; ALA= 알파-락트알부민; CMP= 카세인마크로펩티드; TS = 총 고형물)
파일럿 처리를 위해 6% w/w 단백질(WPI-B 또는 WPI-C)을 갖는 12kg 용액을 준비하고 이어서 30분간 재수화했다. 10% NaOH를 사용하여 pH를 20℃에서 8.0으로 조정했다. 이어서 용액을 Scanima 믹서(SPM-100V, Scanima A/S, 덴마크 소재)로 이동시키고, 여기서 용액의 온도를 부드럽게 혼합하면서 40℃로 증가시켰다. 그 후, 35% H2O2를 용액에 첨가하여 H2O2와 WPI-B 또는 WPI-C의 BLG 사이의 8:1 몰비를 얻었다. 용액을 18시간 동안 40℃에서 유지하고 카탈라아제를 실시예 1에 기술된 바와 같이 H2O2 접근을 제거하기 위해 18시간 인큐베이션의 말단에서 첨가했다. 용액을 실온에서 60분 동안 방치하고 UHT 전 1M HCl을 사용하여 pH를 7.0으로 조정했다. UHT 열적 처리는 서비스 수 유량 80L/h, 생성물 유량 20L/h, 70℃로 예열에 이어서 143℃에서 4초 동안 가열로 작동되는 판형 열 교환기(PHE),(HT320-20, OMVE, 네덜란드 소재)를 사용하여 수행했다. 열처리된 음료를 출구에서 10℃로 냉각하고 100ml 멸균 플라스틱 병에 담아 추가 분석을 위해 즉시 밀봉했다. 더욱이, H2S 수준 분석을 위한 샘플을 UHT의 출구에서 충전했으며, 여기서 1ml의 샘플을 2ml 유리 바이알 안으로 충전하고 실시예 1에 기술된 바와 같이 즉시 뚜껑으로 크림프-밀봉했다(각 샘플에 대해 3회).
여러 가지 분석을 수행하여 음료를 평가하였다. 18시간 동안 산화 후 샘플에 대한 분석 E에 따라 잔류 유리 티올을 측정했다. 음료의 H2S 수준은 생산 후 2시간 이내에 분석되었다(분석 D). 모든 샘플은 H2S 측정 전에 실온에서 보관되었다. 탁도는 분석 Q에 의해 분석되었다.
관능 평가는 음료 생산 당일 수행되었고, 100ml 플라스틱병은 개봉 전 실온에 보관되었다. 각각의 사람에 대해 2병씩 3 내지 5명이 병을 개봉하여 직접적으로 평가하였다. 0 내지 15의 스케일이 사용되었다.
결과:
결과는 표 10에 예시된 바와 같이 H2O2와 BLG의 몰비 8:1에서 WPI-B 또는 WPI-C의 산화가 비처리된 샘플에 비해 유리 티올의 양을 유의하게 감소시켰다는 것을 분명히 보여준다. 더욱이, H2O2를 첨가하지 않은 WPI-B37과 WPI-C1 둘 모두, UHT 처리가 음료에서 높은 수준의 H2S를 초래한다. 그러나, H2O2의 첨가(샘플 WPI-B38 및 WPI-C2)로, 불쾌한 냄새는 실온에서 24시간 보관 후 식별된 관능 임계치보다 낮은 수준에 도달했다.
6% WPI-B 음료에 대해 관찰된 낮은 탁도와 낮은 수준의 불쾌한 냄새는 맛있고 투명한 유청 단백질 음료를 위해 전처리된 WPI 생성물의 사용을 명백히 시사한다.
표 10 과산화수소로 처리된 유청 단백질 단리물로부터 투명한 UHT-처리된 유청 단백질 단리물 음료의 제조는 UHT 처리 시 유리 티올 및 H2S의 발생에서 유의한 감소를 드러낸다.
결론
발명자들은 썩은 계란의 냄새와 유사한 감지된 불쾌한 냄새가 없는 투명한 pH-중성, UHT-처리된 유청 단백질 음료를 생산하기 위해 파일럿 규모에서 산화 공정의 성공적인 사용을 입증했다. 이러한 음료는 스포츠 영양에 특히 매력적인 것으로 간주된다.
실시예 5: 스포츠 영양을 위한 pH-중성 UHT-처리된 유청 단백질 분말의 생산
본 실시예에서 발명자들은 중성 pH에서 재수화 및 UHT 처리 후에 놀랍게도 낮은 수준의 불쾌한 냄새를 생성하는 변형된 유청 단백질 단리물을 생성하기 위해 농축 및 분무 건조를 포함하는 분말 생성물 공정을 만들기 위해 실시예 4에 기술된 조건을 사용하는 타당성을 입증했다.
물을 제거하는 것이 특히 유리하다:
ㆍ 이러한 생성물이 장거리에 걸쳐 운송되어야 하는 경우(물의 운송 회피)
ㆍ 보관 동안 미생물 성장의 위험을 줄이기 위함
재료 및 방법:
10.3% 또는 7.9% 단백질에서 WPI-C(실시예 4, 표 9에 기술된 특성을 가짐) 150kg 용액이 물에 30분 동안 WPI-C의 수화에 의해 제조되었다. 용액을 40℃로 가열하기 전에 용액의 pH를 8(20℃)로 조정했다. 가열된 용액에서 pH는 7.5:1 또는 13:1의 몰 H2O2:BLG 화학량론을 사용하여 H2O2의 첨가 전에 pH 7.7(40℃에서 측정)로 조정되었다.
40℃에서 20시간 인큐베이션 후, 96U 카탈라아제(SigmaC9322)를 단백질 g당 첨가하여 잔류 H2O2를 비활성화했다. 그런 다음 산화된 WPI를 2 pcs Koch HFK328(3838/31) 멤브레인이 장착된 파일럿 규모 MMS NF/RO 장치 상에서 12% 단백질로 농축하고 UF 모드에서 10℃에서 평균 0.9Bar 차압으로 작동했다. 그런 다음 UF 보유물을 SPX Anhydro 파일럿 규모 분무 건조기(185℃ 입구 온도/85℃ 출구 온도)에서 건조시켰다.
생성된 산화된 WPI 분말을 탈염수와 혼합하여 5.9% 단백질을 포함하는 유청 단백질 음료(WPI-C4 및 WPI-C5)를 제공했다. 용액의 pH는 3% HCl을 사용하여 pH 7.0(20℃)으로 조정했다. WPI-C4 용액은 실시예 4에 기술된 바와 같이 PHE가 장착된 OMVE HT320-20 상에서 143℃에서 4초 동안 UHT를 거쳤다. 참조 음료는 WPI-C 분말로부터 동일한 방식으로 제조되었다(임의의 산화성 전처리 없음, WPI-C3).
WPI-C5 용액은 100L/h에서 작동하고 80℃ 및 그 다음 100℃에서 2번의 예열 단계에 이어서 143℃에서 10초 동안(고온, 단시간(HTST)) 가열하는 것으로 구성된 UHT APV/SPX 5010026 시스템을 사용하는 관형 열 교환기(THE)의 사용에 의하여 열적으로 처리되었다. 음료 조성물은 그 다음 3단계에서 78℃, 40℃, 그 다음 10℃로 냉각되고 100mL 멸균 병 안으로 담긴 다음 즉시 밀봉되었다.
UHT-처리된 음료는 유리 티올 기의 함량에 대해 분석 E로, H2S에 대해 분석 D로, 탁도에 대해 분석 Q로, 점도에 대해 분석 C로, 관능에 대해 분석 K로 분석되었다.
결과:
WPI-C4 및 WPI-C5 음료에서 단백질 그램당 유리 티올의 수준은 각각 2.0 및 0.3 마이크로몰/g 단백질로 감소되었다. 표 11에서 볼 수 있듯이 WPI-C4와 WPI-C5에서 티올의 산화는 WPI-C3(비산화된 참조)에 비교할 때 UHT-처리된 음료가 비교할만한 점도, 약간 낮은 탁도 및 중요하게는 유의하게 감소된 H2S 수준을 갖도록 했다. 관능 패널에 따르면 산화된 WPI-C5 음료는 표 12에 표시된 참조 음료(WPI-C3)에 비해 감소된 유황/썩은 냄새를 제공했다. 속성은 0점(낮은 강도)부터 15점(높은 강도)의 점수로 등급화되었다(분석 K). WPI-C5 음료의 관능 점수는 1.7의 점수를 갖는 비가열된 유청 단백질 용액의 것에 근접한다.
표 11 비산화된 참조 WPI-C3 음료에 비한 WPI-C4 및 WPI-C5 음료의 특징.
표 12 음료 WPI-C3 및 WPI-C5의 관능 분석(분석 K). 속성의 다른 문자(그룹)는 샘플이 유의하게 다르다는 것을 나타낸다.
결론:
유리 티올 기의 특정 산화, 과잉 산화제의 불활성화, 한외여과에 의한 후속 농축, 및 분무 건조에 의해 분말화된 산화된 WPI-C4/C5 생성물을 생산하는 것이 가능하였다는 것이 입증되었다. 산화된 WPI-C4/C5를 분말 형태로 제공하면 생성물의 물류 및 유통기한이 향상된다. 생산된 산화된 WPI-C4/C5 분말은 더욱이 비가열된 유청 단백질 용액의 관능 점수에 훨씬 근접하는 6% WPI-C4/C5 단백질을 함유한 UHT-처리된 음료에서 강렬하게 감지되는 유황/썩은 냄새가 없는 것으로 나타났다.
