KR20240068058A - 가이드 중합체를 사용하여 샘플에서 표적 중합체를 결정하는 방법 - Google Patents
가이드 중합체를 사용하여 샘플에서 표적 중합체를 결정하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 일반적으로 생물학적 기공을 사용하여, 표적 중합체, 특히 표적 폴리뉴클레오티드를 검출 및/또는 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 방법을 실시하기 위한 신규 시스템에 관한 것이다. 본 방법은 많은 용도를 갖는다. 특히, 본 방법은 진단, 다형의 검출 및 V(D)J 레퍼토리 분석에 사용될 수 있다.
Description
기술 분야
본 발명은 일반적으로 생물학적 기공을 사용하여 표적 중합체, 특히 표적 폴리뉴클레오티드를 검출 및/또는 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 방법을 실시하기 위한 신규 시스템에 관한 것이다. 본 방법은 많은 용도를 갖는다. 특히, 본 방법은 진단, 다형의 검출 및 V(D)J 레퍼토리 분석에 사용될 수 있다.
배경
광범위한 응용분야에 걸쳐서 신속하고 저렴한 중합체 (예를 들면, DNA 또는 RNA) 시퀀싱 및 확인 기술이 현재 필요하다. 기존 기술이 느리고 고가인 것은 주로 이들이 많은 양의 폴리뉴클레오티드를 생산하기 위해 증폭 기법에 의존하고 신호 검출을 위하여 다량의 전문 형광성 화학물질이 필요하기 때문이다.
생물학적 기공 (및 기타 나노기공)은 중합체 및 다양한 작은 분자에 대하여 직접, 전기적 바이오센서로서 큰 잠재력을 갖는다. 특히, 잠재적 DNA 시퀀싱 기술로서 나노기공에 최근 촛점이 주어졌다.
전위가 나노기공에 걸쳐서 인가되는 경우, 분석물, 예컨대 뉴클레오티드가 특정 시기 동안 배럴에서 일시적으로 머무를 때 전류 흐름에서 변화가 있다. 뉴클레오티드의 나노기공 검출은 알려진 시그니처 및 지속기간의 전류 변화를 제공한다. 가닥 시퀀싱 방법에서, 단일 폴리뉴클레오티드 가닥은 기공에 통과되고 뉴클레오티드의 동일성이 유래된다. 가닥 시퀀싱은 기공을 통해서 폴리뉴클레오티드의 움직임을 제어하기 위해 분자성 브레이크의 사용을 포함할 수 있다.
고체-상태 기공은 Cas9-함유 프로브를 사용하여 표적 DNA 서열을 확인하는데 사용되었다 (Yang 등, Nano Lett. 2018, 18, 10, 6469-6474 및 Weckman 등, ACS Sens. 2019, 4, 8, 2065-2072).
발명의 개요
본 발명자들은 가이드 중합체, 예컨대 RNA 및 DNA, 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질, 예컨대 CRISPR 유전자 편집 기기의 부분을 형성하는 RNA-가이드된 및 DNA-가이드된 이펙터 단백질과 조합으로 생물학적 기공에 대하여 새로운 용도를 확인하였다. 특히, 본 발명자들은 샘플에서 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 존재, 부재, 또는 양을 테스트하기 위해 연관된 RNA-가이드된 이펙터 단백질과 공동으로 사용될 수 있는 변형된 가이드 RNA 서열을 설계하였다. 본 발명자들은 생물학적 기공과 공동으로 가이드 중합체, 예컨대 RNA, 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질, 예컨대 가이드 RNA-가이드된 이펙터 단백질을 사용하여 표적 중합체를 검출하는 방법을 개발하였다. 특히, 본 발명자들은 표적 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 생물학적 기공과 상이하게 상호작용하고 상이한 전기적 측정을 초래한다는 것을 놀랍게도 확인하였다. 전기적 측정 사이 이들 차이는 표적 중합체의 존재 또는 부재를 더욱 효율적으로 확인하는데 사용될 수 있다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질과 생물학적 기공 사이 상호작용에서 비롯하는 전기적 측정에서의 변화는 고체-상태 기공으로 관찰된 것들과 완전히 상이하다 (Weckman 등, ACS Sens. 2019, 4, 8, 2065-2072 및 Yang 등 상기). 생물학적 기공으로, 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 표적 중합체와 연관된 것보다 더 오랜, 더욱 뚜렷한, 및 더욱 복잡한 전기적 효과를 초래한다. 이 유형의 효과는 고체-상태 기공으로 보이지 않는다 (Yang 등 및 Weckman 등 상기는 Cas9에서 비롯한 전류에서 짧고 날카로운 봉쇄를 보았다). 본 발명자들은 이 놀라운 전기적 효과가 생물학적 기공과의 예상치 못한 상호작용에서 비롯한다고 믿는다. 아래 더욱 상세히 논의된 대로, 상이한 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 상이한 전기적 효과 (즉, 상이한 신호)를 생산할 수 있고 이것은 (예를 들면, 상이한 표적 중합체를 검출하기 위해) 본 발명의 맥락에서 활용될 수 있다.
본 방법은 다양한 식으로 수행될 수 있지만, 이들이 가이드 중합체, 예컨대 가이드 RNA, 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질, 예컨대 RNA-가이드된 이펙터 단백질을 사용하여 표적 중합체(들), 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드(들)를 선택하고, 표적 중합체, 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질을 포함하는 복합체의 생물학적 기공으로의 전달을 포함한다는 공통점이 있다. 본 방법은 C2c2를 사용하는 RNA 편집 시스템을 포함하는, 다른 중합체-가이드된 단백질 이펙터 시스템으로 확장될 수 있다. 가이드 중합체, 예컨대 가이드 RNA는 나노기공-기반 검출 방법에서 사용을 위하여 특별히 적응될 수 있다.
본 발명자들에 의해 개발된 본 방법은 민감하고 샘플에서 다른 구성요소로부터 표적 중합체(들)를 추출하기 위해 별도 분리 단계를 요구하지 않고 샘플에서 표적 중합체의 미량을 검출하는데 사용될 수 있다. 그래서, 본 방법은 간단하고 복잡한 단계, 예컨대 풍부화 또는 정제 단계를 요구하지 않는다. 따라서, 본 방법은 빠른 결과 및 미정제 및/또는 "더러운" 샘플로부터의 결과를 수득하는데 사용될 수 있다. 본 방법은 그러므로 신속한 진단이 요구되는 진단적 셋팅에 특히 유용하다. 본 방법은 또한 유전자 또는 게놈의 특정한 단편 또는 영역 표적화하기에 특히 유용하다. 본 방법의 핵심 이익은 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 표적 또는 어댑터의 측정 전에 표적 중합체로부터 적극적으로 제거될 필요가 없다는 것이다. 표적 중합체는 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 여전히 결합된 동안에 전형적으로 검출되거나 특성규명된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 특별히 설계된 가이드 중합체를 사용하여 샘플에서 다른 구성요소로부터 표적 중합체(들)의 분리를 용이하게 한다.
본 방법은 분리 단계를 본질적으로 포함함에 따라 많은 다른 중합체 서열을 함유하는 샘플에서, 중합체 서열, 예컨대 폴리뉴클레오티드 서열에서의 관심의 영역이 특성규명되게, 예를 들어 시퀀싱되게 한다. 예를 들어, 큰 게놈에서 존재하는 관심의 유전자만이 시퀀싱될 수 있다. 시퀀싱은 SNP를 함유하는 영역으로, 또는 관심의 다른 영역, 예컨대 T-세포내 V(D)J 영역으로 제한될 수 있다. 이것은, 복잡하거나 시간-걸리는 단편화 또는 풀-다운 샘플 제조 방법을 요구함 없이 접근되고 있는 원하는 정보로, 감도 및 효율성을 개선한다. 이는 관심의 표적 중합체, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드의 단편만이 측정되거나, 이의 증가된 분율이 샘플에서 총 중합체 단편에 비해 측정됨에 따라 나노기공 실험을 수행하는데 걸린 시간을 또한 감소시킨다 비-표적 중합체의 양이 표적 중합체의 것에 대해 과량인 경우에, 표적 중합체를 검출하는데 걸린 시간은 비-표적 중합체의 제거 또는 이를 측정하기 위한 필요성의 감소로 인해 상당히 감소될 수 있다. 본 방법은 PCR 또는 기타 표적 풍부화 접근법이 필요하지 않다는 이점이 또한 있다.
본 발명은 다음을 제공한다:
- 다음 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는 방법:
a) 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 샘플에서 존재하는 임의의 표적 중합체와 복합체를 형성하는, (i) 표적 중합체의 한 부분에 결합하고 (ii) 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 결합하거나 부착되는 가이드 중합체와 샘플을 접촉시키는 단계;
b) 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 개구부가 있는 생물학적 기공을 포함하는 막과 샘플을 접촉시키는 단계;
c) 막에 걸쳐서 전위차를 인가하고 하나 이상의 전기적 측정을 하는 단계; 및
d) 기공을 통해서 복합체의 전좌에서 비롯하는 전기적 효과의 존재 또는 부재에 대하여 모니터링하고 이에 의해 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및
- 다음을 포함하는, 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 시스템:
a) 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 샘플에서 존재하는 임의의 표적 중합체와 복합체를 형성하는, (i) 만약 존재한다면 표적 중합체의 한 부분에 결합하고 (ii) 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 결합하거나 부착되는 가이드 중합체; 및
b) 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 개구부가 있는 생물학적 기공.
도면의 설명
도면이 본 발명의 특정한 구현예를 설명하기 위한 목적일 뿐이고 제한되는 의도가 아님을 이해되어야 한다.
도 1은 시스 챔버에서 5nM 3.6kb DNA로 100mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. 신호에서 스파이크는 기공을 통해서 DNA의 전좌에 상응한다.
도 2는 단일 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플이 플로우셀에 있는 80mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. Cas9 프로브는 한쪽 단부로부터 ~387개 염기인 3.6kb 가닥 상에서 위치 3213에 결합하는 crRNA로서 Enlam86을 갖는다. 이 예에서 이에 가장 가까운 Cas9가 있는 DNA의 단부는 만화에서 나타나고 이전이 아니고 Cas9 신호 후에 관찰되고 있는 DNA에 기인된 신호에 의해 증명된 대로 먼저 기공에 진입한다.
도 3은 단일 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플이 플로우셀에 있는 80mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. Cas9 프로브는 한쪽 단부로부터 ~387개 염기인 3.6kb 가닥 상에서 위치 3213에 결합하는 crRNA로서 Enlam86을 갖는다. 이 예에서 이에 가장 가까운 Cas9가 있는 DNA의 단부는 만화에서 나타나고 이후가 아니고 Cas9 신호 이전에 관찰되고 있는 DNA에 기인된 신호에 의해 증명된 대로 기공에 진입한다.
도 4는 단일 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플이 플로우셀에 있는 80mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. Cas9 프로브는 DNA의 중간에 가까운 3.6kb 가닥 상에서 위치 2057에 결합하는 crRNA로서 Enlam87을 갖는다. DNA에 기인된 신호는 양쪽 Cas9 신호 이전 및 이후 관찰된다.
도 5는 2개 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플이 플로우셀에 있는 100mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. Cas9 프로브는 3.6kb 가닥 상에서 각각 위치 218 및 3368에 결합하고 3000개 초과 염기의 분리를 초래하는 어느 한쪽 AR837 또는 Enlam51을 갖는다. DNA에 기인된 신호는 제1 이전 또는 제2 이후가 아닌 2개 Cas9 신호 사이 관찰된다.
도 6은 3개 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플이 플로우셀에 있는 800mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. Cas9 프로브는 전장 람다 가닥 상에서 각각 위치 4010, 25515 및 44609에 결합하고 프로브 사이 대략 20000개 염기의 분리를 초래하는 어느 한쪽 Enlam5, Enlam26 또는 Enlam45를 갖는다. DNA에 기인된 신호는 3개 Cas9 신호 사이 관찰된다. 이 도는 상이한 부분이 상응하는 것으로 주해된다.
도 7은 IV 곡선 전압 프로파일의 개략도를 도시한다.
도면이 본 발명의 특정한 구현예를 설명하기 위한 목적일 뿐이고 제한되는 의도가 아님을 이해되어야 한다.
도 1은 시스 챔버에서 5nM 3.6kb DNA로 100mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. 신호에서 스파이크는 기공을 통해서 DNA의 전좌에 상응한다.
도 2는 단일 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플이 플로우셀에 있는 80mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. Cas9 프로브는 한쪽 단부로부터 ~387개 염기인 3.6kb 가닥 상에서 위치 3213에 결합하는 crRNA로서 Enlam86을 갖는다. 이 예에서 이에 가장 가까운 Cas9가 있는 DNA의 단부는 만화에서 나타나고 이전이 아니고 Cas9 신호 후에 관찰되고 있는 DNA에 기인된 신호에 의해 증명된 대로 먼저 기공에 진입한다.
도 3은 단일 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플이 플로우셀에 있는 80mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. Cas9 프로브는 한쪽 단부로부터 ~387개 염기인 3.6kb 가닥 상에서 위치 3213에 결합하는 crRNA로서 Enlam86을 갖는다. 이 예에서 이에 가장 가까운 Cas9가 있는 DNA의 단부는 만화에서 나타나고 이후가 아니고 Cas9 신호 이전에 관찰되고 있는 DNA에 기인된 신호에 의해 증명된 대로 기공에 진입한다.
도 4는 단일 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플이 플로우셀에 있는 80mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. Cas9 프로브는 DNA의 중간에 가까운 3.6kb 가닥 상에서 위치 2057에 결합하는 crRNA로서 Enlam87을 갖는다. DNA에 기인된 신호는 양쪽 Cas9 신호 이전 및 이후 관찰된다.
도 5는 2개 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플이 플로우셀에 있는 100mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. Cas9 프로브는 3.6kb 가닥 상에서 각각 위치 218 및 3368에 결합하고 3000개 초과 염기의 분리를 초래하는 어느 한쪽 AR837 또는 Enlam51을 갖는다. DNA에 기인된 신호는 제1 이전 또는 제2 이후가 아닌 2개 Cas9 신호 사이 관찰된다.
도 6은 3개 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플이 플로우셀에 있는 800mV에서 수득된 전류 추적의 예를 도시한다. Cas9 프로브는 전장 람다 가닥 상에서 각각 위치 4010, 25515 및 44609에 결합하고 프로브 사이 대략 20000개 염기의 분리를 초래하는 어느 한쪽 Enlam5, Enlam26 또는 Enlam45를 갖는다. DNA에 기인된 신호는 3개 Cas9 신호 사이 관찰된다. 이 도는 상이한 부분이 상응하는 것으로 주해된다.
도 7은 IV 곡선 전압 프로파일의 개략도를 도시한다.
상세한 설명
개시된 생산물 및 방법의 상이한 응용분야가 당업계에서 특정 필요에 맞춰질 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 전문용어가 본 발명의 특정한 구현예를 설명하기 위한 목적일 뿐이고, 제한되는 의도가 아님이 또한 이해되어야 한다.
이외에도, 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 대로, 단수형 "한", "하나", 및 "상기"는 내용이 명백히 달리 명시하지 않는 한 복수형 참조물을 포함한다. 그래서, 예를 들어, "중합체" 지칭은 둘 이상의 중합체를 포함하고, "폴리뉴클레오티드"는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, "앵커" 지칭은 둘 이상의 앵커를 지칭하고, "헬리카제" 지칭은 둘 이상의 헬리카제를 포함하고, "기공" 지칭은 둘 이상의 기공 및 기타 등등을 포함한다.
상기 또는 하기이든, 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 이에 의해 그들 전체가 참조로 편입된다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 편입되도록 구체적이고 개별적으로 명시된 것과 동일한 정도로 참조로 본원에 편입된다. 참조로 편입된 공보 및 특허 또는 특허 출원이 명세서에 들어있는 개시내용과 모순되는 한, 본 명세서는 임의의 이러한 모순성 자료를 대체하고/거나 우선하도록 의도된다.
전문용어
본원에 모든 경우에서, 표적 중합체"의 존재 또는 부재 결정하기" 술어는 표적 중합체 "검출하기"와 호환가능하다. 따라서 본 발명의 방법은 그러므로 표적 중합체를 검출하는 방법에 관한 것일 수 있고 단계 (d)는 기공을 통해서 복합체의 전좌에서 비롯하는 전기적 효과를 검출하고 이에 의해 샘플에서 표적 중합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 시스템은 샘플에서 표적 중합체를 검출하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 방법
본 발명은 4 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 단계 (a)에서, 샘플은 (i) 표적 중합체의 한 부분에 결합하고 (ii) 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 결합하거나 부착되는 가이드 중합체와 접촉되고, 여기서 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 샘플에서 존재하는 임의의 표적 중합체와 복합체를 형성한다. 샘플은 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질과 접촉된다. 단계 (b)에서, 샘플은 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 개구부가 있는 생물학적 기공을 포함하는 막과 접촉된다. 단계 (c)에서, 전위차는 막에 걸쳐서 인가되고 하나 이상의 전기적 측정이 실시된다. 단계 (d)에서 기공을 통해서 복합체의 전좌에서 비롯하는 전기적 효과의 존재 또는 부재는 모니터링되고 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재는 결정된다. 복합체는 만약 존재한다면, 표적 중합체, 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질을 포함하고 그래서 기공을 통해서 복합체의 전좌에서 비롯하는 전기적 효과는 양쪽 표적 중합체 및 단백질에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이것은 아래 더욱 상세히 논의된다. 단계 (a) 및 (b)는 어느 한쪽 순서로 동시에 또는 순차적으로 실시될 수 있다.
