KR20240067077A - 신규한 상승적 조합물 및 암 치료를 위한 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EZH2를 억제하는 화합물과 관련된 신규한 조성물, 조합물 및 방법, 및 메틸트랜스퍼라제 EZH2와 관련된 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 그의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 메틸트랜스퍼라제 EZH2와 관련된 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 상승적 2제 요법 조성물로서, 치료가 필요한 대상체에게 치료학적 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 상기 조성물은 EZH2 억제제와 하나의 HMG-CoA 환원효소 억제제 또는 스타틴의 조합을 포함하는, 상승적 2제 요법 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상승적 2제 요법 조성물 뿐만 아니라 유효량의 하나 이상의 항암 약물 또는 화학요법제를 상기 2제 요법 조성물과 조합시켜 추가로 투여하는 것을 포함하는, 특정 유형의 암 및 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 상승적 3제 요법 조성물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 상승적 조합물 및 암 치료를 위한 이의 사용 방법

본 발명은 신규한 상승적 조합물뿐만 아니라 특정 유형의 암 및 종양, 예를 들어 제스트 호몰로그 2 (Zeste Homolog 2)의 히스톤 메틸전이효소 인핸서(EZH2)와 관련된 특정의 암 및 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2 관련 암 및/또는 종양의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 상기 상승적 조합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신규한 마커인 제스트 호몰로그 2의 인핸서(EZH2) 뿐만 아니라, 더 높은 재발 또는 사망 확률의 예후 인자로서 EZH2의 사용, 및 특정 유형의 암을 앓고 있는 대상체의 예후를 예측하기 위한 바이오마커 EZH2를 분석하는 방법에 관한 것이다.

후성적 변형(Epigenetic modification)은 DNA 서열을 변경하지 않고도 DNA 메틸화 및 탈메틸화, 히스톤 변형, 염색질 리모델링 등을 통해 염색질 상태와 유전자 발현을 조절할 수 있다. 중요한 후성적 조절인자 그룹인 폴리콤 그룹 단백질(PcG)은 세포 증식에 중요한 역할을 하며 줄기세포의 다능성과 분화는 물론 악성 형질전환 중의 비정상적인 유전자 발현에 중요한 인자이다. PcG 단백질은 두 개의 핵심 복합체를 함유하고 있고, 각각 유지 복합 폴리콤 억제 복합체 1(PRC1) 및 개시 복합체 폴리콤 억제 복합체 2(PRC2)이다. PRC1은 RING1A 및 RING1B 유비퀴틴 리가제를 통해 Lys 119에서 히스톤 H2A를 모노-유비퀴틴화하는 것으로 알려져 있다. PRC2는 유전자 전사를 조절하기 위해 Lys 27에서 히스톤 H3의 모노-, 디-, 트리-메틸화를 촉매하는 것으로 간주되었다.

제스트 호몰로그 2의 인핸서(EZH2)는 유사한 구조적 모티프와 도메인을 공유하는 많은 종에서 확이된 진화적 보존 유전자이다. 히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2는 C-말단의 SET 도메인에 의해 Lys 27(H3K27me3)에서 히스톤 H3의 트리메틸화를 위한 PRC2의 촉매 서브유닛으로서, 표적 유전자를 침묵시키고 다양한 생물학적 기능( 예 : 세포 주기, 세포 증식, 세포 분화 등)에 관여하는 것으로 확인되었다. 암 진행에서의 EZH2의 역할도 고려되었다. EZH2는 전립선암, 유방암, 난소암 등 다양한 악성 종양에서 비정상적으로 과발현된다. EZH2는 H3K27me3을 매개하고 많은 악성 종양 모델에서 종양 성장과 전이를 촉진하는 중요한 요소로 기능한다. 또한, EZH2의 증가 또는 기능 상실의 돌연변이도 다양한 암에서 발견되고 있다. 일부 연구는 소분자 억제제 또는 유전자 녹다운에 의한 EZH2의 억제에 의해 암세포 성장 및 종양 형성이 감소하는 것을 보여주고 있다. EZH2는 히스톤 변형인자로서 PCR2 의존적 방식으로 역할을 수행하는 것 외에도 암에서 PCR2 및 히스톤 독립적 방식으로 작용한다. 예를 들어, EZH2는 신경 교모종의 비히스톤 단백질 STAT3을 메틸화 하고, 거세 저항성 전립선암(CRPC)의 안드로겐 수용체 관련 복합체에 공활성화 인자로 관여할 수 있다. Gan L et al., (Biomark Res　6,　10 (2018). doi.org/10.1186/s40364-018-0122-2 )에서 설명된 바와 같이, 암에서의 EZH2의 다양한 기능은 다양한 상황 및 다양한 종류의 암에서의 그의 유전적, 전사적, 전사후 및 번역후의 조절에서 유래한다.

EZH2의 발암성의 역할을 뒷받침하는 추가 연구 결과가 최근 들어 나오고 있다. 연구에 따르면, EZH2의 C-말단 촉매 SET 도메인 내의 티로신 641(Y641)에서의 재발성 이형 접합성 점 돌연변이는 배중심 B세포(GCB) 미만성 대세포 B세포 림프종(DLBCL)의 22%에서 발생하며, 여포성 림프종(FL)의 7%~12%에서 발생하는 것으로 나타났다. 이에 따라 효소 활성의 기능 획득이 제공되어 H3K27의 트리메틸화된 형태로의 전환을 증가시키는 것으로 나타났다. Y641 돌연변이(Y641F, Y641N, Y641S, Y641C 및 Y641H)는 메틸화되지 않은 H3K27의 메틸화 활성은 저하되고 있지만 디메틸화 버전의 H3k27의 활성은 향상되고 있다. 따라서 돌연변이는 야생형 EZH2와 협력하여 H3K27의 정상 상태를 전환하여 트리메틸화를 선호하며, 따라서 폴리콤 표적의 발현을 억제했다. A677 및 A687 잔기에서의 EZH2 점 돌연변이는 비호지킨 림프종(NHL)에서도 확인되고 있으며, 마찬가지로 H3K27의 과트리메틸화를 일으킨다. 암에서의 돌연변이 EZH2의 기능 획득형의 역할에 대한 추가 뒷받침은 일반적으로 EZH2 활성을 길항하는 다른 염색질 조절 인자에서의 암 관련 기능 상실 돌연변이의 확인에서 나왔다. UTX(X 염색체에 편재적으로 전사된 테트라트리코펩타이드 반복 유전자)는 디메틸화 및 트리메틸화 H3K27로부터 메틸기를 제거하여 EZH2 활성을 길항함으로써 부분적으로 기능하는 히스톤 디메틸라제이다. UTX에 영향을 미치는 비활성화 돌연변이는 다발성 골수종, 수모세포종, 식도암, 방광암, 췌장암 및 신장암을 포함한 여러 종류의 인간 암에서 발생한다. 이들 돌연변이에는 동형 접합성(여성의 경우) 또는 반접합성(남성의 경우)의 큰 결실, 넌센스 돌연변이, 작은 프레임 이동 삽입/결실 및 조기 종료 코돈을 초래하는 콘센서스 스플라이스 부위 돌연변이가 포함된다. 거의 모든 돌연변이는 UTX의 데메틸라제 활성에 필수적인 JmjC 도메인의 손실을 초래할 것으로 예상되며, H3K27 트리메틸화 레벨을 증가시키는 것으로 나타났다. 따라서 Kim KH et al. (Targeting EZH2 in cancer.　Nat Med. 2016;22(2):128-134. doi:10.1038/nm.4036)에서 설명된 바와 같이, UTX의 기능 상실형 돌연변이는 EZH2의 기능 상실형 돌연변이로 인한 돌연변이와 유사할 수 있다.

이러한 이해에도 불구하고, 종양 및 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 EZH2 억제제의 효능은 여전히 논란의 여지가 있다. 여러 후보가 임상 시험을 진행했거나 현재 진행 중이며 현재까지 이용 가능한 데이터는 결론적인 것은 아니다.

최초의 EZH2 억제제는 3-데아자네프라로신 A(DZNep)였다. 알려진 S-아데노실-L-호모시스테인(SAH) 가수분해효소 억제제인 DZNep은 SAH의 증가를 통해 EZH2를 간접적으로 억제하며, 이는 S-아데노실-L-메티오닌 의존성 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 직접 억제한다. DZNep은 히스톤 메틸화를 전체적으로 억제하지만 EZH2에 특이적인 것은 아니다.

GSK2816126으로도 알려진 두 번째 후보 GSK-126은 야생형 및 Y641 돌연변이체 EZH2를 유사한 효능으로 억제하는 것으로 나타났으며, EZH1(150배 증가된 효능) 또는 20개의 다른 메틸트랜스퍼라제(EZH2에 대해 > 1000배의 선택성)에 비해 고도로 선택적이다. 재발성/난치성 고형 종양 및 혈액학적 악성 종양 환자를 대상으로 GSK-126(NCT02082977)의 안전성, 최대 내약 용량(MTD), 약동학, 약력학을 평가하기 위해 다중심성 1상 임상 시험이 2019년에 시작되었다. 41명의 참가자(고형 종양 21명, 림프종 20명)는 28일간(3주 투여/1주 휴무) 동안 정맥 내 용액으로 GSK2816126을 50~3000mg 범위에서 주 2회 단계적 증량 투여받았다. 그러나 이 임상 단계는 임상 활성에 대한 증거가 불충분하고, 투여 방법과 상대적으로 짧은 반감기가 유효 노출을 제한하는 등 추가 임상 조사를 정당화하지 못하여 종료되었다(임상 시험 번호 NCT02082977 참조). 이 임상 단계의 결과는 Yap TA 등에 의해 보고되었다. (Clin Cancer Res. 2019 Dec 15;25(24):7331-7339)에서는 다발성 고형 종양 및 림프종 세포주의 감수성을 보여주는 전임상 데이터에도 불구하고 GSK2816126이 난치성/재발성 고형 및 혈액학적 악성종양 환자에서 EZH2를 표적으로 하는 실행 가능한 약물이 아니라고 결론지었다. 상기 연구에서는 GSK2816126의 최대 허용 용량(MTD)을 2,400mg으로 정의했지만, 이 레벨에서 이 약물은 부적절한 임상 활성을 보여주었으며, 목표를 벗어난 용량 제한 독성(DLT)으로 인해 추가 용량 증량이 불가능했다.

특히 GSK343, GSK926 및 타제메토스타트(E7438/EPZ6438)을 비롯하여 EZH2의 여러 다른 S-아데노실-메티오닌 경쟁적 억제제도 개발되었다. GSK926과 GSK343은 유방암과 전립선암 세포에서 히스톤 H3K27me3 레벨을 억제하고 EZH2 활성을 억제할 수 있으며, 반면 GSK343은 쥐 약동학 연구에서 높은 제거율로 인해 시험관 내에서 사용할 수 있을 뿐이다.

타제메토스타트는 효능과 약동학적 특성의 개선을 나타냈으며 경구 투여가 가능하다. Wiese M et al. (Klin Padiatr. 2016 Apr;228(3):113-7)은 EZH2 및 기타 PRC2 유전자(EZH1, SUZ12, EED)의 발현과 소아 다형교모세포종(GBM) 환자의 전체 생존 기간과의 상관관계, 및 H3.3 돌연변이 또는 H3 야생형을 보유하는 소아 교모세포종 다형/ 미만성 내인성 교신경교종 /미만성 정중선 신경교종(GBM/DIPG/DMG) 세포에서의 타제메토스타트에 의한 EZH2 억제의 세포독성 영향을 조사했다. 그러나 Wiese et al.은 이러한 EZH2 억제제를 사용한 치료는 이들 종양에 대하여 유망한 접근법은 아니라고 결론지었다. 그럼에도 불구하고 USFDA는 2020년 6월에 FDA 승인 테스트에서 검출된 EZH2 돌연변이에 대해 종양이 양성이고, 이전에 최소 2회 전신 요법을 받은 적이 있는 재발성 또는 난치성(R/R) 여포성 림프종(FL) 성인 환자는 물론 만족스러운 대체 치료 옵션이 없는 R/R FL 성인 환자를 위한 EZH2 억제제 타제메토스타트(TAZVERIK, Epizyme, Inc.)의 조기 승인을 부여했다.

따라서, 현재 메틸트랜스퍼라제 EZH2 활성과 관련된 다수의 악성종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 더 큰 치료 효능을 갖는 새로운 방법 및 조성물이 필요하다. 본 발명은 이러한 필요성에 대처하고 신규한 치료법을 제공한다.

발명의 개요

본 발명은 상승적 2제 요법(bi-therapy) 조성물 뿐만 아니라, 특정 유형의 암 및 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 이의 사용 방법으로서, 치료학적 유효량의 상기 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 조성물이 EZH2 억제제와 하나의 스타틴의 조합을 포함하는, 사용방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상승적 3제 요법(tri-therapy) 조성물 뿐만 아니라 유효량의 하나 이상의 항암 약물 또는 화학요법제를 상기 2제 요법 조성물과 조합하여 투여하는 것을 추가로 포함하는, 특정 유형의 암 및 종양을 치료 및/또는 예방하기 위한 이의 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상승적 2제 요법 및 3제 요법 조성물은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2와 관련된 특정 유형의 암 및 종양을 치료하는데 특히 효과적이다.

가장 중요하게는, 본 발명에 따른 상승적 2제 요법 및 3제 요법은 이전의 임상 시험과 비교하여 EZH2 억제제의 용량 요법을 적어도 절반으로 감소시킬 수 있고, 따라서 상기 종양에 대한 치료 효율성을 유지하면서 훨씬 감소된 독성을 나타낸다. 실제로, 출원인은 하나 이상의 EZH2 억제제(예: GSK-126)와 하나 이상의 스타틴 및/또는 하나 이상의 항암 약물 또는 화학요법제의 조합을 투여하면 암 또는 종양이 GSK-126을 감수성화하며, 따라서 GSK-126에 대한 환자의 내성을 역전 또는 감소시킨다는 것을 본 명세서에서 이하에 나타냈다.

본 발명은 일부 암 대상체, 특히 간모세포종 또는 미만성 내인성 교신경묘종(DIPG)를 앓고 있는 환자에서의 예후 불량의 바이오마커로서 EZH2의 사용, 및 상기 대상체의 분리된 샘플에서 EZH2의 레벨을 결정하는 것을 포함하는 상기 대상체의 불량한 예후를 예측하는 방법을 추가로 제공한다.

