CN118056021A

CN118056021A - 通过使用引导聚合物来确定样品中的靶聚合物的方法

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Publication number: CN118056021A
Application number: CN202280065661.5A
Authority: CN
Inventors: 拉科马·尼尚萨·贾亚辛格; 伊丽莎白·杰恩·华莱士; 理查德·亚历山大·古铁雷斯; 米歇尔·安妮·邓斯通; 布拉德利·艾伦·斯派塞
Original assignee: Monash University; Oxford Nanopore Technology Public Co ltd
Current assignee: Monash University; Oxford Nanopore Technology Public Co ltd
Priority date: 2021-10-04
Filing date: 2022-10-04
Publication date: 2024-05-17
Also published as: AU2022358916A1; CA3232166A1; WO2023057432A1; GB202114183D0

Abstract

本发明一般涉及一种使用生物孔检测和/或分析靶聚合物、尤其是靶多核苷酸的方法。本发明还涉及一种用于执行所述方法的新系统。所述方法具有很多用途。特别地，所述方法可以用于诊断、多态性检测和V(D)J组库分析。

Description

通过使用引导聚合物来确定样品中的靶聚合物的方法

技术领域

本发明一般涉及一种使用生物孔检测和/或分析靶聚合物、尤其是靶多核苷酸的方法。本发明还涉及一种用于执行该方法的新系统。该方法具有很多用途。特别地，该方法可以用于诊断、多态性检测和V(D)J组库分析。

背景技术

目前，广泛的应用需要快速且廉价的聚合物(例如，DNA或RNA)测序和识别技术。现有技术缓慢且昂贵，主要是因为它们依赖扩增技术来产生大量多核苷酸，并且需要大量专业荧光化学品来进行信号检测。

生物孔(和其他纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接电生物传感器具有巨大的潜力。特别地，最近已经关注到纳米孔作为潜在的DNA测序技术。

当跨越纳米孔施加电位时，在分析物(诸如核苷酸)短暂驻留在桶中达某个时间段的情况下，电流发生变化。核苷酸的纳米孔检测给出了已知特征和持续时间的电流变化。在链测序方法中，单条多核苷酸链穿过孔并得出核苷酸的身份。链测序可以涉及使用分子煞车来控制多核苷酸通过孔的运动。

固态孔已被用于使用含有Cas9的探针来识别靶DNA序列(Yang等人,NanoLett.2018,18,10,6469–6474和Weckman等人,ACS Sens.2019,4,8,2065–2072)。

发明内容

本发明人已经确认了生物孔与引导聚合物(诸如RNA和DNA)以及聚合物引导的效应蛋白(诸如形成CRISPR基因编辑机制的一部分的RNA引导的效应蛋白和DNA引导的效应蛋白)的组合的新用途。特别地，本发明人设计了修饰的引导RNA序列，其可以与相关RNA引导的效应蛋白结合使用以测试样品中一种或多种靶多核苷酸的存在、不存在或量。本发明人已经开发了使用引导聚合物(诸如RNA)和聚合物引导的效应蛋白(诸如引导RNA引导的效应蛋白)与生物孔结合来检测靶聚合物的方法。特别地，本发明人已经令人惊讶地确认了靶聚合物和聚合物引导的效应蛋白与生物孔有区别地相互作用并产生不同的电测量。电测量之间的这些差异可以用于更有效地识别靶聚合物的存在或不存在。由聚合物引导的效应蛋白与生物孔之间的相互作用产生的电测量变化与固态孔观察到的那些变化完全不同(Weckman等人,ACS Sens.2019,4,8,2065–2072和Yang等人上文)。与和靶聚合物相关的电效应相比，聚合物引导的效应蛋白与生物孔产生的电效应更长、更明显且更复杂。这种类型的效应在固态孔中未见(Yang等人和Weckman等人(上文)在Cas9产生的电流中观察到短暂而剧烈的阻塞)。本发明人相信这种令人惊讶的电效应是由于与生物孔的意外相互作用产生的。如下文更详细地讨论的，不同的聚合物引导的效应蛋白能够产生不同的电效应(即，不同的信号)并且这可以在本发明的上下文中利用(例如，以检测不同的靶聚合物)。

该方法可以以多种方式进行，但共同点是它们使用引导聚合物(诸如引导RNA)和聚合物引导的效应蛋白(诸如RNA引导的效应蛋白)来选择靶聚合物(诸如靶多核苷酸)，并且涉及将包含靶聚合物、引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白的复合物递送至生物孔。该方法可以扩展到其他聚合物引导的蛋白质效应系统，包括使用C2c2的RNA编辑系统。引导聚合物，诸如引导RNA，可以具体适合用于基于纳米孔的检测方法。

本发明人开发的方法是灵敏的并且可以用于检测样品中痕量的靶聚合物，而不需要单独的分离步骤来从样品中的其他组分中提取靶聚合物。因此，该方法简单并且不需要复杂的步骤，诸如富集或纯化步骤。因此，该方法是快速的并且可以用于获得快速结果以及从粗制和/或“脏”样品获得结果。因此，该方法在需要快速诊断的诊断环境中特别有用。该方法在靶向基因或基因组的特定片段或区域中也特别有用。该方法的一个主要益处是在测量靶标或衔接子之前不需要主动从靶聚合物中去除聚合物引导的效应蛋白。靶聚合物通常被检测或表征，同时仍与聚合物引导的效应蛋白结合。在一些实施例中，该方法使用专门设计的引导聚合物来促进靶聚合物与样品中的其他组分的分离。

该方法使得能够在含有许多其他聚合物序列的样品中对聚合物序列(诸如多核苷酸序列)中的目的区域进行表征，例如测序，因为其固有地包括分离步骤。例如，可以仅对大基因组中存在的目的基因进行测序。测序可以限于含有SNP的区域，或其他目的区域，诸如T细胞中的V(D)J区域。这提高了灵敏度和效率，无需复杂或耗时的片段化或下拉样品制备方法即可访问所需信息。它还减少了进行纳米孔实验所花费的时间，因为仅测量目的靶聚合物(诸如靶多核苷酸)的片段，或者测量其相对于样品中的总聚合物片段增加的比例。当非靶聚合物的量超过靶聚合物的量时，由于去除了或减少了测量非靶聚合物的需要，因此可以显著减少检测靶聚合物所花费的时间。该方法还受益于不需要PCR或其他靶标富集方法。

本发明提供了：

-一种确定样品中靶聚合物的存在或不存在的方法，该方法包括：

a)使该样品与引导聚合物接触，该引导聚合物(i)与该靶聚合物的一部分结合并且(ii)与聚合物引导的效应蛋白结合或附接，其中该引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白与该样品中存在的任何靶聚合物形成复合物；

b)使该样品与包含生物孔的膜接触，该生物孔具有允许该复合物通过该孔的转位的开口；

c)跨越该膜施加电位差并进行一项或多项电测量；以及

d)监测由于该复合物通过该孔的转位而产生的电效应的存在或不存在，并且从而确定该样品中该靶聚合物的存在或不存在；以及

-一种用于确定样品中靶聚合物的存在或不存在的系统，该系统包括：

a)引导聚合物，其(i)若该靶聚合物存在，则与该靶聚合物的一部分结合并且(ii)与聚合物引导的效应蛋白结合或附接，其中该引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白与该样品中存在的任何靶聚合物形成复合物；以及

b)具有开口的生物孔，该开口允许该复合物通过该孔的转位。

附图说明

应当理解，附图仅用于说明本发明的特定实施例的目的，而不旨在进行限制。

图1显示了顺式室中用5nM 3.6kb DNA在100mV下获得的电流迹线的实例。信号中的尖峰对应于DNA通过孔的转位。

图2显示了在80mV下获得的电流迹线的实例，其中附接有单一Cas9探针的DNA样品在流通池中。Cas9探针以Enlam86作为crRNA，其与距一端约387个碱基的3.6kb链上的位置3213结合。在此实例中，最接近Cas9的DNA末端首先进入孔，如漫画所示，并通过在Cas9信号之后而不是之前观察到的归因于DNA的信号来证明。

图3显示了在80mV下获得的电流迹线的实例，其中附接有单一Cas9探针的DNA样品在流通池中。Cas9探针以Enlam86作为crRNA，其与距一端约387个碱基的3.6kb链上的位置3213结合。在此实例中，最接近Cas9的DNA末端最后进入孔，如漫画所示，并通过在Cas9信号之前而不是之后观察到的归因于DNA的信号来证明。

图4显示了在80mV下获得的电流迹线的实例，其中附接有单一Cas9探针的DNA样品在流通池中。Cas9探针以Enlam87作为crRNA，其与接近DNA中部的3.6kb链上的位置2057结合。在Cas9信号之前和之后都观察到归因于DNA的信号。

图5显示了在100mV下获得的电流迹线的实例，其中附接有两个Cas9探针的DNA样品在流通池中。Cas9探针具有AR837或Enlam51，它们分别与3.6kb链上的位置218和3368结合，并引起超过3000个碱基的分隔。在两个Cas9信号之间，但不在第一个信号之前或第二个信号之后观察到归因于DNA的信号。

图6显示了在800mV下获得的电流迹线的实例，其中附接有三个Cas9探针的DNA样品在流通池中。Cas9探针具有Enlam5、Enlam26或Enlam45，它们分别与全长λ链上的位置4010、25515和44609结合，并引起探针之间约20000个碱基的分隔。在三个Cas9信号之间观察到归因于DNA的信号。该图注释了不同部分对应的内容。

图7显示了IV曲线电压概况的示意图。

具体实施方式

应当理解，所公开的产品和方法的不同应用可以根据本领域的具体需要来定制。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述本发明特定实施例的目的，而不希望是限制性的。

另外，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。因此，例如，提及“聚合物”包括两个(种)或更多个(种)聚合物，“多核苷酸”包括两个(种)或更多个(种)多核苷酸，提及“锚”指两个(种)或更多个(种)锚，提及“解旋酶”包括两个(种)或更多个(种)解旋酶，并且提到“孔”包括两个(种)或更多个(种)孔等。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论上文还是下文，均特此通过引用整体并入。本说明书中所提到的所有公开、专利和专利申请均通过相同的程度引用结合在此，如同特定且单独地指示每个单独的公开、专利或专利申请是通过引用并入的。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾的程度上，说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾材料。

术语

在本文的所有情况下，措辞“确定靶聚合物的存在或不存在”可与“检测靶聚合物”互换。因此，本发明的方法可以涉及一种检测靶聚合物的方法，并且步骤(d)可以包括检测由复合物通过孔的转位产生的电效应，并且从而检测样品中的靶聚合物。本发明的系统可以用于检测样品中的靶聚合物。

本发明的方法

本发明提供了一种确定样品中靶聚合物的存在或不存在的方法，该方法包括四个步骤。在步骤(a)中，使样品与引导聚合物接触，该引导聚合物(i)与靶聚合物的一部分结合并且(ii)与聚合物引导的效应蛋白结合或附接，其中该引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白与样品中存在的任何靶聚合物形成复合物。使样品与引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白接触。在步骤(b)中，使样品与包含生物孔的膜接触，该生物孔具有允许复合物通过孔的转位的开口。在步骤(c)中，跨越膜施加电位差并进行一项或多项电测量。在步骤(d)中，监测由于复合物通过孔的转位而产生的电效应的存在或不存在，并确定样品中靶聚合物的存在或不存在。复合物包含靶聚合物(如果存在)和聚合物引导的效应蛋白，并且因此复合物通过孔的转位而产生的电效应能够提供有关靶聚合物和蛋白质二者的信息。这将在下面更详细地讨论。步骤(a)和(b)可以同时执行或以任一顺序依次执行。

该方法可以包括(a)使样品与引导聚合物接触，该引导聚合物(i)与靶聚合物中的序列结合并且(ii)与聚合物引导的效应蛋白结合或附接以形成复合物，其中使样品与包含生物孔的膜接触，该生物孔具有允许复合物通过孔的转位的收缩部，并且其中向孔施加电位；以及(b)当复合物的至少一部分相对于孔移动时进行一项或多项电测量以检测复合物的存在或不存在，从而确定样品中靶聚合物的存在或不存在。步骤(b)可以包括测量流过孔的电流。

在一些实施例中，该方法包括：(a)使样品与引导聚合物、聚合物引导的效应蛋白和包含具有允许复合物通过孔的转位的收缩部的生物孔的膜接触，该引导聚合物与靶聚合物中的序列结合；(b)跨越膜施加电位差；以及(c)进行一项或多项电测量，或测量由样品、引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白与孔的相互作用产生的另一信号，以确定包含引导聚合物、聚合物引导的效应蛋白和靶聚合物的复合物的存在或不存在，从而确定样品中靶聚合物的存在或不存在。步骤(c)可以包括测量流过孔的电流。

