JP2017012171A - ハイブリダイゼーションによるｄｎａ配列決定法 - Google Patents

Abstract

【課題】物理的操作によって核酸配列を決定する方法を提供する。【解決手段】核酸配列に相当する二本鎖核酸分子を、該分子に物理的力をかけることによって変性させる工程、およびその二本鎖核酸分子の復元の遮断を検出する工程を含んでなる方法。より具体的には、方法は、核酸配列に相当する二本鎖核酸分子を、該分子に物理的力をかけることによって変性させる工程、一本鎖核酸分子を得る工程、前記二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程、および前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程を含んでなる方法。【選択図】図１

Description

本発明は、特に、未知の核酸の配列決定あるいは診断のための特定の核酸配列の検出に有用な、核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を決定する迅速な方法に関する。

近年では、核酸配列の決定は分子生物学の中心をなしている。例えば、遺伝的変異、ＲＮＡ発現、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、および染色体コンフォメーションなどの広範囲にわたる生物学的現象は、ハイスループットＤＮＡシークエンシングにより評価することができる（いくつかの例として、Mitreva & Mardis, Methods Mol Biol, 533: 153-87, 2009; Mardis, Genome Med., 1(4): 40, 2009; Cloonan et al, Nat Methods, 5(7): 613-619, 2008; Valouev et al, Genome Res., 18(7): 1051-63, 2008; Valouev et al, Nat Methods., 5(9):829-34, 2008; Orscheln et al, Clin Infect Dis., 49(4): 536-42, 2009; Walter et al, Proc Natl Acad Sci U S A., 106(31): 12950-5, 2009; Mardis et al, N Engl J Med., 361(11): 1058-66, 2009, Hutchinson, Nucl. Acids Res., 35(18): 6227-6237, 2007参照）。

加えて、生理学的試料中の特定のＤＮＡ配列の存在の証明は、現在のところ、例えば、細菌が抗生物質耐性、遺伝子異常を生じる確率、遺伝子改変に関連する癌および例えばＨＩＶまたは肝炎ウイルスに関連する感染などのウイルス感染のリスクを特定するための、診断方法の開発の第一線を構成している（例えば、Zhang et al, Nature, 358: 591-593, 1992; Turner et al, J Bacteriol, 176(12): 3708-3722, 1994; Weston et al, Infection and Immunity, 77(7): 2840-2848, 2009参照）。

近年、核酸配列決定は主としてＳａｎｇｅｒの生化学的方法のキャピラリーに基づく半自動の実装形態を用いて行われている。この古典的な方法は、目的のＤＮＡの増幅工程、続いて蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）の組み込みによりプライマー伸長の各ラウンドが確率論的に終了する「サイクルシークエンシング」の工程を含む。配列は、キャピラリーポリマーゲル中の一本鎖、末端標識伸長産物の高分解能電気泳動分離により決定される。９６または３８４本の独立したキャピラリーにおける同時電気泳動は、限定されたレベルの並列化を提供する。

低コストの配列決定法に対する高い需要は、配列決定プロセスを並列化し、一度に数千または数百万の配列を生成するハイスループットシークエンシング技術の開発を促進した(Shendure & Ji, Nat Biotechnol, 26(10): 1135-45. 2008)。ハイスループットシークエンシング技術は、標準的なダイターミネーター法を用いて可能なものを越えるＤＮＡシーケンシングコストの低減を意図している。現在のところ、このまさにうってつけのハイスループットは、Ｓａｎｇｅｒシークエンシングと比較した場合、個々のリードの長さおよび精度において相当な犠牲をはらって実現される。そのような新しい方法の例としては、４５４およびＳｏlｅｘａ技術が挙げられる。これらの技術は、大腸菌(E. coli)または宿主細胞中でのクローニングを行わずに全ゲノムのショットガンシークエンシングを可能にする。ビーズ表面に捕捉された、アダプターを両脇に配置した短いＤＮＡ断片のライブラリーを、エマルションＰＣＲ法により増幅させる。配列決定は、ＤＮＡポリメラーゼによるプライム合成を用いて行う。４５４法（「ピロシークエンシング」としても知られる）では、アレイは４種類のｄＮＴＰのそれぞれとともに連続して提示され、組み込み量は、放出されたピロリン酸塩の発光検出によりモニタリングする。この方法とＳｏｌｅｘａ法の決定的な違いは、後者が鎖停止ヌクレオチドを用いる点である。停止塩基の蛍光標識は除去すると非遮断３’末端が残り、鎖停止を可逆的プロセスにすることができる。このＳＯＬｉＤ技術は、蛍光標識二塩基プローブを、クローニングにより増幅されたライブラリー鋳型内のアダプター配列とハイブリダイズしたシークエンシングプライマーと連結することに依存している。この二塩基プローブの特異性は、各連結反応ごとに１番目と２番目の塩基を調べることで達成される。連結、検出および切断の並列サイクルは、最終的なリード長を決定するサイクル数を用いて行われる。総て最初の増幅工程を必要とする前述の３つの技術とは対照的に、Ｈｅｌｉｃｏｓプラットフォームは、単一のＤＮＡ分子の配列決定を可能にする。この技術は、合成による配列決定を介して単一のＤＮＡ分子を直接調べるための蛍光ヌクレオチド組み込みの高感度検出システムの使用に基づくものである。

このような方法は例えば米国特許第４，８８２，１２７号、同第４，８４９，０７７号、同第７，５５６，９２２号、同第６，７２３，５１３号、ＰＣＴ特許出願第０３／０６６８９６号；ＰＣＴ特許出願第２００７１１１９２４号、米国特許出願第２００８／００２０３９２号、ＰＣＴ特許出願第２００６／０８４１３２号；米国特許出願第２００９／０１８６３４９、米国特許出願第２００９／０１８１８６０号、米国特許出願第２００９／０１８１３８５号、米国特許出願第２００６／０２７５７８２号、欧州特許第ＥＰ−Ｂｌ−１１４１３９９号；Shendure & Ji, Nat Biotechnol., 26(10): 1135-45. 2008; Pihlak et al, Nat Biotechnol., 26(6): 676-684, 2008; Fuller et al., Nature Biotechnol., 27(11): 1013-1023, 2009; Mardis, Genome Med., 1(4): 40, 2009; Metzker, Nature Rev. Genet., 11(1): 31-46, 2010に記載されている。

しかしながら、これまでに開発された総ての方法には重大な欠点がある。特に、それらは総て、標識されたヌクレオチド（例えば、蛍光）を用いており、それゆえに全体的なコストの深刻な増大に関与している。さらに、これらの新しい方法は、１つ（Ｈｅｌｉｃｏｓプラットフォーム）を除いて総てが、配列決定の前に標的配列の増幅を必要とし、一方では時間がかかり、他方ではエラーの起こる確率を増大させ、コンタミネーションが非常に起こりやすい。

本発明の方法は物理的技術および電子処理に基づくものであり、化学的または生化学的である現在のアプローチとは異なる。その利点は下記のように多数ある。

１）単一分子の配列決定を可能にし、従って、前もって増幅工程（例えば、ＰＣＲによる）を行う必要がない。
２）標識ヌクレオチド（蛍光団または他の何らかの基を用いる）よりもはるかに安い標準的な一本鎖核酸分子が使用されるため、当技術分野の方法よりもはるかにコストが安い。
さらに、単一の二本鎖核酸分子の配列が決定されるので、標準的な一本鎖核酸分子の量が最小限にまで低減される。加えて、少なくともいくつかの実施態様では、プロービング鎖は配列決定プロセスの間に消耗されないので、再利用することができる。
３）二本鎖核酸分子の二末端間の距離を測定することにより、二本鎖核酸に沿って対合した一本鎖核酸分子の局在の決定を可能にする（ｂｐ単位で）。
４）所与の二本鎖核酸ヘアピン上のオリゴヌクレオチドの異なるハイブリダイゼーション位置を１回の変性アッセイで決定することが可能である。
５）測定は、秒単位の時間尺度で周期的に繰り返すことができ、従って偽陽（ポリメラーゼの偽停止）の排除、統計値の改善および計測機器のドリフトの大幅な減少につながる。
６）ハイブリダイズした一本鎖核酸は、（例えば、力もしくはイオン強度を低減することにより、またはヘリカーゼもしくはエキソヌクレアーゼを用いることにより）変性段階の完了の際に放出させることができるため、実験は同じ分子で何回も繰り返し行うことができ、従って統計値を改善し、かつ測定値の信頼性を改善することができる。
７）各分子を他の分子とは独立して操作することができるため、種々の二本鎖核酸分子の並列配列決定が可能となる。