도 1A-E: DMG 세포가 저용량의 GSK-126 억제제에 감수성이 있고 GSK-126이 H3k27me3 트리메틸화를 차단하는 것을 나타낸다. (A) EZH2 전사물는 정상 뇌(n=10)와 비교하여 일련의 DMG 생검(n=35)에서 유의적으로 과발현되었으며, 마이크로어레이 데이터는 GSE50021로부터 검색되었다. 점선의 사각은 발현 중앙값을 중심으로 재그룹화된 샘플의 경계를 나타낸다. DMG 생검과 정상 뇌 사이의 모수적 t 검정. (B) 환자 유래의 세포주는 웨스턴 블롯에 의해 검출된 EZH2 단백질을 발현한다. (C-D) GSK-126은 NEM157i 및 SU-DIPG-IVi DMG 세포의 증식을 강력하게 억제하고(C) 또한 치료 5일 후 종양 세포 사멸을 유도한다(D). 일원배치 분산분석(n>3, p<0.0001), 본페로니 검정 후의 다중 비교(Bonferroni's multiple comparisons post-test). E) H3k27me3 트리메틸화는 GSK-126 처리된 NEM157i 및 SU-DIPG-IVi DMG 세포에서 용량 의존적 방식으로 감소된다. 3개의 독립적인 실험을 대표하는 하나의 블롯. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.
도 2A-C: DMG 세포가 저용량의 GSK-126 억제제에 감수성이 있다는 것을 나타낸다. (A-C) SU-DIPG-IVi(A), NEM157i(B) 및 NEM163i(C) DMG 세포의 세포 생존율은 증가하는 용량의 GSK-126(n=3) 존재 하에서 72시간 처리 후에 측정하였다. 각 세포주에 대해 IC50은 해당 그래프에 표시된다.
도 3: GSK-126 처리된 DIPG 세포에서의 지질 및 콜레스테롤 합성에 관여하는 유전자의 발현의 증가를 나타낸다. 그래프는 1.5% DMSO 또는 GSK-126으로 처리한 NEM163i, NEM157i 및 SU-DIPG-IVi 세포에서의 실시간 정량적 PCR로 측정한 HMGCS, HMGCR, LDLR, NPC1 및 SQLE 전사물의 정규화 레벨을 나타낸다 (각 세포주에서 측정된 IC50, n=6, Unpaired 맨 위트니 검정). GAPDH 전사물은 정규화를 위한 내부 대조로서 사용되었다. **p<0.01; ***p<0.001.
도 4: GSK-126 처리된 DIPG 세포에서의 SQLE 및 HMGCR 단백질의 발현의 증가를 나타낸다. 1.5% DMSO 또는 GSK-126으로 처리한 NEM163i 및 SU-DIPG-IVi 세포에서의 웨스턴법으로 측정한 HMGCR 및 SQLE 단백질 레벨 (각 세포주에서 측정된 IC₅₀, n=4~5, Unpaired 맨 위트니 검정). GAPDH 단백질은 정규화를 위한 내부 대조로서 사용되었다. 2~4개의 독립적인 실험의 대표적인 블롯을 나타낸다. *p<0.05; **p<0.01.
도 5A-C: SU-DIPG-IVi 및 NEM157i DMG 세포의 생존율에 대한 콜레스테롤 생합성 경로 효소의 억제제(X축에 나타낸 용량)의 효과가 없음을 나타낸다. (A-C) 콜레스테롤 생합성 경로에 관여하고 GSK-126 [(A) 테르비나핀: 스쿠알렌 에폭시다제 - SQLE, (B) 아토르바스타틴: 하이드록시메틸글루타릴-조효소 A(HMG-CoA) 환원효소 - HMGSC1, (C) ACSS2 억제제: 아세테이트 의존성 아세틸-CoA 합성효소 2 - ACCS2]에 의해 유도되는 다양한 효소의 세 가지 화학적 억제제는 최대 30μM의 DMG 세포 증식에 영향을 미치지 않으며, 이는 GSK-126이 없는 경우 이러한 억제제에 대한 세포의 감수성이 없음을 암시한다. 일원배치 분산분석(n=3, p<0.0001), 본페로니 검정 후의 다중 비교, *, p<0.05; **, p<0.01.
도 6A-C: DMG 세포에 대한 GSK-126 및 콜레스테롤 생합성 경로 효소 억제제를 포함하는 2제 요법의 상승 효과를 나타낸다. (A-C) DMG 세포(열린 원)에 성장 억제 효과가 없는 용량인 GSK-126 4μM, 및 ACSS2 억제제(A), 아토르바스타틴(B) 또는 테르비나핀(C)의 용량으로 노출된 NEM157i 및 SU-DIPG-IVi 세포(표시된 대로)의 세포 성장 분석. 일원배치 분산분석(n=3, p<0.0001), 본페로니 검정 후의 다중 비교. 2제 요법 치료는 단독으로 효과를 나타내지 않는 낮은 마이크로 몰 용량의 스타틴에서 시작하여 상당한 증식 억제를 나타낸다 (도 3 참조). **, p<0.01; ***, p<0.001.
도 7A-E: 새로운 초대 DMG 세포주 BXdmg1의 분자 및 표현형 특징을 나타낸다. (A) BXdmg1 초대 세포 특성화. 왼쪽 위 패널: 초기 계대 BXdmg1 초대 세포의 세포 형태를 나타내는 명시야 현미경. 바 = 200μm. 위쪽 중간 패널: 핵 불규칙성을 나타내는 세포의 Cytoblock 제제의 H&E 염색. 오른쪽 상단 패널: Ki-67 염색을 사용한 증식 상태. 왼쪽 하단 패널: BXdmg1 세포에서의 H3K27M 돌연변이의 존재를 입증. 하단 중간 패널: BXdmg1 세포의 H3K27me 트리메틸화 상태. 오른쪽 아래 패널: GSK-126에 노출된 후 H3K27me의 전형적인 감소를 입증하는 히스톤 단백질 분리에 대한 웨스턴 블롯. (B,C) BXdmg1 증식은 다른 DMG 세포에 필적하는 감수성인 10.36μM의 IC₅₀으로 GSK-126에 의해 억제된다 (도 2 참조). 일원배치 분산분석(n=3, p<0.0001), 본페로니 검정 후의 다중 비교. (D) BXdmg1 세포는 콜레스테롤 생합성 억제제에 대한 노출에 감수성이 없다. (E) GSK-126과 아토르바스타틴(Ator)의 콤보 치료(Combo treatment)는 GSK-126 또는 아토르바스타틴 단독보다 더 강력한 성장 억제를 나타낸다. 콤보 효과는 저용량에서 볼 수 있으며 GSK-126의 고용량에서는 이러한 농도에서의 세포 독성 때문에 사라진다. 일원배치 분산분석(n=3, p<0.0001), 본페로니 검정 후의 다중 비교. ns, 유의적이지 않음; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.
도 8A-C: DMG 세포 이동에 대한 GSK-126 및 콜레스테롤 생합성 경로 효소 억제제의 상승 효과를 나타낸다. (A-C) NEM157i(A) 및 NEM163i(B) 세포 및 BXdmg1 초대 세포(C)에서 창상 스크래치 분석에 의해 밝혀진 콤보 치료에서의 세포 이동 장애. 일원배치 분산분석(n=3, p<0.0001), 본페로니 검정 후의 다중 비교. ns, 유의적이지 않음; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.
도 9A-E: DMG 스페로이드 형성에 대한 GSK-126 및 콜레스테롤 생합성 경로 효소의 억제제의 상승 효과를 나타낸다. (A, B, D) 표시된 억제제에 노출된 후 표시된 DMG 신경교종 세포로부터 유래하는 대표적인 스페로이드의 위상차 현미경 사진. (C, E) 해당 그래프 위에 나타낸 DMG 세포주로부터 유래하는 스페로이드 형성에 대한 치료 효과의 통계적 분석. 표현형의 기준은 스페로이드가 형성되거나 또는 형성되지 않음(분산된 세포). Fisher의 정확 검정을 이용하여 관련 치료법과 조합(콤보)을 비교했다. GSK-126 투여량은 NEM157i의 경우 20μM, 다른 것의 경우 15μM이었다. ***, p<0.001.
도 10A-C: 마우스에서의 DMG 종양의 발생에 대한 GSK-126 및 콜레스테롤 생합성 경로 효소 억제제의 상승 효과를 나타낸다. (A) GSK-126 복강내 치료 후의 NOD/LtSz-scid IL2R 감마(NSG) 마우스의 뇌간에 이식된 SU-DIPG-IVi-Luc 세포(루시퍼라제 발현)의 동소성 종양 성장 억제. 종양 성장 억제는 지정된 처리(용매 대조: DMSO; GSK-126) 후의 생물발광 실시간 이미지화 및 통계 분석을 통해 모든 마우스에 대해 입증되었다. 회색 스케일 막대는 표현 레벨을 나타내며, 밝은 회색 값은 낮음, 어두운 회색 값은 높음을 나타낸다. 모수적 t 학생 검정(DMSO: n=18; GSK-126: n=23). (B) 세포독성이 없는 용량의 아토르바스타틴과 세포독성이 없는 용량의 GSK-126을 병용하여 동일한 접근법을 수행한다. 두 약물의 병용은 상당한 성장 억제 효과를 나타내며, 반면 단일 치료는 효과가 없다. 막대는 중앙값 플러스 범위를 나타낸다. 일원배치 분산분석(DMSO: n=13; 아토르바스타틴: n=13; GSK-126: n=17; 콤보: n=13; p<0.0001), 본페로니 검정 후의 다중 비교. (C) 콤보 치료에서 이식된 종양의 혈관신생 표현형이 덜 관찰된 병아리 CAM DMG 모델을 이용하여 유사한 종양 성장 억제 결과를 얻었으며, 반면 단일 치료법은 항혈관신생 효과가 없었다. 양측 피셔의 정확 검증. ns, 유의적이지 않음; *, p<0.05; **p<0.01.
도 11A-B: EZH2 침묵이 생체내에서 간모세포종의 발생을 방해한다는 것을 나타낸다. (A-B) Huh6 세포(A) 또는 HepG2 세포(B)를 대조군 siRNA(SiCTR) 또는 EZH2(SiEZH2)에 대한 siRNA로 형질감염시켰다. 24시간 후, 배아 발생 10일째에 세포를 수집하여 병아리 장뇨막(CAM)에 이식했다. 종양 성장을 11일부터 16일까지 모니터링했다. 두 세포주 및 지시된 조건에 대해 왼쪽 상단 패널: 17일째와 절제 및 파라포름알데히드 고정(레인 2) 후에 CAM(레인 1)상에서 성장한 종양의 대표적인 사진. 두 세포주 모두 오른쪽 상단 패널: SiCTR 종양 대 SiEZH2 종양에서의 7일차에 출혈을 나타내거나 출혈하지 않는 CAM의 수는 막대로 표시된다. 양측 피셔의 정확 검정. 두 세포주 모두 하부 패널: SiEZH2 또는 SiCTR로 형질감염된 Huh6 세포 이식 후 6일째에, 종양을 절제하고 무게를 측정했다. 왼쪽 패널: 지시된 조건에서 추출된 종양의 대표적인 사진. 오른쪽 패널: 막대는 종양 무게(mg)의 평균 +/- SD를 나타낸다. 그룹당 분석된 총 계란 수는 해당 조건 위의 괄호 안에 표시된다. 모수적 t 학생 검정. **, p<0.01; ****, p<0.0001.
도 12A-B: 간모세포종 세포의 생존에 대한 시스플라틴 단독 또는 2개의 EZH2 억제제의 효과를 나타낸다. (A-B) Huh6 및 HepG2 세포를 지시된 바와 같이, 증가하는 농도의 시스플라틴(A, 상부 패널), GSK-126(A, 하부 패널) 또는 EPZ-6438(타베메토스타트, B)의 존재하에서 48시간 동안 증식시켰다. 세포 생존율 및 IC₅₀은 Promega의 CellTiter 96^® AQ_ueous 원액 세포 증식 분석을 이용하여 측정하였다. 해당 조건에 대한 IC50은 도시된 바와 같다.
도 13A-C: 2D 및 3D 배양 조건에서 간모세포종 세포의 생존율에 대한 시스플라틴과 GSK-126의 조합 효과를 나타낸다. (A-B) Huh6 및 HepG2 세포는 고전적인 2D 배양 조건에서 또는 GSK-126 단독, 시스플라틴 단독 또는 지시된 바와 같이 둘 다의 조합의 존재 하에 종양 스페로이드로서 72시간 동안 증식시켰다. 약물 농도는 단독으로 사용할 경우 간모세포종 세포를 50% 사멸시키도록 선택되었다(도 12의 각 세포주 및 약물에 대한 IC50 참조). (A) Promega의 CellTiter 96^® AQ_ueous 원액 세포 증식 분석을 이용 사용하여 세포 생존을 측정했다(n=5, 일원배치 분산분석, p<0.0001). Sidak 검정 후의 다중 비교. (B) 살아있는 세포는 Calcein-AM 기질(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Calcein-AM)을 사용하여 녹색으로 염색되었고, 죽은 세포는 Ethidium Homodimer (EthD-1, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/12328897)를 사용하여 적색으로 염색되었다. 데이터는 2D 및 3D 조건에서 성장하는 간모세포종 세포에 대한 시험관 내 GSK-126 및 시스플라틴의 추가적인 항종양 효과를 나타낸다. ***, p<0.001; ****, p<0.0001.
도 14A-B: EZH2 고갈이 간모세포종 세포의 시스플라틴에 대한 감수성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. (A) Huh6(왼쪽) 및 HepG2(오른쪽) 세포를 대조군(SiCTR) 또는 두 개의 서로 다른 SiEZH2(SiEZH2-1 및 SiEZH2-2)로 형질감염시키고, 증가하는 농도의 시스플라틴의 존재 하에서 72시간 동안 증식시켰다. 세포 생존은 Promega의 CellTiter 96^® AQ_ueous 원액 세포 증식 분석을 이용하여 측정되었다. (n=4, 이원배치 분산분석, p<0.0001), Sidak 검정 후의 다중 비교. 밝은 회색 별표: 대조 세포와 SiEZH2-1 형질감염 세포 사이의 세포 생존율의 유의한 변동. 검은색 별표: 대조 세포와 SiEZH2-2 형질감염 세포 사이의 세포 생존율에 있어 유의한 변동. (B) 대조군(SiCTR) 또는 siEZH2 형질감염된 HepG2 세포를 12 μM의 시스플라틴(=IC50)의 존재 하에 종양 스페로이드로 48시간 동안 증식시켰다. 살아있는 세포는 Calcein-AM 기질로 녹색으로 염색되었고 죽은 세포는 EthD-1을 사용하여 빨간색으로 염색되었다(도 11B 참조). 3개의 독립적인 실험에 대한 대표적인 도면이다. ns, 유의적이지 않음; *, p<0.05; **, p<0.01.
도 15A-B: 스타틴이 GSK-126과 상승작용하여 간모세포종 세포를 박멸한다는 것을 나타낸다. (A) Huh6 세포(왼쪽)와 HepG2 세포(오른쪽)를 증가하는 농도의 심바스타틴 또는 아토르바스타틴의 존재 하에서 72시간 동안 처리했다. (n=3, 일원배치 분산분석, p<0.0001; Sidak 검정후의 다중 비교, *, p<0.05; **, p< 0.01; ***, p <0.001; ****, p< 0.0001. (B) Huh6 세포(왼쪽) 및 HepG2 세포(오른쪽)를 증가하는 농도의 GSK-126(상부 패널) 또는 시스플라틴(하부 패널)의 부재 또는 존재 하에서 72시간 동안 처리했다. 심바스타틴 4μM 또는 아토르바스타틴 8μM. (n=3, 이원배치 분산분석, p<0.0001, Sidak 검정 후의 다중 비교. (A-B) CellTiter 96^® AQ_ueous 원액 세포 증식 분석을 이용하여 모든 조건에서 세포 생존율과 IC50을 측정했다. 밝은 회색 별표: GSK-126 단독과 GSK-126을 표시된 농도의 아토르바스타틴과 병용한 경우 세포 생존율의 유의한 변동. 검은색 별표: GSK-126 단독과 지시된 농도의 심바스타틴을 병용한 GSK-126 사이의 세포 생존율에 있어서 유의한 변동 있음. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, ****p<0.0001. 도 16A-B: 스타틴이 시스플라틴의 부재 또는 존재 하에 GSK-126과 상승작용하여 시험관 내에서 간모세포종 세포를 박멸하는 것을 나타낸다. (A-B) Huh6 세포(A) 및 HepG2 세포(B)는 증가하는 농도의 심바스타틴(오른쪽 패널) 또는 아토르바스타틴(왼쪽 패널)의 존재 하에 3μM의 시스플라틴과 조합되거나 조합되지 않은 3μM의 GSK-126으로 72시간 동안 처리하였다. Promega의 CellTiter 96^® AQ_ueous 원액 세포 증식 분석 (n=3, 이원배치 분산분석, p<0.0001; Sidak 검정후의 다중 비교)를 사용하여 각 조건에서 세포 생존율을 측정했다. §: 용매 대조(DMSO)와 GSK-126 단독 또는 GSK-126과 지정된 스타틴의 테스트 농도 중 하나와 병용 사이에 세포 생존율의 유의한 변동. *: 용매 대조군(DMSO)과 GSK-126+시스플라틴 또는 GSK-126+시스플라틴과 검정 농도의 지정된 스타틴 사이의 세포 생존율의 유의한 변동. #: 표시된 스타틴의 표시된 농도에서 GSK-126과 GSK-126 + 시스플라틴 사이의 세포 생존율의 유의한 변동. *, p<0.05; **, p<0.01; ****, p<0.0001; ##, p<0.01; ###, p<0.001; ####, p<0.0001; §§, p<0.01; §§§, p<0.001; §§§§, p<0.0001;
도 17: 스타틴이 타제메토스타크(EPZ-6438)에 대한 간모세포종 세포의 감수성을 강력하게 증가시킨다는 것을 나타낸다. Huh6 세포(왼쪽)와 HepG2 세포(오른쪽)를 8μM의 아토르바스타틴 또는 4μM의 심바스타틴의 부재 또는 존재 하에 증가하는 농도의 타제메토스타트의t 존재 하에서 72시간 동안 처리했다(그래프마다 이하의 범례에 표시됨). Promega의 CellTiter 96^® AQ_ueous 원액 세포 증식 분석을 이용하여 각 조건에 대해 세포 생존율 및 IC50(각 조건의 괄호 안의 값을 참조)을 측정했다 (n=3, 이원배치 분산분석, p<0.0001; Sidak의 검정후의 다중 비교. 검은색 별표: 타제메토스타트 단독과 심바스타틴의 존재 하의 타제메토스타트 사이의 세포 생존율에 유의한 변동 있음. 밝은 회색 별표: 타제메토스타트 단독과 아토르바스타틴의 존재 하에 타제메토스타트 사이의 세포 생존율에 유의한 변동 있음. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.
도 18a-c: 간모세포종에서 EZH2의 발현의 증가를 나타낸다. 특히 도 18a는 C1 및 C2B 하위 그룹에 비해 증식성 C2A 하위 그룹에서 및 우리 데이터 세트 로부터의 비용양 샘플 (이 도면과 이후에서 NT)과 비교하여 증식성 C2A 하위 그룹에서 EZH2 전사체의 증가된 발현을 나타낸다 (gse104766, Hooks KB, Audoux J, Fazli H, Lesjean S, Ernault T, Dugot-Senant N, et al. 증식성 간모세포종의 진단 및 치료 옵션에 대한 새로운 통찰. Hepatology 2018;68:89-10) (Wilcoxon 일치 쌍 부호 순위 테스트). 도 18b는 EZH2 전사물의 발현과 TOP2A 전사체의 발현 사이의 양측 Pearson R 상관관계를 요약한 그래프이다 (gse104766, Hooks KB, Audoux J, Fazli H, Lesjean S, Ernault T, Dugot-Senant N, et al. 증식성 간모세포종에 대한 진단 및 치료 옵션에 대한 새로운 통찰. Hepatology 2018;68:89-10). R과 p-값은 도시한 바와 같다. 도 18c는 이케다의 데이터 세트 (gse131329, Hiyama E. 일본 소아 간 종양 연구회-2(JPLT-2) 시험의 간모세포종 사례에서 유전자 발현 프로파일링: Science Repository OU; 2019 2019-02-12), Carrillo-Reixach의 데이터 세트 (gse133039, Carrillo-Reixach J, Torrens L, Simon-Coma M, Royo L, Domingo-Sabat M, Abril-Fornaguera J, et al. 후성적 발자국에 의해 임상적 의의를 지닌 간모세포종의 분자 위험 계층화가 가능하게 된다. J Hepatol 2020;73:328-341), Lopez-Terrada의 데이터 세트 (gse75271, Sumazin P, Chen Y, Trevino LR, Sarabia SF, Hampton OA, Patel K, et al. 간모세포종의 게놈 분석에 의해 뚜렷한 분자 및 예후 하위 그룹이 특정된다. Hepatology 2017;65:104-121), Karns의 데이터 세트 (gse81928, Valanejad L, Cast A, Wright M, Bissig KD, Karns R, Weirauch MT, et al. PARP1 활성화는 변형된 종양 억제 인자의 발현과 침습성 간모세포종 발증의 기본 경로를 증가시킴. Commun Biol 2018;1:67), Buendia의 데이터 세트 (Cairo S, Armengol C, De Reynies A, Wei Y, Thomas E, Renard CA, et al. 악성도가 높은 소아 간암에서의 간 줄기 유사 표현형과 Wnt/베타-카테닌 및 Myc 신호전달의 상호 작용. Cancer Cell 2008;14:471-484) 및 Kappler의 데이터 세트 (gse151347, Eichenmuller M, Trippel F, Kreuder M, Beck A, Schwarzmayr T, Haberle B, et al. 간모세포종과 HCC와 유사한 특징을 지닌 그 자손의 게놈 상황. J Hepatol 2014;61:1312-1320)로부터의 간모세포종 및 비종양 간 조직에서 EZH2 전사물의 발현 증가를 나타낸다. 짝이 없는 Mann & Whitney 검정t. *p<0.05; ***p<0.001; ****p<0.0001.
도 19: 간모세포종 데이터세트에서의 EZH2와 TOP2A 전사물의 레벨 사이의 긍정적인 상관관계를 나타낸다. 그래프는 Ikeda 데이터세트(gse131329, Hiyama E. 일본 소아 간 종양 연구회-2(JPLT-2) 시험의 간모세포종 사례에서 유전자 발현 프로파일링: Science Repository OU; 2019 2019-02-12), Carrillo-Reixach의 데이터 세트 (gse133039, Carrillo-Reixach J, Torrens L, Simon-Coma M, Royo L, Domingo-Sabat M, Abril-Fornaguera J, et al. 후성적 발자국애 의해 임상적 의의를 지닌 간모세포종의 분자 위험 계층화가 가능하게 된다. J Hepatol 2020;73:328-341), Lopez-Terrada의 데이터 세트 (gse75271, Sumazin P, Chen Y, Trevino LR, Sarabia SF, Hampton OA, Patel K, et al. 간모세포종의 게놈 분석에 의해 뚜렷한 분자 및 예후 하위 그룹이 특정된다. Hepatology 2017;65:104-121), Karns의 데이터 세트 (gse81928, Valanejad L, Cast A, Wright M, Bissig KD, Karns R, Weirauch MT, et al. PARP1 활성화는 변형된 종양 억제 인자의 발현과 침습성 간모세포종 발증의 기본 경로를 증가시킴. Commun Biol 2018;1:67), Buendia의 데이터 세트 (Cairo S, Armengol C, De Reynies A, Wei Y, Thomas E, Renard CA, et al. 악성도가 높은 소아 간암에서의 간 줄기 유사 표현형과 Wnt/베타-카테닌과 Myc 신호전달의 상호 작용. Cancer Cell 2008;14:471-484) 및 Kappler의 데이터 세트 (gse151347, Eichenmuller M, Trippel F, Kreuder M, Beck A, Schwarzmayr T, Haberle B, et al. 간모세포종과 HCC와 유사한 특징을 지닌 그 자손의 게놈 상황. J Hepatol 2014;61:1312-1320)의 HB 샘플에서 EZH2 전사물의 발현과 TOP2A 전사물의 발현 사이의 양측 Pearson R 상관관계를 요약한다. 각 데이터 세트의 R 및 p-값은 해당 그래프에 나타낸 바와 같다.
도 20a-e: EZH2 발현이 종양 재발 및 환자 사망과 상관관계가 있음을 나타낸다. EZH2 전사물의 발현과 임상적 또는 조직학적 특징 사이의 상관 분석. 도 20a: 단계(gse75271, Sumazin P, Chen Y, Trevino LR, Sarabia SF, Hampton OA, Patel K, et al. 간모세포종의 게놈 분석에 의해 면확한 분자 및 예후 하위 그룹이 특정된다. Hepatology 2017;65:104-121); 도 20b: 나타낸 바와 같은 조직병리학적 하위 유형 (gse75271, Sumazin P, Chen Y, Trevino LR, Sarabia SF, Hampton OA, Patel K, at al. 간모세포종의 게놈 분석에 의해은 명확한 분자 및 예후 하위 그룹이 특정된다. Hepatology 2017;65:104-121); 도 20c: 완화 및 재발 (gse133039, Carrillo-Reixach J, Torrens L, Simon-Coma M, Royo L, Domingo-Sabat M, Abril-Fornaguera J, et al. 후성적 발자국에 의해 임상적 의의를 지닌 간모세포종의 분자 위험 계층화가 가능하게 된다. J Hepatol 2020;73:328-341; 도 20d: PRETEXT 방사선 병기 분류 시스템 (gse131329, Hiyama E. 일본 소아 간종양 연구회-2 (JPLT-2) 시험의 간모세포종 사례에 대한 유전자 발현 프로파일링: Science Repository OU; 2019 2019-02-12); 도 20e: 살아 있는 환자와 죽은 환자 (MAS5.0 - u133a, Buendia et al dataset (Cairo S, Armengol C, De Reynies A, Wei Y, Thomas E, Renard CA, et al. 악성도가 높은 소아 간암에서의 간 줄기 유사 표현형과 Wnt/베타-카테닌 및 Myc 신호 전달의 상호 작용. Cancer Cell 2008;14:471-484). 일원배치 분산분석, **p<0.01, 도 20a-d에 대한 Sidak의 검정 후의 다중 비교. 도 20e에 대한 짝이 없는 맨 휘트니 검정. ns, 유의적이지 않음; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001.
도 20a-e: EZH2 침묵이 세포 노화를 유도함으로써 간모세포종 세포 성장을 억제한다는 것을 나타낸다. 도 21a: 두 개의 서로 다른 siRNA(도 21a-e 및 이하의 도면). 도 21a 및 d: 3개 이상의 독립적인 실험의 대표적인 블롯이 잘린 이미지로 나타낸다(로딩 제어: GAPDH). 도 21b: EZH2-고갈된 Huh6(왼쪽) 또는 HepG2(오른쪽) 세포 대 siCTRL 세포의 성장(565nm에서의 흡광도)(n=3, 이원배치 분산분석, ****p<0.0001; Sidak의 검정후의 다중 비교). 도 21c: siCTRL 대 EZH2-고갈 Huh6(왼쪽) 또는 HepG2(오른쪽) 세포에서 측정된 노화. 대표적인 실험을 나타내고 막대 그래프는 평균치 ± 표준 편차(SD)를 요약한다 (n=5, 일원배치 분산분석, ***p<0.001; Sidak 검정후의 다중 비교). 도 21d: siCTRL 대비 EZH2-고갈 Huh6(왼쪽) 또는 HepG2(오른쪽) 세포에서의 세포 주기 억제제 단백질 P16 및 P21의 상대적 레벨. 도 21e: siCTRL 대비 EZH2-고갈 Huh6(왼쪽) 또는 HepG2(오른쪽) 세포에서 카스파제 3/7 활성을 나타내는 그래프 (n=3, 일원배치 분산분석, 유의적이지 않음, Sidak 검정후의 다중 비교). ns, 유의적이지 않음; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001.
도 22a-b: EZH2 침묵이 간모세포종 세포의 이동 및 히스톤 H3 라이신 27의 트리메틸화를 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 22a: 지시된 바와 같이 siEZH2-1 또는 siEZH2-2를 사용한 siCTRL 대배 EZH2-고갈 Huh6 세포의 이동. 상부 패널: 4개의 독립적인 실험의 대표적인 이미지. 하부 패널: 막대 그래프는 평균값 ± SD(n=4, 이원배치 분산분석, ****p<0.0001; Sidak 검정후의 다중 비교)를 요약한다. 도 22b: siCTRL 대비 EZH2-고갈 Huh6(왼쪽) 또는 HepG2(오른쪽) 세포에서의 H3K27me3 및 총 히스톤 H3 단백질의 상대적 레벨. 3가지 독립적 실험의 대표적인 블롯이 잘린 이미지로 나타낸다. (로딩 제어: 히스톤 H3). ***p<0.001; ****p<0.0001.
도 23a-b: EZH2는 히스톤 메틸 트랜스퍼라제 활성을 통해 간모세포종에서 ERK 신호전달을 증강한다는 것을 나타낸다. 도 23a: 지시된 바와 같이 siEZH2-1 또는 siEZH2-2를 사용하여 siCTRL 대 EZH2-고갈 Huh6(왼쪽) 또는 HepG2(오른쪽) 세포에서 총 ERK 및 포스포-ERK(p-ERK) 단백질의 레벨을 나타낸다. 도 23b: 빈 유전자 카세트(LV-CTRL), 야생형 EZH2 단백질(LV-EZH2 카세트) 또는 H698A 돌연변이 형태의 EZH2 단백질(LV-EZH2* 카세트)을 발현하는 Huh6(왼쪽) 및 HepG2(오른쪽) 세포에서 전체 ERK 및 포스포-ERK(p-ERK) 단백질의 레벨을 나타낸다. 도 23a-b: 잘린 이미지로 나타낸 3가지 실험의 대표적인 블롯이다(로딩 제어: 총 단백질).
도 24a-e: EZH2가 메틸 트랜스퍼라제 활성을 통해 간모세포종에서 종양유전자로 작용한다는 것을 나타낸다. 도 24a: EZH2 메틸트랜스퍼라제 도메인에 상응하는 코딩 서열을 나타낸다. 상부 패널: 야생형(WT) 서열. 하부 패널: 잔기 689에서 히스티딘(H) 대신 알라닌(A)을 인코딩하는 돌연변이된 서열(H698A 돌연변이: EZH2*로 지칭됨). 도 24b: LV-CTRL(빈 유전자 카세트), LV-EZH2 또는 LV-EZH2*에 의해 형질도입된 Huh6(왼쪽) 및 HepG2(오른쪽) 세포에서의 내인성 및 트랜스제닉 EZH2 및 EZH2* 단백질의 레벨을 나타낸다. 3개 이상의 독립적인 실험의 대표적인 블롯이 잘린 이미지로 나타낸다(로딩 제어: GAPDH). 도 24c: 빈 카세트(LV-CTRL), 야생형(LV-EZH2) 또는 H698A 돌연변이된 EZH2 단백질 (LV-EZH2*)을 발현하는 형질도입된 Huh6(왼쪽) 또는 HepG2(오른쪽) 세포의 세포 증식(565 nm에서의 흡광도)을 나타낸다 (n=3, 이원배치 분산분석, ****p<0.0001; Sidak 검정후의 다중 비교). 도 24d: CTRL 카세트, EZH2 또는 EZH2*를 발현하는 Huh6(상부) 및 HepG2(하부) 세포로부터 유래된 대표적인 96시간 숙성 스페로이드의 위상차 현미경 사진을 나타낸다. 도 24e: 빈 카세트(LV-CTRL), 야생형(LV-EZH2) 또는 H698A 돌연변이된 EZH2 단백질(LV-EZH2*)을 발현하는 Huh6(왼쪽) 및 HepG2(오른쪽) 세포에서 스페로이드 표면적(mm²)을 나타내는 그래프를 도시한다. (n=4, 일원배치 분산분석, ****p<0.0001; Sidak 검정후의 다중 비교). ns, 유의적이지 않음; *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001.
도 25: 시스플라틴 내성이 간모세포종 세포에서의 EZH2 메틸 트랜스퍼라제 활성에 의해 부분적으로 매개됨을 나타낸다. 빈 카세트(LV-CTRL), 야생형(LV-EZH2) 또는 H698A 돌연변이 EZH2 단백질(LV-EZH2*)을 발현하는 Huh6(왼쪽) 및 HepG2(오른쪽) 세포의 시스플라틴에 대한 반응. 그래프는 증가하는 용량의 시스플라틴으로 처리된 생존 가능한 Huh6(왼쪽) 및 HepG2(오른쪽) 세포의 백분율을 나타낸다. (n=3; 막대 = 평균치 +/- SD; 이원배치 분산분석, ****p<0.0001; Sidak 검정후의 다중 비교). *p<0.05; ***p<0.001; ****p<0.0001.
도 26a-b: EZH2 고갈이 간모세포종 세포에서 HMGCR 레벨을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 26a: siEZH2-1 대 siCTRL Huh6 세포에서 단백질체학 분석으로 측정한 단백질 레벨 배수 변화(X축, log2) 대 q 값(Y축, log10)의 볼카노 플롯. EZH2가 고갈된 세포에서 상당히 하향 및 상향 조절된 단백질은 각각 왼쪽 및 오른쪽 점선 프레임 내에 있다. HMGCR 단백질은 큰 검은 점으로 표시되고 화살표로 표시된다. 도 26b: 2개의 서로 다른 siRNA(표시된 대로 siEZH2-1 또는 siEZH2-2)를 사용한 대조군(siCTRL) 및 EZH2-고갈 Huh6(왼쪽) 또는 HepG2(오른쪽) 세포에서의 HMGCR 단백질 레벨. 3개 이상의 독립적인 실험의 대표적인 블롯이 이미지로 나타낸다(로딩 제어: GAPDH). HMGCR 단백질은 98 kDa의 밴드로 나타낸다.
도 27a-b: GSK-126에 의한 EZH2 히스톤 메틸 트랜스퍼라제의 불활성화가 간모세포종 세포에서 HMGCR 레벨 및 지질 합성을 유도한다는 것을 나타낸다. 도 27a: 대조군(DMSO 처리) 대 GSK-126 처리 Huh6(왼쪽) 또는 HepG2(오른쪽) 세포(IC50에서 사용된 GSK-126; Huh6 및 HepG2세포의 경우 6 및 8 μM)에서 H3K27me3 및 총 H3 단백질의 상대적 레벨. 3개의 독립적인 실험의 대표적인 블롯이 잘린 이미지로 나타낸다(로딩 제어: 히스톤 H3). 도 27b: 대조군(DMSO) 대 GSK-126 처리된 Huh6(왼쪽) 또는 HepG2(오른쪽) 세포의 HMGCR 단백질 레벨. 3개의 독립적인 실험의 대표적인 블롯이 이미지로 나타낸다(로딩 제어: GAPDH). 도 27c: 대조군(DMSO) 대 GSK-126 처리된 Huh6(왼쪽) 또는 HepG2(오른쪽) 세포의 지질 레벨. 지질 과립은 세포의 세포질에서 어두운 과립으로 나타낸다. 3가지 독립적인 실험의 대표적인 이미지가 도시된다.
도 28: 제노푸스 배아에서 GSK-126이 시스플라틴보다 독성이 낮다는 것을 나타낸다. 제노푸스 배아는 패널 아래에 표시된 바와 같이 증가하는 농도의 시스플라틴 또는 GSK-126 존재 하에서 증식했다. 3개의 독립적인 실험의 대표적인 이미지.
도 29: GSK-126와 스타틴이 간모세포종 세포의 클론 생성 능력을 완전히 차단한다는 것을 나타낸다. 간모세포종 세포의 생존 및 증식은 클론 생성 분석을 사용하여 평가되었다. Huh6(상부 패널) 및 HepG2(하부 패널) 세포를 DMSO(대조군: CTRL), IC25 용량의 GSK-126(Huh6 및 HepG2 세포에 대해 각각 3 및 4μM), 스타틴(ATR: 8μM의 아토르바스타틴; SIM: 4μM의 심바스타틴) 또는 둘 모두로 처리했다. 세포 플레이팅 10일 후, 콜로니를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 플레이트를 Fusion FX(Vilber Lourmat)를 사용하여 이미지화 했다. 3개의 독립적인 실험의 대표적인 이미지.
도 30: GSK-126 + 스타틴이 간모세포종 세포의 이동을 방해한다는 것을 나타낸다. Huh6 세포의 이동은 창상 치유 분석을 사용하여 평가되었다. Huh6 세포를 DMSO(대조군: CTRL), IC₂₅ 용량의 GSK-126(Huh6 및 HepG2 세포의 경우 각각 3 및 4μM), 스타틴(ATR: 아토르바스타틴 8μM, SIM: 심바스타틴 4μM) 또는 둘 다로 처리했다. 세포 플레이팅 및 창상 유도 후, Incucyte S3 Live-cell 분석 기기(Sartorius)를 사용하여 상대 창상 밀도의 백분율을 모니터링했다. 상부 패널: 창상 유도 20시간 후 Huh6 세포 이동에 대한 3가지 독립적 실험의 대표적인 이미지. 하부 패널: 표시된 약물로 처리된 Huh6 세포 이동의 동역학 분석. 막대 그래프는 평균치 ± SD를 요약한다. (n=3, 24시간 시점에서의 이원배치 분산분석, ****p<0.0001; Sidak 검정후의 다중 비교). ***p<0.001.
도 31a-d: GSK-126-아토르바스타틴 조합이 간 및 신장 기능에 영향을 주지 않고 생체내에서 간모세포종 발달을 방해한다는 것을 나타낸다. 도 31a: 비히클(주 3회, 1% DMSO를 포함하는 PBS), 시스플라틴(주 2회, 1mg/kg), GSK-126(주 3회, 50mg/kg), 아토르바스타틴(ATR, 주 3회, 20mg/kg) 또는 GSK-126과 아토르바스타틴으로 처리된 다양한 마우스 그룹의 개략도. 도 31b: 그래프는 시간(일)과 종양 부피(mm³) 사이의 상관관계를 요약한다. 이원배치 분산분석 (비히클: n=8; 시스플라틴: n=7 ATR: n=7; GSK-126: n=7; 콤보: n=8; p<0.0001), 터키 검정후의 다중 비교. 도 31c: 28일째에 안락사된 마우스로부터 추출된 종양의 이미지. 도 31d: 상이한 마우스 그룹에서의 ASAT, ALAT, 크레아티닌 및 요소의 혈액 순환 레벨. ns, 유의적이지 않음; *, p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001.