본 방법은 (a) 샘플이 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 수축이 있는 생물학적 기공을 포함하는 막과 접촉하고 전위가 기공에 인가되는, (i) 표적 중합체에서 서열에 결합하고 (ii) 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 결합하거나 부착되어 복합체를 형성하는 가이드 중합체와 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (b) 복합체의 적어도 한 부문이 기공에 관하여 움직임에 따라 하나 이상의 전기적 측정을 하여 복합체의 존재 또는 부재를 검출하고, 이에 의해 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 (b)는 기공을 통해서 흐르는 전류를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 (a) 표적 중합체에서 서열에 결합하는 가이드 중합체, 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 수축이 있는 생물학적 기공을 포함하는 막과 샘플을 접촉시키는 단계; (b) 막에 걸쳐서 전위차를 인가하는 단계; 및 (c) 하나 이상의 전기적 측정을 하거나, 샘플, 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 기공과의 상호작용에서 비롯하는 또 다른 신호를 측정하여, 가이드 중합체, 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및 표적 중합체를 포함하는 복합체의 존재 또는 부재를 결정하고, 이에 의해 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 단계 (c)는 기공을 통해서 흐르는 전류의 측정을 포함할 수 있다.
본 방법은 다수의 상이한 식으로 실시될 수 있다. 본 방법은 다양한 상이한 응용분야를 수행하는데 사용될 수 있다. 본 방법은, 예를 들어, 단일 표적 중합체, 또는 다수의 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 방법은 정량적일 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 존재하는 표적 중합체의 양 (예컨대 농도)는 본 발명의 방법을 사용하여 결정될 수 있고/거나 샘플에서 존재하는 상이한 중합체의 상대량은 결정될 수 있다. 본 방법은 표적 중합체에 대한 추가 정보, 예컨대 다형의 존재 또는 부재 및/또는 다형의 동일성을 제공할 수 있다.
본 방법은 가이드 중합체에 부착된 어댑터가 기공과 상호작용하는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 표적 중합체에 결합되지 않는 어댑터를 포함하는 가이드 중합체가 기공과 상호작용하지 않도록 실시될 수 있다. 전형적으로, 이러한 미결합된 가이드 중합체는 경막 전위가 막에 인가되기 전에 세정 제거된다. 표적 중합체는 표면에, 예를 들어 막에 테더링되어, 어댑터를 포함하는 결합된 가이드 중합체가 세정 제거되는 것을 방지할 수 있다. 표적 중합체는 이에 직접적으로, 예를 들어, 이의 단부 중 하나에 부착된 테더, 예컨대 막 앵커를 가질 수 있다. 대안적으로, 테더, 예컨대 막 앵커를 포함하는 제2 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질은 표적 중합체를 표면에, 예를 들어 막에 테더링하는데 사용될 수 있다.
표적 중합체가 테더링되는 표면은 비드일 수 있다.
어댑터는 표적 중합체에 전형적으로 고유하고 기공과 상호작용시 뚜렷한 신호를 생산한다. 상이한 표적 중합체에 대하여 각각 선택적이고 상이한 어댑터를 갖는 다중 가이드 중합체는 샘플에 첨가되어 기공과 상호작용하는 상이한 어댑터에 의해 유발된 상이한 신호에 기초하여 상이한 표적 중합체를 검출 및/또는 정량화할 수 있다. 이 구현예에서, 어댑터는 바코드를 포함하는 것으로 간주될 수 있다.
본 방법은 상이한 중합체 서열에 결합하는 다중 가이드 중합체를 사용할 수 있다. 상이한 중합체 서열은, 예를 들어, 동일한 표적 중합체에서 상이한 서열 (예를 들면, 표적 중합체의 상이한 부문), 상이한 표적 중합체의 서열 또는 표적 중합체 내에서의 대안적 서열, 예컨대 다형, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형 (SNP)을 포괄하는 서열일 수 있다. 단계 (a)는 바람직하게는 샘플을 둘 이상의 가이드 중합체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 둘 이상의 가이드 중합체는 표적 폴리뉴클레오티드에서 상이한 서열에 또는 상이한 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 표적 중합체를 특성규명하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 표적 중합체, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 부분을 시퀀싱하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 둘 이상의 가이드 중합체 및 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질을 사용한다. 예를 들어, 단계 (a)는 바람직하게는 표적 중합체의 한 부분에 결합하는 각각의 둘 이상의 가이드 중합체 및 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질과 샘플 및 기공을 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 둘 이상의 가이드 중합체 및 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 샘플에서 존재하는 임의의 표적 중합체와 둘 이상의 복합체를 형성한다. 둘 이상의 가이드 중합체 및 가이드 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 임의의 수, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상은 사용될 수 있다. 둘 이상의 가이드 중합체의 수는 둘 이상의 가이드 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 수와 전형적으로 동일하다. 복합체의 수는 둘 이상의 가이드 중합체의 수 및 둘 이상의 가이드 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 수와 전형적으로 동일하고 위에 나열된 수 중 임의의 것일 수 있다. 이들 구현예에서, 단계 (d)는 바람직하게는 기공을 통해서 둘 이상의 복합체의 전좌에서 비롯하는 전기적 또는 전류 효과의 존재 또는 부재를 모니터링하고 이에 의해 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 전기적 또는 전류 효과의 수는 둘 이상의 복합체의 수와 전형적으로 동일하다. 둘 이상의 가이드 중합체는 바람직하게는 표적 중합체의 상이한 서열 또는 부분에 결합한다. 그들 서열 또는 부분은 동일한 표적 중합체 내에서, 상이한 표적 중합체에 존재할 수 있거나 표적 중합체에서 존재할 수 있는 대안적 서열, 예컨대 SNP일 수 있다. 둘 이상의 가이드 중합체는 바람직하게는 동일한 표적 중합체의 상이한 부분에 결합한다. 이것은 둘 이상, 예컨대 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 복합체가 개별 표적 중합체 상에서 형성하고, 기공을 통해서 전좌하고, 다중 전기적 또는 전류 효과를 초래함을 의미한다. 이것은 아래 더욱 상세히 논의된다. 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 상이한 중합체-가이드된 이펙터 단백질 또는 상이한 RNA-가이드된 이펙터 단백질이다. 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 상이한 중합체-가이드된 이펙터 단백질이거나 상이한 RNA-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 상이한 전기적 효과를 초래한다. 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 아래 더욱 상세히 논의된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 2개 단백질은 이들이 상이한 단백질 또는 단백질 상동체, 예컨대 Cas 및 Cpf1이면, 또는 이들이 동일한 단백질, 예컨대 Cas9에서 유래되고, 이들 중 하나가 예를 들어 치환, 결실, 또는 부가를 통해 변형되거나, 이들 중 양쪽이 상이한 식으로 변형되면 상이하다.
일부 구현예에서, 본 방법은 표적 중합체의 상이한 영역에 결합하고 둘 이상의 복합체를 형성하는 둘 이상의 가이드 중합체 및/또는 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질을 사용하여 표적 중합체의 존재, 부재 또는 양을 검출하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 표적 중합체에 둘 이상의 상이한 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질의 결합은 표적 중합체가 샘플에서 존재하면 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 생물학적 기공을 통해서 검출가능한 전기적 신호, 예를 들어 검출가능한 전류 변화를 초래한다. 신호는, 가이드 중합체가 막 앵커를 포함하는 제2 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질에 "연결"되는 때에만 또는 주로 관찰되고 있는 신호로, 가이드 중합체/ 중합체-가이드된 이펙터 복합체 중 하나에서 어댑터의 특징일 수 있고, 이 "연결"은 양쪽 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질이 표적 중합체에 결합되는 때 발생한다. 다시 말해서, 표적 중합체는 어댑터를 포함하는 가이드 중합체/ 중합체-가이드된 이펙터 복합체를 막 앵커를 포함하는 가이드 중합체/ 중합체-가이드된 이펙터 복합체에 "연결"하는 역할을 한다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 막 앵커를 포함하는 구현예에서, 부착은 단백질 자체를 통한 것, 예를 들어 스트렙(strep)-태그/플래그-태그/히스(his)-태그의 사용에 의한 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 표적 중합체가 샘플을 기공과 접촉시키기 전에 샘플에서 다른 중합체로부터 표적 중합체를 분리시킬 필요 없이 선택적으로 시퀀싱될 수 있도록 표적 중합체에 특이적인 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체로 각 표적 중합체를 표시함으로써 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 생물학적 기공을 사용하여 표적 중합체를 선택적으로 특성규명, 예를 들어 시퀀싱하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체는 표적 중합체만이 막에 테더링되도록 막 앵커로 태그화될 수 있다. 샘플에서 다른 중합체는 세정 제거될 수 있다. 대안적으로, 중합체를 따라 움직일 수 있는 중합체 결합 단백질은 샘플에서, 예를 들어 당업계에 알려진 기법을 사용하여 중합체의 단부에 결합될 수 있고, 중합체 결합 단백질은 복합체 형성 후, 예를 들어 중합체 결합 단백질의 움직임에 필요한 보조인자를 첨가함으로써 중합체를 따라 움직이도록 유발될 수 있다. 이 구현예에서, 결합된 가이드 중합체/ 중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체는 중합체 결합 단백질을 표적 중합체 상에서 교착시키고, 한편 중합체 결합 단백질은 비-표적 중합체의 단부까지 가공된다. 그 다음, 경막 전위가 인가되는 때, 전위 및 기공과의 접촉의 힘은 표적 중합체가 기공을 통해서 전좌하도록 표적 중합체로부터 결합된 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체를 변위시킨다. 중합체 결합 단백질이 결합되지 않는 비-표적 중합체는 매우 신속하게 기공을 통과해서 신호가 검출되지 않거나, 수득된 임의의 신호가 기공과 표적 중합체의 상호작용에서 비롯하는 신호로부터 쉽게 구별될 수 있다. 양쪽 표적 및 비-표적 중합체를 포함하여, 샘플에서 중합체의 3'-말단화된 가닥은, 예를 들어 엑소뉴클레아제를 사용하여 분해될 수 있다. 이런 식으로 표적 중합체는 선택적으로 특성규명, 예를 들어 시퀀싱될 수 있다. 중합체 결합 단백질은 보조인자, 예컨대 ATP 또는 예를 들어 또 다른 뉴클레오시드 및 γsGTP를 첨가함으로써 중합체를 따라 움직이도록 유발될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 선택된 지점에서 중합체를 컷팅하는데 사용될 수 있다. 이것은 관심의 영역에 대하여 본 방법에 의해 수득된 정보, 예컨대 서열 정보를 제한하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 활성이 있는 2개 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 관심의 중합체 단편을 수득하는데 사용될 수 있다. 대안으로서, 불활성화되거나 디스에이블(disable)된 뉴클레아제 활성을 갖는 변형된 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 위에 기재된 대로 중합체 결합 단백질을 교착시키는데 사용될 수 있고 제2 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 특성규명되고 있는 단편을 절두하는데 사용될 수 있다. 이 구현예는 예를 들어, V(D)J 레퍼토리 분석 응용분야에서 특히 유용하다.
추가로, 일부 구현예에서, 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체는 기공을 통과하는 전류 상에서 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체의 효과가 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정, 중합체를 정량화 또는 확인하는데 사용될 수 있도록 표적 중합체를 태그화하거나 표지화한다.
예를 들어, 가이드 중합체 또는 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 막 앵커로 태그화된 표적 중합체를 확인하는데 사용될 수 있는 어댑터에 부착될 수 있는 것은 어댑터가 막에 테더링된 표적 중합체에 결합되는 때 기공과 상호작용할 뿐이기 때문이다. 미결합된 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 세정 제거될 수 있다. 상이한 표적 중합체에 각각 선택적이고 상이한 어댑터를 갖는 다중 가이드 중합체는 샘플에 첨가되어 기공과 상호작용하는 상이한 어댑터에 의해 유발된 상이한 신호에 기초하여 상이한 표적 중합체를 검출 및/또는 정량화할 수 있다.
대안적으로, 표적 중합체에 결합된 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체는 표적 중합체가 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 생물학적 기공을 통과하는 때 검출가능한 신호를 생산할 수 있다.
생물학적 기공이 중합체 및 결합된 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체의 통과를 허락할만큼 충분히 크기 때문에, 기공을 통해서 중합체/가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체의 통과는 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체가 기공을 통과하는 때 인식가능한 신호를 생산할 것이다. 이 신호는 아래 더욱 상세히 논의된다. 그래서, 하나 이상의 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체는 표적 중합체를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 가이드 중합체는 특정한 다형이 표적 중합체에서 존재하는 경우에만 결합하도록 설계될 수 있다. 표적 중합체가 기공을 통과함에 따라 관찰된 결합된 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체에 기인하는 신호의 수, 또는 표적 중합체가 기공을 통과함에 따라 특정한 신호의 존재 또는 부재는 다형의 존재 또는 부재를 나타낼 수 있다. 가이드 중합체, 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및/또는 표적 중합체 중 하나 이상은 전형적으로 변형되어 본 방법이 실시되게 한다.
본 방법은 표적 중합체, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드의 양, 또는 표적 중합체, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특징을 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하나 이상의 특징은 (i) 표적 중합체 또는 폴리뉴클레오티드의 길이, (ii) 표적 중합체 또는 폴리뉴클레오티드의 동일성, (iii) 표적 중합체 또는 폴리뉴클레오티드의 서열, (iv) 표적 중합체 또는 폴리뉴클레오티드의 2차 구조 및 (v) 표적 중합체 또는 폴리뉴클레오티드가 변형되는지 여부로부터 전형적으로 선택된다. 이들 속성은 WO 2018/060740에 기재된다. (i) 내지 (v)의 임의의 조합, 예컨대 {i}, {ii}, {iii}, {iv}, {v}, {i,ii}, {i,iii}, {i,iv}, {i,v}, {ii,iii}, {ii,iv}, {ii,v}, {iii,iv}, {iii,v}, {iv,v}, {i,ii,iii}, {i,ii,iv}, {i,ii,v}, {i,iii,iv}, {i,iii,v}, {i,iv,v}, {ii,iii,iv}, {ii,iii,v}, {ii,iv,v}, {iii,iv,v}, {i,ii,iii,iv}, {i,ii,iii,v}, {i,ii,iv,v}, {i,iii,iv,v}, {ii,iii,iv,v} 또는 {i,ii,iii,iv,v}은 본 발명에 따라 측정될 수 있다. (i)-(v)의 모두에서, 표적 중합체는 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드이다.
단계 (a)는 복합체의 하나 이상의 구성요소가 결합할 수 있는 비드 (예를 들면, 미립자)와 샘플을 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, (a)에 사용된 구성요소, 예를 들면, 표적 중합체, 가이드 중합체 또는 중합체-가이드된 이펙터 단백질 중 하나 이상은 비드 (예를 들면, 미립자)에 사전결합될 수 있다. 가이드 중합체 및/또는 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 거기에 부착된 비드에 커플링할 수 있는 결합 모이어티를 갖고 단계 (a)에서 가이드 중합체 또는 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 비드에 커플링되거나, 단계 (a)는 샘플을 비드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
샘플은 수성 매질에서 제공될 수 있거나, 대안적으로 샘플은 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및 가이드 중합체를 함유하는 수성 매질에 첨가될 수 있다. 수성 매질은 막에 걸쳐서 전위차의 인가시 기공을 통해서 이온 흐름을 제공하기 위해 이온을 전형적으로 포함할 것이다. 수성 매질은 완충액을 또한 전형적으로 포함할 것이다. 수성 매질은 6 내지 9의 범위에서 pH 및/또는 약 100 내지 약 200 mM 염, 예컨대 NaCl의 범위에서 이온 농도를 전형적으로 갖는다.
비드는 수성 매질보다 전형적으로 밀도가 높고 매질을 통해서 가라앉아 막을 접촉시키고, 그래서 막 표면에서 앵커에 부착된 종의 농도를 효과적으로 향상시킨다.
본 방법에서, 인가된 전위는 전압 전위일 수 있다. 대안적으로, 인가된 전위는 화학적 전위일 수 있다. 이의 예는 양쪽친매성 층에 걸쳐서 염 구배를 사용하는 것이다. 염 구배는, 예를 들어, Holden 등, J Am Chem Soc. 2007 Jul 11:129(27):8650-5에 개시된다.
가이드 중합체 및/또는 이펙터 단백질은 표적 중합체에 가교될 수 있다.
본 방법은 표적 분자의 풍부화 이후 복잡한 배경에서 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9, 10, 20, 30개 또는 그 이상 표적 중합체를 검출하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 시퀀싱, 예를 들면, 나노기공 시퀀싱은 검출에 사용된다. 그러므로 이 구현예에서, 표적 DNA 분자는 이의 서열에 의해 주로 확인될 수 있다.
본 방법은 다중체 검정으로서 실시될 수 있다. 다중체 검정은 상이한 바코드를 활용할 수 있다. 예를 들어, 상이한 바코드는 상이한 어댑터 상에 있을 수 있다. 바코드는, 예를 들어, 바코드가 기공에 의해 확인되도록 하는 뚜렷한 뉴클레오티드 서열을 각각 가질 수 있다. 일 구현예에서 바코드 서열은 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 결합 단백질과 샘플을 접촉시키기 전에 샘플에서 모든 중합체에 결찰될 수 있다. 제2 바코드는 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 결합 단백질과 샘플을 접촉시키기 전에 제2 샘플에 첨가될 수 있다. 제1 및 제2 샘플은 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 결합 단백질의 첨가 전에 또는 후에, 바람직하게는 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 결합 단백질이 표적 중합체에 결합된 후에 조합될 수 있다. 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 결합 단백질이 표적 중합체에 결합된 후에 샘플의 풀링이 발생하는 경우, 정제 단계 (스트레스, 비-표적 결합된 단백질의 제거, 및/또는 비-표적 중합체의 제거 포함)는 풀링 전에 또는 후에 실시될 수 있다. 여러 샘플, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 8, 9, 10, 20, 30개 샘플은 바코드로 표지화될 수 있고 그 다음 이 식으로 조합될 수 있다. 이 구현예에서 모든 샘플은 동시에, 예를 들면, 동일한 플로우셀을 사용하여 시퀀싱될 수 있고, 그들의 바코드 어댑터를 사용하여 확인될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 바코드 및 시퀀싱 어댑터는 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 결합 단백질이 표적 중합체에 결합된 후에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 바코드 및 시퀀싱 어댑터는 비드 상에 결찰될 수 있다. 표적-로딩된, 바코딩된, 적응된 비드는 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 결합 단백질이 표적 중합체에 결합된 후에 그리고 임의로 하나 이상의 정제 스탭 (예컨대 스트레스, 비-표적 결합된 단백질의 제거, 및/또는 비-표적 중합체의 제거)이 실시된 후에 샘플에 첨가될 수 있다.
