JP2013526870A - ハイブリダイゼーションによるdna配列決定法 - Google Patents
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Abstract
Description
2)標識ヌクレオチド(蛍光団または他の何らかの基を用いる)よりもはるかに安い標準的な一本鎖核酸分子が使用されるため、当技術分野の方法よりもはるかにコストが安い。さらに、単一の二本鎖核酸分子の配列が決定されるので、標準的な一本鎖核酸分子の量が最小限にまで低減される。加えて、少なくともいくつかの実施態様では、プロービング鎖は配列決定プロセスの間に消耗されないので、再利用することができる。
3)二本鎖核酸分子の二末端間の距離を測定することにより、二本鎖核酸に沿って対合した一本鎖核酸分子の局在の決定を可能にする(bp単位で)。
4)所与の二本鎖核酸ヘアピン上のオリゴヌクレオチドの異なるハイブリダイゼーション位置を1回の変性アッセイで決定することが可能である。
5)測定は、秒単位の時間尺度で周期的に繰り返すことができ、従って偽陽(ポリメラーゼの偽停止)の排除、統計値の改善および計測機器のドリフトの大幅な減少につながる。
6)ハイブリダイズした一本鎖核酸は、(例えば、力もしくはイオン強度を低減することにより、またはヘリカーゼもしくはエキソヌクレアーゼを用いることにより)変性段階の完了の際に放出させることができるため、実験は同じ分子で何回も繰り返し行うことができ、従って統計値を改善し、かつ測定値の信頼性を改善することができる。
7)各分子を他の分子とは独立して操作することができるため、種々の二本鎖核酸分子の並列配列決定が可能となる。
・前記核酸配列に相当する二本鎖核酸分子を、その分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;および
・前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる。
a)前記核酸配列に相当する二本鎖核酸分子を、該分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
b)一本鎖核酸分子を得る工程;
c)前記二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程;および
d)前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる方法に関する。
・前記核酸配列に相当する前記二本鎖核酸分子を、該分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
・一本鎖核酸分子を得る工程;
・前記二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程;
・前記二本鎖核酸分子の復元の遮断を検出する工程;および
・停止の持続時間を決定する工程
を含んでなる。
DNAの調製
未知の配列であり数十〜数千の間の塩基対からなるサイズの二本鎖(ds)DNA断片を、一方の先端においてDNAループに連結する。そのもう一方の先端をdsDNA断片に連結すれば、その2つの鎖を異なるコーティングの表面に結合させることができる。例えば、一方の鎖の遊離3’末端をビオチンで標識してストレプトアビジンでコーティングしたビーズに結合させ、反対の鎖の5’末端はジゴキシゲニンで標識して抗Dig抗体でコーティングした表面に結合させることができる。この末端標識は、例えばビオチン(またはdig)修飾ヌクレオチドを付加するためのターミナルトランスフェラーゼの使用、または適切に標識されたオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションなど、当業者に公知の様々な方法で行うことができる。
このDNA構築物を、それが、その標識された(例えば、ビオチン)一方の末端が結合する適当なビーズ(例えば、ストレプトアビジンでコーティングしたもの)の溶液中で数分間インキュベートする。このビーズは、後に操作のために光ピンセットが使用されるならば透明であってよく、操作のために磁気トラップまたはピンセットが使用される場合は磁性ビーズであってよい。
これらの再閉の停止のうちの1つの期間におけるDNA分子の伸長(ビーズと表面との距離)を測定することにより、遮断の位置をナノメーター精度で決定することが可能である(1nmはssDNAにおいて10pNの力の下で2つのヌクレオチド(1bp)にわたる距離に相当する)。開いている構造は、塩基対に対する伸長の最大比を示す(dsDNAにおいてその比はわずか0.34nm/bpである)。
・測定方法の精度;
・ビーズのブラウン運動。
