KR20240069748A - B7-h3 표적화 융합 단백질 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B7-H3 표적화 융합 단백질 및 그의 사용 방법을 제공한다. 표적화 융합 단백질은 B7-H3 표적화 결합 단백질, CD16 표적화 결합 단백질, 및 인터류킨-15 단백질을 포함하는 B7-H3 표적화 삼중특이적 킬러 관여자 분자를 포함한다. 그의 사용 방법은 암 치료 방법, 암 세포에 대한 자연 킬러 (NK) 세포 활성의 유도 방법, 종양 성장의 억제 방법, 암을 갖는 대상체의 생존 증가 방법, 및 대상체에서의 암 세포에 대한 NK-매개 항체-의존적 세포의 세포독성의 유도 방법을 포함한다.

Description

B7-H3 표적화 융합 단백질 및 그의 사용 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2021년 9월 16일 출원된 미국 가출원 번호 63/245,132의 35 U.S.C. § 119(e) 하에서의 우선권 이익을 주장한다. 우선권 출원의 개시내용은 본 출원의 부분으로 간주되며 그 전체가 본 출원의 개시내용에 참조로 본원에 포함된다.
서열 목록의 포함
첨부된 서열 목록의 자료는 이로써 본 출원에 참조로 포함된다. 파일명이 G1421US00_GTBIO2180-1WO.xml인 첨부된 서열 목록 xml 파일은 2022년 9월 13일에 생성되었고, 크기가 55kb이다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 융합 단백질, 또한 보다 구체적으로는 B7-H3 표적화 삼중특이적 킬러 관여자 분자 및 암 치료를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
면역요법은 면역 반응을 증폭 또는 감소시키도록 면역 시스템을 활성화시키거나 억제하는 개별화된 치료이며, 다양한 형태의 암 치료를 위해 빠르게 발전하고 있다. 키메라 항원 수용체 (CAR)-T 세포, CAR-자연 킬러 (NK) 세포, PD-1 및 PD-L1 억제제 등의 암을 위한 면역요법은 환자의 면역 시스템이 암과 싸우도록 돕는 것을 목표로 한다. T 세포의 활성화는 T 세포 수용체 (TCR) 및 펩티드-결합 주요 조직적합성 복합체 (MHC)의 특정 조합, 및 항원 제시 세포 (APC) 상의 리간드와 T 세포의 공동-자극 분자의 상호작용 둘 다에 의존한다. 활성화된 APC 상의 말초 막 단백질인 B7 패밀리는 T 세포 반응의 조절에 참여하는 것으로 나타났다. 최근 연구는, 암 미세환경에서 억제성 B7 분자의 상향조절이 종양의 면역 회피와 크게 관련됨을 나타낸다. B7 패밀리의 새롭게 식별된 구성원으로서, B7-H3은 T 세포의 활성화 및 IFN-γ의 생성을 촉진할 수 있다.
상이한 B7 분자는 면역 세포 반응을 조절하면서 양성 또는 음성 공동-자극 신호를 갖는다. 면역 체크포인트, 예컨대 PD-1, PD-L1, PD-L2, 및 CTLA4는, 면역 시스템을 회피하고 증식을 용이하게 하도록 많은 수용체-리간드 상호작용을 유지하는 분자이다. 억제성 면역 반응을 하향조절하고 종양 세포를 제거하는 T 세포의 세포 세포독성을 촉진하기 위해 이들 단백질을 차단하는 여러 모노클로날 항체 (mAb)가 개발되었다. 면역 체크포인트-차단 약물 중, PD-1 또는 CTLA4를 표적화하는 억제제는, 개선된 반응 및 연장된 생존으로, 전이성 흑색종을 갖는 환자의 치료에 성공적으로 사용되었다. 이 성공은 신장 세포 암종 (RCC), NSCLC, 및 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함한 폭넓은 범위의 악성 종양의 치료를 위한 이러한 작용제의 개발로 이어졌고, 이는 종래의 치료와 비교하여 반응 속도를 더욱 향상시켰고, 환자의 생존 시간을 연장시켰다 (Yang 등, Int J Biol Sci 2020; 16(11):1767-1773).
B7-H3은 여러 종류의 인간 암 세포 중에서 과발현되는 것으로 밝혀졌으며 질환 악화와 상관되었다. B7-H3는 T 세포 활성화 및 IFN-γ 생성과 같은 면역 반응에 대한 공동-자극 분자로서 인식되었다. TCR 신호를 모방하는 항-CD3 항체의 존재 하에, 인간 B7-H3-Ig 융합 단백질은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다의 증식을 증가시키고 시험관내에서 세포독성 T 림프구 (CTL)를 향상시킨다. B7-H3은 또한 결장의 선암종에 대한 항종양 효과를 가지며, 이는 또한 결장암의 치료를 위한 유망한 치료법으로서 간주될 수 있다. 인간 췌장암 환자들 사이의 연구에서, B7-H3은 췌장암에서 풍부하게 발현될 뿐만 아니라 증가된 치료 효능과 관련된 공동-자극 분자로서 인식되었다. B7-H3 발현이 대부분의 검사된 췌장암 샘플에서 검출가능하고, 정상 췌장에 비해 췌장암에서 유의미하게 상향조절되었지만, 높은 종양 B7-H3 수준을 갖는 환자는 낮은 종양 B7-H3 수준을 갖는 환자보다 유의미하게 더 우수한 수술후 예후를 가졌다 (Yang 등, 동일 문헌).
특정 성공에도 불구하고, mAb 치료법의 전반적 효율을 감소시키는 한계가 존재한다. CD16-지향된 이중특이적 및 삼중특이적 단일-사슬 단편 가변 (BiKE 및 TriKE) 재조합 분자의 개발로, 이들이 전체 항체의 Fc 부분이 결핍되고 CD16에 대한 표적화된 특이성을 가짐에 따라 높은 이펙터 기능을 끌어내면서 이들 원치 않는 한계의 대부분이 방지된다 (Gleason 등, Mol Cancer Ther; 11(12); 2674-84, 2012). 그 결과, 재조합 시약은 자연 킬러 (NK) 세포 면역요법을 향상시키는 데 있어 임상적 사용에 대해 매력적이다.
NK 세포가 표적을 인식하고 사멸시키는 능력은 억제성 및 활성화 세포 표면 수용체의 정교한 레퍼토리에 의해 조절된다. NK 세포의 세포독성은, NK 세포의 CD56dim 서브세트에 의해 고도로 발현되는 면역글로불린 G (IgG)에 대한 활성화 저-친화력 Fc-γ 수용체인, CD16을 통한 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 촉발하기 위한, 리툭시맙 등의 항체에 의해, 또는 자연 세포독성 수용체 (NCR)를 통해 매개되는 자연 세포독성에 의해 나타날 수 있다. CD16/CD19 BiKE 및 CD16/CD19/CD22 TriKE는 CD16의 직접적 신호전달을 통해 NK 세포 활성화를 촉발하고 용해 과립의 지향된 분비 및 표적 세포 사멸을 유도할 수 있다. 또한, 이들 시약은 시토카인 및 케모카인 생성으로 이어지는 NK 세포 활성화를 유도한다.
발명의 요약
본 발명은 B3-H7 표적화 융합 단백질, 또한 구체적으로 B7-H3 표적화 삼중특이적 킬러 관여자 분자 (TriKE) 및 그의 사용 방법의 개발에 기초하는 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 서열 번호:13 또는 14에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 서열 또는 그와 90% 동일성을 갖는 서열을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열 번호:13 또는 14에 기재된 바와 같은 핵산 서열 또는 그와 90% 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다.
하나의 측면에서, 아미노산 서열은 서열 번호:6 또는 7로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 발명은, 어느 배향으로든 서로 작동가능하게 연결된, 서열 번호:6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
하나의 측면에서, 단백질은 서열 번호:6의 C-말단과 서열 번호:7의 N-말단 사이의 직접 연결로 서열 번호:6 및 7을 포함한다. 또 다른 측면에서, 단백질은 서열 번호:7의 C-말단과 서열 번호:6의 N-말단 사이의 직접 연결로 서열 번호:7 및 6을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은, 작동가능하게 연결된, 서열 번호:2 또는 19; 4, 17, 또는 18; 6 및 7, 또는 7 및 6을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
하나의 측면에서, 서열 번호:2 또는 19 및 4, 17 또는 18은 서열 번호:3 또는 서열 번호:15에 의해 연결된다. 또 다른 측면에서, 서열 번호:4, 17 또는 18 및 6 또는 7은 서열 번호:5 또는 서열 번호:16에 의해 연결된다. 다른 측면에서, 서열 번호:6 및 7은 어느 배향으로든 작동가능한 연결로 존재한다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 반감기 연장 (HLE) 분자를 추가로 포함한다. 하나의 측면에서, HLE 분자는 서열 번호:21-25 중 어느 하나를 포함하는 Fc 또는 scFc 항체 단편이다. 일부 측면에서, 서열 번호:4는 N72 치환을 갖는다. 다양한 측면에서, N72 돌연변이는 각각 서열 번호:17 및 18에 기재된 N72A 또는 N72D이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 융합 단백질 중 임의의 것을 인코딩하는 단리된 핵산 서열을 제공한다.
하나의 측면에서, 서열은 서열 번호:8이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 대상체에게 본원에 기재된 융합 단백질 중 임의의 것을 투여함으로써 암을 치료하는 것을 포함하는, 대상체에서의 암 치료 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 암은 비-소 폐암, 피부 편평 세포 암종, 췌장암, 원발성 간세포 암종, 결장직장 암종, 투명 세포 신장 암종 또는 유방암으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 작동가능한 연결로 어느 배향으로든 서열 번호:2, 서열 번호:4 및 서열 번호:6 및 7 또는 어느 배향으로든 서열 번호:19, 서열 번호:17 또는 18 및 서열 번호:6 및 7을 포함하는 융합 단백질 및 이러한 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
하나의 측면에서, 서열 번호:19는 서열 번호:3 또는 15의 링커에 의해 서열 번호:17 또는 18에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 측면에서, 서열 번호:17 또는 18은 서열 번호:5 또는 16의 링커에 의해 어느 배향으로든 서열 6 및 7에 작동가능하게 연결된다. 일부 측면에서, 융합 단백질은 반감기 연장 (HLE) 분자를 추가로 포함한다. 하나의 측면에서, HLE 분자는 서열 번호:21-25 중 어느 하나를 포함하는 Fc 또는 scFc 항체 단편이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 서열 번호:1의 아미노산 서열 또는 또는 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 치료 유효량의 융합 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 대상체에게 본원에 기재된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 암 치료 방법을 제공한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은, 대상체에서의 암 세포에 대한 자연 킬러 (NK) 세포 활성의 유도 방법으로서, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체에서 암 세포에 대해 NK 세포 활성을 유도하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, NK 세포 활성의 유도는 NK 세포 탈과립화 유도, 인터페론 γ의 NK 세포 생성 유도, 대상체에서의 다수의 종양 침윤 NK 세포의 증가, 및/또는 NK 세포 증식의 유도 또는 증가를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체에서 종양 성장을 억제하는 것을 포함하는, 대상체에서의 종양 성장의 억제 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 종양 성장 억제는 종양 세포 생존의 감소를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체의 생존을 증가시키는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체의 생존 증가 방법을 제공한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체의 생존을 증가시키는 것을 포함하는, 대상체에서의 암 세포에 대한 자연 킬러 (NK) 매개된 항체-의존적 세포의 세포독성의 유도 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여하는 것은 대상체에게 항암 치료를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 측면에서, 암은 폐암, 전립선암, 다발성 골수종, 난소암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 측면에서, 암 세포는 B7-H3 발현 암 세포이다. 일부 측면에서, 암은 치료 내성 암이다.
도 1a-1d는 cam1615B7-H3 삼중특이적 킬러 관여자 (TriKE)의 작제 및 단리를 예시한다. 도 1a는 (좌측에서 우측으로) 낙타류 항-CD16 VHH, 인간 IL-15, 및 항-B7-H3 scFv로 이루어진 TriKE 작제물의 개략적 도시이다. 도 1b는 이온 교환 (FFQ) 컬럼 상에서의 cam1615B7-H3의 제1-단계 정제로부터의 크로마토그래피 추적을 예시하는 그래프이다. 수집 피크는 양방향 화살표에 의해 표시된다. 도 1c는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 컬럼 상에서의 cam1615B7-H3의 제2-단계 정제로부터의 크로마토그래피 추적을 예시하는 그래프이다. 수집 피크는 양방향 화살표에 의해 표시된다. 도 1d는 2개의 직교 컬럼 단계 후 최종 생성물의 순도를 나타내는 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 겔의 사진이다. 겔의 레인은 분자 마커, 비-환원 (NR) 생성물, 및 환원 (R) 생성물을 표시한다.
도 2a-2h는 cam1615B7-H3 TriKE가 강력하고 특이적인 자연 킬러 (NK) 세포 증식을 유도함을 예시한다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 CellTrace Violet 라벨링하고 5 nM 등몰 농도의 rhIL-15 또는 cam1615B7-H3 TriKE에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 제7일에, 세포를 수확하고 유동 세포계측 평가를 위해 염색하였다. 도 2a는 CellTrace Violet 염료의 희석으로 측정된 NK 세포 (CD56+ CD3-) 증식을 나타내는 대표적 히스토그램을 나타낸다. 도 2b는 증식된 NK 세포의 전반적 비율을 나타내는 풀링된(pooled) 데이터를 예시하는 그래프이다. 도 2c는 고도로 증식된 (3개의 분할을 넘어선 증식으로서 측정됨) NK 세포의 비율을 나타내는 풀링된 데이터를 예시하는 그래프이다. 도 2d는 배양물에서의 NK 세포 수를 나타내는 풀링된 데이터를 예시하는 그래프이다 (N = 9). 도 2e는 T 세포 (CD56- CD3+) 증식을 나타내는 대표적 히스토그램이다. 도 2f는 증식된 T 세포의 전반적 비율을 나타내는 풀링된 데이터를 예시하는 그래프이다. 도 2g는 고도로 증식된 T 세포의 비율을 나타내는 풀링된 데이터를 예시하는 그래프이다. 도 2h는 배양물에서의 T 세포 수를 나타내는 풀링된 데이터를 예시하는 그래프이다 (N = 9). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.
도 3a-3b는 camB7-H3 TriKE 결합 특이성을 예시한다. 도 3a는 B7-H3 양성 암 세포에 대한 TriKE 분자의 결합의 개략적 도시이다. 도 3b는 WT B7-H3에 대한 결합 특이성을 예시하는 그래프이고, BT-12 소아과 뇌 종양 라인은 B7-H3 (WT)을 고도로 발현하며, B7-H3 KO BT-12 (적색) 세포 라인은 CRISPR을 사용하여 생성되었다.
도 4a-4b는 TriKE 분자에 의한 ADCC 유도를 예시한다. 도 4a는 WT TriKE의 ADCC 유도를 나타내는 그래프이다. 도 4b는 CD16 TriKE의 ADCC 유도를 나타내는 그래프이다.
도 5a-5b는 없음으로부터 매우 높은 수준까지의 다양한 수준의 B7-H3 발현을 갖는 혈액 악성종양 세포 라인으로 수행된 기능 검정을 예시한다. 도 5a는 유동 세포계측 (n=3), IncuCyte, 또는 xCelligence 검정에 의해 측정된 CD107a를 사용하여 측정된 NK 세포 활성화를 예시하는 그래프이다. 도 5b는 유동 세포계측 (n=3), IncuCyte, 또는 xCelligence 검정에 의해 측정된 IFN 감마를 사용하여 측정된 NK 세포 활성화를 예시하는 그래프이다.
도 6a-6b는 유동 세포계측에 의한 4개의 골수종 세포 라인에 대한 B7-H3 MFI를 예시한다. 도 6a는 유동 세포계측에 의한 골수종 라인 RPMI-8226, U266, MM1S 및 H929 상에서의 B7-H3의 발현을 나타내는 그래프이다. 도 6b는 도 6a에서의 데이터를 요약하는 그래프이다.
도 7a-7b는 라이브 이미징 IncuCyte Zoom 검정에서 B7-H3-TriKE를 갖거나 갖지 않는 말초 혈액 NK 세포가 골수종 세포를 사멸시키는 능력을 예시한다. 도 7a는 MM1S 세포에 대한 2:1 및 4:1의 이펙터:표적 (E:T) 비율에서의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 7b는 U266 세포에 대한 2:1 및 4:1의 이펙터:표적 (E:T) 비율에서의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8a-8d는 라이브 이미징 IncuCyte Zoom 검정에서 B7-H3-TriKE를 갖거나 갖지 않는 말초 혈액 NK 세포가 골수종 세포를 사멸시키는 능력을 예시한다. 도 8a는 H929 세포에 대한 2:1 및 4:1의 이펙터:표적 (E:T) 비율에서의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 8b는 MM1S 세포에 대한 2:1 및 4:1의 이펙터:표적 (E:T) 비율에서의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 8c는 RPMI-8226 세포에 대한 2:1 및 4:1의 이펙터:표적 (E:T) 비율에서의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 8d는 U266 세포에 대한 2:1 및 4:1의 이펙터:표적 (E:T) 비율에서의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9a-9d는 프로테아좀 억제제 보르테조밉 (10nM) 및 면역조절 약물 레날리도미드 (5μM)와의 B7-H3-TriKE의 효능을 예시한다. 도 9a는 48시간 후 H929 세포에 대한 조합 치료법의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 9b는 48시간 후 RPMI-8226 세포에 대한 조합 치료법의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 9c는 48시간 후 MM1S 세포에 대한 조합 치료법의 효과를 나타내는 그래프이다. 도 9d는 48시간 후 U266 세포에 대한 조합 치료법의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10a-10d는, 1:100 비율로 골수종 세포와 인큐베이션시, 건강한 공여자로부터의 CD33+ 골수 세포로부터 발달된 MDSC에 대한 B7-H3-TriKE의 효과를 예시한다. 도 10a는 B7-H3의 MDSC (CD14+CD11b+) 발현을 나타내는 그래프이다. 도 10b는 유동 세포계측에 의해 측정된 세포 생존을 나타내는 그래프이다. 도 10c는 살아 있는 CD14+ 세포의 플롯이고, 도 10d는 살아 있는 세포 이미징에 의해 48시간에 걸쳐 측정된 H929 성장을 예시하는 그래프이다.
도 11a-11b는 B7-H3 발현 MDSC의 NK 매개된 사멸을 예시한다. 도 11a는 MDSC의 B7-H3 발현을 나타내는 그래프이다. 도 11b는 1:1의 E:T에서 NK로의 공동-배양된 MDSC의 NK 매개된 사멸을 예시하고 B7-H3 TriKE 유무시 사멸을 비교한 그래프이다.
도 12a-12d는 cam1615B7-H3 TriKE가 전립선 종양 표적에 대한 NK 세포 기능을 향상시킴을 보여준다. 도 12a는 CREB5, 22RV1 및 Enza-R 표적에 대해 CD107a+ (탈과립화)를 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다. 도 12b는 CREB5, 22RV1 및 Enza-R 표적에 대해 IFNγ 시토카인 생성을 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다. 도 12c는 CD107a+ (탈과립화)를 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다. 도 12d는 IFNγ 시토카인 생성을 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다.
도 13a-13b는 camB7-H3이 IL -15 단독과 비교하여 전립선암 세포에 대한 NK 세포 기능 및 NK 증식을 증가시킴을 보여준다. 도 13a는 전립선암 세포 표적에 대한 IFNγ를 발현하는 NK 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 도 13b는 3 라운드 이상의 분할을 겪는 NK 세포의 비율을 예시하는 그래프이다.
도 14a-14l은 TriKE가 전립선암 세포 라인에 대한 NK 세포 탈과립화 및 염증성 시토카인 생성을 유도할 수 있음을 보여준다. 도 14a는 CA-2 표적에 대해 CD107a+를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 14b는 PC-3 표적에 대해 CD107a+를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 14c는 DU-145 표적에 대해 CD107a+를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 14d는 CA-2 표적에 대해 IFNγ를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 14e는 PC-3 표적에 대해 IFNγ를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 14f는 DU-145 표적에 대해 IFNγ를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 14g는 LnCAP 표적에 대해 CD107a+를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 14h는 VCAP 표적에 대해 CD107a+를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 14i는 22RV1 표적에 대해 CD107a+를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 14j는 LnCAP 표적에 대해 IFNγ를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 14k는 VCAP 표적에 대해 IFNγ를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 14l은 22RV1 표적에 대해 IFNγ를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다.