본 방법은 표적 중합체에 특이적으로 결합되지 않는 임의의 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및/또는 가이드 중합체, 예를 들면, 가이드 중합체/중합체 가이드된 이펙터 단백질 복합체를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 표적 중합체에 결합되지 않는, 샘플에서 존재하는, 과잉 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및/또는 가이드 중합체, 예를 들면, 가이드 중합체/중합체 가이드된 이펙터 단백질 복합체는 기공과 표적 중합체의/가이드 중합체/중합체 가이드된 이펙터 단백질 복합체의 상호작용을 모니터링하는 때 배경을 생산할 수 있다. 표적 중합체에 특이적으로 결합되지 않는 가이드 중합체, 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및/또는 중합체-가이드된 이펙터 단백질 /가이드 중합체 복합체는 샘플에서 중합체를 표면, 예를 들면, 비드 또는 컬럼에 결합시킴으로써 가이드 중합체, 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및 표적 중합체를 포함하는 복합체로부터 분리될 수 있다. 표적 중합체는 샘플에서 가이드 중합체, 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및/또는 중합체-가이드된 이펙터 단백질 /가이드 중합체 복합체를 표면, 예를 들면, 비드 또는 컬럼에 결합시킴으로써 샘플에서 비-표적 중합체로부터 또한 분리될 수 있다. 표적 중합체(들)는, 예를 들어, 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체 상에서 포획 모이어티를 통해 '풀다운'에 의해 배경에서 분리될 수 있다.
본 방법은 단계 (b) 전에 표적 중합체에 특이적으로 결합되지 않는 임의의 중합체-가이드된 이펙터 단백질을 선택적으로 변성시키는 단계를 포함할 수 있다. 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체 결합의 '오프-표적' 효과는 결합된 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체에 열적 및/또는 화학적 스트레스를 적용함으로써 감소될 수 있다. 전형적으로, 이 구현예에서, 비-표적 결합된 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 적용된 열 스트레스 또는 화학적 스트레스에 의해 선택적으로 변성된다. 적용된 열 또는 화학적 처리는 오직 유리 중합체-가이드된 이펙터 단백질 (즉, 샘플에서 중합체에 결합되지 않지만, 가이드 중합체에 결합될 수 있는 중합체-가이드된 이펙터 단백질) 및 비-표적 결합된 중합체-가이드된 이펙터 단백질 (즉, 샘플에서 중합체에 비-특이적으로 결합되는 중합체-가이드된 이펙터 단백질, 또는 "오프 표적" 중합체-가이드된 이펙터 단백질)이 변성되도록 선택될 수 있다. 표적-결합된 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 열 스트레스 또는 화학적 스트레스 동안 표적 중합체에 결합된 채로 남아있다. 임의의 오프-표적 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 샘플에서 중합체에 이의 비-특이적 결합으로부터 방출된다. 일 구현예에서, 가이드 중합체에서 상응하는 서열에 정확하게 상보적인 표적 서열에 결합된 중합체-가이드된 이펙터 단백질만이 스트레스 동안 중합체에 결합된 채로 남아있다.
임의의 적합한 화학적 스트레스, 예컨대 요소 (예를 들면, 최대 6M, 5M 또는 4M), 구아니디늄 히드로클로리드, 극한 pH (산성 또는 알칼리성, 예컨대 pH6, pH5 또는 pH4 미만 또는 pH8, pH9 또는 pH10 초과) 또는 높은 염 농도는 사용될 수 있다. 적합한 조건은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
화학적 스트레스는, 표적 중합체에 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 특이적 결합의 방해 없이, 중합체에 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 비-특이적 결합의 선택적 방해를 초래하는 임의의 시기 동안 실시될 수 있다. 화학적 스트레스는 약 30 초 내지 약 10 분 동안, 예컨대 약 1 분, 약 2 분, 약 3 분, 약 5 분, 약 6 분, 약 7 분, 약 8 분 또는 약 9 분 동안 실시될 수 있다.
열 스트레스는 임의의 적합한 온도에서 실시될 수 있다. 전형적으로, 온도는 중합체에 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 비-특이적 결합을 방해할만큼 충분히 높지만 표적 중합체에 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 특이적 결합이 방해되지 않는 만큼 충분히 낮다. 예를 들어, 샘플은 약 40℃ 내지 약 65℃, 예컨대 약 45℃ 내지 약 65℃, 약 50℃ 내지 약 60℃, 또는 약 55℃의 온도로 가열될 수 있다.
열 스트레스는, 표적 중합체에 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 특이적 결합 방해 없이, 중합체에 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 비-특이적 결합의 선택적 방해를 초래하는 임의의 시기 동안 실시될 수 있다. 열 스트레스는 약 30 초 내지 약 10 분 동안, 예컨대 약 1 분, 약 2 분, 약 3 분, 약 5 분, 약 6 분, 약 7 분, 약 8 분 또는 약 9 분 동안 실시될 수 있다.
정제 단계는 과잉, 미결합된 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및/또는 가이드 중합체를 제거하는데 사용될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 샘플에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 염화나트륨을 첨가하고 샘플에서 존재하는 중합체가 비드에 결합하도록 카르복실기로 코팅된 상자성 비드와 샘플을 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 적합한 비드는 상업적으로 이용가능한 SPRI 비드이고 당업계에서 알려진 표준 프로토콜은 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 표적 중합체/가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체는 표면, 예를 들면, 상이한 포획 비드를 사용하여 비-표적 중합체에서 후속적으로 분리될 수 있다. 전형적으로, 여기에서 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질은 표면에 표적 중합체/가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체를 특이적으로 결합시키는데 사용되는 결합 모이어티를 함유할 수 있다. 임의의 비-결합된 중합체는 세정 제거될 수 있다. 표적 중합체/가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체는 임의의 적합한 수단에 의해 표면에서 용출될 수 있거나, 예를 들면, 표면이 비드인 경우, 표면은 기공에 복합체를 전달하는데 사용될 수 있다.
'오프-표적' 효과는 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 상에서, 예를 들면, 가이드 중합체 상에서 제1 결합 모이어티를 사용하여 포획 표면 상에서 표적 중합체/가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체 정제, 표적 중합체/가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체 용출하기 및 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 상에서, 예를 들면, 가이드 중합체 상에서 제2 결합 모이어티를 사용하여 제2 특이적 포획 표면에 표적 중합체/가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체를 전하기에 의해 추가로 최소화될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 제1 결합 모이어티 및 제2 결합 모이어티가 둘 모두 단부 확장이거나, 가이드 중합체 상에서 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있는 기타 단일 가닥 중합체 서열인 경우 달성될 수 있다. 가이드 중합체 상에서 제1 단부 확장은 제1 포획 표면, 예를 들면, 비드 상에서 제1 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열을 갖고, 가이드 중합체 상에서 제2 단부 확장은 제2 포획 표면, 예를 들면, 비드 상에서 제2 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열을 갖는다. 이것을 구성하는 하나의 식은 비드, 컬럼 또는 표면 상에서 표적 중합체의 포획에 사용된 3' DNA 확장을 포함하는 crRNA이고 tracrRNA는 5' DNA 확장을 포함한다. 제1 포획 표면, 예를 들면, 비드로부터 표적의 방출은 토홀드 변위로서 알려진 현상에 의해 영향받을 수 있다.
표적 중합체/가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체는 제1 단부 확장에 상보적인 제1 포획 올리고뉴클레오티드를 보유하는 비드 상에서 포획에 의해 비-표적 중합체로부터 먼저 분리된다. 비-표적 중합체는 세정 제거된다. 표적 중합체/가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체는, 비드에 대한 결합에 대하여 가이드 중합체 상에서 제1 단부 확장과 경쟁하는 경쟁자 올리고뉴클레오티드의 첨가를 통해, 토홀드 변위에 의해 비드에서 용출될 수 있다. 이 구현예에서, 제1 포획 올리고뉴클레오티드는 제1 단부 확장보다 더 길고 제1 서열 및 제2 서열을 포함하고, 여기서 제1 서열은 제1 단부 확장에서 서열에 상보적이고 제1 및 제2 서열은 둘 모두 경쟁자 올리고뉴클레오티드의 서열에 상보적이다. 전형적으로, 제1 서열은 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 제2 서열은 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 경쟁자 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 약 80개, 예컨대 약 20 내지 약 60개 또는 약 30 내지 약 50개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 40개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 제1 포획 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 약 80개, 예컨대 약 20 내지 약 60개 또는 30 내지 약 50개 뉴클레오티드, 예를 들어 40개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 포획 올리고뉴클레오티드는 경쟁자 올리고뉴클레오티드와 동일한 길이를 가질 수 있거나, 포획 올리고뉴클레오티드는 경쟁자 올리고뉴클레오티드보다 더 길거나 더 짧을 수 있고, 다만 포획 올리고뉴클레오티드 및 경쟁자 올리고뉴클레오티드는 양쪽 제1 및 제2 서열에 걸쳐 상보적인 서열을 갖는다. 이 구현예에서, 제1 단부 확장은, 5' 단부 확장에서 5' 단부에 또는 3' 단부 확장에서 3' 단부에 있는, 제1 포획 올리고뉴클레오티드에서 서열에 상보적이지 않은 서열을 갖는 단부 부문, 및 제1 포획 올리고뉴클레오티드에서 제1 서열에 상보적인 서열을 갖는 한 부문을 포함한다. 제1 단부 확장의 단부 부문은 약 2 내지 약 10개 뉴클레오티드, 예컨대 약 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오티드의 길이를 전형적으로 가질 수 있다. 제1 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 제1 단부 확장의 부문은 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이를 전형적으로 가질 수 있다.
표적 중합체의/가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체의 용출 이후, 복합체는 가이드 중합체 상에서 제2 단부 확장을 통해 제2 '전달' 비드에 결합된다. 제2 '전달' 비드는 제2 단부 확장에 상보적인 제2 포획 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 제2 포획 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이 또는 약 10 내지 약 80개, 예컨대 약 20 내지 약 60개 또는 약 30 내지 약 50개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 40개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 제2 단부 확장은 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 제2 포획 올리고뉴클레오티드는 제2 단부 확장과 동일한 길이를 가질 수 있거나, 제2 포획 올리고뉴클레오티드는 단부 확장보다 더 길거나 더 짧을 수 있고, 다만 제2 포획 올리고뉴클레오티드 및 제2 단부 확장은 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 상보적인 서열을 갖는다. 제2 단부 확장은 제1 포획 뉴클레오티드, 제1 단부 확장 또는 경쟁자 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 서열을 갖는다. 제2 포획 올리고뉴클레오티드는 제1 포획 뉴클레오티드, 제1 단부 확장 또는 경쟁자 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 서열을 또한 갖는다.
따라서, 가이드 중합체가 제1 단부 확장 및 제2 단부 확장을 포함하는 경우, 본 방법은 단계 (b) 전에 다음 단계를 포함할 수 있다:
(i) 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질/표적 중합체 복합체가 표면에 결합되도록, 제1 단부 확장에 상보적인 서열을 포함하는 제1 포획 올리고뉴클레오티드로 거기에 결합된 표면과 샘플을 접촉시키는 단계;
(ii) 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질/표적 중합체 복합체가 표면에서 방출되도록, 표면에 결합된 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질/표적 중합체 복합체를 경쟁자 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계;
(iii) 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질/표적 중합체 복합체가 비드에 결합되도록, 제2 단부 확장에 상보적인 서열을 포함하는 제2 포획 올리고뉴클레오티드로 거기에 결합된 비드와 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질/표적 중합체 복합체를 접촉시키는 단계; 및 임의로
(iv) 비드를 기공에 전달하는 단계.
본 방법은 바람직하게는 막 및/또는 비드에 커플링되지 않는 가이드 중합체, 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드를 세정 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 상이한 구현예에서, (i) 열 또는 화학적 스트레스, 과잉, 미결합된 및/또는 비-표적 결합된 중합체-가이드된 이펙터 단백질을 제거하기 위한 정제 또는 토홀드 정제 없음; (ii) 유일한 열 또는 화학적 스트레스; (iii) 유일한 과잉, 미결합된 및/또는 비-표적-결합된 중합체-가이드된 이펙터 단백질을 제거하기 위한 정제; (iv) 유일한 토홀드 정제; (v) 열 또는 화학적 스트레스 및 과잉, 미결합된 및/또는 비-표적-결합된 중합체-가이드된 이펙터 단백질을 제거하기 위한 정제; (vi) 열 또는 화학적 스트레스 및 토홀드 정제; (vii) 과잉, 미결합된 및/또는 비-표적-결합된 중합체-가이드된 이펙터 단백질을 제거하기 위한 정제 및 토홀드 정제; 또는 (viii) 열 또는 화학적 스트레스, 과잉, 미결합된 및/또는 비-표적-결합된 중합체-가이드된 이펙터 단백질을 제거하기 위한 정제 및 토홀드 정제가 있을 수 있다.
표적 중합체/가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체가 결합되는 비드는 복합체를 기공에 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 비드는 자성일 수 있고 비드에 결합된 표적 중합체는 플로우셀 바로 밑에 배치된 자기장의 적용에 의해 기공을 포함하는 플로우셀의 웰로 당겨질 수 있거나, 중력에 의해 침강하도록 허용될 수 있다. 시퀀싱은, 비드를 막에 테더링하는, 비드 위로, 어댑터 단부에 혼성화하는 테더, 예컨대 올리고뉴클레오티드-콜레스테롤 테더를 흐르게 함으로써 개시될 수 있다. 대안적으로, 테더는 비드-표적 중합체 접합체가 첨가되기 전에 막에 도입될 수 있다. 예를 들어, 어댑터 단부에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드-콜레스테롤 테더는 비드-표적 중합체(들)가 첨가되기 전에 플로우셀을 통해서 실행 완충액 및 테더를 흐르게 함으로써 플로우셀에서 막에 통합될 수 있다. 이 상황에서, 비드-표적 중합체(들)가 플로우셀에 첨가되는 경우, 이들이 콜레스테롤에 의해 막에서 고정되는 올리고뉴클레오티드를 직면하는 때 이들은 막에 테더링된다.
일부 구현예에서, 표적 중합체는 나노기공 시퀀싱에 적응될 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 중합체의 모두는 본 방법의 단계 (a) 전에 한쪽 또는 양쪽 단부에 첨가된 시퀀싱 어댑터를 가질 수 있다. 샘플에서 중합체는 시퀀싱 어댑터의 첨가 전에 단편화될 수 있다. 대안적으로, 표적 중합체는 단계 (a) 후에 한쪽 또는 양쪽 단부에 첨가된 시퀀싱 어댑터를 가질 수 있다. 단계 (a) 후 샘플에서 중합체는 바람직하게는 단편화되고/거나 가이드 중합체 및/또는 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 표적 중합체에 가교된다. 이 구현예에서, 시퀀싱 어댑터는 비-표적 중합체로부터 표적의 분리 전에 또는 후에 첨가될 수 있다. 시퀀싱 어댑터는 중합체를 따라 움직일 수 있는 중합체 결합 단백질을 전형적으로 포함한다. 시퀀싱 어댑터가 단계 (a) 후에 첨가되는 때 중합체-가이드된 이펙터 단백질/가이드 중합체 복합체는 표적 중합체에 결합된 채로 남아있다. 어댑터의 결합 후, 일부 구현예에서, 일반적으로 표적 중합체가 어댑터 첨가 전에 비-표적 중합체로부터 분리된 경우, 중합체-가이드된 이펙터 단백질/가이드 중합체 복합체는 어댑터 상에서 로딩된 중합체를 따라 움직일 수 있는 중합체 결합 단백질에 의해 변위될 수 있다. 중합체를 따라 움직일 수 있는 중합체 결합 단백질에 의한 중합체-가이드된 이펙터 단백질/가이드 중합체 복합체의 변위는 중합체 결합 단백질이 중합체를 따라 움직이는데 필요한 하나 이상의 보조인자의 첨가에 의해 제어될 수 있다.
표적 중합체는 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질을 통해 표면, 예를 들면, 컬럼 또는 비드에 결합된 동안 이의 유리 단부의 어느 한쪽 또는 양쪽에 어댑터의 결찰에 의해 나노기공 시퀀싱에 적응될 수 있다. 단부는 dA-마감되어 어댑터 결합을 용이하게 할 수 있다.
표적 중합체
표적 중합체는 임의의 중합체일 수 있다. 적합한 중합체는, 비제한적으로, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 RNA 또는 DNA, 단백질, 폴리펩티드, 올리고당, 다당류, 또는 그들의 존재 또는 특징에 대한 정보가 가치 있는 기타 중합체를 포함한다.