该方法可以以多种不同的方式执行。该方法可以用于进行多种不同应用。该方法可以用于例如确定单一靶聚合物或多种靶聚合物的存在或不存在。该方法可以是定量的。例如，可以使用本发明的方法确定样品中存在的靶聚合物的量(诸如浓度)和/或可以确定样品中存在的不同聚合物的相对量。该方法可以提供关于靶聚合物的进一步信息，诸如多态性的存在或不存在和/或多态性的身份。

该方法可以包括确定与引导聚合物附接的衔接子是否与孔相互作用。可以执行该方法使得包含未与靶聚合物结合的衔接子的引导聚合物不与孔相互作用。通常，在将跨膜电位施加到膜之前，此类未结合的引导聚合物被洗掉。靶聚合物可以被系链至表面，例如系链至膜，以防止包含衔接子的结合的引导聚合物被洗掉。靶聚合物可以具有直接与其附接(例如与其末端中的一者附接)的系链，诸如膜锚。可替代地，包含系链(诸如膜锚)的第二引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白可以用于将靶聚合物系链至表面(例如，膜)。

靶聚合物所系链的表面可以是珠。

衔接子通常是靶聚合物所独有的，并在与孔相互作用时产生独特的信号。可以将多个引导聚合物添加到样品中，以基于由不同的衔接子与孔相互作用引起的不同信号来检测和/或定量不同的靶聚合物，每个引导聚合物对不同的靶聚合物具有选择性并具有不同的衔接子。在该实施例中，衔接子可以被认为包含条形码。

该方法可以使用与不同聚合物序列结合的多个引导聚合物。不同的聚合物序列可以例如是同一靶聚合物中的不同序列(例如，靶聚合物的不同部分)、不同靶聚合物的序列或靶聚合物内的替代序列，诸如涵盖多态性的序列，例如单核苷酸多态性(SNP)。步骤(a)优选包括使样品与两个或更多个引导聚合物接触，其中两个或更多个引导聚合物与靶多核苷酸中的不同序列或不同靶多核苷酸的序列结合。

在一些实施例中，该方法可以包括进一步表征靶聚合物。例如，该方法可以包括对全部或部分靶聚合物(诸如靶多核苷酸)进行测序。

在一些实施例中，该方法使用两个或更多个引导聚合物和两个或更多个聚合物引导的效应蛋白。例如，步骤(a)优选包括使样品和孔与两个或更多个引导聚合物接触，每个引导聚合物与靶聚合物的一部分和两个或更多个聚合物引导的效应蛋白结合，其中两个或更多个引导聚合物和两个或更多个聚合物引导的效应蛋白与样品中存在的任何靶聚合物形成两个或更多个复合物。可以使用任何数量的两个或更多个引导聚合物和引导聚合物引导的效应蛋白，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。两个或更多个引导聚合物的数量通常与两个或更多个引导聚合物引导的效应蛋白的数量相同。复合物的数量通常与两个或更多个引导聚合物的数量和两个或更多个引导聚合物引导的效应蛋白的数量相同，并且可以是上面列出的任何数量。在这些实施例中，步骤(d)优选包括监测由两个或更多个复合物通过孔的转位而产生的电或电流效应的存在或不存在，并且从而确定样品中靶聚合物的存在或不存在。电或电流效应的数量通常与两个或更多个复合物的数量相同。两个或更多个引导聚合物优选与靶聚合物的不同序列或部分结合。那些序列或部分可以存在于不同的靶聚合物中、相同的靶聚合物内，或者可以是可以存在于靶聚合物中的替代序列，诸如SNP。两个或更多个引导聚合物优选与同一靶聚合物的不同部分结合。这意味着两个或更多个，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个复合物在单个靶聚合物上形成，通过孔转位，并产生多个电或电流效应。这将在下面更详细地讨论。两个或更多个聚合物引导的效应蛋白优选是不同的聚合物引导的效应蛋白或不同的RNA引导的效应蛋白。两个或更多个聚合物引导的效应蛋白优选是不同的聚合物引导的效应蛋白或不同的RNA引导的效应蛋白，优选地产生不同的电效应。两个或更多个聚合物引导的效应蛋白可以是下文更详细讨论的那些中的任一者。如果两个蛋白质是不同的蛋白质或蛋白质同源物(诸如Cas和Cpf1)，或者如果它们源自相同的蛋白质(诸如Cas9)，并且其中一者被修饰(例如，经由取代、缺失或添加)或者两者都以不同的方式被修饰，则它们是不同的。

在一些实施例中，该方法可以包括使用与靶聚合物的不同区域结合并形成两个或更多个复合物的两个或更多个引导聚合物和/或两个或更多个聚合物引导的效应蛋白来检测靶聚合物的存在、不存在或量，其中如果样品中存在靶聚合物，则两个或更多个不同的引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白与靶聚合物的结合通过生物孔产生可检测的电信号，例如可检测的电流变化，该生物孔允许复合物通过孔的转位。信号可以是引导聚合物/聚合物引导的效应复合物中一者中的衔接子的特征，其中当该引导聚合物与包含膜锚的第二引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白“连接”时仅或主要观察到该信号，并且当引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白都与靶聚合物结合时，才会发生这种“连接”。换言之，靶聚合物用于将包含衔接子的引导聚合物/聚合物引导的效应复合物“连接”至包含膜锚的引导聚合物/聚合物引导的效应复合物。在其中聚合物引导的效应蛋白包含膜锚的实施例中，附接可以经由蛋白质本身，例如通过使用strep-标签/flag-标签/his-标签进行。

在一些实施例中，该方法可以包括使用允许复合物通过孔的转位的生物孔，通过用对靶聚合物具有特异性的引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物标记每个靶聚合物来选择性地表征(例如测序)靶聚合物，使得可以选择性地对靶聚合物进行测序，而无需在使样品与孔接触之前将靶聚合物与样品中的其他聚合物分离。

例如，引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物可以用膜锚标记，使得只有靶聚合物被系链至膜。样品中的其他聚合物可以被洗掉。可替代地，可以例如使用本领域已知的技术将能够沿着聚合物移动的聚合物结合蛋白与样品中的聚合物的末端结合，并且可以例如通过添加聚合物结合蛋白运动所需的辅因子，在复合物形成之后使聚合物结合蛋白沿着聚合物移动。在该实施例中，结合的引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物使聚合物结合蛋白停滞在靶聚合物上，同时加工聚合物结合蛋白，使其离开非靶聚合物的末端。然后，当施加跨膜电位时，电位的力和与孔的接触使结合的引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物从靶聚合物中移位，使得靶聚合物通过孔转位。未结合聚合物结合蛋白的非靶聚合物如此快速地穿过孔以致于检测不到信号，或者使得获得的任何信号可以容易地与由靶聚合物与孔相互作用产生的信号区分。样品中聚合物(包括靶聚合物和非靶聚合物)的3'末端链可以例如使用核酸外切酶被降解。以这种方式，可以选择性地表征靶聚合物，例如测序。可以通过添加辅因子(诸如ATP或另一核苷，例如γsGTP)可以使聚合物结合蛋白沿着聚合物移动。

在另一个实施例中，聚合物引导的效应蛋白可以用于在选定点切割聚合物。这可以用于限制通过该方法获得的关于目的区域的信息，诸如序列信息。例如，可以使用两个具有核酸酶活性的聚合物引导的效应蛋白来获得目的聚合物片段。作为替代方案，具有灭活或失活的核酸酶活性的修饰的聚合物引导的效应蛋白可以用于使如上所述的聚合物结合蛋白停滞，并且第二聚合物引导的效应蛋白可以用于截短所表征的片段。该实施例例如在V(D)J组库分析应用中特别有用。

此外，在一些实施例中，引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物标记或标注靶聚合物，使得引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物对穿过孔的电流的影响可用于确定靶聚合物的存在或不存在、对确定靶聚合物进行定量或识别。

例如，引导聚合物或聚合物引导的效应蛋白可以与可以用于识别用膜锚标记的靶聚合物的衔接子附接，因为衔接子仅当其与系链至膜的靶聚合物结合时才会与孔相互作用。未结合的引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白可以被洗掉。可以将多个引导聚合物添加到样品中，以基于由不同的衔接子与孔相互作用引起的不同信号来检测和/或定量不同的靶聚合物，每个引导聚合物对不同的靶聚合物具有选择性并具有不同的衔接子。

可替代地，当靶聚合物穿过允许复合物通过孔的转位的生物孔时，与靶聚合物结合的引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物可以产生可检测的信号。

由于生物孔足够大以允许聚合物和结合的引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物通过，因此当引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物穿过孔时，聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物穿过孔将产生可识别的信号。下面更详细地讨论该信号。因此，一个或多个引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物可以用于识别靶聚合物。例如，引导聚合物可以被设计为仅当靶聚合物中存在特定多态性时才结合。当靶聚合物穿过孔时观察到的可归因于结合的引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物的信号数量，或者当靶聚合物穿过孔时特定信号的存在或不存在可以表明多态性的存在或不存在。通常修饰引导聚合物、聚合物引导的效应蛋白和/或靶聚合物中的一者或多者以使该方法能够执行。

该方法可以进一步包括确定靶聚合物(诸如靶多核苷酸)的量，或靶聚合物(诸如靶多核苷酸)的一个或多个特征。一个或多个特征通常选自(i)靶聚合物或多核苷酸的长度，(ii)靶聚合物或多核苷酸的身份，(iii)靶聚合物或多核苷酸的序列，(iv)靶聚合物或多核苷酸的二级结构以及(v)靶聚合物或多核苷酸是否被修饰。这些特征描述于WO 2018/060740中。(i)至(v)的任何组合可以根据本发明进行测量，诸如{i}、{ii}、{iii}、{iv}、{v}、{i,ii}、{i,iii}、{i,iv}、{i,v}、{ii,iii}、{ii,iv}、{ii,v}、{iii,iv}、{iii,v}、{iv,v}、{i,ii,iii}、{i,ii,iv}、{i,ii,v}、{i,iii,iv}、{i,iii,v}、{i,iv,v}、{ii,iii,iv}、{ii,iii,v}、{ii,iv,v}、{iii,iv,v}、{i,ii,iii,iv}、{i,ii,iii,v}、{i,ii,iv,v}、{i,iii,iv,v}、{ii,iii,iv,v}或{i,ii,iii,iv,v}。在所有(i)-(v)中，靶聚合物优选是靶多核苷酸。

步骤(a)可以进一步包括使样品与可以与复合物的一种或多种组分结合的珠(例如，微粒)接触。可替代地，(a)中使用的组分(例如，靶聚合物、引导聚合物或聚合物引导的效应蛋白)中的一者或多者可以与珠(例如，微粒)预结合。引导聚合物和/或聚合物引导的效应蛋白优选具有能够与和其附接的珠偶联的结合部分，并且在步骤(a)中引导聚合物或聚合物引导的效应蛋白与珠偶联，或者步骤(a)进一步包括使样品与珠接触。

可以在水性介质中提供样品，或者可替代地可以将样品添加到含有聚合物引导的效应蛋白和引导聚合物的水性介质中。水性介质将通常包含离子以在跨越膜施加电位差时提供通过孔的离子流。水性介质通常还包含缓冲液。水性介质通常具有6至9范围内的pH和/或约100至约200mM盐(诸如NaCl)范围内的离子浓度。

珠通常比水性介质更致密，并通过介质下沉以接触膜，从而有效地提高在膜表面处与锚附接的物质的浓度。

在该方法中，所施加的电位可以是电压电位。可替代地，所施加的电位可以是化学电位。其实例是跨越两亲层使用盐梯度。盐梯度公开于例如Holden等人,J Am ChemSoc.2007年7月11日:129(27):8650-5。

引导聚合物和/或效应蛋白可以与靶聚合物交联。

该方法可以用于在富集靶分子后检测复杂背景中的一种或多种，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或更多种靶聚合物。在一个实施例中，使用测序，例如纳米孔测序来进行检测。因此，在该实施例中，靶DNA分子可以主要通过其序列来识别。

该方法可以作为多重测定执行。多重测定可以利用不同的条形码。例如，不同的条形码可以位于不同的衔接子上。例如，条形码可以各自具有独特的核苷酸序列，使得条形码能够被孔识别。在一个实施例中，在使样品与引导聚合物和聚合物引导的结合蛋白接触之前，可以将条形码序列与样品中的所有聚合物连接。在使样品与引导聚合物和聚合物引导的结合蛋白接触之前，可以将第二条形码添加到第二样品中。第一和第二样品可以在添加引导聚合物和聚合物引导的结合蛋白之前或之后组合，优选在引导聚合物和聚合物引导的结合蛋白已与靶聚合物结合之后组合。当样品合并在引导聚合物和聚合物引导的结合蛋白已与靶聚合物结合之后发生时，可以在合并之前或之后执行纯化步骤(包括应激、非靶结合蛋白的去除和/或非靶聚合物的去除)。多个样品，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30个样品，可以用条形码标注，并且然后以这种方式组合。在该实施例中，所有样品可以同时测序，例如使用相同的流通池，并使用它们的条形码衔接子识别。