도 15a-15d는 cam1615B7-H3 TriKE가 전립선 종양 표적에 대해 건강한 공여자 (흑색 바) 및 전립선암 환자 (백색 바)의 NK 세포 기능을 향상시킴을 보여준다. 도 15a는 C4-2 표적에 대해 CD107a+ (상단) 또는 IFNγ (하단)를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다 (건강한 공여자의 경우 N = 9, 환자의 경우 N = 3). 도 15b는 DU145 표적에 대해 CD107a+ (상단) 또는 IFNγ (하단)를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다 (건강한 공여자의 경우 N = 9, 환자의 경우 N = 3). 도 15c는 LNCaP 표적에 대해 CD107a+ (상단) 또는 IFNγ (하단)를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다 (건강한 공여자의 경우 N = 9, 환자의 경우 N = 3). 도 15d는 PC3 표적에 대해 CD107a+ (상단) 또는 IFNγ (하단)를 발현하는 건강한 공여자 또는 전립선암 환자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다 (건강한 공여자의 경우 N = 9, 환자의 경우 N = 3). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, 및 **** p < 0.0001.
도 16은 PC3 표준 IncuCyte 검정을 예시하는 그래프이다.
도 17은 다양한 처리 조건 하에 PC-3 회전타원체를 예시하는 사진을 나타낸다.
도 18은 시간 경과에 따른 PC-3 회전타원체의 크기를 예시하는 그래프이다.
도 19는 시간 경과에 따른 PC-3 회전타원체의 크기를 예시하는 그래프이다.
도 20은 B7-H3 TriKE 및 BiKE가 PC3 회전타원체의 효율적인 사멸을 매개하는 능력을 예시하는 사진을 나타낸다.
도 21은 시간 경과에 따른 세포 지수를 예시하는 그래프이다.
도 22a-22f는 B7-H3에 대한 엔잘루타미드 내성 전립선암 세포 라인 표현형분석을 예시한다. 도 22a는 CREB5+ 세포에서의 B7-H3 발현을 예시하는 그래프이다. 도 22b는 C4-2 세포에서의 B7-H3 발현을 예시하는 그래프이다. 도 22c는 LN-CaP 세포에서의 B7-H3 발현을 예시하는 그래프이다. 도 22d는 엔잘루타미드 내성 LNCap 세포에서의 B7-H3 발현을 예시하는 그래프이다. 도 22e는 PC3 세포에서의 B7-H3 발현을 예시하는 그래프이다. 도 22f는 22RV1 세포에서의 B7-H3 발현을 예시하는 그래프이다.
도 23a-23l은 camB7-H3 TriKE가 이전의 scFv 버전보다 더 넓은 동적 범위에 걸쳐 전립선암 세포에 대해 활성을 유도하는 방식을 예시한다. 도 23a는 0.3nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 단독에서의 퍼센트 CD107a+ NK 세포를 예시하는 그래프이다. 도 23b는 3nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 단독에서의 퍼센트 CD107a+ NK 세포를 예시하는 그래프이다. 도 23c는 30nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 단독에서의 퍼센트 CD107a+ NK 세포를 예시하는 그래프이다. 도 23d는 0.3nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 및 CA-2 세포에서의 퍼센트 CD107a+ NK 세포를 예시하는 그래프이다. 도 23e는 3nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 및 CA-2 세포에서의 퍼센트 CD107a+ NK 세포를 예시하는 그래프이다. 도 23f는 30nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 및 CA-2 세포에서의 퍼센트 CD107a+ NK 세포를 예시하는 그래프이다. 도 23g는 0.3nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 단독에서의 퍼센트 IFNγ+ NK 세포를 예시하는 그래프이다. 도 23h는 3nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 단독에서의 퍼센트 IFNγ+ NK 세포를 예시하는 그래프이다. 도 23i는 30nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 단독에서의 퍼센트 IFNγ+ NK 세포를 예시하는 그래프이다. 도 23j는 0.3nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 및 CA-2 세포에서의 퍼센트 IFNγ+ NK 세포를 예시하는 그래프이다. 도 23k는 3nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 및 CA-2 세포에서의 퍼센트 IFNγ+ NK 세포를 예시하는 그래프이다. 도 23l은 30nM TriKE의 존재 하에 PBMCNK 및 CA-2 세포에서의 퍼센트 IFNγ+ NK 세포를 예시하는 그래프이다.
도 24a-24f는 B7-H3 TriKE가 폐 종양 표적에 대해 NK 세포 기능을 향상시킴을 예시한다. 도 24a는 A549 (N = 6) 종양 표적에 대해 CD107a+를 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 24b는 A549 (N = 6) 종양 표적에 대해 IFNγ를 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 24c는 NCI-H322 (N = 5) 종양 표적에 대해 CD107a+를 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 24d는 NCI-H322 (N = 5) 종양 표적에 대해 IFNγ를 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 나타내는 그래프이다. 도 24e는 NCI-H460 (N = 7)에 대해 CD107a+를 발현하는 건강한 공여자 (흑색 바) 또는 폐암 환자 (백색 바)로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 나타내는 그래프이다. 도 24f는 NCI-H460 (N = 7)에 대해 IFNγ를 발현하는 건강한 공여자 (흑색 바) 또는 폐암 환자 (백색 바)로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 나타내는 그래프이다. ** p < 0.01, *** p < 0.001, 및 **** p < 0.0001.
도 25a-25b는 처리가 없는 HNSCC에 대한 NK 세포 활성의 평가를 예시한다. 도 25a는 퍼센트 CD107a 발현 (탈과립화에 대한 마커)을 예시하는 그래프이다. 도 25b는 퍼센트 세포내 IFN-y 생성을 예시하는 그래프이다.
도 26a-26b는 종양 및 면역 세포 상의 B7-H3 발현의 평가를 예시한다. 도 26a는 유동 세포계측을 통한 5개 HNSCC 세포 라인 B7-H3 발현 및 B7-H3 단일 도메인과의 결합 친화력을 예시하는 그래프이다. 도 26b는 유동 세포계측에 의한 건강한 공여자 B7-H3 발현으로부터의 PBMC를 예시하는 그래프이다.
도 27a-27d는 B7-H3 TriKE의 기능 검증을 예시한다. 도 27a는 Cal27 트리오와 인큐베이션된 건강한 공여자로부터의 PBMC에서의 CD107a 발현을 예시하는 그래프이다. 도 27b는 Cal27 트리오와 인큐베이션된 건강한 공여자로부터의 PBMC에서의 세포내 IFN-y 생성을 예시하는 그래프이다. 도 27c는 Cal33 트리오와 인큐베이션된 건강한 공여자로부터의 PBMC에서의 세포내 CD107a 발현을 예시하는 그래프이다. 도 27d는 Cal33 트리오와 인큐베이션된 건강한 공여자로부터의 PBMC에서의 세포내 IFN-y 생성을 예시하는 그래프이다.
도 28a-28f는 실시간 이미징 검정을 예시한다. 도 28a는 IncuCyte Zoom 이미저에서 48시간 동안 상이한 조건: 처리되지 않음, 또는 3 nM IL-15, B7-H3 SD 및 B7-H3 TriKE에서 5:1의 E:T로 NK 세포와 인큐베이션 후 Nuclight 적색-라벨링된 Cal27 생존을 나타내는 그래프이다. 도 28b는 Nuclight 적색-라벨링된 Cal27의 화전타원체를 예시하는 사진이다. 도 28c는 도 28b에서의 회전타원체의 크기를 예시하는 그래프이다. 도 28d는 IncuCyte Zoom 이미저에서 48시간 동안 상이한 조건: 처리되지 않음, 또는 3 nM IL-15, B7-H3 SD 및 B7-H3 TriKE에서 5:1의 E:T로 NK 세포와 인큐베이션 후 Nuclight 적색-라벨링된 Cal33 생존을 나타내는 그래프이다. 도 28e는 Nuclight 적색-라벨링된 Cal33의 화전타원체를 예시하는 사진이다. 도 28f는 도 28e에서의 회전타원체의 크기를 예시하는 그래프이다.
도 29a-29b는 다양한 용량의 cam1615B7-H3 TriKE가 난소 종양 표적에 대한 NK 세포 기능을 향상시킴을 보여준다. 도 29a는 OVCAR8 및 MA148 표적에 대해 CD107a+ (탈과립화)를 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다. 도 29b는 OVCAR8 및 MA148 표적에 대해 IFNγ 시토카인 생성을 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다.
도 30a-30i는 cam1615B7-H3 TriKE가 난소 종양 표적에 대한 NK 세포 기능을 향상시킴을 보여준다. 건강한 공여자 또는 난소암 PBMC 세포를 30 nM TriKE 또는 대조군 조건으로 4hr 동안 2:1 E:T 비율로 난소 종양 표적과 인큐베이션하였다. 도 30a는 OVCAR8 표적에 대해 CD107a+ (탈과립화)를 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다 (N = 8). 도 30b는 OVCAR8 표적에 대해 IFNγ 시토카인 생성을 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다 (N = 8). 도 30c는 OVCAR3 표적에 대해 CD107a+ (탈과립화)를 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다 (N = 4). 도 30d는 OVCAR3 표적에 대해 IFNγ 시토카인 생성을 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다 (N = 4). 도 30e는 OVCAR5 표적에 대해 CD107a+ (탈과립화)를 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다 (N = 7). 도 30f는 OVCAR5 표적에 대해 IFNγ 시토카인 생성을 발현하는 건강한 공여자로부터의 NK 세포의 풀링된 비율을 예시하는 그래프이다 (N = 7). 도 30g는 MA-148 표적에 대해 CD107a+ (탈과립화)를 발현하는 건강한 공여자 (흑색 바) 또는 난소암 환자 (백색 바)로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 예시하는 그래프이다 (N = 9). 도 30h는 MA-148 표적에 대해 IFNγ를 발현하는 건강한 공여자 (흑색 바) 또는 난소암 환자 (백색 바)로부터의 NK 세포의 비율의 풀링된 분석을 예시하는 그래프이다 (N = 6). 도 30i는 종양 사멸을 IncuCyte 이미징 검정을 사용하여 평가한 것을 예시하는 그래프이다. OVCAR8 표적을 발현하는 NuclightRed를 카스파제 3/7 생존능 염료와 함께 48hr에 걸쳐 풍부화된 건강한 공여자 NK와 인큐베이션하였다. 살아 있는 (Nuclight Red+카스파제 3/7-) 종양 세포의 백분율을 48-h 기간에 걸쳐 정량화하고 종양 단독에 대해 정규화하였다. 15 min마다 판독치를 얻었다 (4개의 별도의 실험을 대표함). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, 및 **** p < 0.0001.
도 31은 cam1615B7-H3 활성화된 NK 세포의 고차원 분석을 예시한다. 단독으로, 30 nM cam1615B7-H3 TriKE와, OVCAR8 종양 (2:1 E:T)과, 또는 30 nM cam1615B7-H3 TriKE 및 OVCAR8 종양과 인큐베이션된 3개의 공여자 PBMC의 농축 분석. 데이터를 viSNE (Cytobank)에서 가시화하고 CD45+CD56+CD3- 세포 상에서 게이팅하였다.
도 32a-32f는 cam1615B7-H3 TriKE가 생체내에서 난소 종양 진행을 진압하는 데 있어 효과적임을 예시한다. 도 32a는 암컷 NSG 마우스에서의 이종성 난소암 MA-148-Luc 모델을 나타내는 다이어그램이다 (처리 그룹 당 N = 5). 도 32b는 풍부화된 NK 세포 및 명시된 처리로 처리된 MA148 마우스 모델에서의 3주에 걸친 총 플럭스 라디언스 (p/s)로서 측정된 종양 진행을 나타내는 생물발광 이미징을 나타내는 그래프이다. 도 32c는 제21일 데이터 포인트에 대한 생물발광 이미징 결과를 예시하는 그래프이다. 도 32d는 제21일의 총 플럭스 라디언스 (p/s)를 예시하는 사진이다. 도 32e는 D21에 rhIL-15 및 cam1615B7-H3 TriKE 처리 그룹에 대한 복막 세척으로부터의 CD56+CD3- NK 세포 수의 산포도이다. 도 32f는 제21일에 rhIL-15 및 cam1615B7-H3 TriKE 처리 그룹에 대한 복막 세척으로부터의 NK 세포 상에서의 CD16 미디어 형광 강도의 산포도이다. * p < 0.05, ** p < 0.01.
발명의 상세한 설명
본 발명은 B3-H7 표적화 융합 단백질, 또한 구체적으로 B7-H3 표적화 삼중특이적 킬러 관여자 분자 (TriKE) 및 그의 사용 방법의 개발에 기초하는 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법을 기재하기 전에, 본 발명은 기재된 특정 조성물, 방법, 및 실험 조건이 다양할 수 있음에 따라, 이러한 조성물, 방법, 및 실험 조건으로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에서만 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며 제한되도록 의도되지 않음을 이해해야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명백히 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본 개시내용을 읽음에 따라 당업자에게 명백해질 본원에 기재된 유형의 하나 이상의 방법, 및/또는 단계 및 기타 등등을 포함한다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공개물, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사한 또는 등가의 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 수정 및 변형이 본 개시내용의 취지 및 범위 내에 포함됨이 이해될 것이다. 이제 바람직한 방법 및 물질이 기재된다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 서열 번호:13 또는 14에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 서열 또는 그와 90% 동일성을 갖는 서열을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)을 지칭한다. 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, iRNA, miRNA, tRNA, ncRNA, rRNA, 및 재조합 생성된 및 화학적으로 합성된 분자, 예컨대 압타머, 플라스미드, 안티-센스 DNA 가닥, shRNA, 리보자임, 핵산 컨쥬게이션 및 올리고뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따라, 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥 및 선형 또는 공유적으로 원형으로 폐쇄된 분자로서 존재할 수 있다. 핵산은 단리될 수 있다. 용어 "단리된 핵산"은, 핵산이 (i) 시험관내에서, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭되었거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합 생성되었거나, (iii) 예를 들어, 절단 및 겔 전기영동에 의한 분리에 의해 정제되었거나, (iv) 예를 들어, 화학적 합성에 의해 합성되었거나, 또는 (vi) 샘플로부터 추출되었음을 의미한다. 핵산은, 특히, DNA 주형으로부터의 시험관내 전사에 의해 제조될 수 있는 RNA 형태로, 세포로의 도입, 즉, 세포의 형질감염에 사용될 수 있다. 또한, RNA는 서열 안정화, 캡핑, 및 폴리아데닐화에 의해 적용 전에 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 "증폭된 DNA" 또는 "PCR 생성물"은 정의된 크기의 DNA의 증폭된 단편을 지칭한다. PCR 생성물을 검출하기 위한 다양한 기술이 이용가능하고 당업계에 널리 공지되어 있다. PCR 생성물 검출 방법은 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔을 사용하고 에티듐 브로마이드 염색 (DNA 삽입제), 라벨링된 프로브 (방사성 또는 비-방사성 라벨, 서던 블롯팅), 라벨링된 데옥시리보뉴클레오티드 (방사성 또는 비-방사성 라벨의 직접적 혼입을 위한) 또는 증폭된 PCR 생성물의 직접적 가시화를 위한 은 염색을 첨가하는 겔 전기영동; 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의존하는 제한 엔도뉴클레아제 소화; 특정 라벨링된 프로브 (방사성 또는 비-방사성 라벨) 상의 증폭된 DNA의 혼성화를 사용하는 도트 블롯; 자외선 검출을 사용하는 고압 액체 크로마토그래피; 전압-개시 화학 반응/광자 검출과 커플링된 전기화학발광; 및 관심 DNA 단편을 갖는 뉴클레오티드의 정밀한 순서의 결정을 위한 방사성 또는 형광 라벨링된 데옥시리보뉴클레오티드, 올리고 결찰 검정 (OLA), PCR, qPCR, DNA 시퀀싱, 형광, 겔 전기영동, 자기 비드, 대립유전자 특이적 프라이머 확장 (ASPE) 및/또는 직접적 혼성화를 사용하는 직접적 시퀀싱.
일반적으로, 핵산은 문헌: Green 및 Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury, NY 2,028 페이지 (2012)에 기재된; 또는 미국 특허 7,957,913; 미국 특허 7,776,616; 미국 특허 5,234,809; 미국 공개 2010/0285578; 및 미국 공개 2002/0190663에 기재된 것들과 같은 다양한 기술에 의해 추출, 단리, 증폭, 또는 분석될 수 있다. 핵산 분석의 예는 시퀀싱 및 DNA-단백질 상호작용을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 시퀀싱은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의한 것일 수 있다. DNA 시퀀싱 기술은 라벨링된 종결자 또는 프라이머 및 슬랩 또는 모세관에서의 겔 분리를 사용하는 전형적 디데옥시 시퀀싱 반응 (Sanger 방법), 및 차세대 시퀀싱 방법, 예컨대 가역적으로 종결된 라벨링된 뉴클레오티드를 사용한 합성에 의한 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 454 시퀀싱, Illumina/Solexa 시퀀싱, 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브의 라이브러리에 대한 대립유전자 특이적 혼성화, 라벨링된 클론의 라이브러리에 대한 대립유전자 특이적 혼성화 후 결찰, 중합 단계 동안 라벨링된 뉴클레오티드의 혼입의 실시간 모니터링을 사용한 합성에 의한 시퀀싱, 폴로니 시퀀싱, 및 SOLiD 시퀀싱을 포함한다. 분리된 분자는 폴리머라제 또는 리가제를 사용한 순차적 또는 단일 반응에 의해, 뿐만 아니라 프로브의 라이브러리와의 단일 또는 순차적 차등 혼성화에 의해 시퀀싱될 수 있다.
용어 "서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 2개의 폴리펩티드 분자 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적상 정렬된다 (예를 들어, 제2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 서열에 갭이 도입될 수 있음). 이어서 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자가 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성=동일한 위치의 수/위치 (즉, 겹치는 위치)의 총수 x 100). 일부 구현예에서 비교 목적상 정렬된 참조 서열 (예를 들어, 서열 번호:13 또는 14)의 길이는 비교 서열의 길이의 적어도 80%이고, 일부 구현예에서는 적어도 90% 또는 100%이다. 하나의 구현예에서, 두 서열은 동일한 길이이다.
서열 동일성의 요망되는 정도의 범위는 대략 80% 내지 100% 및 이들 사이의 정수 값이다. 개시된 서열 및 청구된 서열 사이의 퍼센트 동일성은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 적어도 99.9%일 수 있다. 일반적으로, 정확한 매치는 참조 서열 (예를 들어, 서열 번호:13 또는 14)의 길이에 걸쳐 100% 동일성을 나타낸다. 바람직하게는, 본원에서 제공된 서열과 100% 동일하지 않은 서열이 원래의 서열의 기능 (예를 들어, B7-H3 또는 CD16에 결합하는 능력)을 보유한다.
본원에 기재된 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드와 약 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 99.5% 이상 동일한 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드가 개시내용 내에서 구현된다. 예를 들어, 폴리펩티드는 서열 번호:13 또는 14와 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 가질 수 있다.
개시된 서열의 변이형은 또한, 상응하는 부분에 걸쳐 원래의 단백질과 적어도 약 70% 상동성을 여전히 남기는, 치환, 결실, 또는 단백질 백본으로의 삽입을 함유하는 펩티드, 또는 전장 단백질을 포함한다. 유사-아미노산, 즉, 보존적 아미노산 치환이 서열의 변화로서 간주되지 않는 경우, 상동성으로부터의 더 큰 정도의 이탈이 허용된다. 보존적 치환의 예는 동일한 또는 유사한 특성을 갖는 아미노산을 포함한다. 예시적 아미노산 보존적 치환은 하기와 같은 변화를 포함한다: 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 리신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트를 아스파르테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 리신에서 아르기닌, 글루타민, 또는 글루타메이트로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 발린에서 이소류신으로, 류신으로.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 서열 번호:13 또는 14에 기재된 바와 같은 핵산 서열 또는 그와 90% 동일성을 갖는 서열에 의해 인코딩되는 단백질을 제공한다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 공유 화학 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산의 임의의 사슬을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 폴리펩티드는 전체 단백질 또는 그의 일부에 대해 코딩하는 완전 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. "단백질 코딩 서열" 또는 특정 폴리펩티드 또는 펩티드를 "인코딩"하는 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 배치시 시험관내에서 또는 생체내에서 폴리펩티드로 전사 (DNA의 경우)되고 번역 (mRNA의 경우)되는 핵산 서열이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에서의 출발 코돈 및 3' (카르복실) 말단에서의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 원핵생물 또는 진핵생물 RNA로부터의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 전사 종결 서열은 통상적으로 코딩 서열에 대해 3'에 위치할 것이다.
하나의 측면에서, 아미노산 서열은 서열 번호:6 또는 7로부터 선택된다.
본원에서 제공되는 핵산 서열은 예를 들어 항체의 경쇄 또는 중쇄를 인코딩하여, 인코딩된 폴리펩티드에 특정 표적에 대한 결합 도메인 또는 표적화 도메인을 부여할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 표적화 펩티드로서 언급될 수 있다.
용어 "항체"는 일반적으로 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. "네이티브(native) 항체" 및 "온전한 면역글로불린" 등은, 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 임의의 척추동물 종으로부터의 경쇄는, 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)라 불리는, 명확히 구별되는 2개의 유형 중 하나로 할당될 수 있다. 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 부류로 할당될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 주요 부류가 존재하고: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 이들 중 여럿은 하위부류 (이소타입), 예를 들어 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ라 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 널리 공지되어 있다.