음료는 비산화된 WPI에 기반한 비교가능하게 UHT-처리된 참조 음료보다 낮은 점도와 더 낮은 탁도를 갖는다.
실시예 6: 산화 동안 pH를 일정하게 유지하는 이점
이전 조사에서, 발명자들은 산화 과정 동안 pH가 0.5 pH 단위 이상만큼 감소한다는 것을 인지했다.
본 실시예에서 발명자들은 산화 단계 동안 필요한 공정 시간을 단축할 수 있도록 pH-stat를 사용하여 pH를 일정하게 유지하는 것이 특히 유리할 수 있음을 입증한다.
파트 1.
산화 동안 pH의 재조정에 의한 반응 동역학을 개선하는 가능성.
재료 및 방법:
9% 단백질에서 WPI-C(실시예 4, 표 9에 기술된 특징을 가짐) 150kg 용액을 실시예 5에 기술된 바와 같이 수화시키고, pH를 조정하고 가열했지만, 산화는 H2O2 대 BLG의 10:1 몰비로 수행되었다. H2O2의 첨가 20분 후에 2개의 100ml 샘플을 뚜껑이 있는 비이커에 붓고 교반하면서 40℃의 수조에 넣었다. 두 샘플 중 하나는 산화 동안 pH가 조정되지 않은 채로 남겨졌고(WPI-C8), 다른 하나는 3시간 후에 pH가 7.7(40℃에서 측정)로 재조정되었다(WPI-C7). 남은 150kg 용액은 5시간 동안 20분마다 재조정에 의해 40℃에서 pH 7.7에서의 정적 pH로 유지되었고 그 후 총 22시간 동안 산화가 계속되면서 pH는 감소하도록 허용되었다(WPI-C6). H2O2 첨가 후 3시간(3h), 5시간(5h), 7시간(7h) 시점에서 각 비이커뿐만 아니라 정적 pH로 유지된 대용량에서 샘플이 취해졌다. 잔류 H2O2를 불균등화하기 위해 ml당 5U 카탈라아제를 첨가하기 전에 분석 H에 따라 샘플에서 잔류 H2O2를 측정했다. 그런 다음 모든 샘플을 분석 E에 따라 유리 티올에 대해 분석했다.
결과:
산화 동안 pH 7.7에서의 정적 pH는 반응 동역학을 유의하게 개선하고 단 7시간 후에 2.0 마이크로몰/g 단백질의 유리 티올의 함량에 도달하게 할 수 있었던 반면 WPI-C7이나 WPI-C8은 어느 것도 24시간 안에 그 수준에 도달하지 못한 것으로 관찰되었다. WPI-C7에서 3시간 산화 후 pH의 단일 재조정은 또한 동역학을 개선하였다. 이들 결과는 티올 산화를 촉진하는데 있어 pH의 영향을 강조한다.
파트 2.
정적 pH에서 산화 동안 H2O2 대 BLG 비율의 영향.
재료 및 방법:
WPI-C의 10% 단백질 용액을 만들고 pH를 pH 8.0(20℃)으로 조정하고, 용액 400g을 온도 조절, 기계적 교반기, pH 센서 및 염기 첨가(7% NaOH)를 위한 액체 투여 시스템 및 WinBio 소프트웨어 제어 시스템을 통한 제어기가 장착된 BioXplorer 400(HEL) 장비의 4개 반응기 각각 안에 분배했다. 시스템은 pH를 pH 7.7로 조정하기 전에 용액을 40℃로 가열하고 7% NaOH 용액의 첨가에 의해 pH 7.7과 40℃에서 14시간 동안 pH를 일정하게 유지하도록 프로그래밍되었다. pH와 온도가 안정되었을 때 H2O2를 아래 계획에 따라 수동으로 반응기에 첨가했다. 산화 동안 1-1.5시간 간격으로 6ml의 샘플을 취했다. 잔류 H2O2는 분석 H에 따라 샘플에서 측정되었고 나머지에는 샘플 ml당 10U 카탈라아제가 첨가되었다. 샘플을 pH 7(20℃)로 조정하고 6% 단백질로 희석했다. 모든 샘플은 분석 E에 따라 유리 티올에 대해 분석되었다. 각 샘플 1ml가 실시예 1에 기술된 UHT-유사 열처리(160초 동안 160℃의 온도를 갖는 알루미늄 블록 사용)에 적용되고 분석 D에 따라 H2S에 대해 분석되었다. 점도는 분석 C에 따라 측정되었다.
결과:
표 13 실시예 6의 파트 2의 결과의 요약. H2O2-처리 이전 유리 티올 기의 함량은 28.7μmol/g 단백질이었다.
첨가된 H2O2의 용량을 증가시키면 티올 산화에 필요한 시간이 감소하고 18:1 몰비 용량에서 불쾌한 냄새는 H2O2:BLG의 9:1 몰비가 사용된 경우 대략적으로 8시간이 요구되는 것에 비해 정적 pH가 적용되는 경우 처음 5시간 이내에 제거될 수 있는 것이 관찰되었다.
결론:
실험은 pH를 유리한 설정점으로 유지하는 것은 (WPI-C7 및 WPI-C8과 비교할 때) 더 빠른 반응 동역학을 허용한다는 것을 입증하였다. 이는 온도/pH 조합에 의해 좌우되는 부분적 풀림의 상태를 유지한 결과일 가능성이 높다.
실험은 더 높은 투여량을 사용하면 반응 시간이 더 짧아지고, pH-stat와 더 높은 H2O2:BLG 투여량의 조합된 사용에 의해 공정 시간이 현저하게 단축될 수 있음을 더욱이 입증하였다. 예를 들어, UHT 처리로 인한 불쾌한 냄새의 발생은 pH 8.0(20℃)에서 H2O2:BLG 비율이 18:1인 경우 3시간 동안 또는 H2O2:BLG 비율이 9:1인 경우 5시간 동안 산화적 전처리에 의해 제거될 수 있다.
실시예 7: 유청 단백질 공급원의 지방 함량의 영향
본 실시예에 기술된 실험에서는 휘발성 유기 화합물로부터 (상기 언급된 불쾌한 냄새에 부가하여) 바람직하지 않은 냄새의 발생에 대한 지방 함량의 영향을 조사했다.
재료 및 방법:
표 14. WPC 분말의 조성
실온에서 1시간 동안 부드러운 교반 하에서 분말의 수화에 의해 각각 WPI-B와 WPC로부터 8% 단백질 용액을 제조했다. pH를 8.0(20℃)으로 조정하였다. 두 샘플 모두 30% 과산화수소의 첨가 후 40℃에서 pH 8.0에서 20시간 동안 인큐베이션하여 8:1 몰 화학양론에 도달되었다.
샘플을 실시예 1에 기술된 바와 같이 UHT 처리에 적용하고 분석 D에 따라 H2S의 함량을 결정했다. 여러 개의 열적으로 처리된 바이알에서 샘플을 수집하여 5mL 샘플을 100mL 파란색-캡 플라스크로 옮겼다. 100ppm 2-헥사논-5-메틸 내부 표준 용액 1.5uL를 첨가하여 최종 농도 30ppb에 도달했다. 휘발성 유기 화합물에 대한 샘플의 분석은 분석 J에 따라 수행되었다.
결과:
pH 8.0 및 40℃에서 8:1 H2O2로 20시간 동안 처리된 WPC와 WPI 음료를 식별을 위한 질량 분석법을 사용하는 동적 헤드스페이스 가스 크로마토그래피 방법을 사용하여 휘발성 유기 화합물의 함량에 대해 분석했다. 분석은 WPC 음료의 헤드스페이스에서 검출된 모든 유기 화합물의 훨씬 더 많은 존재를 밝혔다. 특히 알데히드, 예컨대 헥사날, 헵타날, 2-4 노나디에날(E,E), 노나날 및 벤즈알데히드가 WPI에 비해 훨씬 더 많은 양으로 존재하였다. 알데히드는 지질의 산화로부터 유래하고 WPC는 WPI보다 훨씬 많은 지질을 함유하므로 알데히드도 WPC에서 더 큰 속도로 생성된다. 알데히드 휘발성물질의 형성을 방지하기 위해 가능한 한 낮은 지방의 양을 갖는 단백질 공급원을 사용하는 것이 바람직하다. 부가하여, WPC에는 또한 더 큰 양의 케톤 2-부탄온과 유기산인 아세트산, 포름산, 벤조산이 함유되어 있다.
WPC 음료의 헤드스페이스에서 모든 휘발성 유기 화합물의 증가된 존재의 조합된 효과는 WPI에 비해 휠씬 더 강한 바람직하지 않은 냄새이며, 이는 아마도 검출된 휘발성 유기 화합물의 형성에 기인하는, WPI에 비해 WPC 샘플에 대해 훨씬 더 강렬하고 복잡한 냄새를 나타내는 간단한 감각 자극에 반응하는 평가에 의해 확인되었다.