在另一个实施例中，可以在引导聚合物和聚合物引导的结合蛋白已与靶聚合物结合之后添加条形码和测序衔接子。例如，条形码和测序衔接子可以在珠上连接。在引导聚合物和聚合物引导的结合蛋白已与靶聚合物结合之后并且任选地在一个或多个纯化步骤(包括应激、非靶结合蛋白的去除和/或非靶聚合物的去除)已执行之后，可以将装载靶标的带条形码化的带衔接子的珠添加到样品中。

该方法可以包括去除未与靶聚合物特异性结合的任何聚合物引导的效应蛋白和/或引导聚合物，例如，引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物。样品中存在的未与靶聚合物结合的过量聚合物引导的效应蛋白和/或引导聚合物，例如引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物，在监测靶聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物与孔的相互作用时可以产生背景。可以通过将样品中的聚合物与表面(例如，珠或柱)结合来使未与靶聚合物特异性结合的引导聚合物、聚合物引导的效应蛋白和/或聚合物引导的效应蛋白/引导聚合物复合物与包含引导聚合物、聚合物引导的效应蛋白和靶聚合物的复合物分离。还可以通过将样品中的引导聚合物、聚合物引导的效应蛋白和/或聚合物引导的效应蛋白/引导聚合物复合物与表面(例如，珠或柱)结合来使靶聚合物与样品中的非靶聚合物分离。例如，可以经由引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物上的捕获部分通过‘下拉’将靶聚合物与背景分离。

该方法可以包括在步骤(b)之前选择性地使未与靶聚合物特异性结合的任何聚合物引导的效应蛋白变性。可以通过对结合的引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物施加热和/或化学应激来减少引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物结合的‘脱靶’效应。通常，在该实施例中，通过施加的热应激或化学应激选择性地使非靶标结合的聚合物引导的效应蛋白变性。可以选择所施加的热或化学处理，使得仅游离聚合物引导的效应蛋白(即，不与样品中的聚合物结合，但可以与引导聚合物结合的聚合物引导的效应蛋白)和非靶标结合的聚合物引导的效应蛋白(即，与样品中的聚合物非特异性结合的聚合物引导的效应蛋白，或“脱靶”聚合物引导的效应蛋白)变性。靶标结合的聚合物引导的效应蛋白在热应激或化学应激期间保持与靶聚合物结合。任何脱靶聚合物引导的效应蛋白都会从其与样品中聚合物的非特异性结合中释放出来。在一个实施例中，只有和与引导聚合物中的相应序列完全互补的靶序列结合的聚合物引导的效应蛋白在应激期间保持与聚合物结合。

可以使用任何合适的化学应激，诸如尿素(例如，高达6M、5M或4M)、盐酸胍、极端pH(酸性或碱性，诸如低于pH6、pH5或pH4或高于pH8、pH9或pH10)或高盐浓度。技术人员可以容易地确定合适的条件。

化学应激可以执行任何时间段，从而引起选择性破坏聚合物引导的效应蛋白与聚合物的非特异性结合，而不破坏聚合物引导的效应蛋白与靶聚合物的特异性结合。化学应激可以执行约30秒至约10分钟，诸如约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟或约9分钟。

热应激可以在任何合适的温度下执行。通常，温度高至足以破坏聚合物引导的效应蛋白与聚合物的非特异性结合，但低至足以使聚合物引导的效应蛋白与靶聚合物的特异性结合不被破坏。例如，可以将样品加热至约40℃至约65℃，诸如约45℃至约65℃、约50℃至约60℃、或约55℃的温度。

热应激可以执行任何时间段，从而引起选择性破坏聚合物引导的效应蛋白与聚合物的非特异性结合，而不破坏聚合物引导的效应蛋白与靶聚合物的特异性结合。热应激可以执行约30秒至约10分钟，诸如约1分钟、约2分钟、约3分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟或约9分钟。

纯化步骤可以用于去除过量的、未结合的聚合物引导的效应蛋白和/或引导聚合物。这可以通过例如向样品中添加聚乙二醇(PEG)和氯化钠并使样品与涂覆有羧基基团的顺磁珠接触使得样品中存在的聚合物与珠结合来实现。合适的珠包括商业可得的SPRI珠并且可以使用本领域已知的标准方案。在一个实施例中，随后可以使用表面(例如，不同的捕获珠)使靶聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物与非靶聚合物分离。通常，此处引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白可以含有用于将靶聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物与表面特异性结合的结合部分。任何未结合的聚合物都可以被洗掉。靶聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物可以通过任何合适的方式从表面洗脱，或者表面可以用于将复合物递送至孔，例如，当表面是珠时。

可以通过以下来进一步使‘脱靶’效应最小化：使用在引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白上(例如，在引导聚合物上)的第一结合部分纯化捕获表面上的靶聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物，洗脱靶聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物，并使用在引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白(例如，在引导聚合物上)上的第二结合部分将靶聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物转移至第二特异性捕获表面。这例如当第一结合部分和第二结合部分都是引导聚合物上的末端延伸或能够与寡核苷酸结合的其他单链聚合物序列时可以实现。引导聚合物上的第一末端延伸具有与第一捕获表面(例如，珠)上的第一捕获寡核苷酸互补的序列，并且引导聚合物上的第二末端延伸具有与第二捕获表面(例如，珠)上的第二捕获寡核苷酸互补的序列。一种配置方式是crRNA包含用于捕获珠、柱或表面上的靶聚合物的3'DNA延伸，并且tracrRNA包含5'DNA延伸。靶标从第一捕获表面(例如，珠)的释放可能会受到称为立足点置换的现象的影响。

首先通过在带有与第一末端延伸互补的第一捕获寡核苷酸的珠上捕获，将靶聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物与非靶聚合物分离。非靶聚合物被洗掉。靶聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物可以通过立足点置换经由添加与引导聚合物上的第一末端延伸竞争与珠的结合的竞争寡核苷酸而从珠洗脱。在该实施例中，第一捕获寡核苷酸比第一末端延伸长并且包含第一序列和第二序列，其中第一序列与第一末端延伸中的序列互补，并且第一和第二序列均与竞争寡核苷酸的序列互补。通常，第一序列具有约5至约40个核苷酸的长度，诸如约10至约30个核苷酸或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸，并且第二序列具有约5至约40个核苷酸的长度，诸如约10至约30个核苷酸或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸。竞争寡核苷酸可以具有约10至约80个核苷酸的长度，诸如约20至约60个核苷酸或者约30至约50个核苷酸，例如约40个核苷酸。第一捕获寡核苷酸可以具有约10至约80个核苷酸的长度，诸如约20至约60个核苷酸或者30至约50个核苷酸，例如40个核苷酸。捕获寡核苷酸可以具有与竞争寡核苷酸相同的长度，或者捕获寡核苷酸可以比竞争寡核苷酸更长或更短，条件是捕获寡核苷酸和竞争寡核苷酸具有在第一和第二序列上均互补的序列。在该实施例中，第一末端延伸包含：具有与第一捕获寡核苷酸中的序列不互补的序列的末端部分，该末端部分在5'末端延伸中的5'末端处或在3'末端延伸中的3'末端处，以及具有与第一捕获寡核苷酸中的第一序列互补的序列的部分。第一末端延伸的末端部分通常可以具有约2至约10个核苷酸的长度，诸如约3、4、5或6个核苷酸。第一末端延伸的与第一捕获寡核苷酸互补的部分通常可以具有约5至约40个核苷酸的长度，诸如约10至约30个核苷酸或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸。

靶聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物洗脱后，该复合物经由引导聚合物上的第二末端延伸与第二‘递送’珠结合。第二‘递送’珠包含与第二末端延伸互补的第二捕获寡核苷酸。第二捕获寡核苷酸可以具有约5至约40个核苷酸的长度，诸如约10至约30个核苷酸或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸，或者约10至约80个核苷酸的长度，诸如约20至约60个核苷酸或者约30至约50个核苷酸，例如约40个核苷酸。第二末端延伸可以具有约5至约40个核苷酸的长度，诸如约10至约30个核苷酸或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸。第二捕获寡核苷酸可以具有与第二末端延伸相同的长度，或者第二捕获寡核苷酸可以比末端延伸更长或更短，条件是第二捕获寡核苷酸和第二末端延伸具有在约5至约40个核苷酸，诸如约10至约30个核苷酸或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸的长度上互补的序列。第二末端延伸具有与第一捕获核苷酸、第一末端延伸或竞争寡核苷酸杂交的序列。第二捕获寡核苷酸还具有与第一捕获核苷酸、第一末端延伸或竞争寡核苷酸杂交的序列。

因此，当引导聚合物包含第一末端延伸和第二末端延伸时，该方法可以在步骤(b)之前包括：

(i)使样品与结合有包含与第一末端延伸互补的序列的第一捕获寡核苷酸的表面接触，使得引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白/靶聚合物复合物与表面结合；

(ii)使与表面结合的引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白/靶聚合物复合物与竞争寡核苷酸接触，使得引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白/靶聚合物复合物从表面释放；

(iii)使引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白/靶聚合物复合物与结合有包含与第二末端延伸互补的序列的第二捕获寡核苷酸的珠接触，使得引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白/靶聚合物复合物与珠结合；以及任选地

(iv)将珠递送至孔中。

该方法优选进一步包括洗掉未与膜和/或珠偶联的引导聚合物、聚合物引导的效应蛋白和/或多核苷酸的步骤。

在本发明的不同实施例中，可以存在：(i)无热或化学应激，去除过量的、未结合的和/或非靶标结合的聚合物引导的效应蛋白的纯化或立足点纯化；(ii)仅热或化学应激；(iii)仅去除过量的、未结合的和/或非靶标结合的聚合物引导的效应蛋白的纯化；(iv)仅立足点纯化；(v)热或化学应激和去除过量的、未结合的和/或非靶标结合的聚合物引导的效应蛋白的纯化；(vi)热或化学应激和立足点纯化；(vii)去除过量的、未结合的和/或非靶标结合的聚合物引导的效应蛋白的纯化和立足点纯化；或者(viii)热或化学应激，去除过量的、未结合的和/或非靶标结合的聚合物引导的效应蛋白的纯化以及立足点纯化。

与靶聚合物/引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物结合的珠可以用于将复合物递送至孔。例如，珠可以是磁性的，并且与珠结合的靶聚合物可以通过施加置于流通池下方的磁场而被吸入包含孔的流通池的孔中，或者可以允许通过重力沉降。测序可以通过使系链(诸如与衔接子末端杂交的寡核苷酸-胆固醇系链)在珠上流动来启动，该系链将珠系链至膜。可替代地，可以在添加珠-靶聚合物缀合物之前将系链引入膜中。例如，在添加珠-靶聚合物之前，可以通过使运行缓冲液和系链流过流通池来将与衔接子末端杂交的寡核苷酸-胆固醇系链整合到流通池中的膜中。在这种情况下，当将珠-靶聚合物添加到流通池中时，在它们遇到由胆固醇锚定在膜中的寡核苷酸的情况下，它们就会被系链至膜。

在一些实施例中，靶聚合物可以适合于纳米孔测序。例如，样品中的所有聚合物可以在该方法的步骤(a)之前具有添加到一端或两端的测序衔接子。在添加测序衔接子之前，可以将样品中的聚合物片段化。可替代地，靶聚合物可以在步骤(a)之后具有添加到一端或两端的测序衔接子。在步骤(a)之后，样品中的聚合物优选被片段化，和/或引导聚合物和/或聚合物引导的效应蛋白优选与靶聚合物交联。在该实施例中，可以在使靶聚合物与非靶聚合物分离之前或之后添加测序衔接子。测序衔接子通常包含能够沿着聚合物移动的聚合物结合蛋白。当在步骤(a)之后添加测序衔接子时，聚合物引导的效应蛋白/引导聚合物复合物保持与靶聚合物结合。在衔接子结合后，在一些实施例中，通常在衔接子添加之前靶聚合物已与非靶聚合物分离的情况下，聚合物引导的效应蛋白/引导聚合物复合物可以被能够沿着装载在衔接子上的聚合物移动的聚合物结合蛋白置换。能够沿着聚合物移动的聚合物结合蛋白对聚合物引导的效应蛋白/引导聚合物复合物的置换可以通过添加聚合物结合蛋白沿着聚合物移动所需的一种或多种辅因子来控制。

靶聚合物可以通过将衔接子与其游离末端中的任一末端或两个末端结合，同时经由引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白与表面(例如，柱或珠)结合来适合于纳米孔测序。末端可以加dA尾以促进衔接子结合。

靶聚合物

靶聚合物可以是任何聚合物。合适的聚合物包括但不限于寡核苷酸、多核苷酸(诸如RNA或DNA)、蛋白质、多肽、寡糖、多糖或者关于它们的存在或特性的信息有价值的其他聚合物。