전형적인 항체 분자에서, 각각의 경쇄는 하나의 공유 디술파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되며, 디술파이드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄 사이에서 달라진다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적 간격의 사슬내 디술파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VH) 후 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (VL) 및 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 믿어진다. 각각의 가변 영역은 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역이라 불리는 3개의 세그먼트를 포함하고, 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에는 β-시트 구조의 부분을 형성하는, 3개의 CDR에 의해 연결된, 주로 β-시트 구성을 채택하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각 사슬에서의 CDR은 FR에 의해 서로 근접하여 함께 유지되며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께, 항체의 항원-결합 도메인 또는 표적화 도메인의 형성에 기여한다 (하기 문헌 참조: Kabat 등, NIH Puhl. No. 91-3242, Vol. I, 페이지 647-669 [1991]). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존적 세포의 세포독성에서의 항체의 참여를 나타낸다.
항체는 단백질분해 효소 파파인으로 실험적으로 절단될 수 있고, 이는 중쇄 각각이 파괴되어 3개의 별도의 항체 단편을 생성하게 한다. 경쇄 및 경쇄와 질량이 대략 동등한 중쇄의 단편으로 이루어지는 2개의 단위는 Fab 단편 (즉, "항원 결합" 단편)이라 불린다. 중쇄의 2개의 동등한 세그먼트로 이루어지는 제3 단위는 Fc 단편이라 불린다. Fc 단편은 전형적으로 항원-항체 결합에 관여하지 않지만 항원의 본체 제거에 관여되는 이후 과정에서 중요하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fc 단편 또는 Fc-융합 생성물, 단일-사슬 Fv (scFv), 디술파이드-연결된 Fv (sdfv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편; 디아바디, 트리바디 등을 포함한다 (Zapata 등 Protein Eng. 8(10):1057-1062 [1995]).
Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서의 몇몇 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 3개의 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab') 2 항체 단편은 원래 그 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
항체의 Fc 영역은 세포 표면 수용체 및 보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용하는 항체의 꼬리 영역이다. 이 특성은 항체가 면역 시스템을 활성화시키도록 허용한다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소타입에서, Fc 영역은 항체의 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 도메인으로부터 유래된 2개의 동일한 단백질 단편으로 구성되며; IgM 및 IgE Fc 영역은 각 폴리펩티드 사슬에 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH 도메인 2-4)을 함유한다. IgG의 Fc 영역은 고도로 보존된 N-글리코실화 부위를 갖는다. Fc 단편의 글리코실화는 Fc 수용체-매개 활성에 있어 필수적이다. 이 부위에 부착된 N-글리칸은 주로 복합체 유형의 코어-푸코실화 디안테너리(diantennary) 구조이다. 추가로, 소량의 이들 N-글리칸은 또한 양분 GlcNAc 및 α-2,6 연결된 시알산 잔기를 갖는다.
Fc-융합 단백질 (또한 Fc 키메라 융합 단백질, Fc-Ig, Ig-기반 키메라 융합 단백질 및 Fc-택(tag) 단백질로서 공지됨)은 관심 펩티드 또는 단백질에 유전적으로 연결된 IgG의 Fc 도메인으로 구성된다. Fc-융합 단백질은 생체내 및 시험관내 연구를 위한 가치 있는 시약이 되었다. Fc-융합된 결합 파트너는 단일 펩티드, 세포 표면 수용체와의 결합시 활성화되는 리간드, 신호전달 분자, 단백질 마이크로어레이에서 결합 파트너를 식별하기 위해 사용되는 미끼 단백질로서의 또는 이량체화시 활성화되는 수용체의 세포외 도메인의 범위일 수 있다. 생체내 Fc 도메인의 가장 가치 있는 특징 중 하나는, 이것이 생물요법 약물을 위해 개선된 치료적 효능을 제공하는 관심 단백질의 혈장 반감기를 극적으로 연장시킬 수 있다는 것이며; 이는 Fc-융합 단백질을 매력적인 생물요법 작용제로 만드는 데 기여한다. Fc 융합 단백질은 Fc 융합 단백질 및 제약상 허용가능한 담체 부형제 또는 담체를 포함하는 제약 조성물의 부분일 수 있다. 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 당업계에 널리 공지되어 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산 등의 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 리신; 단당류, 이당류, 및 포도당, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; 킬레이팅 작용제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 긴밀한 비-공유 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이 구성에서는 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 부위를 정의한다. 총체적으로, 6개의 CDR이 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 단지 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)조차도, 전체 결합 부위보다는 더 낮은 친화력이지만, 항원을 인식하고 그에 결합하는 능력을 갖는다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 대한 요망되는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 대한 검토로, 하기 문헌을 참조한다: Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
항체 단편의 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해 소화를 통해 유래되었다 (예를 들어, 하기 문헌 참조: Morimoto 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan 등, Science, 229:81 [1985]). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기에서 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 E. coli로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab'2 단편을 형성할 수 있다 (Carter 등, Bio/Technology 10:163-167 [1992]). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab') 2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 숙련된 실무자에게 명백할 것이다. 다른 구현예에서, 선택 항체는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185 참조.
다양한 측면에서, 본원에서 제공되는 핵산 서열은 B3-H7 단백질에 특이적으로 결합하는 경쇄 및 중쇄를 인코딩한다.
분화 클러스터 276 (CD276)으로서 또한 공지된 B7 상동체 3 (B7-H3)은 CD276 유전자에 의해 인코딩되는 인간 단백질이다. B7-H3 단백질은 그의 세포외 도메인에 의해 결정되는 2개의 동형으로 존재하는 316개 아미노산-길이 유형 I 막횡단 단백질이다. 마우스에서, 세포외 도메인은 면역글로불린 가변 (IgV)-유사 및 면역글로불린 불변 (IgC)-유사 도메인의 단일 쌍으로 이루어지는 반면, 인간에서 이는 엑손 복제로 인해 2개의 동일한 쌍 (4Ig-B7-H3) 또는 하나의 쌍 (2Ig-B7-H3)으로 이루어진다. B7-H3 mRNA는 대부분의 정상 조직에서 발현된다. 대조적으로, B7-H3 단백질은 마이크로RNA에 의한 그의 전사-후 조절로 인해 정상 조직에서 매우 제한된 발현을 갖는다. 그러나, B7-H3 단백질은 많은 상이한 암 유형 (모든 암의 60%)에서 높은 빈도로 발현된다.
비-악성 조직에서, B7-H3은 적응성 면역에서 주로 억제 역할을 하여, T 세포 활성화 및 증식을 억제한다. 악성 조직에서, B7-H3은 종양 항원-특이적 면역 반응을 억제하는 면역 체크포인트 분자이다. B7-H3은 또한 비-면역학적 전-종양형성 기능, 예컨대 이동 촉진, 침입, 혈관신생, 화학내성, 상피-중간엽 전이, 및 종양 세포 대사에 대한 영향을 갖는다. 고형 종양에 대한 그의 선택적 발현 및 그의 전-종양형성 기능으로 인해, B7-H3은 에노블리투주맙, 옴부르타맙, MGD009, MGC018, DS-7300a, 및 CAR-T 세포를 포함한 여러 항암 작용제의 표적이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "B7-H3 표적화 펩티드" 또는 "B7-H3 표적화 단백질"은 B7-H3에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 펩티드 또는 폴리펩티드 (단백질 및 융합 단백질 포함)를 지칭하도록 의도된다. B7-H3 표적화 펩티드는 B7-H3을 포함한 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 대한 특이적 결합을 갖는 항체, 항체 단편 등일 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 B7-H3 표적화 펩티드의 경쇄 및 중쇄를 인코딩한다. 하나의 측면에서, 서열 번호:13의 핵산 서열은 서열 번호:6에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 B7-H3 표적화 펩티드의 경쇄를 인코딩할 수 있다. 또 다른 측면에서, 서열 번호:14의 핵산 서열은 서열 번호:8에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 B7-H3 표적화 펩티드의 중쇄를 인코딩할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명은, 어느 배향으로든 서로 작동가능하게 연결된, 서열 번호:6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함한 융합 단백질을 제공한다.
용어 "융합 분자" 및 "융합 단백질"은 상호교환가능하게 사용되며, 통상적으로 재조합, 화학적 또는 다른 적합한 방법에 의해 공유 연결된 (즉, 융합된) 단백질 또는 펩티드 서열인, 추가의 이펙터 분자를 갖거나 갖지 않는, 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 지칭하도록 의도된다. 요망되는 경우, 융합 분자는 펩티드 링커 서열을 통해 하나의 또는 여러 부위에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 펩티드 링커는 융합 분자의 작제를 보조하기 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, 바람직한 융합 분자는 융합 단백질이다. 일반적으로 융합 분자는 또한 컨쥬게이트 분자를 포함할 수 있다.
서로 "작동가능하게 연결된"이란, 융합 단백질을 구성하는 펩티드 사이에 직접적 또는 간접적 공유 연결이 존재함을 의미한다. 따라서, 작동가능하게 연결된 도메인은 서로에게 직접 공유 커플링될 수 있다. 역으로, 2개의 작동가능하게 연결된 도메인은 개재 모이어티 (예를 들어, 또한 플랭킹 서열)에 상호 공유 연결에 의해 연결될 수 있다. 2개의 도메인이, 예를 들어, 하나 이상의 개재 플랭킹 서열을 갖거나 갖지 않으면서, 제3 도메인에 의해 분리된 경우, 이들은 작동가능하게 연결된 것으로 고려될 수 있다.
2개의 개별 요소를 부착시키는 방법은 통상적으로 링커의 사용을 필요로 한다. 용어 "링커"는 본원에서 사용되는 바와 같이, 예를 들어 컨쥬게이트의 개별 부분을 물리적으로 연결함으로써, 기질 및 활성 작용제가 동일한 영역, 조직, 또는 세포에 대해 표적화되는 것을 가능하게 하는 임의의 결합, 소분자, 또는 다른 비히클을 지칭한다. 링커는 화합물, 통상적으로 약물을 안정적, 공유적 방식으로 세포-결합 작용제에 연결할 수 있는 임의의 화학적 모이어티일 수 있다.
본원에서 제공된 융합 단백질은 예를 들어, 어느 배향으로든 서로 작동가능하게 연결된, 서열 번호:6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 융합 단백질의 C-말단에서의 서열 번호:6에 기재된 아미노산 서열 및 융합 단백질의 N-말단에서의 서열 번호:7에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있거나; 또는 융합 단백질은 융합 단백질의 N-말단에서의 서열 번호:6에 기재된 아미노산 서열 및 융합 단백질의 C-말단에에서의 서열 번호:7에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 융합 단백질 내의 아미노산 서열의 배향은 그의 표적에 대한 융합 단백질 (B7-H3 표적화 융합 단백질)의 결합-특이성을 변경하지 않는다.
B7-H3 표적화 펩티드의 경쇄 및 중쇄는 표적화 펩티드의 결합 특이성 또는 민감도에 영향을 미치지 않으면서 어드 배향으로든 서로 작동가능하게 연결될 수 있다. 하나의 측면에서, 단백질은 서열 번호:6의 C-말단과 서열 번호:7의 N-말단 사이의 직접 연결로 서열 번호:6 및 7을 포함한다. 또 다른 측면에서, 단백질은 서열 번호:7의 C-말단과 서열 번호:6의 N-말단 사이의 직접 연결로 서열 번호:7 및 6을 포함한다.
본원에서 제공된 융합 단백질은 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 대한 특이적 결합을 갖는 융합 단백질을 제공하도록 추가의 단백질 도메인, 예컨대 추가의 표적화 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 표적화 도메인으로서의 B7-H3 표적화 펩티드를 포함한 삼중특이적 킬러 관여자 (TriKE) 분자일 수 있다.
NK 세포는 면역 감시가 가능한 선천적 면역 시스템의 세포독성 림프구이다. 세포독성 T 세포와 같이, NK 세포는 막 침투 및 아팝토시스-유도 그랜자임 및 퍼포린 과립의 저장을 전달한다. T 세포와 달리, NK 세포는 항원 프라이밍을 필요로 하지 않고 MHC 인식의 부재 하에 활성화 수용체를 관여시킴으로써 표적을 인식한다. NK 세포는, IgG 항체의 Fc 부분에 결합하고 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)에 관여하는 활성화 수용체인 CD16을 발현한다. NK 세포는 IL-15에 의해 조절되고, 이는 증가된 항원-의존적 세포독성, 림포카인-활성화된 킬러 활성을 유도할 수 있고/거나, 인터페론 (IFN), 종양-괴사 인자 (TNF) 및/또는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 반응을 매개할 수 있다. 이들 IL-15-활성화된 기능 모두 개선된 암 방어에 기여한다.
치료적으로, NK 세포의 입양 전달은, 예를 들어, NK 세포의 생존 및 생체내 확장을 자극하기 위해 림프고갈 화학요법 및 IL-2와 조합시 난치성 급성 골수성 백혈병 (AML)을 갖는 환자에서 완화를 유도할 수 있다. 이 치료법은 NK 세포 증식 및 기능을 억제하는 조절 T (Treg) 세포의 IL-2-매개 유도 및 항원 특이성의 결핍에 의해 제한될 수 있다. Treg 억제의 부정적 영향을 우회하면서, NK 세포 항원 특이성, 확장, 및/또는 지속성을 구동하는 시약을 생성하는 것은 NK-세포-기반 면역요법을 향상시킬 수 있다.
삼중특이적 킬러 관여자 분자는 종양 세포 (예를 들어, CD33+ 종양 세포 및/또는 EpCAM+ 종양 세포)의 NK-세포-매개 사멸을 구동할 수 있는 2개의 도메인을 포함하는 표적화 융합 단백질이며, NK 세포 자가-지속 신호를 생성할 수 있는 분자내 NK 활성화 도메인은 NK 세포 증식을 구동하고/거나 예를 들어, HL-60 표적, 암 세포, 또는 암 세포-유래 세포 라인에 대한 NK-세포-구동된 세포독성을 향상시킬 수 있다.
NK 세포는, 예를 들어, NK 세포 항상성, 증식, 생존, 활성화, 및/또는 발달에 관여하는 IL-15를 포함한 다양한 시토카인에 대해 반응성이다. IL-15 및 IL-2는 IL-2/IL-15Rβ (CD122) 및 공통의 감마 사슬 (CD132)을 포함한 여러 신호전달 성분을 공유한다. IL-2와 달리, IL-15는 Treg를 자극하지 않아, 면역 반응의 Treg 억제를 우회하면서 NK 세포 활성화를 가능하게 한다. NK 세포 항상성 및 증식의 촉진 이외에, IL-15는 이식-후 셋팅에서 나타날 수 있는 NK 세포 기능적 결함을 구제할 수 있다. IL-15는 또한 CD8+ T 세포 기능을 자극하여, 그의 면역치료 잠재력을 더욱 향상시킬 수 있다. 추가로, 전-임상 연구에 기초하여, IL-15의 독성 프로파일은 저용량에서 IL-2보다 더 유리할 수 있다. IL-15는 NK 세포 발달 항상성, 증식, 생존, 및 활성화에서 역할을 한다. IL-15 및 IL-2는 IL-2/IL-15Rβ (CD122) 및 공통의 감마 사슬 (CD132)을 포함한 여러 신호전달 성분을 공유한다. IL-15는 또한 NK 세포를 활성화시키고 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 후 NK 세포의 접목에서의 기능적 결함을 복원할 수 있다.
본원에서 제공된 융합 단백질은 하나 이상의 NK 세포 관여자 도메인 (예를 들어, CD16, CD16+CD2, CD16+DNAM, CD16+NKp46), 하나 이상의 표적화 도메인 (본원에 기재된 B7-H3 표적화 펩티드와 같은, 예를 들어 종양 세포 또는 바이러스-감염 세포를 표적화하는 것), 및 하나 이상의 시토카인 NK 활성화 도메인 (예를 들어, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21, 또는 기타 NK 세포 향상 시토카인, 케모카인, 및/또는 활성화 분자)을 포함하는 TriKE 분자일 수 있고, 여기서 각각의 도메인은 다른 도메인에 작동가능하게 연결되어 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 융합 단백질은 CD16 NK 세포 관여자 도메인, 예컨대 서열 번호:2 또는 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CD16 도메인; B7-H3 표적화 융합 단백질 도메인, 예컨대 서열 번호:6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B7-H3 융합 단백질; 및 IL-15 시토카인 NK 활성화 도메인, 예컨대 서열 번호:4, 17 또는 18에 기재된 아미노산 서열을 갖는 IL-15를 포함하는 TriKE 분자일 수 있다.
TriKE 분자의 상이한 단백질 도메인은 서로 작동가능한 연결로 존재할 수 있다. 예를 들어, 링커는 서로에 대해 TriKE 분자의 공유 부착된 단백질 도메인에 사용될 수 있다.
융합 단백질의 요소는 하나 이상의 링커를 사용하여 서로 조립된 작동가능한 연결로 존재할 수 있다. 링커는, 화합물 또는 항체가 활성으로 남아 있는 조건에서 산-유도된 절단, 광-유도된 절단, 펩티다제-유도된 절단, 에스테라제-유도된 절단 및 디술파이드 결합 절단에 대해 취약하거나 실질적으로 내성일 수 있다. 링커는, 디술파이드 기, 히드라진 또는 펩티드 (절단가능), 또는 티오에스테르 기 (비-절단가능)를 포함한, 당업계에 널리 공지된, 그의 화학적 모티프에 따라 분류된다. 링커는 또한, 당업계에 공지된 바와 같은 대전된 링커, 및 그의 친수성 형태를 포함한다.
2개 이상의 단백질 또는 단백질 도메인의 융합에 적합한 링커는 자연 링커, 및 경험적 링커를 포함할 수 있다. 자연 링커는, 단백질 도메인 사이에 자연적으로 존재하는 다중-도메인 단백질로부터 유래된다. 자연 링커는, 상이한 방식으로 융합 단백질에 영향을 미칠 수 있는, 그의 길이, 소수성, 아미노산 잔기, 및 2차 구조 등에 따라 여러 특성을 가질 수 있다.
자연 다중-도메인 단백질에서의 링커의 연구로 인해 재조합 융합 단백질의 작제를 위한 다양한 서열 및 형태를 갖는 경험적 링커가 생성되었다. 경험적 링커는 하기 세 가지 유형으로 분류될 수 있다: 유연성 링커, 강성 링커, 및 절단가능 링커. 유연성 링커는 연합된 도메인에서 특정 정도의 이동 또는 상호작용을 제공할 수 있다. 이들은, 일반적으로 유연성을 제공하고, 연결 기능성 도메인의 이동성을 허용하는 작은, 비-극성 (예를 들어, Gly) 또는 극성 (예를 들어, Ser 또는 Thr) 아미노산으로 구성된다. 강성 링커는 이들의 독립적 기능을 유지하기 위해 도메인 사이에 고정된 거리를 성공적으로 유지할 수 있으며, 이는 단백질 도메인의 효율적인 분리 또는 이들의 서로와의 간섭의 충분한 감소를 제공할 수 있다. 절단가능 링커는 생체내에서 기능적 도메인의 방출을 허용할 수 있다. 독특한 생체내 과정을 활용함으로써, 이들은 환원 시약 또는 프로테아제의 존재와 같은 특정 조건 하에 절단될 수 있다. 이러한 유형의 링커는 입체 장애를 감소시키거나, 생체활성을 개선하거나, 링커 절단 후 재조합 융합 단백질의 개별 도메인의 독립적 작용/대사를 달성할 수 있다.
링커의 비-제한적 예는 서열 번호: 3, 5, 10, 12, 15 및 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 링커를 포함한다.
하나의 측면에서, 서열 번호:2 또는 19, 및 4, 17 또는 18은 서열 번호:3 또는 서열 번호:15에 의해 연결된다. 또 다른 측면에서, 서열 번호:4, 17 또는 18 및 6 또는 7은 서열 번호:5 또는 서열 번호:16에 의해 연결된다. 다른 측면에서, 서열 번호:6 및 7은 어느 배향으로든 작동가능한 연결로 존재한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은, 작동가능한 연결로, 서열 번호:2 또는 19; 4, 17, 또는 18; 6 및 7, 또는 7 및 6을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
본원에 기재된 융합 단백질은 야생형 (wt) IL-15 또는 돌연변이 IL-15 시토카인 NK 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 돌연변이 IL-15는 예를 들어 N72 아미노산의 치환을 포함하는 IL-15를 포함할 수 있다. N72 치환의 비-제한적 예는 N72A 및 N72D 돌연변이를 포함한다.
일부 측면에서, 서열 번호:4는 N72 치환을 갖는다. 다양한 측면에서, N72 돌연변이는 N72A 또는 N72D이고, 단백질은 각각 서열 번호:17 또는 18에 기재되어 있다.