결론:
발명자들은 산화된 유청 단백질 생성물 및 이의 맛이 좋은 생성물을 제조하는데 가능한 한 적은 양의 지방을 함유하는 유청 단백질 공급원이 바람직하다는 것을 발견했다.
실시예 8: 열적 구배의 사용
발명자들은 다양한 온도 프로파일을 적용하여 유리 티올의 술펜산으로의 산화에 이어서 술펜산과 노출된 티올의 반응을 통해 단백질 사이에 이황화 결합의 형성을 허용하는 두 번째 온도 단계를 허용하는 단백질의 부분적 풀림에 도달할 때 유리 티올의 제거가 특히 효율적일 수 있음을 발견했다.
방법
1%; 2%; 3%; 4%; 5% 및 6% w/w 단백질 용액을 실온에서 1시간 동안 부드러운 교반 하에서 10mM 인산염 완충액 pH 7.0에서 분말의 수화에 의해 WPI-A(실시예 1 참조)로부터 제조했다.
30% 과산화수소를 miliQ 물에 0.3%로 희석하고 2:1 몰 화학양론에 도달하도록 단백질 용액에 첨가했다. 그 후, 샘플을 온도/시간 단계-구배(25℃에서 99℃까지 5℃ 간격 및 유지 시간 10.5분(총 시간 176분))를 사용하여 PCR 기계(Esco Healthcare SwiftMax Pro)에서 열적으로 처리했다. 샘플을 분석 전에 25℃로 냉각했다.
모든 샘플을 유리 티올(분석 E) 및 GPC-HPLC에 의한 입자 크기(분석 G)에 대해 분석했다.
결과:
놀랍게도, 1%에서 6%까지의 단백질 농도에서 단지 2:1 몰 화학량론을 사용함에 의해 유리 티올의 함량을 95%까지 감소시키는 것이 가능하다는 것이 밝혀졌다. 측정된 유리 티올을 표 15에 나타내었다.
표 15. 1% 내지 6% WPI-A 단백질 용액에서 2:1로 산화 후 유리 티올 및 Mw
응집은 표 15에 나타난 더 높은 단백질 농도에서 증가했지만, 놀랍게도 높은 단백질 농도에서는 제한된 단백질 응집으로 수행될 수 있다.
결론:
유리 티올의 제거는 (1) 최소의 응집을 초래하기 위해 당업자에 의해 선택된 낮은 온도 범위에서 유리 티올의 노출 및 술펜산 상태로의 산화를 허용하고 (2) 이후 더 높은 온도에서 술펜산과 비산화된 유리 티올 잔기 사이의 반응을 허용하는 열적 프로파일의 신중한 설계에 의해 매우 낮은 H2O2:BLG 비율에서 달성될 수 있다.
발명자들은 본 실시예의 발명의 구현이 시스테인 산화의 선택성을 증가시켜 예를 들어 메티오닌 산화를 감소시킨다는 징후를 확인하였다.
실시예 9: 산화 후 열처리와 조합한 낮은 투여량의 산화제의 사용
발명자들은 열적 처리와 낮은 투여량의 산화제를 사용하는 조합이 H2S 농도가 관능 역치 아래인 수준에 도달할 수 있는 원하는 범위까지도 유리 티올 수준의 감소를 야기할 수 있음을 입증했다.
낮은 수준의 산화제와 짧은 인큐베이션 시간, 예를 들어 1시간을 사용함에 의한 온화한 산화는 부분적으로 풀린 단백질 분자가 산화되어 술펜산을 형성하도록 허용할 수 있다. 술펜산은 시스테인 잔기와 과산화물의 반응 동안 일시적인 중간체이고, 원하는 수준의 과산화물의 존재 및/또는 긴 반응 시간, 예를 들어 실시예 1과 2의 경우 8:1 및 18h으로 술핀산 또는 술폰산을 형성하도록 추가로 산화될 수 있다. 반면, 술펜산은 유리 티올의 존재로 소비되어 이황화 결합을 형성할 수도 있다. 본 실시예에서, 발명자들은 낮은 수준의 산화제, 예를 들어 2:1, 짧은 반응 시간, 예를 들어 1h을 사용하였으며, 이는 유리 티올의 한 부분의 산화를 촉진하여 술펜산을 형성하고 추가로 2차 가열 또는 UHT 처리 동안 나머지 유리 티올과 이황화 결합을 형성한다.
재료 및 방법:
6%(w/w, 단백질 중) WPI-C 용액(WPI-C 분말에 대한 자세한 내용은 실시예 4에 나타나 있음)을 20℃에서 pH를 8.0으로 조정하고(분석 B) 40℃ 수조에 넣었다. 단백질 용액의 온도가 40℃에 도달했을 때, 2:1(H2O2와 BLG 사이의 몰비)의 30% H2O2를 교반하면서 천천히 첨가하였다. 이어서 40℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 그 후, 산화된 단백질 용액을 수조에서 꺼내고 카탈라아제를 첨가하여 액세스 H2O2를 제거하고 실온에서 15분 동안 방치했다. 효율적인 가열을 보장하기 위해 얇은 10ml 유리관에 충전된 6ml 용액의 샘플에 60℃에서 81℃의 범위인 온도와 2.5분에서 최대 30분의 다양한 기간으로 열처리를 적용했다. 가열된 샘플을 즉시 10℃ 수조에서 5분 동안 냉각시켰다.
유리 티올에 대한 분석(분석 E)을 수행하고 GPC에 대한 분석(분석 G)을 UHT 시뮬레이션 전 샘플에 대해 수행했다. H2S 수준(분석 D)은 샘플이 실시예 1에 기술된 바와 같이 UHT 시뮬레이션을 거친 후 측정했다.
결과
표 16으로부터 결과는 낮은 투여량의 H2O2(2:1)를 사용할 때, 40℃에서 짧은 인큐베이션 시간, 예를 들어 1시간이 바람직하다는 것을 분명히 보여준다. 인큐베이션 후 유리 티올의 수준은 31.7μmol/g 단백질(WPI-C11)에서 5.4μmol/g 단백질(WPI-C12)로 감소했다. 두 번째 열 처리 없이 WPI-C12를 직접적으로 UHT 처리에 적용하며, 여기서 티올 함량은 1.9μmol/g 단백질로 더욱 감소했다. UHT 처리 동안 이 추가 티올 감소는 이황화 결합의 형성으로 인한 것일 수 있다. 따라서, 단백질 응집체의 형성(증가된 분자량)과 매우 낮은 수준의 H2S로 이어진다.
반면, 샘플(WPI-C13 내지 WPI-C17)이 인큐베이션 후 열처리를 거치는 경우, 81℃에서 5분 동안 가열할 때 가장 낮은 티올 및 H2S 수준이 얻어진다(WPI-C17).
낮은 온도이지만 더 긴 가열 시간, 예를 들어 60℃에서 30분으로의 열처리로(WPI-C13), 유리 티올의 양을 감소시키고 따라서 비산화된 샘플(WPI-C11)에 비해 더 낮은 수준의 H2S를 얻는 것이 또한 가능하다는 것을 인지하는 것이 흥미롭다. 그러나, 이 온도와 시간 조합은 81℃에서 5분 동안의 조합에 비해 훨씬 덜 효율적이었다.
발명자들은 또한 H2O2의 2:1 투여량에서 연장된 가열 시간, 예를 들어 40℃에서 7시간은 바람직하지 않다(WPI-C18)는 것을 입증했다. 더욱이, H2O2의 투여량을 8:1로 증가시킬 경우 1시간의 인큐베이션 시간으로는 충분하지 않다(WPI-C19). 이 경우에 실시예 1에서 입증된 바와 같이 더 긴 인큐베이션 시간, 예를 들어, 18시간이 필요하다.
샘플 WPI-C13 내지 WPI-C19에 대한 UHT 전 분자량과 고유 점도는 모두 WPI-C11에 비해 증가를 보였다. 이는 단백질 분자 사이의 이황화 결합의 형성에 기인한 응집체의 형성을 나타낸다. 단백질 용액은 14 NTU의 낮은 탁도로 여전히 깨끗하다(샘플 WPI-C17에 대해서만 측정됨).
표 16
*) 5.4의 유리 티올의 수준은 UHT 전이고 1.9는 UHT 처리 후임.
결론:
낮은 투여량의 산화제를 사용할 경우 6% 유청 용액의 유리 티올 및 H2S 수준을 감소시키는 것이 가능하였고, 40℃에서 짧은 인큐베이션 시간이 바람직했다. 인큐베이션 후 단백질 용액을 직접적으로 UHT에 적용할 경우 가열 단계가 필요하지 않았고, UHT-처리된 액체는 불쾌한 냄새 없이 음료로 소비될 수 있었다. 그러나, 인큐베이션된 단백질 용액이 분말로 전환되어야 하는 경우 카탈라아제를 불활성화시키기 위한 열처리 단계가 필요하고, 81℃에서 5분 동안 열처리는 후속 UHT 처리에서 불쾌한 냄새가 발생하지 않는 산화된 유청 단백질 조성물을 제공하였다.
발명자들은 본 실시예의 발명의 구현이 시스테인 산화의 선택성을 증가시켜 예를 들어 메티오닌 산화를 감소시킨다는 징후를 확인하였다.