遮断強度は、遮断確率Pblock(=遮断を示すサイクル数/全サイクル数)と平均遮断時間τblockの2つのパラメーターによって特徴付けることができる。Pblockはkonとオリゴヌクレオチド濃度に依存するが、τblockはkoffにのみ依存し、ここで、konとkoffはそれぞれ結合反応定数と解離反応定数である。図2では、オリゴヌクレオチド長および力による典型的なτblockの変動を表す。一塩基誤対合はτblockに、オリゴヌクレオチド長を少なくともヌクレオチド1個分低減することおよび遮断時間を5分の1にすることに相当する劇的な影響を示す。
図4に示されるように、ヘアピンと完全な一致を形成する12塩基のオリゴは、1つの誤対合を持つ同じオリゴに比べ、大きく異なる遮断時間を示す。図4では、種々のオリゴについて、力に対する遮断時間を示す。力が大きくなるほど、遮断時間が長くなる。突然変異がまさに最初のヌクレオチドか最後のヌクレオチドにあれば、その遮断時間に対する影響は最小の5分の1となる。予想されたように、この低下は誤対合の性質に依存し、一般に、ATに対する誤対合は遮断時間を20分の1にするが、GCの誤対合は60分の1にする。
図4に見て取れるように、オリゴヌクレオチドの中央における誤対合は、力が最大の時にのみ見られる極めて短い遮断を生じる。このような誤対合から生じる遮断時間の短縮は、同じ力条件で100分の1を切る。
図5aに見られるように、温度が高くなるほど、遮断時間は著しく短縮される。また、バッファー条件も遮断時間を調節し、マグネシウム、ベタインおよび塩化テトラメチルアンモニウム(TMACはモル濃度で用いる)は、これらの実験で用いたバッファー(25mM Tris pH7.5、150mM KAc、10mM MgCl2、0.2%BSA)に比べて遮断時間を著しく延長する。これらの化合物はGC対よりもAT対を強くするので、これらの対の間の強度の差を小さくする。
RNAおよびLNAオリゴヌクレオチドは、DNAオリゴヌクレオチドよりもssDNAと強いハイブリッドを形成する。同じ標的配列では、遮断時間は、DNAオリゴヌクレオチドに比べてRNAオリゴヌクレオチドでは2倍になる。
遮断時間はオリゴヌクレオチド長に指数関数的に依存することから、このパラメーターは大きく変えることができない。オリゴヌクレオチドが小さすぎると(室温で8塩基より小さい)、遮断時間が短すぎて検出することができない。オリゴが大きすぎると(室温で12塩基より大きい)、遮断時間が長すぎるようになる。
NTPを含まずにgp43 DNAポリメラーゼを添加すると、オリゴヌクレオチドの遮断時間が長くなる。これはハイブリダイズしたプライマーがポリメラーゼの基質であるためであると思われる。gp43ポリメラーゼはオリゴの遮断時間を10倍にする。
オリゴの長さは重要なパラメーターであり、室温で実用的な遮断時間を有するオリゴヌクレオチドの長さは8〜12塩基まで様々である。同じ分子に対して一連の開/再閉実験を容易に行い、開状態期においてオリゴヌクレオチドとDNAの対合により再閉する際の平均遮断時間を測定することができる。この時間はオリゴヌクレオチドのサイズ、再閉の際にかけられた力、温度およびイオン濃度に依存する。対合した断片が誤対合を示せば、遮断時間は有意に(少なくとも10分の1)、かつ、定量可能に短くなる。従って、機械的開/再閉技術により、既知のオリゴヌクレオチド配列と未知配列のDNA断片の間の対合の位置および安定性を即、プローブすることができる(図1cおよび図2参照)。これらの知見は、DNA配列決定および診断における適用の種々の実装形態を示唆する。
種々のオリゴヌクレオチド(流体チャンバーに連続的に導入する)を有する表面を、ビーズに固定されているDNAヘアピンでプローブすることにより、既知配列上にあり得る突然変異の存在を決定すること(プローブオリゴヌクレオチドとの誤対合が起こり、再閉中の停止が短くなる)、または分子上の既知プローブの位置を決定することにより未知のDNAの配列決定を行うことが可能となる(図6参照)。
Claims (26)
- 核酸配列を決定する方法であって、
a)前記核酸配列に相当する二本鎖核酸分子を、該分子に物理的力をかけることによって変性させる工程;
b)一本鎖核酸分子を得る工程;
c)前記二本鎖核酸分子を、前記一本鎖核酸分子の存在下で復元する工程;および
d)前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる、方法。 - 前記二本鎖核酸分子がヘアピンである、請求項1に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸の一方の鎖の少なくとも1つの塩基が表面に直接的または間接的に結合され、前記二本鎖核酸の他方の鎖の少なくとも1つの塩基が可動表面に結合される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸が、工程a)において支持体を引き離すことによって変性される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 支持体を引き離すことによって、前記二本鎖分子に15pN以上、好ましくは17pN以上、より好ましくは18pN以上の物理的力がかけられる、請求項4に記載の方法。