상세한 설명

따라서, 본 발명은 암을 치료 및/또는 예방하는 방법은 물론 히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2와 관련된 암 및 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 상승적 조성물 및 조합물로서, 치료학적 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 조성물이 EZH2 억제제와 하나 이상의 스타틴의 조합을 포함한 것에 관한 것이다.

EZH2 억제제는 전형적으로 EZH2의 S-아데노실-L-메티오닌(SAM) 경쟁적 억제제이며, 특히 Fioravanti R. et al. (Chem. Rec. 2018, 18, 1818-1832)에 기술된 바와 같이 2-피리돈 부분 또는 테트라메틸피페리디노벤즈아미드 부분을 갖는다.

일 예로서 한정하는 것은 아니지만, EZH2 억제제는 중심 골격으로서 이환식 헤테로방향족 고리를 갖는 촉매적 2-피리돈 EZH2 억제제, 예를 들면 GSK-126 또는 GSK2816126 (1-[(2S)-부탄-2-일]-N-[(4,6-디메틸-2-옥소-1H-피리딘-3-일)메틸]-3-메틸-6-[6-(1-피페라지닐)-3-피리디닐]-4-인돌카르복스아미드), UNC1999 (N-[(6-메틸-2-옥소-4-프로필-1H-피리딘-3-일)메틸]-1-프로판-2-일-6-[6-(4-프로판-2-일피페라진-1-일)피리딘-3-일]인다졸-4-카르복스아미드), EPZ005687 (1-사이클로펜틸-N-[(4,6-디메틸-2-옥소-1H-피리딘-3-일)메틸]-6-[4-(모르폴린-4-일메틸)페닐]인다졸-4-카복사미드), 및 EI1 (6-시아노-N-[(4,6-디메틸-2-옥소-1H-피리딘-3-일)메틸]-1-펜탄-3-일인돌-4-카르복사미드)를 포함할 수 있다. 우리는 또한 MC3629, 아미드 결합을 통해 2-피리돈 부위에 연결된 피라졸 및 피롤 기반 화합물을 포함하는 EPZ005687 및 GSK-126의 단순화된 유사체, GSK926 (N-[(4,6-디메틸-2-옥소-1H-피리딘-3-일)메틸]-6-[6-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-3-일]-1-프로판 -2-일린다졸-4-카르복스아미드), GSK343 (N-[(6-메틸-2-옥소-4-프로필-1H-피리딘-3-일)메틸]-6-[2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일]-1 -프로판-2-일린다졸-4-카르복스아미드), 및 GSK503 (N-[(4,6-디메틸-2-옥소-1H-피리딘-3-일)메틸]-3-메틸-6-[6-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-3-일]-1-프로판-2-일인돌-4-카르복스아미드)를 열거할 수 있다. 우리는 아미드 기능을 통해 인돌 핵에 연결된 2-피리돈 부분을 갖는 CPI-360, 아날로그 CPI-169 및 CPI-1205 또는 리라메스타트 (N-[(4-메톡시-6-메틸-2-옥소-1H-피리딘-3-일)메틸]-2-메틸-1-[(1R)-1-[1-(2,2,2-트리플루오로에틸)피페리딘-4-일]에틸]인돌-3-카르복스아미드)를 추가로 열거할 수 있다.

우리는 또한 EPZ-6438 또는 E7438이라고도 불리는 타제메토스타드(Tazemetostat) (N-[(4,6-디메틸-2-옥소-1H-피리딘-3-일)메틸]-3-[에틸(옥산-4-일)아미노]-2-메틸-5-[4-(모르폴린-4-일메틸)페닐] 벤즈아미드은 물론 타제메토스타트의 경구투여 가능한 두 가지 벤즈아미도메틸-2-피리돈 유사체: EPZ011989(1598383-40-4로도 지정됨) (N-[(4,6-디메틸-2-옥소-1H-피리딘-3-일)메틸]-3-[에틸-[4-[2-메톡시에틸(메틸)아미노] 사이클로헥실]아미노]-2-메틸-5-(3-모르폴린-4-일프로프-1-이닐)벤즈아미드) 및 1826865-46-6으로 지정된 ZLD1039 (3-[에틸(옥산-4-일)아미노]-2-메틸-N-[(1-메틸-3-옥소-5,6,7,8-테트라히드로-2H-이소퀴놀린-4-일)메틸]-5-[6-(4-메틸 피페라진-1-일)피리딘-3-일]벤즈아미드)를 열거할 수도 있다. 타제메토스타트의 다른 유사체는 EBI-2511 (N-[(4,6-디메틸-2-옥소-1H-피리딘-3-일)메틸]-5-에틸-6-[에틸(옥산-4-일)아미노]-2-(1-프로판-2-일피페리딘-4-일)-1-벤조푸란-4-카르복스아미드), 피노메토스타트 ((2R,3R,4S,5R)-2-(6-아미노푸린-9-일)-5-[[[3-[2-(6-tert-부틸-1H-벤즈이미다졸-2-일)에틸]사이클로부틸]-프로판-2-일아미노]메틸]옥솔란-3,4-디올), 리라메토스타트 (N-[(4-메톡시-6-메틸-2-옥소-1H-피리딘-3-일)메틸]-2-메틸-1-[(1R)-1-[1-(2,2,2 -트리플루오로에틸)피페리딘-4-일]에틸]인돌-3-카르복스아미드)를 포함한다.

우리는 추가로 JQE5라고도 불리는 JQEZ5 (1-이소프로필-N-((6-메틸-2-옥소-4-프로필-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸)-6-(6-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-3-일)-1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-4-카르복스아미드), PROTAC (PROteolysis TArgeting Chimeric) MS1943 (Feral et al., Adv. Therap. 2020, 3, 2000148 참조), DZNep ((1S,2R,5R)-5-(4-아미노이미다조[4,5-c]피리딘-1-일)-3-(하이드록시메틸)사이클로펜트-3-엔-1,2-디올)), MC1947, 및 MC1948을 열거할 수 있다.

우리는 또한, 2-피리돈 부분 외에 3,4-디하이드로이소퀴놀린 부분을 포함하는 촉매적 EZH2 억제제인 PF-06821497 화합물을 열거할 수 있다. 완전한 화학명은 5,8-디클로로-2-[(4-메톡시-6-메틸-2-옥소-1H-피리딘-3-일)메틸]-7-[(R)-메톡시(옥세탄-3-일)메틸]-3,4-디히드로이소퀴놀린-1-온이다.