실시예 10: 산화제의 제자리 생성의 사용
발명자들은 유리 티올의 제거, 그 때문에 불쾌한 냄새의 감소가 pH 8.0 및 40℃에서 8시간 인큐베이션에 걸쳐 낮은 투여량에서 산화제의 단계별 첨가에 이어서 1회 또는 2회 가열 단계에 의해 달성될 수 있음을 입증했다.
산화제는 1몰 락토스를 락토비온산으로 전환시켜 1몰 산화제(H2O2)를 생성하는 효소의 사용에 의하여 제공된다. 효소의 활성은 용액에 상대적으로 높은 수준의 H2O2의 존재에 의해 억제될 수 있다. 따라서 H2O2의 제자리 생성은 반응의 시작 시 H2O2의 고농도를 피하기 위해 시간에 걸쳐서 기질과 효소를 단계적으로 첨가하도록 설계되었다.
재료 및 방법:
6%(w/w, 단백질 내) WPI-C 용액(WPI-C 분말에 대한 자세한 내용은 실시예 4에 나타나 있음)을 20℃에서 pH를 8.0으로 조정하고(분석 B) 40℃에서 470분 동안 인큐베이션했다. 락토스(알파-락토스 일수화물, Sigma-Aldrich, 미국 소재)와 락토스 산화효소(LactoYIELD®, Chr. Hansen A/S, 덴마크 소재)를 아래 기술된 대로 WPI-C 용액에 단계별로 첨가했다:
ㆍ 시간 0분에 0.75:1(BLG와 락토스 간의 몰비)의 락토스과 1ml/L의 락토스 산화효소를 첨가했다.
ㆍ 시간 180분에 0.25:1(BLG와 락토스 간의 몰비)의 락토스를 첨가했다.
ㆍ 시간 280분과 400분에 0.25:1(BLG와 락토스 간의 몰비)의 락토스와 0.5ml/L의 락토스 산화효소를 첨가했다.
따라서, 1.5:1(BLG와 락토스 간의 몰비)에 상응하는 락토스와 2ml/L의 락토스 산화효소의 전체 양을 따라서 전체 반응의 기간 동안 첨가했다.
샘플을 불활성 락토스 산화효소를 위해 시간 470분에서 수조에서 81℃로 2.5분 동안 가열하고 즉시 얼음에서 2분 동안 냉각했다.
카탈라아제를 첨가하고 실온에서 30분간 반응하도록 허용하였다.
샘플을 카탈라아제의 불활성화를 위해 다시 81℃로 2.5분 동안 가열하고 즉시 얼음에서 2분 동안 냉각했다.
이후 샘플은 비산화된, 비가열된 WPI-C20 샘플을 참조로 포함하여 다양한 분석에 사용하였다. UHT 전 샘플의 유리 티올, 분자량, 고유 점도는 각각 분석 E, G 및 G에 따라 수행하였다. H2S 검출을 위해 분석 D를 사용하였다.
결과:
40℃에서 470분 인큐베이션 후 유리 티올의 수준은 25.6μmol/g 단백질에서 5.5μmol/g 단백질로 성공적으로 감소했다. 그 때문에 H2S의 매우 낮은 수준은 0.5μM으로, 이는 관능 역치 아래이다. WPI-C20 샘플에 비해 WPI-C21 샘플에서 분자량과 고유 점도가 모두 증가했다. 이는 실시예 9에서의 것에 유사한 응집체의 형성을 나타낸다.
표 17
결론:
산화제 성분의 제자리 생성은 H2O2의 직접 첨가에 대한 대안적 방식이 될 수 있다. 첫 번째 단계 인큐베이션 동안 낮은 투여량 및 제자리 산화제의 단계별 생성은 실시예 9와 유사하게 유리 티올의 산화를 허용하여 술펜산을 형성하고 이어서 추가 가열 단계 동안 이황화물 가교의 형성을 허용한다.
발명자들은 본 실시예의 발명의 구현이 시스테인 산화의 선택성을 증가시켜 예를 들어 메티오닌 산화를 감소시킨다는 징후를 확인하였다.
실시예 11: 락토스 및 락토스 산화효소의 일 단계 첨가에 의한 산화제의 제자리 생성의 활용
실시예 10에 기반하여, 발명자들은 또한 단백질 용액에서 유리 티올을 제거하기 위해 산화제(H2O2)의 생성을 위한 락토스 및 락토스 산화효소의 일-단계 첨가의 가능성을 연구했다.
재료 및 방법:
WPI-C(WPI-C 분말에 대한 자세한 내용은 실시예 4에 나타나 있음)와 탈염수를 혼합하여 6% w/w 단백질을 얻고 그 pH를 20℃에서 8.0으로 조정(분석 B)함에 의해 유청 단백질 용액을 제조했다. 본 실시예의 pH 조정은 항상 필요한 최소량의 산/염기를 사용했고 단지 단백질 농도에서의 미미한 변화만 일으켰다. 유청 단백질 용액을 15분 동안 인큐베이션하여 40℃의 온도에 도달했다. 그 후, 락토스(알파-락토스 일수화물, Sigma-Aldrich, 미국 소재) 및 락토스 산화효소(LactoYIELD®, Chr. Hansen A/S, 덴마크 소재, LactoYield 물질 번호 191306 및 셀로비오스 산화효소 활성(LOXU/g) 17.2)의 전체 투여량을 WPI-C 용액에 함께 첨가했다. 첨가된 락토스의 양은 락토스와 BLG 사이의 몰비가 1.5:1에 상응하므로 생성된 H2O2와 BLG 사이의 이론적인 몰비는 1.5:1에 상응한다. 락토스 산화효소는 2mL/L의 양으로 사용하였다. 그런 다음 용액을 40℃에서 360분 동안 유지하여 H2O2의 형성과 유리 티올의 산화를 허용했다.
인큐베이션의 종료 시 6ml 샘플을 얇은 유리관 안에 넣고 83℃에서 2.5분 동안 가열하고 즉시 얼음에서 2분 동안 냉각했다(샘플 WPI-C23).
참조 샘플인 WPI-C22는 WPI-C의 비산화된 용액(단백질 함량이 6% w/w이고 pH 8.0으로 조정됨)이었다. WPI-C22는 2.5분 동안 83℃로 가열되지 않았다.
이후 WPI-C22와 WPI-C23은 서로 다른 분석을 거쳤다. UHT 전 샘플의 유리 티올, 분자량 등은 각각 분석 E 및 G에 따라 수행하였다. 분석 D를 사용하여 UHT-시뮬레이션(실시예 1에 따름) 후 1시간 이내에 H2S의 검출을 수행했다. 관능 테스트는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행했다.
결과:
40℃에서 420분 인큐베이션 후 유리 티올의 수준은 산화된 샘플(WPI-C23)에서 29.8μmol/g 단백질(WPI-C22)에서 7.3μmol/g 단백질로 성공적으로 감소했다. WPI-C23의 시뮬레이션된 UHT 처리는 1μM의 H2S의 낮은 수준을 나타냈고 실온에서 24시간 보관한 후에도 H2S의 냄새를 감지할 수 없었다. 대조적으로, WPI-C22의 시뮬레이션된 UHT 처리는 관능 테스트에 의해 쉽게 감지되는 강한 달걀 같은 불쾌한 냄새를 생성했다.
WPI-C22 참조 샘플과 비교하여 WPI-C23 샘플에서 분자량이 증가했다. 이는 실시예 9 및 10에서의 것과 유사한 열적 처리의 결과로서 응집체의 형성을 나타낸다.
표 17 유리 티올 수준과 UHT 처리에 의해 생성된 불쾌한 냄새 발생을 감소시키기 위한 산화제의 제자리 생성
기준 샘플 WPI-C22는 2.5분 동안 83℃의 열처리를 거치지 않았고 따라서 WPI-C22에 비교하여 응집(및 그에 따라서 몰 중량, Mw의 증가)이 관찰되지 않았다.
결론:
본 실시예는 락토스(따라서 H2O2)와 BLG 사이의 낮은 몰비에서 락토스와 락토스 산화효소의 일 단계 첨가에 의한 산화제의 제자리 생성이 유리 티올을 감소시키고 UHT 처리 시 단지 낮은 수준의 불쾌한 냄새 발생만을 초래하는 실행가능한 접근법임을 입증했다.
실시예 12: 낮은 투여량의 산화제를 사용한 산화된 유청 단백질 분말의 생산
본 실시예에 보고된 실험에서 발명자들은 실시예 9에 기술된 산화 조건을 사용하여 산화된 유청 단백질 분말을 제조하고 더욱이 생성된 산화된 유청 단백질 스트림을 농축하고 분무 건조하는 타당성을 입증했다. 생성된 변형된 유청 단백질 분말은 중성 pH에서 재수화 및 UHT 처리 후 놀랍게도 낮은 수준의 불쾌한 냄새를 발생시켰다.
예를 들어 그러한 생성물을 장거리 운송할 때(물의 운송을 피함) 에너지를 절약하고 보관 동안 미생물 성장의 위험을 줄이기 위해 분무 건조를 사용함에 의해 물을 제거하는 것이 특히 유리하다.