또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 어느 배향으로든 서열 번호:19, 서열 번호:17 또는 18 및 서열 번호:6 및 7을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
하나의 측면에서, 서열 번호:19는 서열 번호:3 또는 15의 링커에 의해 서열 번호:17 또는 18에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 측면에서, 서열 번호:17 또는 18은 서열 번호:5 또는 16의 링커에 의해 어느 배향으로든 서열 6 및 7에 작동가능하게 연결된다.
융합 단백질은 작동가능한 연결로 낙타류 또는 인간 CD16 NK 세포 관여자 도메인 (각각 서열 번호:2 또는 19), wt 또는 돌연변이 IL-15 시토카인 NK 활성화 도메인 (서열 번호:4, 17 또는 18), 및 B7-H3 표적화 펩티드의 경쇄 및 중쇄 (각각 서열 번호:6 및 7)을 포함할 수 있다. CD16 NK 세포 관여자 도메인은 서열 번호:3 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 갖는 링커에 의해 IL-15 시토카인 NK 활성화 도메인에 연결될 수 있다. IL-15 시토카인 NK 활성화 도메인은 서열 번호:5 또는 16에 기재된 아미노산 서열을 갖는 링커에 의해 B7-H3 표적화 펩티드에 연결될 수 있다. IL-15 시토카인 NK 활성화 도메인은 B7-H3 표적화 펩티드의 중쇄 (경쇄에 연결됨)에, 또는 B7-H3 표적화 펩티드의 경쇄 (중쇄에 연결됨)에 연결될 수 있다.
예를 들어, 융합 단백질은, 작동가능한 연결로, N-말단으로부터 C-말단까지, 서열 번호:2, 4, 6 및 7; 서열 번호:2, 4, 7 및 6; 서열 번호:19, 17, 6 및 7; 서열 번호:19, 17, 7 및 6; 서열 번호:19, 18, 6 및 7; 또는 서열 번호:19, 18, 7 및 6을 포함할 수 있다.
구체적으로, 융합 단백질은, 작동가능한 연결로, N-말단으로부터 C-말단까지, 서열 번호:2, 3, 4, 5, 6 및 7; 서열 번호:2, 3, 4, 16, 6 및 7; 서열 번호:2, 15, 4, 5, 6 및 7; 서열 번호:2, 15, 4, 16, 6 및 7; 서열 번호:2, 3, 4, 5, 7 및 6; 서열 번호:2, 3, 4, 16, 7 및 6; 서열 번호:2, 15, 4, 5, 7 및 6; 또는 서열 번호:2, 15, 4, 16, 7 및 6을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 융합 단백질은, 작동가능한 연결로, N-말단으로부터 C-말단까지, 서열 번호:19, 3, 17, 5, 6 및 7; 서열 번호:19, 3, 17, 16, 6 및 7; 서열 번호:19, 15, 17, 5, 6 및 7; 서열 번호:19, 15, 17, 16, 6 및 7; 서열 번호:19, 3, 17, 5, 7 및 6; 서열 번호:19, 3, 17, 16, 7 및 6; 서열 번호:19, 15, 17, 5, 7 및 6; 서열 번호:19, 15, 17, 16, 7 및 6; 서열 번호:19, 3, 18, 5, 6 및 7; 서열 번호:19, 3, 18, 16, 6 및 7; 서열 번호:19, 15, 18, 5, 6 및 7; 서열 번호:19, 15, 18, 16, 6 및 7; 서열 번호:19, 3, 18, 5, 7 및 6; 서열 번호:19, 3, 18, 16, 7 및 6; 서열 번호:19, 15, 18, 5, 7 및 6; 또는 서열 번호:19, 15, 18, 16, 7 및 6을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 융합 단백질은 반감기 연장 (HLE) 분자를 추가로 포함한다.
IgG 면역글로불린과 같은 표적화 단백질의 순환 반감기는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 Fc 영역의 친화력에 의해 조절될 수 있다. 이펙터 기능의 제2 일반적 카테고리는 면역글로불린이 항원에 결합한 후에 작동하는 것들을 포함한다. IgG의 경우, 이들 기능은 보체 캐스캐이드 또는 Fc 감마 수용체 (FcγR)-보유 세포의 참여를 포함한다. FcγR에 대한 Fc 영역의 결합은 특정 면역 효과, 예를 들어, 면역 복합체의 세포내이입, 면역글로불린-코팅된 입자 또는 미생물의 흡입 및 파괴 (또한 항체-의존적 식세포작용, 또는 ADCP라 불림), 면역 복합체의 클리어런스(clearance), 킬러 세포에 의한 면역글로불린-코팅된 표적 세포의 용해 (항체-의존적 세포-매개 세포독성, 또는 ADCC라 불림), 염증 매개자의 방출, 면역 시스템 세포 활성화의 조절, 및 면역글로불린 생성의 조절을 유발한다. 특정 조작된 결합 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 변이형 (예를 들어, scFv) 또는 항체 단편 (예를 들어, Fab 단편))는, 그의 보다 작은 분자 크기 및/또는 단일가(monovalency)로부터 이익을 얻으면서, 또한 기능적 Fc 영역의 부재에 기인하는 여러 단점을 겪는다. 예를 들어, Fab 단편은 이들이 FcRn 결합을 위해 요구되는 Fc 영역이 결핍되고 그의 작은 크기로 인해 신장에 의해 혈액으로부터 빠르게 여과되기 때문에 짧은 생체내 반감기를 갖는다.
본원에 기재된 융합 단백질과 같은 조작된 표적화 폴리펩티드는, 네이티브 결합 폴리펩티드와 비교할 때 FcRn에 대한 감소된 결합을 나타내고, 따라서, 감소된 생체내 반감기를 가질 수 있다. FcRn에 대한 개선된 친화력을 갖는 Fc 변이형은 보다 긴 혈청 반감기를 가질 수 있고, 이러한 분자는, 예를 들어 만성 질환 또는 장애의 치료를 위한, 투여된 폴리펩티드의 긴 반감기가 요망되는 포유류의 치료 방법에서 유용한 응용성을 갖는다. 대조적으로, 감소된 FcRn 결합 친화력을 갖는 Fc 변이형은 보다 짧은 반감기를 갖고, 이러한 분자는 또한, 예를 들어, 단축된 순환 시간이 유리할 수 있는 포유류에 대한 투여를 위해, 예를 들어 생체내 진단 이미징을 위해 또는 출발 폴리펩티드가 연장된 기간 동안 순환계에 존재할 때 독성 부작용을 갖는 상황에서 유용하다.
본원에 기재된 융합 단백질은 대상체에 대한 투여시 그의 생체내 반감기를 연장시키기 위해 반감기 연장 (HLE) 분자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "반감기"는 생체내 특정 표적화 폴리펩티드의 생물학적 반감기를 지칭한다. 반감기는 대상체에게 투여된 양의 절반이 동물에서 순환계 및/또는 기타 조직으로부터 제거되기 위해 필요한 시간에 의해 표시될 수 있다. 표적화 폴리펩티드의 클리어런스 곡선이 시간의 함수로서 작제되는 경우, 곡선은 통상적으로 빠른 α-상 및 보다 긴 β-상을 갖는 2상이다. α-상은 전형적으로 혈관내 공간과 혈관외 공간 사이에서의 투여된 표적화 폴리펩티드의 평형을 나타내고, 부분적으로, 폴리펩티드의 크기에 의해 결정된다. β-상은 전형적으로 혈관내 공간에서의 표적화 폴리펩티드의 이화작용을 나타낸다. 따라서, 용어 반감기는 본원에서 사용되는 바와 같이 바람직하게는 β-상에서의 표적화 폴리펩티드의 반감기를 지칭한다. 인간에서 인간 항체의 전형적인 β 상 반감기는 21일이다.
증가된 반감기는 일반적으로 면역글로불린, 특히 항체, 또한 가장 특히 작은 크기의 항체 단편의 생체내 적용에서 유용하다. 이러한 효과를 달성하기 위해 당업계에 기재된 접근법은 작은 이중특이적 항체 작제물을 보다 큰 단백질에 융합시키는 것을 포함하며, 이는 바람직하게는 단백질 작제물의 치료 효과를 방해하지 않는다. 이중특이적 T 세포 관여자의 이러한 추가 개발에 대한 예는, US 2017/0218078A1에 기재되어 있으며, 이는 표적 세포 표면 항원에 결합하는 제1 도메인, 인간 및/또는 마카카(Macaca) CD3ε 사슬의 세포외 에피토프에 결합하는 제2 도메인, 및 특정 Fc 양식 (HLE 분자)인 제3 도메인을 포함하는 이중특이적 T 세포 관여 분자의 반감기 연장 형식 (HLE 형식)을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "반감기 연장 분자", "HLE 서열" 등은 생체내 반감기를 증가 또는 연장시키기 위해 관심 폴리펩티드에 연결 또는 융합될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드 등의 임의의 분자를 지칭하도록 의도된다. 구체적으로, HLE 서열은 일반적으로 면역글로불린의 Fc 영역 또는 scFc 영역을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 그의 2개의 중쇄의 각각의 Fc 도메인 (또는 Fc 모이어티)에 의해 형성된 네이티브 면역글로불린의 부분을 지칭한다. 네이티브 Fc 영역은 동종이량체이다. 대조적으로, 용어 "유전적으로-융합된 Fc 영역" 또는 "단일-사슬 Fc 영역" (scFc 영역)은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 단일 폴리펩티드 사슬 내에서 유전적으로 연결된 (즉, 단일 연속적 유전자 서열에서 인코딩된) Fc 도메인 (또는 Fc 모이어티)으로 구성된 합성 Fc 영역을 지칭한다. 따라서, 유전적으로 융합된 Fc 영역 (즉, scFc 영역)은 단량체이다.
용어 "Fc 도메인"은 파파인 절단 부위의 바로 상류의 힌지 영역 (즉, IgG에서 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 제1 잔기를 114로 함)에서 시작하고 항체의 C-말단에서 끝나는 단일 면역글로불린 중쇄의 부분을 지칭한다. 따라서, 완전한 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 scFc 영역은 상기 Fc 모이어티 사이에 개재된 링커 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 연결 펩티드)를 통해 유전적으로 융합된 적어도 2개의 Fc 도메인을 포함한다. scFc 영역은 2개의 동일한 Fc 모이어티를 포함할 수 있거나 2개의 동일하지 않은 Fc 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 융합 단백질 중 임의의 것에 혼입될 수 있는 HLE 분자 (단독 또는 링커 폴리펩티드를 통해 또 다른 Fc 도메인과 조합됨)의 제조에 사용될 수 있는 Fc 도메인의 비-제한적 예는 서열 번호:26-33 중 어느 하나를 포함하는 아미노산을 갖는 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함한다.
HLE 분자의 제조에 사용될 수 있는 scFc 영역의 제조에 사용될 수 있는 링커 폴리펩티드의 비-제한적 예는 서열 번호:34-35 중 어느 하나를 포함하는 아미노산을 갖는 폴리펩티드 중 임의의 것을 포함한다.
본원에 기재된 HLE 분자는, 서열 번호:26-33 중 어느 하나를 포함하는 아미노산을 갖는 Fc 도메인, 또는 서열 번호:34-35 중 어느 하나를 포함하는 아미노산을 갖는 링커를 통해, 서열 번호:26-33 중 어느 하나를 포함하는 아미노산을 갖는 제2 Fc 도메인에 융합된 서열 번호:26-33 중 어느 하나를 포함하는 아미노산을 갖는 제1 Fc 도메인을 포함하는 scFc 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, HLE 분자는 서열 번호:21-25 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 융합 단백질 중 임의의 것을 인코딩하는 단리된 핵산 서열을 제공한다.
CD16 NK 세포 관여자 도메인, 예컨대 서열 번호:2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CD16 도메인; B7-H3 표적화 융합 단백질 도메인, 예컨대 서열 번호:6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 갖는 B7-H3 융합 단백질; 및 IL-15 시토카인 NK 활성화 도메인, 예컨대 서열 번호:4에 기재된 아미노산 서열을 갖는 IL-15를, 작동가능한 연결로 포함하는, 또한 서열 번호:1에 기재된 바와 같은 TriKE 융합 단백질과 같은, 본원에 기재된 융합 단백질은 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 하나의 측면에서, 서열은 서열 번호:8 또는 그와 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 대상체에게 본원에 기재된 융합 단백질 중 임의의 것을 투여함으로써 암을 치료하는 것을 포함하는, 대상체에서의 암 치료 방법을 제공한다.
용어 "대상체"는 본원에서 사용되는 바와 같이 대상 방법이 수행되는 임의의 개체 또는 환자를 지칭한다. 일반적으로, 대상체는 인간이지만, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 대상체는 동물일 수 있다. 따라서, 척추동물, 예컨대 설치류 (마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그 포함), 고양이, 개, 토끼, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 닭 등을 포함한 농장 동물, 및 영장류 (원숭이, 침팬지, 오랑우탄 및 고릴라 포함)를 포함한 기타 동물이 대상체의 정의 내에 포함된다.
용어 "치료"는 본원에서 용어 "치료적 방법"과 상호교환가능하게 사용되며, 1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치유하고/거나, 늦추고/거나, 그의 증상을 완화시키고/거나, 그의 진행을 중단시키는 치료적 처리 또는 조치, 및 2) 예방적/방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 것들은 특정 의학적 장애를 이미 갖고 있는 개체 뿐만 아니라 궁극적으로 장애를 얻을 수 있는 것들 (즉, 방지적 조치를 필요로 하는 것들)을 포함할 수 있다.
용어 "치료 유효량", "유효 용량", "치료 유효 용량", "유효량" 등은 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 추구되는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 끌어낼 대상 화합물의 양을 지칭한다. 일반적으로, 반응은 환자에서의 증상의 개량 또는 요망되는 생물학적 결과이다. 이러한 양은 암을 치료하기 위해 충분해야 한다. 유효량은 본원에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
용어 "투여" 및/또는 "투여하는"은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 제약 조성물을 제공하는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 투여 경로는 장내, 국소 또는 비경구일 수 있다. 이와 같이, 투여 경로는 피부내, 피하, 정맥내, 복강내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 경피, 경기관, 피하, 관절내, 피막하, 거미막하, 척수내 및 경골내, 경구, 설하 협측, 직장, 질, 비강 안구 투여, 뿐만 아니라 주입, 흡입, 및 연무를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 어구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여됨"은 본원에서 사용되는 바와 같이 장내 및 국소 투여 이외의 투여 모드를 의미한다.
본원에 기재된 융합 단백질은 융합 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물로 제형화될 수 있다. "제약상 허용가능한"이란, 담체, 희석제 또는 부형제가 제형의 다른 성분과 상용성이고 그의 수용자에게 해롭지 않아야 함을 의미한다. 담체의 예는 리포솜, 나노입자, 연고, 미셀, 마이크로스피어, 마이크로입자, 크림, 에멀젼, 및 겔을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 부형제의 예는 접착방지제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 결합제, 예컨대 당류 및 그의 유도체 (수크로스, 락토스, 전분, 셀룰로스, 당 알콜 등) 단백질, 예컨대 젤라틴 및 합성 중합체, 윤활제, 예컨대 활석 및 실리카, 및 보존제, 예컨대 항산화제, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 레티닐 팔미테이트, 셀레늄, 시스테인, 메티오닌, 시트르산, 황산나트륨 및 파라벤을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 희석제의 예는 물, 알콜, 식염수 용액, 글리콜, 미네랄 오일 및 디메틸 술폭시드 (DMSO)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
제약 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 투여량 형태로 투여될 수 있다. 적합한 단위 투여량 형태는 분말, 정제, 환제, 캡슐, 로젠지, 좌약, 패치, 비강 스프레이, 주사제, 이식가능 지속-방출 제형, 지질 복합체 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 방법은 암의 치료에 관한 것이다. 용어 "암"은, 암 (악성 종양)을 양성 종양과 구별하는 다른 부위 (2차 부위, 전이)에 대한 침범 및 확산 가능성을 갖는 하나의 부위 (원발 부위)에서 시작하는 비정상적이고 제어되지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 질환의 그룹을 지칭한다. 실질적으로 모든 기관이 영향받을 수 있으며, 이는 인간에게 영향을 미칠 수 있는 100개 초과의 유형의 암으로 이어진다. 암은 유전적 소인, 바이러스 감염, 이온화 방사선으로의 노출, 환경 오염물 노출, 담배 및/또는 알콜 사용, 비만, 잘못된 식습관, 신체 활동 부족 또는 임의의 이들의 조합을 포함한 다양한 원인으로 인해 발생할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "신생물" 또는 "종양" (그의 문법적 변형 포함)은, 양성 또는 암성일 수 있는, 조직의 새롭고 비정상적인 성장을 의미한다. 관련 측면에서, 신생물은 다양한 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는 신생물 질환 또는 장애를 나타낸다. 예를 들어, 이러한 암은 전립선, 췌장, 담도, 결장, 직장, 간, 신장, 폐, 고환, 유방, 난소, 뇌, 및 두경부의 암, 흑색종, 육종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종 등을 포함할 수 있다.
국립 암 연구소에 의해 기재된 예시적 암은 하기를 포함한다: 급성 림프모구 백혈병, 성인; 급성 림프모구 백혈병, 소아; 급성 골수성 백혈병, 성인; 부신피질 암종; 부신피질 암종, 소아; AIDS-관련 림프종; AIDS-관련 악성 종양; 항문암; 성상세포종, 소아 소뇌; 성상세포종, 소아 대뇌; 담관암, 간외; 방광암; 방광암, 소아; 골암, 골육종/악성 섬유성 조직구종; 뇌 줄기 신경교종, 소아; 뇌 종양, 성인; 뇌 종양, 뇌 줄기 신경교종, 소아; 뇌 종양, 소뇌 성상세포종, 소아; 뇌 종양, 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 소아; 뇌 종양, 뇌실막종, 소아; 뇌 종양, 수모세포종, 소아; 뇌 종양, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 소아; 뇌 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 소아; 뇌 종양, 소아 (기타); 유방암; 유방암 및 임신; 유방암, 소아; 유방암, 남성; 기관지 선종/유암종, 소아: 카르시노이드 종양, 소아; 카르시노이드 종양, 위장관; 암종, 부신피질; 암종, 섬세포; 원발 부위 미상의 암종; 중추 신경계 림프종, 원발성; 소뇌 성상세포종, 소아; 대뇌 성상세포종/악성 신경교종, 소아; 자궁경부암; 아동 암; 만성 림프구성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 만성 골수증식성 장애; 건초의 투명 세포 육종; 결장암; 결장직장 암, 소아; 피부 T-세포 림프종; 자궁내막암; 뇌실막종, 소아; 상피암, 난소; 식도암; 식도암, 소아; 유잉 계열의 종양; 두개외 생식 세포 종양, 소아; 고환외 생식 세포 종양; 간외 담관암; 안암, 안구내 흑색종; 안암, 망막모세포종; 담낭암; 위(Gastric, Stomach)암; 위암, 소아; 위장관 카르시노이드 종양; 생식 세포 종양, 두개외, 소아; 생식 세포 종양, 고환외; 생식 세포 종양, 난소; 임신 영양막 종양; 신경교종. 아동 뇌간; 신경교종. 아동 시각 경로 및 시상하부; 털세포 백혈병; 두경부암; 간세포 (간)암, 성인 (원발성); 간세포 (간)암, 소아 (원발성); 호지킨 림프종, 성인; 호지킨 림프종, 소아; 임신 중 호지킨 림프종; 하인두암; 시상하부 및 시각 경로 신경교종, 소아; 안구내 흑색종; 섬세포 암종 (내분비 췌장); 카포시 육종; 신장암; 후두암; 후두암, 소아; 백혈병, 급성 림프모구, 성인; 백혈병, 급성 림프모구, 소아; 백혈병, 급성 골수성, 성인; 백혈병, 급성 골수성, 소아; 백혈병, 만성 림프구성; 백혈병, 만성 골수성; 백혈병, 털세포; 입술 및 구강 암; 간암, 성인 (원발성); 간암, 소아 (원발성); 폐암, 비-소세포; 폐암, 소세포; 림프모구 백혈병, 성인 급성; 림프모구 백혈병, 소아 급성; 림프구성 백혈병, 만성; 림프종, AIDS- 관련; 림프종, 중추 신경계 (원발성); 림프종, 피부 T-세포; 림프종, 호지킨, 성인; 림프종, 호지킨; 아동; 림프종, 호지킨 임신 중; 림프종, 비-호지킨, 성인; 림프종, 비-호지킨, 소아; 림프종, 비-호지킨 임신 중; 림프종, 원발성 중추 신경계; 거대글로불린혈증, 발덴스트롬; 남성 유방암; 악성 중피종, 성인; 악성 중피종, 소아; 악성 흉선종; 수모세포종, 소아; 흑색종; 흑색종, 안구내; 메르켈 세포 암종; 중피종, 악성; 잠복 원발을 갖는 전이성 편평 경부암; 다발성 내분비 종양형성 증후군, 소아; 다발성 골수종/형질 세포 신생물; 균상식육종; 골수이형성 증후군; 골수성 백혈병, 만성; 골수성 백혈병, 소아 급성; 골수종, 다발성; 골수증식성 장애, 만성; 비강 및 부비동 암; 비인두암; 비인두암, 소아; 신경모세포종; 비-호지킨 림프종, 성인; 비-호지킨 림프종, 소아; 비-임신 중 호지킨 림프종; 비-소 세포 폐암; 구강암, 소아; 구강 및 입술 암; 구강인두암; 골육종/뼈의 악성 섬유성 조직구종; 난소암, 소아; 난소 상피암; 난소 생식 세포 종양; 난소 저 악성 잠재성 종양; 췌장암; 췌장암, 소아, 췌장암, 섬세포; 부비동 및 비강 암; 부갑상선암; 음경암; 크롬친화세포종; 송과 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 소아; 뇌하수체 종양; 형질 세포 신생물/다발성 골수종; 흉막폐모세포종; 임신 및 유방암; 임신 및 호지킨 림프종; 임신 및 비-호지킨 림프종; 원발성 중추 신경계 림프종; 원발성 간암, 성인; 원발성 간암, 소아; 전립선암; 직장암; 신장 세포 (신장)암; 신장 세포암, 소아; 신우요관, 이행 세포암; 망막모세포종; 횡문근육종, 소아; 타액선암; 타액선암, 소아; 육종, 유잉 계열의 종양; 육종, 카포시; 육종 (골육종) 악성 섬유성 조직구종 of Bone; 육종, 횡문근육종, 소아; 육종, 연조직, 성인; 육종, 연조직, 소아; 시자리 증후군; 피부암; 피부암, 소아; 피부암 (흑색종); 피부암종, 메르켈 세포; 소세포 폐암; 소장암; 연조직 육종, 성인; 연조직 육종, 소아; 잠복 원발성 편평 경부암, 전이성; 위암; 위암, 소아; 천막상 원시 신경외배엽 종양, 소아; T-세포 림프종, 피부; 고환암; 흉선종, 소아; 흉선종, 악성; 갑상선암; 갑상선암, 소아; 신우요관의 이행 세포암; 영양막 종양, 임신; 원발 부위 미상 암, 소아; 특이 암, 아동; 신우요관, 이행 세포암; 요도암; 자궁 육종; 질암; 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 소아; 외음부암; 발덴스트롬 거대글로불린혈증; 및 윌름스 종양.