본 발명에 따른 상승적 2제 요법 및 3제 요법 조성물에 사용될 수 있는 다른 선택적 EZH2 억제제는 이하를 포함한다:

- 5,8-디클로로-2-[(4-메톡시-6-메틸-2-옥소-1,2-디히드로-피리딘-3-일)메틸]-7-[메톡시(옥세탄-3-일)메틸]-3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2/-/)-온;

- 5,8-디클로로-2-[(4-메톡시-6-메틸-2-옥소-1,2-디히드로-피리딘-3-일)메틸]-7-[(R)-메톡시(옥세탄-3-일)메틸]-3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2H)-온;

- 5,8-디클로로-2-[(4-메톡시-6-메틸-2-옥소-1,2-디히드로-피리딘-3-일)메틸]-7-[(S)-메톡시(옥세탄-3-일)메틸]-3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2/-/)-온;

- 5-브로모-8-클로로-2-[(4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸]-7-(1,4-디메틸-f/-/-1,2,3-트리아졸-5-일)-3,4-디히드로이소퀴놀린-1(2/-/)-온; 5,8-디클로로-7-(3,5-디메틸-1,2-옥사졸-4-일)-2-[(4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸]-3,4-디히드로이소퀴놀린-1{2H)-온;

- N-[(4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸]-5-[에틸(테트라히드로-2H-피란-4-일)아미노]-4-메틸-4'-(모르폴린-4-일메틸)비페닐-3-카르복스아미드;

- N-[(4,6-디메틸-2-옥소-1,2-디히드로피리딘-3-일)메틸]-5-[에틸(테트라히드로-2H-피란-4-일)아미노]-4-메틸-4'-(모르폴린-4-일메틸)비페닐-3-카르복스아미드;

- N-[(4-메톡시-6-메틸-2-옥소-1, 2-디히드로피리딘-3-일)메틸]-2-메틸-1-[(1R)-1-[1-(2,2,2-트리플루오로에틸)피페리딘-4-일]에틸]-1H-인돌-3-카르복스아미드;

- N-(4,6-디메틸-2-옥소-1, 2-디히드로피리딘-3-일메틸)-1-이소프로필-3-메틸-6-[6-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-3-일]-1H-인돌-4-카르복스아미드;

- N-[(6-메틸-2-옥소-4-프로필-1,2-디하이드로피리딘-3-일)메틸]-6-[2-(4-메틸피페라진-1-일)피리딘-4-일]-1-(프로판-2-일)-1H-인다졸-4-카르복스아미드.

상기 하나의 스타틴은 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 메바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴, 세리바스타틴 및/또는 이들의 유사체로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다. 스타틴은 처방전을 통해 입수할 수 있다. 임상 조사중인 몇 가지가 더 있다. 그러나 본 발명에 따른 병용 요법에 사용되는 상기 하나의 스타틴은 바람직하게는 로바스타틴을 포함하지 않으며, 따라서 로바스타틴을 전혀 포함하지 않는다.

스타틴은 지질 저하 화합물로 기능하는 3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-조효소 A 환원효소 억제제(HMG-CoA 억제제 또는 HMGCR 억제제라고도 함)인 화합물 그룹이다. HMG-CoA는 메발로네이트 경로, 즉, 콜레스테롤과 기타 이소프레노이드를 생성하는 대사 경로의 속도 제한 효소인 효소{(즉, NADH 의존성(EC 1.1.1.88), NADPH 의존성(EC 1.1.1.34)}이다. HMG-CoA는 일반적으로 LDL 수용체를 통한 저밀도 지단백질(LDL)의 내재화 및 분해에서 유래하는 콜레스테롤은 물론 산화된 콜레스테롤 종에 의해 억제된다. 스타틴에 의한 HMG-CoA의 경쟁적 억제는 초기에 콜레스테롤 생산을 감소시키며, 적응 반응으로서 감소된 세포 콜레스테롤 수치는 간 및 기타 조직의 LDL 수용체(LDLR)를 포함한 유전자 발현의 스테롤 조절 요소 결합 단백질(SREBP) 매개 활성화를 유발하며, 이에 따라 순환계에서 LDL의 흡수를 증가시켜 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추게 된다.

본 발명에 따른 상승적 조성물 또는 병용요법은 히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2와 관련된 암 및 종양을 치료 및/또는 예방하는데 효과적이다. 이는 환자의 암 상태에 유익한 변화를 초래하는 것으로 나타났다. 변화는 주관적 또는 객관적일 수 있으며, 치료 중인 암의 증상이나 징후, 예를 들어 암세포 수의 감소, 암세포의 증식, 암종양의 크기, 다른 항암제에 대한 암세포의 내성,및/또는 환자 상태의 악화 방지와 같은 특징과 관련될 수 있다. 또한, 이들 병용요법은 종전의 임상시험에 비해 EZH2 억제제의 용량을 감소하여 투여하는 것이 가능해졌으며, 따라서 환자는 EZH2 억제제의 독성 부작용을 덜 겪게 되지만, 여전히 암에 대한 치료 효능을 유지하고 있다. GSK-126과 같은 EZH2 억제제의 투여량은 현재 임상시험에 사용되는 용량과 비교하여 최소 절반 정도 감량할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 2제 또는 3제 요법에서 GSK-126의 용량 요법은 정맥내 투여를 통해 주 2회 20 내지 1500mg, 바람직하게는 50 내지 1200mg, 더욱 바람직하게는 100 내지 1000mg일 수 있다.

실제로, 출원인은 GSK-126 등의 하나의 EZH2 억제제와, 하나 이상의 스타틴 및/또는 하나 이상의 항암 약물 또는 화학요법제의 조합물을 투여하면 암 또는 종양이 GSK-126에 감수성이 있으며, 이로써 GSK-126에 대한 환자의 내성을 역전 또는 감소시킨다는 것을 이하에 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 환자 또는 대상체는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 암 치료가 필요하거나 암/종양이 발생할 위험이 있는 인간을 의미한다.

히스톤 메틸트랜스퍼라제 EZH2와 관련된 암 및 종양은 특히 간모세포종(HB), 미만성 내인성 교신경교종 (DIPG, 질병의 출현에 관여하는 히스톤 H3 유전자의 돌연변이 빈도 때문에 "미만성 정중선 신경아교종 H3K27M-돌연변이"로도 알려짐; Louis, D.N., et al., The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathol, 2016. 131(6): p. 803-20), 미만성 정중선 신경교종(DMG), 방광암, 골암,뇌암, 유방암, 악성림프종, 횡문근종양, 백혈병, 폐암, 위암, 전립선암, 대장암, 식도암, 난소암, 자궁암, 간암, 고환암, 췌장암, 신장암, 직장암, 갑상선암, 피부암, 두경부암 중에서 선택될 수 있다. 상기 종양 및 암은 내피로부터 중간엽으로의 전이 관련 병리와 연관되지 않는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상승적 2제 요법 조성물 또는 병용 요법은 바람직하게는 항암 표준 치료, 방사선 요법 또는 다른 1차 또는 2차 암 요법 후에 재발성 또는 난치성 환자에게 투여된다. 이는 이들 암 또는 종양 중 일부는 특정 항암제에 내성을 가질 수 있기 때문이다.

실제로, 이하의 실시예에서 출원인이 입증한 바와 같이, 상기 2제 요법은 현저한 상승적 치료 효과를 갖는다: GSK-126과 하나의 스타틴을 조합 또는 병용 투여할 때 나타나는 치료 효과 및/또는 유익한 효과는 단독으로 투여했을 때보다 더 컸으며, 개별 화합물의 효과를 합하여 생성된 효과보다 더 컸다 (즉, 추가 효과보다 더 큰 효과). 특히, 세포 이동 및 부착에 관하여 병용 요법 또는 2제 요법의 예상치 못한 효능이 입증되었다. 상승 효과를 확인하는 방법은 Foucquier J. et al. (Pharmacology Research & Perspectives (2015) (3)3:e00l49)등 다양한 문헌에서 논의되고 있다.

2제 요법 조성물의 상승 효과로 인해, 환자에게 하나의 스타틴과 조합시켜 투여되거나 동시 투여된 EZH2 억제제의 치료학적 또는 예방적 유효량은 현재 임상 단계에서 지금까지 투여된 용량보다 훨씬 낮을 수 있다. 이와 같이 감소된 GSK-126의 유효 투여량은 환자의 1 내지 20mg/kg 또는 5-10mg/kg으로 포함될 수 있다. 본 발명의 2제 요법 내에서 EZH2 억제제의 투여 요법의 이러한 감소는, 암세포의 지연 또는 억제, 종양 성장, 종양 혈관신생, 진행 및/또는 전이의 억제, 종양 크기 감소, 세포 사멸 유도, 평균 생존 시간의 증가, 및 암세포가 내성을 갖게 되었거나 내성이 있는 항암제에 대한 암세포의 감작화를 포함하여, 효율적인 항암 효과를 유지하면서 환자에 대한 약물의 일반적인 독성을 크게 감소시키는 데 상당한 영향을 미친다.

본 발명에 따른 GSK-126과 스타틴의 조합을 포함하는 상승적 조성물 및 치료 방법은 시험관 내에서 간모세포종 세포를 근절하고 생체 내에서 간모세포종 성장과 혈관 형성을 차단하는 것으로 나타났다. 이들 조성물은 또한 시스플라틴 내성 간모세포종 치료에도 효과적이다.

특히, 출원인은 실시예 2 및 4에서 메틸트랜스퍼라제 EZH2는 간모세포종의 핵심 종양유전자이며 이 소아 간 종양의 치료에 관련하는 치료 표적임을 명확히 입증했다. 출원인은 EZH2가 히스톤 H3 및 비히스톤 표적에 대한 메틸 트랜스퍼라제 활성을 통해 한편으로는 증식성 간모세포종에서의 핵심 종양유전자로 작용하여, 염색질의 응축 및 종양 억제 유전자의 억제를 초래한다는 것을 입증했다. 실제로, 출원인은 EZH2 메틸트랜스퍼라제 활성이 세포 이동, 생존, 시스플라틴 내성 및 종양 발생 및 혈관신생에 필요하며, 따라서 EZH2 메틸트랜스퍼라제 활성이 암화 과정과 약물 내성의 중심인 것을 분명히 보여주었다. 한면, EZH2는 콜레스테롤과 지질 합성을 담당하는 HMG-CoA 환원효소와 침습성 간모세포종에 관여하는 이중 특이성 포스파타제인 DUSP9의 과발현을 유도하는 전사 보조인자로 작용하는 것을 보여주었다 (참조: Khoubai and Grosset, Int J Mol Sci 2021, https://doi.org/10.3390/ijms222111538).

2제 요법 또는 3제 요법의 시너지 효과에 대하여, 출원인은 GSK-126으로 처리된 간모세포종 세포에서 HGMCR 단백질이 유도되었음을 보여주었는데, 이는 EZH2와 하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소(HMGCR) 유전자 사이의 기능적 연결을 시사한다. 예를 들어, 아토르바스타틴(Atorvastatin)과 심바스타틴(Simvastatin)이라는 두 가지 스타틴은 심장 질환 및 이상지질혈증의 치료에 널리 사용되어 왔지만, 동일한 용량에서 이들 스타틴 중 어느 것도 간모세포종에 영향을 미치지 않았다. 그러나 놀랍게도 이러한 스타틴이 실제로 GSK-126 또는 EPZ6438과 같은 EZH2 억제제에 대한 간모세포종의 감수성을 증가시킨다는 것이 밝혀졌다. 또한, IC50 용량의 50%로 사용되는 GSK-126의 첨가로 아토르바스타틴과 심바스타틴에 대한 간모세포종의 감수성이 증가되었으며, 간모세포종은 2제 요법에 IC50 용량의 25%로 사용되는 시스플라틴을 추가할 때 훨씬 더 빨리 사망했다.

마찬가지로, 출원인은 GSK126로 처리한 DIPG에서 지질 및 콜레스테롤 합성에 관여하는 유전자의 발현이 증가함을 보여주었다. 특히, 하이드록시메틸글루타리-CoA 신타제(HMGCS), 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소(HMGCR), 저밀도 지질단백질 수용체(LDLR), 니만-피크 C1 단백질(NPC1) 및 스쿠알렌 에폭시다제(SQLE) 유전자, HMGCR 및 SQLE 단백질의 발현 유도로, GSK-126이 DIPG에서 지질 및 콜레스테롤 합성 경로를 활성화한다는 것을 입증했다.

이는 이하의 실시예에서 입증되는 적어도 스타틴과 함께 EZH2 억제제를 포함하는 2제 요법 조성물의 상승 효과에 대한 기구적 설명 및 확인이다. 그 결과, 간모세포종과 DIPG는 약물의 효과로부터 피할 가능성이 적게 되었다. 또한 EZH2 억제제는 간모세포종 관리를 개선하기 위해 단독으로 사용하거나 시스플라틴과 병용하여 사용할 수 있으며, 스타틴의 첨가에 의해 메발로네이트 경로를 차단하여 GSK-126의 효과가 강화되었다.

유전적 또는 약물 기반 약리학적 접근법을 이용하여 'EZH2 기능을 비활성화하면, 출원인은 EZH2 단백질이 시험관 내에서 간모세포종 세포의 2D 및 3D 성장 및 생존과 병아리 배아 모델에서 침습성 및 혈관신생 종양의 발달에 필요하다는 것을 보여주었다.

출원인은 또한 EZH2의 고갈에 의해 간모세포종 세포의 시스플라틴에 대한 감수성을 증가시키며, 시스플라틴과 GSK-126의 조합에 의해 시험관 내에서 종양 세포 제거에 추가적인 효과가 있다는 것을 밝혀냈다. GSK-126을 단독으로 사용한 경우도 5~10μM 범위의 농도에서 시험관 내에서 간모세포종 세포를 사멸시키는데 매우 효율적이었다. 따라서 이러한 데이터는 예를 들어 시스플라틴과 GSK-126을 포함하는 이러한 2제 요법이 1차 선택 치료에서 유효하고, 화학요법의 효율을 개선할 수 있으며, 또한 재발하여 시스플라틴에 대해 획득 내성을 보이는 환자를 위한 2차 치료로서 유용하다는 것을 명확히 보여주었다.

또한, 출원인은 EZH2 억제제, 스타틴(심바스타틴 또는 아토르바스타틴 등) 및 시스플라틴을 포함하는 본 발명에 따른 하나의 3제 요법을 실시하고, 심바스타틴 또는 아토르바스타틴의 첨가에 의해 GSK-126 단독의 항종양 잠재력이 증가함을 보여주고, 이로써 3제 요법의 치료학적 이점이 입증하였다.

본 발명에 따른 3제 요법 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 2제 요법 조성물을 포함하고, 추가로 하나 이상의 항암 약물을 포함하며, 상기 항암약물은 백금 화합물 또는 백금 기반 제제, 티로신 키나제 억제제, 탁산 유도체, 토포이소머라제 억제제, 호르몬 치료제, 항안드로겐제, 안드로겐 수용체제, 혈관신생 억제제, 면역치료제, 항염증제, 방사선치료제, 항암 효과을 갖는 생물학적 제제, 천연물질로 만든 항암제 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 3제 요법에 사용되는 바람직한 항암제는 백금 화합물 또는 백금계 제제, 예를 들어 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴, 피코플라틴, 네다플라틴, 트리플라틴 및/또는 리포플라틴이다. 출원인은 이하의 실시예에서, 유효량의 GSK-126, 스타틴과 상기 백금 화합물과 같은 추가 항암제를 포함하는 3제 요법 조합물을 투여하면, 우수한 치료 효과를 제공하며, 이에 따라 암세포 증식의 실질적 억제, 암세포 전이 억제, 종양 크기 감소, 대상체의 생존 시간 증가, 보다 일반적으로는 암의 하나 이상의 징후 및/또는 증상의 실질적 개선을 초래한다는 것을 입증했다. 이러한 3제 요법 조합은 항암제에 대한 암세포의 내성을 역전 또는 감소시키고 및/또는 암세포를 항암제에 감수성이 있는 것이 가능하지만 작용 메커니즘은 알려져 있지 않다.

이러한 3제 요법에 사용될 수 있는 기타 화학요법제는, 안트라세네디온(안트라퀴논) 예를 들어 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(다우노마이신; 루비도마이신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신 및 발루비신); 타목시펜 및 이의 대사산물 예를 들어 4-하이드록시타목시펜(아피목시펜) 및 N-데스메틸-4-하이드록시타목시펜(엔독시펜); 탁산류 예를 들어 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀, 카바지탁셀, 홍두산 A, 홍두산 B, 홍두산 C, 바카틴 I 및 바카틴 II; 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민(HN2), 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란(L-사르콜리신) 및 클로람부실 등의 질소 머스타드); 에틸렌이민 및 메틸멜라민(예를 들어, 헥사메틸멜라민, 티오테파, 부술판 등의 알킬 술포네이트, 카르무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNLJ) 등의 니트로소우레아, 세무스틴(메틸-CCN-U) 및 스트렙토조인(스트렙토조토신),및 데카르바진(DTIC; 디메틸트리아제노이미다졸카르복스아미드) 등의 트리아젠; 항대사물질(예: 메토트렉세이트(아메톱테린) 등의 엽산 유사체, 플루오로우라실(5-플루오로우라실; 5-FU) 등의 피리미딘 유사체, 플록수리딘(플루오로데옥시우리딘; FUdR) 및 시타라빈(시토신 아라비노사이드), 및 메르캅토퓨린(6-머캅토퓨린; 6-MP), 티오구아닌(6-티오구아닌; 6-TG) 및 펜토스타틴 또는 2'-데옥시코포니신) 등의 퓨린 유사체 및 관련 억제제; 천연물, 예를 들어 빈블라스틴(VLB) 및 빈크리스틴 등의 빈카 알칼로이드, 에토포시드 및 테니포시드 등의 에피포도필로톡신; 닥티노마이신(액티노마이신 D), 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신) 및 미토마이신(미토마이신 Q) 등의 항생제; L-아스파라기나제 등의 효소; 하이드록시우레아 등의 치환된 우레아; 프로카르바진(N-메틸히드라진; MIH) 등의 메틸 히드라진 유도체; 및/또는 미토탄 및 아미노글루테티미드 등의 부신피질 억제제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

항안드로겐 약물은 안드로겐 수용체를 차단하거나, 세포 표면의 결합 부위를 놓고 경합하거나, 안드로겐 생성에 영향을 미치거나 이를 중재함으로써 안드로겐 경로를 변경하는 약물이다. 항안드로겐 약물은 엔잘루타마이드, 아비라테론, 비칼루타마이드, 플루타마이드, 닐루타마이드, 아팔루타마이드, 피나스테리드, 두타스테리드, 알파트라디올 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

방사선치료제는 당업계에 잘 알려져 있으며 체외 방사선 요법 및/또는 체내 방사선 요법을 포함한다. 체외 방사선 치료는 고에너지 X-선 및/또는 감마선의 방사성 빔을 환자의 종양에 전달하고, 체내 방사선 요법은 환자의 종양에 방사성 원자를 전달한다. 체외 방사선 치료와 체내 방사선 치료는 모두 충분한 양의 방사능을 표적 부위에 전달하여 종양 증식을 억제하거나 암세포를 사멸하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 방사선치료제는 방사성 원자를 포함하고 생물학적 제제 또는 합성 제제와 복합체를 형성하여 표적 부위로의 전달을 증가시킨다. 따라서 방사선치료제는 항체와 같은 표적화 부분에 결합되어 암세포에 대한 방사선치료제의 국소화를 향상시킬 수 있다.