표적 중합체는 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드는 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA의 1개 가닥에 혼성화된 RNA의 1개 가닥을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 알려진 임의의 합성 핵산, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 잠금된 핵산 (LNA) 또는 뉴클레오티드 측쇄가 있는 기타 합성 중합체일 수 있다. PNA 백본은 펩티드 결합에 의해 연결된 반복하는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성된다. GNA 백본은 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 반복하는 글리콜 단위로 구성된다. TNA 백본은 포스포디에스테르 결합에 의해 서로 연결된 반복하는 트레오스 당으로 구성된다. LNA는 리보스 모이어티에서 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 여분의 브리지를 갖는 위에서 논의된 대로 리보뉴클레오티드로부터 형성된다.
폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 DNA, RNA 또는 DNA 또는 RNA 하이브리드, 가장 바람직하게는 DNA이다. 표적 폴리뉴클레오티드는 가이드-폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질이 결합하는 이중 가닥 영역을 포함한다. 표적 폴리펩티드는 이중 가닥일 수 있다. 표적 폴리펩티드는 다른 구조, 예컨대 헤어핀 루프, 삼중체 및/또는 사중체가 있는 단일 가닥 영역 및 영역들을 포함할 수 있다. DNA/RNA 하이브리드는 동일한 가닥 상에서 DNA 및 RNA를 포함할 수 있다. 바람직하게는, DNA/RNA 하이브리드는 RNA 가닥에 혼성화된 1개 DNA 가닥을 포함한다.
표적 폴리뉴클레오티드는 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 길이가 적어도 10개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 길이가 1000개 이상 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍, 5000개 이상 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 또는 길이가 100000개 이상 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 50개 이하 뉴클레오티드, 예컨대 40개 이하, 30개 이하, 20개 이하, 10개 이하 또는 5개 이하 뉴클레오티드를 전형적으로 갖는 짧은 뉴클레오티드 중합체이다. 표적 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 길이가 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드, 예컨대 길이가 약 20 내지 약 25개 뉴클레오티드이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 15개, 약 16개, 약 17개, 약 18개, 약 19개, 약 20개, 약 21개, 약 22개, 약 23개, 약 24개, 약 25개, 약 26개, 약 27개, 약 28개, 약 29개 또는 약 30개 뉴클레오티드일 수 있다.
표적 중합체는 질환 및/또는 미생물과 연관된 중합체일 수 있다.
본 방법은 여러, 예컨대 약 2 내지 50개, 3 내지 40개, 4 내지 30개, 5 내지 25개, 6 내지 15개 또는 8 내지 10개 표적 중합체를 검출할 수 있다. 표적 중합체는 중합체의 한 그룹일 수 있다. 예를 들어, 그룹은 특정한 표현형과 연관될 수 있다. 그룹은 세포의 특정한 유형과 연관될 수 있다. 예를 들어, 그룹은 박테리아성 세포를 나타낼 수 있다. 그룹은 바이러스, 진균, 박테리아, 마이코박테리움 또는 기생충을 나타낼 수 있다.
표적 중합체는 특정한 질환 또는 병태와 연관된 바이오마커이거나 이를 포함하는 둘 이상의 중합체의 그룹일 수 있다. 바이오마커는 질환 또는 병태를 진단하거나 예측하는데 사용될 수 있다. 바이오마커의 적합한 패널은 예를 들어 Edwards, A.V.G. 등 (2008) Mol. Cell. Proteomics 7, p1824-1837; Jacquet, S. 등 (2009), Mol. Cell. Proteomics 8, p2687-2699; Anderson N.L. 등 (2010) Clin. Chem. 56, 177-185에 기재된 대로 당업계에서 알려진다. 질환 또는 병태는 바람직하게는 암, 관상동맥 심장 질환 및 심혈관 질환을 포함하는 심장 질환, 또는 감염성 질환, 예컨대 결핵 또는 패혈증이다.
표적 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 마이크로RNA (또는 miRNA) 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)이다. 둘 이상의 표적 폴리뉴클레오티드의 그룹은 둘 이상의 miRNA의 그룹일 수 있다. 본 발명에 사용을 위하여 적합한 miRNA는 당업계에서 잘 알려진다. 예를 들어, 적합한 miRNA는 공공으로 이용가능한 데이터베이스에 저장된다 (Jiang Q., Wang Y., Hao Y., Juan L., Teng M., Zhang X., Li M., Wang G., Liu Y., (2009) miR2Disease: 인간 질환에서 마이크로RNA 규제완화를 위하여 수동으로 선별된 데이터베이스. Nucleic Acids Res.).
표적 중합체는 바람직하게는 리더 서열을 포함한다. 이러한 서열은 WO 2018/060740에 개시된다.
중합체-가이드된 이펙터 단백질
중합체-가이드된 이펙터 단백질은 가이드 중합체를 통해 표적 중합체에 결합하는 임의의 단백질일 수 있다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질은, 비-제한 예로써, 표적 중합체의 부분에 결합하는 가이드 올리고뉴클레오티드, 예컨대 압타머, 또는 가이드 폴리펩티드, 예컨대 항체에 결합할 수 있거나 부착될 수 있다.
중합체-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질이다. 이 구현예에서, 가이드 중합체는 바람직하게는 가이드 폴리뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질은 가이드 폴리뉴클레오티드에 결합하거나 부착되는 그리고 가이드 폴리뉴클레오티드가 결합하는 표적 중합체, 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하는 임의의 단백질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드 인식 도메인 및 적어도 하나의 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 인식 도메인은 가이드 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, RNA) 및 표적 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, DNA)를 결합시킨다. 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽 가닥을 컷팅하는 1개 뉴클레아제 도메인을 함유할 수 있거나, 제1 뉴클레아제 도메인이 표적 폴리뉴클레오티드의 1개 가닥의 절단을 위하여 위치되고 제2 뉴클레아제 도메인이 표적 폴리뉴클레오티드의 상보적 가닥의 절단을 위하여 위치되는 2개 뉴클레아제 도메인을 함유할 수 있다. 뉴클레아제 도메인은 활성 또는 불활성일 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 도메인 또는 2개 뉴클레아제 도메인 중 한쪽 또는 양쪽은 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있다.
가이드 폴리뉴클레오티드는 가이드 RNA, 가이드 DNA, 또는 양쪽 DNA 및 RNA를 함유하는 가이드일 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 가이드 RNA이다. 그러므로, 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 RNA-가이드된 이펙터 단백질이다.
RNA-가이드된 이펙터 단백질은 가이드 RNA에 결합하거나 부착되는 임의의 단백질일 수 있다. RNA-가이드된 이펙터 단백질은 전형적으로 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하는 가이드 RNA의 영역이 아닌 가이드 RNA의 영역에 결합한다. 예를 들어, 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 경우, RNA-가이드된 이펙터 단백질은 전형적으로 tracrRNA에 결합하고 crRNA는 전형적으로 표적 중합체, 예컨대 표적 폴리뉴클레오티드에 결합한다. RNA-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 또한 표적 폴리뉴클레오티드에 결합한다. 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하는 가이드 RNA의 영역은 RNA-가이드된 이펙터 단백질에 또한 결합할 수 있다. RNA-가이드된 이펙터 단백질은 전형적으로 표적 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 영역에 결합한다. RNA-가이드된 이펙터 단백질이 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드의 영역은 전형적으로 가이드 RNA가 혼성화하는 서열에 가까이 자리한다. 가이드 RNA 및 RNA-가이드된 이펙터 단백질은 전형적으로 복합체를 형성하고, 이 복합체는 그 다음 가이드 RNA의 서열에 의해 결정된 부위에서 표적 폴리뉴클레오티드에 결합한다.
RNA-가이드된 이펙터 단백질은 가이드 RNA가 결합하는 서열의 업스트림 또는 다운스트림 결합할 수 있다. 예를 들어, RNA-가이드된 이펙터 단백질은 가이드 RNA가 결합하는 서열 옆에 자리잡은 DNA에서 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에 결합할 수 있다. PAM은 짧은 (10개 미만, 전형적으로 2 내지 6개 염기 쌍) 서열, 예컨대 5'-NGG-3' (식중 N은 임의의 염기임), 5'-NGA-3', 5'-YG-3' (식중 Y는 피리미딘임), 5'TTN-3' 또는 5'-YTN-3'이다. 상이한 RNA-가이드된 이펙터 단백질은 상이한 PAM에 결합한다. RNA-가이드된 이펙터 단백질은, 특히, 표적이 RNA 또는 DNA/RNA 혼성인 경우, PAM을 포함하지 않는 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있다.
RNA-가이드된 이펙터 단백질은 전형적으로 뉴클레아제, 예컨대 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제이다. RNA-가이드된 이펙터 단백질은 전형적으로 Cas 단백질이다. RNA-가이드된 이펙터 단백질은 Cas, Csn2, Cpf1, Csf1, Cmr5, Csm2, Csy1, Cse1 또는 C2c2일 수 있다. Cas 단백질은 Cas3, Cas 4, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas10 또는 Cas10d일 수 있다. 바람직하게는, Cas 단백질은 Cas9이다. Cas, Csn2, Cpf1, Csf1, Cmr5, Csm2, Csy1 또는 Cse1은 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥 DNA 영역을 포함하는 경우 사용된다. C2c2는 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥 RNA 영역을 포함하는 경우 사용된다.
DNA-가이드된 이펙터 단백질, 예컨대 RecA 계열로부터 단백질은 DNA를 표적하는데 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 RecA 계열로부터 단백질의 예는 RecA, RadA 및 Rad51이다. RNA-가이드된 엔도뉴클레아제의 뉴클레아제 활성은 디스에이블될 수 있다. RNA-가이드된 엔도뉴클레아제의 촉매적 뉴클레아제 부위의 하나 이상은 불활성화될 수 있다. 예를 들어, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제가 2개 촉매적 뉴클레아제 부위를 포함하는 경우, 촉매적 부위의 한쪽 또는 양쪽은 불활성화될 수 있다. 전형적으로, 촉매적 부위의 한쪽은 이것이 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드의 1개 가닥을 컷팅할 것이고 다른 촉매적 부위는 폴리뉴클레오티드의 반대 가닥을 컷팅할 것이다. 그러므로, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 표적 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 영역의 양쪽 가닥, 한쪽 가닥을 컷팅할 수 있거나 어느 가닥도 컷팅하지 않을 수 있다.
폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 Cas9이다. Cas9는 표적 인식 및 뉴클레아제 엽을 포함하는 이중-엽상, 다중-도메인 단백질 구조를 갖는다. 인식 엽은 가이드 RNA 및 DNA를 결합시킨다. 뉴클레아제 엽은 표적 DNA의 상보적 및 비-상보적 가닥의 절단을 위하여 위치하는 HNH 및 RuvC 뉴클레아제 도메인을 함유한다. Cas 9의 구조는 Nishimasu, H., 등, (2014) 가이드 RNA 및 표적 DNA가 있는 복합체내 Cas9의 결정 구조. Cell 156, 935-949에 상세된다. Cas9에 대하여 관련한 PDB 참조는 5F9R (표적 DNA 절단을 위하여 프라이밍된 단일-가이드된 RNA 및 이중-가닥 DNA가 있는 복합체내 촉매적으로-활성 연쇄상 구균 CRISPR-Cas9의 결정 구조)이다.
Cas9는 야생형 Cas9와 비교하여 감소된 오프-표적 결합을 보여주는 '향상된 특이성' Cas9일 수 있다. 이러한 '향상된 특이성' Cas9의 예는 연쇄상 구균 Cas9 D10A/H840A/K848A/K1003A/R1060A이다. ONLP12296는 TEV-절단가능한 링커가 있는 C-말단 Twin-Strep-태그를 갖는 연쇄상 구균 Cas9 D10A/H840A/K848A/K1003A/R1060A의 아미노산 서열이다.
RNA-가이드된 엔도뉴클레아제의 촉매적 부위는 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있다. 돌연변이는 치환, 삽입, 또는 결실 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산은 촉매적 부위에 치환되거나 삽입되거나 상기로부터 결실될 수 있다. 돌연변이는 촉매적 부위에 단일 아미노산이 있다면 바람직하게는 치환 삽입이고, 더욱 바람직하게는 치환이다. 당업자는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제의 촉매적 부위 및 이들을 불활성화시키는 돌연변이를 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 예를 들어, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제가 Cas9인 경우, 하나의 촉매적 부위는 D10에 돌연변이에 의해 그리고 다른 것은 H640에 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드를 컷팅하지 않고 그래서 방향성 편향 없음을 보여주는 불활성화된 ('죽은') 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질. 표적 폴리뉴클레오티드를 컷팅하는 활성 ('살아있는') 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질은 컷트 부위의 2개 단부의 겨우 한쪽에 결합된 채로 남아있을 수 있고 그래서 일부 방향성 편향을 보여줄 수 있다.
중합체-가이드된 이펙터 단백질은 전형적으로 장기간 동안 표적 중합체에 결합된 채로 남아있다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 적어도 약 1 내지 적어도 약 10, 예컨대 약 2 내지 약 8 시간 또는 약 4 내지 약 6 시간 동안 표적 중합체에 결합된 채로 남아있다.
중합체-가이드된 이펙터 단백질은 전형적으로 표적 중합체에, 만약 존재한다면, 결합된 채로 남아있고, 복합체의 부분으로서 기공을 통해서 전좌한다. 단백질의 전좌는 본 발명에 따라 측정되고 정보를 제공하는 전기적 또는 전류 효과를 생산한다. 이것은 아래 더욱 상세히 논의된다.
중합체-가이드된 이펙터 단백질은 본 발명의 방법에서 사용을 위하여 특이적으로 변형될 수 있다. 단백질은 막에 커플링할 수 있는 앵커, 예컨대 콜레스테롤을 포함할 수 있다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 거기에 부착된 표면에 커플링할 수 있는 결합 모이어티를 갖는다. 표면은 바람직하게는 비드의 표면이다.
가이드 중합체
가이드 중합체는 표적 중합체에 결합할 수 있고 표적 중합체에 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 결합을 매개할 수 있다. 가이드 중합체는 표적 중합체에 결합하는 것을 가능하게 하는 임의의 구조를 가질 수 있다. 표적 중합체에 관하여 위에 논의된 중합체의 임의의 것일 수 있다. 가이드 중합체는 바람직하게는 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단백질, 올리고당, 또는 다당류이다. 가이드 폴리펩티드 또는 단백질은 바람직하게는 징크 핑거 결합 단백질, 전사 활성제-유사 이펙터 (TALE), 전사 인자, 제한 효소, DNA-결합 단백질 또는 효소, 항체, 또는 항체 단편이다. 적합한 항체 단편은 당업계에서 알려지고, 비제한적으로, Fab, Fab', (Fab')2, FV, scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Bis-scFv, 미니바디, Fab2 및 Fab3을 포함한다. 가이드 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 압타머이다.
가이드 중합체는 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 결합할 수 있다. 이 맥락에서, 가이드 중합체는 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 결합할 수 있거나, 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 의해 결합될 수 있거나 양쪽일 수 있다. 가이드 중합체는 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 부착될 수 있다. 예를 들어 스트렙타비딘/비오틴을 사용하여, 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 가이드 중합체를 부착하기 위한 적합한 방법은 당업계에서 알려진다. 중합체-가이드된 이펙터는 바람직하게는 가이드 중합체에 공유적으로 부착된다. 예를 들어 클릭 화학을 사용하는 공유 부착은 WO 2018/060740에 논의된다.
가이드 중합체는 바람직하게는 가이드 폴리뉴클레오티드이다. 이 경우에, 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질이다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 표적 중합체에 결합할 수 있거나 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 서열을 포함한다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 표적 중합체에서 서열에 결합하는 뉴클레오티드 서열 및 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질에 결합하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드에서 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열 및 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질에 결합하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 표적 중합체에 결합/혼성화하고 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질에 결합하는 것을 가능하게 하는 임의의 구조를 가질 수 있다.
표적 중합체가 폴리뉴클레오티드이면, 가이드 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 표적 폴리뉴클레오티드에서 약 20개 뉴클레오티드의 서열에 혼성화한다. 가이드 폴리뉴클레오티드가 결합하는 서열은 약 10 내지 약 40개, 예컨대 약 15 내지 약 30개, 바람직하게는 약 18 내지 약 25개, 예컨대 약 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오티드일 수 있다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 표적 폴리뉴클레오티드의 이중 가닥 영역 중 1개 가닥에 상보적이다. 가이드 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에, 또는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 서열에 상보적인 약 10 내지 약 40개, 예컨대 약 15 내지 약 30개, 바람직하게는 약 18 내지 약 25개, 예컨대 약 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상보성의 정도는 바람직하게는 정확하다.
가이드 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 가이드 RNA이다. 가이드 RNA는 PAM에 대해 5'인 표적 폴리뉴클레오티드에서 한 영역에 상보적일 수 있다. 이것은 표적 폴리뉴클레오티드가 DNA를 포함하는 경우, 특히 RNA 이펙터 단백질이 Cas9 또는 Cpf1인 경우 바람직하다. 가이드 RNA는 구아닌에 의해 측접되는 표적 폴리뉴클레오티드에서 한 영역에 상보적일 수 있다. 이것은 표적 폴리뉴클레오티드가 RNA를 포함하는 경우, 특히 RNA 이펙터 단백질이 C2c2인 경우 바람직하다.