하나의 측면에서, 암은 비-소 폐암, 피부 편평 세포 암종, 췌장암, 원발성 간세포 암종, 결장직장 암종, 투명 세포 신장 암종 또는 유방암으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 융합 단백질의 투여는 하나 이상의 추가의 치료적 작용제와 조합되어 이루어질 수 있다. 어구 "조합 치료법", "~와 조합" 등은 반응을 증가시키기 위한 하나 초과의 의약 또는 치료의 동시 사용을 지칭한다. 본 발명의 융합 단백질 및 그의 제약 조성물은 예를 들어 암 치료에 사용되는 다른 약물 또는 치료와 조합되어 사용될 수 있다. 구체적으로, 대상체에 대한 융합 단백질의 투여는 화학요법 작용제, 수술, 방사선요법, 또는 이들의 조합과 조합되어 이루어질 수 있다. 이러한 치료법은 본 발명의 조성물의 투여 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다.
용어 "화학요법 작용제"는 본원에서 사용되는 바와 같이 암 치료에 사용되는 임의의 치료적 작용제를 지칭한다. 화학요법 작용제의 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 악티노마이신, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카페시타빈, 시스플라틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에토포시드, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이리노테칸, 메클로레타민, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 테니포시드, 티오구아닌, 토포테칸, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 파니투마맙, 에르비툭스 (세툭시맙), 마투주맙, IMC-HF 8, TheraCIM hR3, 데노수맙, 아바스틴 (베바시주맙), 휴미라 (아달리무맙), 헤르셉틴 (트라스투주맙), 레미케이드 (인플릭시맙), 리툭시맙, 시나기스 (팔리비주맙), 마일로타르그 (젬투주맙 옥소가미신), 사르클리사 (이사툭시맙), 랩티바 (에팔리주맙), 티사브리 (나탈리주맙), 제나팍스 (다클릭시맙), 뉴트로스펙 (테크네튬 (99mTc) 파놀레소맙), 토실리주맙, 프로스타신트 (인듐-III 라벨링된 카프로맙 펜데티드), 벡사르 (토시투모맙), 제발린 (이트륨 90에 컨쥬게이션된 이브리투모맙 티욱세탄 (IDEC-Y2B8)), 졸레어 (오말리주맙), 맙테라 (리툭시맙), 레오프로 (압식시맙), 맙캄파트 (알렘투주맙), 시물렉트 (바실릭시맙), 류코스칸 (술레소맙), CEA-스칸 (아르시투모맙), 베를루마 (노페투모맙), 파노렉스 (에드레콜로맙), 알렘투주맙, CDP 870, 나탈리주맙 길로트리프 (아파티닙), 린파르자 (올라파립), 페르제타 (페르투주맙), 오트디보 (니볼루맙), 보술리프 (보수티닙), 카르보메틱스 (카르보잔티닙), 오기브리 (트라스투주맙-dkst), 수텐트 (수니티닙 말레이트), 애드세트리스 (브렌툭시맙 베도틴), 알레센사 (알렉티닙), 칼퀀스 (아칼라브루티닙), 예카르타 (실로류셀), 베르제니오 (아베마시클립), 키트루다 (펨브롤리주맙), 알리코파 (코판리십), 널린스 (네라티닙), 임핀지 (두르발루맙), 다잘렉스 (다라투무맙), 테센트릭 (아테졸리주맙), 및 타르세바 (에를로티닙). 면역요법 작용제의 예는 인터류킨 (11-2, 11-7, 11-12), 시토카인 (인터페론, G-CSF, 이미퀴모드), 케모카인 (CCL3, CC126, CXCL7), 면역조절 이미드 약물 (탈리도미드 및 그의 유사체).
하나의 구현예에서, 본 발명은 치료 유효량의 서열 번호:1의 아미노산 서열 또는 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 대상체에게 본원에 기재된 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 암 치료 방법을 제공한다.
자연 킬러 세포 (또한 NK 세포 또는 대형 과립 림프구 (LGL)로서 언급됨)는, 공지된 선천적 림프구 세포 (ILC)의 빠르게 확장되는 패밀리에 속하는 선천적 면역 시스템에 중요한 세포독성 림프구의 유형이며 인간에서 모든 순환 림프구의 5-20%를 차지한다. NK 세포의 역할은 척추동물 적응성 면역 반응에서의 세포독성 T 세포의 역할과 유사하다. NK 세포는 감염 약 3일 후에 작용하는 바이러스-감염 세포 및 기타 세포내 병원체에 대한 빠른 반응을 제공하고, 종양 형성에 반응한다. 전형적으로, 면역 세포는 감염된 세포 표면 상에 존재하는 주요 조직적합성 복합체 (MHC)를 검출하여, 시토카인 방출을 촉발하고, 용해 또는 아팝토시스에 의해 감염된 세포의 사멸을 유발한다. 그러나, NK 세포는, 이들이 항체 및 MHC의 부재 하에 스트레스 부여된 세포를 인식하고 사멸시키는 능력을 가져, 훨씬 더 빠른 면역 반응을 가능하게 하기 때문에 독특하다. 이들이 MHC 부류 1의 "자가" 마커가 결핍된 세포를 사멸시키기 위해 활성화를 필요로 하지 않는다는 개념으로 인해 이들은 "자연 킬러"로 명명되었다. MHC I 마커가 결핍된 유해 세포는 T 림프구 세포 등의 다른 면역 세포에 의해 검출 및 파괴될 수 없기 때문에 이 역할이 특히 중요하다.
자연 킬러 세포가 선천적 면역의 이펙터인 것에 추가로, 활성화 및 억제성 NK 세포 수용체 둘 다, NK 세포 활성의 자가-용인 및 지속을 포함한, 중요한 기능적 역할을 한다. NK 세포는 또한 적응성 면역 반응에서 역할을 한다: 수많은 실험이 즉각적 환경에 쉽게 적응하고 동일한 항원으로의 2차 감염에 반응하는 데 기본이 되는 항원-특이적 면역학적 기억을 공식화하는 그의 능력을 입증하였다. 선천적 및 적응성 면역 반응 둘 다에서의 NK 세포의 역할은 잠재적 암 치료법으로서 NK 세포 활성을 사용하는 연구에서 점점 더 중요해지고 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명은, 대상체에서의 암 세포에 대한 자연 킬러 (NK) 세포 활성의 유도 방법으로서, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체에서 암 세포에 대해 NK 세포 활성을 유도하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, NK 세포 활성의 유도는 NK 세포 탈과립화 유도, 인터페론 γ의 NK 세포 생성 유도, 대상체에서의 다수의 종양 침윤 NK 세포의 증가, 및/또는 NK 세포 증식의 유도 또는 증가를 포함한다.
자연 킬러 세포 또는 대형 과립 림프구 (LGL)는 공지된 선천적 림프구 세포 (ILC)의 빠르게 확장되는 패밀리에 속하는 선천적 면역 시스템에 중요한 세포독성 림프구의 유형이며 인간에서 모든 순환 림프구의 5-20%를 차지한다. 이들은 하기를 포함한 다양한 기능을 갖는다: 세포용해성 과립 매개 세포 아팝토시스, 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 시토카인-유도된 NK 및 세포독성 T 림프구 (CTL) 활성화.
NK 세포는 세포독성이고; 그의 세포질 내의 소형 과립은 퍼포린 및 그랜자임으로서 공지된 프로테아제 등의 단백질을 함유한다. 사멸 예정인 세포에 근접한 방출시, 퍼포린은 표적 세포의 세포 막 내에 기공을 형성하여, 그랜자임 및 관련 분자가 진입할 수 있는 수성 채널을 생성하여, 아팝토시스 또는 삼투성 세포 용해를 유도한다. 아팝토시스와 세포 용해 사이의 구별이 면역학에서 중요하다: 바이러스-감염된 세포의 용해는 잠재적으로 비리온을 방출할 수 있는 반면, 아팝토시스는 바이러스 내부의 파괴를 초래한다. α-디펜신, 항균 분자 또한 NK 세포에 의해 분비되며, 호중구의 것과 유사한 방식으로 그의 세포 벽을 파괴함으로써 박테리아를 직접 사멸시킨다.
감염된 세포는 면역 세포에 의한 검출을 위해 일상적으로 항체로 옵소닌화된다. 항원에 결합하는 항체는 NK 세포 상에서 발현된 FcγRIII (CD16) 수용체에 의해 인식되어, NK 활성화, 세포용해성 과립의 방출 및 결과적인 세포 아팝토시스를 발생시킬 수 있다. 이는 리툭시맙 (리툭산), 오파투무맙 (아제라) 등과 같은 일부 모노클로날 항체의 주요 사멸 메커니즘이다.
시토카인은 NK 세포 활성화에서 중요한 역할을 한다. 이들은 바이러스 감염 시 세포에 의해 방출되는 스트레스 분자임에 따라, NK 세포에 영향 받은 부위에서의 바이러스 병원체의 존재 신호를 제공하는 역할을 한다. NK 활성화에 관여하는 시토카인은 IL-12, IL-15, IL- 18, IL-2, 및 CCL5를 포함한다. NK 세포는 인터페론 또는 대식세포-유래된 시토카인에 반응하여 활성화된다. 이들은 적응성 면역 반응이 감염을 제거할 수 있는 항원-특이적 세포독성 T 세포를 생성하는 동안 바이러스 감염을 함유하는 역할을 한다. NK 세포는 IFNγ 및 TNFα를 분비함으로써 바이러스 감염을 제어하도록 작용한다. IFNγ는 식세포작용 및 용해를 위해 대식세포를 활성화시키고, TNFα는 직접적인 NK 종양 세포 사멸을 촉진하도록 작용한다. NK 세포가 결핍된 환자는 헤르페스 바이러스 감염의 초기 단계에 매우 취약한 것으로 증명되었다.
종양-침윤 NK 세포는 인간 삼중-음성 유방암에서 약물-유도된 세포 사멸을 촉진하는 데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. NK 세포는 이들이 비-자가 HLA 항원 (자가는 아님)을 발현할 때 표적 세포를 인식하므로, 자가유래 (환자 자신의) NK 세포 주입은 임의의 항종양 효과를 나타내지 않았다. 대신에, 조사자들은 말초 혈액으로부터의 동종이계 세포를 사용하는 작업 중에 있으며, 이는 치명적일 수 있는 이식편 대 숙주 질환의 위험을 제거하기 위해 환자에게 주입하기 전에 모든 T 세포를 제거할 것을 필요로 한다. 이는 면역자기 컬럼 (CliniMACS)을 사용하여 달성될 수 있다. 추가로, 혈액 내의 NK 세포의 제한된 수로 인해 (림프구의 단지 10%만이 NK 세포임), 그 수가 배양에서 확장되어야 한다. 이는 몇 주가 걸릴 수 있으며 수율은 공여자에 따라 다르다.
하나의 구현예에서, 본 발명은, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체에서의 종양 성장을 억제하는 것을 포함하는, 대상체에서의 종양 성장의 억제 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 종양 성장 억제는 종양 세포 생존의 감소를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체의 생존을 증가시키는 것을 포함하는, 암을 갖는 대상체의 생존 증가 방법을 제공한다.
생존 증가란, 대상체에게 본 발명의 융합 단백질을 투여한 경우, 투여 부재 하에, 또는 본 발명의 융합 단백질을 포함하지 않는 또 다른 치료 체제의 투여시의 생존과 비교하여, 대상체의 생존이 증가함을 의미한다.
추가의 구현예에서, 본 발명은, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체의 생존을 증가시키는 것을 포함하는, 대상체에서의 암 세포에 대한 자연 킬러 (NK) 매개된 항체-의존적 세포의 세포독성의 유도 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여하는 것은 대상체에게 항암 치료를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 측면에서, 암은 폐암, 전립선암, 다발성 골수종, 난소암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 측면에서, 암 세포는 B7-H3 발현 암 세포이다. 일부 측면에서, 암은 치료 내성 암이다.
논의된 적용을 위해 고려되는, B7-H3 TriKE 분자의 개발, 특성화 및 효능 평가를 논의하는 실시예가 하기에 제시된다. 하기 실시예는 본 발명의 구현예를 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지는 않는다. 이들은 사용될 수 있는 것들에 있어 전형적이지만, 당업자에게 공지된 다른 절차, 방법론, 또는 기술이 대안적으로 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1
삼중특이적 개발 및 특성화
항원-특이적 면역요법은 정상 조직에서 최소의 종양이탈 발현을 가지며 종양 세포 상의 표적 항원의 과발현을 필요로 한다. 이상적으로, 항원은 광범위한 암에서 높은 발현을 나타내어, 면역요법을 다수의 셋팅에 적용가능하게 만들고, 광범위한 표적이 식별될 수 있는 경우 바스켓 임상 시험이 더욱 대중화되고 있다. 체크포인트 리간드의 B7 패밀리의 구성원인 막횡단 공동자극 단백질인 B7-H3은 면역요법에 대한 표적으로서 관심을 끌고 있다. 이는 T-세포 상의 수용체를 관여시킴으로써 공동-자극 및 억제 둘 다의 맥락에서 관여되지만, 이는 또한 종양 미세환경 내의 대식세포, 및 종양 세포 등의 항원 제시 세포 상의 발현을 통해 면역 회피에 기여하는 것으로 나타났다. B7-H3 발현은 많은 유형의 암에서 높지만 정상 조직에서는 매우 낮다. 마우스 세포에 대해 반응성인 B7-H3-표적화 CAR T 작제물을 활용하는 마우스 모델은, 독성의 부재 하에 항-종양 반응을 입증하여, 표적으로서의 B7-H3의 안전성 프로파일을 더욱 강조하였다. 난소 종양의 93%는 B7-H3을 발현하며, 발현은 진행 단계, 높은 재발률, 및 낮은 생존과 관련된다. 결장암, 전립선암, 췌장암, 비-소세포 폐암, 및 위암을 포함한 다른 유형의 암종에서도 유사한 발견이 존재하며, 이는 B7-H3이 암 생물학, 진행, 및 다양한 상이한 암에 걸친 치료법에 있어 유용한 마커가 될 수 있음을 나타낸다. 이들 특징으로 인해, Fc 최적화된 항체 (NCT02982941)로부터 CAR T 세포 (NCT04077866)에 이르는 양식에서 이 항원을 표적화하는 다수의 임상 시험이 현재 진행 중이다.
블리나투모맙 등의 이중특이적 면역 관여자는 인상적인 임상적 성공을 나타내었다. 단일 조작 분자로서, 그의 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 중 하나는 암 세포를 표적화하고, 다른 하나는 T 세포 상의 CD3을 표적화한다. 이는 T 세포와 암 세포 사이의 면역 시냅스를 생성하여, 종양을 사멸시킨다. 그러나, T 세포의 활성화 및 증식은 시토카인 방출 증후군, 파종성 혈관내 응고, 및 뇌병증 및 발작을 포함한 신경계 이벤트를 초래할 수 있다. 따라서, 본 연구는 T 세포 대신에 자연 킬러 (NK) 세포를 선택적으로 관여시키는 것을 목표로 한다. NK 세포는 선천적 면역 시스템의 부분이며, 종양 감시에 있어 주요 역할을 하며, 고형 종양 및 혈액암과 관련된 다수의 연구에서 잠재력을 나타내었다. 이들 특징으로 인해, NK 세포 상의 가장 강력한 활성화 수용체인 CD16을 표적화하는 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 종양 관련 항원을 표적화하는 scFv, 및 IL-15 모이어티로 이루어진 삼중특이적 킬러 관여자 (TriKE) 플랫폼이 디자인되고 기재되었다. 본 발명자들은 CD16에 대한 단일 도메인 항체를 첨가함으로써 이 플랫폼을 개선하였으며, 그 결과 IL-15 활성 및 전반적 기능이 더 우수해졌다. IL-15는 NK 세포 기능에 있어 가장 중요한 항상성 시토카인이다. 이는 NK 세포 확장 및 생존에 필수적이며, 이는 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)을 증폭시킬 수 있고, 이는 림포카인-활성화된 킬러 활성을 유도할 수 있고, 이는 인터페론 감마 (IFNγ) 및 종양-괴사 인자 알파 (TNFα)와 같은 다른 공동-자극 매개자의 생성을 향상시킬 수 있다.
cam1615B7-H3이라 불리는, 인간화 낙타류 항-CD16 VHH 단일 도메인 항체 (sdAb)와 항-B7-H3 scFv 사이의 변형된 가교제로서 인간 IL-15로 생체조작된 2세대 TriKE가 본원에 기재된다. 따라서, 단일 분자에서, 하기 두 가지 중요한 치료적 특성이 통합되었다: NK 세포 확장을 특이적으로 향상시키는 능력과 ADCC를 향상시키는 능력. cam1615B7-H3은, 이종성 난소암 모델에 대해서도 강력한 활성을 또한 나타내면서, 시험관내에서 다양한 고형 종양에 대해 NK 세포 활성의 강력하고 특이적인 유도를 나타내었다. 따라서, TriKE를 사용한 B7-H3의 표적화는 다수의 고형 암의 NK-세포-기반 면역요법에서 높은 치료적 가치를 가질 수 있다.
cam1615B7-H3 TriKE의 작제
낙타류로부터 유래된 단일-도메인 VHH 항체는 종래의 VL-VH scFv 단편에 비해 이점을 제공하는 것으로 공지되어 있다. 낙타류 (라마) 항-CD16으로부터의 상보성 결정 영역 (CDR)은 보편적인 인간화 중쇄 스캐폴드로 분할되었다. 이 인간화된 낙타류 서열이 cam1615B7-H3에 사용되었다. DNA 셔플링 및 DNA 결찰 기술을 사용하여 cam1615B7-H3을 인코딩하는 하이브리드 유전자를 합성하였다. 완전히 조립된 유전자 (5' 말단으로부터 3' 말단까지)는 NcoI 제한 부위; ATG 출발 코돈; 항-인간 CD16 VHH; 20개 아미노산 (aa) 세그먼트, PSGQAGAAASESLFVSNHAY (서열 번호:36); 인간 야생형 IL-15; 7개 아미노산 링커, EASGGPE (서열 번호:37); 항-B7-H3 mAb 376.96 scFv; 및 XhoI 제한 부위를 인코딩하였다. 생성된 하이브리드 유전자를 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 유도성 T7 촉진제의 제어 하에 pET28c 발현 벡터로 스플라이싱하였다. cam1615B7-H3을 인코딩하는 DNA 표적 유전자는 1527개 염기 쌍이었다. 미네소타 대학교 (미국 미네소타주 세인트 폴)의 생물의학 게놈 센터는 작제물의 유전자 서열 및 프레임내 정확도를 검증하였다.