상기 3제 요법 조성물은 바람직하게는 RORy(레티노산 수용체 관련 고아 수용체 y)의 억제제를 포함하지 않으며, 수니티닙 등의 항-VEGF 제제 또는 게피티닙, 에를로티닙, 소라페닙, 수니티닙, 다사티닙, 라파티닙, 닐로티닙, 보르테조밉 또는 살리노마이신 등의 제제를 포함하지 않으며, VEFG/VEGFR 억제제를 포함하지 않으며, BCL2 억제제 또는 LSD1 억제제를 포함하지 않는다.

따라서, 본 발명은 또한 메틸트랜스퍼라제 EZH2와 관련된 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 기재된 바와 같은 치료학적으로 효과적인 2제 요법 또는 3제 요법을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 2제 요법 또는 3제 요법은 항암 표준 치료, 방사선 요법 또는 다른 1차 또는 2차 암 요법 후에 재발 또는 난치성 환자에게 투여되는, 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 특히 EZH2 및/또는 토포이소머라제 2-알파(TOP2A) 상향조절을 특징으로 하는 C2A 하위 그룹 간모세포종을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 치료학적 유효량의 EZH2 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 특히 EZH2 및/또는 TOP2A 상향 조절을 특징으로 하는 DIPG를 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 치료학적 유효량의 EZH2 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 조성물을 제공한다.

치료를 받는 대상자의 연령층은 각양각색이지만, 대부분은 1세부터 5세이다.

본 발명의 이러한 측면에 따르면, EZH2 억제제로는 GSK-126이 바람직한데, 이는 지금까지 간모세포종의 1차 선택 치료에서 표준약물로 사용되어 왔지만, 독성이 매우 높고 심각한 2차 병리증상을 일으키는 것으로 알려져 있는 시스플라틴에 비해 독성이 20배나 낮기 때문이다. 따라서 이 측면에 따르면, GSK-126은 증식성 및 침습성 간모세포종의 새로운 치료 옵션으로 사용되거나 재발 환자 또는 시스플라틴에 화학내성을 나타내는 환자를 위한 2차 치료법으로 사용되었다.

실제로, 출원인은 실시예 3에서, EZH2의 상향조절은 특히 공격적인 간모세포종(HB)의 존재와 연관되어 있으며 새로운 바람직하지 않은 예후 인자를 구성하며, 이로써 재발이나 사망 위험이 높아지는 등 환자의 결과를 예측할 수 있음을 입증하였다. 이러한 상향조절은 예후가 가장 나쁘고, 종양의 병기가 더 진행하여 전체 생존율이 최악인, C2A 및 C2B로 명명된 HB 종양의 3개 하위 그룹 중의 하나인 C2A 하위 그룹으로 지정된 HB 종양의 한 하위 그룹에서 입증되었다. 전사 프로파일링은 HB를 C1, C2A 및 C2B라는 세 가지 하위 그룹으로 분리했으며, 이는 간결한 4개 유전자 시그니처로 식별할 수 있다: 하이드록시스테로이드 17-베타 탈수소효소 6, 인테그린 알파 6, 토포이소머라제 2-알파 및 비멘틴, 이때 토포이소머라제 2-알파(TOP2A)는 증식성 C2A 종양의 특징임(참조: Hooks KB et al., Hepatology, 2018 Jul;68(1):89-102. doi: 10.1002/hep.29672). 출원인은 고도 증식성 종양 C2A 아형은 토포이소머라제 2-알파 유전자 상향 조절을 특징으로 할 뿐만 아니라, TOP2A의 상향 조절과 긍정적이고 강한 상관관계가 있는 것으로 나타난 EZH2 상향 조절에 의해서도 나타남을 추가로 입증했다. EZH2 및/또는 TOP2A의 상향조절은 환자의 재발 또는 사망의 나쁜 결과와 함께 종양의 특히 공격적인 성격과 암성 세포의 높은 증식률을 나타내는 지표이다.

EZH2는 HB에서 상향조절되고, 그의 발현은 TOP2A 발현 세포를 비롯한 바람직하지 않은 분자 및 임상 바이오마커를 갖는 종양이나 재발 또는 사망한 환자에서 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 EZH2는 환자의 재발 또는 사망에 대한 HB 또는 DIPG의 독립적인 예후 인자로 사용될 수 있다. 대안적으로, EZH2와 TOP2A, 또는 EZH2와 DUSP9(이중 특이성 포스파타제 9), 또는 EZH2, TOP2A 및 DUPS9의 조합은 따라서 환자의 재발 또는 사망에 대한 HB 또는 DIPG의 예후 인자로 사용될 수 있다.

이 측면에 따르면, 따라서 본 발명은 HB 또는 DIPG를 앓고 있는 환자의 재발 가능성 및 심지어 사망 가능성이 더 높은 불량한 예후의 바이오마커로서의 EZH2의 사용, 및 HB 또는 DIPG 중에서 선택된 암을 앓고 있는 환자의 예후를 평가 및/또는 예측하는 방법으로서, 상기 대상체의 분리된 샘플에서 EZH2의 레벨을 시험관 내에서 결정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. EZH2의 레벨이 기준 대조 값보다 높거나 같은 경우, HB 또는 DIPG의 예후 불량이 결정된다. 전형적으로, 기준 대조 값은 HB 또는 DIPG를 앓고 있는 대상 집단의 EZH2 레벨의 중앙값으로부터 얻어지는 EZH2의 혈청 레벨이다. 예를 들어, EZH2의 레벨은 동일하거나 더 높다.

이 측면에 따르면, HB 또는 DIPG를 앓고 있는 대상체의 예후를 예측하는 방법은 (i) 상기 대상체로부터 분리된 샘플에서 단백질 레벨 또는 RNA 레벨에서 EZH2의 레벨 및 농도를 검출하고, (ii) 검출 결과를 대조 샘플의 상응하는 바이오마커의 결과 또는 기준 값의 결과와 비교하는 것을 포함하며, 대조군 또는 기준 값과 비교하여 상기 대상체에서 적어도 바이오마커 EZH2의 농도의 증가, 레벨의 증가는 대상체의 음성 진화를 나타낸다. 바이오마커 EZH2를 평가하는 것 외에도, 방법은 예를 들어 TOP2A 및/또는 DUSP9 바이오마커를 평가하는 것을 포함하여, 상기 환자의 음성 임상적 진행의 추가 바이오마커를 평가하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

동일한 측면에 있어서, 본 발명은 단백질 레벨 또는 RNA 레벨에서 적어도 EZH2의 레벨, 농도 및/또는 존재를 검출하는데 적합한 제제를 포함하는 시험관 내 키트를 제공한다. 이러한 키트는 단백질 레벨 또는 RNA 레벨에서 TOP2A 및/또는 DUSP9의 레벨, 농도 및/또는 존재를 평가할 수 있는 제제를 추가로 포함할 수 있다. 이들 제제는 당업계에 잘 알려져 있다. 일부는 단백질 검출 및 정량 분석, 예를 들어 웨스턴 블롯, ELISA, 방사면역분석, 면역확산 분석, 면역전기영동, 면역염색, 면역침전, 질량분석, 및 단백질 마이크로어레이 등을 실행하는데 사용된다. 다른 제제는 RNA 레벨에서 바이오마커 EZH2 단독 또는 TOP2A 및/또는 DUSP9와의 조합의 과발현을 검출하는데 적합하다.

본 발명은 또한 하나의 바이오마커 EZH2 단독 또는 TOP2A 및/또는 DUSP9와의 조합의 과잉발현을 검출하기 위해 환자의 사전 스크리닝 단계를 포함하며, 이로써 이들 환자에 대한 구체적인 치료 프로토콜과 구체적인 후속 조치를 계획할 수 있는 암 치료요법을 제공한다.

본 발명은 추가로 상기 기재된 바와 같은 2제 요법 또는 3제 요법의 조합 및 약제약적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 또한 선택적으로 하나 이상의 항암 약물을 포함할 수 있다. 본 조성물의 제형화 및 원하는 투여에 적합한 임의의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제 및/또는 희석제가 본 명세서에서 고려된다.

전형적으로, 이러한 약제학적으로 허용되는 부형제는 염 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 락토스, 글루타민산나트륨, PVP, HPpCD, CD, 글리세롤, 말토스, 만니톨 및 사카로스 등의 약제학적 동결 방지제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 국소, 비경구, 폐, 비강, 직장 또는 경구 투여에 적합한 제제를 포함한다. 임의의 주어진 경우에 가장 적합한 투여 경로는 부분적으로는 암 상태의 성질 및 중증도, 그리고 선택적으로 암의 단계에 따라 달라질 것이다. 바람직한 약제학적 조성물은 비경구 투여용으로 제제화되며, 가장 바람직하게는 정맥내 투여용으로 제제화 된다. 즉시 방출형 및 지속 방출형 투여 제형 모두 본 발명의 범위 내에 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약학 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체에는, 인산 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼(예: 오일/물 또는 물/오일 에멀젼), 다양한 종류의 습윤제 및/또는 보조제를 포함하여, 표준 약제학적 담체, 완충제 및 부형제 중 임의의 것이 포함된다. 적합한 약제학적 담체 및 그의 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co., Easton, l9th ed. 1995)에 기술되어 있다. 바람직한 약제학적 담체는 활성제제(들)의 의도된 투여 방식에 따라 달라진다.

따라서 약제학적 조성물은 바람직하게는 주사, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제제화된다. 주사용 제제는 단위 투여 제형, 예를 들어 방부제가 첨가된 앰플 또는 다회 투여 용기로 제공될 수 있다. 주사 가능 조성물은 바람직하게는 등장성 수용액 또는 현탁액이다. 제제는 멸균될 수 있고 및/또는 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제 등의 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명에 따르면, EZH2 억제제는 유리하게는 스타틴 및 임의로 항암제와 공동 투여되어 암 및 종양의 치료 및/또는 예방에 대한 상승 효과를 제공한다. EZH2 억제제, 스타틴 및 항암제는 동시에(공동 투여) 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

3제요법의 경우, EZH2 억제제 및 스타틴은 항암제와 병용하여 동일하거나 상이한 투여 경로, 경구 또는 비경구(예: 정맥내)를 통해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, EZH2 억제제 및 스타틴은 비경구(예: 정맥내)로 투여되며, 항암제는 경구 투여할 수도 있고 그 반대로 투여할 수도 있다.

따라서 환자는 치료학적 유효량의 GSK-126 화합물과 하나의 스타틴을 투여 받을 수 있다. 이러한 투여에는 유효량을 특정 기간 동안, 예를 들어, 약 1~24시간 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31일 이상 또는 지정된 순서로 제공하며, 예를 들어, GSK-126과 스타틴을 투여한 후에 하나 이상의 항암제를 투여하거나 그 반대의 경우가 포함될 수 있다. 치료 프로토콜은 2개 이상의 구조적으로 다른 화합물의 순차적 또는 동시 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 구조적으로 다른 2개 이상의 약제학적 활성 화합물은 2개 이상의 구조적으로 다른 활성 약학적 활성 화합물을 함유하는 경구 투여에 적합한 약제학적 조성물을 투여함으로써 동시 투여될 수 있다. 또 다른 예로서, 두 개 이상의 구조적으로 다른 화합물은 하나의 화합물을 투여한 후 다른 화합물을 투여함으로써 동시 투여될 수 있다. 경우에 따라, 동시 투여되는 화합물이 동일한 경로로 투여된다. 다른 예로서, 동시 투여되는 화합물은 다른 경로를 통해 투여된다. 예를 들어, 한 가지 화합물은 경구로 투여할 수 있으며, 다른 화합물은 예를 들어 정맥내 또는 복강내 주사를 통해 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.

따라서, 약제학적 조성물은 EZH2 억제제 및 하나의 스타틴(예를 들어, 아토르바스타틴, 심바스타틴, 플루바스타틴, 로수바스타틴, 메바스타틴, 세리바스타틴, 프라바스타틴, 및/또는 피타바스타틴), 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제 또는 희석제를 혼합함으로써 제조된 개별 투여 단위 및 선택적으로 하나 이상의 항암제를 포함하는 단일 약제 또는 개별 약제(separate medicament)로서 제조될 수 있다.

약제학적 조성물 또는 약제는 EZH2 억제에 반응하는 암을 예방, 치료, 감수성화 또는 제어하기 위해 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 약제학적 조성물 또는 약제는 대상체에서 유효한 치료 반응을 유발하기에 충분한 양으로 대상체에게 투여되었다. 유효한 치료 반응에는 암의 증상이나 합병증을 적어도 부분적으로 정지 또는 지연하는 반응이 포함되었다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료학적 유효량(therapeutically effective dose)"으로 정의되었다.

투여되는 활성 약제의 투여량은 대상체의 체중, 연령, 대상체의 상태, 치료할 부위의 표면적 또는 부피 및 투여 형태에 따라 달라진다. 투여량의 크기는 또한 특정 대상체에게 특정 제형의 투여에 수반되는 부작용의 존재, 성격 및 정도에 따라 결정될 것이다. 전형적으로, 본 발명의 활성 화합물(들)의 투여량은 원하는 효과를 달성하기에 충분한 투여량이다. 최적의 투여 일정은 대상체의 체내 활성 물질 축적을 측정하여 계산할 수 있다. 일반적으로 투여량은 매일, 매주, 매월 중 1회 이상 투여할 수 있다. 당업자는 최적의 투여량, 투여 방법 및 반복률을 쉽게 결정할 수 있다. 본 발명의 조성물의 최적 투여량, 독성 및 치료 효능은 투여되는 조성물의 상대적 효능에 따라 달라질 수 있으며, 또한 예를 들어, LD50(집단의 50%에 대한 치사량) 및 ED50(집단의 50%에 치료학적으로 유효한 용량)을 결정함으로써 세포 배양 또는 실험 동물의 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며 LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 제제가 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 약물을 사용할 수도 있지만, 정상 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하고 그에 따라 부작용을 줄이기 위해 영향을 받은 조직 부위에 이러한 제제를 표적화 하는 전달 시스템을 설계하는데 주의를 기울일 필요가 있다.

일반적으로, 조성물의 효능량 또는 유효량은 먼저 저용량 또는 소량의 조성물을 투여한 다음, 독성 부작용이 최소화되거나 전혀 없이 치료 대상체에서 원하는 효과가 관찰될 때까지 필요에 따라 제2 또는 제3의 약물을 추가하여 투여 용량을 점진적으로 증가시킴으로써 결정된다.

조성물의 단회 또는 복수회 투여는 환자가 필요로 하고 허용하는 투여량 및 빈도에 따라 투여된다. 여하튼, 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기 위해 효율적인 양의 본 발명의 조성물을 제공해야 한다. 일반적으로, 용량은 환자에게 허용할 수 없는 독성을 일으키지 않으면서 질병의 증상 또는 징후를 치료하거나 개선하는데 충분한 량이다.

본 출원 전체를 통하여, 다양한 참고문헌이 언급되고, 이들 간행물의 전체 내용은 본 발명이 속하는 기술 상태를 보다 완전하게 설명하기 위해 본 출원에 참고로 포함된다.

실시예

실시예 1: 미만성 정중선 신경교종(DMG)을 치료 및/또는 예방하기 위한 2제 요법 효율

실시예 1.1: 방법

마이크로어레이 분석

GSE50021 발현 프로파일(DMG 샘플 35개, 정상 뇌 샘플 10개)은 Gene Expression Omnibus 데이터베이스로부터 추출하였다. 원시 판독은 분위수로 정규화되며,log2 변환되었다. EZH2에 대한 ILMN_1652913 프로브로 식별된 발현 값을 추출하고 GraphPad Prism을 이용하여 분석했다.

DMG 세포주 및 초대 BXdmg1 세포

본 연구에 사용된 DMG 세포주는 NEM157i, NEM157i-VEGF, NEM163i, SU-DIPG-IVi, SU-DIPG-IVi-Luc 및 초대 세포 BXdmg1이었다. 기원 및 렌티바이러스 변형 절차(비사멸화 포함) 및 배양 조건이 본 명세서에서 이하에 설명되어 있다.

화학적 억제제

EZH2 억제제 GSK-126, 아토르바스타틴, ACSS2 억제제 및 테르비나핀이 사용되었다(Selleckchemicals, Houston, USA).

웨스턴 블롯

블롯은 표준 기술을 사용하여 수행되었다(아래 참조).

히스톤 추출

히스톤 추출은 제조업체의 지침에 따라 수행되었다 (히스톤 추출 키트 - ab113476, Abcam, Paris, France).

증식 분석

세포 증식은 제조업체의 지침에 따라 시험관 내 독성학 분석 키트(Sulforhodamine B, Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France)를 사용하여 측정되었다. 세포를 96웰 플레이트에 웰당 2000개 세포의 밀도로 3중으로 플레이팅했다. CLARIOstar 멀티플레이트 판독기(BMG Labtech, Champigny-sur-Marne, France)를 사용하여 표시된 시점에서 565 nm에서 흡광도를 측정했다.

아폽토시스 분석

표시된 농도와 시간에 따라 약물에 노출된 후, 세포를 Annexin V-PE (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) 및 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD) (BD Bioscience)로 표지했다. [4]에 기재된 바와 같이 유세포 분석기를 사용하여 분석했다.

이동 분석

2x10⁴개 세포/웰을 96웰에 넣고 24시간 동안 배양했다. IncuCyte Wound Maker(96핀 창상 제작 도구)를 사용하여 스크래치를 만들었다.

스페로이드 배양

스페로이드 배양을 위한 표준 배양 방법은 DMG 세포주와 간모세포종 세포주 모두에 사용되었다.

DMG 생체 내 모델

동물 실험은 유럽(지침 2010/63/UE) 및 프랑스(법령 2013-118) 지침에 따라 수행되었다. 마우스 실험은 지역 윤리 위원회의 승인을 받았으며 프랑스 고등 교육, 연구 및 혁신부 장관의 검증을 받았다 (APAFIS #13466-2019032112211281, 승인 번호 B33063916). DMG NEM157i/NEM157i-VEGF CAM 모델은 Capdevielle V et al. Neuro Oncol 2019; 10.1093/neuonc/noz215)에서 설명되어 있다.

마우스 정위 모델(NOD/LtSz-scid IL2R 감마 마우스의 SU-DIPG-IVi-Luc)은 Mohammed 등 (Nat Med 2017;23(4):483-492)의 연구를 기반으로 개발되었다.

화학적 억제제

GSK-126은 IC50이 9.9nM인 고도로 선택적인 EZH2 메틸트랜스퍼라제 억제제이다 (20종류의 다른 인간 메틸트랜스퍼라제에 비해 EZH2에 대해 >1000배 선택적). GSK-126(SelleckChem)을 DMSO(디메틸 설폭사이드)에 용해시키고 -20°C에서 보관했다. 콜레스테롤 합성 경로의 3개의 억제제가 사용되었다: HMG-CoA 환원효소 억제제인 아토르바스타틴, 아세테이트 의존성 아세틸-CoA 합성효소 2(ACSS2)를 표적으로 하는 ACSS2 억제제 및 테르비나핀(스쿠알렌 에폭시다제 억제제). 모든 억제제는 Selleckchemicals(Houston, USA)에서 구입했다. 모든 억제제를 DMSO에 분취하고 -20°C에서 보관했다.

초대 세포 분리, 배양 및 특성화

모든 세포주는 마이코플라스마의 존재 여부를 정기적으로 테스트했으며 2021년 4월 인증을 위해 STR 프로파일링에 성공하였다 (LGC, Molsheim, France). 보르도 대학병원에서 치료를 받기 위해 등록한 환자(또는 보호자)는 프랑스 국가 지침에 따라 생물학적 프로브가 익명 방식으로 연구 목적으로 사용될 수 있다는 서면 동의를 받았다.