가이드 RNA는 표적 폴리뉴클레오티드에 그리고 RNA-가이드된 이펙터 단백질에 결합하는 것을 가능하게 하는 임의의 구조를 가질 수 있다. 가이드 RNA는 표적 폴리뉴클레오티드에서의 서열에 결합하는 crRNA 및 tracrRNA를 포함할 수 있다. tracrRNA는 전형적으로 RNA-가이드된 이펙터 단백질에 결합한다. 가이드 RNA의 전형적 구조는 당업계에서 알려진다. 예를 들어, crRNA는 전형적으로 단일 가닥 RNA이고 tracrRNA는 전형적으로 1개 가닥이 crRNA의 3' 단부에 부착되는 이중 가닥 영역 및 crRNA에 부착되지 않는 가닥의 3' 단부에 헤어핀 루프를 형성하는 부분을 갖는다. crRNA 및 tracrRNA는 단일 조각 sgRNA로서 시험관내 전사될 수 있다. 가이드 RNA는 바람직하게는 sgRNA이다
가이드 RNA는 다른 구성요소, 예컨대 추가의 RNA 염기 또는 DNA 염기 또는 다른 핵염기를 포함할 수 있다. 가이드 RNA에서 RNA 및 DNA 염기는 천연 염기 또는 변형된 염기일 수 있다. 가이드 DNA는 가이드 RNA 대신 사용될 수 있고, DNA-가이드된 이펙터 단백질은 RNA-가이드된 이펙터 단백질 대신에 사용될 수 있다. 가이드 DNA 및 DNA-가이드된 이펙터 단백질의 사용은 표적 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 바람직할 수 있다.
가이드 중합체는 본 발명의 방법에서 사용을 위하여 특이적으로 변형될 수 있다. 본 방법은, (i) 바코드 및/또는 리더 서열을 임의로 포함하는, 어댑터 서열, 및/또는 (ii) 막에 커플링할 수 있는 앵커를 포함하는 가이드 중합체, 특히 가이드 RNA를 사용할 수 있다. 앵커는 바람직하게는 콜레스테롤이다. 앵커는 바람직하게는 가이드 중합체 상에서 확장에 혼성화된 폴리뉴클레오티드를 통해 가이드 중합체, 예컨대 가이드 폴리뉴클레오티드에 부착된다. 표적 중합체는 바람직하게는 거기에 부착된 막에 커플링할 수 있는 앵커를 갖고 가이드 중합체는 바람직하게는 거기에 부착된 어댑터 및/또는 리더 서열을 갖는다.
가이드 중합체는 바람직하게는 거기에 부착된 표면에 커플링할 수 있는 결합 모이어티를 갖는다. 표면은 비드의 표면이다. 결합 모이어티는 바람직하게는 가이드 폴리뉴클레오티드 상에서 단부 확장이다. 가이드 중합체는 바람직하게는 가이드 폴리뉴클레오티드 상에서 임의로 단부 확장인, 2개 결합 모이어티를 포함한다.
가이드 중합체는 (i) 어댑터 및/또는 (ii) 막에 커플링할 수 있는 앵커가 부착되는 본원에 논의된 가이드 중합체 중 임의의 것일 수 있다.
(i) 앵커 또는 (ii) 어댑터는 tracrRNA의 5' 단부, tracrRNA의 3' 단부, crRNA의 3' 단부에, 또는 내부적으로 존재할 수 있고, 예를 들어, 여기서 tracrRNA 및 crRNA는 sgRNA에 포함된다. (i) 앵커 또는 (ii) 어댑터는 crRNA의 5' 단부에, 예를 들면, 화학적 기 또는 스페이서를 통해 첨가될 수 있다. (i) 앵커 또는 (ii) 어댑터는 가이드 중합체에 화학적 기 또는 스페이서를 통해 첨가될 수 있다. (i) 앵커 또는 (ii) 어댑터는 가이드 중합체의 5' 또는 3' 단부에, 예컨대 tracrRNA의 5' 또는 3' 단부 또는 crRNA의 5' 또는 3' 단부에 임의의 적합한 수단, 예를 들면, 결찰에 의해, 화학적 기, 예를 들면, 티올, 클릭 기, 비오틴 등을 통해, 또는 DNA, RNA, PNA, BNA, LNA, TNA 스페이서를 통해 부착될 수 있다. 스페이서가 폴리뉴클레오티드인 경우, 스페이서는 약 1 내지 약 30개, 예컨대 약 2 내지 약 20개, 약 3 내지 약 15개, 약 4 내지 약 10개, 예컨대 약 5, 6, 7 8 또는 9개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
앵커는 가이드 중합체에서 단부 확장, 또는 내부 루프 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 (앵커 올리고뉴클레오티드)에 부착될 수 있다. tracrRNA의 5' 단부, tracrRNA의 3' 단부, crRNA의 3' 단부 또는 crRNA의 5' 단부는, 예를 들어, 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 단부 확장을 가질 수 있다. 앵커 올리고뉴클레오티드는 단부 확장과 동일한 길이를 가질 수 있거나, 앵커 올리고뉴클레오티드는 단부 확장보다 더 길거나 더 짧을 수 있고, 다만 앵커 올리고뉴클레오티드 및 단부 확장은 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 상보적인 서열을 갖는다. 앵커 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 내부 루프 서열은 위에 특정된 길이 중 임의의 것을 가질 수 있다.
가이드 중합체는 합성적으로 변형될 수 있다. 양쪽 crRNA 및 tracrRNA의 5' 및 3' 단부는 변형될 수 있다. 본원에 참조로 편입된, Lee 등, (2017) 합성적으로 변형된 가이드 RNA 및 공여체 DNA는 CRISPR-Cas9 조작을 위한 다목적 플랫폼이다. eLIFE;6:e25312 참조. 합성 변형은 DNA, RNA, PNA, LNA, BNA, DNA 스페이서, RNA 스페이서 및 무염기성 스페이서 예를 들면, Sp18을 포함하는, 가이드 RNA (또는 가이드 DNA)에 변형된 또는 인공 염기의 편입을 포함할 수 있다. 대안적으로 변형은 뉴클레오티드 염기 예컨대 평면 소수성 분자, 화학적 태그, 형광성 분자, 압타머 서열, 아민, 아지드, 알킨, 티올, 클릭 기, 비오틴에 구조적으로 관련되지 않은 화학적 모이어티를 이용한 변형을 포함할 수 있다.
가이드 중합체가 가이드 폴리뉴클레오티드이면, 가이드 폴리뉴클레오티드는 거기에 부착된 폴리뉴클레오티드를 따라 움직일 수 있는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 5' 단부에 전형적으로 가까운, 가이드 폴리뉴클레오티드의 가닥의 한쪽 단부에 가까이 결합될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 결합 단백질이 결합되는 단부는 어댑터, 바람직하게는 리더 서열을 포함하는 어댑터의 첨가에 의해 전형적으로 변형된다. 가이드 RNA가 리더 서열을 포함하는 경우 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 리더 서열에 전형적으로 결합된다.
가이드 RNA가 crRNA를 포함하는 경우, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질은 crRNA를 따라 움직일 수 있도록 위치할 수 있다. 이러한 가이드 RNA는 표적 중합체의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 기공을 통해서 crRNA가 전좌하는 본 방법에 유용하다.
가이드 중합체는 표면, 예컨대 비드 또는 컬럼 상에서 표적 중합체의 포획을 가능하게 하도록 특이적으로 적응될 수 있다. 이것은 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체가 결합되는 표적 중합체가 포획되게 하고 샘플에서 비-표적 중합체로부터 분리되도록 하고, 그 다음 세정 제거될 수 있다. 가이드 중합체는 표면에, 예컨대 비드 또는 컬럼에 결합되는 포획 올리고뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 갖는, 3' 또는 5' 단부에서 단부 확장을 포함할 수 있다. 예를 들어, 포획 올리고뉴클레오티드는 표면에 친화성 태그에 의해 결합될 수 있다. 임의의 적합한 친화성 태그는 사용될 수 있다. 하나의 예는 비오틴-스트렙타비딘 친화성 태그이다. 포획 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이 또는 약 10 내지 약 80개, 예컨대 약 20 내지 약 60개 또는 약 30 내지 약 50개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 40개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 단부 확장은 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 포획 올리고뉴클레오티드는 단부 확장과 동일한 길이를 가질 수 있거나, 포획 올리고뉴클레오티드는 단부 확장보다 더 길거나 더 짧을 수 있고, 다만 포획 올리고뉴클레오티드 및 단부 확장은 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이에 걸쳐 상보적인 서열을 갖는다.
가이드 중합체는 제1 결합 모이어티 및 제2 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 제1 결합 모이어티 및 제2 결합 모이어티 양쪽은 가이드 중합체 상에서 단부 확장, 또는 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 있는 다른 단일 가닥 중합체 서열일 수 있다. 가이드 중합체 상에서 제1 단부 확장은 제1 포획 표면, 예를 들면, 비드 상에서 제1 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열을 가질 수 있고, 가이드 중합체 상에서 제2 단부 확장은 제2 포획 표면, 예를 들면, 비드 상에서 제2 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 이것을 구성하는 하나의 식으로 crRNA는 비드, 컬럼, 또는 표면 상에서 표적 분자의 포획에 사용된 3' DNA 확장을 포함하고 tracrRNA는 5' DNA 확장을 포함한다. 일 구현예에서, 제1 단부 확장은, 제1 포획 올리고뉴클레오티드에서 서열에 상보적이지 않은 서열을 갖는, 5' 단부 확장에서 5' 단부에 또는 3' 단부 확장에서 3' 단부에 있는, 단부 부문, 및 제1 포획 올리고뉴클레오티드에서 제1 서열에 상보적인 서열을 갖는 한 부문을 포함한다. 제1 단부 확장의 단부 부문은 전형적으로 약 2 내지 약 10개 뉴클레오티드, 예컨대 약 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 제1 포획 올리고뉴클레오티드에 상보적인 제1 단부 확장의 부문은 전형적으로 약 5 내지 약 40개, 예컨대 약 10 내지 약 30개 또는 약 15 내지 약 25개 뉴클레오티드, 예를 들어 약 20개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
제2 단부 확장은 제1 포획 뉴클레오티드, 제1 단부 확장 또는 경쟁자 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 서열을 갖는다. 제2 포획 올리고뉴클레오티드는 또한 제1 포획 뉴클레오티드, 제1 단부 확장 또는 경쟁자 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 서열을 갖는다. 단부 확장은 가이드 중합체의 5' 또는 3' 단부에, 예컨대 tracrRNA의 5' 또는 3' 단부 또는 crRNA의 5' 또는 3' 단부에 부착될 수 있다. 단부 확장은 임의의 적합한 수단에 의해 가이드 중합체에 부착될 수 있다. 단부 확장은, 예를 들어, 화학적 기 또는 스페이서, 예를 들면, 결찰을 통해, 화학적 기, 예를 들면, 티올, 클릭 기, 비오틴 등을 통해, 또는 DNA, RNA, PNA, BNA, LNA, TNA 스페이서를 통해 첨가될 수 있다. 스페이서가 폴리뉴클레오티드인 경우, 스페이서는 약 1 내지 약 30개, 예컨대 약 2 내지 약 20개, 약 3 내지 약 15개, 약 4 내지 약 10개, 예컨대 약 5, 6, 7, 8 또는 9개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 단부 확장은, tracrRNA 및 crRNA가 sgRNA에서 포함되는, 예를 들어, tracrRNA의 5' 단부, tracrRNA의 3' 단부, crRNA의 3' 단부, crRNA의 5' 단부에 존재할 수 있거나 가이드 RNA에 내부적으로 첨가된 서열에 의해 치환될 수 있다. 내부 서열이 단부 확장을 위하여 본원에 기재된 기능을 수행하는데 사용되는 경우, 가이드 중합체 내에서 루프 구조에서 전형적으로 존재하거나, 달리 포획 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화를 위하여 접근가능하다.
샘플
샘플은 임의의 적합한 샘플일 수 있다. 샘플은 전형적으로 표적 중합체 중 적어도 하나를 함유한다고 알려지거나 함유할 것으로 의심되는 것이다. 본 방법은 기공에 전달을 위하여 표적 중합체를 선택하는데 사용될 수 있다. 샘플의 다른 구성요소는 세정 제거될 수 있고, 예를 들어, 이들은 기공을 포함하는 세포 밖으로 분출될 수 있다. 이러한 기타 구성요소는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 폴딩 또는 언폴딩될 수 있는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 중합체, 예컨대 비-표적 중합체, 및 세포 파편.
샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 본 발명은 임의의 생물 또는 미생물에서 수득되거나 추출된 샘플 상에서 시험관내 실시될 수 있다. 생물 또는 미생물은 전형적으로 고세균, 원핵 또는 진핵이고 전형적으로 5개 계: 식물계, 동물계, 균계, 모네라계 및 원생생물계 중 하나에 속한다. 본 발명은 임의의 바이러스에서 수득되거나 추출된 샘플 상에서 시험관내 실시될 수 있다.
샘플은 바람직하게는 유체 샘플이다. 샘플은 전형적으로 체액을 포함한다. 체액은 인간 또는 동물로부터 수득될 수 있다. 인간 또는 동물은 질환을 앓고 있거나, 앓고 있다고 의심되거나, 이의 위험에 처할 수 있다. 샘플은 소변, 림프, 타액, 점액, 정액, 또는 양수일 수 있지만, 바람직하게는 전혈, 혈장, 또는 혈청이다. 전형적으로, 샘플은 기원이 인간이지만, 대안적으로 또 다른 포유동물에서 예컨대 상업적으로 사육된 동물 예컨대 말, 소, 양, 또는 돼지에서 나올 수 있거나 대안적으로 애완동물 예컨대 고양이 또는 개일 수 있다.
대안적으로, 식물 기원의 샘플은 상업적 작물, 예컨대 시리얼, 콩류, 과일, 또는 야채, 예를 들어 밀, 보리, 귀리, 카놀라, 옥수수, 콩, 쌀, 바나나, 사과, 토마토, 감자, 포도, 담배, 강낭콩, 렌즈콩, 사탕수수, 코코아, 면화, 차, 또는 커피로부터 전형적으로 수득된다.
샘플은 비-생물학적 샘플일 수 있다. 비-생물학적 샘플은 바람직하게는 유체 샘플이다. 비-생물학적 샘플의 예는 수술적 유체, 물 예컨대 식수, 해수 또는 하천수, 및 실험실 테스트를 위한 시약을 포함한다.
샘플은, 예를 들어 원심분리에 의해 또는 원치 않는 분자 또는 세포, 예컨대 적혈구를 걸러내는 막 통과에 의해 검정되기 전에 가공될 수 있다. 샘플은 채취시 바로 측정될 수 있다. 샘플은 또한 전형적으로 검정 전에, 바람직하게는 -70℃ 미만에서 보관될 수 있다.
샘플은 게놈성 DNA를 포함할 수 있다. 게놈성 DNA는 단편화될 수 있거나 본 방법의 단계 (a)는 게놈성 DNA를 단편화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. DNA는 임의의 적합한 방법에 의해 단편화될 수 있다. 예를 들어, DNA를 단편화하는 방법은 당업계에서 알려진다. 이러한 방법은 트랜스포사제, 예컨대 MuA 트랜스포사제를 사용할 수 있다.
샘플은 T-세포 DNA를 포함할 수 있다.
샘플은 비-표적 중합체를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 표적 폴리뉴클레오티드 및 비-표적 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자 또는 게놈에서 유래될 수 있다.
전기적 측정 및 효과
단계 (c)는 막에 걸쳐서 전위를 인가하는 단계를 포함한다. 인가된 전위는 전압 전위일 수 있다. 대안적으로, 인가된 전위는 화학적 전위일 수 있다. 이것의 예는 막, 예컨대 아래 논의된 막 중 임의의 것에 걸쳐서 염 구배를 사용하는 것이다. 염 구배는 Holden 등, J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27):8650-5에 개시된다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드가 기공에 관하여 움직임에 따라 기공을 통과하는 전류는 폴리뉴클레오티드의 서열을 추정하거나 결정하는데 사용된다. 이것은 가닥 시퀀싱이다.
단계 (c)는 또한 하나 이상의 전기적 측정을 하는 단계를 포함한다. 적합한 전기적 측정은, 비제한적으로, 전류 측정, 전도도 측정, 커패시턴스 측정, 임피던스 측정, 터널링 측정 (Ivanov AP 등, Nano Lett. 2011 Jan 12; 11(1):279-85), 및 FET 측정 (국제 출원 WO 2005/124888)을 포함한다. 이들 측정의 임의의 수 및 조합은 본 방법에서 이루어질 수 있다. 하나 이상의 전기적 측정은 경막 전류 측정, 예컨대 기공을 통해서 흐르는 이온성 전류의 측정을 포함할 수 있다.
하나 이상의 광학적 측정은 하나 이상의 전기적 측정 (Soni GV 등, Rev Sci Instrum. 2010 Jan; 81(1):014301)과 조합될 수 있다. 하나 이상의 광학적 측정은 Chen 등, Nat Commun 9, 1733 (2018)에 기재된 것들일 수 있다.
전기적 측정은 Stoddart D 등, Proc Natl Acad Sci, 12;106(19):7702-7, Lieberman KR 등, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72, 및 국제 출원 WO 2000/28312에 기재된 대로 표준 단일 채널 기록 장비를 사용하여 이루어질 수 있다. 대안적으로, 전기적 측정은 예를 들어 국제 출원 WO 2009/077734 및 국제 출원 WO 2011/067559에 기재된 대로 다중-채널 시스템을 사용하여 이루어질 수 있다.
단계 (c)는 바람직하게는 막에 걸쳐서 전위차를 인가하고 기공을 통해서 흐르는 전류를 측정하는 단계를 포함한다. 단계 (d)는 바람직하게는 기공을 통해서 복합체의 전좌에서 비롯하는 전류 효과의 존재 또는 부재를 모니터링하고 이에 의해 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다.