靶聚合物优选是靶多核苷酸。多核苷酸可以是核酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。多核苷酸可以包含与DNA的一条链杂交的RNA的一条链。多核苷酸可以是本领域已知的任何合成核酸，诸如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)或具有核苷酸侧链的其他合成聚合物。PNA主链由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。GNA主链由通过磷酸二酯键连接的重复二醇单元构成。TNA主链由通过磷酸二酯键连接在一起的重复苏糖构成。LNA由如上所讨论的核糖核苷酸形成，其具有连接核糖部分中的2'氧和4'碳的额外桥。

多核苷酸优选是DNA、RNA或者DNA或RNA杂交体，最优选DNA。靶多核苷酸包含与引导多核苷酸和多核苷酸引导的效应蛋白结合的双链区域。靶多肽可以是双链的。靶多肽可以包含单链区域和具有其他结构的区域，诸如发夹环、三链体和/或四链体。DNA/RNA杂交体可以包含同一链上的DNA和RNA。优选地，DNA/RNA杂交体包含与RNA链杂交的一条DNA链。

靶多核苷酸可以具有任何长度。例如，多核苷酸的长度可以是至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400或至少500个核苷酸或核苷酸对。靶多核苷酸的长度可以是1000个或更多个核苷酸或核苷酸对、5000个或更多个核苷酸或核苷酸对或者100000个或更多个核苷酸或核苷酸对。靶多核苷酸可以是寡核苷酸。寡核苷酸是短核苷酸聚合物，其通常具有50个或更少的核苷酸，诸如40个或更少、30个或更少、20个或更少、10个或更少或者5个或更少的核苷酸。靶寡核苷酸的长度优选为约15至约30个核苷酸，诸如长度为约20至约25个核苷酸。例如，寡核苷酸的长度可以是约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸。

靶聚合物可以是与疾病和/或微生物相关的聚合物。

该方法可以检测多种，诸如约2至50、3至40、4至30、5至25、6至15或8至10种靶聚合物。靶聚合物可以是一组聚合物。例如，该组可以与特定表型相关。该组可以与特定类型的细胞相关。例如，该组可以指示细菌细胞。该组可以指示病毒、真菌、细菌、分枝杆菌或寄生虫。

靶聚合物可以是一组两种或更多种聚合物，其是或包含与特定疾病或病症相关的生物标志物。生物标志物可以用于诊断或预测疾病或病症。合适的生物标志物组是本领域已知的，例如描述于Edwards,A.V.G.等人(2008)Mol.Cell.Proteomics 7,p1824-1837；Jacquet,S.等人(2009),Mol.Cell.Proteomics 8,p2687-2699；Anderson N.L.等人(2010)Clin.Chem.56,177-185。疾病或病症优选是癌症、心脏病(包括冠心病和心血管疾病)或传染病(诸如结核病或败血症)。

靶寡核苷酸或多核苷酸优选是微小RNA(或miRNA)或小干扰RNA(siRNA)。两种或更多种靶多核苷酸的组可以是两种或更多种miRNA的组。适用于本发明的miRNA是本领域众所周知的。例如，合适的miRNA存储在公开可得的数据库中(Jiang Q.,Wang Y.,Hao Y.,JuanL.,Teng M.,Zhang X.,Li M.,Wang G.,Liu Y.,(2009)miR2Disease:a manually curateddatabase for microRNA deregulation in human disease.Nucleic Acids Res.)。

靶聚合物优选包含前导序列。此类序列在WO 2018/060740中讨论。

聚合物引导的效应蛋白

聚合物引导的效应蛋白可以是经由引导聚合物与靶聚合物结合的任何蛋白质。作为非限制性实例，聚合物引导的效应蛋白可以与靶聚合物的部分所结合的引导寡核苷酸(诸如适体)或引导多肽(诸如抗体)结合或附接。

聚合物引导的效应蛋白优选是多核苷酸引导的效应蛋白。在该实施例中，引导聚合物优选是引导多核苷酸。多核苷酸引导的效应蛋白可以是与引导多核苷酸结合或附接并且与引导多核苷酸所结合的靶聚合物、优选靶多核苷酸结合的任何蛋白质。多核苷酸引导的效应蛋白优选包含靶多核苷酸识别结构域和至少一个核酸酶结构域。识别结构域结合引导多核苷酸(例如，RNA)和靶多核苷酸(例如，DNA)。多核苷酸引导的效应蛋白可以含有一个切割双链多核苷酸的一条或两条链的核酸酶结构域，或者可以含有两个核酸酶结构域，其中使第一核酸酶结构域定位以用于切割靶多核苷酸的一条链，并且使第二核酸酶结构域定位以用于切割靶多核苷酸的互补链。核酸酶结构域可以是活性的或非活性的。例如，核酸酶结构域或者两个核酸酶结构域中的一者或两者可以通过突变失活。

引导多核苷酸可以是引导RNA、引导DNA、或含有DNA和RNA两者的引导。引导多核苷酸优选是引导RNA。因此，多核苷酸引导的效应蛋白优选是RNA引导的效应蛋白。

RNA引导的效应蛋白可以是与引导RNA结合或附接的任何蛋白质。RNA引导的效应蛋白通常与引导RNA的区域结合，该区域不是与靶多核苷酸结合的引导RNA的区域。例如，当引导RNA包含crRNA和tracrRNA时，RNA引导的效应蛋白通常与tracrRNA结合并且crRNA通常与靶聚合物(诸如靶多核苷酸)结合。RNA引导的效应蛋白优选还与靶多核苷酸结合。与靶多核苷酸结合的引导RNA的区域也可以与RNA引导的效应蛋白结合。RNA引导的效应蛋白通常与靶多核苷酸的双链区域结合。RNA引导的效应蛋白所结合的靶多核苷酸区域通常定位成靠近引导RNA所杂交的序列。引导RNA和RNA引导的效应蛋白通常形成复合物，该复合物然后在由引导RNA的序列确定的位点处与靶多核苷酸结合。

RNA引导的效应蛋白可以结合引导RNA所结合的序列的上游或下游。例如，RNA引导的效应蛋白可以与位于引导RNA所结合的序列旁边的DNA中的原间隔相邻基序(PAM)结合。PAM是短序列(少于10个，通常为2至6个碱基对)，诸如5'-NGG-3'(其中N是任一碱基)、5'-NGA-3'、5'-YG-3'(其中Y是嘧啶)、5'TTN-3'或5'-YTN-3'。不同的RNA引导的效应蛋白与不同的PAM结合。RNA引导的效应蛋白可以与不包含PAM的靶多核苷酸结合，特别是当靶标是RNA或DNA/RNA杂交体时。

RNA引导的效应蛋白通常是核酸酶，诸如RNA引导的核酸内切酶。RNA引导的效应蛋白通常是Cas蛋白。RNA引导的效应蛋白可以是Cas、Csn2、Cpf1、Csf1、Cmr5、Csm2、Csy1、Cse1或C2c2。Cas蛋白可以是Cas3、Cas 4、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10或Cas10d。优选地，Cas蛋白是Cas9。当靶多核苷酸包含双链DNA区域时，优选使用Cas、Csn2、Cpf1、Csf1、Cmr5、Csm2、Csy1或Cse1。当靶多核苷酸包含双链RNA区域时，优选使用C2c2。

DNA引导的效应蛋白，诸如来自RecA家族的蛋白，可以用于靶向DNA。可以使用的来自RecA家族的蛋白质的实例是RecA、RadA和Rad51。RNA引导的核酸内切酶的核酸酶活性可以是禁用的。RNA引导的核酸内切酶的催化核酸酶位点中的一者或多者可以是失活的。例如，当RNA引导的核酸内切酶包含两个催化核酸酶位点时，催化位点中的一者或两者可以是失活的。通常，催化位点中的一者将切割其特异性结合的多核苷酸的一条链，并且另一催化位点将切割多核苷酸的相对链。因此，RNA引导的核酸内切酶可以切割靶多核苷酸的双链区域的两条链、一条链或两条链均不切割。

多核苷酸引导的效应蛋白优选是Cas9。Cas9具有双叶、多结构域蛋白质结构，包含靶识别叶和核酸酶叶。识别叶结合引导RNA和DNA。核酸酶叶含有HNH和RuvC核酸酶结构域，使它们定位以用于切割靶DNA的互补链和非互补链。Cas 9的结构详细描述于Nishimasu,H.等人,(2014)Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and TargetDNA.Cell 156,935-949。Cas9的相关PDB参考是5F9R(具有催化活性的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)CRISPR-Cas9与单引导RNA和准备用于靶DNA切割的双链DNA的复合物的晶体结构)。

Cas9可能是‘特异性增强’的Cas9，与野生型Cas9相比，脱靶结合减少。此类‘特异性增强’的Cas9的一个实例是酿脓链球菌Cas9 D10A/H840A/K848A/K1003A/R1060A。ONLP12296是酿脓链球菌Cas9 D10A/H840A/K848A/K1003A/R1060A的氨基酸序列，其具有带有TEV可切割接头的C末端Twin-Strep-tag。

RNA引导的核酸内切酶的催化位点可以通过突变失活。突变可以是取代、插入或缺失突变。例如，一个或多个，诸如2、3、4、5或6个氨基酸可以被取代或插入催化位点或从催化位点删除。突变优选是取代插入，更优选催化位点处的单个氨基酸的取代。技术人员将能够容易地识别RNA引导的核酸内切酶的催化位点和使它们失活的突变。例如，当RNA引导的核酸内切酶是Cas9时，一个催化位点可以通过D10处的突变失活，并且另一个催化位点可以通过H640处的突变失活。

失活(‘死亡’)多核苷酸引导的效应蛋白不会切割靶多核苷酸，并且因此不显示方向性偏差。切割靶多核苷酸的活性(‘存活’)多核苷酸引导的效应蛋白可以仅保持与切割位点的两个末端中的一个末端结合，并且因此可以显示出一些方向性偏差。

聚合物引导的效应蛋白通常保持与靶聚合物的结合，持续延长的时段。聚合物引导的效应蛋白优选保持与靶聚合物的结合，持续至少约1至至少约10小时，诸如约2至约8小时或约4至约6小时。

聚合物引导的效应蛋白通常保持与靶聚合物(如果存在)的结合，并作为复合物的一部分通过孔转位。蛋白质的转位产生根据本发明测量的电或电流效应并提供信息。这将在下面更详细地讨论。

聚合物引导的效应蛋白可以被具体修饰以用于本发明的方法。蛋白质可以包含能够与膜偶联的锚，诸如胆固醇。聚合物引导的效应蛋白优选具有能够与其所附接的表面偶联的结合部分。该表面优选为珠的表面。

引导聚合物

引导聚合物能够与靶聚合物结合并介导聚合物引导的效应蛋白与靶聚合物的结合。引导聚合物可以具有使其能够与靶聚合物结合的任何结构。它可以是上面参考靶聚合物讨论的聚合物中的任一者。引导聚合物优选是寡核苷酸、多核苷酸、多肽、蛋白质、寡糖或多糖。引导多肽或蛋白质优选是锌指结合蛋白、转录激活因子样效应物(TALE)、转录因子、限制性酶、DNA结合蛋白或酶、抗体或抗体片段。合适的抗体片段是本领域已知的并且包括但不限于Fab、Fab'、(Fab')2、FV、scFv、双体、三体、四体、Bis-scFv、微型抗体、Fab2和Fab3。引导寡核苷酸优选是适体。

引导聚合物可以与聚合物引导的效应蛋白结合。在本上下文中，引导聚合物可以与聚合物引导的效应蛋白结合、可以被聚合物引导的效应蛋白结合或两者。引导聚合物可以与聚合物引导的效应蛋白附接。用于将引导聚合物与聚合物引导的效应蛋白附接的合适方法是本领域已知的，例如使用链霉亲和素/生物素。聚合物引导的效应物优选与引导聚合物共价附接。WO 2018/060740中讨论了共价附接，例如使用点击化学。

引导聚合物优选是引导多核苷酸。在这种情况下，聚合物引导的效应蛋白优选是多核苷酸引导的效应蛋白。引导多核苷酸优选包含能够与靶聚合物结合或与靶多核苷酸杂交的序列。引导多核苷酸优选包含与靶聚合物中的序列结合的核苷酸序列和与多核苷酸引导的效应蛋白结合的核苷酸序列。引导多核苷酸优选包含与靶多核苷酸中的序列杂交的核苷酸序列和与多核苷酸引导的效应蛋白结合的核苷酸序列。引导多核苷酸可以具有使其能够与靶聚合物结合/杂交并且与多核苷酸引导的效应蛋白结合的任何结构。

如果靶聚合物是多核苷酸，则引导多核苷酸通常与靶多核苷酸中约20个核苷酸的序列杂交。引导多核苷酸所结合的序列可以是约10至约40个，诸如约15至约30个，优选约18至约25个，诸如约19、20、21、22、23或24个核苷酸。引导多核苷酸通常与靶多核苷酸的双链区域的一条链互补。引导多核苷酸优选包含约10至约40个、诸如约15至约30个、优选约18至约25个、诸如约19、20、21、22、23或24个核苷酸的核苷酸序列，该核苷酸序列与靶多核苷酸的序列或其中的序列互补。互补程度优选是精确的。