봉입체로부터의 단백질의 정제
대장균 균주 BL21 (DE3) (Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨)을 플라스미드 형질감염 후 단백질의 발현에 사용하였다. 박테리아 발현은 표적 단백질을 봉입체 (IB)로 격리시켰다. 박테리아를 카나마이신 (30 mg/mL)을 함유하는 800 mL Luria 브로쓰(broth) 내에서 밤새 배양하였다. 흡광도가 600 nm에서 0.65에 도달하면, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드/IPTG (FischerBiotech, 미국 뉴저지주 페어 론)로 유전자 발현을 유도하였다. 박테리아를 2 h 후에 수확하였다. 완충 용액 (50 mM Tris, 50 mM NaCl, 및 5 mM EDTA pH 8.0) 중에서의 균질화 단계 후, 펠릿을 음파처리하고 원심분리하였다. 단백질을 0.3% 나트륨 데옥시콜레이트, 5% Triton X-100, 10% 글리세린, 50 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 및 5 mmol/L EDTA (pH 8.0)의 용액을 사용하여 펠릿으로부터 추출하였다. 추출물을 3회 세척하였다.
봉입체에서의 박테리아 발현은 재폴딩을 필요로 한다. 따라서, 단백질을 나트륨 N-라우로일-사르코신 (SLS) 공기 산화 방법을 사용하여 재폴딩하였다 (20). IB를 100 mM Tris, 2.5% SLS (Sigma, 미국 미주리주 세인트 루이스) 중에 용해시키고 원심분리에 의해 정화하였다. 이어서, 50 μM의 CuSO4를 용액에 첨가하고, 이어서 -SH 기의 공기-산화를 위해 20 h 동안 빠른 교반과 함께 실온에서 인큐베이션하였다. 6 M 우레아 및 10% AG 1-X8 수지 (200-400 메쉬, 클로라이드 형태) (Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘레스)를 세제-가용화된 단백질 용액에 첨가함으로써 SLS의 제거를 수행하였다. 구아니딘 HCl (13.3 M)을 용액에 첨가하고, 이를 37℃에서 2 내지 3 h 동안 인큐베이션하였다. 용액을 재폴딩 완충제, 50 mM Tris, 0.5 M 1-아르기닌, 1 M 우레아, 20% 글리세롤, 5 mM EDTA, pH 8.0로 20배 희석하였다. 혼합물을 4℃에서 2일 동안 재폴딩하고, 이어서 4℃에서 48 h 동안 pH 8.0에서 5 부피의 20 mM Tris-HCl에 대하여, 이어서 8 부피로 추가의 18시간 동안 투석하였다. 이어서 생성물을 고속 유동 Q 이온 교환 컬럼 상에서 정제하고, 크기 배제 컬럼 (Superdex 200, GE, 미국 매사추세츠주 말보로) 상으로 통과시켜 추가로 정제하였다. 단백질 순도를 Simply Blue Safe Stain (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드)으로 염색된 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 결정하였다.
B7-H3 표적화 TriKE의 생성 및 정제
ADCC 및 NK 세포 확장이 둘 다 가능한 2세대 TriKE를 작제하기 위해, 기존 TriKE 플랫폼을 변형하였다. 2개의 변형된 플랭킹 영역을 갖는 야생형 인간 IL-15 가교제를 2개의 항체 단편, N-말단 VHH 인간화 낙타류 항-CD16 단편 및 C-말단 항-B7-H3 단편 사이에 삽입하여 cam1615B7-H3을 생성하였다. 도 1a는 B7-H3 TriKE 작제물의 개략도를 나타낸다. B7-H3 TriKE는 ~46 kDa의 분자량을 갖는 단일 펩티드를 형성하는 IL-15 및 2개의 유연성 링커 영역에 의해 연합된 CD16 및 B7-H3을 표적화하는 낙타류 나노바디 (cam)로부터의 단일 사슬 가변 단편을 포함한다. 이는, 대략 35kDa의 단일 펩티드를 형성하는 단일 유연성 링커 영역과 camCD16 및 camB7-H3으로 이루어진 BiKE와 상이하다. NK 세포-매개 표적 용해는 B7-H3 TriKE 또는 BiKE에 의한 직접적 물리적 연결의 형성을 통해 B7-H3-발현 종양 세포를 향해 지향된다. 이어서 IL-15는 NK 세포를 자극한다. 도 1b는 그래프의 가로축 상에 나타난 8-mL 분취액 중에서 수집된 용리액으로의 정제의 제1 단계로서 FFQ 이온 교환 컬럼으로부터의 흡광도 추적을 나타낸다. 양방향 화살표는 약물이 컬럼을 빠져나갈 때 수집 피크를 나타낸다. 도 1c는 제2 정제 단계인 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로부터의 흡광도 추적을 나타낸다. 컬럼으로부터의 제1 피크를 수집하고, 다양한 약물 함유 분획을 풀링하고, 균일한 생성물의 존재에 대하여 Comassie Blue 염색으로 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다 (도 1d). 최종 생성물은 약 55 kDa의 분자량을 가지며 순도가 90% 초과였으며; 예측 분자량은 54.58 kDA이었다. 다른 TriKE 분자와 마찬가지로, 이 TriKE도 두어 시간 정도의 EC50 범위를 가지며 그의 크기로 인해 빠른 클리어런스 프로파일을 가질 것으로 예상된다.
cam1615B7-H3 TriKE는 강력하고 특이적인 NK 세포 증식을 유도함
cam1615B7-H3 TriKE에서의 야생형 IL-15 모이어티는 NK 세포에 대한 증식성 신호의 표적화된 전달을 유도하도록 디자인되었다. 이것을 시험하기 위해, 7일 기간에 걸쳐 CellTrace 염료의 희석을 평가하는 증식 검정을 처리 없음 (NT), 단량체 rhIL-15 (IL15), 또는 TriKE (cam1615B7-H3)로 처리된 PBMC 상에서 수행하였다. 7일 종료시, 세포를 수확하고, CD56+CD3- 세포에 대한 게이팅에 의해 증식을 평가하였다. 처리 없음 (NT)은 낮은 NK 세포 수로 낮은 증식을 발생시킨 반면, cam1615B7-H3은 rhIL-15에 의해 유도된 것과 진폭이 유사한 전반적인 증식 증가를 유도하였으며 (도 2a-2d), 이들 두 그룹 사이에 유의미한 차이는 없었다. IL-15는 NK 세포 및 T 세포 둘 다에 작용하기 때문에, 다음으로 T 세포 (CD56-CD3+)에 대한 게이팅에 의해 특이성을 평가하였다. TriKE 처리 그룹에서는 최소 T 세포 증식이 나타난 것과 대조적으로, rhIL-15는 T 세포의 강건한 증식을 유도하였으며 (도 2e 및 2f), 이는 cam1615B7-H3 TriKE IL-15 전달이 NK 세포에 대해 더 제한되었음을 명확히 보여준다. 이러한 차이는 강건하게 증식하는 집단 (3개 분할을 넘어섬)에서 특히 주목할 만하였으며, 여기서 cam1615B7-H3 TriKE는 처리되지 않은 그룹에 비해 유의미하게 더 낮은 증식을 나타낸 반면 (도 2g), T 세포 수는 처리되지 않은 그룹과 TriKE-처리된 그룹 간에 차이가 없었다 (도 2h). 이 데이터는 cam1615B7-H3 TriKE에서의 cam16 관여자가 T 세포가 아닌 NK 세포에 IL-15를 특이적으로 전달함을 나타낸다.
도 3a 및 3b에 예시된 바와 같이, 본 발명의 camB7-H3 TriKE는 WT B7-H3에 대한 강한 결합 특이성을 나타내었다. BT-12 소아과 뇌 종양 라인은 B7-H3 (WT)을 고도로 발현한다. CRISPR (Theruvath 등)을 사용하여 B7-H3 KO BT-12 세포 라인을 생성하였다. Raji (음성 B7-H3) 및 전립선암 세포 라인 C4-2 (양성 B7-H3) 및 다수의 다른 라인 사용시 유사한 특이성이 나타났다. B7-H3 BiKE는 양성 및 음성 세포 라인과 유사한 결합을 가졌다 (데이터 나타내지 않음).
CD16을 갖지 않는 또는 갖는 NK-92 세포를 NCI IL-15 및 GTB-5550의 희석액과 함께 48시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 레사주린 (n=4)을 사용하여 대사 활성을 측정하였다. 도 4a-4b에 나타낸 바와 같이, TriKE 분자는 CD16+ NK-92에서의 NCI IL-15보다 2배 더 강력한 것으로 나타났다.
실시예 2
일반적 물질 및 방법
암 세포 라인 및 항체
MA-148 (미네소타 대학교에서 현지 확립)은 인간 상피 고등급 장액성 난소암종 세포 라인이다. 생체내 실험을 위해, 라인을 Invitrogen의 리포펙타민 시약 및 10 μg/mL의 블라스티시딘과 적용된 선택 압력을 사용하여 루시퍼라제 리포터 작제물로 형질감염시켰다. 난소암종 세포 라인 OVCAR5 및 OVCAR8은 국립 보건원 (NIH, 미국 메릴랜드주 프레드릭)의 국립 암 연구소 (NCI)의 발달 치료학 프로그램인 생물학적 시험 부문이 후원하는 DTP, DCTD 종양 저장소로부터 입수하였다. OVCAR3 (난소), C4-2 (전립선), DU145 (전립선), LNCaP (전립선), PC-3 (전립선), A549 (폐), NCI-H322 (폐), NCI-H460 (폐), 및 Raji 세포 (버킷 림프종)를 포함한 다른 세포 라인은 American Type Culture Collection으로부터 입수하였다. 음성 대조군으로서 사용된 Raji 세포를 제외하고, 모든 라인은 높은 수준의 B7-H3을 발현한다. 라인을 10-20% 소 태아 혈청 (FBS) 및 2 mmol/L L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지하였다. 라인을 일정한 37℃에서 5% CO2를 함유하는 가습 대기에서 인큐베이션하였다. 부착 세포가 90% 초과 컨플루언시(confluency)가 되면, 이들을 탈착을 위해 트립신-EDTA를 사용하여 패시징하였다. 세포 수를 위해 표준 혈구계를 사용하였다. 생존율 >95%를 갖는 세포만을 실험에 사용하였다. 모노클로날 항체 scFv 단편 376.96에 대한 서열은 Dr. Ferrone에 의해 얻었으며 이를 TriKE를 작제하는 데 사용하였다.
세포 생성물
동의를 받고, 연구에서의 인간 대상체의 사용에 대한 위원회에 의한 지침을 준수하고, 헬싱키 선언에 따라, 기관 검토 위원회 (IRB) 승인이 인정된 후 (프로토콜 9709M00134 및 1607M91103) 정상 지원자 또는 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 얻었다. 생체내 연구의 경우, 제조업체의 권장사항 (STEMCELL Technologies, 미국 매사추세츠주 케임브리지)에 따라, 신선한 PBMC를 CD3 및 CD19-양성 세포에 대해 자기적으로 3회 고갈 (즉, 자석을 가로지르는 3회 통과)시켜, NK-세포-풍부화된 생성물을 생성하였다. 1차 용적축소 수술 당시 진행기 난소 또는 원발성 복막 암종으로 진단된 여성에서 난소암 표본 (복수)을 수집하였다. 전립선암의 경우, 전이성 거세 저항성 전립선암을 갖는 2명의 환자 및 전이성 호르몬 민감성 전립선암을 갖는 1명의 환자로부터 혈액을 얻었다. 폐암의 경우, 진단 당시, 치료 전에, 7명의 절제불가능한 폐암 환자로부터 혈액을 얻었다. 세포를 펠릿화하고, 적혈구에 대해 용해시키고, 10% DMSO/90% FBS에서 저온보존하고, 액체 질소 중에서 저장하였다.
IL-15 자극을 통한 NK 세포 확장
IL-15 모이어티를 통해 NK 세포 확장을 특이적으로 유도하는 TriKE의 능력을 측정하기 위해, 건강한 공여자로부터의 PBMC를 키트 사양에 따라 CellTrace Violet Proliferation Dye (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드)로 라벨링하였다. 염색 후, 세포를 지정된 농도의 TriKE, 또는 등몰 농도의 대조군과 배양하고, 37℃에서 7일 동안 5% CO2를 함유하는 가습 대기 중에서 인큐베이션하였다. 세포를 수확하고, 생존능에 대해 Live/Dead 시약 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드)으로 염색하고, 항-CD56 PE/Cy7 (Biolegend, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 항-CD3 PE-CF594 (BD Biosciences, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크)에 대해 표면 염색하여 생존가능한 CD56+ CD3-NK 세포 집단 또는 CD56-CD3+ T 세포 집단에 대해 게이팅하였다. FlowJo 소프트웨어 (FlowJo LCC, 버전 7.6.5, 미국 오레곤주 애쉬랜드)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
세포독성 및 NK 세포 활성화의 평가
ADCC는 CD107a (리소좀-관련 막 단백질 LAMP-1) 및 세포내 IFNγ 생성을 통해 탈과립을 평가함으로써 유동 세포계측 검정에서 측정하였다. 해동시, 정상 공여자 및 환자-유래된 PBMC 또는 복수 세포를 10% 송아지 태아 혈청 (RPMI-10)이 보충된 RPMI 1640 배지에서 밤새 (37℃, 5% CO2) 휴지시켰다. 다음날 아침, 이들을 RPMI-10으로 2회 세척 후 종양-표적 세포 또는 배지로 현탁시켰다. 이어서 세포를 TriKE 또는 대조군과 37℃에서 10 min 동안 배양하였다. 이어서 플루오레세인 이소티오시에이트 (FITC)-컨쥬게이션된 항-인간 CD107a 모노클로날 항체 (BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산호세)를 첨가하였다. 1시간 37℃ 인큐베이션 후, GolgiStop (1:1500, BD Biosciences) 및 GolgiPlug (1:1000, BD Biosciences)를 3 h 동안 첨가하였다. 포스페이트 완충 식염수로 세척 후, 세포를 PE/Cy 7-컨쥬게이션된 항-CD56 mAb, APC/Cy 7-컨쥬게이션된 항-CD16 mAb, 및 PE-CF594-컨쥬게이션된 항-CD3 mAb (BioLegend, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로 염색하였다. 세포를 4℃에서 15 min 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 2% 파라포름알데히드로 고정하였다. 이어서 aBV650 컨쥬게이션된 항-인간 IFNγ 항체 (BioLegend)를 통한 검출을 통해 IFNγ의 생성을 평가하기 위해 세포내 펌 완충제 (BioLegend)를 사용하여 세포를 투과화시켰다. 샘플을 세척하고, LSRII 유동 세포계측기 (BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산호세)에서 평가하였다.
실시간 종양-사멸 검정
IncuCyte 플랫폼을 사용하여 실시간으로 종양 사멸을 평가하였다. 자기-비드-풍부화된 CD3-CD56+ NK 이펙터 세포를, 2:1 이펙터:표적 비율로 NuclightRed 안정적 발현 OVCAR8 세포와 함께 96-웰 편평 투명-바닥 폴리스티렌 조직-배양-처리 마이크로플레이트 (Corning, 영국 플린트셔) 내에 플레이팅하였다. 카스파제-3/7 녹색 염료 (Sartorious, 미국 미시간주 앤아버)를 첨가하여 아직 NuclightRed 형광을 잃지 않은 죽어가는 세포를 포착하였다. 이어서 지정된 처리를 30 nM 농도로 첨가하고, 플레이트를 37℃/5% CO2에서 세포 인큐베이터 내부에 하우징된 IncuCyte ZOOM® 플랫폼에 배치하였다. 3개의 기술 복제로부터 이미지를 4X 대물 렌즈를 사용하여 48 h 동안 15 min마다 얻고, 이어서 IncuCyte™ Basic Software v2018A (Sartorious)를 사용하여 분석하였다. 그래프 판독치는 출발 (0 h) 시점에 살아 있는 표적 단독에 대해 정규화된 살아 있는 OVCAR8 표적 (NuclightRed+카스파제-3/7-)의 백분율을 나타낸다.
질량 세포계측 (CyTOF)
질량 세포 계측 (CyTOF) 연구를 위해, PBMC를 단독으로 또는 2:1 비율 +/- cam1615B7-H3 (30 nM)으로 OVCAR8과 함께 24 h 동안 인큐베이션하였다. 샘플 수확 후, 세포를 카운팅하고, 트리판 블루 배제를 사용하여 생존능을 측정하였다. 바코딩 및 CyTOF 염색을 위해 각 공여자로부터의 20만개 세포를 5-mL 폴리스티렌 U자-바닥 튜브에 분취하였다. 세포를 Cisplatin (Fluidigm 제품# 201064, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코)으로 염색한 후, Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit (Fluidigm 제품# 201060)를 사용하여 바코딩하였다. 바코딩 후, 모든 세포를 단일 5-mL 폴리스티렌 U자-바닥 튜브 내에 조합하고, 4℃에서 30 min 동안 표면 마커 항체 칵테일에서 인큐베이션하였다.
이어서, 표면 염색 후, 세포를 2% PFA를 사용하여 고정하였다. 세포내 염색을 위해, 세포를 실온에서 5 min 동안 Triton X 0.1%와 인큐베이션에 의해 투과화한 후, 4℃에서 30 min 동안 세포내 항체 칵테일과 인큐베이션하였다. 이어서 염색된 세포를 Cell-ID Intercalator (Fluidigm 제품# 201192A)와 인큐베이션하였다. 다음날 아침 세포를 세척하고, CyTOF 2 기기 상에서 진행시켰다. 세척 단계를 Maxpar PBS (Fluidigm 제품# 201058), Maxpar Cell Staining Buffer (Fluidigm 제품# 201068), 또는 Millipure Water를 사용하여 1600RPM으로 4 min 동안 완료하였다. 맞춤형 태깅된 항체의 경우: Maxpar 항체 라벨링 키트 (Fluidigm)를 사용하여 특이적 ScFv에 대한 중금속의 컨쥬게이션을 수행한다. 프로토콜은 0.5 M TCEP: Pierce Bond-Breaker TCEP Solution (Thermo Scientific 제품# 77720, 미국 매사추세츠주 월섬)을 사용한 부분 항체 감소, 뿐만 아니라 3kDa 및 50kDa 크기 둘 다의 원심분리 필터 유닛 (Millipore 제품# UFC500396, UFC505096, 미국 매사추세츠주 벌링턴)을 사용한 포괄적 완충제 교환을 포함한다. 항체의 컨쥬게이션 후, 수율을 측정하고, 최종 시약을 항체 안정화제 (Boca Scientific 제품# 131 000, 미국 매사추세츠주 웨스트우드) 중에서 저장한다. 이어서 시약을 적정하고, 공지된 유동 세포계측 항체에 대하여 검증한다. 3명의 공여자로부터의 데이터가 결부되었다. FCS 파일 결부를 Cytobank 및 Flowjo의 조합으로 완료하였다. 모든 Visne 분석을 Cytobank에서 수행하였다.
생체내 마우스 연구 및 이미징
MA-148-Luc 난소암 세포를 이전에 기재된 NK 세포 이종성 마우스 모델 시스템에 통합하였다. NSG 마우스 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1 Wjl/SzJ, n = 5/그룹)를 2.0 x 105 MA-148-luc 세포로 IP 주사하고, 이어서 3일 후 저선량 전신 광조사 (225 cGy)로 컨디셔닝하였다. 다음날, 모든 그룹은 1백만개 NK 세포/마우스와 동등한 고도로 풍부화된 NK 세포 (PBMC 자기적으로 CD3 및 CD19 고갈됨)를 수용하였고, 약물 체제가 시작되었다. 단일 처리 과정은 3주 동안 매일 (월요일~금요일) 30 μg의 TriKE 또는 5 μg rhIL-15의 IP 주사를 제공하는 것으로 이루어졌다. MA-148-luc 세포는 루시퍼라제 리포터 유전자로 형질감염된 MA-148의 서브라인으로, 매주 마우스의 이미징을 통해 그의 생물발광 활성을 결정하고 종양 진행 모니터링을 가능하게 한다. 간단히, 마우스에게 이미징 10 min 전에 100 μL의 30 mg/mL 루시페린 기질을 주사하고 이어서 이소플루란 가스의 흡입을 통해 마취하였다 (25). 이어서 Xenogen Ivis 100 이미징 시스템을 사용하여 마우스를 이미징하고 Living Image 2.5 소프트웨어 (Xenogen Corporation, 미국 캘리포니아주 알라메다)로 분석하였다. 실험 종료시 (제21일), 모든 동물을 희생시키고, 사후 복막 세척을 수행하여 유동 세포계측에 의해 인간 NK 세포 함량을 분석하였다. 동물 이미징 및 분석은 미네소타 대학교 이미징 센터에서 수행하였다. 마우스 연구는 미네소타 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)로부터의 승인 (프로토콜 1908-37330A) 후 그의 지침을 준수하여 수행하였다.