재료 및 방법:
7.6% w/w 단백질을 함유한 WPI-C(실시예 4, 표 9에 기술된 특징을 가짐) 250kg 용액을 실온에서 부드러운 교반으로 30분 동안 물에 WPI-C의 수화에 의해 제조했다(WPI-C24). 그 후, 용액을 40℃로 가열하고, KOH(4.5%)와 NaOH(2.3%)의 잿물 혼합물을 첨가하여 용액의 pH를 7.8(40℃)로 조정하였다. H2O2를 H2O2와 BLG 사이에 1.9:1의 몰비(대략 150mg H2O2/L에 상응함)를 얻기에 충분한 양으로 첨가하고 용액을 40℃에서 60분 동안 부드럽게 혼합하면서 인큐베이션했다. 인큐베이션의 종료 시 단백질 용액을 2분의 유지 시간으로 판형 열 교환기를 통해 85℃로 가열하였고 이후 <10℃로 냉각했다.
그런 다음 산화된 WPI를 0.3M HCl을 사용하여 30분 동안 교반하면서 pH를 7.1(20℃)로 조정했다. 분석 E에 의한 유리 티올 기, 실시예 1에 따른 UHT 시뮬레이션, 분석 D에 의한 H2S 분석 Q에 의한 탁도, 분석 C에 의한 점도 및 실시예 1에 기술된 바와 같은 관능을 위해 이 시점에서 샘플(WPI-C25) 200ml를 취했다. 아미노산과 산화된 아미노산은 각각 분석 F1과 F2에 의해 정량화하였다.
잔류 산화된 WPI 용액은 2 pcs Alfa Laval RO98pHt 3838/65 멤브레인이 장착되고, 요소당 최대 차압 1.1bar를 갖는 30bar 및 10℃에서 RO 모드에서 작동된 파일럿 규모 MMS NF/RO 장치 상에서 단백질 함량 10.5% w/w에 상응하는 Brix 14로 농축하였다. RO 잔류물을 그 다음 SPX Anhydro 파일럿 규모 분무 건조기(185℃ 입구 온도/85℃ 출구 온도)에서 건조하여 분말(WPI-C26)을 생성했다.
WPI-C26(상기 표에 표시된 조성을 가짐)을 부드러운 교반 하에서 실온에서 재수화하여, 분석 E에 의한 유리 티올 기, 실시예 1에 따른 UHT 시뮬레이션 적용, 분석 D에 의한 H2S 결정 및 실시예 1에 기술된 바와 같은 관능을 특징으로 하는 6% w/w의 양으로 단백질을 함유한 WPI-C26 용액을 생성했다. 잔류 H2O2는 분석 H에 따라 측정했다.
WPI-C26 분말의 별도 샘플을 재수화하여 7.6% w/w의 양으로 단백질을 함유하는 용액을 제공하고 아미노산과 산화된 아미노산을 각각 분석 F1 및 F2에 의해 정량화했다.
샘플 WPI-D24, WPI-D25 및 WPI-D26의 아미노산 프로필은 EU 152/2009 방법 참조를 기반으로 Eurofins Vitamin Testing Denmark DJ041-1에 의해 결정되었다.
조합된 시스테인 + 시스테인 수준은 유로핀스 분석에서 유래되었고 이황화 가교에서 시스테인 잔기(시스테인)의 양은 데이터를 분석 E의 것들과 조합하고(L-시스테인의 분자량을 곱하여 중량-농도로 전환) g/100g 단위로 다시 계산함에 의해 계산되었다:
이황화물에서 Cys = (1 - (g 단위 유리 SH/100g 단백질) / (g 단위 Cys+시스테인/100g 단백질))*100%
결과:
표 18에 나타난 바와 같이, 40℃에서 60분 인큐베이션 시간으로 H2O2의 낮은 투여량에 의한 산화는 출발 물질(WPI-C24)에서의 29.6으로부터 실험실 UHT 처리 후 매우 매우 낮은 양의 H2S를 생성한 1.7μmol SH/g 단백질(WPI-C25)로 유리 티올의 감소를 초래하였으며, 이는 관능 평가로 감지할 수 없었다. 1.8μmol SH/g 단백질 특징화 샘플 WPI-C26은 0.4μM H2S를 생성했으며 관능 평가에서는 감지될 수 없었다.
발명자들은 낮은 탁도 및 점도가 샘플 WPI-C25에 대해 관찰된 494kDa의 Mw와 월등한 일치가 있다는 것을 발견했다.
실시예 12의 공정의 가열 단계 동안, 유리 티올 및 술펜산에 의한 이황화 결합의 형성으로 인해 분자량이 19에서 494kDa로 증가되었다. 발명자들은 WPI-C26의 경우 농축 및 건조 단계에 에 의해 분자량이 717kDa까지 약간 증가한다는 것을 발견했다.
표 18 산화된 유청 단백질 분말의 생산
아미노산 분석의 결과는 도 2에 도시되어 있고 본 발명이 가능하게 하는 유리 티올의 선택적 산화를 입증한다. 산화된 유청 단백질 샘플 WPI-C25 및 WPI-C26은 비산화된 참고 샘플 WPI-C24와 실질적으로 동일한 아미노산 프로필을 가지고 있다.
표 19에 나타난 바와 같이, 샘플 WPI-C24 내지 WPI-C26에서 트립토판 및 메티오닌의 분석에서는 산화(WPI-C25) 및 건조(WPI-C26) 후 이들 아미노산의 수준에서 유의미한 변화가 나타나지 않았으므로 부드럽고 선택적인 산화 과정을 명확하게 입증했다. 표 19는 산화 및 건조 후에 키누레닌이 형성되지 않았음을 추가로 입증한다. 발명자들은 더욱이 샘플 WPI-C24 내지 WPI-C26에서 o-Tyr, DiTyr 또는 DiOia의 흔적을 발견하지 못했다.
총 시스테인(Cys + 시스테인)의 아미노산 분석을 조합함에 의해, 발명자들은 본 실시예의 유리 티올의 감소가 주로 이황화-결합된 시스테인의 82.9%(WPI-D24)에서 산화된 샘플(WPI-D25)에서 99.1% 및 건조된 샘플(WPI-D26)에서 97.4%로 증가에서 입증된 바와 같이 이황화 결합의 형성에 기인하였다는 것을 발견했다; 표 19 참조. 발명자들은 WPI-D25와 WPI-D26 사이의 사소한 차이가 분석 오류 내에 있을 것으로 예상한다. 더욱이, 발명자들은 WPI-D26에서의 응집체가 WPI-D24의 상태로 완전히 환원될 수 있음을 발견하여 응집체가 이황화-결합에 의해 안정화되었음을 확인했다(환원 및 비-환원 조건 하에서 샘플의 SDS-PAGE 분석에 의해 확인됨).
마지막으로, 잔류 과산화물의 분석은 WPI-D25와 WPI-D26에는 이전에 첨가된 과산화물이 전혀 존재하지 않았다는 것을 밝혔다.
표 19 샘플 특징(BDL = 검출 한계 미만)
결론:
낮은 투여량의 산화제와 짧은 반응 시간을 사용하여 UHT 처리 동안 불쾌한 냄새가 발생하지 않는 산화된 WPI 분말을 생산하는 것이 가능하였다. 이 조합은 환원성 이황화 결합에서 높은 양의 cys, 유리 티올로서 낮은 시스테인 수준, 및 결과적으로 UHT 처리를 거칠 때 생성된 낮은 수준의 H2S를 특징으로 하는 액체 생성물과 분말 둘 모두를 초래했다.
WPI-D25 및 WPI-D26 제조에 사용된 산화제의 낮은 투여량은 원료(WPI-D24)의 것과 비슷하고 특히 총 시스테인 또는 메티오닌 잔기의 유의미한 손실 없이 눈에 띄는 아미노산 프로필을 초래했고 산화 생성물이 검출될 수 있었다.
첨가된 과산화물의 잔류물의 존재는 WPI-D25 및 WPI-D26에서는 검출될 수 없었으며, 이는 과산화물이 본 방법에서 산화제로 사용될 수 있고 카탈라아제의 첨가에 대한 필요 없이도 완전히 소비될 수 있음을 나타낸다.
실시예 13: 낮은 투여량 및 고온의 사용
발명자들은 낮은 투여량의 산화제의 사용이 직접 증기 주입 UHT 처리와 조합하여 효율적으로 사용되어 유청 단백질 조성물에서 유리 티올을 성공적으로 감소시킬 수 있고 결과적으로 후속 열적 처리 시 낮은 수준의 불쾌한 냄새를 갖는 유청 단백질 음료로 이어질 수 있음을 입증했다.
재료 및 방법:
WPI-C 분말을 탈염수에 용해시킴에 의해 WPI-C 용액(6% w/w의 양으로 되는 단백질) 225kg을 제조했다.
WPI-C 용액을 가열 맨틀을 사용하여 유지 탱크에서 교반하면서 40℃로 가열했다. WPI-C27을 생산하기 위해 pH를 40℃에서 측정한 pH 7.8로 조정하였다.
WPI-C27 20kg이 143℃에서 4초 동안 직접 증기 주입(DSI)에 의해 직접적으로 UHT 처리를 거치고(WPI-C28) 후속적으로 플래시 냉각에 의해 70℃로 냉각된 다음 10℃로 냉각되었다. WPI-C28의 플래시 냉각으로부터 플래시 수는 샘플 Flash1로 수집되었다.