本発明は、核酸配列の決定方法に関し、本方法では、前記核酸に相当する変性された二本鎖核酸の復元が遮断される。

本明細書において「核酸配列の決定」とは、核酸中の実際の塩基の連続を解読するのみならず、例えば、核酸分子における特定の配列の検出または、２つの異なる核酸分子の配列間の違いの検出など、核酸配列に関する情報の取得に直接的または間接的につながるあらゆる取り組みを意味する。

本発明は、変性した二本鎖核酸の二鎖が適当な条件下で再ハイブリダイズするという知見に基づく。復元工程中に前記の変性した二本鎖核酸のいずれかの鎖に何らかの分子が結合されれば、再ハイブリダイゼーションは部分的にしか起こらない。本発明者らは、今般、特定の条件下で、永久的または一時的なこの再ハイブリダイゼーションの停止が、変性した二本鎖核酸分子に含まれる配列に関する情報を得るために使用可能であることを見出した。本発明によれば、この二本鎖核酸分子の再ハイブリダイゼーションの遮断を検出することができ、次に、この遮断に関連する物理的パラメーター（例えば、遮断の持続時間、二本鎖核酸分子上の遮断の位置）により核酸の配列の決定が可能となる。

従って、本発明は、核酸配列を決定する方法であって、前記核酸配列に相当する変性した二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程を含んでなる方法に関する。

本明細書において「変性」とは、鎖の間の大部分の水素結合が切れた場合に起こる二本鎖核酸分子の鎖の分離プロセスを意味する。この変性プロセスは変性した核酸分子を生じ、それにより、二本鎖核酸分子の変性の結果生じた２本の分離した相補鎖を意味する。本明細書において「復元」とは、２本の分離した相補鎖がハイブリダイゼーションを介して二重らせんを再形成するプロセスを意味する。本明細書において「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の２本以上の相補鎖の間の非共有結合的な配列特異的相互作用を確立して単一のハイブリッドとするプロセスである。

核酸を変性させるための、当業者に公知のいくつかの可能性が存在する。最も好ましい方法では、２本の鎖は物理的力をかけることによって分離される。例えば、前記二本鎖核酸の遊離末端を引き離し、そのようにして対合している塩基間の結合を破壊し、二本鎖核酸を開くことができる。

従って、一つの実施態様において、本発明の方法は、核酸配列を決定する方法に関し、前記方法は、
・前記核酸配列に相当する二本鎖核酸分子を、その分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；および
・前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる。

このタイプの配列決定法において、再対合を容易にするためには、二本鎖ＤＮＡの遊離末端（すなわち、支持体と結合していない末端）を、引き離す前に互いに共有結合的にまたは準共有結合的に互いに結合するよう配列することが有利であり得る。好ましい実施態様では、二本鎖核酸分子はヘアピンである。本発明において二本鎖核酸を図示することが求められる場合は、それを開いている（または閉じている）「ジッパー」に例えることができ、すなわち、二本鎖核酸の変性はジッパーを開けることであり、復元は再び閉じることである。

本発明者らは、特定の条件下で、ある分子が変性した二本鎖核酸分子に結合された際に前記二本鎖核酸分子の復元が遮断されることを見出した。この結合分子は、例えば核酸、タンパク質または小分子など、前記の変性した二本鎖核酸分子上の特定の配列に対して親和性を有するいずれの種類の分子であってもよい。しかしながら、一本鎖核酸を使用することが好ましく、これはそのような一本鎖核酸は変性した二本鎖核酸の一方の鎖上にある相補配列とハイブリダイズ可能であるためである。この一本鎖核酸は、復元プロセスの遮断に十分な長さである限り、いずれの長さであってよい。好ましくは、この一本鎖核酸の長さは３〜２０ヌクレオチドの間、より好ましくは７〜１５の間、さらにより好ましくは８〜１２の間である。

本発明の一本鎖核酸は、特に、天然型または修飾型のＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。前記一本鎖核酸はまた、例えばリボース部分が２’酸素および４’炭素をつなぐ付加的架橋で修飾されているヌクレオチドであるロックド核酸（ＬＮＡ）、または主鎖がペプチド結合で連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシンユニットの繰り返しから構成されるペプチド核酸（ＰＮＡ）などの修飾ヌクレオチドから作製されてよい。

一本鎖核酸分子が復元前の変性した二本鎖核酸に付加した場合に、再ハイブリダイゼーションが遮断されれば、その一本鎖核酸分子の配列が二本鎖核酸分子の配列の少なくとも一部と相補的であることが示される。

従って、本発明の方法はまた、核酸配列を決定する方法であって、
ａ）前記核酸配列に相当する二本鎖核酸分子を、該分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）一本鎖核酸分子を得る工程；
ｃ）前記二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程；および
ｄ）前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる方法に関する。

本発明は、任意の種類の二本鎖核酸に適用される。ほとんどの場合、二本鎖核酸はＤＮＡであるが、本発明はまた、完全に対合しているもしくは完全は対合していない一本鎖ＤＮＡ−一本鎖ＤＮＡの二本鎖、あるいは完全に対合しているもしくは完全には対合していない一本鎖ＤＮＡ−一本鎖ＲＮＡの二本鎖、あるいは完全に対合しているもしくは完全には対合していない一本鎖ＲＮＡ−一本鎖ＲＮＡの二本鎖に適用されると理解される。さらに、この二本鎖は、異なる起源のサンプルから得られた２本の一本鎖の少なくとも部分的な再対合から構成されてもよい。最終的に、本発明はまた、単独の一本鎖ＤＮＡまたは単独の一本鎖ＲＮＡの二次構造に適用される。

典型的な構成において、この二本鎖核酸分子は具体的には、２つの固体支持体（例えば、顕微鏡のスライド、マイクロピペット、微粒子）に固定することができる。一方の末端は表面に直接的または間接的に結合させ、他方の末端は可動表面に直接的または間接的に結合させることができる。この実施態様では、支持体を引き離す際に、二本鎖核酸の両末端に張力をかける。この張力が閾値よりも大きい場合には２本の鎖は分離し、核酸分子は変性する。かける張力は好ましくは１５ｐＮ以上、より好ましくは１６ｐＮ以上、さらにより好ましくは１７ｐＮ以上、非常に好ましい態様では１８ｐＮ以上である。この力は温度、ヌクレオチド種およびバッファーによって異なるが、当業者ならば２本の鎖を分離させるためにこれらのパラメーターに関して容易にこのような力をかけることができる。他方、張力が最小値より小さくなった際に、変性した二本鎖核酸の２本の鎖は再ハイブリダイズ可能となる。前記２本の鎖の再ハイブリダイゼーションを得るには、好ましくは１２ｐＮ以下の張力がかけられ、より好ましくは１１ｐＮ以下、より一層好ましくは１０ｐＮ以下である。最も好ましくは、二本鎖核酸はヘアピンである。本明細書において「ヘアピン」とは、一方の鎖の５’末端が、対合していないループを介して他方の鎖の３’末端に物理的に結合している二重らせんを意味する。前記物理結合は共有結合でも非共有結合でもよい。好ましくは、前記物理結合は共有結合である。従って、ヘアピンは、二本鎖のステムと、対合していない一本鎖ループからなる。ヘアピンにおいて、ループに関与していない２本の鎖の末端は遊離しており、従って引き離すことができる。その結果、二本鎖核酸の対合解除が起こり、変性した二本鎖核酸分子が生じる。前記核酸分子のそれぞれの末端を閾値よりも強い力で引っ張ることにより、ヘアピン二本鎖核酸分子を完全に開くことができる。分子にかけられる張力が最小値を下回るまで小さくなると、核酸分子は再ハイブリダイズしてヘアピンを再形成する。前記核酸鎖の１つにハイブリダイズされた一本鎖核酸分子が存在すると、再ハイブリダイゼーションの停止が起こる。従って、このような停止が検出されれば、その一本鎖核酸分子が前記二本鎖ステムの少なくとも一部と相補的な配列を含んでいることを示す。

これについては、瞬時、例えば１秒、の後にヘアピンがリフォールドするようなループの配列および長さに設計することが有利である。これを達成する方法は、従来技術、例えば、Woodside et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103 (16): 6190-6195, 2006に記載されている。開いた状態から試験値にまで力が小さくなると、一本鎖ＤＮＡの弾性のために、開いたヘアピンの伸長は様々に変わる。ヘアピンのリフォールドまでのわずかな遅延により、使用者は、遮断状態を検出するために用いられるものと同じ力でヘアピンの伸長を決定することができる。