DMG 생검을 실험실에서 접수하였으며 MACSBrain Tumor Dissociation Kit(Miltenyi Biotech, Paris, France) 및 표준 GentleMACs 뇌 조직 분리 프로그램을 사용하여 24시간 이내에 GentleMACs 세포 분리기(Miltenyi Biotech, Paris, France)를 사용하여 분리하였다. 얻어진 세포를 Amniomax C100SUP + Amniomax C100 기본 배지(Gibco, ThermoFisher, Illkirch Cedex, France)에서 배양했다. 생검의 분자 및 세포 분석은 도 7에 자세히 설명되어 있다 (참조: Rahal, F., C. Capdevielle, B. Rousseau, J. Izotte, J. W. Dupuy, D. Cappellen, G. Chotard, M. Menard, J. Charpentier, V. Jecko, C. Caumont, E. Gimbert, C. F. Grosset and M. Hagedorn (2022). “"EZH2 차단제는 오프 타켓 효과를 통해 히스톤 돌연변이 확산 정중선 신경교종을 콜레스테롤 대사 억제제에 감수성이 있음." Neurooncol Adv 4(1): vdac018). 생검 유래 세포(BXdmg1)의 특성화에는 면역조직화학이 사용되었다. 세포를 채취하여 단편화 및 염색 전에 CytoBlocks에 포함시켰다(도 7A). 자동 염색은 구연산염 완충액중에서 열 항원 검색, Flex 증폭 처리 및 이하의 항체와 함께 인큐베이션한 후에 Omnis Dako® 염색기에서 수행했다: Ki-67 (Dako, 클론 MIB1, 1/100), H3-K27M (Diagomics, 클론 RM192, 1/5000) 및 H3-K27me3 (ABcam, 클론 8290, 1/100). 디아미노벤지딘(Dako)을 사용하여 밝혀졌다. 세포는 정기적으로 계대배양되었으며 균질한 형태학적 표현형을 나타내고, 이를 BXdmg1이라고 명명하였다.

웨스턴 블롯

RIPA 완충액(Sigma Aldrich)과 단백질분해효소 억제제(Sigma Aldrich)를 사용하여 세포를 긁어내어 세포 용해물을 준비하고, 4°C에서 15분 동안 13000g에서 원심분리했다. 단백질 농도는 Pierce^TM BCATM Protein Assays(ThermoFisher)를 사용하여 측정하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 4-15% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔(Bio-Rad)에 동량의 세포 추출물을 로딩했다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막(Transblot® Turbo midi-size, Bio Rad)에 블로팅하고, Odyssey 차단 완충액(LI-COR Biosciences, ScienceTec, Les Ulis, France) 또는 0.1% 트윈 20(TBST)이 포함된 트리스 완충 식염수에 희석된 BSA로 차단하고, 1차 항체로 밤새 4°C에서 프로빙했다. 사용된 1차 항체는 다음과 같다: 토끼 폴리크로날 항-EZH2 (1:1000 희석, #5246S, Ozyme/Cells 신호 전달, Saint Cyr l'Ecole, 프랑스), 토끼 항-GAPDH(1:15000, BLE649203, Ozyme/ Cells 신호 전달), 토끼 모노클로날 H3K27me3(1:1000, 9733S, Ozyme/Cells 신호 전달), 마우스 모노클로날 히스톤 H3 (1:500, sc-517576, Santa-Cruz, Heidelberg, Germany), 마우스 모노클로날 액틴(C-2)(1:500, sc-8432, Santa-Cruz), 마우스 모노클로날 항-HMGCR(1:1000, CL0259, Atlas 항체, Bromma, 스웨덴), 토끼 폴리클로날 항-SQLE(1:1000, 12544-1-AP, Proteintech, Manchester, UK), 이들은 차단 완충액 또는 5% BSA로 희석하였다. TBST로 세척한 후 막을 상응하는 염소 항 마우스 IgG(H+L)-HRP 접합체(1:3000, 170-6516, Biorad, Marnes-la-Coquette, France) 또는 항-토끼 IgG-HRP(1:3000, 170-6516, Biorad)와 함께 배양했다( 1:3000, A0545, Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, 프랑스). TBST(10분간 2회)로 세척한 후 Fusion FX(Vilber Lourmat)로 막을 노출시켰다. 정량화는 ImageJ(미국 메릴랜드주 베데스다 소재 국립 보건원)를 사용하여 수행하였다.

siRNA 형질감염

iRNA를 1x siMAX 희석 완충액(30mM HEPES, 100mM KCl, 1mM MgCl₂, pH=7.3(Eurofins, Ebersberg, Germany))에 희석했다. 세포를 각각의 EZH2 siRNA 또는 대조 siRNA(AllStars Negative Control siRNA, Qiagen, Courtaboeuf, France)로 독립적으로 형질감염시켰다. 간단히 설명하면, 10nM의 siRNA를 역방향 및 정방향 형질감염에 관한 제조업체의 지침에 따라 RNAiMAX 형질감염 시약(Invitrogen)을 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 전에 리포펙타민 RNAiMAX(ThermoFischer)를 형질감염 배지(OptiMEM, Gibco, ThermoFisher, Illkirch Cedex, France)에서 1/100로 희석했다.

세포 이동 분석 및 스페로이드 배양

IncuCyte S3 생세포 분석 시스템 (Essen BioScience, Ltd, Royston Hertfordshire, United Kingdom)을 사용하여 이동을 모니터링했다. 수정되지 않은 원본 Incucyte 이미지는 통계 분석에 사용되었지만, 효과의 입증을 위해 Adobe Photoshop CS4 (San Jose, USA)를 사용하여 변환되었다. 셀의 가시성을 최적화하기 위해 이하의 기능: 그레이스케일 모드, 바이크롬 모드, 네거티브, 대비/광도, 노출/감마, 네거티브가 사용되었다.

스페로이드 형성 분석을 위해, 96웰 플레이트에서는 웰당 10⁴개의 세포가 사용되었다. 웰당 메틸셀룰로오스/배지/세포 및 억제제(10, 15 또는 20μM) 혼합물의 부피는 100μL였으며 메틸셀룰로오스의 최종 농도는 0.5%였다. 신속하고 온화한 균질화 후, 혼합물을 세포 접착을 제한하도록 처리된 둥근 바닥 세포 배양 마이크로플레이트(U자형) 위에 두었다. 그 후, 스페로이드를 37°C 및 5% CO₂의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양했다. 스페로이드의 사진과 필름은 InCellis 세포 이미저(Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, France)로 촬영하였다. 시험한 용량에서 용량 의존적 효과가 관찰되지 않았기 때문에 모든 용량을 통계 분석을 위해 통합했다.

RNA 정제 및 실시간 정량 PCR 분석

제조업체의 지침에 따라 TRI 시약(Sigma)을 사용하여 세포주로부터 총 RNA를 분리했다. 메신저 RNA(mRNA) 발현의 정량화를 위해, Maxima 역방향 Transcriptase (Thermo Scientific)를 사용하여 총 RNA를 역전사했다. RT-qPCR 증폭은 1X SYBR® Premix Ex Taq™(Takara Bio Europe)을 함유하는 12μL 다중 PCR 반응에서 수행되었다. 정방향 및 역방향 프라이머는 표 1에 기재되어 있다. GAPDH mRNA는 정규화를 위한 내부 대조군으로서 기능했다.

닭과 마우스 모델

병아리 CAM 분석 DMG 모델의 경우, 1x10⁶ NEM157i/NEM157i-VEGF(50:50) 세포를 표시된 농도의 억제제를 포함하는 마프리겔과 혼합하고, 40μl를 CAM에 직접 넣었다. 종양의 증식은 2~3일마다 실체현미경(DS-Fi2, Nikon/SMZ745T)을 사용하여 모니터링했다. 종양을 PFA 4%로 고정하고 사진 기록을 진행했다. 간모세포종 Huh6 및 HepG2 세포에도 유사한 접근법이 사용되었다.

마우스 모델에서, 사멸되지 않는 SU-DIPG-IV 계통이 사용되었다. SU-DIPG-IVi는 MOI가 10인 루시퍼라제 벡터(Luc)에 의해 형질도입되었다. 생후 2일째에, 2μl중의 SU-DIPG-IVi-Luc 세포 10⁵개를 2% 이소플루란과 50% 산소 농도의 마취 하에 2 μl NeuroSyringe(Hamilton Neuros, Dutscher, Bruxelles, Belgium)를 사용하여 목을 통해 뇌간에 3mm 깊이까지 직접 주입했다. 8일 후에 용매 대조(DMSO) 또는 GSK-126(6 또는 10mg/kg), 아토르바스타틴(10mg/kg) 또는 콤보(스타틴과 GSK-126의 병용)로 주 3회 치료를 시작했다. 각 치료의 1-2일후에 마취된 마우스를 사용하여 Biospace imager (Biospace Lab, Nesles la Vallee, France)에서 종양 성장을 비공격적으로 평가했다.

치료 전, 마우스에게 미세 문신을 새겼다(Aramis kit, BiosebLab, France). 동물은 체중을 측정한 후 IACUC 권장 사항에 따라 오른쪽 아래 사분면에 복강내 주사를 맞았다. 1ml 투베르쿨린 주사기와 26게이지 주사바늘을 사용하여 30g 마우스(3mg/ml)에 대해 주입량 200μl를 사용하였고, 매주 실제 체중으로 조정했다. 치료는 8일차부터 시작하여 일주일에 3회 수행했다. 종양 증식은 Biospace imager(Biospace Lab, Nesles la Vall

e, France)에서 비공격적으로 평가되었다. 전체 과정은 37℃의 가열 매트 위에서 수행되었다. 동물을 면도하고 이미징 전용의 상자에 멸균 상태(PSM-2 하)로 마취시켰다. 이미징화 전에 동물은 동물의 체중에 따라 PBS(50~100μl)에 희석된 D-Luc(Promega, E264X) 150mg/kg의 복강내 주사를 맞았다. 다음에 박스를 50% 산소와 2% 이소플루란이 유지되는 포토 이미저의 37℃ 가열 매트 위에 놓았다. 이미징은 일주일에 2회 수행했다. 단지 부동성을 원하고 동물의 각성이 거의 즉각적이었기 때문에 마취 시간은 약 15분이었다. 21일째에 동물은 경추 탈구로 사망했다.

통계적 방법

GraphPad Prism 5 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc. San Diego, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행했다. 2개 이상의 시료의 정량적 비교를 위해, 일원배치 분산분석 검정을 사용하고, 이어서 본페로니 사후 검정을 사용했다. 데이터 분포가 정상적이지 않은 경우, Kruskal-Wallis 검정은 선택된 관련 조건에 대한 Dunn의 사후 검정에 따라 사용되었다. 두 개의 작은 독립한 샘플을 비교하기 위해 unpaired t-검정을 사용했다. 반정량적 접근법을 사용한 표현형 평가로 분석된 실험의 경우, 피셔의 정확 검정이 사용되었다. 모든 실험(생체 내 실험 제외)은 독립적으로 최소 3회 수행되었다. n=독립적 실험. <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 도면내의 모든 데이터에 대해 *: p< 0.05, **: p< 0.01, ***: p < 0.001 또는 표시된 경우 정확한 p-값.

실시예 1.2: 결과

DMG 샘플 및 세포주에서의 EZH2 유전자 및 단백질 발현

EZH2의 전사물은 정상 뇌에 비해 DMG 샘플에서 상당히 과잉 발현되었다 (도 1A). 비슷한 결과는 전립선암, 폐암, 간세포암, 대장암, 유방암에서 췌장암에 이르는 다른 고형 악성 종양에서도 발견되었다. 평균 EZH2 과잉 발현은 두 그룹 사이의 높은 발현 가변성으로 인해 대조군에 비해 크게 상승하지 않았지만, 중앙값 EZH2 발현을 중심으로 재편성된 핵심 샘플 세트와 차이는 여전히 중요했다(도 1A, 왼쪽 플롯, 박스형 프레임). 본 연구에 사용된 세포주는 모두 웨스턴 블롯에 의해 밝혀진 바와 같이 EZH2 단백질의 발현을 나타냈다(도 1B).

DMG 세포는 GSK-126 억제제에 감수성이 있다

GSK-126의 현저한 증식 억제는 6μM 이상의 용량에서 관찰되었으며 25μM를 초과하는 고용량에서는 합계하였다(도 1C). 세포 증식이 강하게 감소했을 때 유사한 용량에서 종양 세포 아폽토시스의 증가를 동반했다(도 1D). 또한 GSK-126은 DMG 세포에서 H3K27me3 트리메틸화를 효율적으로 억제했다(도 1E). 마지막으로, GSK-126의 절반 최대 억제 농도(IC50)는 3개의 DMG 세포주에서 측정되었으며 7.6~10.3μM의 범위로 하였다(도 2).

GSK-126 처리 DIPG 세포에서 지질 및 콜레스테롤 합성에 관여하는 유전자 발현 증가

GSK-126에 의한 DIPG 세포의 처리는 HMGCS, HMGCR, LDLR, NPC1 및 SQLE 유전자와 HMGCR 및 SQLE 단백질의 발현을 유도했다(도 3 및 4). 이들 결과는 우리의 단백질 데이터를 확인하며 (참조: Rahal, F., C. Capdevielle, B. Rousseau, J. Izotte, J. W. Dupuy, D. Cappellen, G. Chotard, M. Menard, J. Charpentier, V. Jecko, C. Caumont, E. Gimbert, C. F. Grosset and M. Hagedorn (2022). "EZH2 차단제는 표적 외 효과를 통해 히스톤 돌연변이 확산 정중선 신경교종을 콜레스테롤 대사 억제제에 대해 감수성이 있다". Neurooncol Adv 4(1): vdac018), 또한 GSK-126이 DIPG 세포에서 지질 및 콜레스테롤 합성 경로를 활성화한다는 것을 입증했다.

ACSS2 억제제인 아트로바스타틴 및 테르비나핀이 단독으로 또는 GSK-126과 조합시켜 DMG 세포에 미치는 영향

이들 변화를 해석하기 위해서, 우리는 콜레스테롤의 생합성에 관여하는 몇 가지 주요 효소[스쿠알렌 에폭시다제, 하이드록시메틸글루타릴-조효소 A(HMG-CoA) 환원효소, AcetylCoA 아세테이트 의존성 아세틸CoA 합성효소 2]가 GSK-126 처리된 DMG 세포에 중요하게 되었다고 가정했다. 이들 효소는 지질 대사와 관련된 질병에 관여하는 것으로 오랫동안 알려져 있다. 시험한 각 콜레스테롤 생합성 억제제에 대해 두 가지 다른 종양 세포주 단독에서는 효과가 관찰되지 않았다(도 5). 그러나 DMG 세포 성장에 영향을 주지 않는 저용량의 GSK-126(4μM)을 동시 처리한 경우(도 1C, 도 7D), 1~5μM 범위의 용량에서 3가지 억제제 모두에서 상당한 성장 억제가 발생했다(도 6, A-C).

새로 분리된 DMG 세포에 대한 DMG 세포주 데이터의 검증

사멸되지 않는 세포주, 또는 특정 시간 동안 배양된 세포주는 원래 세포와 다르게 거동할 수 있다. 따라서 우리는 기능 분석을 위해 DMG 생검에서 세포를 분리했다. 명시야 현미경에서는 균질한 방추형 세포 집단을 나타낸다(도 7A 및 삽입도). BXdmg1 세포의 H&E 염색은 유사분열 활성이 매우 높은 불규칙한 이핵성 세포 핵을 갖는 비정형 호산구성 세포를 나타냈고, 거의 모든 종양 세포는 Ki-67 항원을 발현한다(도 7A). 종양 세포는 또한 H3K27M 돌연변이에 대해서는 강하게 양성이고 H3K27me3 트리메틸화에 대해서는 음성이었다(도 7A). BXdmg1 세포의 기원이 되는 생검의 세포, 분자 및 유전적 특징 분석으로, 특히 c83A>T; 히스톤 H3F3A에서의 pK28M 돌연변이가 BXdmg1 세포에서 보존되는 드라이버 발암성 사건을 유발함을 확인했다. GSK-126 처리는 히스톤 정제 단백질 추출물의 웨스턴 블롯에서 밝혀진 바와 같이 용량 의존적 방식으로 H3K27me3 트리메틸화를 감소시켰다(도 7A, 오른쪽 아래 패널). BXdmg1 세포는 다른 DMG주에 필적하는 약 10μM(도 7C)의 IC50으로 GSK-126(도 7B)에 의한 증식 억제에 감수성이 있다. BXdmg1 세포의 증식은 최대 10μM의 세 가지 콜레스테롤 생합성 억제제에 의해 영향을 받지 않는다(도 7D). GSK-126과 아토르바스타틴을 조합시키면 각 억제제에 대해 3μM과 5μM의 저용량에서 상당한 증식 억제를 나타냈으며, 예상대로 GSK-126 단독의 세포 독성이 이미 확립되어 있기 때문에 이 표화는 더 높은 용량에서 은폐되었다(도 7E).

아토르바스타틴, GSK-126 및 조합이 세포 이동에 미치는 영향

우리는 또한 Live-Cell IncuCyte® S3 분석 시스템(Sartorius)을 구비한 자동 세포 스크래쳐를 사용하여 DMG 세포 이동에 대한 약물의 영향을 조사했다. 세포 이동은 합류 및 창상 개시 후 24시간부터 48시간까지 측정되었다. 초기 노출된 영역은 매우 깨끗하며 모든 조건에서 도시하기 위해 동일한 크기의 프레임으로 표시된다(도 8A-C). 24시간 후 DMG 세포 NEM157i, NEM163i 및 기본 BXdmg1 세포를 이동시켜 덮여진 노출 영역의 백분율은 Incucyte 소프트웨어에 의해 보고되었으며, 오른쪽 그래프의 조건에 따라 표시된다(도 8A-C). 시험한 모든 세포에 대하여 단일 처리 또는 용매 대조와 비교하여 콤보 치료에서는 이동 활성의 유의적인 억제(약 2배)가 관찰되었다(p<0.001). NEM163i 및 BXdmg1 세포에서도 DMSO에 비해 아토르바스타틴에 의해 이동이 느려졌지만 (p<0.05 및 p<0.001), 콤보 치료에 노출된 세포는 아토르바스타틴 단독에 비해 여전히 이동 세포에 의해 덮이는 면적이 더 적었다(p<0.001).

아토르바스타틴/GSK-126 조합에 의한 종양 세포 스페로이드 형성의 억제

우리의 세포에서 세포 이동과 접착 현상을 더욱 자세히 조사하기 위한 시도로, 우리는 DMG 세포의 스페로이드 형성을 허용하는 프로토콜을 사용하고 IncuCyte S3 분석 시스템을 사용하여 세포 이동 및 응집을 분석했다. 종양 스페로이드는 생체 내 증식 조건에 더 가까운 3D 복잡성을 추가하는, 기존 2D 모델보다 더 현실적인 배양 시스템으로 간주된다. 우리의 초대 BXdmg1 세포를 포함하여 3가지 다른 DMG 세포주를 사용하여, 우리는 모든 세포주로 종양 신경구를 안정적으로 생성할 수 있었다(도 9A, 9B, 9D). 크기가 약간 다르고 때로는 경계 형상이 다르기는 하지만 (확실한 경계가 있는 것과 불규칙한 것), 둥근 모양의 구체가 24시간 이내에 빠르게 형성된다. 그러나 콤보 치료에 노출된 세포는 단일 GSK-126 치료에 비해 스페로이드를 거의 형성하지 않았다(p<0.001, 모든 세포에 대해, 도 9C 및 9E). 일부 GSK-126 처리 배양물에서는, 스페로이드 형성은 특히 초대 세포에서 영향을 받았다(도 9D, 9E).

NOD/LtSz-scid IL2Rgamma(NSG) 마우스에서의 동소성 SU-DIPG-IVi-Luc 이식 종양 세포에 대한 GSK-126의 효과.