잔류 WPI-C27은 40℃에서 60분 동안 1.9:1 H2O2:bLG와 그 다음 143℃에서 4초의 유지 시간으로 직접 증기 주입에 의한 UHT 처리로 산화되고 후속적으로 플래시 냉각에 의해 70℃로 냉각된 다음 10℃로 냉각되어 산화된 WPI-C29 샘플을 생성했다. WPI-C29의 플래시 냉각으로부터 플래시 물을 후속 적용에서 낮은 H2S 수준을 생성하는 생성물을 생산함에 있어 H2O2의 낮은 투여량과 고온 처리(여기서는 DSI)를 조합한 생산 공정의 타당성을 조사하기 위해 샘플 Flash2로 수집했다.
수집 직후, Flash1 및 Flash2 샘플 1.0mL를 2mL GC 바이알(Mikrolab no ML 33003VU)로 옮기고 알루미늄 뚜껑(Mikrolab ML 33032)과 전자 크림퍼(Thermo Scientific CRMA60180-ECRH11KI)를 사용하여 크림프-밀봉했다. 샘플 Flash1 및 Flash2에서 H2S 함량은 분석 D에 따라 분석했다.
WPI-C27 및 WPI-C29는 산화된 WPI-C29 샘플이 가혹한 열 처리를 거치는 경우에도 낮은 수준의 불쾌한 냄새를 생성한다는 것을 입증하기 위해 추가로 UHT 처리를 시뮬레이션하도록 적용했다. 샘플 WPI-C27, WPI-C28 및 WPI-C29의 유리 티올 함량 및 분자량을 각각 분석 E 및 G에 따라 분석했다.
결과:
본 조사에서, 발명자들은 표 20에 나타낸 바와 같이 유리 티올 함량에서의 효율적인 저하를 입증하기 위해 가열 것으로서 143℃에서 4초의 직접 증기 주입과 조합하여 낮은 H2O2 투여량(1.9:1 H2O2:bLG)을 이용했다.
표 20은 H2O2의 부재에서 WPI-C28을 생산하기 위해 직접 증기 주입에 의해 WPI-C27 원료의 유리 티올 함량이 미미하게 감소함을 입증한다. 그러나, WPI-C29를 생성하기 위한 직접 증기 주입과 조합한 1.9:1 H2O2:bLG 몰비로 산화는 유리 티올 함량을 5.9μmol SH/g 단백질로 유의하게 감소시킨다.
WPI-C28과 WPI-C29의 열적 가공 과정에서 생성된 단백질 응집체의 분자량은 본질적으로 구별할 수 없다는 것이 추가로 입증되었으며 이는 WPI-C29의 가공 과정에서 낮은 H2O2 함량의 존재는 WPI-C의 전체적인 응집 성향에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
WPI-C28의 가공 과정 동안 발명자들은 놀랍게도 샘플을 가열하기 위한 직접 증기 주입 및 143℃에서 4초의 유지 시간 후 열적 처리의 증발/응축 단계 동안 생성된 플래시 물(Flash1)로부터 계란 향을 감지했다. 실제로 수집된 플래시 물(Flash 1)에서 4.3μM H2S 농도가 입증되었고 작업자가 쉽게 감지할 수 있었다.
대조적으로, WPI-C29 샘플의 가공 과정 동안 발명자들은 계란 향을 관찰하지 않았고 H2S 측정은 수집된 플래시 물(Flash2)에서 매우 낮은 수준의 0.1μM H2S를 확인했다. 발명자들은 따라서 놀랍게도 낮은 H2O2 투여량의 사용이 그 자체로 제조 공정에서 열적 처리에 의해 생성된 H2S 수준에 대한 작업자의 노출을 줄이는데 유익할 수 있음을 발견했다.
시뮬레이션된 UHT 처리를 거친 WPI-C27 및 WPI-C29 샘플의 H2S 함량은 샘플에서 각각 5.7μM H2S 및 0.3μM H2S를 나타냈다. 가공 동안 고온의 사용과 조합하여 낮은 투여량의 H2O2로의 산화는 음료의 최종 제조에서 H2S 수준이 없는/낮은 음료 조성물을 제조할 수 있다는 수준과 명확하게 입증되었다.
표 20 실시예 13에서 제조된 샘플
결론:
발명자들은 예를 들어 1.9:1 H2O2:bLG의 몰비를 사용한 유청 단백질의 산화가 유청 단백질 조성물의 유리 티올의 함량을 감소시키기 위해 UHT-유형의 열 처리와 조합하여 사용될 수 있다는 것을 입증했다.
유청의 가공에서 낮은 H2O2 투여량의 사용은 UHT 장비의 작업자에 대한 H2S의 노출을 유의하게 줄일 수 있다.
WPI-C29의 유리 티올 기의 낮은 함량에 기인하여 두 번째 UHT-처리를 거치는 경우에도 불쾌한 냄새가 발생하지 않을 것이다.
실시예 14: 만성 신장 질환 환자에 대해 적합한 산화된 유청 단백질 음료를 생산하기 위한 낮은-투여량의 H2O2의 사용
만성 신장 질환 환자는 신장 기능장애로 인해 많은 단백질-풍부 식품(고기, 가금류, 유제품)에서 흔히 발견되는 유기 인을 잘 제거하는데 비효율적이고, 따라서 인이 낮은 유청 단백질 조성물을 제공하는 것이 특히 유익할 수 있다. 본 실시예는 BLG 단리물이 선택적인 낮은-투여량 H2O2 산화를 거쳐 불쾌한 냄새가 낮은(또는 불쾌한 냄새가 전혀 없는) 영양 pH 중성 음료를 생산할 수 있음을 입증한다. 이러한 음료는 첨가된 지질이 있거나 없이 둘 모두로 생산될 수 있다.
재료 및 방법:
표 21에 기술된 특징을 갖는 WPI-D를 사용하여 본 실시예의 음료 조성물을 제조하였다.
표 21 WPI-D 특징
3리터 WPI-D 단백질 용액(6% 단백질 w/w)은 분말을 탈염수에 30분 동안 부드러운 교반으로 용해함에 의해 제조되었다. 3M NaOH를 사용하여 pH를 20℃에서 pH 8.0으로 조정하고 용액을 더 작은 분취액으로 분할하고 40℃로 평형화했다. 3% 과산화수소를 H2O2와 bLG 사이 2:1의 최종 함량 몰비로 첨가하고 산화 단백질 용액을 40℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 산화 용액은 OMVE HT122 벤치-탑 UHT 시스템을 사용하여 2.5분의 유지 시간으로 83℃로 열 처리되고 후속적으로 20℃로 냉각되었다.
산화된 단백질 용액을 5kDa 한외여과막이 장착된 200mL Amicon 교반된 셀의 사용에 의해 3bar TMP에서 N2 가스를 사용하여 7.8%로 농축하여 샘플 WPI-D5를 제공했다. 단백질 함량은 PAL-α 휴대용 굴절계(ATAGO)를 사용하여 추정하고 분석 A로 확인했다.
7.8% 단백질 w/w를 함유한 참조 용액(WPI-D6)은 추가 처리 없이 WPI-D를 탈염수에 30분 동안 부드럽게 교반하면서 용해함에 의해 제조하였다.
WPI-D5 및 WPI-D6 용액의 유리 티올 함량은 분석 E에 따라 결정했다.
지질이 있거나 없는 예시적인 음료 조성물(BEV-D1, BEV-D2, BEV-D3 및 BEV-D4)은 표 22에 기술된 성분을 혼합함에 의해 제조하였다. 단백질 및 지질 성분은 개별적으로 40℃로 수조에서 사전 평형화하고 유화제를 지질 상에 첨가하였다.
이어서 사전-평형화된 단백질 용액을 지질상 또는 탈염수와 혼합하고 울트라-투락스를 사용하여 간략하게 혼합하고 마지막으로 GEA Panda 균질기를 사용하여 200bar에서 균질화하여 6% w/w의 단백질 함량을 갖는 표 22의 음료 조성물을 생성했다. 음료 조성물은 실시예 1에 따라 시뮬레이션된 UHT 처리를 거치고 UHT 시뮬레이션 다음 날 분석 D를 사용하여 H2S를 측정했다.
표 22 예시적인 음료 조성물의 레시피.
결과:
본 실시예에서는 특히 최소한의 인 함량을 지닌 단백질 공급원이 필요한 만성 신장 질환를 위한 영양 음료로 적합하게 되는 인 함량이 낮은 것을 특징으로 하는 WPI-D로부터 83℃에서 열처리와 조합하여 낮은 H2O2 투여량의 사용에 의해 산화된 WPI-D5를 생산하는 가능성을 입증했다.
표 23에서 입증된 바와 같이 산화 공정은 WPI-D6에서 54.2μmol SH/g 단백질로부터 WPI-D5에서 산화 후 9.2μmol SH/g 단백질로 유리 티올의 양을 감소시켰다는 것이 밝혀졌다.
지질이 있거나 없는 영양 음료 조성물이 시뮬레이션된 UHT 처리를 거치는 경우 비산화된 WPI-D6 단백질을 함유한 BEV-D1 및 BEV-D3 샘플이 관능 역치를 유의하게 초과하는 약 10μM H2S 초과의 H2S 수준을 생성하는 것으로 나타났다. 대조적으로, WPI-D5 단백질을 함유하는 BEV-D2 및 BEV-D4 음료 조성물은 <0.7μM H2S를 발생시켰고 관능 테스트에서 감지된 수준을 낮추었다.