ヘアピンの使用により、特に、対合および対合解除のサイクルを遂行してシグナル／ノイズ比を高めることが可能となる。

二本鎖核酸の遊離末端を結合させる技術は公知であり、その一部は以下により詳細に述べる。

遮断の決定とは、本明細書においては、遮断に関連する物理的パラメーターの決定を意味する。これらのパラメーターのうち最も有用なものは、二本鎖核酸分子における遮断の位置であり、この位置は、二本鎖核酸分子上の一本鎖核酸分子のハイブリダイゼーションの位置に相当する。実際に、本発明者らは、復元の停止が起こる、延長された二本鎖核酸上の位置を正確に決定可能であることを見出し、ヘアピンの使用により、当業者は変性／復元プロセス中の任意の時間にヘアピンの２つの遊離末端間の物理的距離を決定する手段を与える。

本明細書において「遊離末端」とは、もう一方の鎖の末端に共有結合されていない一方の鎖の末端を意味し、上述したように、これらの遊離末端はそれぞれ異なる表面に結合させることができる。例えば、これらの表面の一方は可動であり得、他方は不動であり得る。従って当業者は、ヘアピン二本鎖核酸の遊離末端間の距離を測定するために、単にその２つの表面間の距離を測定すればよいということを容易に実現するであろう。

この距離は、ヘアピン核酸はその後完全に延長されるため、ヘアピン分子が完全に変性される際に最大（ｚ_ｈｉｇｈ（Ｆ_ｏｐｅｎ））となり、ヘアピン分子が完全に復元される時に最小（ｚ_ｌｏｗ（Ｆ_ｔｅｓｔ））となる。長さの比較は総て、一本鎖核酸が同じ弾性特性を有するように同じ力Ｆ_ｔｅｓｔで行うことが有利である。ループが閉じる時間の遅れを用いて当業者は、Ｚ_ｈｉｇｈ（Ｆ_ｔｅｓｔ）を測定することができる。同様に、復元プロセスが一時的に停止された際の２つの遊離末端間の距離も測定することができ、予測されるように、この距離ｚはｚ_ｈｉｇｈ〜ｚ_ｌｏｗ（ｚは総て、Ｆ＝Ｆ_ｔｅｓｔで測定される）の間である。距離ｚは、一本鎖核酸の配列が相補的である配列がそのヘアピン分子内のどこに局在するかによって異なることが即明らかである。もし前記一本鎖核酸がヘアピンの遊離末端近くに局在する配列とハイブリダイズすれば、その自己復元プロセスは完全なヘアピンが再形成される直前に遮断され、この場合、ｚ_{ｐａｕｓｅ}は最小となる。一方、前記一本鎖核酸がヘアピンの、対合していないループに近い部分とハイブリダイズすれば、その復元プロセスはヘアピンが完全にまたはほとんど完全に変性した状態で停止し、この場合、ｚ_{ｐａｕｓｅ}は最大となる（図１）。

二本鎖核酸分子における物理的距離と塩基数は正確に相関させることができる。例えば、距離１ｎｍは、１０ｐＮの力の下で、核酸において２つのヌクレオチドにわたる距離（１ｂｐ）に相当する。力に対する正確な較正は、一本鎖核酸の弾性により与えられる。従って、二本鎖核酸分子の２つの遊離末端間の距離を単に測定することにより、復元が遮断された場所を正確に決定することができる。

よって、一つの実施態様において、本発明は、決定する配列に相当する二本鎖核酸分子がまず物理的力をかけることにより変性され、次に、一本鎖核酸の存在下で再ハイブリダイズされ、その再ハイブリダイゼーションの遮断の存在が検出される、核酸配列決定法からなる。一態様では、復元プロセスが遮断された際に、二本鎖分子の二末端間の距離が測定される。好ましくは、前記分子の二末端間の距離は、分子が完全に変性した際に決定される。さらにより好ましくは、これらの２つの距離が比較され、遮断の位置が決定される。

復元の遮断に関連する別の有用なパラメーターとして、復元が遮断されている時間がある（本明細書では、復元停止の持続時間と呼ぶ）。実際に、再ハイブリダイゼーションが遮断されている時間を測定することは可能である。例えば、当業者は、二本鎖核酸の二末端間の距離が上記で定義されたｚ（すなわち、ｚ_ｈｉｇｈ〜ｚ_ｌｏｗの間の中間値）である時間を測定することができる。

遮断の持続時間は二配列間の相補性の程度に依存する。相補性が高ければ、その二分子間で形成される結合の数が増えるので、持続時間は長くなる。また、遮断時間が二配列間の相補性の領域の長さに依存することも明らかである。領域が長いほど、その二分子間で形成される結合の数が増えるので、持続時間が長くなる。従って、特定の条件下で復元停止の持続時間がほとんど永久的となるということに容易に想到する。特に、一本鎖核酸が変性した二本鎖核酸とハイブリダイズし得る、２０を越える、好ましくは２５を越える、さらにより好ましくは３０を越えるヌクレオチドを含んでなる場合、その一本鎖核酸は、前記二本鎖核酸にかけられる力がＦ_ｔｅｓｔにまで低下された場合でも、二本鎖ヘアピンとハイブリダイズしたままであり（何分間も）、従って、前記二本鎖ヘアピンの自己再ハイブリダイゼーションが妨げられる。このような場合、一本鎖核酸分子を放出させるための酵素を使用することが有利であり得る。従って、前記一本鎖核酸分子の放出は、対合および非対合のサイクルの遂行を可能とし、従って、シグナル／ノイズ比を高める。好適な酵素の例としては、例えば、ヘリカーゼ類、例えば、ＵｖｒＤヘリカーゼ、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔ７ Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＲｅｃＢＣＤヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＭＣＭヘリカーゼ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、Ｔ４ ＵｖｓＷヘリカーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原ヘリカーゼ、ヘルペスウイルスヘリカーゼ、酵母Ｓｇｓｌヘリカーゼ、ＤＥＡＨ＿ＡＴＰ依存性ヘリカーゼおよび乳頭腫ウイルスヘリカーゼＥｌタンパク質とその同族体が挙げられる。好ましくは、Ｔ４ ＵｖｓＷヘリカーゼが用いられる。

停止の持続時間はまた、反応条件によっても異なり得る。この持続時間は温度が上昇するにつれて短くなる。同様に、バッファー条件でも停止の持続時間を調節することができ、例えば、マグネシウム、ベタインおよび塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣはモル濃度で用いる）は遮断時間を延長する。これらの化合物はＧＣ対よりもＡＴ対を強くするので、これらの対の間の強度の差を小さくする。しかしながら、温度とバッファーを一定とすると、停止の持続時間は、変性した二本鎖核酸上の引張力および一本鎖核酸とのその相補性だけに依存する。

従って、特定の一態様において、本発明の方法は、
・前記核酸配列に相当する前記二本鎖核酸分子を、該分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
・一本鎖核酸分子を得る工程；
・前記二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程；
・前記二本鎖核酸分子の復元の遮断を検出する工程；および
・停止の持続時間を決定する工程
を含んでなる。

好ましい一態様では、前記二本鎖核酸分子の復元の遮断の検出は、上記のように二本鎖核酸分子上の遮断の位置を決定することを含む。

この特定の実施態様では、本発明の方法は、診断目的で、特に、探索する異常に相当する核酸の可変領域の配列決定を可能とするために使用することができ、従って、この技術は下記に配列決定に関して記載されるものと同等である。

しかしながら、オリゴヌクレオチドとＤＮＡ配列の間の誤対合がはるかに短命のハイブリダイゼーションをもたらすという所見に基づけば、本発明の方法は、簡略化された技術を提供することができる。第１の態様において、ヘアピン二本鎖核酸分子の復元は、上記の方法のいずれかによって一本鎖核酸により遮断され、遮断の持続時間が決定される。好ましい一態様では、この値は参照値と比較される。さらに好ましい一態様では、参照値は、上記の方法のいずれかで決定されるような、参照一本鎖核酸を用いた場合に見られる停止の長さに相当する。

例えばゲノムＤＮＡの突然変異を探すなどの診断目的では、この技術は次の２つの方法で実施することができる：

１）探索する突然変異を含んでなるゲノムＤＮＡを用いて形成したヘアピンを溶液中、オリゴヌクレオチドでプローブする。

２）探索する突然変異を有する配列を含むヘアピンを、一定サイズの一本鎖ＤＮＡ断片として溶液中に存在するゲノムＤＮＡによりプローブする。このアッセイの目的がこのような配列中の特定の配列または存在し得る突然変異の存在を見つけることだけであれば、このヘアピンのループ内にこの配列を置くことで、極めて簡単な検出法が提供される。オリゴがループ内でハイブリダイズすれば、ヘアピンの再折りたたみを完全に妨げ、極めて大きな伸長変化が起こり、従って、下記のように、これは容易に検出することができる。