引导多核苷酸优选是引导RNA。引导RNA可以与靶多核苷酸中对PAM为5'的区域互补。当靶多核苷酸包含DNA时，特别是当RNA效应蛋白是Cas9或Cpf1时，这是优选的。引导RNA可以与靶多核苷酸中侧翼为鸟嘌呤的区域互补。当靶多核苷酸包含RNA时，特别是当RNA效应蛋白是C2c2时，这是优选的。

引导RNA可以具有使其能够与靶多核苷酸和RNA引导的效应蛋白结合的任何结构。引导RNA可以包含与靶多核苷酸中的序列结合的crRNA和tracrRNA。tracrRNA通常与RNA引导的效应蛋白结合。引导RNA的典型结构是本领域已知的。例如，crRNA通常是单链RNA，并且tracrRNA通常具有双链区域，其中一条链与crRNA的3'末端附接，并且在该链的3'末端形成发夹环的部分未与crRNA附接。crRNA和tracrRNA可以在体外转录为单件sgRNA。引导RNA优选是sgRNA

引导RNA可以包含其他组分，诸如额外的RNA碱基或DNA碱基或其他核碱基。引导RNA中的RNA和DNA碱基可以是天然碱基或修饰碱基。可以使用引导DNA代替引导RNA，并且使用DNA引导的效应蛋白代替RNA引导的效应蛋白。当靶多核苷酸是RNA时，可以优选使用引导DNA和DNA引导的效应蛋白。

引导聚合物可以被具体修饰以用于本发明的方法。该方法可以使用引导聚合物，特别是引导RNA，其包含(i)衔接子序列，任选地包括条形码和/或前导序列和/或(ii)能够与膜偶联的锚。锚优选是胆固醇。锚优选经由与引导聚合物上的延伸杂交的多核苷酸与引导聚合物(诸如引导多核苷酸)附接。靶聚合物优选具有能够与和其附接的膜偶联的锚，并且引导聚合物优选具有和其附接的衔接子和/或前导序列

引导聚合物优选具有能够与和其附接表面偶联的结合部分。表面是珠的表面。结合部分优选是引导多核苷酸上的末端延伸。引导聚合物优选地包含两个结合部分，其任选地是引导多核苷酸上的末端延伸。

引导聚合物可以是本文讨论的引导聚合物中的任一者，其附接有(i)衔接子和/或(ii)能够与膜偶联的锚。

(i)锚或(ii)衔接子可以存在于tracrRNA的5'末端、tracrRNA的3'末端、crRNA的3'末端或内部，例如，其中tracrRNA和crRNA包含在sgRNA中。(i)锚或(ii)衔接子可以例如经由化学基团或间隔子添加至crRNA的5'末端。(i)锚或(ii)衔接子可以经由化学基团或间隔子添加至引导聚合物。(i)锚或(ii)衔接子可以通过任何合适的方式(例如，经由化学基团(例如，硫醇)、点击基团、生物素等连接，或经由DNA、RNA、PNA、BNA、LNA、TNA间隔子连接)与引导聚合物的5'或3'末端附接，诸如与tracrRNA的5'或3'末端或者crRNA的5'或3'末端附接。当间隔子是多核苷酸时，间隔子可以具有约1至约30个，诸如约2至约20个，约3至约15个，约4至约10个，诸如约5、6、7、8或9个长度的核苷酸。

锚可以附接至与引导聚合物中的末端延伸或内部环序列互补的寡核苷酸(锚寡核苷酸)。tracrRNA的5'末端、tracrRNA的3'末端、crRNA的3'末端或crRNA的5'末端可以具有长度为例如约5至约40个，诸如约10至约30个或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸的末端延伸。锚寡核苷酸可以具有与末端延伸相同的长度，或者锚寡核苷酸可以比末端延伸更长或更短，条件是锚寡核苷酸和末端延伸具有在约5至约40个，诸如约10至约30个或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸的长度上互补的序列。锚寡核苷酸可以具有例如约5至约40个核苷酸的长度，诸如约10至约30个或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸。内部环序列可以具有上面指定的长度中的任一者。

引导聚合物可以被合成修饰。crRNA和tracrRNA的5'和3'末端都可以被修饰。参见Lee等人,(2017)Synthetically modified guide RNA and donor DNA are a versatileplatform for CRISPR-Cas9 engineering.eLIFE；6:e25312，通过引用并入本文。合成修饰可以包括将修饰的或人工碱基掺入引导RNA(或引导DNA)中，包括DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、DNA间隔子、RNA间隔子和脱碱基间隔子，例如Sp18。可替代地，修饰可以包括用结构上与核苷酸碱基无关的化学部分进行修饰，诸如平面疏水分子、化学标签、荧光分子、适体序列、胺、叠氮化物、炔烃、硫醇、点击基团、生物素。

如果引导聚合物是引导多核苷酸，则引导多核苷酸可以具有能够沿着与其附接的多核苷酸移动的多核苷酸结合蛋白。多核苷酸结合蛋白可以在接近引导多核苷酸链的一个末端(通常接近5'末端)处结合。通常通过添加衔接子、优选包含前导序列的衔接子来修饰多核苷酸结合蛋白所结合的末端。当引导RNA包含前导序列时，多核苷酸结合蛋白通常与前导序列结合。

当引导RNA包含crRNA时，多核苷酸结合蛋白可以被定位以使得其能够沿着crRNA移动。此类引导RNA可用于crRNA通过孔转位以检测靶聚合物的存在或不存在的方法。

引导聚合物可以特别适应于使得能够捕获表面(诸如珠或柱)上的靶聚合物。这使得引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物所结合的靶聚合物被捕获并与样品中的非靶聚合物分离，然后可以将非靶聚合物洗掉。引导聚合物可以在3'或5'末端包含末端延伸，其具有与结合至表面(诸如珠或柱)的捕获寡核苷酸的序列互补的序列。例如，捕获寡核苷酸可以通过亲和标签与表面结合。可以使用任何合适的亲和标签。一个实例是生物素-链霉亲和素亲和标签。捕获寡核苷酸可以具有约5至约40个核苷酸的长度，诸如约10至约30个或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸，或约10至约80个核苷酸的长度，诸如约20至约60个或者约30至约50个核苷酸，例如约40个核苷酸。末端延伸可以具有约5至约40个核苷酸的长度，诸如约10至约30个核苷酸或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸。捕获寡核苷酸可以具有与末端延伸相同的长度，或者捕获寡核苷酸可以比末端延伸更长或更短，条件是捕获寡核苷酸和末端延伸具有在约5至约40个，诸如约10至约30个或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸的长度上互补的序列。

引导聚合物可以包含第一结合部分和第二结合部分。第一结合部分和第二结合部分可以都是引导聚合物上的末端延伸或能够与寡核苷酸结合的其他单链聚合物序列。引导聚合物上的第一末端延伸可以具有与第一捕获表面(例如，珠)上的第一捕获寡核苷酸互补的序列，并且引导聚合物上的第二末端延伸可以具有与第二捕获表面(例如，珠)上的第二捕获寡核苷酸互补的序列。这种情况的一种配置方式是crRNA包含用于捕获珠、柱或表面上的靶聚合物的3′DNA延伸，并且tracrRNA包含5′DNA延伸。在一个实施例中，第一末端延伸包含：具有与第一捕获寡核苷酸中的序列不互补的序列的末端部分，该末端部分在5'末端延伸中的5'末端处或在3'末端延伸中的3'末端处，以及具有与第一捕获寡核苷酸中的第一序列互补的序列的部分。第一末端延伸的末端部分通常可以具有约2至约10个核苷酸的长度，诸如约3、4、5或6个核苷酸。第一末端延伸的与第一捕获寡核苷酸互补的部分通常可以具有约5至约40个核苷酸的长度，诸如约10至约30个核苷酸或者约15至约25个核苷酸，例如约20个核苷酸。

第二末端延伸具有与第一捕获核苷酸、第一末端延伸或竞争寡核苷酸杂交的序列。第二捕获寡核苷酸还具有与第一捕获核苷酸、第一末端延伸或竞争寡核苷酸杂交的序列。末端延伸可以与引导聚合物的5'或3'末端附接，诸如与tracrRNA的5'或3'末端或crRNA的5'或3'末端附接。末端延伸可以通过任何合适的方式与引导聚合物附接。末端延伸可以例如经由化学基团或间隔子添加，例如经由化学基团(例如，硫醇)、点击基团、生物素等连接或经由DNA、RNA、PNA、BNA、LNA、TNA间隔子连接。当间隔子是多核苷酸时，间隔子可以具有约1至约30个，诸如约2至约20个，约3至约15个，约4至约10个，诸如约5、6、7、8或9个长度的核苷酸。末端延伸可以存在于tracrRNA的5'末端、tracrRNA的3'末端、crRNA的3'末端、crRNA的5'末端，或者可以被内部添加到引导RNA中的序列取代，例如，其中tracrRNA和crRNA包含在sgRNA中。当内部序列用于进行本文所述的末端延伸的功能时，其通常存在于引导聚合物内的环结构中，或者以其他方式易于与捕获寡核苷酸杂交。

样品

样品可以是任何合适的样品。样品通常是已知含有或怀疑含有至少一种靶聚合物的样品。该方法可以用于选择递送至孔的靶聚合物。样品的其他组分可以被洗掉，例如，它们可以从包含孔的池中被冲走。此类其他组分包括以下项中的一者或多者：可折叠或不可折叠的蛋白质、肽、碳水化合物、聚合物(诸如非靶聚合物)和细胞碎片。

样品可以是生物学样品。本发明可以在体外在从任何生物体或微生物获得或提取的样品上执行。生物体或微生物通常是太古代生物、原核生物或真核生物并且通常属于五界中的一者：植物界、动物界、真菌界、原核生物界和原生生物界。本发明可以在体外在从任何病毒获得或提取的样品上执行。

样品优选是流体样品。样品通常包含体液。体液可以从人或动物获得。人或动物可能患有疾病、怀疑患有疾病或处于疾病风险中。样品可以是尿液、淋巴液、唾液、粘液、精液或羊水，但优选是全血、血浆或血清。通常，样品源自人类，但可替代地，它可以来自另一哺乳动物，诸如来自商业养殖的动物，诸如马、牛、羊或猪，或者可以可替代地是宠物，诸如猫或狗。

可替代地，植物来源的样品通常获自商业作物，诸如谷类、豆类、水果或蔬菜，例如小麦、大麦、燕麦、油菜、玉米、大豆、稻、香蕉、苹果、西红柿、马铃薯、葡萄、烟草、豆、扁豆、甘蔗、可可、棉花、茶或咖啡。

样品可以是非生物学样品。非生物学样品优选是流体样品。非生物学样品的实例包括外科流体、水(诸如饮用水、海水或河水)以及用于实验室测试的试剂。

可以在测定之前对样品进行处理，例如通过离心或通过穿过过滤掉不需要的分子或细胞(诸如红细胞)的膜。可以在取得样品后立即对其进行测量。样品通常还可以在测定前储存，优选低于-70℃。

样品可以包含基因组DNA。基因组DNA可以被片段化，或者该方法的步骤(a)可以进一步包括使基因组DNA片段化。DNA可以通过任何合适的方法片段化。例如，使DNA片段化的方法是本领域已知的。此类方法可以使用转座酶，诸如MuA转座酶。

样品可以包含T细胞DNA。

样品可以包含非靶聚合物。在一个实施例中，靶多核苷酸和非靶多核苷酸可以源自相同的基因或基因组。

电测量和效应

步骤(c)包括跨越膜施加电位。施加的电位可以是电压电位。可替代地，所施加的电位可以是化学电位。这种情况的一个实例是跨越膜使用盐梯度，诸如下面讨论的膜中的任一者。盐梯度公开于Holden等人,J Am Chem Soc.2007年7月11日；129(27):8650-5。在一些情况下，当多核苷酸相对于孔移动时穿过孔的电流用于估计或确定多核苷酸的序列。这就是链测序。

步骤(c)还包括进行一项或多项电测量。合适的电测量包括但不限于电流测量、电导测量、电容测量、阻抗测量、隧穿测量(Ivanov AP等人,Nano Lett.2011年1月12日；11(1):279-85)，以及FET测量(国际申请WO 2005/124888)。在该方法中可以进行这些测量的任何数量和组合。一项或多项电测量可以包括跨膜电流测量，诸如测量流过孔的离子电流。

一项或多项光学测量可以与一项或多项电测量相结合(Soni GV等人,Rev SciInstrum.2010年1月；81(1):014301)。一项或多项光学测量可以是Chen等人,Nat Commun9,1733(2018)中描述的那些。

电测量可以使用标准单通道记录设备进行，如Stoddart D等人,Proc Natl AcadSci,12；106(19):7702-7，Lieberman KR等人,J Am Chem Soc.2010；132(50):17961-72，以及国际申请WO 2000/28312中描述的。可替代地，可以使用多通道系统进行电测量，例如如国际申请WO 2009/077734和国际申请WO 2011/067559中所述。