- 変性した二本鎖核酸が、工程c)において支持体を一緒にすることによって復元される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二本鎖分子にかけられる力が、支持体を一緒にすることによって12pN以下、好ましくは11pN以下、より好ましくは10pN以下に低減される、請求項6に記載の方法。
- 支持体に結合されていない前記二本鎖核酸の末端が、共有結合的にまたは非共有結合的に互いに連結される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 工程a)〜d)が数回繰り返される(測定値を蓄積し、シグナル/ノイズ比を高めるために)、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 工程d)の検出が、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離(z)を測定することを含んでなる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸分子が変性された際に、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離(zhigh)を測定するさらなる工程を含んでなる、請求項10に記載の方法。
- ・zとzhighを比較する工程、および
・遮断位置を決定する工程
をさらに含んでなる、請求項11に記載の方法。 - 前記遮断の持続時間を測定するさらなる工程を含んでなる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遮断の持続時間を参照値と比較するさらなる工程を含んでなる、請求項13に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸分子がnマーの一本鎖核酸分子のライブラリーから選択され、該ライブラリーが、あり得る総ての組合せのn−2またはn−3個のヌクレオチドとそれぞれ連結された、あり得る総ての組合せのジまたはトリヌクレオチドからなり、nは整数、好ましくは30以下である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ジまたはトリヌクレオチドが前記一本鎖核酸分子の中央に位置する、請求項15に記載の方法。
- 前記ジまたはトリヌクレオチドが前記一本鎖核酸分子の中央をはずれて位置する、請求項15に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸中の、4つの塩基、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミジンのうち少なくとも1つの各存在が特定の拡大タグで置換され、前記拡大タグがオリゴヌクレオチドである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸が前記拡大タグのうち1つに相補的なオリゴヌクレオチドである、請求項18に記載の方法。
- 前記二本鎖核酸分子上の前記一本鎖核酸の各遮断位置を決定するさらなる工程を含んでなる、請求項18または19に記載の方法。
- 工程a)〜d)と前記二本鎖核酸分子上の一本鎖核酸の各遮断位置を決定するさらなる工程が、前記拡大タグに相補的な各オリゴヌクレオチドを用いて連続的に繰り返される、請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法。
- i)上流一本鎖核酸プライマーに、隣接するハイブリダイズした一本鎖核酸を連結する工程、および
ii)
α 前記二本鎖核酸を、前記の連結されたプライマーの存在下で変性させ、復元すること、および
β 前記復元の遮断を検出すること
によって前記プライマーの伸長をモニタリングする工程
をさらに含んでなる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。 - 工程(i)〜(ii)が異なる一本鎖核酸を用いて繰り返される、請求項22に記載の方法。
- 前記一本鎖核酸分子がnマーの一本鎖核酸分子のライブラリーから選択され、該ライブラリーが、あり得る総ての組合せのn−2個のヌクレオチドと3’末端において連結された、あり得る総ての組合せのジヌクレオチドからなり、nは整数、好ましくは20以下である、請求項22または23に記載の方法。
- 新たに合成された鎖が放出または解離される、請求項22〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項22〜25に記載の工程が、請求項22のプライマーに関してヌクレオチド1個分上流または下流にシフトしたプライマーを用いて繰り返される、核酸配列の決定方法。
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