本発明の方法はまた、未知の核酸の直接配列決定にも使用可能である。本発明の配列決定法にはいくつかの実施態様がある。第１の実施態様では、本発明の方法を用いて物理的配列決定法が達成される。核酸ヘアピンに異なる既知の一本鎖核酸プローブを連続的にハイブリダイズさせることにより（変性および復元サイクル下）、復元期の間の停止の位置（ｎｍで厳密に測定される）から前記核酸ヘアピンの配列を推定することができる。

当業者ならば、配列決定される二本鎖核酸をあり得る総ての組合せの配列を表す一本鎖核酸セットとハイブリダイズさせるよりもむしろ、有利に、異なる一本鎖核酸プローブの数を最小化する戦略を採るであろう。一本鎖プローブが最適か、二本鎖標的分子が最適か、またはその両方が最適かによって種々の選択肢が適用可能である。

一態様において、本発明は、限られた数の塩基だけが特異的であって残りのものは特異的でない一連の一本鎖核酸プローブを用いて行う。例えば、この一連のプローブはｎ個の塩基の一本鎖核酸分子からなり得、あり得る総てのジヌクレオチド（例えば、ＡＡ、ＡＴ、ＡＧなど、あり得る組合せは全部で１６通り）またはあり得る総てのトリヌクレオチド（例えば、ＡＡＡ、ＡＡＴ、ＡＡＧなど、あり得る組合せは全部で６４通り）がそれぞれ、あり得る総ての組合せのｎ−２またはｎ−３個のヌクレオチドと連結され、ｎは整数、好ましくは３０以下であり、より好ましくはｎは２０以下であり、さらにより好ましくはｎは８以下である。２または３個の塩基だけが特異的である（すなわち、一連の１６または６４種の異なるプローブ）場合、ジまたはトリヌクレオチドの位置はそれぞれのハイブリダイゼーションで決定される。これにより、一連の一本鎖核酸分子を混合することが可能となり、バッファー交換の回数が減る。例えば、ＡＡＮＮＮＮＮＮの場合、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより開発されたＳｏｌｉｄシークエンシングプラットフォームで実施する際に厳密に必要なのは４バッチのプローブだけである。これらのジまたはトリヌクレオチドは、ｎマーのプローブのどの位置にあってもよい。好ましい実施態様では、供試ヌクレオチドはオリゴの中央に位置するが、これはこの位置が誤対合により敏感であり、この方法の感度が高まるからである。

本発明の方法の１つの明らかな利点は、前記方法により二本鎖分子の両鎖を同時に配列決定できることである。実際に、各プローブは、そのプローブが持つ配列に相補的な配列を含んでなる鎖とハイブリダイズする。次に、ハイブリダイズしたプローブの位置を上記のジッパーの開閉法によって決定する。従って、内部対照を設ければ、両鎖の配列を同時に決定することができる。プローブが結合した鎖を同定できるようにするには、ジまたはトリヌクレオチドがプローブの中央付近であるがわずかに中央をはずれて位置するようにプローブを設計することが便利である。本方法の別の好ましい実施態様は、これらのヌクレオチドがわずかに中央をはずれており、その結果、どの鎖にオリゴが結合するかによって遮断がシフトするようなプローブに関する。例えば、ジヌクレオチドはプローブの中央のすぐ５’側または３’側に位置してよい。また、中央ヌクレオチドがトリヌクレオチドの最も５’側または最も３’側のヌクレオチドとなるプローブを使用することもできる。例えば、８マーのオリゴのあり得る選択肢としては、ＮＮＸＸＮＮＮＮまたはＮＮＸＸＸＮＮＮである。最後に、総てヌクレオチド（Ｎ）の組合せの代わりに遺伝子塩基（Ｚ）を使用することもできる。遺伝子塩基（Ｚ、例えば、５−ニトロインドールまたは３−ニトロピロール）は、４つの塩基総てと均一な相互作用を示し、オリゴヌクレオチドの希釈率を小さくする。

ハイブリダイゼーションの機械的検出による配列決定の分解能は、ビーズと固定面の間の距離の測定における達成可能な空間的分解能によって制限される。この分解能は最終的に、結合している分子の剛性（ビーズのブラウン運動の振幅を設定する）によって決定される。約１０ｐＮの張力下、約１０００ｂｐの分子では、空間的分解能（１秒平均で）は約２ｎｍ（すなわち、約２ｂｐ（ジッパーが閉じられた状態））である。ブラウンノイズはＤＮＡ長の２乗（すなわち、ヌクレオチド数の２乗）として低下するので、この技術はより短い分子の配列決定にも十分適している。

別の態様では、配列決定される核酸は、ハイブリダイズするプローブの位置の決定を向上させるために再設計される。例えば、米国特許第６，７２３，５１３号は、位置特定を助けるための１以上の塩基の拡大を含む配列決定技術を開示している。この技術では、標的核酸中の塩基対を、４つの塩基、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミン（または核酸がＲＮＡであればウラシル）のそれぞれを表す４つの異なるタグ（拡大タグ）に関連づける。次に、各特定の塩基、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの全存在を対応する拡大タグで置換する。好ましい実施態様では、各拡大タグは、特定の長さ（例えば、ｎ個の塩基）および特定の配列のオリゴヌクレオチドである。従って、元の二本鎖核酸は、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの拡大タグに相補的なオリゴヌクレオチドの連続的な存在において、上記の方法に従ってジッパーの開閉を行うことによって決定することができる。これらのオリゴヌクレオチドは二本鎖核酸の対応する鎖と対合し、対応するコードされている塩基においてその再ハイブリダイゼーションを遮断する。

従って、この態様において、本発明は、一本鎖核酸が拡大タグの１つに相補的なオリゴヌクレオチドである、上記のような配列決定法を提供する。好ましい一態様では、本方法は、二本鎖核酸分子上で前記一本鎖核酸の各遮断位置を決定するさらなる工程を含んでなる。さらに好ましい態様では、前記方法の配列決定のための全工程ならびに各遮断位置を決定する工程は、拡大タグに相補的な各オリゴヌクレオチドを用いて連続的に繰り返される。

各塩基が拡大される、すなわち、ｎマーのオリゴヌクレオチドで置換されることから、ハイブリダイズするプローブの位置を決定するために必要な精度はｎ ｎｍ未満となるだけでよい。例えば、拡大タグが８マーのオリゴヌクレオチドである場合には、８塩基未満、すなわち、８ｎｍ未満の精度で分子の２つの遊離末端間の物理的距離を決定することができれば、その延期の位置を正確に決定することができる。このアプローチのもう１つの利点は、多数のビーズを４回の連続アッセイだけで並列的に配列決定できることである。

第２の実施態様では、本発明の方法は、酵素的工程を含んでなる。このアプローチの好ましい一つの実施態様は、連続的ハイブリダイゼーションと相補配列の連結によるヘアピンの配列決定からなる。本発明のこの実施態様では、長い二本鎖核酸分子の配列を決定することが可能である。なお、長い二本鎖核酸分子とは、本明細書では、５００ｂｐより長い、より好ましくは７５０ｂｐより長い、さらにより好ましくは１０００ｂｐより長い分子と理解される。この技術は、上流一本鎖核酸プライマーに、隣接するハイブリダイズした一本鎖核酸を連結することからなる。次に、プライマーの伸長を、上記のように、ヘアピン二本鎖核酸分子を変性させ、復元し、復元の遮断を検出することによってモニタリングする。その後、この方法を異なる一本鎖核酸分子を用いて繰り返す。本発明の方法によれば、配列決定される二本鎖核酸分子を事前に増幅する必要はなく、本発明の方法は単一の二本鎖核酸分子に対して行うことができる。