步骤(c)优选包括跨越膜施加电位差并测量流过孔的电流。步骤(d)优选包括监测由复合物通过孔的转位而产生的电流效应的存在或不存在，并且从而确定样品中靶聚合物的存在或不存在。

步骤(d)包括监测由于复合物通过孔的转位而产生的电效应、优选电流效应的存在或不存在，并且从而确定样品中靶聚合物的存在或不存在。该效应指示引导多核苷酸、多核苷酸引导的效应蛋白和靶多核苷酸形成的复合物在转位时与孔相互作用。如果观察到仅与引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白通过孔转位相关的电或电流效应，则样品中不存在靶聚合物。如果观察到与复合物(即，引导聚合物、聚合物引导的效应蛋白和靶聚合物)通过孔转位相关的电或电流效应，则样品中存在靶聚合物。下面讨论两种效应之间的差异。

该效应还可以由与复合物组分中的一者、靶多核苷酸或引导多核苷酸附接的衔接子的通过孔的转位引起。在这种情况下，该效应指示与复合物组分中的一者、靶多核苷酸或引导多核苷酸附接的衔接子通过孔的转位。该方法优选包括确定衔接子与孔相互作用的存在或不存在。衔接子优选地包括条形码。

使用一种或多种电测量来监测该效应。该效应通常是一项或多项电测量的一个或多个方面的测量变化。该一个或多个方面包括但不限于一项或多项电测量的量、持续时间、一致性和复杂性。持续时间也称为停留时间，因为其效应与停留在生物孔中的复合物或其部分有关。下面将更详细地讨论这些方面中的一些。该效应优选是流过孔的电流的一个或多个方面的测量变化，诸如量、持续时间、一致性和复杂性中的一者或多者。

该复合物包含靶聚合物(如果存在)、聚合物引导的效应蛋白和引导聚合物，因此复合物通过孔的转位产生的电或电流效应(与仅引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白相反)提供有关靶聚合物存在的信息以及有关靶聚合物和聚合物引导的效应蛋白的信息。庞大的聚合物引导的效应蛋白与孔相互作用，并在转位时占据孔开口内的空间，并且因此通常会对一项或多项电测量(诸如电流)产生长期、明显且复杂的影响。相比之下，靶聚合物快速移动通过孔，相互作用较少，并且孔开口的阻塞较少，并且因此通常对一项或多项电测量(诸如电流)具有更短、不太明显和不太复杂的影响。这些不同的影响允许本发明的方法确定靶聚合物是否存在。如果仅观察到聚合物引导的效应蛋白和结合/附接的引导聚合物的影响，则靶聚合物不存在。如果除了聚合物引导的效应蛋白和结合/附接的引导聚合物的影响之外还观察到靶聚合物影响，则靶聚合物存在。

复合物的聚合物引导的效应蛋白部分通过孔的转位优选产生电效应，该电效应和与复合物的靶聚合物部分通过孔转位相关的电效应相比为(i)更长、(ii)更明显和(iii)更复杂中的一者或多者。复合物的聚合物引导的效应蛋白部分通过孔的转位优选产生电效应，该电效应和与复合物的靶聚合物部分通过孔转位相关的电效应相比为(i)、(ii)、(iii)、(i)和(ii)、(i)和(iii)、(ii)和(iii)或者(i)、(ii)和(iii)。复合物的聚合物引导的效应蛋白部分通过孔的转位优选产生电效应，该电效应和与复合物的靶聚合物部分通过孔转位相关的电效应相比为(i)更长、(ii)更明显和(iii)更复杂。在这些实施例中，引导聚合物通常在转位时与聚合物引导的效应蛋白结合/附接。引导聚合物可以与聚合物引导的效应蛋白共价附接。庞大的蛋白质的效应通常掩盖了结合/附接的引导聚合物的任何可观察到的效应。

如果由蛋白质通过孔转位产生的效应发生的持续时间比由靶聚合物通过孔转位产生的效应发生的持续时间更长(或更多时间)，则该效应更长。如果由蛋白质通过孔转位产生的一项或多项电测量的量的变化发生的持续时间比由靶聚合物通过孔转位产生的一项或多项电测量的量的变化发生的持续时间更长(或更多时间)，则该效应更长。

如果由蛋白质通过孔转位产生的效应大于由靶聚合物通过孔转位产生的效应，则该效应更明显。如果由蛋白质通过孔转位产生的一项或多项电测量的量的变化量大于由靶聚合物通过孔转位产生的一项或多项电测量的量的变化，则该效应更明显。

更复杂的效应优选包括与由靶聚合物通过孔转位产生的效应相比时，由聚合物引导的效应蛋白通过孔转位产生的效应(i)不一致、(ii)有噪声和(iii)涉及步进事件。更复杂的效应优选包括与由靶聚合物通过孔转位产生的一项或多项电测量的一个或多个方面的测量变化相比时，由聚合物引导的效应蛋白通过孔转位产生的一项或多项电测量的一个或多个方面的测量变化(i)不一致、(ii)有噪声和(iii)涉及步进事件。更复杂的效应可以包括(i)、(ii)、(iii)、(i)和(ii)、(i)和(iii)、(ii)和(iii)或者(i)、(ii)和(iii)。

步骤(c)优选包括测量流过孔的电流。复合物的聚合物引导的效应蛋白部分通过孔的转位优选产生电流效应，该电流效应和与复合物的靶聚合物部分通过孔转位相关的电流效应相比为(i)更长、(ii)更明显和(iii)更复杂中的一者或多者。该效应可以是如上所述的(i)-(iii)的任何组合。复合物的聚合物引导的效应蛋白部分通过孔的转位优选产生电流效应，该电流效应和与复合物的靶聚合物部分通过孔转位相关的电流效应相比为(i)更长、(ii)更明显和(iii)更复杂。

如果由蛋白质通过孔转位产生的电流变化发生的持续时间比由靶聚合物通过孔转位产生的电流变化发生的持续时间更长(或更多时间)，则该电流效应更长。

如果由蛋白质通过孔转位产生的电流变化大于由靶聚合物通过孔转位产生的电流变化，则该电流效应更明显。当聚合物引导的效应蛋白通过孔转位时，优选引起开孔电流的至少约20％的变化。聚合物引导的效应蛋白通过孔转位时，更优选引起开孔电流的至少约30％的变化、至少约40％的变化、至少约50％的变化、至少约60％的变化、至少约70％的变化或至少约80％的变化。引导聚合物通常在转位时与聚合物引导的效应蛋白结合/附接。靶聚合物通过孔转位时优选引起开孔电流的约10％或更低的变化。靶聚合物通过孔转位时优选引起开孔电流的约9％或更低的变化、约8％或更低的变化、约7％或更低的变化、约6％或更低的变化或者约5％或更低的变化。

更复杂的电流效应优选包括(i)不一致效应、(ii)噪声和(iii)电步进事件中的一者或多者。在这些实施例中，引导聚合物通常在转位时与聚合物引导的效应蛋白结合/附接。引导聚合物可以与聚合物引导的效应蛋白共价附接。庞大的蛋白质的效应通常掩盖了结合/附接的引导聚合物的任何可观察到的效应。该效应可以是如上所述的(i)-(iii)的任何组合。

如果使用一个引导聚合物和一个聚合物引导的效应蛋白来形成一个复合物，则优选在与聚合物引导的效应蛋白相关的电或电流效应之前和/或之后观察到与靶聚合物相关的电或电流效应。时间将取决于引导聚合物与靶聚合物结合的位置。如果引导聚合物在靶聚合物的一个末端或朝向靶聚合物的一个末端结合/形成复合物，则优选在与聚合物引导的效应蛋白和引导聚合物相关的电或电流效应之前或之后观察到与靶聚合物相关的电或电流效应。是在之前还是之后取决于是靶多核苷酸的游离末端(之前)还是结合有引导聚合物引导的效应蛋白和引导聚合物的末端(之后)首先进入孔。

如果使用两个或更多个引导聚合物和两个或更多个聚合物引导的效应蛋白来形成两个或更多个复合物，则可以在由两个或更多个复合物的聚合物引导的效应蛋白部分通过孔转位而产生的电或电流效应之前和/或之后观察到与两个或更多个复合物的靶聚合物部分通过孔转位相关的电或电流效应。可以在由两个或更多个复合物的聚合物引导的效应蛋白部分通过孔转位产生的电或电流效应之间观察到与两个或更多个复合物的靶聚合物部分通过孔转位相关的电或电流效应。例如，如果使用两个引导聚合物和两个聚合物引导的效应蛋白，使得在靶聚合物的每一末端形成复合物，则可以观察到一个复合物的效应，然后是靶聚合物的效应，然后是第二复合物的效应。可以使用任何数量的引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白组合来与靶聚合物的不同部分结合并提供可观察到的电或电流效应的不同组合。与靶聚合物通过孔转位相关的电或电流效应可以(a)在由两个或更多个聚合物引导的效应蛋白通过孔转位产生的两个或更多个电或电流效应之前和/或之后以及(b)在由两个或更多个聚合物引导的效应蛋白通过孔转位产生的两个或更多个电或电流效应之间观察到。

该方法可以涉及测量当聚合物相对于孔移动时穿过孔的电流。因此，装置还可以包括能够跨越膜和孔施加电位并测量电信号的电路。该方法可以使用膜片钳或电压钳来执行。该方法优选地涉及电压钳的使用。

该方法可以涉及测量当聚合物相对于孔移动时穿过孔的电流。用于测量通过蛋白质孔的离子电流的合适条件是本领域已知的并且在实例中公开。该方法通常通过跨越膜和孔施加电压来执行。所使用的电压通常为+5V至-5V，诸如+4V至-4V、+3V至-3V或+2V至-2V。所使用的电压通常为-600mV至+600mV或-400mV至+400mV。所使用的电压优选在具有选自-400mV、-300mV、-200mV、-150mV、-100mV、-50mV、-20mV和0mV的下限和独立地选自+10mV、+20mV、+50mV、+100mV、+150mV、+200mV、+300mV和+400mV的上限的范围内。所使用的电压更优选在100mV至240mV的范围内并且最优选在120mV至220mV的范围内。通过使用增加的施加电位可以增加孔对不同核苷酸的区分。

该方法通常在任何电荷载体存在下执行，诸如金属盐，例如碱金属盐，卤化物盐，例如氯化物盐，诸如碱金属氯化物盐。电荷载体可以包括离子液体或有机盐，例如四甲基氯化铵、三甲基苯基氯化铵、苯基三甲基氯化铵或1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓。在上面讨论的示例性装置中，盐存在于室中的水溶液中。通常使用氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、氯化铯(CsCl)或亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。优选KCl、NaCl以及亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。电荷载体可以是跨膜不对称的。例如，膜每一侧上的电荷载体的类型和/或浓度可以不同。

盐浓度可以处于饱和状态。盐浓度可以为3M或更低，并且通常为0.1至2.5M、0.3至1.9M、0.5至1.8M、0.7至1.7M、0.9至1.6M或1M至1.4M。盐浓度优选为150mM至1M。该方法优选使用至少0.3M，诸如至少0.4M、至少0.5M、至少0.6M、至少0.8M、至少1.0M、至少1.5M、至少2.0M、至少2.5M或至少3.0M的盐浓度执行。高盐浓度提供高信噪比并允许电流指示针对正常电流波动背景识别的核苷酸的存在。

该方法通常在缓冲液存在下执行。在上述示例性装置中，缓冲液存在于室中的水溶液中。任何缓冲液均可以用于本发明的方法中。通常，缓冲液是磷酸盐缓冲液。其他合适的缓冲液是HEPES和Tris-HCl缓冲液。该方法通常在4.0至12.0、4.5至10.0、5.0至9.0、5.5至8.8、6.0至8.7或7.0至8.8或7.5至8.5的pH下执行。所使用的pH优选为约7.5。

该方法可以在0℃至100℃、15℃至95℃、16℃至90℃、17℃至85℃、18℃至80℃、19℃至70℃、或20℃至60℃下执行。该方法通常在室温下执行。该方法任选地在支持酶功能的温度(诸如约37℃)下进行。

孔

本发明的方法使用具有允许复合物通过孔的转位的开口或通道的生物孔。孔开口或通道的最小直径大至足以允许复合物通过孔的转位。孔可以在开口或通道中具有收缩部，其允许复合物通过孔的转位。开口或通道优选地允许复合物通过孔的转位并允许孔与聚合物引导的效应蛋白之间的一种或多种相互作用。孔开口或通道的最小直径大至足以允许复合物通过孔的转位并允许孔与聚合物引导的效应蛋白之间的一种或多种相互作用。孔可以在开口或通道中具有收缩部，其允许复合物通过孔的转位并允许孔与聚合物引导的效应蛋白之间的一种或多种相互作用。一种或多种相互作用可以选自物理相互作用、空间相互作用、静电相互作用、氢键和范德华相互作用。