단계 (d)는 기공을 통해서 복합체의 전좌에서 비롯하는 전기적 효과, 바람직하게는 전류 효과의 존재 또는 부재를 모니터링하고 이에 의해 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 효과는 이것이 전좌함에 따라 기공과 상호작용하는 가이드 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질 및 표적 폴리뉴클레오티드에 의해 형성된 복합체를 나타낸다. 기공을 통해서 전좌하는 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질과만 연관된 전기적 또는 전류 효과가 보여지면, 표적 중합체는 샘플에 없다. 기공을 통해서 전좌하는 복합체 (즉, 가이드 중합체, 중합체-가이드된 이펙터 단백질, 및 표적 중합체)와 연관된 전기적 또는 전류 효과가 보여지면, 표적 중합체는 샘플에서 존재한다. 2개 효과 사이 차이는 아래 논의된다.
효과는 복합체, 표적 폴리뉴클레오티드, 또는 가이드 폴리뉴클레오티드의 구성요소 중 하나에 부착된 어댑터의 기공을 통해서 전좌에 의해 또한 유발될 수 있다. 이 경우에, 효과는 복합체, 표적 폴리뉴클레오티드, 또는 가이드 폴리뉴클레오티드의 구성요소 중 하나에 부착된 어댑터의 기공을 통해서 전좌를 나타낸다. 본 방법은 바람직하게는 기공과 어댑터의 상호작용의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 어댑터는 바람직하게는 바코드를 포함한다.
효과는 하나 이상의 전기적 측정을 사용하여 모니터링된다. 효과는 전형적으로 하나 이상의 전기적 측정의 하나 이상 양태에서의 측정된 변화이다. 하나 이상의 양태는, 비제한적으로, 하나 이상의 전기적 측정의 수량, 지속기간, 일관성, 및 복잡성을 포함한다. 지속기간이 체류 시간으로서 또한 알려지는 것은 효과가 생물학적 기공에서 체류하는 복합체 또는 이의 한 부분에 관련하기 때문이다. 이들 양태의 일부는 아래 더욱 상세히 논의된다. 효과는 바람직하게는 기공을 통해서 흐르는 전류의 하나 이상의 양태, 예컨대 수량, 지속기간, 일관성, 및 복잡성 중 하나 이상에서의 측정된 변화이다.
복합체는 (그저 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질과 반대로) 기공을 통해서 복합체의 전좌에서 비롯하는 전기적 또는 전류 효과가 표적 중합체의 존재에 대한 정보 그리고 양쪽 표적 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 대한 정보를 제공하도록 만약 존재한다면, 표적 중합체, 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및 가이드 중합체를 포함한다. 부피가 큰 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 기공과 상호작용하고 전좌함에 따라 기공의 개구부 내에서 공간을 차지하고 그래서 전형적으로 하나 이상의 전기적 측정, 예컨대 전류 흐름 상에서 오랜, 뚜렷한, 및 복잡한 효과를 초래한다. 대조적으로, 표적 중합체는 더 적은 상호작용 및 기공 개구부의 더 적은 차단으로 기공을 통해서 빨리 움직이고 그래서 전형적으로 하나 이상의 전기적 측정, 예컨대 전류 흐름 상에서 더 짧은, 덜 뚜렷한, 및 덜 복잡한 효과를 갖는다. 이들 상이한 효과는 본 발명의 방법이 표적 중합체가 존재하는지 여부를 결정하도록 한다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및 결합된/부착된 가이드 중합체의 효과만이 보여지면 표적 중합체는 없다. 표적 중합체 효과가 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및 결합된/부착된 가이드 중합체의 효과 이외에도 보여지면 표적 중합체는 존재한다.
기공을 통해서 복합체의 중합체-가이드된 이펙터 단백질 부분의 전좌는 바람직하게는 기공을 통해서 전좌하는 복합체의 표적 중합체 부분과 연관된 전기적 효과보다 (i) 더 오랜, (ii) 더욱 뚜렷한 및 (iii) 더욱 복잡한 중 하나 이상인 전기적 효과를 초래한다. 기공을 통해서 복합체의 중합체-가이드된 이펙터 단백질 부분의 전좌는 바람직하게는 기공을 통해서 전좌하는 복합체의 표적 중합체 부분과 연관된 전기적 효과보다 (i), (ii), (iii), (i) 및 (ii), (i) 및 (iii), (ii) 및 (iii) 또는 (i), (ii) 및 (iii)인 전기적 효과를 초래한다. 기공을 통해서 복합체의 중합체-가이드된 이펙터 단백질 부분의 전좌는 바람직하게는 기공을 통해서 전좌하는 복합체의 표적 중합체 부분과 연관된 전기적 효과보다 (i) 더 오랜, (ii) 더욱 뚜렷한 및 (iii) 더욱 복잡한 전기적 효과를 초래한다. 이들 구현예에서, 가이드 중합체는 이것이 전좌함에 따라 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 전형적으로 결합/부착된다. 가이드 중합체는 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 공유적으로 부착될 수 있다. 부피가 큰 단백질의 효과는 전형적으로 결합된/부착된 가이드 중합체의 임의의 관찰가능한 효과를 차폐시킨다.
기공을 통해서 전좌하는 단백질에서 비롯하는 효과가 기공을 통해서 전좌하는 표적 중합체에서 비롯하는 효과보다 더 오랜 지속기간 (또는 더 많은 시간) 동안 발생하면 효과는 더 오래 간다. 기공을 통해서 전좌하는 단백질에서 비롯하는 하나 이상의 전기적 측정의 수량에서의 변화가 기공을 통해서 전좌하는 표적 중합체에서 비롯하는 하나 이상의 전기적 측정의 수량에서의 변화보다 더 오랜 지속기간 (또는 더 많은 시간) 동안 발생하면 효과는 더 오래 간다.
기공을 통해서 전좌하는 단백질에서 비롯하는 효과가 기공을 통해서 전좌하는 표적 중합체에서 비롯하는 효과보다 더 크면 효과는 더욱 뚜렷하다. 기공을 통해서 전좌하는 단백질에서 비롯하는 하나 이상의 전기적 측정의 수량에서의 변화 양이 기공을 통해서 전좌하는 표적 중합체에서 비롯하는 하나 이상의 전기적 측정의 수량에서의 변화보다 더 크면 효과는 더욱 뚜렷하다.
더욱 복잡한 효과는 바람직하게는 기공을 통해서 전좌하는 표적 중합체에서 비롯하는 효과와 비교된 때 (i) 불일치함, (ii) 시끄러움 및 (iii) 스텝핑 이벤트 포함인, 기공을 통해서 전좌하는 중합체-가이드된 이펙터 단백질에서 비롯하는 효과를 포함한다. 더욱 복잡한 효과는 바람직하게는 기공을 통해서 전좌하는 표적 중합체에서 비롯하는 하나 이상의 전기적 측정 중 하나 이상의 양태에서의 측정된 변화와 비교된 때 (i) 불일치함, (ii) 시끄러움 및 (iii) 스텝핑 이벤트 포함인, 기공을 통해서 전좌하는 중합체-가이드된 이펙터 단백질에서 비롯하는 하나 이상의 전기적 측정 중 하나 이상의 양태에서의 측정된 변화를 포함한다. 더욱 복잡한 효과는 (i), (ii), (iii), (i) 및 (ii), (i) 및 (iii), (ii) 및 (iii) 또는 (i), (ii) 및 (iii)을 포함할 수 있다.
단계 (c)는 바람직하게는 기공을 통해서 흐르는 전류를 측정하는 단계를 포함한다. 기공을 통해서 복합체의 중합체-가이드된 이펙터 단백질 부분의 전좌는 바람직하게는 기공을 통해서 전좌하는 복합체의 표적 중합체 부분과 연관된 전류 효과보다 (i) 더 오랜, (ii) 더욱 뚜렷한 및 (iii) 더욱 복잡한 중 하나 이상인 전류 효과를 초래한다. 효과는 위에 제시된 대로 (i)-(iii)의 임의의 조합일 수 있다. 기공을 통해서 복합체의 중합체-가이드된 이펙터 단백질 부분의 전좌는 더욱 바람직하게는 기공을 통해서 전좌하는 복합체의 표적 중합체 부분과 연관된 전류 효과보다 (i) 더 오랜, (ii) 더욱 뚜렷한 및 (iii) 더욱 복잡한 전류 효과를 초래한다.
기공을 통해서 전좌하는 단백질에서 비롯하는 전류에서의 변화가 기공을 통해서 전좌하는 표적 중합체에서 비롯하는 전류에서의 변화보다 더 오랜 지속기간 (또는 더 많은 시간) 동안 발생하면 전류 효과는 더 오래 간다.
기공을 통해서 전좌하는 단백질에서 비롯하는 전류에서의 변화가 기공을 통해서 전좌하는 표적 중합체에서 비롯하는 전류에서의 변화보다 더 크면 전류 효과는 더욱 뚜렷하다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 바람직하게는 기공을 통해서 전좌함에 따라 개방 기공 전류에서 적어도 약 20% 변화를 초래한다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 더욱 바람직하게는 기공을 통해서 전좌함에 따라 개방 기공 전류에서 적어도 약 30% 변화, 적어도 약 40% 변화, 적어도 약 50% 변화, 적어도 약 60% 변화, 적어도 약 70% 변화 또는 적어도 약 80% 변화를 초래한다. 가이드 중합체는 이것이 전좌함에 따라 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 전형적으로 결합/부착된다. 표적 중합체는 바람직하게는 기공을 통해서 전좌함에 따라 개방 기공 전류에서 약 10% 이하 변화를 초래한다. 표적 중합체는 바람직하게는 기공을 통해서 전좌함에 따라 개방 기공 전류에서 약 9% 이하 변화, 약 8% 이하 변화, 약 7% 이하 변화, 약 6% 이하 변화 또는 약 5% 이하 변화를 초래한다.
더욱 복잡한 전류 효과는 (i) 불일치 효과, (ii) 잡음 및 (iii) 전기적 스텝핑 이벤트 중 바람직하게는 하나 이상을 포함한다. 이들 구현예에서, 가이드 중합체는 이것이 전좌함에 따라 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 전형적으로 결합/부착된다. 가이드 중합체는 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 공유적으로 부착될 수 있다. 부피가 큰 단백질의 효과는 전형적으로 결합된/부착된 가이드 중합체의 임의의 관찰가능한 효과를 차폐한다. 효과는 위에 제시된 대로 (i)-(iii)의 임의의 조합일 수 있다.
1개 가이드 중합체 및 1개 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 1개 복합체를 형성하는데 사용되면, 표적 중합체와 연관된 전기적 또는 전류 효과는 바람직하게는 중합체-가이드된 이펙터 단백질과 연관된 전기적 또는 전류 효과 전에 및/또는 후에 관찰된다. 타이밍은 가이드 중합체가 표적 중합체에 결합하는 위치에 따라 달라질 수 있다. 표적 중합체의 한쪽 단부에 또는 단부 쪽으로 가이드 중합체가 결합/복합체가 형성하면, 표적 중합체와 연관된 전기적 또는 전류 효과는 바람직하게는 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및 가이드 중합체와 연관된 전기적 또는 전류 효과 전에 또는 후에 관찰된다. 전인지 후인지는 표적 폴리뉴클레오티드의 자유 단부 (전) 또는 결합된 가이드 중합체-가이드된 이펙터 단백질 및 가이드 중합체가 있는 단부 (후)가 기공에 먼저 들어가는지에 따라 달라진다.
둘 이상의 가이드 중합체 및 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 둘 이상의 복합체를 형성하는데 사용되면, 기공을 통해서 전좌하는 둘 이상의 복합체의 표적 중합체 부분과 연관된 전기적 또는 전류 효과는 기공을 통해서 전좌하는 둘 이상의 복합체의 중합체-가이드된 이펙터 단백질 부분에서 비롯하는 전기적 또는 전류 효과 전에 및/또는 후에 관찰될 수 있다. 기공을 통해서 전좌하는 둘 이상의 복합체의 표적 중합체 부분과 연관된 전기적 또는 전류 효과는 기공을 통해서 전좌하는 둘 이상의 복합체의 중합체-가이드된 이펙터 단백질 부분에서 비롯하는 전기적 또는 전류 효과 사이 관찰될 수 있다. 예를 들어, 복합체가 표적 중합체의 각 단부에 형성하도록 2개 가이드 중합체 및 2개 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 사용되면, 1개 복합체의 효과, 이어서 표적 중합체의 효과, 이어서 제2 복합체의 효과는 보여질 것이다. 가이드 중합체/중합체-가이드된 이펙터 단백질 조합의 임의의 수는 표적 중합체의 상이한 부분에 결합하고 관찰가능한 전기적 또는 전류 효과의 상이한 조합을 제공하는데 사용될 수 있다. 기공을 통해서 전좌하는 표적 중합체와 연관된 전기적 또는 전류 효과는 기공을 통해서 전좌하는 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질에서 비롯하는 둘 이상의 전기적 또는 전류 효과 (a) 전에 및/또는 후에 및 (b) 사이 관찰될 수 있다.
본 방법은 중합체가 기공에 관하여 움직임에 따라 기공을 통과하는 전류를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 그러므로, 장치는 전위를 인가하고 막 및 기공에 걸쳐서 전기적 신호를 측정할 수 있는 전기 회로를 또한 포함할 수 있다. 본 방법은 패치 클램프 또는 전압 클램프를 사용하여 실시될 수 있다. 본 방법은 바람직하게는 전압 클램프의 사용을 포함한다.
본 방법은 중합체가 기공에 관하여 움직임에 따라 기공을 통과하는 전류의 측정을 포함할 수 있다. 단백질 기공을 통해서 이온 전류를 측정하기 위한 적합한 조건은 당업계에서 알려지고 실시예에서 개시된다. 본 방법은 전형적으로 막 및 기공에 걸쳐서 인가된 전압을 이용해 실시된다. 사용된 전압은 전형적으로 +5 V 내지 -5 V, 예컨대 +4 V 내지 -4 V, +3 V 내지 -3 V 또는 +2 V 내지 -2 V이다. 사용된 전압은 전형적으로 -600 mV 내지 +600mV 또는 -400 mV 내지 +400 mV이다. 사용된 전압은 바람직하게는 -400 mV, -300 mV, -200 mV, -150 mV, -100 mV, -50 mV, -20mV 및 0 mV로부터 선택된 하한 그리고 +10 mV, + 20 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV, +200 mV, +300 mV 및 +400 mV로부터 독립적으로 선택된 상한을 갖는 범위이다. 사용된 전압은 더욱 바람직하게는 범위 100 mV 내지 240 mV 및 가장 바람직하게는 120 mV 내지 220 mV의 범위이다. 증가된 인가된 전위를 사용함으로써 기공에 의해 상이한 뉴클레오티드 사이 구별을 증가하는 것이 가능하다.
본 방법은 전형적으로 임의의 전하 운반체, 예컨대 금속 염, 예를 들어 알칼리 금속 염, 할리드 염, 예를 들어 클로리드 염, 예컨대 알칼리 금속 클로리드 염의 존재 하에 실시된다. 전하 운반체는 이온성 액체 또는 유기 염, 예를 들어 테트라메틸 암모늄 클로리드, 트리메틸페닐 암모늄 클로리드, 페닐트리메틸 암모늄 클로리드, 또는 1-에틸-3-메틸 이미다졸륨 클로리드를 포함할 수 있다. 위에 논의된 예시적 장치에서, 염은 챔버에서 수용액으로 존재한다. 염화칼륨 (KCl), 염화나트륨 (NaCl), 염화세슘 (CsCl) 또는 페로시안화칼륨과 페리시안화칼륨의 혼합물은 전형적으로 사용된다. KCl, NaCl 및 페로시안화칼륨과 페리시안화칼륨의 혼합물은 바람직하다. 전하 운반체는 막에 걸쳐서 비대칭일 수 있다. 예를 들어, 전하 운반체의 유형 및/또는 농도는 막의 각 측면 상에서 상이할 수 있다.
염 농도는 포화 상태일 수 있다. 염 농도는 3 M 이하일 수 있고 전형적으로 0.1 내지 2.5 M, 0.3 내지 1.9 M, 0.5 내지 1.8 M, 0.7 내지 1.7 M, 0.9 내지 1.6 M 또는 1 M 내지 1.4 M이다. 염 농도는 바람직하게는 150 mM 내지 1 M이다. 본 방법은 바람직하게는 적어도 0.3 M, 예컨대 적어도 0.4 M, 적어도 0.5 M, 적어도 0.6 M, 적어도 0.8 M, 적어도 1.0 M, 적어도 1.5 M, 적어도 2.0 M, 적어도 2.5 M 또는 적어도 3.0 M의 염 농도를 사용하여 실시된다. 높은 염 농도는 높은 신호 대 잡음 비를 제공하고 뉴클레오티드의 존재를 나타내는 전류가 정상 전류 기복의 배경에 대해 확인되도록 한다.
본 방법은 전형적으로 완충액의 존재 하에 실시된다. 위에 논의된 예시적 장치에서, 완충액은 챔버에서 수용액으로 존재한다. 임의의 완충액은 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 전형적으로, 완충액은 인산염 완충액이다. 다른 적합한 완충액은 HEPES 및 Tris-HCl 완충액이다. 본 방법은 전형적으로 4.0 내지 12.0, 4.5 내지 10.0, 5.0 내지 9.0, 5.5 내지 8.8, 6.0 내지 8.7 또는 7.0 내지 8.8 또는 7.5 내지 8.5의 pH에서 실시된다. 사용된 pH는 바람직하게는 약 7.5이다.
본 방법은 0 ℃ 내지 100 ℃, 15 ℃ 내지 95 ℃, 16 ℃ 내지 90 ℃, 17 ℃ 내지 85 ℃, 18 ℃ 내지 80 ℃, 19 ℃ 내지 70 ℃, 또는 20 ℃ 내지 60 ℃에서 실시될 수 있다. 본 방법은 전형적으로 실온에서 실시된다. 본 방법은 임의로 효소 기능을 지원하는 온도, 예컨대 약 37 ℃에서 실시된다.