好ましい実施態様では、一本鎖核酸分子のライブラリーが用いられる（例えば、米国特許第４，８８２，１２７号および同第４，８４９，０７７号）。前記ライブラリーはｎ個の塩基の一本鎖核酸分子からなり、あり得る総てのジヌクレオチド（例えば、ＡＡ、ＡＴ、ＡＧなど、全部で１６通りの組合せ）がその３’末端において、あり得る総ての組合せのｎ−２個のヌクレオチドと連結され、ｎは整数、好ましくは２０以下であり、より好ましくはｎは１２以下であり、さらに好ましくはｎは８以下である。より好ましい一つの実施態様では、最後のｍ個のヌクレオチドが次回のハイブリダイゼーションおよび連結の前に切断され、ｍは１〜ｎ−１の間の整数であり、好ましくは、ｍはｎ−１に等しい(Mir et al, Nucleic Acids Res., 37(1): e5, 2009)。切断可能な配列の使用により、合成工程数を少ないままに、遮断位置の精度（数ｎｍ）に対してそれほど厳密でない要件でハイブリダイゼーションの検出が可能となる。別法としては、５’末端にリン酸基を欠くオリゴを使用することであり、これにより、一度にオリゴが１個だけ連結することができ、次工程の前にキナーゼを用いて不足するリン酸基を付加すれば次の連結が可能となる。この手順をあり得る１６のジヌクレオチドのそれぞれを用いて繰り返すことにより、連続する一本鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれの連結時の相補鎖の長さの連続的増加を検出することができる。また、アッセイ数を減らすために、４バッチの１６のオリゴヌクレオチドをプールすることもできる。ジヌクレオチド配列はそれぞれ２回検出されるので、その配列を決定するには十分である。従って、二本鎖核酸全体が一本鎖核酸分子のライブラリーによって相補されたところで、合成された鎖が放出され（例えば、ヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼによる）、先のプライマーよりもヌクレオチド１個分上流または下流にシフトした上流一本鎖核酸プライマーを用いてプロセスが再開される。この手順をｎ−ｍ回繰り返すと、二本鎖核酸配列の完全な決定が可能となり、例えば、８マーのオリゴマーのライブラリーでは、ｍ＝３の時、二本鎖分子の完全な配列を得るためには、この手順（すなわち、相補鎖の合成）を５回繰り返すだけでよい。

従来技術の方法は総て蛍光ヌクレオチドを用いるのに対し、本発明の方法だけがプローブの伸長の機械的検出を含む。従って、本発明の方法は、従来技術の方法に伴ういずれの欠点も被らない。例えば、８マーのオリゴマーが上手く連結されるということは、二本鎖ヘアピンの伸長変化が８ｎｍであることを表す。これは２ｎｍ（これは約１０００ｂｐの分子では約１０ｐＮの張力下での空間的分解能（１秒平均で）である）の分解能で容易に検出することができる。各工程では単一のオリゴヌクレオチドが連結されるので、その検出は、伸長の相対的（すなわち、連続的連結の前と後の）変化の検出を意味するに他ならない。

本発明の方法の実装形態は、特に、単一分子レベルでのリアルタイムの核酸相互作用を探査するために設計された装置の存在により可能となった。そのような装置は、例えば、米国特許第７，０５２，６５０号および同第７，２４４，３９１号に記載されている。そこに記載されている機器は、ミクロンサイズの超常磁性ビーズにピコニュートンスケールの力をかける磁気トラップを使用する。要するに、前記の機器は光学顕微鏡、磁石およびＰＣを含んでなる。二本鎖核酸分子は、一方の末端は例えば表面などの不動エレメントに、もう一方の末端は可動表面、この場合磁性ビーズにと、多数のポイントで固定される。磁石は、ビーズに働かせるために提供する。特に、磁石は、ビーズを前記表面から引き離すために使用することができる。しかしながら、本発明の方法の実装形態は上記の機器に限定されない。本発明の方法を実施するためには、二本鎖核酸分子を完全に伸長させ、次いでリフォールディングすると同時に、前記分子の伸長をモニタリングする任意の装置を使用することができる。例えば、光ピンセットを用いてもよいが、それらには事前に力の較正を行う必要があり、ハイスループット測定のための並列化が容易ではない。さらなる欠点は、全体的な核酸のねじれの制御ができないこと、および集束レーザーにより溶液が局所的に加熱される可能性があり、ハイブリダイゼーション条件を変化させるおそれがあることである。

二本鎖核酸は、適切なビーズ（例えば、ストレプトアビジンでコーティングしたもの）の溶液中で数分間インキュベートし、二本鎖核酸はその標識された（例えば、ビオチン）末端のうち一方でビーズに結合する。ビーズは、後に操作のために光ピンセットが使用されるならば透明であってよく、操作のために磁気トラップまたはピンセットが使用される場合は磁性ビーズであってよい。

ビーズ−核酸アセンブリは、分子のもう一方の標識末端と結合するようにその表面が処理された（例えば、核酸のＤｉｇ標識末端に結合させるための抗Ｄｉｇでコーティングされた表面）流体チャンバー中に注入する。従って、ビーズは核酸ヘアピンを介して表面に固定される。図１ａ参照。次に、ビーズと表面の距離を当業者に公知の様々な手段でモニタリングするが、例えば、それらの距離を推定するために、カメラにおけるそれらの画像の回折環を使用することができ、あるいはエバネッセントモードで照射された場合にそれらが散乱する光の強度（または蛍光の放出）を用いてそれらの距離を測定してもよい。あるいは、固定表面上のセンサーまでのそれらの距離を推定するために、それらが発生させる磁界を測定することができる（例えばＧＭＲまたはＨａｌｌセンサーなどの磁気センサーを使用）。

ビーズに固定した核酸分子を表面へ引き寄せるために、様々な技術が記載されている。焦点近くの透明ビーズを捕捉するために、集束レーザー光の光を使用することができる。固定表面に対する光線の相対的並進により、連結している分子に力をかけることができる（典型的な光ピンセットアッセイ）。加えられた力は、その平衡位置からのビーズの移動に比例し、結合している分子に一定の力を加えるためには捕捉光線上のフィードバックループが必要である。

ビーズに一定の力を加えるために、ビーズの周囲の流れにより発生する流体力学的抗力の使用が記載されているが、通常、その空間的精度は低い（＞１００ｎｍ）。好ましい実施態様では、上記のように、核酸ヘアピンにより表面に固定された超常磁性ビーズを引き寄せるために磁気トラップを使用する。この構成においては、固定されたビーズに一定の力をかけるために、サンプルの上に配置した小さな磁石が使用され、その位置は＜１ｎｍの精度で決定することができる（引張力、および流体力学的抗力による消散に依存する）。どの場合においても、連結しているヘアピンは、約１６ｐＮよりも大きい力でビーズを引っ張ることにより、機械的に完全に開くことができることを注記しておく。分子にかける張力を約１１ｐＮより小さくすると、ヘアピンに自発的に再び閉じさせることができる（開いている状態の移行はヒステリシス的ではあるが可逆的である）。もし、開いている状態の時に、溶液中の一部の分子（例えば、タンパク質、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡもしくはＰＮＡの相補的オリゴヌクレオチド）が延長された一本鎖核酸に結合していれば、力が１１ｐＮよりも小さくなった場合に、これらの分子はヘアピンの再閉を遮断する。従って、このアッセイの原理は２つの力の間の切り替えであり、より大きい方のＦ_ｏｐｅｎはヘアピンを開き、小さい方のＦ_ｔｅｓｔは、再び閉じ、一時的遮断の際の分子の伸長の測定を可能にするために用いられる。遮断位置は、完全伸長と遮断状態の間の直線関係により、配列に関連づける。精度を最も良くするためには、完全伸長は、好ましくは、テスト張力Ｆ_ｔｅｓｔで測定する。これは、力がＦ_ｏｐｅｎからＦ_ｔｅｓｔへと小さくなったところで、一瞬でリフォールディングされるようにヘアピンループを設計することによって達成される。

核酸を表面または支持体に結合させるためには、当技術分野で公知のいずれの技術を用いてもよい。本質的に、核酸は、例えばマイクロビーズなどの支持体に直接的に固定され、支持体は、例えば核酸の官能基化末端と反応することができるストレプトアビジン、ＣＯＯＨ基などでコーティングすることによるなど、この表面の官能基化を含む。

このような方法では一般に、核酸の、特に３’および５’末端の官能基化、すなわち、適当な化学基をそれらにグラフトすることが必要となる。さらに、操作の終了時に鎖が解離するのを防ぎ、適切な場合、後者を繰り返すことができるように、分子の他の２つの遊離末端をループにより連結することが好ましい。この目的で、様々な手順を採用することができる。