开口或通道的直径优选为至少约5nm，诸如直径为至少约5.5nm、至少约6nm、至少约7nm、至少约8nm、至少约9nm、至少约10nm、至少约11nm或至少约12nm。开口或通道的直径通常小于约20nm，但直径可以高达约100nm。开口或通道的直径优选为约5nm至约20nm，诸如直接为约6nm至约19nm、约7nm至约18nm、约8nm至约17nm、约9nm至约16nm或约10nm至约15nm。如果聚合物引导的效应蛋白是RNA引导的核酸内切酶，诸如Cas、Cas12a(以前称为Cpf1)或C2c2，则开口或通道的直径优选为约11nm至约13nm，诸如约12nm。如果聚合物引导的效应蛋白是Cas9，则开口或通道的直径优选为约11nm至约13nm，诸如约12nm。聚合物引导的效应蛋白的最大尺寸优选为约3nm或更小，诸如约2nm或更小或约1nm或更小，小于生物孔的开口或通道。

生物孔是在一定程度上跨越膜的结构。它允许由施加电位驱动的水合离子跨越膜或在膜内流动。该孔通常跨越整个膜，使得水合离子可以从膜的一侧流到膜的另一侧。然而，孔不必跨越膜。它的一端可能是封闭的。例如，孔可以是膜中的凹槽、间隙、通道、沟槽或狭缝，水合离子可以沿着其流动或流入其中。

生物孔是由生物材料构建的孔，诸如多肽、蛋白质或多核苷酸。生物孔可以是天然存在的生物孔或天然存在的生物孔的修饰形式。合适的修饰是本领域已知的并且在下文讨论。

生物孔优选为蛋白质孔。蛋白质孔是允许水合离子(诸如多核苷酸)从膜的一侧流到膜的另一侧的多肽或多肽的集合。在本发明中，蛋白质孔能够形成允许由施加电位驱动的水合离子从膜的一侧流到另一侧的孔。蛋白质孔允许多核苷酸从膜(诸如三嵌段共聚物膜)的一侧流到另一侧。蛋白质孔允许多核苷酸(诸如DNA或RNA)通过该孔移动。该孔允许复合物从膜(诸如三嵌段共聚物膜)的一侧流到另一侧。

蛋白质孔可以包括一种或多种翻译后修饰(PTM)。一种或多种PTM可以选自磷酸化、糖基化、脂化和二硫键的形成。与野生型或天然存在的孔相比，一种或多种PTM可以被修饰。例如，蛋白质孔中一种或多种不同的氨基酸可以被磷酸化。蛋白质孔可能缺少这些PTM中的一者或多者。

蛋白质孔优选被糖基化。蛋白质孔的糖基化可以被修饰。与野生型或天然存在的孔相比，蛋白质孔的糖基化优选被修饰。糖基化可以以任何方式修饰。修饰的糖基化可以包括(a)蛋白质孔中一种或多种不同的氨基酸被糖基化，(b)一种或多种聚糖的性质被改变，(c)糖基化的类型被改变或其任何组合，诸如(a)、(b)、(c)、(a)和(b)、(a)和(c)、(b)和(c)或者(a)、(b)和(c)。蛋白质孔中一种或多种不同的氨基酸被糖基化包括但不限于在野生型或天然存在的孔中通常被糖基化的一种或多种氨基酸未被糖基化、在野生型或天然存在的孔中通常不被糖基化的一种或多种氨基酸被糖基化和/或一种或多种聚糖被移动到不同的氨基酸。糖基化的类型可以从N-连接糖基化改变为O-连接糖基化，或反之亦然。蛋白质孔优选不被糖基化(也称为非糖基化)或优选缺乏糖基化。

蛋白质孔可以是单体或寡聚体。孔优选地由数个重复亚基构成，诸如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个，在至少15个，或至少16个亚基。孔优选是六聚体、七聚体、八聚体或九聚体孔。孔可以是同源寡聚体或异源寡聚体。补体成分9(C9)通常是22聚体。

蛋白质孔通常包括离子可以流过的桶或通道。孔的亚基通常围绕中心轴并为跨膜桶或通道或者跨膜α-螺旋束或通道贡献链。

蛋白质孔的桶或通道通常包括促进与聚合物引导的效应蛋白以及核苷酸、多核苷酸或核酸相互作用的氨基酸。这些氨基酸优选位于桶或通道(如果存在)的收缩部附近。蛋白质孔通常包括一种或多种带正电的氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸或组氨酸，或者芳香族氨基酸，诸如酪氨酸或色氨酸。这些氨基酸通常促进孔与聚合物引导的效应蛋白以及核苷酸、多核苷酸或核酸之间的相互作用。

蛋白质孔优选是补体成分9(C9)、产气夹膜羧菌溶素O、侧耳溶血素、单增李斯特菌溶血素、穿孔素-2、焦孔素-A3、L-、P-和M-环蛋白、II型分泌系统蛋白D、GspD、InvG、VirB7、SpoIIIAG、Cag8、Cag3、Cag或IV型分泌系统装置蛋白CagY、WzzB、穿透素、Afp2中的其他蛋白、主要穹窿蛋白、硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶还原酶、Arf-GAP、呼吸道合胞病毒核糖核蛋白、基孔肯雅病毒非结构蛋白1、PRC、YaxA、XaxA或PrgH。如果聚合物引导的效应蛋白是RNA引导的核酸内切酶，诸如Cas、Cas12a(以前称为Cpf1)或C2c2，则孔优选是C9。如果聚合物引导的效应蛋白是Cas9，则孔优选是C9。C9是寡聚体。在本发明的上下文中，C9孔是C9蛋白质单体的寡聚体。

生物孔可以是人工生物孔。合适的孔是本领域已知的并且包括但不限于DNA折纸孔(Langecker等人,Science,2012；338:932-936)和聚合物修饰的固态孔。固态孔可以用上面讨论的聚合物中的任一者来修饰。

生物孔存在于膜中。该膜优选是两亲层，诸如三嵌段共聚物膜，或固态层。WO2018/060740中讨论了膜。生物孔可以是两亲膜中的蛋白质孔或人工孔，诸如DNA折纸孔。生物孔可以是固态层中的蛋白质孔或人工孔，诸如DNA折纸孔。

固态层可以由有机和无机材料形成，包括但不限于微电子材料、绝缘材料(诸如Si₃N₄、A1₂O₃和SiO)、有机和无机聚合物(诸如聚酰胺)、塑料(诸如)或弹性体(诸如双组分加成固化硅橡胶)和玻璃。固态层可以由石墨烯形成。合适的石墨烯层公开于WO2009/035647中。Yusko等人,Nature Nanotechnology,2011；6:253-260和美国专利申请号2013/0048499描述了在不使用微粒的情况下将蛋白质递送至固态层中的孔。

本文描述的蛋白质中的任一者，诸如蛋白质孔，可以被修饰以帮助其识别或纯化，例如通过添加组氨酸残基(his标签)、天冬氨酸残基(asp标签)、链霉亲和素标签、flag标签、SUMO标签、GST标签或MBP标签，或通过添加信号序列以促进它们从细胞中分泌，在该细胞中多肽天然不含有此类序列。引入遗传标签的替代方式是使标签化学反应到孔或构建体上的天然或工程化位置上。这种情况的一个实例是使凝胶转移试剂与在孔外部工程化的半胱氨酸反应。这已被证明是一种用于分离溶血素异源寡聚体的方法(Chem Biol.1997年7月；4(7):497-505)。

孔可以用展现标记来标注。展现标记可以是允许检测孔的任何合适的标记。合适的标记包括但不限于荧光分子、放射性同位素(例如¹²⁵I、³⁵S)、酶、抗体、抗原、多核苷酸和配体(诸如生物素)。

本文描述的蛋白质中的任一者，诸如蛋白质孔，可以合成或通过重组方式制备。例如，孔可以通过体外翻译和转录(IVTT)来合成。孔的氨基酸序列可以被修饰以包括非天然存在的氨基酸或以增加蛋白质的稳定性。当通过合成方式产生蛋白质时，可以在生产期间引入此类氨基酸。孔也可以在合成或重组生产后改变。

本文描述的蛋白质中的任一者，诸如蛋白质孔，可以使用本领域已知的标准方法产生。编码孔或构建体的多核苷酸序列可以使用本领域的标准方法衍生和复制。编码孔或构建体的多核苷酸序列可以使用本领域的标准技术在细菌宿主细胞中表达。可以通过来自重组表达载体的多肽的原位表达在细胞中产生孔。表达载体任选地携带诱导型启动子以控制多肽的表达。这些方法描述于Sambrook,J.和Russell,D.(2001).Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY中。

可以在通过任何蛋白质液相色谱系统从蛋白质产生生物体纯化后或在重组表达后大规模产生孔。典型的蛋白质液相色谱系统包括FPLC、AKTA系统、Bio-Cad系统、Bio-RadBioLogic系统和Gilson HPLC系统。

装置、条件和阵列

该方法可以使用WO 2008/102120和/或WO 2018/060740中描述的装置和条件执行。

该膜通常是膜阵列的一部分，其中每个膜优选地包括生物孔。因此，本发明提供了一种使用膜阵列检测靶聚合物的方法。该阵列可以是WO 2018/060740中描述的那些中的任一者。

另外的实施例

衔接子、偶联物、接头、锚、前导序列、测序衔接子或Y衔接子、发夹环、珠或微粒、膜、阵列、多核苷酸结合蛋白和相关的游离核苷酸或辅因子可以是WO 2018/060740中描述的那些中的任一者。

锚可以是Jones等人,J.Am.Chem.Soc.2021,143,22,8305–8313中描述的那些中的任一者。锚优选是胆固醇。

诊断

本发明的方法可以用于诊断或预测疾病或病症。该疾病或病症优选是癌症、冠心病、心血管疾病、结核病或败血症。疾病或病症的实例在WO 2018/060740中阐述。

由于在使用多重方法的实施例中，可以确定两种或更多种靶聚合物(例如，至少多于5种、10种或更多、20种或更多或者30种或更多)的存在或不存在，因此可以预测或诊断上面列出的任何疾病中的两种或更多种(例如，3种、4种、5种、6种或更多种)。因此，提供了一种用于检测和/或分析多种(例如，至少2种或更多、至少3种或更多、至少10种或更多、至少20种或更多或者至少30种或更多)靶聚合物的多重方法。

该方法还可以用于检测源自微生物或微生物群的聚合物，诸如多核苷酸。这可用于疾病诊断和监测，但也有其他应用。例如，该方法可以用于分析肠道或阴道菌群、皮肤或其他地方存在的微生物。微生物可以是例如细菌、病毒、真菌或分枝杆菌。该方法可以用于确定哪种感染原引起疾病，并因此确定最佳治疗过程。例如，尿路感染和其他感染越来越多地产生抗菌抗性。该方法可以用于确定引起感染的细菌，并因此识别成功治疗感染的抗生素或其他治疗。

该方法可以用于表征基因组DNA。在一个特定的示例性实施例中，该方法可以用于识别多态性，诸如SNP。在另一个实施例中，本发明的方法可以用于组库分析，例如V(D)J区域的组库分析。此类方法可以使用源自血细胞或T细胞的样品进行分析。

该方法还可以用于表征未知的聚合物序列。

系统

本发明还提供了用于实施本发明的方法的系统。该系统用于确定样品中靶聚合物的存在或不存在。在本发明的上下文中，术语“系统”和“试剂盒”是可互换的。因此，本发明提供了一种用于确定样品中靶聚合物的存在或不存在的试剂盒。

该系统或试剂盒包括引导聚合物，该引导聚合物(i)若该靶聚合物存在，则与该靶聚合物的一部分结合并且(ii)与聚合物引导的效应蛋白结合或附接，其中该引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白与该样品中存在的任何靶聚合物形成复合物。上面参考本发明的方法讨论的实施例中的任一者同样适用于本发明的系统。

该系统或试剂盒还包括具有开口的生物孔，该开口允许复合物通过该孔的转位。参考本发明的方法讨论的孔中的任一者可以存在于本发明的系统中。

孔优选存在于膜中。合适的膜是如上所讨论的。该系统或试剂盒可以是上面公开的膜中的任一者，诸如两亲层、三嵌段共聚物膜或固态层。

该系统或试剂盒优选地适应于跨越膜施加电压并进行一项或多项电测量。WO2018/060740中讨论了适当的适应。

该系统或试剂盒可以进一步包括能够沿着多核苷酸和/或前导序列移动的多核苷酸结合蛋白。试剂盒可以进一步包括微粒。

引导聚合物、聚合物引导的效应蛋白、锚、衔接子、多核苷酸结合蛋白、前导序列和/或微粒可以是本文定义的那些中的任一者。该系统或试剂盒可以包括引导聚合物组或引导聚合物/聚合物引导的效应蛋白复合物组。该组通常是为特定目的而设计的，诸如检测特定微生物、与疾病相关的标志物、特定多态性等。