기공
본 발명의 방법은 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 개구부 또는 채널이 있는 생물학적 기공을 사용한다. 기공 개구부 또는 채널의 최소 직경은 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용할만큼 충분히 크다. 기공은 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 개구부 또는 채널에서 수축을 가질 수 있다. 개구부 또는 채널은 바람직하게는 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하고 기공과 중합체-가이드된 이펙터 단백질 사이 하나 이상의 상호작용을 한다. 기공 개구부 또는 채널의 최소 직경은 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용할만큼 충분히 크고 기공과 중합체-가이드된 이펙터 단백질 사이 하나 이상의 상호작용을 한다. 기공은 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 개구부 또는 채널에서 수축을 가질 수 있고 기공과 중합체-가이드된 이펙터 단백질 사이 하나 이상의 상호작용을 한다. 하나 이상의 상호작용은 물리적 상호작용, 입체적 상호작용, 정전기적 상호작용, 수소 결합 및 반데르발스 상호작용으로부터 선택될 수 있다.
개구부 또는 채널은 바람직하게는 직경이 적어도 약 5nm, 예컨대 직경이 적어도 약 5.5nm, 적어도 약 6nm, 적어도 약 7nm, 적어도 약 8nm, 적어도 약 9nm, 적어도 약 10nm, 적어도 약 11nm 또는 적어도 약 12nm이다. 개구부 또는 채널은 전형적으로 직경이 약 20 nm 미만이지만 직경이 최대 약 100nm일 수 있다. 개구부 또는 채널은 바람직하게는 직경이 약 5nm 내지 약 20nm, 예컨대 직경이 약 6nm 내지 약 19nm, 약 7nm 내지 약 18nm, 약 8nm 내지 약 17 nm, 약 9nm 내지 약 16nm 또는 약 10nm 내지 약 15nm이다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas, Cas12a (Cpf1로서 이전에 알려짐) 또는 C2c2이면 개구부 또는 채널은 바람직하게는 직경이 약 11nm 내지 약 13nm, 예컨대 약 12nm이다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 Cas9이면 개구부 또는 채널은 바람직하게는 직경이 약 11nm 내지 약 13nm, 예컨대 약 12nm이다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질의 최대 치수는 바람직하게는 생물학적 기공의 개구부 또는 채널보다 약 3nm 이하, 예컨대 약 2nm 이하 또는 약 1nm 이하 더 작다.
생물학적 기공은 어느 정도 막을 가로지르는 구조이다. 이는 인가된 전위에 의해 구동된 수화된 이온이 막을 가로질러 또는 막 내에서 흐르도록 허용한다. 기공은 전형적으로 수화된 이온이 막의 한쪽에서 막의 다른쪽으로 흐를 수 있도록 전체 막을 가로지른다. 하지만, 기공은 막을 가로지를 필요는 없다. 한쪽 단부에서 닫힐 수 있다. 예를 들어, 기공은 수화된 이온이 흐를 수 있는 막에서 웰, 갭, 채널, 트렌치 또는 슬릿일 수 있다.
생물학적 기공은 생물학적 물질, 예컨대 폴리펩티드, 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드로부터 작제되는 기공이다. 생물학적 기공은 자연적으로 발생하는 생물학적 기공 또는 자연적으로 발생하는 생물학적 기공의 변형된 버전일 수 있다. 적합한 변형은 당업계에서 알려지고 아래 논의된다.
생물학적 기공은 바람직하게는 단백질 기공이다. 단백질 기공은 수화된 이온, 예컨대 폴리뉴클레오티드가 막의 한쪽에서 막의 다른쪽으로 흐르도록 허용하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 집합이다. 본 발명에서, 단백질 기공은 인가된 전위에 의해 구동된 수화된 이온이 막의 한쪽에서 다른쪽으로 흐르도록 허용하는 기공을 형성할 수 있다. 단백질 기공은 폴리뉴클레오티드가 막, 예컨대 삼중블록 공중합체 막의 한쪽에서 다른쪽으로 흐르도록 허용한다. 단백질 기공은 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA가 기공을 통해서 움직이도록 한다. 기공은 복합체가 막, 예컨대 삼중블록 공중합체 막의 한쪽에서 다른쪽으로 흐르도록 허용한다.
단백질 기공은 하나 이상의 번역후 변형 (PTM)을 포함할 수 있다. 하나 이상의 PTM은 인산화, 글리코실화, 지질화, 및 이황화 결합의 형성으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 PTM은 야생형 또는 자연적으로 발생하는 기공과 비교하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 단백질 기공에서 하나 이상의 상이한 아미노산은 인산화될 수 있다. 단백질 기공은 이들 PTM 중 하나 이상이 결여될 수 있다.
단백질 기공은 바람직하게는 글리코실화된다. 단백질 기공의 글리코실화는 변형될 수 있다. 단백질 기공의 글리코실화는 바람직하게는 야생형 또는 자연적으로 발생하는 기공과 비교하여 변형된다. 글리코실화는 임의의 방식으로 변형될 수 있다. 변형된 글리코실화는 (a) 단백질 기공에서 하나 이상의 상이한 아미노산이 글리코실화됨, (b) 하나 이상의 글리칸의 성격이 변화됨, (c) 글리코실화의 유형이 변화됨 또는 이들의 임의의 조합, 예컨대 (a), (b), (c), (a) 및 (b), (a) 및 (c), (b) 및 (c), 또는 (a), (b) 및 (c)를 포함할 수 있다. 단백질 기공에서 하나 이상의 상이한 아미노산이 글리코실화됨은, 비제한적으로, 글리코실화되지 않는 야생형 또는 자연적으로 발생하는 기공에서 전형적으로 글리코실화되는 하나 이상의 아미노산, 글리코실화되는 야생형 또는 자연적으로 발생하는 기공에서 전형적으로 글리코실화되지 않는 하나 이상의 아미노산 및/또는 상이한 아미노산으로 움직이는 하나 이상의 글리칸을 포함한다. 글리코실화의 유형은 N-결합 글리코실화에서 O-결합 글리코실화로 또는 그 반대로 변화될 수 있다. 단백질 기공은 바람직하게는 글리코실화되지 않거나 (또한 아글리코실화됨으로서 알려짐) 바람직하게는 글리코실화가 결여된다.
단백질 기공은 단량체 또는 올리고머일 수 있다. 기공은 바람직하게는 여러 반복하는 아단위, 예컨대 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16개 아단위로 구성된다. 기공은 바람직하게는 6량체성, 7량체성, 8량체성 또는 9량체성 기공이다. 기공은 호모-올리고머 또는 헤테로-올리고머일 수 있다. 보체 구성요소 9 (C9)는 전형적으로 22-량체이다.
단백질 기공은 전형적으로 이온이 흐를 수 있는 배럴 또는 채널을 포함한다. 기공의 아단위는 전형적으로 중심 축을 둘러싸고 가닥을 경막 β 배럴 또는 채널 또는 경막 α-나선 다발 또는 채널에 제공한다.
단백질 기공의 배럴 또는 채널은 전형적으로 중합체-가이드된 이펙터 단백질, 뿐만 아니라 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산과 상호작용을 용이하게 하는 아미노산을 포함한다. 이들 아미노산은 바람직하게는 만약 존재한다면 배럴 또는 채널의 수축 근처에 자리한다. 단백질 기공은 전형적으로 하나 이상의 양전하 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신 또는 히스티딘, 또는 방향족 아미노산, 예컨대 티로신 또는 트립토판을 포함한다. 이들 아미노산은 전형적으로 기공과 중합체-가이드된 이펙터 단백질, 뿐만 아니라 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산 사이 상호작용을 용이하게 한다.
단백질 기공은 바람직하게는 보체 구성요소 9 (C9), 퍼프린골리신 O, 플루로톨리신, 리스테리오리신, 퍼포린-2, 가스더민-A3, L-, P- 및 M-고리 단백질, 유형 II 분비 시스템 단백질 D, GspD, InvG, VirB7, SpoIIIAG, Cag8, Cag3, Cag 또는 유형 IV 분비 시스템 장치 단백질 CagY에서 기타 단백질, WzzB, 펜트락신, Afp2, 메이저 볼트 단백질, 티오레독신-의존성 퍼옥시다제 리덕타제, Arf-GAP, 호흡기 세포융합 바이러스 리보핵단백질, 치쿤구니야 바이러스 비구조적 단백질 1, PRC, YaxA, XaxA 또는 PrgH이다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas, Cas12a (이전에 Cpf1로서 알려짐) 또는 C2c2이면 기공은 바람직하게는 C9이다. 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 Cas9이면 기공은 바람직하게는 C9이다. C9는 올리고머이다. 본 발명의 맥락에서, C9 기공은 C9 단백질 단량체의 올리고머이다.
생물학적 기공은 인공 생물학적 기공일 수 있다. 적합한 기공은 당업계에서 알려지고, 비제한적으로, DNA 오리가미 기공 (Langecker 등, Science, 2012; 338: 932-936) 및 중합체-변형된 고체-상태 기공을 포함한다. 고체-상태 기공은 위에 논의된 중합체 중 임의의 것으로 변형될 수 있다.
생물학적 기공은 막에서 존재한다. 막은 바람직하게는 양쪽친매성 층, 예컨대 삼중블록 공중합체 막, 또는 고체-상태 층이다. 막은 WO 2018/060740에 논의된다. 생물학적 기공은 양쪽친매성 막에서 단백질 기공 또는 인공 기공, 예컨대 DNA 오리가미 기공일 수 있다. 생물학적 기공은 고체-상태 층에서 단백질 기공 또는 인공 기공, 예컨대 DNA 오리가미 기공일 수 있다.
고체-상태 층은, 비제한적으로, 마이크로전자 물질, 절연 물질 예컨대 Si3N4, A12O3, 및 SiO를 포함하는 양쪽 유기 및 무기 물질, 유기 및 무기 중합체 예컨대 폴리아미드, 플라스틱 예컨대 Teflon® 또는 탄성중합체 예컨대 2-성분 부가-경화 실리콘 고무, 및 유리로부터 형성될 수 있다. 고체-상태 층은 그래핀으로부터 형성될 수 있다. 적합한 그래핀 층은 WO 2009/035647에 개시된다. Yusko 등, Nature Nanotechnology, 2011; 6: 253-260 및 미국 특허 출원 번호 2013/0048499는 미립자의 사용 없이 고체-상태 층에서 단백질의 기공으로의 전달을 설명한다.
본원에 기재된 단백질 중 임의의 것, 예컨대 단백질 기공은, 예를 들어 히스티딘 잔기 (his 태그), 아스파르트산 잔기 (asp 태그), 스트렙타비딘 태그, 플래그 태그, SUMO 태그, GST 태그 또는 MBP 태그의 부가에 의해, 또는 폴리펩티드가 이러한 서열을 자연적으로 함유하지 않는 세포로부터 그들의 분비를 촉진하기 위한 신호 서열의 부가에 의해 그들의 확인 또는 정제를 돕기 위해 변형될 수 있다. 유전적 태그를 도입하는 것에 대한 대안은 기공 또는 작제물 상에서 천연 또는 조작된 위치에 태그를 화학적으로 반응시키는 것이다. 이것의 예는 기공의 외부 상에서 조작된 시스테인에 겔-시프트 시약을 반응시키는 것일 것이다. 이것은 헤모리신 이종-올리고머를 분리하는 방법으로서 입증되었다 (Chem Biol. 1997 Jul;4(7):497-505).
기공은 노출 표지로 표지화될 수 있다. 노출 표지는 기공이 검출되게 하는 임의의 적합한 표지일 수 있다. 적합한 표지는, 비제한적으로, 형광성 분자, 방사성 동위원소, 예를 들면, 125I, 35S, 효소, 항체, 항원, 폴리뉴클레오티드, 및 리간드 예컨대 비오틴을 포함한다.
본원에 기재된 단백질 중 임의의 것, 예컨대 단백질 기공은 합성적으로 또는 재조합 수단에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 기공은 시험관내 번역 및 전사 (IVTT)에 의해 합성될 수 있다. 기공의 아미노산 서열은 비-자연적으로 발생하는 아미노산을 포함하도록 또는 단백질의 안정성을 증가시키도록 변형될 수 있다. 단백질이 합성 수단에 의해 생산되는 경우, 이러한 아미노산은 생산 동안 도입될 수 있다. 기공은 어느 한쪽 합성 또는 재조합 생산 이후 또한 변경될 수 있다.
본원에 기재된 단백질 중 임의의 것, 예컨대 단백질 기공은 당업계에서 알려진 표준 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 기공 또는 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 당업계에서 표준 방법을 사용하여 유래되고 복제될 수 있다. 기공 또는 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 당업계에서 표준 기법을 사용하여 박테리아성 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 기공은 재조합 발현 벡터로부터 폴리펩티드의 현장 발현에 의해 세포에서 생산될 수 있다. 발현 벡터는 임의로 폴리펩티드의 발현을 제어하기 위해 유도성 프로모터를 운반한다. 이들 방법은 Sambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY에 기재된다.
기공은 재조합 발현후 또는 생물을 생산하는 단백질로부터 임의의 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 의한 정제 이후 대규모로 생산될 수 있다. 전형적 단백질 액체 크로마토그래피 시스템은 FPLC, AKTA 시스템, Bio-Cad 시스템, Bio-Rad BioLogic 시스템, 및 Gilson HPLC 시스템을 포함한다.
장치, 조건, 및 어레이
본 방법은 WO 2008/102120 및/또는 WO 2018/060740에 기재된 장치 및 조건을 사용하여 실시될 수 있다.
막은 전형적으로 막의 어레이의 부분이고, 여기서 각 막은 바람직하게는 생물학적 기공을 포함한다. 그러므로, 본 발명은 막의 어레이를 사용하여 표적 중합체를 검출하는 방법을 제공한다. 어레이는 WO 2018/060740에 기재된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
추가의 구현예
어댑터, 커플링, 링커, 앵커, 리더 서열, 시퀀싱 어댑터 또는 Y 어댑터, 헤어핀 루프, 비드 또는 미립자, 막, 어레이, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질 및 연관된 유리 뉴클레오티드 또는 보조-인자는 WO 2018/060740에 기재된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
앵커는 Jones 등, J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 22, 8305-8313에 기재된 것들 중 하나일 수 있다. 앵커는 바람직하게는 콜레스테롤이다.
진단
본 발명의 방법은 질환 또는 병태를 진단하거나 예측하는데 사용될 수 있다. 질환 또는 병태는 바람직하게는 암, 관상동맥 심장 질환, 심혈관 질환, 결핵, 또는 패혈증이다. 질환 또는 병태의 예는 WO 2018/060740에 제시된다.
다중체 방법을 사용하는 구현예에서 둘 이상의 표적 중합체 (예를 들면, 적어도 5 초과, 10 이상, 20 이상 또는 30개 이상)의 존재 또는 부재가 결정될 수 있으므로, 위에 나열된 질환 중 임의의 것의 둘 이상 (예를 들면, 3, 4, 5, 6개 이상)을 예측하거나 진단하는 것이 가능하다. 따라서, 복수 (예를 들면, 적어도 2 이상, 적어도 3 이상, 적어도 10 이상, 적어도 20 이상 또는 적어도 30개 이상)의 표적 중합체를 검출 및/또는 분석하기 위한 다중체 방법이 제공된다.
본 방법은 미생물 또는 미생물들의 그룹에서 유래된 중합체, 예컨대 폴리뉴클레오티드를 검출하는데 또한 사용될 수 있다. 이것은 질환 진단 및 모니터링에 유용할 뿐 아니라, 기타 응용분야를 갖는다. 예를 들어, 본 방법은 피부 또는 다른 곳에서 존재하는 미생물인 장 또는 질내 균총을 분석하는데 사용될 수 있다. 미생물은, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균, 또는 마이코박테리움일 수 있다. 본 방법은 감염성 제제가 질환을 유발시키는지를 결정하는데 그리고 따라서 최상 치료 과정을 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 요로 감염 및 기타 감염은 항박테리아성 저항성을 점점 더 발달시키고 있다. 본 방법은 감염을 책임지는 박테리아를 결정하는데 그리고 따라서 감염을 성공적으로 치료할 항생제 또는 다른 치료를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 방법은 게놈성 DNA를 특성규명하는데 사용될 수 있다. 하나의 특정한 예시적 구현예에서, 본 방법은 다형, 예컨대 SNP를 확인하는데 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서 본 발명의 방법은 예를 들어 V(D)J 영역의 레퍼토리 분석에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 분석을 위하여 혈액 세포, 또는 T-세포에서 유래된 샘플을 사용할 수 있다.
본 방법은 알려지지 않은 중합체 서열을 특성규명하는데 또한 사용될 수 있다.
시스템
본 발명은 본 발명의 방법을 실행하기 위한 시스템을 또한 제공한다. 시스템은 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 것이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "시스템" 및 "키트"는 호환가능하다. 본 발명은 그러므로 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 키트를 제공한다.
시스템 또는 키트는 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질은 샘플에서 존재하는 임의의 표적 중합체와 복합체를 형성하는, (i) 만약 존재한다면 표적 중합체의 한 부분에 결합하고 (ii) 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 결합하거나 부착되는 가이드 중합체를 포함한다. 본 발명의 방법에 관하여 위에 논의된 구현예 중 임의의 것은 본 발명의 시스템에 똑같이 적용한다.
시스템 또는 키트는 또한 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 개구부가 있는 생물학적 기공을 포함한다. 본 발명의 방법에 관하여 논의된 기공 중 임의의 것은 본 발명의 시스템에서 존재할 수 있다.