통계 분석
GraphPad PRISM 8 (GraphPad Prism Software, Inc., 미국 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 모든 통계 시험을 생성하였다. 모든 시험관내 연구에서, 반복 측정으로 단방향 ANOVA를 사용하여 cam1615B7-H3 그룹과 비교한 유의성을 계산하였다. 마우스 연구에서는, 양방향 ANOVA를 사용하여 종단적 연구에서 유의성을 계산하였으며, 단방향 ANOVA를 사용하여 제21일 시점에서의 라디언스 차이의 유의성을 계산하였다. 짝을 이루지 않은 t 시험을 사용하여 세포 수 및 MFI에서의 차이를 평가하였다. 바는 평균 ± SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, 및 **** p < 0.0001로서 표시된다.
실시예 3
혈액암 세포
본 발명의 H7-B3 TriKE 분자의 효능을 여러 혈액암 세포 라인에서 평가하였다. 달리 기재되지 않는 한, 사용된 방법은 실시예 2에 기재된 바와 같다.
도 5a-5b에 예시된 바와 같이, 없음으로부터 매우 높은 수준까지의 다양한 수준의 B7-H3 발현을 갖는 혈액 악성종양 세포 라인으로 기능 검정을 수행하였다. 유동 세포계측 (n=3), IncuCyte, 또는 xCelligence 검정에 의해 측정된 CD107a 및 IFN 감마를 사용하여 NK 세포 활성화를 측정하였다.
이어서 분석은 다발성 골수종에 중점을 두었다. 골수종에서의 B7-H3 (CD276) 발현은 무진행 생존 감소와 관련되며, 이는 건강한 조직에서의 낮은 발현을 나타내고, 이는 골수 유래 억제 세포 (MDSC)에서 발현되며, 이는 골수종 성장을 촉진한다.
도 6a-6b에 나타낸 바와 같이, 유동 세포계측에 의해 B7-H3의 높은 발현이 골수종 라인 RPMI-8226, U266, 및 MM1S에서 나타났고, 비교적 낮은 발현이 H929에서 나타났다.
B7-H3-TriKE를 갖거나 갖지 않는 말초 혈액 NK 세포가 골수종 세포를 사멸시키는 능력을 TriKE의 용량을 상승시키며 라이브 이미징 IncuCyte Zoom 검정에서 비교하였다. 3 nM 농도에서 최대 사멸이 나타났다. 3nM B7-H3-TriKE가 첨가되었을 때 4개 골수종 라인 모두의 NK 세포 매개된 사멸의 통계적으로 유의미한 증가가 나타났다. U266 및 MM1S에 대하여, B7-H3-TriKE는 2:1 및 4:1의 이펙터:표적 (E:T) 비율에서 사멸을 유의미하게 향상시켰다. RPMI-8226은 NK 세포의 세포독성에 대해 비교적 높은 내성을 나타내었지만, B7-H3-TriKE는 4:1의 E:T에서 사멸을 향상시켰다. H929 세포는 2:1의 E:T에서 B7-H3-TriKE의 존재 하에 보다 강력하게 사멸되었지만, 아마도 두 그룹 모두에서의 높은 자연 세포독성으로 인해 E:T 4:1에서는 사멸의 차이가 없었다 (도 7a-7b 및 8a-8d 참조).
프로테아좀 억제제 보르테조밉 (10nM) 및 면역조절 약물 레날리도미드 (5μM)와 B7-H3-TriKE의 효능을 또한 시험하였다. 세포독성 곡선을 반복 측정 ANOVA에 의해 비교하고 삼중으로 수행하였다. B7-H3-TriKE, NK 세포, 및 레날리도미드와의 조합 치료법은 48시간의 살아 있는 세포 이미징 후 H929 세포의 상승작용적 사멸을 나타내었지만 (p=0.047), 보르테조밉과의 조합은 NK 세포 및 TriKE 단독과 비교하여 사멸을 추가로 향상시키지 않았다 (도 9a). 레날리도미드 및 보르테조밉 둘 다 NK 세포 및 B7-H3 TriKE와 제공시 MM1S에 대한 개선된 사멸 경향을 나타내었지만, 통계적 유의성에 도달하지는 않았다 (도 9b). B7-H3-TriKE, NK 세포, 및 레날리도미드 또는 보르테조밉과의 조합 치료법은 48시간의 살아 있는 세포 이미징 후 RPMI-8226 세포의 상승작용적 사멸을 나타내었다 (각각 p<0.001 및 0.015) (도 9c). B7-H3-TriKE 및 NK 세포와 조합된 보르테조밉은 U266 세포에서 사멸을 향상시켰다 (p=0.037) (도 9d).
MDSC는 IL-6 및 GM-CSF를 사용하거나 7일 동안 1:100 비율로 골수종 세포와 이들을 인큐베이션함으로써 건강한 공여자로부터의 CD33+ 골수 세포로부터 발달되었다. MDSC (CD14+CD11b+)는 B7-H3의 높은 발현을 나타내었다 (도 10a). MDSC는 또한 3명의 새로 진단된 골수종 환자의 골수 흡인물로부터 단리되었고 56-95 생존을 나타내었다 (흡인물을 용해 완충제로 가공하고 CD14, CD11b, 및 B7-H3에 대해 염색하였음). 살아 있는, CD14+ 세포의 유동 세포계측 플롯을 나타내었다 (도 10c). MDSC를 골수종 세포와 인큐베이션하고, 살아 있는 세포 이미징에 의해 48시간에 걸쳐 성장을 측정하였다 (도 10b). 세포독성 검정에 대한 MDSC의 첨가는 골수종 세포 성장을 향상시켰지만, B7-H3 TriKE 및 NK 세포에 의해 극복되었다 (도 10d). B7-H3-TriKE는, 심지어 비교적 낮은 B7-H3-발현 H929 라인에서도, 골수종 세포의 NK 세포 매개된 사멸을 유의미하게 향상시켰다. 이는 또한, 이것이 MDSC-유도된 골수종 성장을 역전시킬 수 있음을 보여준다.
MDSC는 B7-H3을 발현하였기 때문에, 이들은 1:1의 E:T로 NK와 공동-배양된 MDSC였고, B7-H3 TriKE 유무에 따른 사멸을 비교하였다 (도 11a 및 11b 참조).
실시예 4
전립선암에서 H7-B3 TriKE의 효능
본 발명의 H7-B3 TriKE 분자의 효능을 여러 전립선암 세포 라인에서 평가하였다. 달리 기재되지 않는 한, 사용된 방법은 실시예 2에 기재된 바와 같다.
도 12a-12d, 14a-14l 및 15a-15d에 예시된 바와 같이, cam1615B7-H3 TriKE는 전립선암을 표적화한다. cam1615B7-H3 TriKE가 전립선암에 대해 NK 세포 활성을 개선하는 능력을 시험하였다. 시험된 모든 전립선암 세포 라인은 B7-H3을 발현하였다. 이들 시험을 위해, 정상 공여자 PBMC 및 전이성 전립선암 환자로부터 얻어진 PBMC를 사용하였다. 전이성 전립선암 환자는 정상 공여자와 비교할 때 NK 세포 활성의 약간의 감소를 나타내었으며, cam1615B7-H3 TriKE는 대조군과 비교할 때 C4-2, DU145, LNCaP 및 PC3 전립선암 선암종 세포 라인에 대해 정상 공여자 및 환자 NK 세포 둘 다에서 탈과립화 및 IFNγ 생성을 향상시켰다 (도 14a-14g, 14j 및 15a-15d). 개별 cam16 VHH 또는 항-B7-H3 scFv 성분은 C4-2에 대해 증가된 NK 세포 활성화를 유도하지 않았다. 따라서, 데이터는 cam1615B7-H3 TriKE가 전립선암 셋팅 내에서 NK 세포 면역요법에서 유망성을 가짐을 나타내고, 현재의 치료적 접근법으로는 결과가 좋지 않음으로 인해 신규한 개입을 필요로 하는 환자에서 NK 세포 기능이 구제될 수 있음을 보여준다. 전립선암 세포를 사용하여 TriKE에 의해 유도된 신호는 강한 자연 세포독성 신호에 의해 유도된 것보다 더 강했으며 B7-H3에 대해 특이적이었다.
도 13a-13b에 나타낸 바와 같이, cam1615B7-H3 TriKE는 IL-15 단독보다 NK 기능 유도에 있어 더 강력하였고, 또한 IL-15 단독과 비교하여 NK 세포 증식 유도에 있어 더 강력하였다.
도 16에 예시된 바와 같이, IncuCyte 플랫폼을 사용하여 실시간으로 PC-3 세포의 종양 사멸을 평가하였고, 이는 전립선암 세포 사멸을 유도하는 B7-H3 TriKE 분자의 향상된 효능을 강조하였다.
도 17-20에 나타낸 바와 같이, B7-H3 TriKE 분자는 또한 시간 경과에 따라 PC-3 회전타원체 크기를 감소시킬 수 있었다.
도 21에 예시된 바와 같이, B7-H3 TriKE 분자에 의한 전립선암 세포의 사멸은 처리 개시 후 빠르게 (두어 시간 이내에) 나타나는 것으로 입증되었다.
다양한 엔잘루타미드 내성 전립선암 세포를 그의 B7-H3 발현에 대해 표현형분석하였다. 도 22a-22f에 예시된 바와 같이, 시험된 모든 세포 라인은 B7-H3을 발현하였다.
도 23a-23l에 나타낸 바와 같이, CD107a+ 및 IFNγ+ NK 세포의 퍼센트 측정에 의해 평가시, camB7-H3 TriKE는 이전의 scFv 버전보다 더 넓은 동적 범위에 걸쳐 전립선암 세포에 대해 활성을 유도하는 것으로 나타났다.
실시예 5
폐암에서 H7-B3 TriKE의 효능
본 발명의 H7-B3 TriKE 분자의 효능을 여러 폐암 세포 라인에서 평가하였다. 달리 기재되지 않는 한, 사용된 방법은 실시예 2에 기재된 바와 같다.
도 24a-24f에 예시된 바와 같이, cam1615B7-H3 TriKE는 폐암을 표적화한다. cam1615B7-H3 TriKE가 B7-H3-발현 폐암에 대해 NK 세포 활성을 개선하는 능력을 2개의 비-소세포 폐암 선암종 라인인 A549 및 NCI-H322와 인큐베이션된 정상 공여자 PBMC에서 시험하였다 (도 24a-24d). 두 경우 모두, cam1615B7-H3 TriKE는 대조군과 비교할 때 NK 세포 활성화를 유의하고 강건하게 개선하였다. 개별 cam16 VHH 또는 항-B7-H3 scFv 성분을 시험하였고, 이는 A549에 대해 배경 NK 세포 활성을 나타내지 않았다. 정상 공여자 PBMC 뿐만 아니라 새로 진단된 절제불가능한 폐암을 갖는 환자로부터의 PBMC를, 임의의 치료법 전에, 대세포 폐암 세포 라인인 NCI-H460 세포와 인큐베이션하였다. 데이터가 명확히 보여주는 바와 같이, cam1615B7-H3 처리는 대조군과 비교할 때 대세포 폐암에 대해 정상 공여자 및 환자 샘플 둘 다에서 NK 세포 기능을 강하게 증가시켰다 (도 24e-24f). 폐암 세포에 대한 NK 세포 탈과립화 및 IFNγ 생성의 TriKE-매개 유도는 NK 세포가 K562 표적 단독과 인큐베이션될 때 나타나는 것보다 더 높았다. 폐암 세포 라인에 대한 활성화는 이것이 B7-H3- Raji 세포에 의한 활성화보다 더 높았기 때문에 B7-H3 발현에 대해 특이적이었다. 따라서, 데이터는 cam1615B7-H3 TriKE가 다수의 고형 종양 표적에 대해 광범위한 B7-H3-특이적 활성을 가짐을 나타낸다.
실시예 6
두경부암에서 H7-B3 TriKE의 효능
본 발명의 H7-B3 TriKE 분자의 효능을 여러 두경부암 세포 라인에서 평가하였다. 달리 기재되지 않는 한, 사용된 방법은 실시예 2에 기재된 바와 같다.
전 세계적으로 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)은 약 900,000건의 사례와 400,000명의 사망을 차지한다. 판코니 빈혈 (FA)과 같은 일부 셋팅에서, 환자는 치유적 치료 (동종이계 줄기 세포 이식)를 받지만, 단지 초기 성인기에 높은 발병률로 HNSCC로 발달한다. 비-FA HNSCC 환자에 대한 현재의 치료 전략은 수술, 화학요법 및 방사선요법을 포함한다. 그러나, 이들은 화학요법 및 방사선의 높은 독성 수준에 대한 그들의 낮은 용인성으로 인해 FA HNSCC 환자에게는 실행가능한 치료 옵션이 아니다. 따라서, FA HNSCC 환자 치료를 위한 신규하고 표적화된 치료적 개입이 매우 필요하다.
B7 및 CD28 패밀리의 체크포인트 구성원인 B7-H3은 여러 고형 종양에서 과발현되지만 건강한 조직에서는 부재하거나 발현되지 않는다. 이는 면역요법에 대한 유망한 표적이며, 특히 전립선암에서, 최근의 바스켓 시험은 강한 임상 신호를 나타내었다. 여기서 B7-H3 표적화 성분을 포함하는 삼중특이적 킬러 관여자 (TriKE)의 능력이 개발되었고, B7-H3-발현 두경부암 표적에 대한 직접적 NK 세포 사멸에 대해 시험하였다. 이 TriKE 분자는 CD16에 대한 인간화 낙타류 나노바디, B7-H3에 대한 낙타류 나노바디 및 두 관여자 사이의 야생형 IL-15 서열을 함유하는 NK 세포 관여 도메인을 포함한다. B7-H3 발현을 FANCA 유전자의 CRISPER KO로 야생형 HNSCC 세포 및 쌍을 이루는 버전에 대한 유동 세포계측에 의해 평가하였고, KO가 B7-H3 발현에 영향을 미치지 않음이 결정되었다. 따라서, HNSCC에 대한 TriKE 활성은 정상 HNSCC 및 FA-HNSCC 셋팅 둘 다에 존재할 것이다.
B7-H3 TriKE의 존재 하에 HNSCC 라인에 대한 NK 세포 반응을, NK 세포 탈과립화 및 시토카인 분비를 평가하기 위한 유동 세포계측 기반 기능 검정, 또는 표적 사멸을 직접 평가하기 위한 IncuCyte 이미징 검정을 통해 평가하였다. B7-H3 TriKE-처리된 샘플의 NK 세포 탈과립화 및 IFN-감마 생성은 B7-H3 단일 도메인 또는 IL-15 단독으로 처리된 대조군 샘플의 것과 비교하여 더 높았다. B7-H3 TriKE는 또한, 2D 및 3D IncuCyte 이미징 검정 둘 다에서, FANCA 유전자와 관계없이 B7-H3 단일 도메인 또는 IL-15 단독으로의 처리와 비교하여 NK 세포에 의한 더 많은 HNSCC 표적 세포 사멸을 유도하였다. 진행 중인 실험은 생체내 B7-H3 TriKE의 기능 및 효능을 평가할 것이다. 종합하면, 이 데이터는, B7-H3 TriKE가 B7-H3 발현 HNSCC 세포에 대한 낙타류 나노바디인 B7-H3-CD16에 대해 NK 세포 활성을 구동할 수 있음을 보여주며, 이는 HNSCC 또는 FA-HNSCC 환자를 치료하도록 임상적으로 시행되기 위해 사용될 B7-H3-표적화된 TriKE에 대한 가능성을 제시한다.
도 25a-25b에 나타낸 바와 같이, 건강한 공여자로부터의 동결된 PBMC (N=3)를 5시간 동안 5개의 HNSCC 세포 라인: UM-SCC-01, SFCI-SCC-07, JHU-SCC-FaDu, Cal27 및 Cal33과 인큐베이션하여 CD107a 발현 (탈과립화에 대한 마커로서) 및 세포내 IFN-γ 생성을 평가하였다. HNSCC 세포 라인은 처리 없이 NK 세포 세포용해성 기능을 유도하지 않았다.
도 26a-26b에 나타낸 바와 같이, 5개의 HNSCC 세포 라인을 유동 세포계측을 통해 B7-H3 발현 및 B7-H3 단일 도메인과의 결합 친화력에 대해 평가하였고, 건강한 공여자로부터의 PBMC를 유동 세포계측에 의해 B7-H3 발현에 대해 평가하였다. B7-H3은 HNSCC에서 고도로 발현되지만 건강한 면역 세포에서는 발현되지 않는다.
도 27a-27d에 나타낸 바와 같이, B7-H3 TriKE는 HNSCC에 대해 NK 세포 활성을 유도하였다. 건강한 공여자로부터의 동결된 PBMC (N=3)를 5시간 동안 (A-B) Cal27 트리오 및 (B-C) Cal33 트리오 (각 트리오는 HNSCC WT 라인 및 HNSCC FANCA KO 라인의 2개 클론으로 이루어짐)와 상이한 처리: 처리 없음 또는 3 nM IL-15, MOPC, B7-H3 SD 및 B7-H3TriKE에서 인큐베이션하여 CD107a 발현 (탈과립화에 대한 마커로서) 및 세포내 IFN-y 생성을 평가하였다. 에러 바는 평균의 표준 오차를 나타내고, 통계적 유의성은 *p < .05, **p < .01, ***p < .001 및 ****p < .0001로서 결정되었다.
도 28a-28f에 나타낸 바와 같이, B7-H3 TriKE는 실시간 이미징 검정에서 HNSCC에 대한 NK 세포 사멸을 유도하였다. 풍부화된 NK 세포 (N=4)를 5:1의 E:T로 Nuclight 적색-라벨링된 Cal27과 상이한 조건: 처리 없음 또는 3 nM IL-15, B7-H3 SD 및 B7-H3 TriKE에서 48시간 동안 IncuCyte Zoom 이미저에서 인큐베이션하였다. 시간 당 적혈구 수를 t=0에서 표적 단독에 대해 정규화함으로써 살아 있는 세포의 퍼센트의 정량화를 수행하였다. Nuclight 적색-라벨링된 Cal27의 회전타원체를 72시간 동안 형성한 후, 풍부화된 NK 세포 (N=4)와 5:1의 E:T로 상이한 조건: 처리 없음 또는 3 nM IL-15, B7-H3 SD 및 B7-H3 TriKE에서 96시간 동안 IncuCyte S3 이미저에서 인큐베이션하였다. 시간 경과에 따른 회전타원체를 보여주는 대표적 이미지. 시간 당 평균 적색 물체 영역의 수를 t=0에서 표적 단독에 대해 정규화함으로써 퍼센트 평균 적색 물체 영역 (살아 있는 세포)의 정량화를 수행하였다. 동일한 세트의 검정을 Cal33으로 수행하였다.
건강한 세포는 보존하면서 HNSCC 세포를 효과적으로 제거할 수 있는 표적화된 치료법이 매우 필요하다. 여기서, 본 발명자들은 HNSCC 상에서 발현되는 B7-H3 리간드에 대한 TriKE 분자의 전임상 연구를 기재하였다. 본 발명자들은, B7-H3 TriKE로의 처리가 HNSCC에 대해 NK 세포 탈과립화 및 시토카인 생성을 효과적으로 유도할 뿐만 아니라 시험관내 HNSCC의 표적화된 사멸을 구동함을 확인하였다. 진행 중인 실험은 생체내 B7-H3 TriKE의 기능 및 효능을 평가할 것이다. 향후 연구는, HNSCC의 HPV 상태가 HNSCC 종양 미세환경에서 TriKE의 효능에 임의의 영향을 미치는지의 여부를 평가하는 것에 추가로, HNSCC 종양 미세환경의 조사, 및 HNSCC 종양 미세환경에서의 B7-H3 TriKE 효능 평가를 포함할 것이며, 이전 연구는 HPV+/- HNSCC 종양 미세환경에서의 차등 NK 세포 활성을 보고하였다.
실시예 7
난소암에서 H7-B3 TriKE의 효능
본 발명의 H7-B3 TriKE 분자의 효능을 여러 난소암 세포 라인에서 평가하였다. 달리 기재되지 않는 한, 사용된 방법은 실시예 2에 기재된 바와 같다.