该系统或试剂盒可以另外包括一种或多种使得能够执行上述实施例中任一者的其他试剂或仪器。此类试剂或仪器包括以下项中的一者或多者：合适的缓冲液(水溶液)、从受试者获得样品的工具(诸如包含针的容器或仪器)、扩增和/或表达多核苷酸的工具、如上定义的膜或者电压或膜片钳装置。试剂可以干燥状态存在于系统或试剂盒中，使得流体样品用于重新悬浮试剂。系统或试剂盒还可以任选地包括使系统或试剂盒能够用于本文描述的方法中的说明或关于该方法可以用于哪种生物体的细节。该系统或试剂盒可以包括磁体或电磁体。该系统或试剂盒可以任选地包括核苷酸。

该系统或试剂盒可以包括如本文所述的具有末端延伸或第一和第二末端延伸的引导聚合物以及如本文所述的捕获寡核苷酸或第一和第二捕获寡核苷酸。该系统或试剂盒可以进一步包括如本文所述的竞争寡核苷酸。该系统或试剂盒可以进一步包括包含亲和分子对(例如，链霉亲和素)的一半的珠以及包含亲和分子对(例如，生物素)的另一半的第一和第二捕获寡核苷酸。第一和第二捕获寡核苷酸可以各自与单独的表面结合，例如与单独的珠群体结合。第一捕获寡核苷酸可以与例如“纯化”珠或“纯化”柱结合。第二捕获寡核苷酸可以与例如“递送”珠结合。“纯化”珠和/或“递送”珠可以是磁性的。

以下实例说明本发明。

实例

材料

使用了以下材料：

·dCas9(Cas9-Spy-(D10A/H840A))：其序列公开于WO 2018/060740中

·3.6kb双链线性λDNA(SEQ ID NO:1)

·全长双链线性λDNA

·tracr RNA(IDT altR)

·CRISPR RNA(Enlam86、Enlam87、AR837、Enlam51、Enlam5、Enlam26、Enlam45)

·Minion

·C9单体

·寡聚缓冲液(10mM HEPES-NaOH，50mM NaCl，pH7.5，0.02mg/mL amphipol)

·含介质缓冲液的顺式和反式Minion流通池

·介质缓冲液(300mM铁氰化钾、300mM亚铁氰化钾，1M LiCl，50mM HEPES-NaOH，pH8)

·结合缓冲液(25mM HEPES-NaOH，pH 8.0，150mM NaCl，1mM MgCl2)

·LiCl缓冲液(2M LiCl，25mM HEPES-NaOH，pH8)或任何其他合适的缓冲液

·2x LiCl缓冲液(4M LiCl，50mM HEPES-NaOH，pH8)或任何其他合适的2x缓冲液

·加热块

C9寡聚方案

在寡聚缓冲液中将C9单体稀释至1mg/ml，并在37℃下孵育至少30分钟且最多24小时。这产生寡聚孔。

将孔插入到Minion流通池上

取寡聚孔并在介质缓冲液中稀释1/20,000。将300uL添加到minion流通池中并运行孔插入脚本。该脚本应用电压斜升，其从100mV开始，保持10秒，然后将电压增加5mV直至105mV，并再保持10秒。它继续将电压增加5mV，并在每个电压下保持10秒，直到达到450mV的电压，此时结束。在脚本持续期间，监测每个通道中的电流，并且如果检测到>50pA的电流，则关闭通道并将电压设置为0。脚本完成后，用1mL介质缓冲液冲洗流通池。然后用1mL LiCl缓冲液冲洗流通池。这产生具有孔的LiCl流通池。

仅DNA样品的制备

在LiCl缓冲液中将3.6kb双链线性λDNA稀释至5nM。

附接单个Cas9探针的DNA样品的制备

1.通过将10uM tracr RNA加热至90℃持续2分钟，并且然后置于冰上10分钟来快速冷却。

2.在含有结合缓冲液的Eppendorf Protein Lo-Bind管中按以下顺序添加以下组分，在步骤之间进行孵育，如5uL反应所示。每次添加后通过移液混合。

a)3uM dCas9。

b)6uM快速冷却的tracr RNA。

c)在室温下孵育5分钟。

d)7.5uM CRISPR RNA。

e)在室温下孵育5分钟。

f)150nM 3.6kb双链线性λDNA。

g)在室温下孵育至少20分钟。

3.取步骤2中制备的5uL样品，并添加145uL LiCl缓冲液。现在已准备好添加到流通池中。

附接多个Cas9探针的DNA样品的制备

2.在含有结合缓冲液的Eppendorf Protein Lo-Bind管中按以下顺序添加以下组分，在步骤之间进行孵育，如5uL反应所示。每次添加后通过移液混合。分别对每个探针进行此步骤。

a)3uM dCas9。

b)6uM快速冷却的tracr RNA。

c)在室温下孵育5分钟。

d)7.5uM CRISPR RNA。

e)在室温下孵育5分钟。

3.在Eppendorf Protein Lo-Bind管中添加5uL上述步骤2中制备的每个探针样品和足够的3.6kb双链线性λDNA，使得150uL中的浓度为5nM。锅中的实际浓度将根据探针的数量而变化。在室温下孵育至少20分钟。

4.向步骤3中制备的样品中添加75uL 2x LiCl缓冲液和足够的水以使总体积为最多150uL。现在已准备好添加到流通池中。

Minion平台上的电生理实验

评定含孔的LiCl流通池上的电流值，并且如有必要，施加电压偏移，使其读数尽可能接近0pA。运行IV曲线，以10mV的步长从0mV斜升至+-100mV，每个级别保持30秒(参见图7)。采样频率设置为30kHz。这用作添加样品之前的对照部分。

将前两部分中任一部分中产生的150uL样品添加到minion流通池中，并重复IV曲线测量。

结果

这些在图1-7中示出。

序列

3.6kb双链线性λDNA(SEQ ID NO:1)

/>

Enlam86

从IDT订购的将与该DNA序列结合的altR cas9 tracr：GGGTCATTGAAGCCTGCCGT(SEQ ID NO:2)

Enlam87

从IDT订购的将与该DNA序列结合的altR cas9 tracr：GGTTTCTTCCGTGTCAGCAC(SEQ ID NO:3)

AR837

从IDT订购的将与该DNA序列结合的altR cas9 tracr：TCATGTCTTACCCCCAATAA(SEQ ID NO:4)

Enlam51

从IDT订购的将与该DNA序列结合的altR cas9 tracr：AATCAGCGACACTGAATACG(SEQ ID NO:5)

Enlam5

从IDT订购的将与该DNA序列结合的altR cas9 tracr：

CGTGGGCGTACTTTATGGGGGCGG(SEQ ID NO:6)

Enlam26

从IDT订购的将与该DNA序列结合的altR cas9 tracr：

CGGACTGCGATAATAAGTGGTGG(SEQ ID NO:7)

Enlam45

从IDT订购的将与该DNA序列结合的altR cas9 tracr：

TGTGGTAGTGAGATGAAAAGAGG(SEQ ID NO:8)

Claims

1.一种确定样品中靶聚合物的存在或不存在的方法，所述方法包括：

a)使所述样品与引导聚合物接触，所述引导聚合物(i)与所述靶聚合物的一部分结合并且(ii)与聚合物引导的效应蛋白结合或附接，其中所述引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白与所述样品中存在的任何靶聚合物形成复合物；

b)使所述样品与包含生物孔的膜接触，所述生物孔具有允许所述复合物通过所述孔的转位的开口；

c)跨越所述膜施加电位差并进行一项或多项电测量；以及

d)监测由于所述复合物通过所述孔的转位而产生的电效应的存在或不存在，并且从而确定所述样品中所述靶聚合物的存在或不存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述复合物的所述聚合物引导的效应蛋白部分通过所述孔的转位产生电效应，所述电效应和与所述复合物的转位通过所述孔的所述靶聚合物部分相关的电效应相比为(i)更长、(ii)更明显和(iii)更复杂中的一者或多者。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(c)包括跨越所述膜施加电位差并测量流过所述孔的电流。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述复合物的所述聚合物引导的效应蛋白部分通过所述孔的转位产生电流效应，所述电流效应和与所述复合物的转位通过所述孔的所述靶聚合物部分相关的电流效应相比为(i)更长、(ii)更明显和(iii)更复杂中的一者或多者。

5.根据权利要求2或4所述的方法，其中更复杂的电或电流效应包括(i)不一致效应、(ii)噪声和(iii)电步进事件中的一者或多者。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中在与所述聚合物引导的效应蛋白相关的所述电或电流效应之前和/或之后观察到与所述靶聚合物相关的所述电或电流效应。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶聚合物为靶多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述靶多核苷酸为双链的或包含双链区域和/或为DNA、DNA/RNA杂交体或RNA。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述引导聚合物为引导多核苷酸并且所述聚合物引导的效应蛋白为多核苷酸引导的效应蛋白。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述引导多核苷酸为引导RNA并且所述多核苷酸引导的效应蛋白为RNA引导的效应蛋白。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述RNA引导的效应蛋白为RNA引导的核酸内切酶或者其中RNA引导的核酸内切酶的核酸酶活性被禁用的所述RNA引导的核酸内切酶。

12.根据权利要求11所述的方法，其中：

a)所述RNA引导的核酸内切酶的一个或多个催化核酸酶位点失活；和/或

b)所述RNA引导的核酸内切酶为Cas、Cas12a或C2c2。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述Cas为Cas9。

14.根据权利要求7至13中任一项所述的方法，其中所述引导多核苷酸包含与所述靶聚合物中的序列结合的核苷酸序列和与所述多核苷酸引导的效应蛋白结合的核苷酸序列。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述引导多核苷酸为包含与所述靶多核苷酸中的序列结合的crRNA和tracrRNA的引导RNA。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述引导RNA为sgRNA。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述引导聚合物、所述聚合物引导的效应蛋白或在存在时的所述靶聚合物具有能够与所述膜偶联的锚。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述锚包含胆固醇。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括使所述样品和所述孔与两个或更多个引导聚合物接触，所述两个或更多个引导聚合物中的每一个(i)与所述靶聚合物的一部分结合并且(ii)与两个或更多个聚合物引导的效应蛋白结合或附接，其中所述两个或更多个引导聚合物和两个或更多个聚合物引导的效应蛋白与所述样品中存在的任何靶聚合物形成两个或更多个复合物，并且步骤(d)包括监测由所述两个或更多个复合物通过所述孔的转位而产生的两个或更多个电或电流效应的存在或不存在，并且从而确定所述样品中所述靶聚合物的存在或不存在。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述两个或更多个引导聚合物与所述靶聚合物的不同部分结合。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述两个或更多个聚合物引导的效应蛋白是不同的聚合物引导的效应蛋白或不同的RNA引导的效应蛋白。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中在由所述两个或更多个复合物的转位通过所述孔的所述聚合物引导的效应蛋白部分产生的所述电或电流效应之间观察到与所述两个或更多个复合物的转位通过所述孔的所述靶聚合物部分相关的所述电或电流效应。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括在所述靶聚合物存在时，确定所述靶聚合物的量或所述靶聚合物的一个或多个特征。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述一个或多个特征选自(i)所述靶聚合物的长度，(ii)所述靶聚合物的身份，(iii)所述靶聚合物的序列，(iv)所述靶聚合物的二级结构以及(v)所述靶聚合物是否被修饰。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述孔为天然存在的生物孔或天然存在的生物孔的修饰形式。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述天然存在的生物孔为补体成分9(C9)、产气夹膜羧菌溶素O、侧耳溶血素、单增李斯特菌溶血素、穿孔素-2、焦孔素-A3、L-、P-和M-环蛋白、II型分泌系统蛋白D、GspD、InvG、VirB7、SpoIIIAG、Cag8、Cag3、Cag或IV型分泌系统装置蛋白CagY、WzzB、穿透素、Afp2中的其他蛋白、主要穹窿蛋白、硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶还原酶、Arf-GAP、呼吸道合胞病毒核糖核蛋白、基孔肯雅病毒非结构蛋白1、PRC、YaxA、XaxA或PrgH。

27.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述孔为人工生物孔。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述孔为DNA折纸孔。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述膜为(i)三嵌段共聚物膜或(ii)固态层，并且所述生物孔存在于所述固态层中的孔中。

30.一种用于确定样品中靶聚合物的存在或不存在的系统，所述系统包括：

c)引导聚合物，其(i)若所述靶聚合物存在，则与所述靶聚合物的一部分结合并且(ii)与聚合物引导的效应蛋白结合或附接，其中所述引导聚合物和聚合物引导的效应蛋白与所述样品中存在的任何靶聚合物形成复合物；以及

d)具有开口的生物孔，所述开口允许所述复合物通过所述孔的转位。

31.根据权利要求30所述的系统，其中所述孔存在于膜中。

32.根据权利要求30或31所述的系统，其中所述系统适应于跨越所述膜施加电压并进行一项或多项电测量。

33.根据权利要求30至32中任一项所述的系统，其中所述系统适应于执行根据权利要求1至29中任一项所述的方法。