最も単純な手順は、合成オリゴヌクレオチドを用いて二本鎖核酸の一方の末端を２種類の異なる官能基（例えば、ビオチンとアミン）で官能基化することであり、これにより２つの異なる前処理面への固定が可能となる。この２本の鎖の他方の末端は、ループの形態の、部分的に対合した合成ヌクレオチドを用いて連結することができる。このようにして、対合した一本鎖核酸、すなわちヘアピンが二本鎖核酸から生成される。この方法の利点は、大きな核酸断片の異種集団（遺伝子または染色体の分画で得られるような）を官能基化し、次に同時に分析できる能力にある。この場合、核酸サンプルは２種類の（またはそれを越える）制限酵素を用いて分画され、その酵素は、断片全体は類似している、その末端に２種類の異なる制限部位を有する部分集団を得ることを可能にする。これにより、二末端に異なる処理を行うことができる（例えば、一方の末端を、その末端に適当な制限部位を有するループの形態のオリゴヌクレオチドに連結することによる）。この方法の欠点は２つの隣接する官能基間の立体的障害にあり、これにより表面への結合が困難となる場合がある。この問題を解決するために、ヘアピン分子の各遊離末端に塩基の「スペーサー」配列を付加し、次にその末端に官能基を付加し、２つのスペーサー配列は非相補的であり、各官能基に、その専用の表面に結合する十分なスペースを提供することが有利であり得る。さらに有利には、各スペーサー配列の配列が、既知配列の一本鎖シークエンシングプライマーを本発明の配列決定法において使用するために設計されている。二本鎖核酸分子へのループおよび／またはスペーサーの付加は、分子生物学で慣用されている任意の方法を用いて行うことができる。これらの方法は当業者に周知であり、従ってここでは詳細に記載する必要はない。

実際の固定技術については多数存在し、それらは高分子（タンパク質、ＤＮＡなど）を市販の前処理表面に固定するための技術から派生したものである。これらの技術の大部分は免疫学検査のために開発されたものであり、タンパク質（免疫グロブリン）を、タンパク質のカルボキシル（−ＣＯＯＨ）またはアミン（−ＮＨ_２）末端と反応できる基（−ＣＯＯＨ、−ＮＨ_２、−ＯＨなど）を担持する表面に連結させる。

核酸の共有結合による固定は、直接的に、分子の５’末端の遊離のリン酸基を介して行うことができ、それは第二級アミン（ＳｔｒａｓｂｏｕｒｇのＰｏｌｙｌａｂｏにより市販されているＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ表面）と反応して共有結合を形成する。また、ＤＮＡをアミン基で官能基化し、次にタンパク質と同様に処理することも可能である。

ストレプトアビジンでコーティングした表面（Ｄｙｎａｌビーズなど）もあり、ストレプトアビジンとビオチン化ＤＮＡ分子との間の準共有結合的固定を可能にする。最後に、ジゴキシゲニンに対する抗体を表面にグラフトすることにより（上述の方法による）、ジゴキシゲニンで官能基化された核酸がそこに固定され得る。これは多くの潜在的な固定技術の一例にすぎない。

結合および固定技術としては、例えば、欧州特許第１５２８８６号に記載の、セルロースなどの固相支持体へのＤＮＡの結合のために酵素的カップリングを用いる技術も挙げておくべきである。

欧州特許第１４６８１５号ではまた、支持体へのＤＮＡの結合の様々な方法が記載されている。同様に、国際公開第９２／１６６５９号では、ＤＮＡを結合するためにポリマーを使用する方法が提案されている。

当然ながら、核酸は支持体に直接結合されてもよいが、必要に応じて、特に表面に及ぼす影響を制限する目的で、核酸は不活性なペプチドアームまたは例えば、欧州特許第３２９１９８号に記載されているような他の種類の末端に結合されてもよい。

以下の実施例は、本発明の他の特徴および利点を明らかにすることを可能にするであろう。

ヘアピンＤＮＡ上でのオリゴヌクレオチドとそれらの相補配列のハイブリダイゼーションの検出原理 ビーズを引っ張る力を約１６ｐＮを上回る値まで大きくすることにより、ビーズを表面（ａ）に固定しているヘアピンＤＮＡを一時的に開く。その状態で溶液中の相補的断片を開かれたＤＮＡヘアピン上のその標的とハイブリダイズさせ、このようにして、力が小さくなり初期値に戻った際に、ヘアピン（ｂ）が再閉するのを防ぐ。ヘアピンのリフォールディングは、持続時間は様々であるが、明確に定義された伸長において見られる４つのプラトーを示す。７３．７１ｎｍにおける最上部のプラトーは、Ｆ_ｔｅｓｔで完全に開いたヘアピン８３ｂｐに関連し、最下部のプラトーは完全にリフォールディングされたヘアピンに相当する。２５．４７ｎｍおよび３５．１７ｎｍの２つの中間のプラトーは、溶液に２つのオリゴが入れられたために現れたものである。これらの伸長変化（ｚ_ｈｉｇｈ−ｚ）から、ヘアピンに沿って相補配列が対合していた場所が推定できる。ここで、それらの位置によれば、遮断は、予想された位置２９ｂｐおよび４０ｂｐと極めてよく一致した２８．６６ｂｐおよび３９．６０ｂｐの場所で同時に起こっている。このプラトーの位置は、数回の開／閉サイクル（ここでは約２０サイクル）から得られたヒストグラムにガウス関数を当てはめることにより、より良く推定される。 遮断時間はオリゴヌクレオチド長および引張力に強く依存する Ａ）１２００ｂｐヘアピンに対する１０塩基オリゴヌクレオチドによる時間τの遮断。Ｂ）遮断時間のヒストグラムは平均値２秒でポアソン分布を示す。Ｃ）遮断時間はオリゴヌクレオチドサイズによって変化し、試験段階に用いる力Ｆ_ｔｅｓｔによって指数関数的に変化する。 ９塩基オリゴの場合のオリゴ濃度による遮断確率および遮断時間の経時的推移 遮断時間は濃度には依存しない。遮断確率はＫｍ １０ｎＭを示す。 １２個のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの遮断時間を力に対してプロットする 丸の記号の曲線を除き、これらのオリゴヌクレオチドは総て１または２個の誤対合を有するが、その後の場合では、遮断は短すぎて測定することができなかった。誤対合が最後または最初の塩基に存在すれば、遮断時間は５分の１になった。誤対合がそのオリゴヌクレオチドの中央のＡＴ塩基対に関するものである場合、遮断時間は２０分の１を下回るまで短くなったが、ＧＣ塩基対に関するものである場合には、６０分の１に達する。二重の誤対合は、測定できないほど遮断時間を短くする。 １０個のオリゴヌクレオチドＡＣＡＧＣＣＡＧＣＣに対する温度による遮断時間の経時的推移 一般に、温度が１０℃高くなると遮断時間は３分の１になる。 １０ｂｐのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの遮断時間を力に対してプロットする 丸の記号の曲線を除き、これらのオリゴヌクレオチドは総て１または３個のＬＮＡ（配列記号でマーク）を含む。ＤＮＡを１個のＬＮＡで置換すると、遮断時間は２倍になる。 図１ｃに示されるものなどの実験（この場合、溶液中のオリゴヌクレオチドが分子上の様々な位置において、開いているＤＮＡと対合することができる）におけるＤＮＡ伸長の分布のヒストグラム ヒストグラムピークの位置（３つの異なる分子、すなわち、異なる結合ビーズに強く相関している）から、そのＤＮＡ上のハイブリッドの位置を推定することができる。 拡大配列に相当するＤＮＡヘアピンに対する、４種類の８塩基ヌクレオチドＡ _８ 、Ｃ _８ 、Ｔ _８ 、Ｇ _８ に相当する遮断位置のヒストグラム これらの遮断位置は、それらの予測された位置と正確に相関している。本発明者らは、ここでは、Ｇ_８＝ＧＣＡＣＧＣＡＣ、Ｃ_８＝ＴＣＧＣＴＣＧＣ、Ｔ_８＝ＧＣＣＡＧＣＣＡおよびＡ_８＝ＣＣＧＡＣＣＧＡを用いている。

実験例
ＤＮＡの調製
未知の配列であり数十〜数千の間の塩基対からなるサイズの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片を、一方の先端においてＤＮＡループに連結する。そのもう一方の先端をｄｓＤＮＡ断片に連結すれば、その２つの鎖を異なるコーティングの表面に結合させることができる。例えば、一方の鎖の遊離３’末端をビオチンで標識してストレプトアビジンでコーティングしたビーズに結合させ、反対の鎖の５’末端はジゴキシゲニンで標識して抗Ｄｉｇ抗体でコーティングした表面に結合させることができる。この末端標識は、例えばビオチン（またはｄｉｇ）修飾ヌクレオチドを付加するためのターミナルトランスフェラーゼの使用、または適切に標識されたオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションなど、当業者に公知の様々な方法で行うことができる。