표 23 시뮬레이션된 UHT 처리 후 음료 특징
결론:
10% w:w 지질을 포함하는 6% 유청 단백질 음료를 생산하기 위해 WPI-D의 사용은 2:1 H2O2:bLG를 사용한 산화를 통해 입증되었다. WPI-D의 낮은 인 수준은 이러한 음료를 만성 신장 질환으로 고통받는 환자에게 특히 유용하게 한다.
실시예 15: 유리 티올의 노출을 위한 고압의 사용
본 실시예에서 발명자들은 단백질 조성물을 그 자체로는 압력 완화 후 결정된 바와 같이 주요 티올-함유 유청 단백질(bLG)의 유의한 변성/응집을 유도하기에는 불충분한 적당한 압력 하에서 산화 조건을 거치게 함에 의해 WPI-D에서 유리 티올을 산화시키는 것을 목표로 했다.
발명자들은 새로운 이황화 결합의 형성을 달성하기 위한 구조적 자유도가 존재하는 한 bLG에서 유리 티올의 부분 산화가 술펜산으로 산화된 유리 티올과 남아있는 비산화된 유리 티올 사이의 이황화 결합 형성을 허용한다는 것을 제안한다. 본 실시예에서 이 구조적 자유도는 가압 하에서 유리 티올을 H2O2에 노출시킨 후 용액을 85℃에서 5분 동안 가열함에 의해 달성된다.
방법 및 재료
WPI-D는 실온에서 부드럽게 교반하면서 6%로 재수화하고 이어서 20℃에서 2M NaOH를 사용하여 pH를 8.0(WPI-D7 내지 WPI-D13)으로 조정했다.
H2O2를 샘플 WPI-D8 내지 WPI-D10, WPI-D12 및 WPI-D13에 첨가하여 H2O2:bLG 몰비가 2:1에 도달했다. WPI-D7, 및 WPI-D11에는 H2O2를 첨가하지 않았다.
WPI-D13을 제외한 각 샘플 32mL를 Nalgene HDPE 플라스틱병에 옮겨 담고 캡으로 밀봉하였다. 병을 정수성 유체 매질을 함유한 압력 용기에 담그고 QFK-6 고압 장치(Avure Technoliges AB, 스웨덴 베스테로스 소재)를 사용하여 표 24에 기술된 대로 20-25℃에서 30 또는 60분 동안 50 또는 100bar로 가압했다.
샘플 WPI-D8 내지 WPI-D13(WPI-D9 제외)은 고압 처리에서 직접적으로 취하고 15mL 샘플을 나사-캡 뚜껑이 있는 20mL Duran GL 18 시약 유리로 옮기고 86℃ 수조에 5분간 담갔다. 가열 후 샘플을 얼음물 수조에서 냉각했다.
모든 샘플의 유리 티올 함량은 분석 E에 따라 측정했다. 선택된 샘플은 실시예 1에 따라 시뮬레이션된 UHT 처리 및 관능 평가를 거쳤고 H2S는 실시예 D에 따라 측정했다.
결과:
bLG에서 유리 티올에 접근할 수 있도록 적당한 압력의 사용을 평가했다. H2O2(WPI-D7)의 부재에서 85℃/5분으로 가열하면서 pH 8.0에서 고압 처리하면 시뮬레이션된 UHT 후 높은 수준의 불쾌한 냄새가 발생하고 발명자에게는 '계란향'으로 감지된다.
H2O2(WPI-D12)의 존재에서 pH 8.0에서 고압 처리는 유리 티올 수준에서 ~23μmol SH/g 단백질 또는 출발 물질의 절반 바로 아래(이론적으로 54μmol SH/g 단백질)로의 감소로 이어진다. 85℃/5분의 열 처리와 조합했을 때 생성된 유리 티올 수준은 WPI-D13에서 6.8μmol SH/g 단백질, WPI-D8에서 5.9μmol SH/g 단백질, WPI-D10에서 3.9μmol SH/g 단백질로 감소했다. 샘플 WPI-D8 및 WPI-D13의 시뮬레이션된 UHT 처리 후 불쾌한 냄새를 측정한 결과, 티올 환원은 0.5 및 0.4μM H2S에서 낮은 수준의 불쾌한 냄새와 5 미만의 감지도를 초래한다는 이전 관찰이 확인되었다. 압력 처리 없이 2:1 H2O2:bLG의 존재에서 85℃에서 5분 동안 샘플 WPI-D9의 열적 처리는 또한 유리 티올 수준을 감소시켰지만 식별된 유리 티올 수준이 9μmol SH/g 단백질로 효율성이 약간 떨어졌다.
표 24 WPI-D에서 유리 티올의 고압 산화
결론:
본 실시예는 풀린 단백질에 대한 대안적인 수단을 이용하여 유리 티올을 노출시키고 산화를 허용할 수 있음을 입증한다. 여기에서 적당히 높은 압력, 낮은 2:1 H2O2:bLG 산화제 투여량 및 이어지는 열적 처리의 조합은 유리 티올 수준을 UHT 처리를 거치는 경우 매우 낮은 감지 및 측정된 수준의 불쾌한 냄새로 이어질 정도로 감소시키는데 충분했다.
실시예 16: 낮은 투여량 및 짧은 인큐베이션 시간의 사용
본 실시예에서 발명자들은 놀랍게도 매우 짧은 인큐베이션 시간으로 고온 산화에 의해 산화된 WPI를 생산하는 것이 가능하였다는 것을 보여주었다.
재료 및 방법:
6% 단백질(w/w) WPI 용액(WPI-C)을 40℃에서 pH 7.8로 조정하고 대략 10℃로 냉각시켰다. 그 후 H2O2를 WPI 용액에 첨가하여 H2O2:bLG 몰비가 1.9:1에 도달하도록 하고 1분 동안 혼합했다. WPI 용액을 판형 열 교환기를 통해 85℃로 가열한 직후 유지 시간을 2분으로 하여 고온 산화를 수행하고 후속적으로 <10℃로 냉각시켰다(WPI-C30).
음료는 WPI-C30(액체 산화된 WPI 용액)으로부터 생산되었다. UHT 전에 6% 산화된 WPI 용액의 pH는 1% HCl을 사용하여 pH 7.0(22℃)으로 조정되었다. UHT 열적 처리는 80L/h의 서비스 수 유량, 20L/h의 생성물 유량, 70℃로 예열한 후 143℃에서 20초 동안 가열로 작동되는 판형 열교환기(PHE)(HT320-20, OMVE, 네덜란드 소재)를 사용하여 수행되었다. 열처리된 음료를 출구에서 10℃로 냉각하고 100ml 멸균 플라스틱 병에 담아 추가 분석을 위해 즉시 밀봉했다. 더욱이, H2S 수준 분석(분석 D)을 위한 샘플을 UHT의 출구에서 취했는데, 여기서 샘플 1ml를 2ml 유리 바이알에 충전하고 실시예 1에 기술된 바와 같이 즉시 뚜껑으로 크림프-밀봉했다.
결과:
본 실험에서는 10℃에서 H2O2(1.9:1)를 첨가하여 유리 티올의 함량을 93%까지 감소시키고 85℃/2분에서 짧은 인큐베이션 시간에서 고온 산화를 수행할 수 있었음을 입증했다. 이에 의해 투명한(9.2 NTU) UHT 음료에서는 매우 낮은 수준의 H2S(0.2μM)가 발견되었다.
결론:
발명자들은 65℃를 초과하는 온도에서 단시간 동안 낮은 수준의 H2O2와 함께 단백질을 인큐베이션함에 의해 가공 시간 및 에너지 사용을 줄일 수 있음을 발견했다. 얻은 산화된 유청 단백질 조성물은 음료로 직접적으로 사용될 수 있고, 예를 들어 고온 산화 후 즉시 병입될 수 있거나, 대안적으로 그대로 건조되거나 농축되고 후속적으로 바람직하게는, 분무 건조에 의해 건조될 수 있다.