우리는 신생아 면역 저하 마우스에서의 동소성 뇌간 신경교종 모델을 개발했다. SU-DIPG-IVi-Luc 세포는 렌티바이러스 형질감염 절차를 사용하여 생성되었다. 첫 번째 실험에서 우리는 이 모델에서 GSK-126 치료의 효능을 테스트하고, 용매 대조군(n=18, 도 10A)과 비교하여 처리된 마우스(n=23)에서 생물발광(p=0.009)으로 입증된 10mg/kg의 복강내 투여량에서 상당한 성장 감소를 발견했다. 아토르바스타틴/GSK-126 콤보 치료 실험을 위해, 우리는 증식 억제를 피하기 위해 GSK-126의 용량을 6mg/kg으로 줄였다. 4회 치료 후, 아토르바스타틴(n=13), GSK-126(n=17)(p<0.05) 및 DMSO 대조군 (p<0.01, n=13, 도 10B)에 비해 콤보에 의한 유의하게 큰 종양 증식 억제가 발생하였다(n=13). 대조군이나 단일 치료 간에는 유의미한 차이가 발견되지 않았다. 본 연구에 사용된 동물의 모든 생물발광 이미지를 나타낸다(도 10A, B). 아토르바스타틴/GSK-126 콤보 치료는 또한 우리가 최근 개발한 병아리 CAM DMG 모델에서 더 우수한 항종양 효과를 나타낸다. 이 단기 모델에서는, 이전에 확립된 성인 신경교종 CAM 모델을 기반으로, 약물을 종양에 직접 적용하고 생체현미경으로 증식을 모니터링할 수 있다. 약물 작용의 표현형 특성화는 종양 혈관화 정도를 높음 또는 낮음/중간으로 분류하여 수행할 수 있다(도 10C, 오른쪽 패널). 혈관 신생 정도는 종양 세포 공격성의 간접적 지표인 숙주 조직과 상호작용하는 종양 세포의 능력으로 해석되어야 한다. 콤보 치료된 실험 종양은 아토르바스타틴(p=0.036), GSK-126(p=0.0248) 및 DMSO 대조군(p=0.03, 도 10C, 왼쪽 그래프)과 비교하여 혈관신생 감소를 나타냈다.

실시예 2: 간모세포종의 치료 및/또는 예방을 위한 3제 요법의 효율

EZH2는 증식성 간모세포종에서의 중심 종양유전자이다

고전적인 2D 배양과 3D 스페로이드 모델을 이용하여, 우리는 RNA 간섭에 의한 EZH2의 고갈이 노화를 활성화함으로써 시험관 내에서 HB 유래 세포주 Huh6 및 HepG2의 증식을 차단한다는 것을 발견했다 (하기 실시예 4 및 도 21 참조). 생체 내에서 EZH2의 고갈은 융모요막 분석을 사용하여 간모세포종의 발증을 완전히 방해했으며(CAM, Indersie et al, Oncotarget, 2017, PMID: 29662633), 종양 혈관신생을 낮춤으로써 종양 세포의 공격성을 감소시켰다(도 11). 따라서 EZH2는 간모세포종의 치료에 적합한 치료 표적이다.

다음에 우리는 두 가지 EZH2 억제제인 GSK-126과 타제메토스타트(EPZ-6438이라고도 알려짐 - https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/66558664 참조)가 간모세포종 세포의 성장에 미치는 영향을 측정했다. 타제메토스타트가 20μM 이상의 농도에서 효과적이었지만(도 12), GSK-126의 IC₅₀(최대 유효 농도의 절반)은 약 6~8μM으로, 이는 시스플라틴보다 두 배 낮은 농도이다(도 12).

따라서 우리는 고전적인 2D 배양 조건과 3D 종양 스페로이드를 사용하여 간모세포종 세포를 제거하기 위해 시스플라틴과 GSK-126(도 12A의 각 세포주에서의 각 약물에 대해 측정된 IC₅₀ 참조)을 결합한 효과를 시험했다. 도 13에 도시된 바와 같이, GSK-126 및 시스플라틴은 두 배양 모델 모두에서 간모세포종 세포를 제거하는 추가 효과를 나타냈다.

이어서, 우리는 EZH2가 간모세포종 세포의 시스플라틴 내성에 관여한다는 가설을 검증했는데, 이는 시스플라틴으로 치료받은 재발 환자에서 흔히 관찰되는 상황이다. 도 14A에 도시된 바와 같이, 시스플라틴에 대한 Huh6 및 HepG2 세포의 감수성은 EZH2 단백질의 비존재하에 35~48% 증가했는데, 이는 EZH2가 시스플라틴 내성에 관여함을 입증한다. 시스플라틴은 또한 EZH2를 발현하지 않는 경우 3D 스페로이드로 배양된 간모세포종 세포를 제거하는데 더욱 강력했다(도 14B).

EZH2 억제제 GSK-126은 간모세포종 세포를 효율적으로 제거하고 DMG 세포에서의 콜레스테롤 대사를 조절 해제하므로(실시예 1.2 참조), 우리는 시험관 내에서 이러한 종양 간 세포를 제거하기 위해 스타틴이 GSK-126 및/또는 시스플라틴과 시너지 효과를 발휘하는지 여부를 테스트했다. 도 15A에 도시된 바와 같이, 심바스타틴 또는 아토르바스타틴 단독은 각각 20μM 및 50μM 이상의 농도에서 Huh6 및 HepG2 세포에 항종양 효과를 나타냈다. 예상한 대로, GSK-126에 대한 Huh6 및 HepG2 세포의 감수성은 심바스타틴 또는 아토르바스타틴의 존재 하에서 유의미하게(적어도 2배) 증가했으며(도 15B), 이는 스타틴이 GSK-126과 상승작용하여 간모세포종 세포를 제거하지만, 시스플라틴으로는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 다음에, GSK-126, 시스플라틴, 스타틴을 조합한 3제 요법을 테스트했다. 도 16A-B에 도시된 바와 같이, GSK-126 + 시스플라틴(각각 3μM)의 조합에 대한 Huh6 및 HepG2 세포의 감수성은 심바스타틴 또는 아토르바스타틴의 존재하에 크게 증가했다. 3제 요법 GSK-126+시스플라틴+스타틴은 간모세포종 세포를 사멸시키는데 GSK-126+스타틴 조합보다 훨씬 더 효율적이었다(도 16A-B). 다시 말하지만, 심바스타틴은 GSK-126 단독 또는 시스플라틴과 조합하여 항종양 효과를 강화하는데 있어 아토르바스타틴보다 약간 더 효율적이었다.

최종적으로, 우리는 GSK-126과 스타틴의 상승 효과가 다른 EZH2 메틸트랜스퍼라제 억제제로 확장될 수 있다는 가설을 테스트했다. 놀랍게도, 도 17의 데이터는 심바스타틴 또는 아토르바스타틴이 EZH2 억제제 타제메토스타트(E7438/EPZ6438)에 대한 간모세포종 세포의 감수성을 유의하게 강화한다는 것을 나타내며, 이는 스타틴이 모든 EZH2 억제제와 상승 효과를 발휘할 가능성이 있다는 우리의 발견을 뒷받침한다.

종합하면, DMG 및 간모세포종 세포에 대한 이러한 시험관 내 및 생체 내 데이터는 EZH2 억제제(GSK-126, 타제메토스타트…)에 의한 EZH2 효소 활성의 억제가 종양 세포가 생존하고 EZH2 억제제에 의해 매개되는 해로운 효과에 저항하도록 돕는 적응 대사 과정인 콜레스테롤 생합성을 활성화한다는 것을 명확하게 나타냈다. 스타틴과 EZH2 억제제를 조합함으로써 종양 세포는 EZH2 불활성화에 의해 매개되는 콜레스테롤을 합성할 수 없으며, 아폽토시스 과정을 통해 사멸하도록 프로그램된다.

실시예 3 : EZH2 상향조절은 증식성 간모세포종 및 예후 불량 지표와 관련되어 있다

실시예 3.1: 재료 및 방법

세포 배양

인간 HB 세포주 Huh6 및 HepG2를 각각 DMEM 1g/L 및 DMEM 4.5g/L에서 단층으로 배양했다 (둘베코의 변형 이글 배지, Gibco). 배양 배지에는 10% 소 태아 혈청(FBS, Sigma) 및 페니실린/스트렙토마이신(1,000 단위/mL)(Gibco)이 보충되었다. 사용된 모든 세포는 STR(Short Tandem Repeat) 프로파일링을 사용하여 정기적으로 인증되었으며 한 달에 2회 마이코플라스마 감염에 대하여 테스트했다.

3D 배양을 위해 낮은 부착성 96웰 플레이트에서 웰당 10,000개의 세포로 스페로이드를 형성했다. 각 웰에서 세포를 100μl의 배지 및 100μl의 메틸셀룰로오스와 최종 농도 0.5%로 혼합했다. 스페로이드를 갖는 플레이트를 배양하고 IncuCyte® S3 생세포 분석 시스템(Essen BioScience)을 사용하여 정기적으로 스캔했다.

siRNA 형질감염

EZH2 mRNA를 표적으로 하는 두 개의 상이한 siRNA [서열번호 11에 기재된 siEZH2-1: GAG GGA AAG UGU AUG AUA A(TT); 서열번호 12에 기재된 siEZH2-2: UUU GGC UUC AUC UUU AUU G(TT)] 또는 대조 RNA(AllStars Negative Control siRNA, Qiagen)로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염은 웰당 250,000개 세포가 있는 6웰 마이크로플레이트에서 수행되었다. siRNA를 1x siMAX 희석 완충액(6mM HEPES, 20mM KCl, 0.2mM MgCl₂, pH=7.3; Eurofins, Ebersberg, Germany)으로 희석했다. siRNA를 형질감염 배지(OptiMEM, Gibco)에서 1/100으로 희석된 리포펙타민(RNAiMax Invitrogen)과 접촉시켰다. 각 siRNA에는 20nM의 최종 농도를 사용하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하여 리포솜이 형성되도록 한 다음, 항생물질을 함유하지 않는 배지에서 6시간 동안 배양한 세포에 첨가하였다. 형질감염 후, 배지를 항생제가 함유된 새로운 배지로 교체하였다.

돌연변이 유발 및 플라스미드 구축

클로닝을 수행하기 위해 렌티바이러스 플라스미드 pSIN-EF1alphaL-eGFP-IRES-Puro를 사용했다. 야생형 EZH2 및 돌연변이형 EZH2 (EZH2*)에 해당하는 두 개의 삽입물을 클로닝하였다. 간단히 말하면, 야생형 EZH2 오픈 판독 프레임은 SinoBiological로부터 주문한 cDNA를 매트릭스 및 이하의 프라이머: 순방향: 서열번호 13에 제시된 5'-GCG CGC TAG CAC CAT GGG CCA GAC TGG GAA-3'; 역방향: 서열번호 14에 기재된 5'- GCG CAC GCG TTC AAG GGA TTT CCA TTT CTC-3'로 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다: EZH2*로 지칭되는 H689A 돌연변이는 이하의 프라이머: 정방향: 서열 번호 15에 제시된 5'- GTTTGGATTTACCGAAGCATTTGCAAAACGAATTTTGTTACCCTTGCG-3' 및 역방향: 서열번호 16에 기재된 5'- CGCAAGGGTAACAAAATTCGTTTTGCAAATGCTTCGGTAAATCCAAAC-3'을 사용하여 Jung Kim et al. (Polycomb-and Methylation-Independent Roles of EZH2 as a Transcription Activator. Cell Rep, 2018. 25(10): p. 2808-2820 e4)에 의해 기술된 돌연변이 유발에 의해 얻어졌다. PCR 산물은 pSIN-EF1αL-eGFP-IRES-Puro 벡터의 NheI/MluI 부위에 클로닝하고, 렌티바이러스 생산을 위해 벡타로지 핵심 시설로 보내지기 전에 완전히 서열 분석을 했다.

렌티바이러스 생산, 적정 및 세포 형질도입

감염성 렌티바이러스 입자의 생산 및 적정은 벡토로지 플랫폼 VECT'UB에 의해 수행되었다. 절차와 폴리시는 Maurel M et al (기능적 스크리닝을 통해 글리피칸-3을 제어하는 5개의 마이크로RNA를 특정함, 즉 간세포 암종에서 miR-1271 하향 조절의 역할. Hepatology, 2013. 57(1): p. 195-204) 또는 Laloo B et al (기능적, 통합적, 정량적 방법에 의한 전사 후 조절 분석. Mol Cell Proteomics, 2009. 8(8): p. 1777-88)에 의해 이전에 설명되었다. 렌티바이러스 입자를 세포에 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 그 후 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 다음에 실험에 사용하기 전에 며칠 동안 배양했다. 각 실험마다 단백질의 이소성 발현이 확인되었다.

약물 치료

시스플라틴(S1166), EPZ6438(타마제메토스타트, S7128로도 알려짐), GSK-126(S7061), 아트로바스타틴 (S5715) 및 심바스타틴(S1792)은 SelleckChem에서 구입했다. 시스플라틴을 NaCl 0.9%에 용해시켰다. EPZ6438, GSK-126, 아트로바스타틴 및 심바스타틴을 DMSO(디메틸 설폭사이드)로 용해시켰다. 심바스타틴의 경우 세포 분석에 사용하기 전에 EtOH 처리 시 NaOH에 의해 약물이 활성화되었다. 모든 약물은 -20°C에서 보관되었다.

세포 증식 및 생존율 분석

2D 배양의 경우 Huh6에 대해 총 2,000개 세포/웰, HepG2에 대해 3,000개 세포/웰을 96웰 마이크로티터 플레이트에 파종했다. 세포 증식은 유전자 조작 후 24시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 후, 그리고 약물 처리 후 48시간 또는 72시간 후에 시험관 내 MTS 분석 키트 또는 설포르호다민 B(SRB, 565 nm에서의 흡광도) 분석(Sigma)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 측정하였다. 3D 배양을 위해 상술한 바와 같이 스페로이드를 형성하고 마이크로플레이트를 IncuCyte® S3 라이브 세포 분석 시스템에서 배양하고 8시간마다 스캔했다. 유전자 조작을 위해, 플레이팅 전에 렌티바이러스 형질도입 또는 유전자 고갈을 수행했다. 약물치료를 위해, 실험과 약물에 따라 스페로이드는 4일차 또는 5일차에 48시간 또는 72시간 처리하였다. 스페로이드에서의 세포 생존율 분석은 1μM 칼세인 AM(BioLegend) 및 2μM 에티듐 동종이량체 1(Sigma)을 사용하여 37℃에서 30분 동안 수행하였다. 스페로이드는 IncuCyte® S3 라이브 세포 분석 시스템을 사용하여 이미지화 하였다. 모든 세포 생존율 분석에서 약물은 최대 억제 농도(IC50)의 절반으로 사용되었다.

세포 노화

EZH2-침묵 또는 대조 세포를 24웰 플레이트에 파종했다. 3일 후, 세포를 고정시키고 제조사의 지침에 따라 베타-갈락토시다제 염색 키트(Cell Signaling, Danvers, Massachusetts, USA)를 사용하여 노화 분석으로 베타-갈락토시다제 활성을 측정하였다. InCellis 현미경(Bertin Technologies, France)을 사용하여 세포를 관찰하고 이미지화 했다. 노화 세포는 ImageJ를 사용하여 계산했다.

아폽토시스

아폽토시스은 카스파제 3/7 활성 분석(Promega Corp., Madison, WI, USA).을 사용하여 유전자 조작 또는 약물 처리 후 96웰 플레이트에 파종된 EZH2-침묵 세포 또는 대조 세포에서 측정하였다.

세포 이동

EZH2-침묵 또는 대조 세포를 웰당 35,000개 세포의 밀도로 2-웰 세포 배양 삽입물(Biovalley, France)에 플레이팅했다. 18시간 후 InCellis 현미경(Bertin Technologies, France)을 사용하여 0, 8 및 24시간에 세포 이동을 이미지화 했다. 정량화는 Image J를 사용하여 수행했다.

세포 이동에 대한 약물의 영향을 연구하기 위해, 세포를 웰당 50,000개 세포의 밀도로 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 부착할 때까지 배양했다. IncuCyte WoundMaker(96핀 창상 제조 도구)를 사용하여 스크래치를 만들었다. 다음에 IC25에서 세포를 약물로 처리했다. IncuCyte® S3 라이브 세포 분석 시스템을 사용하여 24시간 동안 매 시간마다 각 웰을 스캔하여 세포 이동을 모니터링했다.

지질 액적 분석

세포를 웰당 250,000개 세포의 밀도로 6웰 플레이트에 플레이팅 했다. 24시간 후, 세포를 이전에 결정된 IC50에서 약물로 처리하거나 처리하지 않았다. 48시간 치료 후, 세포를 4% PFA에 15분 동안 고정시켰다. 다음에 실온에서 15분 동안 빨간색 오일로 염색했다. 마지막으로 세포를 여러 번 세척했다. InCellis 현미경(Bertin Technologies, France)을 사용하여 스캔했다.

웨스턴 블롯

세포를 용해시키고 RIPA 완충액(Sigma), 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Roche)의 혼합물을 사용하여 처리의 48시간 후 또는 유전자 조작의 72시간 후에 총 단백질을 추출했다. BCA Protein Assays(ThermoFisher)를 이용하여 단백질을 정량한 후, 40ug의 총 단백질을 이동을 위해 4-15% 프리캐스트 젤(Bio-Rad)에 로딩했다. 다음에 단백질을 니트로셀룰로오스 막(Transblot® Turbo midi-size, Bio Rad)상에 전사했다. 막을 5% BSA 또는 Odyssey 차단 완충액(LI-COR Biosciences)으로 차단했다. 상응하는 항체로 검출하였다(표 2). Fusion FX(Vilber Lourmat)를 사용하여 화학발광으로 밝혀졌다. ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA)를 사용하여 정량화를 수행했다.

표 2:

프로테오믹스

프로테오믹스 분석은 보르도 대학(https://proteome.cgfb.u-bordeaux.fr/en)의 Proteomics Core Facility에서 EZH2 또는 대조군이 고갈된 Huh6 세포주에서 수행되었다. 모든 단계는 Ghousein et al (miR-4510은 RAF1 표적화 및 RAS/RAF/MEK/ERK 신호 전달 불활성화를 통해 간세포 암종 발생을 차단함. Liver Int, 2020. 40(1): p. 240-251)의 설명에 따라 수행되었다.

병아리 CAM 분석

동물 절차는 유럽(지침 2010/63/UE) 및 프랑스(법령 2013-118) 지침에 따라 전술한 바와 같이 수행했다 (Indersie, E., et al., 생체 내 실험적 종양 진행 중의 종별 특이적 방식으로 세포 및 분자 변화의 추적. Oncotarget, 2018. 9(22): p. 16149-16162) (Indersie, E., et al., MicroRNA 요법은 베타-카테닌과 Wnt 신호 전달을 표적으로 삼아 생체 내에서 간모세포종의 성장을 억제. Hepatol Commun, 2017. 1(2): p. 168-183). 간단히 말하면, 수정된 배아는 분할 단계에서 받았다. 다음에 37.4℃, 70% 습도에서 배양했다. 발달 3일째에 달걀 껍질의 윗부분을 열고 의료용 듀라포어 테이프로 입구를 밀봉했다. 배아 발달 10일차에 100만 개의 Huh6 또는 HepG2 세포가 Matrigel®(증식인자 감소, Corning) 액적(40μL)에 매립하고, CAM에 침적했다. 종양 성장 및 혈관신생은 입체현미경(SMZ745T)으로 모니터링하고, 사진은 1일차, 3일차, 7일차에 카메라(DS-Fi2)를 사용하여 촬영되었다. 7일째에 모든 종양을 PFA 4%로 고정하고 추출했다. 다음에 정밀 천평을 사용하여 무게를 측정했다.

클론원성 분석

Huh6 및 HepG2 세포를 12웰 플레이트에 각각 500 및 1000 세포/웰로 파종했다. 부착 후, 세포를 약물로 처리하였다. Huh6의 경우, 아토르바스타틴(8uM), 심바스타틴(4uM) 및/또는 GSK-126(3uM) 및 HepG2의 경우 아토르바스타틴(8uM), 심바스타틴(4uM) 및/또는 GSK-126(4uM).