フォース・ストレッチング機器(Force streching apparatus)
このＤＮＡ構築物を、それが、その標識された（例えば、ビオチン）一方の末端が結合する適当なビーズ（例えば、ストレプトアビジンでコーティングしたもの）の溶液中で数分間インキュベートする。このビーズは、後に操作のために光ピンセットが使用されるならば透明であってよく、操作のために磁気トラップまたはピンセットが使用される場合は磁性ビーズであってよい。

ビーズ−ＤＮＡアセンブリを、例えば分子のもう一方の標識末端と結合するようにその表面が処理された（例えば、ＤＮＡのＤｉｇ標識末端に結合させるための抗Ｄｉｇでコーティングされた表面）流体チャンバー中に注入する。このようにしてビーズはＤＮＡ−ヘアピンを介して表面に固定される（図１ａ参照）。次に、ビーズと表面との距離を当業者に公知の様々な手段でモニタリングするが、例えば、それらの距離を推定するために、カメラでのそれらの画像の回折環を使用することができ、あるいはエバネッセントモードで照射された場合にそれらが散乱する光の強度（または蛍光の放出）を用いてそれらの距離を測定してもよい。あるいは、固定表面上のセンサーまでのそれらの距離を推定するために、それらが発生させる磁界を測定することができる（例えばＧＭＲまたはＨａｌｌセンサーなどの磁気センサーを使用）。

ビーズに固定されているＤＮＡ分子を表面へ引き寄せるために、様々な技術が記載されている。好ましい実施態様では、上記のように、ＤＮＡヘアピンにより表面に固定された超常磁性ビーズを引き寄せるために磁気トラップを使用する。この構成においては、固定されたビーズに一定の力を加えるために、サンプルの上に配置した小さな磁石が使用され、その位置は＜１ｎｍの精度で決定することができる（引張力および流体力学的抗力による消散に依存する）。この一連の実験では、米国特許第７，０５２，６５０号および同第７，２４４，３９１号に記載の機器を用いた。さらに、特に断りのない限り、本明細書で報告した実験は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＡｃ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２％ＢＳＡ中で行った。

どの場合においても、連結しているヘアピンは、約１６ｐＮよりも大きい力でビーズを引っ張ることにより、機械的に完全に開くことができる。分子にかける張力を約１１ｐＮより小さくすると、ヘアピンが自発的に再び閉じさせることができる（開いている状態の移行はヒステリシス的ではあるが可逆的である）。もし、開いている状態の時に、溶液中の一部の分子（例えば、タンパク質、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡもしくはＰＮＡの相補的オリゴヌクレオチド）と延長された一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡと結合していれば、力が１１ｐＮよりも小さくなった場合に、これらの分子はヘアピンの再閉を一時的に遮断する。アッセイの原理は２つの力の間の切り替えであり、大きい方のＦ_０ｐｅｎはヘアピンを開き、小さい方のＦ_ｔｅｓｔは、再び閉じ、一時的遮断の際の分子の伸長の測定を可能にするために用いられる。遮断位置は、完全伸長と遮断状態の間の直線関係により、配列に関連づける。精度を最も良くするためには、完全伸長は、好ましくは、テスト張力Ｆ_ｔｅｓｔで測定する。これは、力がＦ_ｏｐｅｎからＦ_ｔｅｓｔへ低減されたところで、一瞬でリフォールディングされるようにヘアピンループを設計することによって達成される。

オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション位置は、塩基対の分解能により測定することができる
これらの再閉の停止のうちの１つの期間におけるＤＮＡ分子の伸長（ビーズと表面との距離）を測定することにより、遮断の位置をナノメーター精度で決定することが可能である（１ｎｍはｓｓＤＮＡにおいて１０ｐＮの力の下で２つのヌクレオチド（１ｂｐ）にわたる距離に相当する）。開いている構造は、塩基対に対する伸長の最大比を示す（ｄｓＤＮＡにおいてその比はわずか０．３４ｎｍ／ｂｐである）。

この測定の精度は、２つのノイズの関与により限定される：
・測定方法の精度；
・ビーズのブラウン運動。

ビーズの垂直位置を測定するために様々な技術を使用することができる。最も単純なものは、ビデオ顕微鏡によるものである（米国特許第７，０５２，６５０号および同第７，２４４，３９１号）。この方法を用いて得られた図１の結果では、標準的な分解能は平均して１秒あたり１ｎｍに達している。良好な分解能を備えた他の方法としては、例えば分解能０．１ｎｍに達するＰＳＤセンサーを用いるレーザー照射(Greenleaf and Block, Science, 313: 801, 2006)、およびエバネッセント波照射(Singh-Zocchi et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 100(13): 7605-7610, 2003、Liu et al., Biophys J., 96(9): 3810-3821, 2009)が示されている。

分解能における固有の制限は、ｓｓＤＮＡ分子を引き寄せるビーズのブラウン搖動によりもたらされる。＜ｘ^２＞＝４ｋ_ＢＴΔｆ（６πηｒ）／ｋ^２ _{ｓｓＤＮＡ}（Ｆ）、式中、ｋ_{ｓｓＤＮＡ}（Ｆ）はｓｓＤＮＡ分子の剛性、ｋ_Ｂはボルツマン定数、Ｔは絶対温度、ηは水の粘度、ｒはビーズの半径、Δｆは測定の周波数帯域である。ｋ_{ｓｓＤＮＡ}（Ｆ＝１０ｐＮ）＝０．０５／Ｎｂ（Ｎ／ｍ）、式中、ＮｂはｓｓＤＮＡの塩基の数である。８４ｂｐのヘアピンに対して、これは平均して１秒間に０．０４ｎｍのノイズをもたらす（Δｆ＝ｌＨｚ）。図１におけるより大きなノイズ（σ約１ｎｍ）は、本質的に測定装置によるものであり、固有の搖動によるものではない。固有のブラウンノイズはヘアピンのサイズとともに増大し、例えば、１２００ｂｐのヘアピンは１秒間に平均して０．６ｎｍのノイズをもたらす。

ハイブリダイゼーションの品質は遮断時間の平均値により評価される
遮断強度は、遮断確率Ｐ_{ｂｌｏｃｋ}（＝遮断を示すサイクル数／全サイクル数）と平均遮断時間τ_{ｂｌｏｃｋ}の２つのパラメーターによって特徴付けることができる。Ｐ_{ｂｌｏｃｋ}はｋ_ｏｎとオリゴヌクレオチド濃度に依存するが、τ_{ｂｌｏｃｋ}はｋ_ｏｆｆにのみ依存し、ここで、ｋ_ｏｎとｋ_ｏｆｆはそれぞれ結合反応定数と解離反応定数である。図２では、オリゴヌクレオチド長および力による典型的なτ_{ｂｌｏｃｋ}の変動を表す。一塩基誤対合はτ_{ｂｌｏｃｋ}に、オリゴヌクレオチド長を少なくともヌクレオチド１個分低減することおよび遮断時間を５分の１にすることに相当する劇的な影響を示す。

実際、τ_{ｂｌｏｃｋ}および従ってｋ_ｏｆｆは、オリゴヌクレオチド濃度に依存しないことから測定が簡単である（図３）。しかしながら、ｋ_ｏｎも測定可能である。

平均遮断時間はオリゴヌクレオチド配列に依存するが、ヘアピン上のその位置には依存しない。ヘアピン上の２つの特定の位置が一致する配列を検討したところ、両遮断とも遮断時間は同じであるが、大きく異なる位置に見られる。

１つの突然変異が遮断時間に劇的な影響を示す
図４に示されるように、ヘアピンと完全な一致を形成する１２塩基のオリゴは、１つの誤対合を持つ同じオリゴに比べ、大きく異なる遮断時間を示す。図４では、種々のオリゴについて、力に対する遮断時間を示す。力が大きくなるほど、遮断時間が長くなる。突然変異がまさに最初のヌクレオチドか最後のヌクレオチドにあれば、その遮断時間に対する影響は最小の５分の１となる。予想されたように、この低下は誤対合の性質に依存し、一般に、ＡＴに対する誤対合は遮断時間を２０分の１にするが、ＧＣの誤対合は６０分の１にする。

遮断時間は、誤対合がオリゴの中央にある場合に劇的に短くなる
図４に見て取れるように、オリゴヌクレオチドの中央における誤対合は、力が最大の時にのみ見られる極めて短い遮断を生じる。このような誤対合から生じる遮断時間の短縮は、同じ力条件で１００分の１を切る。