도 29a-29b 및 30a-30i에 예시된 바와 같이, cam1615B7-H3 TriKE는 난소암의 강력한 사멸을 나타낸다. cam1615B7-H3 TriKE가 난소암 세포에 대해 NK 세포 활성을 매개하는 능력을 평가하였다. 사용된 난소암 세포는 강건한 B7-H3 발현을 나타내었다. B7-H3은 면역 반응에서 역할을 하는 것으로 나타났기 때문에, 정상 면역 세포에 대한 활성을 유도하는 cam1615B7-H3의 능력을 PBMC에서 평가하였다. NK 세포에 대한 게이팅을 허용하는 유동 세포계측 검정은, cam1615B7-H3이 대조군과 비교하여 NK 세포에서 일부 배경 탈과립화 (CD107a)를 유도하였음을 결정하였지만, 이 활성은 낮았다. IFNγ에서는 배경 노이즈가 나타나지 않았다. 대조적으로, PBMC을 OVCAR8, OVCAR3, 및 OVCAR5를 포함한 다양한 고등급 장액성 난소 선암종 세포 라인과 인큐베이션한 경우, 처리 없음 및 rhIL-15 단독과 비교하여 강건한 NK 세포 탈과립화 및 세포내 IFNγ 생성이 나타났다 (도 29a-29b 및 30a-30f). TriKE의 개별 성분이 그 자체로 NK 세포 활성을 유도할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 개별 cam16 VHH, IL-15, 또는 항-B7-H3 scFv 성분을 PBMC 및 OVCAR8 세포와 인큐베이션하고, 활성을 결정하였다. 데이터는, 개별 성분이 OVCAR8 세포에 대해 NK 세포 활성을 향상시키지 않음을 명확히 보여준다. 정상 공여자 PBMC 및 수술 당시 난소암 환자의 복막강으로부터의 복수로부터의 NK 세포 활성을 또 다른 고등급 장액성 난소 선암종 세포 라인인 MA-148 세포에 대해 평가하였다 (도 29a-29b 및 30g-30h). 대조군과 비교하여, cam1615B7-H3 TriKE는 정상 공여자 NK 세포에서 강건한 활성을 유도하였다. 난소-암-유래된 복수 샘플로부터의 NK 세포 활성은 종양 미세환경에 의해 구동된 NK 세포 기능 변경 및 CD16 발현 감소로 인해 예상대로 감소한 반면, cam1615B7-H3 TriKE는 대조군과 비교하여 유의미하게 향상된 NK 세포 탈과립화를 유도하였다. 마지막으로, 난소암 종양 세포 (OVCAR8)의 사멸을 풍부화된 NK 세포 단독 (처리 없음), NK 세포 및 rhIL-15 (IL15), 및 NK 세포 및 cam1615B7-H3 TriKE의 존재 하에 2일 기간에 걸쳐 동적으로 측정하였다 (도 30i). 이 검정에서, 종양 세포는 안정적으로 발현되는 형광 단백질 (NucLight Red)로 추적될 수 있으며, 최근 세포 사멸을 배제하는 데 사용되는 초기 아팝토시스의 검출은 녹색 형광 카스파제3/7 염료에 의해 매개된다. 제공된 기본 판독치는 지정된 시간에 종양 단독에 대해 정규화된 살아 있는 종양 세포 (Red+Green-)의 수이다. 나타낸 바와 같이, cam1615B7-H3 TriKE는 대조군과 비교하여 강건하고 빠른 종양 사멸을 유도하였다. 이 데이터는, cam1615B7-H3 TriKE가 시험관내에서 난소암 세포에 대한 활성을 강력하게 향상시킴을 나타낸다. 주목할 점은, cam1615B7-H3 TriKE가, K562 세포에 의해 유도된, TriKE의 부재 하에, 강력한 자연 세포독성 신호와 비교할 때, 난소암에 대해 유사한 탈과립화 및 보다 강한 IFNγ 생성을 유도했다는 것이다. PBMC+종양+TriKE에 대한 활성화를 PBMC+TriKE 단독에 대한 활성화로 나누어 계산한, 모든 난소암 세포 라인에 대한 NK 세포 활성화 배수는, B7-H3-음성 Raji 라인에 의한 활성화보다 더 높았으며, 이는 TriKE의 B7-H3 특이성을 나타낸다.
도 31에 예시된 바와 같이, cam1615B7-H3 TriKE 활성화된 세포의 고차원 분석을 수행하였다. NK 세포에 대한 TriKE 활성화의 표현형 및 기능적 효과를 광범위하게 평가하기 위해, 맞춤형 42 파라미터, CyTOF (질량 세포계측) NK 세포 표적화된 패널을 사용하였다. PBMC를 처리하지 않고 남겨 두었고, cam1615B7-H3 TriKE와 24 h 동안 인큐베이션, 종양 (OVCAR8)과 24 h 동안 인큐베이션, 또는 종양 및 cam1615B7-H3 TriKE와 24 h 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 염색하고, 고정하고, CyTOF2 상에서 진행시켰다. 샘플 (조건 당 3개의 생물학적 복제)을 결부시키고, 데이터를 viSNE로 가시화하였고, 이는 2D 플롯에서 개별 세포의 국소화를 표시하기 위해 모든 발현 정보를 사용하여 다차원 데이터를 탐색한다 (도 31). 데이터는 CD56brights 대비 CD56dims의 분포에서 변화가 없음을 나타내었다. 활성화 마커 CD25 및 CD69는 둘 다 TriKE 처리로 유도되었으며, 케모카인 수용체 CXCR3도 마찬가지였다. NK 세포의 세포용해성 활성에 관여하는 그랜자임 B는 이펙터+ TriKE에서 프라이밍되었지만, 종양 표적 (이펙터+종양+TriKE)의 존재 하에 이들 그랜자임 B 고 세포는 사라졌으며, 이는 ADCC 구동된 특이적 탈과립화의 원인일 가능성이 높다. 흥미롭게, TriKE의 존재 하에 이펙터가 종양에 노출되었을 때 억제성 KIR (KIR2DL1, KIR2DL3 및 KIR3DL1) 및 활성화 KIR (KIR2DS1 및 KIR2DS4) 둘 다가 발현 감소하였다. 이는 NKG2D의 경우에도 마찬가지인 것으로 보였지만, 자연 세포독성 수용체 (NCR: NKp30, NKp44 및 NKp46)는 덜 영향 받았다. 마지막으로, 억제성 수용체 TIGIT 또한 영향 받지 않은 것으로 보였다. 종합하면, 이 데이터는 TriKE 매개된 활성화 후 NK 세포 표현형의 동적 변화를 입증한다.
도 32a-32f에 예시된 바와 같이, cam1615B7-H3 TriKE는 생체내에서 항-종양 활성을 매개한다. 생체내 활성의 결정은 번역의 중요한 단계이다. 그러나, cam1615B7-H3 TriKE가 종양에 대한 기능을 유도하는 능력을 평가하기 전에 독성에 대한 잠재성을 평가하였다. 이를 수행하기 위해, NSG 마우스를 광조사하고, 1백만개 NK 세포로 접목하고, 3주 동안 처리하지 않거나, IL-15, 또는 cam1615B7-H3으로 처리하였고, 초기 처리 후 90일 동안에 걸쳐 체중을 추적하였다. 아마도 광조사로 인해, 모든 그룹에서의 초기 체중 감소에도 불구하고, TriKE 처리된 그룹 vs. 대조군에서 유의미한 차이가 나타나지 않았다. IL-15의 낮은 독성 프로파일 및 B7-H3의 안전성 프로파일을 고려하면 이는 놀라운 것이 아니다. 시험관내 데이터는 cam1615B7-H3 TriKE가 다양한 종양에 대해 NK 세포를 강력하게 활성화시킬 수 있음을 나타내지만, 이 TriKE가 전임상 모델에서 효능을 갖는지의 여부를 평가하기 위해, 난소암의 이전에 기재된 이종성 마우스 모델을 사용하였다 (도 32a). 이 모델에서는, 인간 NK 세포 및 인간 고등급 장액성 MA-148-luc 세포를 NSG 마우스의 복막강 내로 주사한다. 종양 진행의 종단적 분석은, cam1615B7-H3 처리된 마우스가 IL-15 처리된 또는 종양 단독 마우스와 비교할 때 최저 종양 진행을 나타내었음을 보여주었다 (도 32b). 수확 당시 (제21일), cam1615B7-H3-처리된 마우스는 종양 단독 그룹보다 유의미하게 더 낮은 종양 부담을 가졌다 (도 32c-32d). 이 시점에 복막 세척은 rhIL-15 및 cam1615B7-H3 처리된 그룹에서 유사한 인간 NK 세포 수를 나타내었고, 이는 종양 제어의 차이가 단지 NK 세포 수의 차이에 의해 구동되지는 않았음을 나타낸다 (도 32e). cam1615B7-H3 TriKE의 작용 메커니즘과 관련하여, TriKE-처리된 마우스는 IL-15 처리된 마우스보다 더 높은 수준의 CD16 발현을 갖는 NK 세포를 가졌다 (도 32f). 종종 면역 세포의 고갈과 관련되는 PD-1 발현 또한, IL-15-처리된 마우스 대비 TriKE-처리된 마우스에서 보다 낮은 (그러나 유의미하지는 않은) 발현 경향을 가졌다.
실시예 8
결론 및 논의
고형 종양에 대한 이상적인 표적화된 면역요법 개입은 표적적중 종양이탈 독성이 제한되거나 전혀 없는 다양한 암종에 대한 광범위한 인식을 가질 것이다. B7-H3은 이들 특징을 나타낸다: 이는 다수의 종양에서 높은 발현 및 정상 조직에서 낮은 발현을 갖는다. B7-H3에 대한 표적화된 항체-기반 치료법은 현재 임상에서 탐구되고 있다 (NCT04185038, NCT02982941, NCT03406949, NCT03729596, NCT04077866, 및 NCT02475213). 지금까지의 임상 시험에서 항-B7-H3 항체의 안전성 프로파일 및 효능은 모두 호의적이었다. B7-H3을 표적화하는 방사성라벨링된 항체는 적어도 10년 동안 안전하게 투여되었다. 약물은 아동에서 두개내 사용에 충분히 안전한 것으로 간주되었다. 흥미롭게도, B7-H3은 혈관계 및 간질 섬유모세포에서 발현되는 것으로 보고되었으며, 이는 이 항원이 종양 혈관계 및 아키텍처를 표적화하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 높은 B7-H3 발현과 다양한 종양 성장 파라미터 (보다 적은 종양-침윤성 림프구, 보다 빠른 암 진행, 및 췌장관 선암종 (PDAC), 전립선암, 난소암, 폐암, 및 투명 세포 신장 암종 등의 여러 암에서의 불량한 임상 결과) 사이에는 명확한 상관관계가 존재한다. 또한, 대부분의 암에 대한 자연 세포독성은 통상적으로 내인성 NK 세포가 암 진행을 저지하기에 충분하지 않으며, 이는 이 연구에서 시험된 대부분의 종양 라인에 대한 낮은 자연 세포독성에 의해 강조된다. 종합하면, 이들 연구는 B7-H3을 표적화하는 것에 대한 매우 설득력 있는 사례를 형성한다.
그러나, 이전의 치료적 접근법 어느 것도, 최적 NK 세포 면역요법을 위한 두 가지 중요 구성요소인 시토카인 신호전달 및 ADCC를 조합하지 않는다. 본원에 기재된 cam1615B7-H3 단백질은 그 최적 조합을 사용한다. 본 발명자들의 데이터는 cam1615B7-H3 TriKE가 NK 세포에 특이적 IL-15 신호를 전달하여, 표적이탈 독성을 방지하고, 또한 난소, 전립선, 및 폐암 셋팅에서 다양한 선암종 세포 라인에 대해 ADCC를 매개함을 나타낸다. 이러한 이중 작용 메커니즘은 향상된 NK 세포 증식, 생존, 및 표적화된 활성화를 가능하게 한다. TriKE를 IL-15가 결핍된 이중특이적 킬러 관여자 (BiKE)와 비교한 본 발명자들의 이전 연구는, TriKE 내의 IL-15 모이어티가 NK 세포 증식, 생존, 증가된 STAT5 신호전달, 및 향상된 프라이밍을 유도함을 보여주었다. 그러나, 본 발명자들은, 본 발명자들의 시험관내 연구가 등몰 농도의 IL-15로의 처리와 비교할 때 본질적으로 최소이기는 하지만 TriKE에 의한 전반적 T 세포 증식의 일부 유도를 나타냄을 유의해야 한다. 이는, TriKE가 단량체 IL-15보다 더 많은 특이성을 유도하고 있으면서, 이는 여전히 낮은 수준으로 T 세포 증식을 촉발함을 나타낸다. 흥미롭게도, 처리하지 않은 것과 비교할 때 전반적 T 세포 증식이 TriKE에 의해 증가되면서, 3개 분할을 넘어서는 증식은 실제로 감소하고, 이들 두 그룹을 비교할 때 배양 종료시 T 세포 수의 차이가 없다. cam1615B7-H3 TriKE의 특이성을 완전히 설명하고 T 세포, 또한 더 중요하게는 T 세포 독성에 대한 영향을 평가하기 위해서는 보다 복잡한 모델 및 환자에서의 탐구가 필요할 것이다.
전임상 난소암 마우스 모델 결과는 고무적이었고 처리된 동물은 안정적인 질환을 가졌지만, 이 모델 내에서 처리는 치유성이 아니었다. 이는 다양한 요인에 기인할 수 있다. 인간 NK 세포 공여자는 가변적이며, 유도 만능 줄기 세포 유래된 NK 세포 (iNK)와 같은 NK 세포 생성물에서의 돌파구에 의해 해결될 수 있는 문제이다. 또한, TriKE 분자는 크기가 65 kDa 미만으로 작아, 신장을 통한 빠른 제거 및 최적 미만 용량을 초래한다. 상이한 공여자는 상이한 속도로 제거할 수 있다. 대안적으로, IL-15에 의해 매개되는 또는 강한 NK 세포 활성화를 통한 NK 세포 고갈이 작동될 수 있다. TriKE는 활성화에 대하여 CD16 표적화에 의존하며, 메탈로프로테이나제 ADAM17에 의해 절단될 수 있다. 본 발명자들 및 다른 사람들은 난소암을 갖는 여성의 복수로부터 유래된 NK 세포에서의 낮은 수준의 CD16 및 이 현상을 모방하는 MA-148 이종성 마우스 모델을 이전에 기재하였다. ADAM 17은 활성화 및 시토카인 수용체 둘 다에 의해 촉발될 수 있기 때문에, CD16 절단은 종양 자체 또는 염증성 종양 미세환경에 의한 NK 세포의 과도-활성화에 의해 매개될 수 있다. NK 세포에서의 CD16 발현 감소가 다른 종양 셋팅에서 기재되었기 때문에, 이는 난소암에 대해 독특한 것이 아니다. CD16 하향조절이 모든 종양 셋팅에서 나타나지 않을 수 있지만, 본 발명자들의 복수 데이터는 CD16 발현이 낮은 셋팅에서 TriKE가 비록 감소된 방식이기는 하나 여전히 종양 사멸을 매개할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 수년 동안 임상적으로 시험된 ADAM17 억제제, 또는 최근 기재되어 현재 임상 시험 중인 절단불가능한 CD16 수용체를 갖는 세포 생성물 (NCT04023071)과의 조합은, CD16이 하향조절되는 셋팅에서 TriKE의 활성을 크게 개선할 것이다.
대부분의 면역요법 양식은 체크포인트 차단 및 T 세포에 중점을 두는 반면, 자연 킬러 세포는 이를 고형 종양에 대한 세포-기반 치료법에 대한 이상적인 후보로 만드는 다수의 특징을 갖는다. 이들 연구는, 광범위한 암의 NK-세포-매개 표적화를 구동하기 위해, 이중특이적 항체 가교제로서 IL-15를 통합하는 독특한 생물학적 플랫폼 기술에 중점을 둔다. TriKE는 기능적 NK 세포-매개 사멸, 활성화, 및 증식을 향상시키도록 의도된 항원-특이적 시냅스를 촉진함으로써 자연 세포독성의 비-특이적 메커니즘을 극복한다. 이 연구에서 기재된 TriKE 분자는 다수의 고형 종양 악성 종양에서 과발현되는 Ig 단백질의 B7 공동자극 패밀리의 구성원인 B7-H3을 표적화한다. B7-H3는 TriKE 분자에 대한 강건한 표적이어서, 난소암, 전립선암, 및 폐암의 NK-세포 시험관내 사멸을 선택적으로 증가시킴이 밝혀졌다. IL-15 작용은 T 세포에 대한 표적이탈 효과가 거의 없으며 NK-세포 활성에 대해 현저히 특이적이다. 이는 TriKE가 고형 종양에 대해 작용할 수 있다는 개념을 뒷받침하는 최초의 생체내 이종이식 데이터를 제공하며, 그의 향후 임상 개발을 지지한다.
서열:
본 발명은 상기 실시예를 참조로 하여 기재되었지만, 수정 및 변형이 본 발명의 취지 및 범위 내에 포함됨이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구범위에 의해서만 제한된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (38)

  1. 서열 번호:13 또는 14에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 서열 또는 그와 90% 동일성을 갖는 서열.
  2. 제1항의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 번호:6 또는 7로부터 선택되는 것인 단백질.
  4. 어느 배향으로든 서로 작동가능하게 연결된, 서열 번호:6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 단백질이 서열 번호:6의 C-말단과 서열 번호:7의 N-말단 사이의 직접 연결로 서열 번호:6 및 7을 포함하는 것인 융합 단백질.
  6. 제4항에 있어서, 단백질이 서열 번호:7의 C-말단과 서열 번호:6의 N-말단 사이의 직접 연결로 서열 번호:7 및 6을 포함하는 것인 융합 단백질.
  7. 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질.
  8. 작동가능한 연결로, 서열 번호:2 또는 19; 4, 17, 또는 18; 6 및 7 또는 7 및 6을 포함하는 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 서열 번호:2 또는 19 및 4, 17 또는 18이 서열 번호:3 또는 서열 번호:15에 의해 연결된 것인 융합 단백질.
  10. 제8항에 있어서, 서열 번호:4, 17 또는 18 및 6 또는 7이 서열 번호:5 또는 서열 번호:16에 의해 연결된 것인 융합 단백질.
  11. 제8항에 있어서, 서열 번호:6 및 7이 어느 배향으로든 작동가능한 연결로 존재하는 것인 융합 단백질.
  12. 제8항에 있어서, 반감기 연장 (HLE) 분자를 추가로 포함하는 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, HLE 분자가 서열 번호:21-25 중 어느 하나를 포함하는 Fc 또는 scFc 항체 단편인 융합 단백질.
  14. 제8항에 있어서, 서열 번호:4가 N72 치환을 갖는 것인 융합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, N72 돌연변이가 N72A 또는 N72D인 융합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 단백질이 서열 번호:17 또는 18에 기재된 것인 융합 단백질.
  17. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산 서열.
  18. 제17항에 있어서, 서열이 서열 번호:8인 단리된 핵산 서열.
  19. 대상체의 암 치료 방법으로서, 대상체에게 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 투여함으로써 암을 치료하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 암이 비-소 폐암, 피부 편평 세포 암종, 췌장암, 원발성 간세포 암종, 결장직장 암종, 투명 세포 신장 암종 또는 유방암으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 어느 배향으로든 서열 번호:19, 서열 번호:17 또는 18 및 서열 번호:6 및 7을 포함하는 융합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 서열 번호:19가 서열 번호:3 또는 15의 링커에 의해 서열 번호:17 또는 18에 작동가능하게 연결된 것인 융합 단백질.
  23. 제21항에 있어서, 서열 번호:17 또는 18이 서열 번호:5 또는 16의 링커에 의해 어느 배향으로든 서열 번호 6 및 7에 작동가능하게 연결된 것인 융합 단백질.
  24. 제21항에 있어서, 반감기 연장 (HLE) 분자를 추가로 포함하는 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, HLE 분자가 서열 번호:21-25 중 어느 하나를 포함하는 Fc 또는 scFc 항체 단편인 융합 단백질.
  26. 치료 유효량의 서열 번호:1의 아미노산 서열 또는 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  27. 대상체의 암 치료 방법으로서, 대상체에게 제26항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  28. 대상체에서의 암 세포에 대한 자연 킬러 (NK) 세포 활성의 유도 방법으로서, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체에서 암 세포에 대해 NK 세포 활성을 유도하는 것을 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, NK 세포 활성의 유도가 NK 세포 탈과립화 유도, 인터페론 γ의 NK 세포 생성 유도, 대상체에서의 다수의 종양 침윤 NK 세포의 증가, 및/또는 NK 세포 증식의 유도 또는 증가를 포함하는 것인 방법.
  30. 대상체에서의 종양 성장의 억제 방법으로서, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체에서 종양 성장을 억제하는 것을 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 종양 성장 억제가 종양 세포 생존의 감소를 포함하는 것인 방법.
  32. 암을 갖는 대상체의 생존 증가 방법으로서, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체의 생존을 증가시키는 것을 포함하는 방법.
  33. 대상체에서의 암 세포에 대한 자연 킬러 (NK) 매개된 항체-의존적 세포의 세포독성의 유도 방법으로서, 대상체에게 서열 번호:1에 기재된 서열 및 서열 번호:1과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 융합 단백질을 투여함으로써 대상체의 생존을 증가시키는 것을 포함하는 방법.
  34. 제27항, 제28항, 제30항, 제32항 또는 제33항에 있어서, 대상체에게 항암 치료를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  35. 제27항, 제28항, 제30항, 제32항 또는 제33항에 있어서, 대상체가 암을 갖는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 암이 폐암, 전립선암, 다발성 골수종, 난소암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 암 세포가 B7-H3 발현 암 세포인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 암이 치료 내성 암인 방법.
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