기공은 바람직하게는 막에서 존재한다. 적합한 막은 위에 논의된다. 시스템 또는 키트는 위에 개시된 막 중 임의의 것, 예컨대 양쪽친매성 층, 삼중블록 공중합체 막 또는 고체-상태 층일 수 있다.
시스템 또는 키트는 바람직하게는 막에 걸쳐서 전압을 인가하도록 그리고 하나 이상의 전기적 측정을 하도록 적응된다. 적합한 적응은 WO 2018/060740에 논의된다.
시스템 또는 키트는 폴리뉴클레오티드 및/또는 리더 서열을 따라 움직일 수 있는 폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 미립자를 추가로 포함할 수 있다.
가이드 중합체, 중합체-가이드된 이펙터 단백질, 앵커, 어댑터, 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 리더 서열 및/또는 미립자는 본원에 정의된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 시스템 또는 키트는 가이드 중합체의 또는 가이드 중합체/ 중합체-가이드된 이펙터 단백질 복합체의 패널을 포함할 수 있다. 패널은 전형적으로 특정한 목적으로, 예컨대 특정한 미생물, 질환과 연관된 마커, 특정한 다형 등을 검출하도록 설계된다.
시스템 또는 키트는 위에 언급된 구현예 중 임의의 것이 실시되게 하는 하나 이상의 다른 시약 또는 기구를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 시약 또는 기구는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 적합한 완충액(들) (수용액), 대상체로부터 샘플을 수득하기 위한 수단 (예컨대 바늘을 포함하는 용기 또는 기구), 폴리뉴클레오티드를 증폭 및/또는 발현하기 위한 수단, 위에 정의된 대로 막 또는 전압 또는 패치 클램프 장치. 시약은 유체 샘플이 시약을 재현탁시키는데 사용되도록 건조한 상태로 시스템 또는 키트에서 존재할 수 있다. 시스템 또는 키트는 또한, 임의로, 시스템 또는 키트가 본원에 기재된 방법에서 사용되게 하는 지침 또는 본 방법이 사용될 수 있는 생물에 관한 상세를 포함할 수 있다. 시스템 또는 키트는 자석 또는 전자석을 포함할 수 있다. 시스템 또는 키트는, 임의로, 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
시스템 또는 키트는 본원에 기재된 대로 단부 확장, 또는 제1 및 제2 단부 확장을 갖는 가이드 중합체 및 본원에 기재된 대로 포획 올리고뉴클레오티드 또는 제1 및 제2 포획 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 시스템 또는 키트는 본원에 기재된 대로 경쟁자 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 시스템 또는 키트는 친화성 분자 쌍 (예를 들면, 스트렙타비딘)의 한쪽 절반을 포함하는 비드 및 친화성 분자 쌍 (예를 들면, 비오틴)의 다른쪽 절반을 포함하는 제1 및 제2 포획 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 제1 및 제2 포획 올리고뉴클레오티드는 별도 표면에, 예를 들면, 비드의 별도 집단에 각각 결합될 수 있다. 제1 포획 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, "정제" 비드에 또는 "정제" 컬럼에 결합될 수 있다. 제2 포획 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어,"전달" 비드에 결합될 수 있다. "정제" 비드 및/또는 "전달" 비드는 자성일 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 실례한다.
실시예
물질
하기 물질을 사용하였다:
· dCas9 (Cas9-Spy-(D10A/H840A)): 이것의 서열은 WO 2018/060740에 개시됨
· 3.6kb 이중 가닥 선형 람다 DNA (서열번호: 1)
· 전장 이중 가닥 선형 람다 DNA
· tracr RNA (IDT altR)
· CRISPR RNAs (Enlam86, Enlam87, AR837, Enlam51, Enlam5, Enlam26, Enlam45)
· 미니온
· C9 단량체
· 올리고머화 완충액 (10mM HEPES-NaOH, 50mM NaCl, pH7.5, 0.02mg/mL 앰피폴(amphipol))
· 시스 및 트란스로 매개체 완충액이 있는 미니온 플로우셀
· 매개체 완충액 (300mM 페리시안화칼륨, 300mM 페로시안화칼륨, 1M LiCl, 50mM HEPES-NaOH, pH8)
· 결합 완충액 (25 mM HEPES-NaOH, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2)
· LiCl 완충액 (2M LiCl, 25mM HEPES-NaOH, pH8) 또는 임의의 기타 적합한 완충액
· 2x LiCl 완충액 (4M LiCl, 50mM HEPES-NaOH, pH8) 또는 임의의 기타 적합한 2x 완충액
· 열 블록
C9 올리고머화 프로토콜
C9 단량체를 올리고머화 완충액에 1mg/ml로 희석하고 37℃에서 적어도 30 분 및 최대 24 시간 동안 인큐베이션시킨다. 이것은 올리고머화된 기공을 생산한다.
미니온 플로우셀에 기공 삽입
올리고머화된 기공을 취하고 매개체 완충액에 1/20,000 희석시킨다. 300uL를 미니온 플로우셀에 첨가하고 기공 삽입 스크립트를 실행한다. 이 스크립트는 100mV에서 시작하여 10 초 동안 유지한 전압 램프를 적용한 다음 전압을 5mV 내지 105mV만큼 증가시키고 추가 10 초 동안 유지한다. 종료하는 지점에서 450mV의 전압에 도달하는 때까지 각 전압에서 전압을 5mV만큼 계속 증가시키고 10 초 동안 유지시킨다. 스크립트의 지속기간 동안 전류를 각 채널에서 모니터링하고 >50pA의 전류가 검출되면 채널을 끄고 전압을 0으로 설정할 것이다. 스크립트가 완료한 경우, 플로우셀을 통해서 매개체 완충액 1mL를 플러싱한다. 그 다음 플로우셀을 통해서 LiCl 완충액 1mL를 플러싱한다. 이것은 기공이 있는 LiCl 플로우셀을 생산한다.
DNA 전용 샘플의 제조
3.6kb 이중 가닥 선형 람다 DNA를 LiCl 완충액에 5nM로 희석시킨다.
단일 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플의 제조
1. 2 분 동안 90℃로 가열하고 그 다음 10 분 동안 얼음 위에 배치함으로써 tracr RNA 10uM을 스냅 냉각시킨다.
2. 결합 완충액을 함유하는 에펜도르프 단백질 Lo-Bind 튜브에서 5uL 반응에 대하여 언급된 대로 단계들 사이 인큐베이션하는 하기 순서로 하기 구성요소를 첨가한다. 각 첨가후 피펫팅에 의한 혼합.
a) 3uM dCas9.
b) 6uM 스냅 냉각된 tracr RNA.
c) 5 분 동안 실온에서 인큐베이션.
d) 7.5uM CRISPR RNA.
e) 5 분 동안 실온에서 인큐베이션.
f) 150nM 3.6kb 이중 가닥 선형 람다 DNA.
g) 적어도 20 분 동안 실온에서 인큐베이션.
3. 단계 2에서 제조된 샘플 5uL를 취하고 LiCl 완충액 145uL를 첨가한다. 이것은 이제 플로우셀에 첨가할 준비이다.
다중 Cas9 프로브가 부착된 DNA 샘플의 제조
1. 2 분 동안 90℃로 가열하고 그 다음 10 분 동안 얼음 위에 배치함으로써 tracr RNA 10uM을 스냅 냉각시킨다.
2. 결합 완충액을 함유하는 에펜도르프 단백질 Lo-Bind 튜브에서 5uL 반응에 대하여 언급된 대로 단계들 사이 인큐베이션하는 하기 순서로 하기 구성요소를 첨가한다. 각 첨가후 피펫팅에 의한 혼합. 별도로 각 프로브에 대하여 이 단계를 수행한다.
a) 3uM dCas9.
b) 6uM 스냅 냉각된 tracr RNA.
c) 5 분 동안 실온에서 인큐베이션.
d) 7.5uM CRISPR RNA.
e) 5 분 동안 실온에서 인큐베이션.
3. 에펜도르프 단백질 Lo-Bind 튜브에서 위에 단계 2에서 제조된 각 프로브 샘플 5uL 그리고 150uL내 농도가 5nM이도록 충분한 3.6kb 이중 가닥 선형 람다 DNA를 첨가한다. 이 포트에서 실제 농도는 프로브의 수에 따라 다양할 것이다. 적어도 20 분 동안 실온에서 인큐베이션시킨다.
4. 단계 3에서 제조된 샘플에 2x LiCl 완충액 75uL 그리고 총 부피 최대 150uL를 취하기 위해 충분한 물을 첨가한다. 이것은 이제 플로우셀에 첨가할 준비이다.
미니온 플랫폼 상에서 전기생리학 실험
전류 값이 기공이 있는 LiCl 플로우셀 상에서 얼마인지를 평가하고 필요한 경우, 달성될 수 있는 한 0pA에 가깝게 판독하도록 전압 오프셋을 인가한다. 각 수준에서 30 초 동안 고정하는 10mV 단계로 0mV에서 +- 100mV로 램핑하는 IV 곡선을 실행한다 (도 7 참조). 샘플링 주파수를 30kHz로 설정한다. 이것은 샘플이 첨가되기 전에 제어 섹션의 역할을 한다.
이전 2개 섹션 중 어느 한쪽에서 생산된 150uL 샘플을 미니온 플로우셀에 첨가하고 IV 곡선 측정을 반복한다.
결과
이들을 도 1-7에 도시한다.
서열
3.6kb 이중 가닥 선형 람다 DNA (서열번호: 1)
Enlam86
이 DNA 서열에 결합할 IDT에서 주문된 altR cas9 tracr:
GGGTCATTGAAGCCTGCCGT (서열번호: 2):
Enlam87
이 DNA 서열에 결합할 IDT에서 주문된 altR cas9 tracr:
GGTTTCTTCCGTGTCAGCAC (서열번호: 3)
AR837
이 DNA 서열에 결합할 IDT에서 주문된 altR cas9 tracr:
TCATGTCTTACCCCCAATAA (서열번호: 4)
Enlam51
이 DNA 서열에 결합할 IDT에서 주문된 altR cas9 tracr:
AATCAGCGACACTGAATACG (서열번호: 5)
Enlam5
이 DNA 서열에 결합할 IDT에서 주문된 altR cas9 tracr:
CGTGGGCGTACTTTATGGGGCGG (서열번호: 6)
Enlam26
이 DNA 서열에 결합할 IDT에서 주문된 altR cas9 tracr:
CGGACTGCGATAATAAGTGGTGG (서열번호: 7)
Enlam45
이 DNA 서열에 결합할 IDT에서 주문된 altR cas9 tracr:
TGTGGTAGTGAGATGAAAAGAGG (서열번호: 8)
서열목록 전자파일 첨부
Claims (33)
- 다음 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는 방법:
a) (i) 표적 중합체의 한 부분에 결합하고 (ii) 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 결합하거나 부착되는 가이드 중합체와 샘플을 접촉시키는 단계로서, 상기 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 샘플에 존재하는 임의의 표적 중합체와 복합체를 형성하는, 단계;
b) 기공을 통해서 복합체의 전좌(translocation)를 허용하는 개구부가 있는 생물학적 기공을 포함하는 막과 샘플을 접촉시키는 단계;
c) 막에 걸쳐서 전위차를 인가하고 하나 이상의 전기적 측정을 하는 단계; 및
d) 기공을 통해서 복합체의 전좌에서 비롯하는 전기적 효과의 존재 또는 부재에 대하여 모니터링하고 이에 의해 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계. - 제 1 항에 있어서, 기공을 통해서 복합체의 중합체-가이드된 이펙터 단백질 부분의 전좌가 기공을 통해서 전좌하는 복합체의 표적 중합체 부분과 연관된 전기적 효과보다 (i) 더 오랜, (ii) 더욱 뚜렷한 및 (iii) 더욱 복잡한 것 중 하나 이상인 전기적 효과를 초래하는, 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 (c)가 막에 걸쳐서 전위차를 인가하고 기공을 통해서 흐르는 전류를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제 3 항에 있어서, 기공을 통해서 복합체의 중합체-가이드된 이펙터 단백질 부분의 전좌가 기공을 통해서 전좌하는 복합체의 표적 중합체 부분과 연관된 전류 효과보다 (i) 더 오랜, (ii) 더욱 뚜렷한 및 (iii) 더욱 복잡한 것 중 하나 이상인 전류 효과를 초래하는, 방법.
- 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서, 더욱 복잡한 전기적 또는 전류 효과가 (i) 불일치 효과, (ii) 잡음 및 (iii) 전기적 스텝핑 이벤트 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 중합체와 연관된 전기적 또는 전류 효과가 중합체-가이드된 이펙터 단백질과 연관된 전기적 또는 전류 효과 전에 그리고/또는 후에 관찰되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 중합체가 표적 폴리뉴클레오티드인, 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 표적 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥이거나 이중 가닥 영역을 포함하고/거나 DNA, DNA/RNA 혼성 또는 RNA인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 중합체가 가이드 폴리뉴클레오티드이고 상기 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질인, 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드가 가이드 RNA이고 상기 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질이 RNA-가이드된 이펙터 단백질인, 방법.
- 제 10 항에 있어서, 상기 RNA-가이드된 이펙터 단백질이 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 또는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제의 뉴클레아제 활성이 디스에이블(disable)되는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제인, 방법.
- 제 11 항에 있어서,
a) 상기 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제의 하나 이상의 촉매적 뉴클레아제 부위가 불활성화되고/거나;
b) 상기 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제가 Cas, Cas12a 또는 C2c2인,
방법. - 제 12 항에 있어서, 상기 Cas가 Cas9인, 방법.
- 제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드가 표적 중합체에서 서열에 결합하는 뉴클레오티드 서열 및 폴리뉴클레오티드-가이드된 이펙터 단백질에 결합하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 가이드 폴리뉴클레오티드가 표적 폴리뉴클레오티드에서 서열에 결합하는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 가이드 RNA인, 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 sgRNA인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 중합체, 상기 중합체-가이드된 이펙터 단백질, 또는 상기 표적 중합체가, 만약 존재한다면, 막에 커플링할 수 있는 앵커를 갖는, 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 앵커가 콜레스테롤을 포함하는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)가 각각 (i) 표적 중합체의 한 부분에 결합하고 (ii) 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 결합하거나 부착되는 둘 이상의 가이드 중합체와 샘플 및 기공을 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 둘 이상의 가이드 중합체 및 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 샘플에서 존재하는 임의의 표적 중합체와 둘 이상의 복합체를 형성하고 단계 (d)가 기공을 통해서 둘 이상의 복합체의 전좌에서 비롯하는 둘 이상의 전기적 또는 전류 효과의 존재 또는 부재에 대하여 모니터링하고 이에 의해 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제 19 항에 있어서, 상기 둘 이상의 가이드 중합체가 표적 중합체의 상이한 부분에 결합하는, 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 둘 이상의 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 상이한 중합체-가이드된 이펙터 단백질 또는 상이한 RNA-가이드된 이펙터 단백질인, 방법.
- 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 기공을 통해서 전좌하는 둘 이상의 복합체의 표적 중합체 부분과 연관된 상기 전기적 또는 전류 효과가 기공을 통해서 전좌하는 둘 이상의 복합체의 중합체-가이드된 이펙터 단백질 부분에서 비롯하는 전기적 또는 전류 효과 사이 관찰되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 만약 존재한다면 표적 중합체의 양 또는 표적 중합체의 하나 이상의 특징을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 하나 이상의 특징이 (i) 표적 중합체의 길이, (ii) 표적 중합체의 동일성, (iii) 표적 중합체의 서열, (iv) 표적 중합체의 2차 구조 및 (v) 표적 중합체가 변형되는지 여부로부터 선택되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기공이 자연적으로 발생하는 생물학적 기공 또는 자연적으로 발생하는 생물학적 기공의 변형된 버전인, 방법.
- 제 25 항에 있어서, 상기 자연적으로 발생하는 생물학적 기공이 보체 구성요소 9 (C9), 퍼프린골리신 O, 플루로톨리신, 리스테리오리신, 퍼포린-2, 가스더민-A3, L-, P- 및 M-고리 단백질, 유형 II 분비 시스템 단백질 D, GspD, InvG, VirB7, SpoIIIAG, Cag8, Cag3, Cag 또는 유형 IV 분비 시스템 장치 단백질 CagY에서 기타 단백질, WzzB, 펜트락신, Afp2, 메이저 볼트 단백질, 티오레독신-의존성 퍼옥시다제 리덕타제, Arf-GAP, 호흡기 세포융합 바이러스 리보핵단백질, 치쿤구니야 바이러스 비구조적 단백질 1, PRC, YaxA, XaxA 또는 PrgH인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기공이 인공 생물학적 기공인, 방법.
- 제 27 항에 있어서, 상기 기공이 DNA 오리가미 기공인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막이 (i) 삼중블록 공중합체 막 또는 (ii) 고체-상태 층이고 상기 생물학적 기공이 고체-상태 층에서 기공에 존재하는, 방법.
- 다음을 포함하는, 샘플에서 표적 중합체의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 시스템:
c) 가이드 중합체 및 중합체-가이드된 이펙터 단백질이 샘플에서 존재하는 임의의 표적 중합체와 복합체를 형성하는, (i) 만약 존재한다면 표적 중합체의 한 부분에 결합하고 (ii) 중합체-가이드된 이펙터 단백질에 결합하거나 부착되는 가이드 중합체; 및
d) 기공을 통해서 복합체의 전좌를 허용하는 개구부가 있는 생물학적 기공. - 제 30 항에 있어서, 상기 기공이 막에서 존재하는, 시스템.
- 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 상기 시스템이 막에 걸쳐서 전압을 인가하고 하나 이상의 전기적 측정을 하도록 적응되는, 시스템.
- 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하도록 적응되는, 시스템.
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