遮断時間は温度およびバッファー条件に依存する
図５ａに見られるように、温度が高くなるほど、遮断時間は著しく短縮される。また、バッファー条件も遮断時間を調節し、マグネシウム、ベタインおよび塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣはモル濃度で用いる）は、これらの実験で用いたバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＡｃ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２％ＢＳＡ）に比べて遮断時間を著しく延長する。これらの化合物はＧＣ対よりもＡＴ対を強くするので、これらの対の間の強度の差を小さくする。

ＲＮＡまたはＬＮＡオリゴヌクレオチドを用いると遮断時間が延長される
ＲＮＡおよびＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドよりもｓｓＤＮＡと強いハイブリッドを形成する。同じ標的配列では、遮断時間は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに比べてＲＮＡオリゴヌクレオチドでは２倍になる。

ＬＮＡヌクレオチドはさらに劇的な影響を示し、１個のヌクレオチドがＤＮＡからＬＮＡへ変わると、そのオリゴヌクレオチド全体の遮断時間が２倍になる。３つの塩基がＤＮＡからＬＮＡへ変わると、遮断時間は５倍になる。総てのヌクレオチドがＤＮＡからＬＮＡへ変わると、１０の塩基ＬＮＡオリゴヌクレオチドの遮断時間が１時間を超えるといった劇的な影響が出る。オリゴヌクレオチドのサイズをＬＮＡ６塩基まで小さくすると、１秒という妥当な遮断時間が得られる。

ＤＮＡオリゴヌクレオチドの場合では、これらの選択的オリゴヌクレオチド（ＬＮＡまたはＲＮＡ）の１つによる遮断の平均時間を測定することにより、それが相補的オリゴヌクレオチドとの完全なハイブリダイゼーションによるものであるかどうか、また、そうでなければ誤対合がどこにあるか（例えば、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの中央かその一方の末端付近か）といった、その性質を決定することができる。

検出可能なオリゴヌクレオチドの長さ
遮断時間はオリゴヌクレオチド長に指数関数的に依存することから、このパラメーターは大きく変えることができない。オリゴヌクレオチドが小さすぎると（室温で８塩基より小さい）、遮断時間が短すぎて検出することができない。オリゴが大きすぎると（室温で１２塩基より大きい）、遮断時間が長すぎるようになる。

酵素がハイブリッドを安定化し得る
ＮＴＰを含まずにｇｐ４３ ＤＮＡポリメラーゼを添加すると、オリゴヌクレオチドの遮断時間が長くなる。これはハイブリダイズしたプライマーがポリメラーゼの基質であるためであると思われる。ｇｐ４３ポリメラーゼはオリゴの遮断時間を１０倍にする。

ハイブリダイゼーションパラメーターの概要
オリゴの長さは重要なパラメーターであり、室温で実用的な遮断時間を有するオリゴヌクレオチドの長さは８〜１２塩基まで様々である。同じ分子に対して一連の開／再閉実験を容易に行い、開状態期においてオリゴヌクレオチドとＤＮＡの対合により再閉する際の平均遮断時間を測定することができる。この時間はオリゴヌクレオチドのサイズ、再閉の際にかけられた力、温度およびイオン濃度に依存する。対合した断片が誤対合を示せば、遮断時間は有意に（少なくとも１０分の１）、かつ、定量可能に短くなる。従って、機械的開／再閉技術により、既知のオリゴヌクレオチド配列と未知配列のＤＮＡ断片の間の対合の位置および安定性を即、プローブすることができる（図１ｃおよび図２参照）。これらの知見は、ＤＮＡ配列決定および診断における適用の種々の実装形態を示唆する。

ハイブリダイゼーションの機械的検出による診断および配列決定
種々のオリゴヌクレオチド（流体チャンバーに連続的に導入する）を有する表面を、ビーズに固定されているＤＮＡヘアピンでプローブすることにより、既知配列上にあり得る突然変異の存在を決定すること（プローブオリゴヌクレオチドとの誤対合が起こり、再閉中の停止が短くなる）、または分子上の既知プローブの位置を決定することにより未知のＤＮＡの配列決定を行うことが可能となる（図６参照）。

別の態様では、配列決定される核酸が、ハイブリダイズプローブの位置の決定を増進するために拡大タグの使用によって再設計される。図７に報告されている実験では、特定の塩基、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの全存在がそれぞれ対応する拡大タグ（この場合には８マーのオリゴヌクレオチド）で置換された。図７に示されるように、遮断位置は、その配列から予想される位置と完全に一致する。

Claims (26)

1. 核酸配列を決定する方法であって、
   ａ）前記核酸配列に相当する二本鎖核酸分子を、該分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
   ｂ）一本鎖核酸分子を得る工程；
   ｃ）前記二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程；および
   ｄ）前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
   を含んでなる、方法。
2. 前記二本鎖核酸分子がヘアピンである、請求項１に記載の方法。
3. 前記二本鎖核酸の一方の鎖の少なくとも１つの塩基が表面に直接的または間接的に結合され、前記二本鎖核酸の他方の鎖の少なくとも１つの塩基が可動表面に結合される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記二本鎖核酸が、工程ａ）において支持体を引き離すことによって変性される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 支持体を引き離すことによって、前記二本鎖分子に１５ｐＮ以上、好ましくは１７ｐＮ以上、より好ましくは１８ｐＮ以上の物理的力がかけられる、請求項４に記載の方法。
6. 変性した二本鎖核酸が、工程ｃ）において支持体を一緒にすることによって復元される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記二本鎖分子にかけられる力が、支持体を一緒にすることによって１２ｐＮ以下、好ましくは１１ｐＮ以下、より好ましくは１０ｐＮ以下に低減される、請求項６に記載の方法。
8. 支持体に結合されていない前記二本鎖核酸の末端が、共有結合的にまたは非共有結合的に互いに連結される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 工程ａ）〜ｄ）が数回繰り返される（測定値を蓄積し、シグナル／ノイズ比を高めるために）、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 工程ｄ）の検出が、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離（ｚ）を測定することを含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記二本鎖核酸分子が変性された際に、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離（ｚ_ｈｉｇｈ）を測定するさらなる工程を含んでなる、請求項１０に記載の方法。
12. ・ｚとｚ_ｈｉｇｈを比較する工程、および
    ・遮断位置を決定する工程
    をさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記遮断の持続時間を測定するさらなる工程を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記遮断の持続時間を参照値と比較するさらなる工程を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記一本鎖核酸分子がｎマーの一本鎖核酸分子のライブラリーから選択され、該ライブラリーが、あり得る総ての組合せのｎ−２またはｎ−３個のヌクレオチドとそれぞれ連結された、あり得る総ての組合せのジまたはトリヌクレオチドからなり、ｎは整数、好ましくは３０以下である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記ジまたはトリヌクレオチドが前記一本鎖核酸分子の中央に位置する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ジまたはトリヌクレオチドが前記一本鎖核酸分子の中央をはずれて位置する、請求項１５に記載の方法。
18. 前記二本鎖核酸中の、４つの塩基、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミジンのうち少なくとも１つの各存在が特定の拡大タグで置換され、前記拡大タグがオリゴヌクレオチドである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記一本鎖核酸が前記拡大タグのうち１つに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記二本鎖核酸分子上の前記一本鎖核酸の各遮断位置を決定するさらなる工程を含んでなる、請求項１８または１９に記載の方法。
21. 工程ａ）〜ｄ）と前記二本鎖核酸分子上の一本鎖核酸の各遮断位置を決定するさらなる工程が、前記拡大タグに相補的な各オリゴヌクレオチドを用いて連続的に繰り返される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. ｉ）上流一本鎖核酸プライマーに、隣接するハイブリダイズした一本鎖核酸を連結する工程、および
    ｉｉ）
    α 前記二本鎖核酸を、前記の連結されたプライマーの存在下で変性させ、復元すること、および
    β 前記復元の遮断を検出すること
    によって前記プライマーの伸長をモニタリングする工程
    をさらに含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
23. 工程（ｉ）〜（ｉｉ）が異なる一本鎖核酸を用いて繰り返される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記一本鎖核酸分子がｎマーの一本鎖核酸分子のライブラリーから選択され、該ライブラリーが、あり得る総ての組合せのｎ−２個のヌクレオチドと３’末端において連結された、あり得る総ての組合せのジヌクレオチドからなり、ｎは整数、好ましくは２０以下である、請求項２２または２３に記載の方法。
25. 新たに合成された鎖が放出または解離される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 請求項２２〜２５に記載の工程が、請求項２２のプライマーに関してヌクレオチド１個分上流または下流にシフトしたプライマーを用いて繰り返される、核酸配列の決定方法。

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