Claims (37)
- 산화된 유청 단백질 조성물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
a) 유청 단백질 공급원을 가공하여, 산화 유청 단백질 용액을 제공하는 것으로, 여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은,
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제를 포함하고, 그리고
- 6.5-9.5의 범위인 pH,
- 산화 유청 단백질 용액의 중량에 대해 적어도 1% w/w의 총 단백질 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 10% w/w의 베타-락토글로불린(BLG) 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w의 단백질 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 총 지방 함량을 가지며,
여기서 상기 산화 유청 단백질 용액은 추가로
i) 0-160℃의 범위인 온도이고/이거나
ii) 20-4000bar의 범위인 압력으로 가압되고,
b) 상기 산화 유청 단백질 용액의 BLG 분자 중 적어도 일부의 유리 티올의 산화를 허용하는 하나 이상의 조건 하에서 상기 산화 유청 단백질 용액을 인큐베이션하여, 바람직하게는, 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 양을 최대 15 마이크로몰/g 단백질로 감소시키는 것으로, 여기서 상기 하나 이상의 조건은
I) 0-160℃의 범위인 온도의 산화 유청 단백질 용액, 및/또는
II) 20-4000bar의 범위인 압력으로 가압된 산화 유청 단백질 용액을 포함하고,
c) 임의로, 보다 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액 또는 이의 단백질 농축물을 적어도 60℃의 온도로 가열하는 것을 포함하는 열처리 단계를 거치고,
d) 임의로, 보다 바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액으로부터 유래된 단백질을 적어도 포함하는 액체 공급원료를 건조시키는 것을 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 과산화물, 오존, 이산소 또는 이의 조합을 포함하거나 심지어 이로 이루어진, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제는 과산화수소, 벤조일 퍼옥사이드 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 과산화물인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량 사이의 몰비는 적어도 1:2, 보다 바람직하게는 적어도 1:1, 보다 더 바람직하게는 적어도 2:1, 가장 바람직하게는 적어도 3:1인, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의
- 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제와
- 유리 티올 기의 총량 사이의 몰비는 1:2-15:1, 더 바람직하게는 1:1.5-10:1, 보다 더 바람직하게는 1:1-8:1, 가장 바람직하게는 1:1-3:1인, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 7.0-9.5, 보다 바람직하게는 7.1-8.5, 보다 더 바람직하게는 7.2-8.5, 가장 바람직하게는 7.4-8.2의 범위인 pH를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액은 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 보다 바람직하게는 최대 0.5% w/w, 보다 더 바람직하게는 최대 0.2% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.1% w/w의 총 지방 함량을 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 조건 i)은 5-65℃, 보다 바람직하게는 10-65℃, 보다 더 바람직하게는 30-60℃, 가장 바람직하게는 40-55℃의 범위인 온도를 갖는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 조건 i)은 66-160℃, 보다 바람직하게는 70-145℃, 보다 더 바람직하게는 75-120℃, 가장 바람직하게는 80-100℃의 범위인 온도를 갖는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 조건 ii)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액에 20-4000bar, 보다 바람직하게는 200-3500bar, 보다 더 바람직하게는 300-3000bar, 가장 바람직하게는 500-2500bar의 범위인 압력을 적용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 조건 ii)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액에 25-1000bar, 보다 바람직하게는 30-500bar, 보다 더 바람직하게는 35-300bar, 가장 바람직하게는 40-200bar의 범위인 압력을 적용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)는 단계 a)의 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올 기의 초기 양을, 상기 초기 양의 20-80%, 보다 바람직하게는 초기 양의 30-80%, 보다 더 바람직하게는 50-75%, 가장 바람직하게는 60-75%로 감소시키거나 감소시키도록 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)는 산화 유청 단백질 용액의 유리 티올의 양을 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 8 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 2 마이크로몰/g 단백질로 감소시키거나 감소시키기 위해 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
- 단계 b) 동안 소비되지만 단계 b)의 종료 시 제거된 임의의 과잉 산화제는 배제시킨, 산화제의 양과
- 단계 a)에서 유리 티올 기의 초기 양 사이의 몰비는 1:2-30:1, 더 바람직하게는 1:2-25:1, 보다 더 바람직하게는 1:1-20:1, 가장 바람직하게는 1:1-15:1인, 방법. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
- 단계 b) 동안 소비되지만 단계 b)의 종료 시 제거된 임의의 과잉 산화제는 배제시킨, 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 산화제의 양과
- 단계 a)에서 유리 티올 기의 초기 양 사이의 몰비는 1:4-15:1, 더 바람직하게는 1:3-10:1, 보다 더 바람직하게는 1:2-5:1, 가장 바람직하게는 1:2-2:1인, 방법. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)의 기간은 최대 12시간, 보다 바람직하게는 최대 6시간, 보다 더 바람직하게는 최대 3시간, 가장 바람직하게는 최대 1시간인, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)는 상기 산화 유청 단백질 용액을 시스테인의 티올 기를 산화시킬 수 있는 잔류 산화제를 제거하는 성분, 바람직하게는 카탈라아제와 접촉시킴으로써 산화를 중단시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)로부터 얻은 산화된 유청 단백질 용액을 열처리 단계에 적용하는 것을 포함하는 c)를 추가로 포함하는, 방법.
- 다음을 포함하는 산화된 유청 단백질 조성물:
- 총 고형물에 대해 적어도 30% w/w의 단백질 함량,
- 최대 15 마이크로몰의 유리 티올 기/g 단백질,
- 총 단백질에 대해 적어도 0.7% w/w의 트립토판 함량,
- 총 단백질에 대해 적어도 0.3% w/w의 메티오닌 함량,
- 최대 0.2 마이크로그램/mg 단백질의 키누레닌 함량,
- 바람직하게는, 총 고형물에 대해 최대 3% w/w의 지방 함량,
- 바람직하게는, 100-600 마이크로몰/g 단백질의 범위인 단백질 결합 황의 함량,
- 바람직하게는, 150-400 마이크로몰/g 단백질의 범위인 이황화 결합을 형성하는 단백질 결합 시스테인 잔기의 함량. - 제19항에 있어서, 18kDa 내지 10000kDa, 보다 바람직하게는 50-8000kDa, 가장 바람직하게는 80-5000kDa의 범위인 단백질의 중량 평균 분자량을 갖는, 산화된 유청 단백질 조성물.
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 단백질의 적어도 60% w/w는 18kDa 내지 10000kDa, 보다 바람직하게는 적어도 80% w/w, 보다 더 바람직하게는 적어도 90% w/w, 가장 바람직하게는 적어도 99% w/w의 분자량을 갖는, 산화된 유청 단백질 조성물.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 총 고형물에 대해 적어도 86% w/w, 가장 바람직하게는 총 고형물에 대해 적어도 90%의 단백질 함량을 갖는, 산화된 유청 단백질 조성물.
- 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 총 고형물에 대해 최대 1% w/w, 가장 바람직하게는 최대 0.2%의 지방 함량을 갖는, 산화된 유청 단백질 조성물.
- 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 최대 10 마이크로몰의 유리 티올 기/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 5 마이크로몰의 유리 티올 기/g 단백질을 포함하는, 산화된 유청 단백질 조성물.
- 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 총 단백질에 대해 0.7-3% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 1.0-3% w/w의 트립토판 함량을 갖는, 산화된 유청 단백질 조성물.
- 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 총 단백질에 대해 0.3-3.3% w/w, 가장 바람직하게는 총 단백질에 대해 1.3-3.2% w/w의 메티오닌 함량을 갖는, 산화된 유청 단백질 조성물.
- 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 최대 0.2 마이크로그램/mg 단백질, 가장 바람직하게는 최대 0.01 마이크로그램/mg 단백질의 키누레닌 함량을 갖는, 산화된 유청 단백질 조성물.
- 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 분말의 형태인, 산화된 유청 단백질 조성물.
- 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 액체의 형태인, 산화된 유청 단백질 조성물.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된, 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 산화된 유청 단백질 조성물.
- 5.5-8.5의 pH, 보다 바람직하게는 6.5-7.5의 pH를 갖는 열처리된, 바람직하게는 열 멸균된 음료로서, 상기 음료는 적어도 0.5% w/w 단백질을 차지하기에 충분한 양으로 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 산화된 유청 단백질 조성물을 포함하고, 바람직하게는 생산 7일 후에 최대 5 마이크로몰/L, 보다 바람직하게는 3 마이크로몰/L, 보다 더 바람직하게는 1.0 마이크로몰/L, 가장 바람직하게는 최대 0.7 마이크로몰/L의 H2S의 함량을 갖는, 음료.
- 다음을 포함하는 식품 성분:
- 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 산화된 유청 단백질 조성물의 고형물, 및
- 하나 이상의 추가 성분(들)로 바람직하게는 다음으로부터 선택됨:
- 유제품 성분, 바람직하게는, 비산화된 유제품 성분,
- 식물 기반 성분,
- 비유제품 탄수화물 공급원,
- 향미제, 및/또는
- 감미료(감미 탄수화물/폴리올/HIS). - 제32항에 있어서, 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 산화된 유청 단백질 조성물의 고형물이 상기 식품 성분의 중량의 0.5-95% w/w, 보다 바람직하게는 상기 식품 성분의 중량의 1-90% w/w, 보다 더 바람직하게는 5-85% w/w, 가장 바람직하게는 10-80% w/w를 차지하는, 식품 성분.
- 제32항 또는 제33항에 있어서, 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 산화된 유청 단백질 조성물의 고형물이 상기 식품 성분의 단백질의 0.5-95% w/w, 보다 바람직하게는 상기 식품 성분의 단백질의 1-90% w/w, 보다 더 바람직하게는 5-85% w/w, 가장 바람직하게는 10-80% w/w를 차지하는, 식품 성분.
- 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 최대 15 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 14 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 13 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 12 마이크로몰/g 단백질의 양으로 유리 티올 기를 포함하는, 식품 성분.
- 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 최대 10 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 8 마이크로몰/g 단백질, 보다 바람직하게는 최대 5 마이크로몰/g 단백질, 보다 더 바람직하게는 최대 3 마이크로몰/g 단백질, 가장 바람직하게는 최대 2 마이크로몰/g 단백질의 양으로 유리 티올 기를 포함하는, 식품 성분.
- 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 분말의 형태이고, 바람직하게는 최대 6% w/w의 양으로 물을 포함하는, 식품 성분.
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