37℃에서 10일 동안 배양한 후, 세포를 4% PFA로 고정하고 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 염색했다. Fusion FX(Vilber Lourmat)에서 판독.

제노푸스 배아의 독성 분석

낭배 단계 배아의 배치(배치별로 10개의 배아)를 표시된 농도의 시스플라틴 또는 GSK-126의 존재 하에 24웰 플레이트에서 배양했다. 처리되지 않은 대조 배아가 41단계에 도달할 때까지 배아를 용액에 방치했다. 대조군 또는 시스플라틴 처리된 배아를 0.1x Marc's Modified Ringer중에서 배양했다. GSK-126 처리된 배아를 0.1% DMSO가 보충된 0.1x Marc's Modified Ringer중에서 배양했다.

종양 이종이식편

NOD/LtSz-scid IL2R 감마 널(NSG) 마우스는 규제 기관(프랑스 정부)에 준거하는 표준 조건에서 사육되었다. 멸균한 음식과 물은 자유롭게 섭취할 수 있었다. 마트리겔의 50% 중의 100만개의 Huh6 세포를 8~9주령 암컷 마우스 (26-32 g; APAFIS #32917-2021121316283534 v2, Agreement #B33063916, Minist

re de l'Enseignement Superieur, de la Recherche et de l'Innovation)의 오른쪽 옆구리에 총 100μl의 피하주사 했다.

종양 증식은 종양이 평균 부피 250mm³에 도달할 때까지(12일째, 화살표 참조) 캘리퍼 측정으로 모니터링했다. 따라서, 마우스를 무작위로 5개 그룹으로 나누고 복강내 경로를 통해 다른 약물을 투여하였다. 시스플라틴은 1mg/kg의 용량으로 일주일에 두 번 주사되었다. GSK-126과 아토르바스타틴(ATR)은 각각 50mg/kg과 20mg/kg의 용량으로 주 3회 주사했다. 비히클(5% DMSO를 함유한 PBS)을 일주일에 3회 주사했다. 종양 대조군의 크기가 2000 mm3에 도달할 때까지 종양 증식을 추가로 16일 동안 모니터링했다. 따라서 모든 마우스를 안락사시켰다. 안락사된 모든 마우스로부터 혈액을 채취했다. 간장과 신장에 대한 다양한 치료의 독성을 평가하기 위해 순환성 ASAT, ALAT, 크레아티닌 및 요소를 측정했다.

통계 분석

통계 분석은 GraphPad Prism 6.0 또는 7.0 소프트웨어를 사용하여 수행했다. 모든 데이터는 적어도 3회의 독립적인 실험의 평균으로 표시되며, 오차 막대는 평균의 표준 편차(SD)를 나타낸다. 실험에 일치하지 않는 두 개의 값 그룹이 포함된 경우, 비모수적 Mann-Whitney 검정을 평균치의 비교를 위해 사용하였다. 실험에 두 개의 일치하는 값 그룹이 포함되어 있고, 데이터가 가우스 분포를 따르는 것으로 간주되는지 여부에 따라, 모수적 t-검정 또는 비모수적 Wilcoxon 일치 쌍 부호 순위 검정이 사용되었다. 실험에 3개 이상의 값 그룹이 포함된 경우, 통상의 일원배치 분산분석. 실험에 3개 이상의 값 그룹과 2개의 실험 인자가 포함된 경우, 이원배치 분산분석은 복수의 평균치 및 조건을 비교하기 위해 사용되었다. 일원배치 및 이원배치 분산분석 검정 후에 Sidak 검정후의 다중 비교를 했다. 실험에 두 개의 범주형 변수 그룹이 포함된 경우, 양측 카이제곱 검정이 사용되었다. p < 0.05의 경우 결과가 유의미한 것으로 간주되었다. 도면의 모든 데이터에 대해, *: p< 0.05, **: p< 0.01, ***: p<0.001, ****: p<0.0001 또는 지시된 경우 정확한 p-값.

전사체학 데이터

전사체학 데이터 및 데이터 세트(표 3)는 이전의 간행물에 기재된 바와 같다 (Hiyama, E., 일본 소아 간 종양 연구회-2 (JPLT-2) 시험의 간모세포종 사례에서의 유전자 발현 프로파일링. 2019, Science Repository OU; Carrillo-Reixach, J., et al., 후성적 발자국에 의해 임상적 의의를 지닌 간모세포종의 분자 위험 계층화를 가능하게 함. J Hepatol, 2020. 73(2): p. 328-341; Sumazin, P., et al., 간모세포종의 게놈 분석에 의해 뚜렷한 분자 및 예후 하위 그룹이 특정됨. Hepatology, 2017. 65(1): p. 104-121; Valanejad, L., et al., PARP1 활성화는 변형된 종양 억제 인자의 발현과 공격성 간모세포종 발병의 기본이 되는 경로를 증가시킴. Commun Biol, 2018. 1: p. 67; Cairo, S., et al., 공격적인 소아 간암에서 Wnt/베타-카테닌과 Myc 신호의 간 줄기 유사 표현형과 상호 작용. Cancer Cell, 2008. 14(6): p. 471-84; ichenmuller, M., et al., 간모세포종과 HCC와 유사한 특징을 지닌 그 자손의 게놈 상황. J Hepatol, 2014. 61(6): p. 1312-20; Hooks, K.B., et al., 증식성 간모세포종에 대한 진단 및 치료 옵션에 대한 새로운 통찰. Hepatology, 2018. 68(1): p. 89-102) 또는 NCBI 유전자 발현 옴니버스에서 업로드됨 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, 참조: 해당 그래프 및/또는 도면 범례의 수탁 번호 및 참조번호). (Edgar, R., M. Domrachev, and A.E. Lash, Gene Expression Omnibus: NCBI 유전자 발현 및 혼성화 어레이 데이터 저장소. Nucleic Acids Res, 2002. 30(1): p. 207-10) 또는 R2: 유전체학 분석 및 시각화 플랫폼(https://r2.amc.nl).

실시예 3.2: EZH2가 예후불량의 지표라는 증거

간모세포종에서의 EZH2의 역할이 거의 알려져 있지 않기 때문에, 우리는 먼저 C1, C2A 및 C2B 종양 분류를 고려하여 공개된 데이터 세트에서의 EZH2 전사체의 발현을 분석했다 (Hooks KB et al., Hepatology, 2018 Jul;68(1):89-102. doi: 10.1002/hep.29672). 도 18a에 도시된 바와 같이, EZH2 mRNA는 비종양(NT) 샘플에 비해 간모세포종에서 증가했고, 이 발현은 특히 증식성 및 토포이소머라제 2-알파(TOP2A) 단백질 양성 C2A 그룹과 관련이 있었다 (Hooks KB et al., Hepatology, 2018 Jul;68(1):89-102. doi: 10.1002/hep.29672). 이 결과에 일치하게, 우리 코호트의 간모세포종 샘플에서의 EZH2와 TOP2A mRNA 사이에는 강한 양의 상관관계가 발견되었다(도 18b). 이러한 데이터를 확인하기 위해, 우리는 6개의 추가로 발표된 전사물 데이터 세트에서 EZH2 mRNA 레벨을 분석했다. 모든 경우에서 EZH2 mRNA 발현은 간모세포종에서 유의하게 증가했고(도 18c), 그의 발현은 TOP2A mRNA 발현과 강한 상관관계가 있었다(도 19). 이들 데이터는 EZH2 발현이 증식성 및 공격성 간모세포종 아형과 관련될 수 있음을 시사한다. 이러한 경향을 확인하기 위해, 임상 및 조직학적 데이터를 사용하여 비교 분석을 수행했다. EZH2 mRNA는 Sumazin et al. (Hepatology 2017 Jan; 35(1): 104-121. doi: 10.1002/hep.28888)에 의해 정의된 종양 발달의 모든 단계에서 및 모든 PRETEXT 그룹에서 상향조절되었다. EZH2 mRNA 발현은 예후 불량의 배아, 예후 양호한 태아 아형보다 혼합형 및 소세포 조직학적 아형에서 더 높았고, 재발성 종양과 사망 환자에서 유의하게 증가했다(도 20). 이들 데이터는 EZH2가 간모세포종의 독립적인 예후 인자가 될 수 있음을 시사한다.

실시예 4 : EZH2 단백질은 히스톤 메틸 트랜스퍼라제 활성을 통해 간모세포종에서

증식성 간모세포종에서의 EZH2의 역할을 해독하기 위해, 우리는 먼저 RNA 간섭 기술과 C2A 유래 간모세포종 세포주 Huh6 및 HepG2의 사용을 조합했다 (Hooks KB et al., Hepatology, 2018 Jul;68(1):89-102. doi: 10.1002/hep.29672). 도 21a에 도시된 바와 같이, EZH2-1 또는 EZH2-2 siRNA는 형질감염 3일 후 두 세포주 모두에서 EZH2 단백질 레벨을 효과적으로 침묵시켰다. EZH2 고갈로부터 96시간 후, 간모세포종 세포의 증식이 절반으로 감소했고(도 21b), P16 및 P21 증가, 베타-갈락토시다제 양성 염색 및 카스파제-3/7 활성화의 결여에 의해 예시된 바와 같이 세포는 아폽토시스의 징후 없이 노화에 들어갔다(도 21c-e). Huh6 세포의 이동도 EZH2 단백질의 손실에 의해 억제되었다(도 22a). HepG2 세포는 우리의 배양 조건에서 이동하지 않는다. 분자 레벨에서, EZH2 침묵은 히스톤 H3 리신 27(H3K27, 도 22b)의 트리메틸화 및 세포외 신호 조절 키나제(ERK, 도 23a)의 인산화를 유의하게 감소시켰다. 이들 데이터는 EZH2-침묵 간모세포종 세포에서의 응축 염색질의 완화, 종양 억제 인자의 강력한 발현 및 MAPK/ERK 신호 전달의 불활성화를 시사하며, 이는 증식성 간모세포종에서의 중요한 역할을 한다(Mosca et al. Liver Cancer 2022; 11:126-140).

히스톤 메틸 트랜스퍼라제 활성이 EZH2 단백질의 발암 활성에 필수적인지를 확인하기 위해, 우리는 야생형 EZH2 도입유전자 또는 EZH2 촉매 사멸 돌연변이인 H689A를 이소적으로 발현하는 형질전환 세포주를 개발했다(도 24a, 도 23b, 24a-e 및 25에서 EZH2*로 지칭됨). 이 돌연변이체에는 EZH2의 메틸 트랜스퍼라제 활성이 결여되어 있다(도 24a)(Kim et al., Cell Rep 2018; 25:2808-2820 e2804). 이들 두 가지 형태의 EZH2 단백질 각각의 이소성 발현은 Huh6 및 HepG2 세포에서의 웨스턴 블롯팅에 의해 먼저 검증되었다(도 22b). 다음에, 이들의 구체적인 효과를 시험관 내에서 조사했다. 도 23b, 24c-e 및 25에 도시된 바와 같이, 야생형 EZH2 단백질은 ERK의 인산화, 간모세포종 세포의 증식, 더 큰 스페로이드의 형성 및 시스플라틴에 대한 내성을 강화했으며, 반면 돌연변이 EZH2* 단백질은 효과가 없었다. 종합하면, 이들 데이터는 히스톤 메틸 트랜스퍼라제 활성이 간모세포종 세포에서의 EZH2의 발암성 기능 및 시스플라틴 기반 화학요법에 대한 증식 및 저항 능력에 관여하고 있음을 명확하게 입증했다.

실시예 5 : EZH2 히스톤 메틸 트랜스퍼라제 활성은 지질 합성과 관련됨

간모세포종에서의 EZH2의 발암 효과를 뒷받침하는 분자 메커니즘을 추가로 조사하기 위해, 우리는 EZH2-침묵 및 대조 Huh6 세포에서 비교 단백질체 분석을 수행했다(도 26a). 컷오프 배율 변화 1.8과 컷오프 p-값 0.05를 이용하여, 54개 및 87개 유전자는 대조 세포에 비하여 EZH2-침묵 세포에서 각각 유의미하게 상향 및 하향 조절되었다(도 26a). Huh6 세포에서의 P16 및 베타-카테닌 단백질의 상향 조절과 CTSV 및 DUSP9 단백질의 하향 조절은 웨스턴 블랏을 통해 평가하였으며, 우리의 결과는 우리의 단백질 데이터의 정확성을 확인했습니다 (도 21d 및 데이터는 도시되지 않음). 하향조절된 단백질 중에서, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소(HMGCR)는 EZH2-침묵된 Huh6 및 HepG2 세포 둘 다에서 감소하였다(도 26a-b). 예상한 대로, 특이적 억제제인 GSK-126 또는 EZH2 히스톤 메틸 트랜스퍼라제에 의한 이들 세포의 처리는 히스톤 H3 리신 27의 트리메틸화를 감소시켰지만(도 27a), 이는 HMGCR 발현 및 지질 합성을 촉발시켰다(도 27b-c). 이들 데이터는 보상 메커니즘으로서 간모세포종 세포가 GSK-126에 반응하여 지질 합성을 강화한다는 것을 시사한다.

GSK-126은 종양단백질 EZH2의 활성을 효율적으로 차단하므로, 간모세포종의 새로운 치료 옵션으로 검토될 수 있다. 따라서 우리는 그의 독성을 제노푸스 배아에서의 시스플라틴의 독성과 비교했다. 시스플라틴은 간모세포종의 1차 치료에서 표준약물로 30년 동안 사용되고 있다. 낭배 단계에서, 배아는 농도를 증가시키면서 시스플라틴 또는 GSK-126으로 처리했다(도 28). 우리의 결과는 시스플라틴이 50μM의 저용량에서 독성이 있는 반면, GSK-126은 1mM의 고용량에서 독성이 있다는 것을 나타냈다. 따라서 GSK-126은 시스플라틴보다 독성이 적다. 이는 증식성 및 공격성 간모세포종의 새로운 치료 옵션으로 고려될 수 있으며, 재발 환자 또는 시스플라틴에 대한 화학요법 내성을 나타내는 환자의 2차 치료법으로 고려될 수 있다.

실시예 6 : GSK-126과 스타틴의 조합은 시험관 내 및 생체 내에서 간모세포종 세포를 효율적으로 근절한다

GSK-126은 HMGCR 단백질 레벨과 지질 합성을 유도하므로(도 27b 및 c), 우리는 GSK-126을 HMGCR 효소의 2가지 특이적 억제제인 아토르바스타틴(ATR) 또는 심바스타틴(SIM)과 조합하는 효과를 테스트했다. 도 29에 나타난 바와 같이, 최적 이하 용량의 GSK-126 (Huh6 및 HepG2 세포의 경우 각각 3 및 4 μM), ATR(8μM) 또는 SIM(4μM) 단독에서는 클론원성 세포 검정에 의해 밝혀진 바와 같이 간모세포종 세포의 증식 및 생존에 거의 영향을 미치지 않았다(도 29). 그러나 동일한 농도에서 GSK-126과 ATR 또는 SIM의 조합은 상승 효과를 나타냈고 시험관 내에서 두 세포주 모두에서 간모세포종 세포를 완전히 제거했다(도 29). 또한 GSK-126 + ATR 또는 GSK-126 + SIM 콤보는 Huh6 세포 이동을 크게 차단했으며, 반면 각 약물 단독으로는 효과가 제한적이었다(도 30). 최종적으로, 면역 저하 NSG 마우스에서 Huh6 세포의 이종이식 모델을 이용하여 생체 내에서 이러한 약물의 효과를 테스트했다(도 31a) (Hooks KB, Audoux J, Fazli H, Lesjean S, Ernault T, Dugot-Senant N, et al. 증식성 간모세포종의 진단 및 치료 옵션에 대한 새로운 통찰. Hepatology 2018;68:89-10). 도 31b에 나타낸 바와 같이, GSK-126 + ATR 조합(GSK-126, 50mg/kg; ATR, 20mg/kg)은 마우스에서 간모세포종 발병을 효율적으로 억제했으며, 반면 GSK-126과 ATR 단독에서는 동일한 용량에서 효과가 없었다. 1mg/kg의 용량에서,시스플라틴도 종양 증식을 방해했지만 조합보다 효율이 떨어졌다(도 11 및 31b). 종양 추출 후 시스플라틴 또는 단독으로 사용하는 각 약물과의 비교를 통해, 콤보는 분명히 종양 증식 및 혈관신생을 감소시키는데 가장 강력했다(도 31c). 한편, 상이한 약물 및 조합은 혈액 순환중의 ASAT, ALAT, 크레아티닌 및 요소 레벨에 영향을 미치지 않아 간독성 및 신독성이 없음을 입증한다(도 31d). 종합하면, 우리의 데이터는 GSK-126과 스타틴을 조합시켜 시험관 내에서 간모세포종 세포를 근절하고 생체 내에서 종양 성장과 혈관 형성을 차단하는 이점을 입증한다.

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Claims (12)

1. 메틸트랜스퍼라제 EZH2와 관련된 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 치료학적 유효량의 상기 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 조성물이 EZH2 억제제와 하나의 스타틴의 조합을 포함하는, 방법에 사용하기 위한 조성물.
2. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 EZH2 억제제는 GSK-126, UNC1999, EPZ005687, EI1, MC3629, GSK926, GSK343, GSK503, CPI-360, CPI-169, CPI-1205, 타제메토스타트, EPZ011989, ZLD1039, EBI-2511, 피노메토스타트, 리라메토스타트, JQEZ5, PROTAC MS1943, DZNep, MC1947, MC1948, 및/또는 PF-06821497 중에서 선택되는, 방법에 사용하기 위한 조성물.
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 메틸트랜스퍼라제 EZH2와 관련된 종양은 간모세포종, 미만성 내인성 교신경교종(DIPG), 미만성 정중 신경교종(DMG), 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 악성림프종, 횡문근종양, 백혈병, 폐암, 위암, 전립선암, 대장암, 식도암, 난소암, 자궁암, 간암, 고환암, 췌장암, 신장암, 직장암, 갑상선암, 피부암, 두경부암중에서 선택되는, 방법에 사용하기 위한 조성물.
4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나의 스타틴은 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴, 세리바스타틴 및 이들의 유사체 중에서 선택되는, 방법에 사용하기 위한 조성물.
5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,상기 EZH2 억제제는 GSK-126 또는 타제메토스타트인, 방법에 사용하기 위한 조성물.
6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,상기 EZH2 억제제는 GSK-126 또는 타제메토스타트이고, 상기 스타틴은 아토르바스타틴 또는 심바스타틴인, 방법에 사용하기 위한 조성물.
7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EZH2 억제제는 GSK-126이고 GSK-126은 20~1500mg, 또는 50~1200mg, 또는 100~1000mg의 용량으로 주 2회 상기 대상체에게 정맥내 투여되는, 방법에 사용하기 위한 조성물.
8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 유효량의 항암제를 추가로 포함하는, 방법에 사용하기 위한 조성물.
9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암제는 백금 화합물, 탁산 유도체, 토포이소머라제 억제제, 호르몬 치료제, 안드로겐 결핍제, 안드로겐 수용체 제제, 세린/트레오닌 키나제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항혈관신생제, 면역치료제, 항염증제, 항암 효과가 있는 생물학적 제제, 천연물질로 만든 항암제 중에서 선택되는, 방법에 사용하기 위한 조성물.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴, 카보플라틴 및/또는 옥살리플라틴인, 방법에 사용하기 위한 조성물.
11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 경로, 비경구 및 비-비경구 경로 또는 국소 주사를 통해 필요로 하는 환자에게 투여되는, 방법에 사용하기 위한 조성물.
12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 항암 표준 치료, 방사선 요법 또는 다른 1차 또는 2차 암 치료법 후에 재발 또는 난치성 환자에게 투여되는, 방법에 사용하기 위한 조성물.